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14,000 in the proteoglycan from the low-density fraction to about 23,000 in that from the high-density fraction. Each keratan sulphate proteoglycan contains two polysaccharide chains and two oligosaccharides that are Asn-linked to the core protein. The distribution pattern of the oligosaccharide types is also different in the three proteoglycans as shown in Table 1.

References

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Fresenius Z Anal Chem (1988) 330:448 449 �9 Springer-Verlag 1988

B 42 GLIA (Glykoprotein-Lectin-Immunosorbent- Assay): Eine neue Technik zlir Glykoproteincharakterisierung und zur Definition der Kohlenhydrat-Spezifit/it von Lectinen E. K6ttgen, Ch. Miiller, B. Hell, H. Kairies und A. Kage

Universitfitsklinikum Rudolf Virchow der Freien Universitfit Berlin, Institut fiir Klinische Chemie und Klinische Biochemie, Spandauer Damm 130, D-1000 Berlin 19

GLIA (Glycoprotein-lectin-immnnosorbent-assay): A new technique to characterize glycoproteins and to define the carbohydrate specificity of lectins

Dem Glycan-Anteil von Glykokonjugaten wird seit einigen Jah- ren immer gr6Bere Bedeutung bei wichtigen biologischen Regu- lationsvorgfingen zuerkannt. Er fungiert u.a. als Mediator, Li- gand oder Rezeptor bei der Zellerkennung und Zellmigration, bei immunvermittelten oder endokrinologisch gesteuerten Re- aktionen, bei Himostase-Mechanismen oder bei der Tumorent- wicklung und -Ausbreitung [1]. Diese vielfiltigen Aufgaben sind nur durch eine sorgfiltig gesteuerte Regulation des Kohlenhy- drat-processing m6glich. Zum Studium dieser Glycan-Variabili- t i t wird neben den aufwendigen Oligosaccharid-Strukturanaly- sen gew6hnlich die Lectin-Affinitits-Chromatographie genutzt [2, 3].

Das hier vorgestellte Analysenprinzip GLIA er6ffnet nicht nur neue methodische Ansitze, mit hoher Spezifitit und Sensiti- vitit den Glycan-Anteil definierter Glyoproteine ohne Vorreini- gung aus einem Proteingemisch zu charakterisieren, sondern es ist auch hervorragend geeignet, die Kohlenhydrat-Spezifitit einzelner Lectine durch die Quantifizierung yon Bindungs- und Inhibitor-Konstanten prizise zu beschreiben.

Material und Methoden

Die verwendeten Lectine wurden von Sigma und Medac, gerei- nigte Glykoproteine von Behring und Sigma, die Antik6rper gegen Glykoproteine von Dakopatts, alle weiteren Reagentien soweit nicht anders mitgeteilt von Merck bezogen. Im weiteren wurden Mikrotiter-Testplatten von NUNC und als Photometer Titertek, Multiscan (Flow Labs) verwendet.

Testprinzip des ,Glykoprotein-Lectin-Immunosorbent-As- say (GLIA)':

1. An die Mikrotiter-Festphase wird mit bekannten Verfah- ren ein monospezifischer Antik6rper gekoppelt [4]. Bei zu ho- hem Leerwertsignal miissen die Antik6rper zuvor enzymatisch

deglykosyliert werden. Die Festphasen-Absittigung erfolgt mit Albumin (Glykoprotein-frei).

2. Nach entsprechendem Waschcyclus (10 mmol/1 Tris, 1 mmol/1 CaC12, 1 mmol/1 MgC12, 0,05% Tween, pH 7,4) wird der zu untersuchende Ligand (gereinigtes Glykoprotein oder Glykoproteingemisch) in verschiedenen Verdiinnungsstufen (in o.g. Puffer) zugegeben und fiber 60 min bei Raumtemperatur inkubiert.

3. Nach erneutem Waschcyclus wird Peroxydase-gekoppel- tes Lectin (in o.g. Puffer) zugegeben und der Ansatz 60 min bei Raumtemperatur inkubiert.

4. Nach einem weiteren Waschcyclus erfolgt die Quantifizie- rung des gebundenen Lectins durch Inkubation mit Peroxidase- Substratl6sung (Tetramethylbenzidine) und Extinktionsmes- sung bei 620 nm.

Bei den Studien zur Uberprfifung der Kohlenhydrat-Spezifi- tilt werden dem 3. Inkubationsansatz als Inhibitoren Mono- oder Oligosaccharide in verschiedenen Konzentrationen zuge- geben. Hierbei ist streng zu beachten, dab die Molaritit der Inkubationspuffer in Versuchsreihen mit und ohne Inhibitor- zusatz identisch ist.

