Hinweis Bei dieser Datei handelt es sich um ein Protokoll ... · EinleitunK Die hier vorliegende Ausarbeitung beschäftigt sich mit dem Thema,,Proteine und Enzyme". Sie besteht aus

HinweisBei dieser Datei handelt es sich um ein Protokoll, das einen Vortrag im Rahmendes Chemielehramtsstudiums an der Uni Marburg referiert. Zur besserenDurchsuchbarkeit wurde zudem eine Texterkennung durchgeführt und hinter daseingescannte Bild gelegt, so dass Copy & Paste möglich ist – aber Vorsicht, dieTexterkennung wurde nicht korrigiert und ist gerade bei schlecht leserlichenDateien mit Fehlern behaftet.

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Dr. Ph. Reiß, im Juli 2007

Übungen im Slf,-: Experimentalvortrag

SS 97Dozenten: Butenuth, Gerstner, Perst

Proteine und EnzmeReferent:

Oliver Wißner

Oliver WißnerBeethovenstr. 11a35043 Marburg

Chemie in der Schule: www.chids.de

Inhaltsverzeichnis

Seite

1. Einführung in Funktion und Struktur der Proteine1.1 Funktion von ProteinenVersuch 1: Nachweiß von Eiweiß1.2.] Aufbau der Proteine1.2.2 Strukturebene des ProteinaufbausVersuch 2: Vorstellung der Katalase1.2.3 Denaturierung von ProteinenVersuch 3: Nachweis von Aminosäuren im Hydrolysat

22358111414

2. Enzyme 162.1 Einführung 16Versuch 4: Katalysierte Umsetzung von Hamstotfmit Urease 172.2 Das aktive Zentrum 18Versuch 5: Substratspezifität: Umsatz von Thiohamstoffmit Urease 19Versuch 6: Umsatz von HarstofI / Thioharristoff mit Urease 19Versuch 7: Umsatz einer Harnstoff / Bleiacetatlsg. mit Urease 192.3 Hemmung / Blockierung von Enzymen 202.4 Bindungsarten des aktiven Zentrums 212.5 Beeinflußung der Enzymaktivität durch ,,äußere" Faktoren 21Versuch 8: pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität 21

3. Beispiele für den Einsatz und Wirkungsweise von Enzymen3.1 Lysozym (Immunabwehr)Versuch 9: Zerstörung von Bakterien durch Lysozym3.2 Enzyme als Bestandteil von WaschmittelnVersuch 10: Filmtest für Proteasen

2323232525


=

~.

EinleitunK

Die hier vorliegende Ausarbeitung beschäftigt sich mit dem Thema ,,Proteineund Enzyme".Sie besteht aus drei Teilen, in denen auf einzelne Aspekte des Themas nähereingegangen wird.

Der erste Teil nimmt Bezug auf den Aufbau und die Struktur von Proteinen undversucht eine Vorstellung über ihre lebenswichtige Bedeutung zu entwickeln.

Der zweite Teil beschreibt die eine spezielle Gruppe von Proteinen, die Enzyme.Wirkungsweise, Funktion und Aufgaben der enzymatischen Katalyse werdenhier Schwerpunkte sein.

Der dritte Teil versucht an Hand von Beispielen die Inhalte aus den beidenvorangegangen Teilen zu erläutern und zu vertiefen.


1. Einfühnmg in Funktion und Struktur der Proteine

,Protein - ein Wort von Jöns J. Berzelius im' Jahre 1836 geprägt, um dieWichtigkeit dieser Stoffgruppe zu betonen.Es stammt vom griechischen Wort proteios und bedeutet soviel wie "an ersterStelle" .

Mit diesen Worten beschrieb J.J. Berzelius den Umstand, daß Proteine eineentscheidende Rolle in praktisch allen biologischen Prozessen spielen.Die folgende Übersicht soll einen Einblick in ihre komplexen Funktionen undEinsatzgebiete verschaffen. Es sollte deutlich werden, daß das Leben so wie wires kennen ohne sie nicht möglich wäre.

1.1 Funktion von Proteinen

1. Enzymatische Katalyse.~_ • Alle bekannten Enzyme sind Proteine. Sie "katalysieren alle chemischen

Reaktionen in biologischen Systemen, wobei einige dieser Reaktionen relativeinfach strukturiert sind, andere hingegen hochkompliziert. Sie spielen eineeinzigartige Rolle bei der Auswahl der chemischen Umsetzungen.Der zweite Teil dieser Ausarbeitung wird sich ausfiihrlicher mit dem Themader Enzyme beschäftigen.

2. Transport und Speicherung• Viele kleinere Moleküle und Ionen werden durch spezifische Proteine

transportiert.Hämoglobin, Sauerstoffträger im Blut, und Myoglobin, Sauerstoffträger imMuskel sollen an dieser Stelle als Beispiel dienen. '

3. Koordinierte Bewegung\~ • Kontraktionen des Muskelgewebes werden durch gleitende Bewegung zweier

.Arten von Proteinfilamenten (Myosin und Aktinin) ermöglicht, IhreAuswirkungen sind direkt durch Entstehung von Bewegung durch muskuläreVerkürzung wahrnehmbar. Im mikroskopischen Bereich werden z.B.Vorgänge wie die Bewegung von Chromosomen während der Mitoseebenfalls durch aus Protein bestehenden kontraktilen Systemen veranIaßt.

