Grundlagen der Bioprozesstechnik791.104

Bakkalaureatsstudium LBT (217)Prozesskontrolle

(K. Bayer)

Sommersemester 2005Version 25.04.05

Themen Dauer Vortragender

Anwendung der Bioprozesstechnik(Backhefe, Starterkultur, Antibiotika, Enzyme, Zitronensäure, Antikörper, Vakzine,Alkohol, Abwasser/Abluft)

(3 h) KB

Grundelemente des Bioprozesses(Upstream, Fermentation, Downstream), die Vielfältigkeit der Mikro-organismen),Produkt, Transformation (Umweltbiotechnologie, Biokatalye)

(3 h) KB

Fermentationsstrategien 4 KB

Biologische Grundlagen (4 h) RB

Wachstum der MikroorganismenRein- und Mischkulturen

(6 h) RB

ProzesskontrolleAnalyse, Mess- und Regeltechnik

(6 h) KB

Kultivierung der Mirkoorganismen im technischen MaßstabDimensionierung (Design) von Bioreaktoren, Spezialreaktoren, nicht homogeneReaktortypen (z.B. Immobilisierung, Fliessbett)

(10 h) HK

Maßstabsvergrößerung, Steriltechnik (6 h) HK

AufarbeitungEigenschaften von FermentationsbrühenKonzentration Produkt, Biomasse, Viskosität DichteZellabtrennungZentrifugation, Mikrofiltration, FlockulationZellaufschluss(Extraktion)Adsorptive ReinigungChromatographieExpanded bed

(8 h) AJ

Prozessauslegung (5 h) AJ, HK, KB

PROCESS CONTROL and AUTOMATION

outline

• Bioprocess control

• Sensors

• chemical/physical

• biosensors

• flow injection analysis

• Application of neural networks

• Process control

• process control systems

• requirements due to quality management

UPSTREAMPROCESSING

DOWNSTREAMPROCESSINGFERMENTATION

BIOPROCESS

BIOPROCESS OPERATION

Bioprocess (Fermentation)

„black box“

Substrate

Process operation:empirical

„more an art than science“

Product

Biomass

End productswater, CO2

Mass balance

Substrate + O2 Biomass + Product + H2O + CO2 + heat

Impact of process control in bioprocessing

Efficiency (yield) of a bioprocess is determined by• performance of the cell factory• environmental parameters

maintenance of process conditions

Goal: optimal utilisation of biological features• biosynthesis • transformation • degradation

PROCESS CONTROL and AUTOMATION

PROCESS CONTROL and AUTOMATION

Main characteristics of a Bioprocess• complex• highly interactive• parallel• non linear

monitoring- controlquality management

documentation

Key issues+

Product isolation(Downstream-

processing)

biosynthesis

Zur Nutzung des Potentials von Mikroorganismen oder Zellenmuß die bio-, chemische und physikalische Umgebungkontinuierlich analysiert (monitoring) und kontrolliert werden(control).

Sensoren und Systeme zur Überwachung, Steuerung undRegelung komplexer Vorgänge = Prozeßleitsysteme(Prozeßrechner)

Aufgaben: Steuern Regeln Dokumentation

Bio-Prozessführung (Bioprocess control)

Definitionen

• Prozess: System in dem die Transformation und/oder derTransport von Materialien, Energie und/oder Informationabläuft

• Prozessleitung (Control) Steuerung Regelung

• Monitoring (Prozessbeobachtung, -überwachung)

• Automatisierung: Ablauf von Prozessen ohnemenschlichen Eingriff

PROZESSLEITUNG und AUTOMATISIERUNG

Reasons for an increasing need for automation anduse of computers in bioprocessing

process level• process regimes became far more complex and sophisticated e.g. (batch fedbatch)• continuous increase of variables to be monitored• increasing complexity of variables

level of quality management• demands related to quality management increased dramatically (hidden plant, makes approx. 35% (up to 70%) of costs)

LV Automatisierung von Bioprozessen

Meßverstärkerund ReglerRückfluss-

kühler

Stutzen f. Messsonden

SteuerungSPS

Labor-Bioreaktor mit Meß-und Regeltechnik

Kommunikationmit PC

(Visualisierung,Konfigurierung)

SignalconverteramplifierpH,pO ,

2Temp.,stirrer,

weight (volume), air flow

pH RIC

Temperature, RIC

pO RI2

stirrer RIC

ADC Fermenter

Process control systemVisualisation

weight RIC

DAC

Signalconverteramplifierweight (volume),conductivity, pH

ADC Peripherie

Exhaust gas analysis

O2 CO

2

Interface

Substrate-feedtank

weight RIC

weight RIC

Pump

base

Pump

Measurement signalsControl

Media stream

Säure

Cooling water

Hot watersteam

weight RICweight RIC

weight RIC

weight RIC

weight RIC

Airflowcontroller

Outflowwater

air-filter

Air in

anti-foam

sensor

antifoam RIC

R...recordI....indicateC..control

Feed IC

ADC Analog to Digital Converter

DAC Digital to Analog Converter

Conductivity RIpH RIC

MONITORING and CONTROL Signal-Flow and Media stream

Process control needs in different fermentation strategies

• Batch cultivation:

Monitoring of state variables (pH, pO2, temperature, rpm...)

• Fed batch cultivation -

growth control by exponential substrate feed

Monitoring of state variables(pH, pO2, temperature,rpm...)

Substrate feed to maintainconstant growth rate

Process control needs in different fermentation strategies

• Continuous cultivation: Monitoring of state variables (pH, pO2, temperature, rpm...)

Feed and volume control (dilution rate D)

• STATE VARIABLES (MONITORING)

• on line: pH, pO2, temperature, rpm, biomass etc.

• off line (biomass, product, residual substrate, etc.)