Zum Zweck einer klaren Zuordnung yon Proteinkonzentra- tion im jeweiligen Testansatz zur Lectinaffinitit mul3 fiir jedes zu testende Glykoprotein parallel ein herk6mmlicher ELISA entwickelt werden. Hierbei wird nur im 3. Inkubationsschritt statt des Lectins ein Biotin-gekoppelter Antik6rper zur Quanti- fizierung des gebundenen Liganden mittels Avidin-Peroxidase verwendet [4]. F/Jr jedes zu testende Glykoprotein werden mit GLIA- und ELISA-Technik Standardbezugskurven erstellt. Alle Analysen erfolgen im Zweifach-Ansatz.

Ergebnisse und Diskussion

Die grundsfitzliche Validitit der hier vorgestellten Technik wurde am Modell bekannter Lectine sowie mit Glykoproteinen bekannter Oligosaccharid-Struktur erarbeitet. Als Lectin diente z.B. Concanavalin A (Con A), als Ligand Fibrinogen, dessen Oligosaccharidstruktur bekannt ist. Der an die Festphase zu bindende Antik6rper kann in diesem Testanzsatz 1:5000 ver- diinnt werden. Pero• Con A wird in einer Konzentration von 0,5 mg/1 eingesetzt.

Uber einen bestimmten Konzentrationsbereich werden Bin- dungskurven im herk6mmlichen ELISA-Verfahren und im Lec- tin-Bindungsassay erstellt. Bei jeder Glykoprotein-Konzentra- tion kann aus dem Quotienten ExtinktiOn~LiA/ExtinktiOnELiSA eine ffir Lectin und Glykoprotein charakteristische Bindungs- konstante errechnet werden, die den Glycan-Anteil des Ligan- den definiert. Entsprechende Konstanten wurden ffir Fibrino- gen gegeniiber den Lectinen Con A, WGA, PNA, LCA und Lotus tetragonolobus ermittelt. Im weiteren wurden die Affini- t/itskonstanten dieser Lectine auch gegenfiber anderen Glyko-

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proteinen (c~- 2 Makroglobulin, a-1 Protease Inhibitor, CRP, Transferrin, Fibronectin) errechnet. Die Ergebnisse zeigen klar, dab Glykoproteine gegenfiber definierten Lectinen jeweils typi- sche Bindungskonstanten besitzen. Dabei wird bei Mehrfachun- tersuchungen in der Serie und von Tag zu Tag eine gute Prazision erreicht.

Die hohe Sensitivit/it dieses Glycan-spezifischen Nachweis- verfahrens wird durch die Tatsache belegt, dab beispielsweise im Con A assay Fibrinogen bis zu einer Konzentration von 5 mg/1 nachgewiesen wird.

Zur Uberprfifung der Lectin-Bindungsspezifitat werden Mo- no- und Oligosaccharide in den verschiedenen Inkubations- schritten zugegeben. Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusam- menfassen: (1) Die Antik6rper-Bindung wird niemals dutch Kohlenhydrate inhibiert; (2) die jeweils spezifischen Zucker hemmen kompetitiv die Lectin-Ligand Wechselwirkung sowohl bei gleichzeitiger als auch bei nachfolgender Zugabe des Inhibi- tors zum Lectin; (3) nach Ermittlung der konzentra- tionsabhfingigen Inhibitorwirkung einzelner Zucker gegen- fiber der Lectin-Glykoprotein-Interaktion kann nach Umfor- mung der Daten im doppelt reziproken Plot jeweils eine charakteristische Kohlenhydrat- und Lectin-spezifische Inhibi- torkonstante (Ki) ermittelt werden. Im Fibrinogen-Con A-As- say wurden beispielsweise folgende Ki errechnet: Methylmanno- sid 0,12mmol/1, Mannose: 0,45mmol/1, Methylglucosid: 0,625 mmol/1, Glucose: 3,7 mmol/1, N-Acetylglucosamin: 16,7 mmol/1. Alle weiteren biologisch relevanten Monosaccha- ride (z.B. Galactose, N-Acetylgalactosamin, Fucose, Sialin- saure) hemmen die o.g. Wechselwirkung nicht ( K i > 100 mmo1/1).

Die obengenannten Versuchsansatze k6nnen in gleicher Weise auch zur Glycan-Definition eines einzelnen Glykopro-

reins aus einem Glykoproteingemisch (z. B. Serum oder Ge- webshomogenat) herangezogen werden. Versuchsreihen mit Se- rumproben, denen zuvor der zu testende Ligand durch chroma- tographische Verfahren entzogen - oder als gereinigtes Protein zusatzlich zugeffigt wird, zeigen zweifelsfrei die Bindungsspezifi- t fit. Auch die erh6hte Anwesenheit anderer Glykoproteine st6rt die spezifische Bindung nicht.