4. Mechanische Stützfunktion• Die hohe Zugfestigkeit von Haut, Bindegewebe und Knochen wird durch das

Vorhandensein von Kollagen, einem Faserproteine gewährleistet.

5. Immunschutz


• In. diesem Zusammenhang sind die Antikörper als hochspezifische Proteine,die Fremdsubstanzen wie Viren, Bakterien und Zellen von allderenOrganismen erkennen und diese binden können, zu nennen.Proteine spielen somit eine vitale Rolle bei der Unterscheidung .zwischen

· " d fr d'"eigen un " em .

6. Erzeugung und Übertragung von Nervenimpulse• Die Kommunikation zwischen Nervenzellen unterschiedlicher Art wird durch

spezifische Reize an bestimmte Rezeptorproteine vermittelt. Das Acetylcholinstimuliert z.B. RezeptormoJeküle, die verantwortlich sind für die Übertragungvon Nervenimpulsen an den Synapsen.

7. Kontrolle des Wachstums und der Differenzierung• Die kontrollierte Folge der Expression von genetischer Information ist für

ordnungsgemäßes Wachstum und die Differenzierung von Zellenunabdingbare Voraussetzung. Beispiele, die an dieser Stelle zu nennen wären,sind die Repressorproteine, welche spezifische Segmente der DNA einer Zelle

~! stillegen können und der Nervenwachstumsfaktor, der die Kopplung vonNerven zu Verbundsystemen im höheren Organismus steuert.

Der folgende Versuch· 1 soll den Nachweiswon Eiweißen in tierischenOrganismen auf einfache Weise demonstrieren. Er dient gleichzeitig derEinführung und der Erläuterung von typischen Eigenschaften der Proteine,

Versuch 1: Nachweis von Eiweiß

Versuchsbeschreibung 1a) Eiweiß als Bestandteil von Fleisch

Chemikalien:ca. 60g ungewürztes gehacktes Fleisch, 150 ml dest. Wasser.

Geräte250 ml Becherglas, Glastrichter, Rundfilterpapier, Bunsenbrenner,Demonstrationsreagenzglas, Stativklammer, Stativ.

DurchführungDas Gehackte wird in das Becherglas gegeben und mit 150 ml dest. Wasserversetzt und vermischt. Der sich so bildende Brei bleibt tue ca. eine halbe Stundestehen, anschließend wird das Wasser abfiltriert,Das so gewonnene Filtrat wird nun in eine Demonstrationsreagensglas überführtund im Bunsenbrenner und Schütteln gelinde erwärmt,

ErgebnisUnter Einwirkung der Bunsenbrennerflamme beginnt nach kurzer Zeit emweißer Niederschlag auszufallen, Die Proteine koagulieren.

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ErklärungAlbumine und Globuline des Fleisches sind wasserlöslich und gerinnen beim

-0 Erhitzen, Die Eiweiße denaturieren. Als Albumine werden Proteine bezeichnet,die in tierischen Flüssigkeiten vorkommen. Protein von kugeliger Gestalt, dieBestandteil des Blutes sind, werden als Globuline angesprochen.Koagulation: die ursprüngliche hochgeordnete Raumstruktur wird in eineungeordneten Zustand überführt. Die Peptidkette entfaltet sich, da sichstabilisierende Bindungen lösen. Werden dabei Gruppen reaktiv, welche zuvorin der Faltstruktur neutralisiert oder "maskiert" waren so verliert das Proteinseine Löslichkeit, bzw. seine biologische Aktivität.

Versuchsbeschreibung 1b) Die XanthoproteinreaktionBei der Xanthoproteinreaktion wird der Benzolrest dreier Aminosäuren, dieBestandteil eines jeden Eiweißes sind, notriert, Es entsteht ein gelbes bis orangesReaktionsprodukt, das als qualitativer Nachweis dient.

Chemikalien150 ml konz. lINO), weiße Schwanenfeder, dest. Wasser. -

GeräteKristalisierschale, Pipette, Handschuhe, Pinzette, Wasserflasche

DurchführungDie weiße Schwanenfeder wird in die Kristalisierschale gelegt und mit konz.HN03 beträufelt. Nach einigen Minuten hat sich die Feder deutlich gelb verfärbt.Sie wird nun vorsichtig mitdest. Wasser gespült und anschießend vorgeführt.

ErklärungNitrierung:Herstellung des elektrophilen Teilchens: Autoprotolyse der lIN03

lIN03 + HN03 => N02+ + H20 + N03•

Nitroniumion


coo+ I3HN-C-H

ICH2

COO·

+ I3HN-C- H

C~2

COO

+ I3HN-C-H

ICH2

H

Phenylalanin

OH

Tyrosin Tryptophan

o

Nitrierung des Benzolrings

H 0

I 0-ooC-C-CH2-~ !I P

INH3+

1.2.1 Aufbau der Proteine

HI

- ...... ·OOC-C-CH2

INHt

Die Proteine sind aus 20 Arten von Aminosäuren aufgebaut. Aus diesem Grundwerden sie auch als die Grundbausteine bezeichnet. Die Aminosäuren stellendas Alphabet des Lebens dar und ist ca. 2 Millionen Jahre alt.Die einzelnen Aminosäuren unterscheiden sich in: '

• Größe• Gestalt• Wasserstoffbindungsfähigkeit• chemische Reaktivität

Bei pH 7 liegen die Aminosäuren als Zwitterionen vor, das heißt, daß dieAminogruppe protoniert und die Carboxylgruppe der Aminosäure deprotoniertvorliegt.