• CONTROL VARIABLES: feed rate (exponential feed), temperature, rpm etc.

• QUALITY VARIABLES:• rates (qP, OUR, CER, RQ) (material balancing)• amount and physiological activity of biomass• key metabolites

Zuordnung der wichtigsten Prozessgrössen in derFermentation

Stellgrössen

Zustands-grössen

ZielgrössenDrehzahl

Säure/Lauge

Induktor

Precursor

Zuluftmenge

Heiz/Kühlmittel

Dosagen

Substrat

Produktion Biomasse

RespirationsquotientO2/CO2

Leistungsaufnahme

Wachstumsrate

Verbrauch Substrat

Produkt/-bildungsrate

Ausbeute

Pro

tein

, RN

A, D

NA)

pH Subs

trat

Visk

ositä

tDru

ck

O 2-A

bgas

CO2-A

bgas

Prod

uktk

onz.

Biom

asse

pO2

Met

abol

ite

Tem

pera

tur

Begriffsdefinitionen für Sensoren und Geräte in derProzessanalytik

on-line - off-line

on-line: Messgrössen können unmittelbar erfasst werden, z.B. pH Messung im Bioreaktor

off-line: Probe entnommen und in externem Gerät analysiert Probenaufbereitung, Verzögerung, z.B. Restsubstrat mittels HPLC

in-situ - ex-situ

in-situ: Sensor im Bioreaktor

ex-situ: Probe zur Analyse in externes Gerät transferiert

Wunsch: on-line, in-situ

Messung physikalischer Größen:

Temperatur:Arrhenius Gleichung - Temperatur beeinflußt direkt dieReaktionskinetik.

k = GeschwindigkeitskonstanteT = Temperatur in oKR = GaskonstanteA = KonstanteE = Konstante für Aktivierungsenergie

Meßprinzip: Messung des elektrischen Widerstandes (z.B. Pt100)

Gewichtsmessung:Auf Grund des Zweiphasensystems (Gas-Flüssigkeit) und der sichändernden Dichte ist die Gewichtsmessung der Volumsmessungvorzuziehen. Zugabe bestimmter Nährstoffkomponenten auch überGewichtsmessung.

Meßprinzip: piezoresistiver Effekt - der Widerstand bestimmterMaterialien ändert sich mit dem Druck - „Dehnungsmessstreifen -Gewichtsmessdosen“.

dR/R = Wiederstandsänderungρ= spez. elektr. Widerst.l = LängeF = Querschnitt

Hottinger Baldwin

Durchflußmessung

Thermische Massenflußmessung

Durchflußmeßsystem beruhend aufCoriolis Effekt:Einer entlang einer rotierenden Kugel nachaußen bewegter Körper beschreibt eine ent-gegen der Rotationsrichtung gekrümmte Bahn= Corioliskraft, bzw. -beschleunigung

Das im Sensor strömende Medium verändert durch die daraufeinwirkenden Coriolis Kräfte das Schwingungsverhalten. Verdrehungdes Sensorrohres ist proportional zum Massefluß und zur Dichte desMediums, Genauigkeit liegt bei 0,1%.

Bestimmung chemischer ParameterIonenselektive Elektroden

pH-Messung: Sterilisierbare pH Elektroden druckbeauf-schlagbar oder mit Gelelektrolyt befüllt (verhindernEindringen von Nährlösung während der Sterilisation)

Weitere ionenselektiveElektroden für Na, K, NH4,meist aber nicht sterilisierbar

pO2-Messung (Clark Elektrode)Der Gelöst-O2 gibt Aufschluß über denfür die Zelle verfügbaren SauerstoffAmperometrische Messung:Aktivitätsmessung beruht auf Strom-messungElektrochemische Vorgänge: Kathodeund Anode durch Elektrolyten elek-trisch leitend verbunden,Polarisationsspannung (600 - 750 mV)Sauerstoff an der Kathode reduziert

Reaktion an der Kathode:

O2 + 2H2O + 4e- 4 OH-

Reaktion an der Anode:

4Ag + 4OH- 4Ag2O + H2O + 4e-

Diffusionsgrenzstrom (ID) vom O2-Partialdruck und Löslichkeitdes O2 in der Membran, nicht aber von der Löslichkeit in derMeßlösung (Konzentration), abhängig.Treibende Kraft für die Diffusion ist das Partialdruckgefälle

k = KonstanteDm = Diffusionskonstante des Gases d. gasperm. Membrana = Löslichkeit des Gases in gaspermeabler MembranA = Oberfläche der Arbeitselektroded = Dicke der gasperm. Membrana.Dm = P = PermeabilitätpGas = Partialdruck des elektroaktiven Gasesn= Anzahl der übertragenen ElektronenF = Faraday Konstante

Abgasanalyse

Kenntnis der Abgaszusammensetzung (O2/CO2) zur Erstellungvon Massenbilanzen über Wachstum und/oder Produktbildung

Substrat + O2 Biomasse + (Produkt) + CO2 + H2O + Wärme

• Ermittlung der Biomasse durch Komponentenbilan- zierung• Rückschlüsse auf Stoffwechsel, z.B. Crabtree Effekt• Berechnung des spezifischen O2 Bedarfs für Reaktorauslegung

Abgasanalyse O2-Analysatoren

Bestimmung des Sauerstoffs aufgrund para- und thermomagnetischer Eigenschaften

Para- und Diamagnetismus:

• bahnmagnetisches Moment: Bewegungen der Elektronen im Raum um den Atomkern

• kernmagnetisches Moment: Rotation um die eigene Achse

• spinmagnetisches Moment:Rotation der ProtonenMagnetische Moment eines Moleküls oder Ions ist Vektorsummeder Teilmomente• Diamagnetische Stoffe: resultierendes Moment von null, richten sich quer zu den Kraftlinien aus, schwächen Intensität des Feldes ab• Paramagnetische Stoffe: magnetisches Moment verschieden von null, orientieren sich in Richtung des Feldes, verstärken es da- durch.