Mit der hier vorgestellten Versuchsanordnung des GLIA ist es im Vergleich mit herk6mmlichen Verfahren damit wesentlich einfacher m6glich, sehr spezifisch, sensitiv, zeitsparend und kostengiinstig in Proteingemischen Glycan-Reste von Einzel- proteinen zu beschreiben. Damit k6nnen nicht nur spezifische Veranderungen der Proteinglykosylierung in Serum- und Ge- websproben bei verschiedenen Erkrankungen untersucht wer- den, sondern es sind ebenso auch Lectine aus tierischen und menschlichen Geweben bezfiglich Kohlenhydrat-Spezifitat zu charakterisieren.

Literatur

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B 43 Protein- und Lipid-gebundene N-Acetyl- neuramins/iure (Sialins/iure) im Serum. Tierexperimentelle Befunde und Untersuchungen zur diagnostischen Relevanz in der Humanmedizin A. Miiller, M. Eck, Ch. Miiller, P. Sinha und E. Kfittgen

Universitatsklinikum Rudolf Virchow der Freien Universitat Berlin, Institut ftir Klinische Chemie und Klinische Biochemie, Spandauer Damm 130, D-1000 Berlin 19

Protein- and lipid-bound N-aeetylneuraminic acid (sialic acid) in serum. Animal studies and investigations on the diagnostic significance in human medicine

N-Acetylneuraminsfiure (NANA) ist als typischer Kohlenhy- dratrest sowohl bei Glykoproteinen als auch bei Glykolipiden grundsatzlich in endstfindiger Position der Oligosceharideinheit lokalisiert. Diesen endstandigen Glycananteilen wird bei biolo- gischen Regulationsvorgangen wesentliche Bedeutung zuge- sprochen, so auch bei der Fetalentwicklung und bei der mali- gnen Transformation [1]. Entsprechend wurden vielfach Versu- che unternommen, die NANA-Bestimmung als Tumormarker zu nutzen. Die Aussagen zur diagnostischen Relevanz sind je- doch sehr widersprfichlieh [2, 3].

Ziel der vorliegendcn Untersuchung ist daher, sowohl die Konzentrationen der Gesamt-NANA als auch der Lipid-gebun- denen NANA in Serumproben eines groBen Patientenkollektivs zu fiberprfifen und gleichzeitig tierexperimentelle Untersuchun- gen zu diesem Thema vorzunehmen.

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Material und Methoden

Die Gesamt-NANA (G-NANA) (Protein- und Lipid-gebun- dene NANA) wurde enzymatisch mit der Testpackung von Boehringer Mannheim in der Adaptation fiir den Cobas Bio (Hoffmann La Roche) bestimmt [4]. Zur Quantifizierung der Lipid-gebundenen NANA (L-NANA) wurde Material nach Se- rum-Extraktion (Chloroform/Methanol 2:1) eingesetzt. Nach- folgend wurde die NANA wiederum mit der auf dem Cobas Bio adaptierten Methode enzymatisch bestimmt. Im weiteren wurden in allen menschlichen Serumproben die Konzentratio- nen von AFP und CEA mittels ELISA-Technik analysiert.

Es wurden Serumproben von folgenden Patientengruppen herangezogen: (I) Mamma-Carcinom (n = 130) mit pra- und postoperativem Verlauf; (II) Colon- und Magen-Carcinom (n = 40); (III) Systemische Tumorerkrankungen (n = 110) wie akute und chron, myeloische Leukamie, Non-Hodgkin-Lymphome, Morb. Hodgkin; (IV) akute Hepatitis (n = 10); (V) chron, ent- zfindliche Erkrankungen (n = 60) wie chron. Hepatitis, primar biliare Cirrhose, primar chron. Polyarthritis. Im weiteren wur- den Kontrollproben (n = 40) von Gesunden mitgeffihrt. Alle Diagnosen waren klinisch sowie serologisch und/oder histolo- gisch gesichert.

Zusatzlich wurde G-NANA und L-NANA in Serumproben von Ratten quantifiziert: (I) Kontrolltiere (n = 20); (II) Zustand nach 2/3 Resektion der Leber am 1., 2., 5., 7. und 9. Tag postope- rativ (je n=3) ; (III) Zustand nach Galactosamin-Gabe (500 mg/kg) zur Induktion einer Hepatitis (1., 2., 3., 5. und 7. Tag nach GalN-Gabe) (je n = 3); (IV) Morris-Hepatom - tragende Tiere: Morris-Hepatom 7777 (schnellwachsend, ent- differenziert) (n = 5), Morris-Hepatom 9221 (langsam wach- send, differenziert) (n = 9).