Der Dissoziationsgrad ändert sich mit dem pH. Dieser Effekt gilt auch für die inden Seitenketten enthaltene funktionellen Gruppen, so daß jede Aminosäure an

: bestimmten pH-Werten ihre typische Ladungen ausprägen.

COOH

IH2N-C-H

IR allgemeine Schreibweise einerAminosäure

L·llOm .... I 0·110m.... ,

Absolute Konfiguration der L- und D-Isomeren von Aminosäuren

Überfiihrung in Keilstrich und anschließend in Fischer - Projektion:

coo. +

R- C -NH3

L -Isomer

COOFischerprojektion I------...~ R-C-NHt

~

~+R-C -NH3

C I a

H

S - Konfiguration

L - Konfiguration


Aminosäuren Zwischenmolekulare Kräfteohne polare Gruppen (aliphatische & aromatische Reste)

Lysin (Lys)Arginin (Arg)

Alanin (Ala) R= -CH3

Valin (Val) R= -CH(CH3)2

Leuein (Leu) R= -CH2CH(CH3) 2

Isoleuein R= -CHCH2CH3(S)

ICH3

Phenylalanin (Phe) R=. -CH2C6Hs

COOH

Prolin fIN + H (Pro)

~H2

mit HydroxylgruppenTyrosin (Tyr) R= -CHZC6H.OH

Senn (Ser) R= -CH20 HThreonin (Thr) R- -CHOH

-. CH 3

mit weiteren Aminogruppeno

Asparagin (Asn) R= -CH2CNH2

Glutamin (GIn) R= -CH2CH2CNH2

oR= -(CH2)4NH2R= -(CH2)3NHCNH2

o

Van der Waals 'Kräfte

elektrostatische Wechselwirkungen\ Wasserstoff-Briicken-Bindungen

elektrostatische WechselwirkungeilWasserstoff-Brückenbindungen

Tryptophan (Trp) R=

-c~H

Histidin (His) R- -CH2

ljHmit Mercapto- oder SulfidgruppeIlCystein (Cys) R= -CH2SH

Methionin (Met) R= CH2CH2SCH3

Aminosäuren mit CarboxygruppenAsparaginsäure (Asp) R= CH2COOH

Glutaminsäure (Glu) R= CH2CH2COOH

elektrostatische WechselwirkungenAtombindung (Disulfidbtndungen)

elektrostatische Wechselwirkungen


1.2.2 Strukturebene des Proteinaufbaus

1. PrimärstrukturCharakteristische AminosäuresequenzDie Aminosäuresequenz ist das Bindeglied zwischen der genetischen Botschaftder DNA und der dreidimensionalen Struktur, welche die Grundlage derbiologischen Funktion des Proteins darstellt.

@-@)-C@)-@ -@D2. SekundärstrukturDie Sekundärstruktur bezieht sich auf sterische Wechselwirkungen derPeptidgruppe. Alle CO und NH-Gruppen der Hauptkette sind anWasserstofibrückenbindungen beteiligt, was zum Auftreten einer periodischenStruktur führt. Die a-Helix und die ß-Faltblattstruktur sind Beispiele für dieSekundärstruktur.

Peptidbindung

H:O H: H:o H1 ,'11 I: I I. 11 I

NH2-C-+-C-N ~C-+-C-NI I I I I

CH3 CHOH

JH3

i: ...I

Alanin Threonin

" I T t-C-N- .. ~ -C==-N-

partieller Doppelbindungscharakter

Peptid gruppe

,.

Abbildung 1: Peptidgruppe


Die Peptideinheit ist als starr und planar einzuordnen. Der Wasserstoff dersubstituierten Aminogruppe hat fast immer trans-Position in Bezug auf denSauerstoff der Carbonylgruppe. Freie Rotation um die Bindung zwischen demC-Atom der Carbonylgruppe und dem N-Atom der Peptideinheit ist nichtmöglich, weil diese Bindung partiellen Doppelbindungscharakter besitzt. ImGegensatz dazu ist die Bindung zwischen dem a.-Kohlenstoff und demCarbonyl-Kohlenstoff-Atom eine reine Einfachbindung. wie auch diejenigezwischen dem 0.-Kohlenstoffatom und dem Stickstoffatom. Die Rotationsfreiheitist somit groß um die Bindung, die beiderseits von der starren Peptideinheitausgehen.

I .II

@Abbildung 2: Modell einer rechtsgängigen a.-Helix .