2

Abgasanalyse O2-AnalysatorenSauerstoff stark paramagnetisch, Stickstoffdioxid, Stickoxid undChloroxid schwach paramagnetisch, fast alle Gase schwachdiamagnetisch

1 Vergleichsgas Eingang2 Drosseln3 Vergleichsgaskanäle4 Mikroströmungsfühler für Meß- und Störsignal5 Meßgang Eingang6 Meßkammer7 Paramagnetischer Meßeffekt8 Elektromagnet mit wechselnder Flußstärke9 Meßgas- und Vergleichsgas-Ausgang10 Mikroströmungsfühler

Paramagnetischer SauerstoffanalysatorSauerstoff aufgrund paramagnetischer Eigen-schaften in Meßkammer stärker gebunden

Druckanstieg, über Mikroströmungsfühler (4)erfasst

5

6

7 8

2

1

3

3

9

10

4

Abgasanalyse O2-Analysatoren Ringkammeranordnung

Zur Messung des O2-Gehaltesnutzt man, dass paramagne-tische Eigenschaften mitzunehmender Temperaturverlorengehen

Suszeptibilität (= Empfänglich-keit) ist indirekt proportional T2

1 Strahlungsquelle2 optischer Filter3 Strahlungsteiler4 Antrieb Blendenrad5 Blendenrad6 Meßküvette7 Vergleichsküvette, gefüllt mit N2 (nicht infrarot aktives Gas)8 Empfängerkammer rechts9 Empfängerkammer, links10 Mikroströmungsfilter

CO2 AnalysatorInfrarotspektrometrische Messung: Kohlenstoffhältige Gase zeigen imInfrarotbereich Absorption, dadurch nimmt das Gas Energie auf wird inWärme umgewandelt und in beiden Empfängerkammern (8 und 9)entstehen unterschiedliche Drücke, Druckausgleich über Mikro-strömungsfühler erfaßt.

Massenspektrometrie: zur AbgasanalyseMoleküle im Hochvakuum mit Elektronen beschossen, dadurch ionisiertund in der Folge in elektrischen und magnetischen Feldern nachMassenzahl (m/e m= Massezahl, e= Ladung) getrennt.

Quadrupol MS: 4 Stabelektroden, an denen Gleich- oder Wechsel-spannung anliegt, zu analysierenden Substanzen im Mittelpunkteingeschossen

Probleme bei der Abgasanalyse:

CO2, N2 und O2 liefert folgende Bruchstücke:

CO2 44, 28, 16, 12 Matrix aufbauen aus

N2 28, 14 mehreren Eichgasen

O2 32,16

Messung biologischer Größen

• Methoden zur Erfassung der Biomasse

• Substrate, physiologisch wichtige Metaboliten oder Endprodukte des Stoffwechsels

Bestimmung der Biomasse• Wichtigste Messgrösse in der Bioprozeßtechnik• Kenntnis der physiologischen Aktivität meist wichtiger als die Dichte der Biomasse

Methoden: Indirekte Methoden:

Material- und Energiebilanzen, Massenerhaltung, Stöchiometriebiochemischer Reaktionen oder Materialbilanz ausgewählterSchlüsselkomponenten, wie z.B. Atmung, Wärmeproduktionoder O2-Verbrauch, CO2-Bildung u.a.

• Elektrochemische Methoden

• Impedanzmessung (Wechselstromwiderstand) Zellsuspension einem sinusförmigen Wechselfeld ausgesetzt

• Kapazitätsmessung und spezifische Leitfähigkeit (Wirkleit- wert)

Monitoring of viable biomass(Aber instruments, http://www.aber-instruments.co.uk)• Intact plasma membranes of cells act as tiny capacitors under the influence of an electric field• The non-conducting nature of the plasma membrane allows a build up of charge• Resulting capacitance can be measured; cell type specific and directly proportional to the concentration of viable cells

System is responsive to viable cells andinsensitive to cells with leakymembranes, gas bubbles and celldebris.(Range 0,1 - 200 gBDM/l)

Bestimmung der Biomasse Optische Sensoren:

Nephelometrie und spektralfluorometrischen Methoden

Nephelometrie: Streulicht, Lichtstreuung in biologischen Probendurch suspendierte Zellen, Feststoffpartikel und Gasblasen,beschrieben mit Lambert Beer'schen Gesetz:

I= Intensität des LichtesIo= Intensität des Ausgangslichtesk= Extinktionskoeffizientl= Dicke der Küvettec= Konzentration

log Io/I gleich der optischen Dichte (OD)lineares Verhalten nur im Biomassebereich unter 1 g/l (= OD 0,5)- keine online Messung; z.B. bei OD = 5 nur 1/100000 deseingestreuten Lichtes vom Detektor empfangenVerbesserung durch Wechsellichtsensoren: zwei Infrarot Diodenabwechselnd ein- und ausgeschaltet,Aquasant Sonde: erfaßt reflektiertes Licht

Fluoreszenzmessungmulti-wave FluoreszenzIn-situ Fluoreszenzmessung bis bis zu120 Anregungs- und Emissionsspektrenerfassbar

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 20 40 60 80 100 120 140Meßpunkte

RFU

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

BTS

(g/l)

BTS (g/l) Tryptophan Pyridoxin/Pyridoxamin NAD(P)HNAD(P)H NAD(P)H Riboflavin/FAD/FMN Riboflavin/FAD/FMNPyridoxin/Pyridoxamin Riboflavin/FAD/FMN Pyridoxin/Pyridoxamin Pyridoxin/PyridoxaminRiboflavin/FAD/FMN Riboflavin/FAD/FMN Riboflavin/FAD/FMN Riboflavin/FAD/FMNStreulicht 590 nm

Off-lineLaser flow Cyto-metrie (FACS,Cell Sorter)

Biosensoren:Prinzipieller AufbauMeßanordnung in der ein biologisches oder biochemischesSelektivitätselement (= Signalgeber) mit einem Transducer(=Signalwandler) verknüpft ist

Biologische Komponenten:Mikroorganismen, Zellen,Organellen, Enzyme, Anti-körperund Nukleinsäuren

Biochemische Reaktion erzeugt einelektronisch erfassbares undkonvertierbares Signal.