'i7 •

Ausbildung zweier periodischer Strukturen:die Alpha-Helix und die Beta-Faltblattstroktllr

~~~~~~.4I~~~~~~'.,A:1W'~• ö Ö . 9

: r.~~ ]: ~~~ : ~ , 1--7~ 8 ' Ö006

Abbildung 3: Antiparallele ß-FaltblattstruleturDie ß-Faltblattstruktur unterscheidet sich wesentlich von der a.-Helix, indem siemehr platten- oder stabförmige Gestalt besitzt. Die Polypeptidkette der ßFaltblattstruktur ist fast völlig gestreckt. Weiterhin erfolgt die Stabilisation derStruktur durch die Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen verschiedenerPolypeptidstränge. Benachbarte Stränge können in dieselbe (parallel) oderentgegengesetzte (antiparallel) Richtung laufen.


Ca. = Chirales C-Atom

TertiärstrukturDie Bezeichnung Tertiärstruktur bezieht sich auf die sterischenWechselwirkungen von Aminosäureresten, die innerhalb der linearen Sequenzweit voneinander entfernt sind. Die Trennungslinie zwischen Sekundär- undTertiärstruktur ist willkürlich.Die Bindungsarten, die hierbei auftreten können sind unterschiedlicherArt und sollen kurz angesprochen werden: - -- "-- . . ~ - -~"-. '. .11a) kovalente Bindungen .'b) elektrovalente Bindungenc) WasserstofIbrückenbindungend) Van der Waal'sehe Kräfte

Quartärstruktur ~

Bei Proteine, welche aus mehr als einer Polypeptidkette bestehen trittein weiteres Struktunnerkmal, das als Quartärstruktur bezeichnet wird,


auf Sie sagt etwas darüber aus, wie die einzelnen Ketten (protomere)in einem solchem Proteinverband zueinander angeordnet sind.

Proteinkomplex aus Protomeren (Hc.:..""" cl'<;>/;;.' t.-7 )

Versuch 2: VorsteUung eines lebenswichtigen Enzyms im Blut:die Katalase:

Chemikalien2 ml Wasserstoffperoxidlösung, 100 ml RinderblutGeräte500 mI Becherglas, Pipette

DurchführungIn einem Becherglas werden 100 ml Rinderblut vorgelegt und anschließend mit2 ml H202 versetzt.An den Eintropfstellen bildet sich ein weißlich-rosa Schaum. Der entweichendeSauerstoffbeginnt das Blut aufzuschäumen.

Wasserstoffperoxid wird in bestimmten Zellorganellenals Zellgift gebildet.Das Enzym Katalase übernimmt die lebenswichtige Funktion dieses Giftabzubauen und den Organismus vor Schaden zu bewahren.

Abbau von H202 im Organismus

2 H202 .. ·2 H20 + O2 + 196.2 KJBei Zimmertemperatur ist die Zerfallstemperatur unmeßbar klein.

Die große Zerfallshemmung von H202 beruht darauf: daß der erste Schritt derH:O:-Thermolyse in einer energieaufwendigen Molekülspaltungen zwei HORadikale besteht. Letzteres setzt sich dann unter Auslösen einerRadikalkettenreaktion weiter mit H20,! um


(HO (HydroylradikaI) + H202 .. H20 + H02 (Perhydroylradikal)H02 + H202 • H20 + O2+ HO).

Die Katalase hierbei als Biokatalysator (s. u.), wodurch dieZersetzungsgeschwindigkeit des Wasserstoffs stark erhöht wird.

Der Wasserstoffperoxidzerfall durch Katalase erfolgt nach dem Haber-WeissMechanismus:

+111[Fe(HzO)6]2+ + HzOz

Kette:

+11----... [Fe(HzO)sOQH]2+ + H30 +

+11[Fe(H:P)6]2+ + H30+

+ HOOH +111[Fe(H20 )6]3+ + .OH

+ HOOH +111• [Fe(HzO)6]3+ + HOOe

. +11---. [Fe(HzÜ)6]2+

- 02, - Ir

Das hier beschriebene Eisenatom befindet sich in dem Hämoglobinkomplex desBlutes gebunden. Die Katalase verdrängt einen H20 - Liganden in diesemKomplex, wodurch ein neuer, stabilerer Komplex ensteht. Dieser neue Komplexkann als Enzyrn-Substrat-Komplex betrachtet werden, der nun denWasserstoffperoxidzerfall beschleunigt. Die Reaktion an sich verläuft ansonstengenauso wie oben beschrieben.


16

Protein

t NH

H, /H H, /H N)(His)

0 0

H20 . 1 ... OHz R2N . I ... NRz R2N. I.NR2. .

- - - - -Fe (111) Fe (111) Fe (111)

1 \ 1 \ . 11

\NHzO 10Hz RzN 1 NRz R2N R2

0 0 0H/ 'H H/ 'H H/ 'H

:

t <:»!

+H2Ü 2 +H2Ü 2 +H2Ü 2

-H3O+ - H3O+ -H3O+

Protein

H'O/H

HzO.. I .: OHz-. .:

Fe (111)

1 \HzO 1 0 Hz

o-,OH

Fe::--Aquokornplex

kkat ~ 10~2 molls'

H, /Ho

RzN ... I .... NRz

- -Fe (111)

1 \RzN I NRz

o

"'OH

Häm

(His)

Fe (111)

1 \RzN 1 NRz

O"'OH

Katalase

kkat z 108 molls"

t~l:1Wf - .t,~6«-t-.Kc"'r~X'


~- -

1.2.3 Denaturierung von ProteinenDie Denaturierung von Proteinen wie sie oben bereits beschrieben worden istkann auf verschiedene Art und Weise geschehen und zu unterschiedlichenErgebnissen führen.Eine Denaturierung der dreidimensionalen Raumstruktur durch Wärme kanndurchaus reversible erfolgen. Jedoch eine Zerstörung der Struktur durchAuflösung der Primärstruktur der Aminosäuren durch Säure geschiehtirreversible.• Säure / Lauge• Temperatur• Oxidationsmittel

Versuch 3: Nachweis von Aminosäuren im Eiweißhvdrolvsat mit Hilfe derDC und Ninhvdrin.Im Rahmen dieses Versuches sollen die "Bausteine" der Proteine mit Hilfe derDC getrennt und mit Ninhydrin nachgewiesen werden.Aus diesem Grund wurde ein Hühnereiweiß mit 0,1 m Salzsäure versetzt in eineAmpulle eingeschlossen und für 48 h bei 11QOC inkubiert.Das so gewonnene Eiweißhydrolysat (das Protein ist vollständig denaturiert)enthält nun die aufgespaltenen und freien Aminosäuren des Proteins.

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GlJciI ,-Ianin Gria Vitia lAcin15 1'1 111'1 SIll'! Sill S",

Abb.6:Dünnschichtchromatographie

\......-/ChemikalienMerck-Ninhydrinlösung, Lösungsmittel Chloroform: konz. NB3 : Butanol (3 : 3: 1)

GeräteFließkammer, DC-Folien, Pinzette, Trockenschrank, Fön.

DurchführungAuf eine DC-Karte werden 8 verschiedene AS aufgetragen, eine Mischung ausallen acht und einen Punkt des Hydrolysats. Die aufgetragenen Punkte werdenmit dem Fön gewissenhaft getrocknet, um Verwischungen zu vermeiden.Anschließend wird die Folie für ca. 2h in die Fließkammer gestellt. Nachdem dieoberste Fließmittelfront ermittelt worden ist, wird die Folie mit dem Fön kurz


getrocknet und mit Ninhydrin besprüht. Die Reaktion und Entwicklung erfolgtdurch endgültige Trocknung im Trockenschrank (110°C).Die so kenntlich gemachten AS des Hydrolysats können so qualitativ mit denenzum Vergleich aufgetragenen, bekannten AS verglichen werden.Die Adsorptionschromatographie bedient sich der Unterschiede der AS in denAdsorptionskräften. Diese stellen sich aus den unterschiedlichen Eigenschaftender Aminosäuren dar (s.o.),Die Bindungskräfte der stationären Phase wechselwirken nun mit den AS diesich in der mobilen Phase des Lösungsmittels befinden, wodurch diese im Laufedes Durchtritts aufgrund der verschiedenartigen Verteilung in den I Phasen(Nernt'scher Verteilungssa1z) getrennt werden.Der endgültige Nachweis der einzelnen AS wird durch das Ninhydrin-Reagenzgeliefert.

Nachweis der Aminosäuren mit Hilfe von Ninhydrin:

1,2,3- Indartrion

o -1,,2,3.- lndantrion - Hydrat

(Ninhydrin) ,

OH

OH

+ R --c H --COOH

INH2

-H20..

-N-CH-COOH

~

",COOHN -=-C- 'R

Hydrotyse ...

- CO 2NH 2

NH 2 +OH

OH

blauer Farbstoff


2. EnzymeIn diesem zweiten Haupteil dieser Arbeit wird sich mit einem Unterkapitel derProteine eingehender befaßt, um deren Wichtigkeit und Wirksamkeitverständlich zu machen.

2.1 EbütihrungChemische Reaktionen in Abwesenheit eines Katalysators kommen In

biologischen Systemen kaum vor.Die Enzyme sind Biokatalysatoren mit bestimmten Eigenschaften:• hohe katalytische Aktivität• hohe Spezifität• Enzymaktivität ist regulierbarManche dieser Enzyme sind direkt an der Umwandlung von verschiedenenEnergieformen beteiligt.

Bsp.Umsetzungen im biologischen System, die ohne Enzyme kaum möglichwären:

• Atmung:Carboanhydrase: Hydratisierung von CO2

CO2 + H20 => H2C03 · --

=> Transfer von CO2 aus dem Gewebe ins Blut

• Ab-, Um- und Aufbau von MolekülenDNAse

• Abbau von HarnstoffUrease

Enzyme als Biokatalysator• wandeln verschiedene Energieformen ineinander um (ATP Verbrauch

Aufbau bei der Muskelkontraktion)• beschleunigt die Einstellung des Reaktionsgleichgewichtes• erniedrigen die Aktivierungsenergie ._,~ ->. .•

(' \ Unkatalysiert-I

I ~ I

\ />:; " \Q) / \

"5, i \

~ /K' . \w I ata vsiert "CI) ./ ••-. \

"ä; I "

~ SUbs~at \\

und

ProduktB _ProduktAL....-_------

Reaktionsverlauf Reaktlonsverjauf •

~ G'" = GObergangszustand -G.,ubstr3t

Abbildung 7: Katalysewirkung der Enzyme


Enzyme beschleunigen Reaktionen um Faktoren von wenigstens einer Millionen.In ihrer Abwesenheit würden die meisten Umsetzungen nicht in wahrnehmbarenUmfang ablaufen.

Versuch 4: Katall'sierte Umsetzung von Harnstoffmit Hilfe von Urease