Denkbare Primärsignale: Temperatur, Konzentration, Redox,Fluoreszenz, Absorptionsverhalten und ImpedanzBiosensoren sind nicht in situ sterilisierbar Messung außerhalb desBioreaktors, meist in Fließinjektionssystemen (FIA)

Immobilisierungstechniken für biologische Komponente

• Einschluß der Biomoleküle im gelösten Zustand hinter einerinerten Membran (wird heute praktisch nicht mehr angewendet)

• Adsorption an einer Oberfläche mittels physikalischerWechselwirkungen

• Vernetzen mit bifunktionellen Agenzien

• Einschluß in einer Polymermatrix

• Kovalentes Binden an eine funktionelle Trägermatrix

Häufig ist mit der Immobilisierung ein Aktivitätsverlust verbunden.

Beispiel für einen Enzymsensor: Glukosesensor

Enzym: Glukoseoxidase (GOD)Flavoprotein, oxidiert Glucose zu Gluconolacton, aus demGluconsäure entsteht, Coenzym FAD wird zu FADH reduziert.

Durch molekularen O2 wird das Enzym reoxidiert und es entstehtH2O2, das durch anodische Oxidation bei 0.5- 0,7 V ampero-metrisch bestimmt werden kann:

H2O2 + O2 + 2H+ + 2e-

Reaktionsablauf

Möglichkeiten zur Erfassung der Glukose:

• Bestimmung der Glukonsäure: Problem Pufferkapazität der Probe

• Messung der Abnahme des pO2 - konstanter pO2 notwendig

• Amperometrische Bestimmung des H2O2: Oxidation von H2O2 an einer Pt- oder Graphitelektrode (700mV gegen Ag/AgCl in 0,1m KCl, pH 5,6) liefert Strom proportional zur Glukose- konzentration. Differentialmessung mit zwei Elektroden, eine davon mit inaktiviertem Enzym, zur Vermeidung von Interferenzen mit anderen oxidierbaren SubstanzenQuerempfindlichkeiten mit leicht oxidierbaren Substanzen, wie Ascorbinäure

Aufbau eines Glucosesensors in DünnschichttechnikEnzym ist in einer Polymermatrix immobilisiert

Redoxmediatoren (Ferrocenderivate) als künstliche Elektronenakzeptoren(Ersatz für molekularen Sauerstoff) ermöglichen geringeres Arbeitspoten-tial (220 mV gegen Ag/AgCl) zur Senkung der Querempfindlichkeiten.Reduzierter Mediator an Elektrode reoxidiert und resultierender Stromzwischen Enzymelektrode und Gegenelektrode gemessen.

Key issues for signal generation

• Transfer of substrate (analyte) to electrode surface (diffusion through membrane)

• Enzymatic conversion

• Measurement of current

• potentiometric (measurement of potential between working and reference electrode)

• amperometric (current generated by oxidation or reduction of substrates is related to concentration, conversion of analytes during measurement)

Meßanordnung für Biosensoren

Fließinjektionsanalysensysteme zur automatisierten Prozeß-kontrolle von Fermentationen (Prozeßmonitoring)

Flow Injection Analysis (FIA)

Aseptic Sampling Device (cell free)Rotating membrane

Combination of valves(whole broth)

Crossflow-filtration(cell free)

Aseptic Sampling devices

Automation of FIA System

Software structure for systems control and data processing

Data display of process monitoring system

Glu

kose

konz

entra

tion

[g/l]

bzw

. OD

0

10

20

30

40

50

06:00 08:24 10:48 13:12 15:36 18:00 20:24 22:48 01:12

0

2

4

6

8

10

12

Troc

kens

ubst

anz

[g/l]

Glukose [g/l]

OD

TS [g/l]

Application of Persep membrane sampling system coupled to Biosensor/FIA-System , monitoring E.coli K12-Fermentation in the range of 5-50g/l Glukose)

Monitoring of glucose concentration in E. coli fermentation

0 2 4 6 8 10 12 14 1610

15

20

25

30

35

40

Verw

eilz

eit

Verweilzeit

Peak Nr.

10

20

30

40

50

Brei

te b

. Hal

ber H

oehe

Halbwertsbreite

0.025

0.030

0.035

0.040

0.045

0.050

0.055

0.060

Hoehe/ Flaeche

Höhe/Fläche

0

1

2

3

4

Tailingfaktor

TailingFaktor

Automated analysis of FIA data

• Produktanalytik - Menge und Qualität (Aktivität), Reinheitchromatographisch, immunchemisch, Elektrophorese,Glykosylierung, etc.

• Physiologische Aktivität der Zellen

• Restsubstratanalytik, NebenprodukteLaktat, NH3 in tier. Zellkultur, EtOH, Acetat in mikrobiellenFermentationen, u.a.

• Plasmidkopienzahl, %-Satz Plasmidträger, Keimzahl(cfu), etc

Inprozesskontrolle -Anforderungen von QM!