Chemikalien50 ml 1 % HarnstoffIlösung, 2 ml Ureaselösung (200mg in 100ml Wasser), 50ml H2ü , BTB als Indikator.

GeräteDemonstrationsreagensglas, Stativ, Glasstab, Pipette, Wasserflasche.

DurchführungIn dem Reagenzglas werden 50 ml der Harnstofflösung + 50 ml H~ eingefülltund mit 2ml einer BIB -Indikatorlösung versetzt. Die Lösung färbt sich gelb(saurer pH-Bereich). Nach der Zugabe der Harnstoffllösung beginnt sich die

"--/ Lösung blau zu verfärben (alkalischer pH-Bereich).

Die Umsetzung erfolgt nach dem Carbamidsäure-Mechanismus:

Voraussetzung: Bildung eines Enzym-Substrat-Komplexes

\

'----'

E + S -4---....~ ES -----+-E+P

Edukteu

'[0 IL ÄH~I

::JI

.11

adsorbiertesProdukt

R~;l~tiunswc;;

NfA..= Reaktionsenthalpie

E~ = Aktivicruugscnergi« ,kr Adsorptioll bzw. Desorption

E, F:.... = A~1il'it:rIlIl~.rI!IIt!rgit! der katalysierten bzw. lIichtkJf<i~l'si.:rtl·1I R.:ak:iIJII

T

I~HR, Produkte

l.~H~

Abb. 8: Energiediagramm für Reaktionen mit und ohne Katalysator


Die Enzyme verschieben die Gleichgewichte nicht sondern setzen wie auch indiesem Fall die Aktivierungsenergie der Reaktion herab.Für die oben beschriebene Reaktion bedeutet dies, daß die Umsetzung bereitsbei Raumtemperatur geschieht.

2.2 Das aktive ZentrumDas aktive Zentrum eines Enzyms ist die Region, welche das Substrat bindetund gleichzeitig diejenigen Aminosäurereste bereitstellt, die direkt am Trennenund Zusammenfügen von Bindungen teilnehmen.Die aktiven Zentren der unterschiedlichen Proteine zeichnen sich durch einigeGemeinsamkeiten aus: .

I. Das aktive Zentrum macht nur einen relativ kleinen Teil des Enzyms aus.2. Es stellt eine dreidimensionale Einheit dar (siehe Lysozym).3. Die Substratbindung an das Enzym erfolgt durch relativ schwache Kräfte.4. Die aktiven Zentren sind höhlen- oder spaltenförmig,5. Die Bindungsspezifität ist von der definierten Anordnung der Atome im

aktiven Zentrum abhängig.

Die Eigenschaften von aktiven Zentren:Zwei Modellvorstellungen.

.R· :,. ~. _. 1 . -. 0: _._ --' .' •__ .' . __"

ES·Komplex

>

~. -..,

-1":... " .-

. .

Schüssel - Schloß - Modell

Substrat +,I

\

II

IDas aktive Zentrum des Enzyms hat eine dem Substrat komplementäre Gestalt. '

Induced - fit - Modell

~ab C

ES·Komplex

)

+Substrat

Das Enzym verändert sich bei der Substratbindung. Das aktive Zentrum hat diedem Substrat komplementäre Gestalt erst nach der Bindung des letzteren.


Versuch 5: Substratspezifität Umsatz von Thioharnstoff mit Urease

Chemikalien50 ml I % Thiohamstotllösung, 2 ml Ureaselösung (s.o.), BTB-Indikatorlösung.50 ml H20

GeräteDemonstrationsreagenzglas, Glasstab, Pipette, Stativ.

DurchführungDie Thiohamstotllösung wird in das Reagenzglas gefüllt und mit derIndikatorlösung versetzt. Die Flüssigkeit färbt sich gelb. Nach. Zusatz derUreaselösung tritt keine Farbänderung ein. Der Thioharnstoff kann nicht durchdie Urease umgesetzt werden.

Versuch 6: Umsatz einer Harnstoff I. Thioharnstoff - Lösung mit Urease imVergleich mit einer Harnstofllösltng.

Chemikalien2 x 50 ml 1% Harnstofflösung, 50 ml 1% Thioharnstofflösung. 50 ml H~, 2 mlUreaselösung, 2 ml BTB-lösung.

Geräte2 Demonstrationsreagenzgläser, Glasstab, Stativ, Pipette, 2 x 2 ml Spritzen.

Durchfiihrung .:In das erste Reagenzglas werden 50 ml Harnstofflösung + SO ml H20 eingefülltund mit 2 ml BTB-Iösung versetzt. In das zweite werden 50 ml Hamstofflösung+ 50 ml Thioharnstofflösung gefüllt und ebenfalls mit 2 ml BTB-lösung versetzt.Beide Lösungen färben sich gelb.Nun werden gleichzeitig in beide Reagenzgläser je 2 ml Urease zugegeben.Nach einiger Zeit färbt sich die reine Harnstofllösung blau, während dasGemisch aus Harnstoff / Thioharnstotllösung sich langsamer blau verfärbt,

Erwartung? :::) Kompetetive Hemmung .Bei diesem Versuch handelt es sich um die Demonstration einer kompetctivenHemmung, die im weiteren Verlauf dieser Ausarbeitung näher erläutert werdenwird.

VerSllch 7: Umsatz einer Harnstoff/ Bleiacetat - Lösung mit Urease

Chemikalien50 ml 1~/o Harnstofflösung, 50 ml H20 , kleine Spatelspitze Bleiacetat, 2 mlBTB-Lösung, 2 ml Ureaselösung


v -

. !'-,.:

GeräteDemonstrationsreagenzglas, Pipette, Glasstab, kleiner Spatel.

DurchführungIn das Reagenzglas wird die Harnstoffiösung + H20 eingefüllt, mit 2 ml BTBLösung versetzt . Die Flüssigkeit färbt sich gelb. Nun wird wenig Bleiacetathinzugegeben und anschließend Ureaselösung. Eine weitere Verfärbung bleibtaus. Die Blei-Ionen besetzen das aktive Zentrum der Urease wodurch ein Abbaudes Harnstoffes nicht mehr möglich ist.Der Mechanismus dieser Hemmung erfolgt nach dem der nicht-kompetetivenHemmung (s.u.).Erwartung? => Nicht-kompetetive Hemmung

2.3 Hemmung I Blockierung von EnzynlenIm folgenden soll auf die qualitativen Unterschiede im Mechanismus derverschiedenen Hemmungstypen eingegangen werden und entsprechendeModelle vorgestellt werden.

1. Kompetitive Henunung

• reversible Hemmung durch eine schnelle Gleichgewichtseinstellung zwischenEnzym und Inhibitor. .

• der kompetitive Inhibitor wird vom aktiven Zentrum gebunden.• er vermindert die Katalysegeschwindigkeit.

2. Nicht - kompetitive Hemmung

• reversibel• Inhibitor und Substrat werden gleichzeitig gebunden.• nicht-kompetitiver Inhibitor wirkt durch die Erniedrigung der Wechselzahl

eines Enzyms.

Blockierung eines Enzyms

• irreversibel• aktives Zentrum wird blockiert

Substrat

(

f!JKompetitiver Substrat

Inhibitor {

I Nichtkompet itiver(li[\ Inhib itor ~G

~"-@Abbildung 9: Unterschied zwischen einem kompetitiven und einem nichtkompetitiven Inhibitor.

zoChemie in der Schule: www.chids.de

'~.

2.4 Bindungsarten des aktiven Zentrums

Reversible molekulare Interaktionen in biologischen Systemen werde durch dreiArten von Kräften vermittelt:

a) elektrostatische Bindungen (gel.Substrate, Coulombsches Gesetz)b)Wasserstoff-Brücken-Bindungen (2 Atome teilen sich einH-Atom)c) Van der Waals-Bindungen (sterisch komplementäre Strukturen)

Eine wichtige Komponente in der Ausbildung dieser Kräfte, ist die exakteAusrichtung der Wirkungsrichtung dieser Kräfte.Viele Substrate werden, obwohl ungeladen, trotzdem mit hoher Affinität undSpezifität an Enzymen gebunden.Hier treten die charakteristischen Wasserstoflbrückenbindungen auf Einewichtige Eigenschaft dieser Bindungsart ist ihre Bindungscharakteristik. Derstärkste Zusammenhang ist dann gewährleistet, wenn Donor, Akzeptor- undWasserstoffatom auf einer Linie angeordnet sind.

2.5 Beeinßussung der Enzymaktivität durch "äußere" Faktoren

• pH- Abhängigkeit

• Medium• Temperatur

Die drei genannten Faktoren nehmen Einfluß auf die zwischenmolekularenKräfte, die zwischen dem aktiven Zentrum und dem Substrat wirken.Das Medium Wasser z.B. setzt mit seiner hohen Dielektrizitätskonstante dieStärke der elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen anderen (polaren)Molekülen und Ionen , wogegen es die Wechselwirkungen zwischen unpolarenMolekülen verstärkt, herab. . .Die pH-Abhängigkeit erklärt sich aus den unterschiedlichenDissoziationskonstanten der einzelnen funktionellen Gruppen, so daß bei einerbestimmten Umgebungs-pH die entsprechenden Gruppen ionisiert oder neutralvorliegen. Dies hat natürlich einen großen Effekt auf die Stärke und Art derAusbildung der intermolekularen Kräfte (z.B, Ionen- oderWasserstoflbrückenbindungen).

Versuch 8: pH- und Temperaturabhängigkeit der EnzvmaktivitätDieser Versuch soll die pfl-Abhängigkeit des Verdauungsenzyms Pepsinverdeutlichen, indem bei verschiedenen pH-werten die gleiche Reaktiondurchgeführt werden soll.

Aufgabe des Pepsin:Die "Eiweißverdauung" ~ Hydrolyse von Esterverbindungen


i

CH3 : 0 H: H

1 : 11 I: IH2N- C -+ C - N -+-C - COOH

I : IH ---- ---- H

Alanin

Peptid

Glycin

Hydrolyse...

CH3 0

I 11H2N-C-C-OH

IH

Carboxylkomponente

H 0

I 11H2N-C-C-OH

IH

ArninokoFt:Jponente

Chemikaliengekochtes Eiweiß, 3 x 50 ml Wasser, verd. Salzsäure, Pepsin

Geräte'0- 3 Demonstrationsreagenzgläser, Stativ, Wasserflasche, Tropfflasche, pH-Papier,

Glasstab