Neben den „quasi on-line“ erfassten Messgrössen, wird eine Reihevon off-line Analysen durchgeführt

State and novel trends in Bioprocess Monitoring

Availability of sophisticated biochemical proceduresproviding analysis on molecular level (DNA chips,2-D- electrophoresis, etc)

Key issues:• increase quality of information on metabolic level• deeper understanding of metabolic regulatory networks

Principle of microarrays:

Isolation of mRNA species Reverse Transcriptionusing fluorescence marked nucleotides Hybridisation

Powerful tool to screen shifts in transcription

Backlogs:• complexity of analytical procedures and assays• too low sampling frequency

Fusion of sophisticated analytical techniques with conti-nuously emerging computing facilities

i.e. exploitation of on-line data through correlation to

key variables of metabolism using mathematical modellingand simulation techniques (e.g. neural network simulations)

Hierarchical organisation of metabolic regulatory networksunit control level analytes relevance to process

controlstimulon global regulatory

networks and stressresponse

signal mole-cules, such as,ppGpp, cAMP

high

modulon co-ordination ofmetabolic subunits

activity of keyenzymes potential

operon control of single en-zymes and enzymeclusters

low

Approach to selection of significant data

Acquisition of complex data by

Solution:mathematical modelling e.g. application of neural networks

Artificial Neural Network• Information-processing systems inspired by interconnected, parallel structure of the mammalian brain

• ANNs are collections of mathematical models• properties of biological nervous systems• implementation of analogies of adaptive biological learning (training)

dentrites

cell

axon

Application of artificial neural networks

Definition

Neural network is a system composed of many simple processingelements operating in parallel (=neurons)

Neural network including connections

(between neurons)compare

Input Output

Target

Adjustweights

Training

Application of artificial neural networks

Key elements of ANNs - „neurons“

Highly interconnected processing elements analogous to neuronsare tied together with weighted connections analogous tosynapses.

Signals are trans-ferred to neurons,which are activatedwhen a threshold isexceeded.

“Knowledge“ isacquired by learningfrom data and isstored in connectionweights as distri-buted memory

Application of artificial neural networks

A neuron is a nonlinear static processing unit with several inputsand a single output.

Input signals are modifiedby multiplication with acorresponding constant

Wij to produce a totalinput signal, activated ordeactivated by activationfunction (sigmoid,hyperbolic tangens, etc.).

Application of artificial neural networks

I1

I2

I3 X=ΣWjIj

Neural network based modelling of Pasmid Copy Number(PCN) of recombinant E. coli during fed batchfermentation using on-line data (O2, CO2, KOHconsumption, OD etc.)

0

20

40

60

80

100

120

12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32Laufzeit (h)

PCN

PCN NN10 Modell

Start Feed Induktion

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

0

1

2

3

4 pO2 Biomass MF1 MF2 MF6 MF7 MF8 Tgs3 IR

Sens

or R

espo

nse

Time [h]

0

1

2

3

4

Biom

ass x

[g/l]

0

100

200

300

400

pO2 [

%]

Escherichia coli batch Fermentation

Data from Carl-Fredrik Mandenius, Univ. Linköping, S-Sence, 1999

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

Estimated values for X Reference values for X Reference values for µ Estimated values for µ

Biom

ass x

[g/l]

Time [h]

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Spec

ific g

rowt

h ra

te µ

[h-1]

ANN prediction of environmental variables in E. coli

Data from Carl-Fredrik Mandenius, Univ. Linköping, S-Sence, 1999

Information in the technical area

“from data to information”

• Process control (“Prozeßleittechnik”) is the fusion of classic control technique with information technology aided monitoring and auto- mation.• Process control changed from mainly signal dominated man- machine interaction to information based man-process communi- cation.• Modern process control enables networking and precise co- ordination of individual parts of the process

PROZESSLEITUNGMaximale Effizienz biotechnologischer Prozesse durch weit-gehende Nutzung des Potentials mikrobieller oder höherer Zellen.

Dazu muß die chemische und physikalische Umgebung der Zellenkontinuierlich analysiert und kontrolliert werden.

Dazu benötigt man neben den Sensoren, Systeme mit denenkomplexe Vorgänge

• überwacht (monitoring)

• kontrolliert und (control)

• dokumentiert werden können

Prozeßleitsysteme (Prozeßrechner) (process control)

Begriffsdefinitionen Prozeßleitung - Leiten - Steuern- Regeln

Leiten (DIN 19922/1)Die Gesamtheit aller Maßnahmen, um bei Einhaltungfestgelegter Konventionen und Ziele den gewünschten Ablaufeines Prozesses zu garantieren. Dabei steht im Vordergrund dieKoordination von Daten und Signalflüssen zwischen Betreiberund Prozeß mit den Funktionen durchführen, schützen undoptimieren

Prozeßrechner, Prozeßleitsystem notwendig

Steuern (DIN 19226)

Regeln (DIN 19226)

Steuerung (DIN 19226)Vorgang bei dem eine od. mehrere Größen (Eingangsgrößen)andere Größen (Ausgangsgrößen) aufgrund der imSteuersystem festgelegten Gesetzmäßigkeiten (Algorithmus)beeinflussen

Übertragung eines Sollwertes (=Führungsgrösse) aufdenProzess zur Herstellung einer Ausgangsgrösse (Regelgrösse)

Keine Rückkoppelung Abweichungen möglich

STEUEREINRICHTUNG(Eingeben, Messen, Ver-

arbeiten, Stellen)

STEUERSTRECKEProzeß

FÜHRUNGS-GRÖSSE

STELLGRÖSSE AUSGANGS-GRÖSSE

Regelung (DIN 19226)Nachteil der Steuerung: keine automatische Reaktion aufStörungen Einführung einer Rückkoppelung zwischenSystemausgang und Systemeingang geschlossenerRegelkreis (loop)

STEUERSTRECKEProzeß

FÜHRUNGS-GRÖSSE

REGEL -GRÖSSE

STELLGRÖSSE

Rückkoppelung (feed back)

STEUEREINRICHTUNG REGLER

(Eingeben, Messen, Vergleichen, Stellen)

Vergleich Sollwert/Istwert

Regler ist das Grundelement für dieAutomatiserung der Prozeßführung

Historische Entwicklung regeltechnischer Geräte

1939 PID Regler1969 Programmierbare Regler1962 DDC (Direct Digital Control)1964 Integrierte Schaltkreise1977 Prozeßleitsysteme

Vorteil: Prozeß läuft beiAusfall eines Kreisesweiter

Nachteil: Vernetzung undVerknüpfung der Meßwertesehr beschränkt

Klassische Regelung und Steuerung einer Fermentation

Einschleifige Regel- und Steuerkreise mit manuellerSollwertvorgabe für Temperatur, pH, pO2, Drehzahl etc.

Entwicklung Computergestütze Prozeßleitung

• Einzelne Reglereinheiten programmierbare Regler =‘Speicherprogrammierbare Steuerungen’

• Messwerterfassung mit Hilfe eines Computers(Analog/Digital-Wandlung) Sollwertvorgabe durchComputer (Set point Control SPC)

• Ansteuerung der einzelen Geräte (Aktoren) direkt vomRechner (direct digital control DDC)

Arten von Signalen

• Analoge Eingangssignale (0)4-20mA; 0-1; 0-10 V (z.B.Meßwerte)

• Analoge Ausgangssignale (0)4-20mA; 0-1; 0-10 V (z.B.Steuersignale für drehzahlgesteuerte Motoren (Rührer,Pumpen))

• Digitale Ein- und Ausgangssignale +/- 5 V (z.B. Ventileauf/zu, Pumpen aus/ein)

Signale einzelner Sensoren• verstärkt,• von Analog- in Digitalwerte gewandelt Interface, AnalogDigitalConverter -ADC• auf Plausibilität geprüft• gefiltert• in ‘engineering units’ umgerechnet• in einzelnen Regelkreisen (Soll-Istwert-Vergleich) weiter verarbeitet.

Signalaufbereitung

Verfahren zur Wandlung von Analogwerten:

Vergleichsverfahren: Digitalwert wird mit Hilfe eines Generatorsso lange verändert bis Ausgangssignal des ADC dem Analog-signal entspricht.

Sägezahnverfahren: Spannung so lange erhöht bis die an einemDifferenzverstärker liegende Spannung des Meßsignals erreichtwird, Impulse werden gezählt.

Gütekriterium eines ADC ist die Auflösung (resolution):= jener Wert um den sich die Eingangsspannung ändern muß,damit die niederwertigste Stelle des Datenwortes (LSB = leastsignificant bit) verändert wird.

Wandlung von Analogwerten

Auflösung gängiger ADCs: 8 bit 1/256 (1/28)10 bit 1/1096 (1/210)12 bit 1/4096 (1/212)FSR = Endwert (Full Scale Range),

n = Anzahl der Datenbits

Set point controlRegelung einer Fermentation mit SollwertvorgabeManuelle Sollwerteinstellung durch Prozessrechner ausgeschaltet - override signal)

Direct digital Control DDC (digitale Vielfachregelung)Einzelne Aktoren (Ventile, Pumpen, etc.) direkt vom Rechner angesteuert,Reglerstrategien softwaremäßig realisiert.

Vorteile: Vernetzung einzelner Parameter, modellgestützte ProzeßführungNachteile: bei Ausfall des Rechners wird der Prozeß instabil

Anforderungen an Hardware und Betriebssystemvon Prozessleitsystemen

• Multitasking - zeitlich parallelle Verarbeitungmehrerer logischer Aufgaben (tasks)Quasi - Parallelverabeitung, d.h. Betriebs-system muss Aufgaben nach Priorität aufteilen

• Echtzeitfähigkeit - Meßwerte müssen demSystem unmittelbar zur Verfügung stehen undauch verarbeitet werden

Leistungsfähigkeit der Hardware

• Einhaltung konstanter Zykluszeiten und Abtastratennotwendig

• Aufgaben nicht mit geforderten Geschwindigkeitabgearbeitet und Regelung nicht gewährleistet

• Analyse der Einzelprozesse nach zeitkritischenAnsprüchen für den Entwurf von Prozeßleitstruk-turen notwendig

Hierarchisch organisiertes Prozeßleitsystem

• Realisierung der zeitkritischen Anforderungen durch zusätzlicheHardwarekomponenten und Auslagerung von Teilprozessen

• Jedem Fermenter eigene Prozessrechenstation zugeordnet– anfallende Daten unmittelbar verarbeitet und umgesetzt

• an nächsthöhere Ebene nur mehr reduzierte Daten weitergegeben

• Vorteile:– ausfallsicher durch verteilte Hardware– kritische Komponenten werden redundant ausgeführt und kontrollieren sich

gegenseitig z.B. Bus und CPU Karte).• Nachteile:

– höhere Kosten

Anstehende Aufgaben herkömmlich nicht realisierbar

Off-line Verarbeitung derDaten, graphische Dar-stellung, Speicherung,Auswertung

On-line Verarbeitunglangsam ändernderInformation, Eingabe off-line Daten, Modeller-stellung

Steuerung und Regelungschnell ändernderProzesse (ms Bereich)

Prozessebene, Feldebene

Hierarchie der Prozessleitung bei zeitkritischen Prozessen

Grundstruktur des am IAM in Betrieb stehenden hierarchischaufgebauten Prozessleitsystems (Honeywell TDC 3000)

Hauptelemente:HM History ModuleAM Application ModuleHG Hiway GatewayLCN Local Control Net-workUS Universal StationDH Data HiwayPR Printer

AIN Analog InputAOT Analog OutputDOT Digital Output DIN Digital Input

AMC Advanced Multi-function ControllerUWS Universal Work-station IPC Industrial Program-mable Controller

Input/Output SignalsUnit V1/SF V2 V3 V4 V5 V6 F1 F2 F3 F4 M1 U1 P1 P2 P3 TotalpH 2 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1 1 1 1 18pO2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1 1 1 1 17Temperature 3 1 1 1 1 1 1 3 3 1 1 1 1 1 1 21Pressure 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 4 1 1 1 23Conductivity 1 1 1 1 1 1 6Turbidity IR 1 1 1 3Magn. Stirrer 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14Mass-flow 1 6 6 6 4 2 2 27Pumps 1 1 5 5 5 3 2 2 24Diff. Pressure 1 1 1 1 1 1 1 7Niveau Sensor 1 1 1 3Top Drive 1 1 1 3

Analog Input 15 7 7 7 3 3 15 22 22 8 10 10 5 5 5 144Analog Output 1 2 2 1 10 11 11 4 4 4 1 5 1 57Digital Input 5 5 5 5 2 2 7 10 10 4 7 7 4 4 4 81Digital Output 69 46 50 49 17 17 76 76 76 21 49 48 29 29 35 687

Input/Output Signals Analog in/out, Digital in/out

Feldbussysteme• Im IAM Prozeßleitsystem zentrale Verabeitung der Signale

und Transfer zu Aktoren– hohe Leitungskosten und Störanfälligkeit (Induktivität,

Ohm’scher Widerstand etc.• Neues Konzept - Feldbussysteme

– konsequente Realisierung der hierarchischen Anordnung– Systeme sicherer, flexibler, ausbaufähiger und kostengünstiger

zu gestalten und– Signale vor Ort verarbeitet, Kommunikation untereinander nur

mehr digital– Entwicklung völlig neuartiger Sensoren (smart sensors) und

Aktoren• Analog/Digitalwandlung integriert, besitzen „eigene Intelligenz“,• Sensoren: Kalibrierdaten, Serviceintervalle• Aktoren empfangen Digitalwerte und wandeln sie vor Ort

Smart Sensor

Aktoren

Smart Aktor

digitale Steuersignale

Prozessleitsysteme in Qualitätsmanagement-Systemen

• Produktsicherheit ist wesentliches Kriterium bei der Herstellungvon (bio)-pharmazeutischen Produkten (Biologica)

• Qualitätssicherung ist notwendige Maßnahme zur Erhaltung derProduktsicherheit

• Verfahrensschritte müssen detailliert ausgearbeitet unddokumentiert sein,

• Richtlinien in „Good Manufacturing Practice (GMP)“ festgelegt.GMP ist ein Managementkonzept, enthält Maßnahmen nach demStand der Technik zur

– Sicherung der Produktqualität und des Personals einesbestimmten Hestellungsprozesses

– GMP Richtlinien verlangen Validierung der jeweiligen Verfahren, bzw.der einzelnen Schritte

Beinhaltet: dokumentierte Hygieneprogramme, Kontrollen dertechnischen Ausrüstung, geplante Inprozeßkontrollen,Überwachung des Reinheitsstatus von Räumen, Maßnahmen zurArbeitssicherheit, Einhaltung bestimmter Unit Operations, etc.

Richtlinien in übergreifenden Industrienormen (ISO 9000, 9001,9002, 9003), in Normen für den Betrieb von Qualitätskontroll-labors: EN 45001, 45002, 45003, in Kriterien für Laborzertifi-zierung EN 45011, 45012, 45013, 45014, in Guidelines der FDA

„Good Manufacturing Practice (GMP)“ Richtlinien

Definition Validierung• US Food and Drug Administration (FDA) (http://www.fda.gov/)

Guidelines on General Principles of Process Validation „...establishingdocumented evidence, which provides a high degree of assurances thata specific process will consistently produce a product meeting it’spredefined specifications and quality attributes“.

• Definition der EU: „...action of proving in accordance with the principlesof Good Manufacturing Practice, that any procedure, process,equipment, material, activity or system leads to the expected result“

• Österreich: Arzneimittelgesetzhttp://www.bmgf.gv.at/cms/site/attachments/9/9/4/CH0008/CMS1066209564174/infoblatt_einreichung_par_63_amg.pdf

• Früher wurde nur Prozeß (Verfahren) validiert, heute: geänderteSichtweise, auch von der FDA

• Einzelheiten der Verfahrensschritte und begeitende Maßnahmen (z.B.Analytik)

• niedergeschrieben in SOP’s (Standard Operation Procedures)(= Pflichtenheft) Datenblätter mit Beschreibung der Methode,verwendete Geräten, Materialien, etc.

Beispiele Kritische Punkte für Validierung:– Spezifikation der Geräte

– Bezugshinweise

– Standardsubstanzen (zugelassene Standards gemäß StraßburgerAbkommen),

– Untersuchungsmethoden,

– Nachuntersuchungsfristen u.a.m.– Analytik– Methode– Analytisches Arbeitsblatt– Probenspezifikation– Entwicklung der Methode– Validierungsaufzeichnung (Linearität, versch. Konzentrationsbereiche)– u.a.m.

Klassische Vorgangsweise Produktfreigabe• Abfassung von Protokollen (Analysen, Herstellung, Rohstoffe,

etc.)• Chargenfreigabeprotokoll• Rückstellmuster• Freigabeentscheid durch Leiter der Qualitätssicherung

Heute: Qualitätssicherung soll möglichst automatisiert ablaufenGründe:• Produktion und Analytik weitgehend automatisiert, computer-

gestützt• gestiegene Anforderungen an Qualitätssicherung (rekombi-

nante Produkte)• GMP = „hidden Plant“ (Produkt = Documents) - bis zu 70% der

Herstellungskosten Suche nach Einsparungsmöglichkeiten

Notwendigkeit der Validierung von computerisierten Produktionsanlagen

Validierung von computerisierten Produktionsanlagen• Trendwende der FDA in der Anerkennung elektronisch

gestützter Prozeßführung und Dokumentation• Software ist „Device“und daher inspektionsfähig durch FDA• Freigabeprotokolle aufgrund einer „elektronischen Unter-

schrift“ generiert• Daher Validierung von Prozeßleitsystemen notwendig

Gemäß Empfehlung der PMA (Pharmaceutical ManufacturingAssociation): Zerlegung von computerisierten Produktions-anlagen in funktionelle Einheiten

Validierung von computerisierten Produktionsanlagen

Jedes Modul einzelnvalidieren, vor Vali-dierung der Gesamt-anlage

Auch „operatingenvironment“ (off-lineAnalytik) in Validie-rung einbeziehen

Validierung von Computersysstemen = dynamischer Prozeß nach dem ‘lifecycle approach’ durchgeführt

„functional testing of hardware and software based on the specifiedperformance“,

life cycle eines neuen Systems beginnt mit• Identifikation der user requirements• Design• Integration• Qualifikation• Validierung• Maintenace• endet mit Außerbetriebnahme

Wer muß validieren: Alle Betriebe, die nach GMP arbeiten; Herstellung,Verarbeitung, Verpackung oder Haltung von Human- und Veterinär-Therapeutika oder Herstellung, Verpackung, Lagerung oder Installation vonmedizinischen GerätenVerantwortlichkeit für Durchführung der Validierung der Computersysteme:Betreiber der Anlage, bzw. End user

Validierung von computerisierten Produktionsanlagen

Allgemeine FDA Anforderungen für die Validerung von Computersystemen– Betriebssicherheit– Sicherheit gegen unbefugte oder unbeabsichtigte Eingaben– Ausreichende Dokumentation– Kontrollen integriert, dass im automatisierten Herstellungsprozeß Produkt

nach festgelegten Qualitätsstandards produziert wirdWesentliche Punkte für die Validierung von Computern• System-Definition (funktionelle Anforderungen an Soft- und Hardware)• Software Entwicklung durch qualifiziertes Personal nach

festgeschriebenen SOP’s– System Software– Konfigurierbare Software– Userspezifische Software

Validierung von computerisierten Produktionsanlagen

Validation Master Plan (Vergabe von Verantwortlichkeiten)

• Installation qualification:– establishing confidence, that process equipment and ancillary

systems are capable of consistency operating within establishedlimits and tolerances

• Operation qualification– establishing confidence, that the process is effective and reproducible

• Product qualification:– establishing confidence, through appropriate testing, that the finished

product produced by a specified process meets all releaserequirements for functionality and safety

Systempflege (maintenance) und Vorgangsweise bei Änderungen,Identifizierung von Ereignissen, die validierten Status verändern könnten,Maßnahmen zu deren Verhinderung

Ablauf eines Validierungsprojektes:

• Angaben über:– Systemverantwortlichkeit– Gebäude, Raum– Computersystem: z.B. PLS Einsatz in folg. Produktionsbereichen– Systembeschreibung: Software/Hardware Gesamtsystem,

Funktionen, Umfang, Abgrenzung zu anderen Bereichen undSchnittstellen

– Prozeß (MSR), analoge/digitale Aus- und Eingänge– Energieversorgung, Stromlaufpläne

• Beschreibung der Hardware– Beschreibung HW Ebenen, ev. vorhandene Hierarchien (Leitebene,

Feldebene),– Hardware Dokumentation (IQ, OQ, PQ, SOPs)– Leitebene: z.B. Leitrechner, Prozeßrechner, Bedienterminal,

Alarmdrucker, Protokolldrucker,Modemalarm, Scanner, Barcodereader etc.

Ablauf eines Validierungsprojektes (Fortsetzung)

• Feldebene: angesteuerte Aktoren, Schnittstellen– Datenübertragung: Physik. Einheit (z.B. Bussegment, Ethernet)– Ausführung: z.B. Kabelart, Länge, Übertragungsgeschwindigkeit,

Anzahl der Module– Übertragungsprotokoll (z.B. TCP/IP), Zugriffsverfahren,

Übertragungssicherheit

• Software– Betriebssystem: SW Leitrechner, Prozeßrechner, LAN, etc.– Konfigurierte SW, Kundenspezifische SW– Anforderungen an die Dokumentation der SW (SOP)

• Betreibermanuals, Struktogramme,• Programme (IQ, OQ, PQ, SOPs)

– SW muß auditierbar sein– Funktionen des Computersystems (verwendete SW an einzelnen

Einheiten)– Archivierung der Daten, z.B. Chargenprotokolle, Alarmprotokolle– Bilanzierungen, Statistikfunktionen, Meßdaten, Protokolleingänge,

Re-Evaluierung der Anlage

• Logistik:– Ablaufüberwachung, Freigabe, Quarantäne, Kontrollfunktion über

Abläufe, Steuerungs- und Regelfunktionen, Beschreibung desSignalflusses, Regelalgorithmen

• Beschreibung Rezepturbetrieb– Rezept = verfahrenstechnische Operation, alle Schritte zur

Produktion einer Charge, sequentiell abgearbeitet

• Prozeßbedienung– Prozeßbeobachtung, Visualisierung, Auflistung der Darstellungs-

möglichkeiten, z.B. Anlagenübersicht, Trends, Meß- undRegelkreise, Rezepturen, Alarmierung, Dokumentation

• Mengengerüst des Computersystems• Anzahl der Signale an einzelnen Prozeßeinheiten

Ablauf eines Validierungsprojektes (Fortsetzung)