DurchführungIm ersten Reagenzglas befindet sich Eiweiß mit SO ml Wasser und Pepsin.Im zweiten Reagenzglas befindet sich Eiweiß mit 50 ml Wasser und verd..Salzsäure.Im dritten Reagenzglas befindet sich Eiweiß mit SO ml Wasser, verd. Salzsäureund Pepsin. - ., -.Um das Temperaturoptimum zu nutzen und somit einen entsprechenden Umsatzder Reaktion, empfiehlt es sich bei ca 37°C Wassertemperatur zu arbeiten.In Glas 1 wird keine Reaktion eintreten.In Glas 2 wird nur sehr langsam eine Reaktion einsetzen (-einige h),In Glas 3 wird nach einigen Minuten eine Reaktion sichtbar. Es stellt sich eine

~/ Trübung des Wasser ein. Das Eiweiß wird durch das Pepsin gespalten.In diesem dritten Glas kann das Enzym in seinem pll-Optimum operieren undwird somit seine höchste biologische Effektivität erreichen.

Aktivität und Effektivität der Wechselwirkungsmöglichkeiten des aktivenZentrums:• die angesprochenen Gruppen liegen durch ihren pK-Wert beim

entsprechenden pH-Wert der Umgebung günstig ionisiertvor.• Wasserstoff-Brückenbildung• Tertiärstruktur ist ebenfalls pH und Temperatur abhängig.• Wasser schwächt polare Wechselwirkungen (Bsp.: Eo)

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1,0

relativeEnzymaktivität

0,5

Pepsin

---------------------------------------------~

2 4 6 7 8 9 10 11 12 pH

plf-Optimum für Pepsin: 1,8

3. Beispiele für den Einsatz und Wirkungsweise von EnzymenDer dritte Teil dieses Votrags widmet sich dem Bereich der technischenAnwendung von Enzymen an Hand von zwei Beispielen: dem Lysozym, alskörpereigenes Immunenzym in seiner Vewendung. in derArzneimittelanwendung und der Verwendung von Proteasen und Amylasen inWaschmitteln. .

3.1 Lysozym (lmmunabwehr)

Abbildung 11 :Aminosäuresequenz von Lysozym

Versuch 9: Zerstörung von Bakterien durch das Enzvm LvsoZVm.In diesem Versuch soll die Wirkung von Lysozym auf Bakterien demonstriertwerden.

Chemikalien und Geräte1 AgaAga- Platte mit angezüchteten Bakterius subtilus Stämmen,

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1 AgaAga- Platte mit angezüchteten Bakterius subtilus Stämmen und ememTropfen konzentrierter Lysozym-Lösung.

DurchführungDie beiden Platten sind bereits einige Tage vor dem Versuch entwickelt worden,so daß die Stämme genügend Zeit hatten zu wachsen.Demonstriert wird zum Einen die Platte mit dem ungestörten Wachstum derBakterien und zum Anderen die andere Platte mit einem durch das Lysozymentstandenen Lysehof da dort die Stämme durch das Enzym zerstört wordensind.

Wirkungsweise: Das' Enzym hydrolysiert die glykosidische Bindung zwischenCl von MNAc und C4 von GlcNAc.

CHzOH CHzOH \

~0"'n V:-~y :H~~

N-H N-HI !

o=c o=cI ICH) CH)

GlcNAc MNAc

Abb. 12: Hydrolyse des Polysaccharidanteil der Bakterienzellwand.

Mechanismus der Lyse erfolgt in 2 Schritten

. AspC ---: 52

0----+ --::::-:--l /

,Glu L c! 3 5 ~ '"o

0, r--:---:'·C~ ASP

1' : 52-0

Abbildung 14: 1. Schritt des katalytischen Mechanismus


H-

-:1_' 0I Glu I C

~ 00,

" Asp: ~/c- 52 :-0 --t

D O\:-GTIsp I/ 52

-0

-Abbildung 15: 2.Schritt des katalytischen Mechanismus

Ablauf der Lyse:Die Caroxylgruppe von Glutaminsaüre 35 gibt ein Ir an die Bindung zwischenCl des Rings und dem glykosidischen Sauerstoffatom und Spaltung derselbenab. Es ensteht ein Carbeniumion. Die heiden Ringe trennen sich. DasCarbeniumion reagiert mit OH- des Lösungsmittels.

'---'-- Glutamin 35 wird durch Ir aus dem Lösungsmittel protonisiert, womit dasEnzym für einen neuen Katalysevorgang bereit ist,

Enscheidende Element in dem Katalvseschema: .- 1. Allgemein und saure Katalyse (Glutaminsäure 35).

I 2. Förderung der Bildung eines Carbeniumions als Intermediärprodukt durchzwei Faktoren:a) elektrostatische Faktor, der durch die Anwesenheit einer negativ geladenenGruppe (Asparaginsäure 52).b) geometrischer Faktor, beim Bindungsprozeß drängt das Enzym das Substratdie Geometrie des Übergangszustandes anzunehmen.

3.2 Enzvme als Bestandteil von Waschmitteln

~" • biologische Abbaubarkeit• größere Effektivität bei niedrigeren Waschtemperaturen

Viele Feinwaschmittel (-60°C) enthalten als Bestandteile Proteasen wie

Versuch 10: Filmtest für Proteasen

ChemikalienWaschmittel Burtil ohne Enzyme, Waschmittel Persil mit Enzymen, belichteterund entwickelter, jedoch unfixierter Röngtenfilm.

Geräte2 Magnetrührer, 2 Rührfische, 700 ml Wasser, Pinzette.


DurchfühnlngIn zwei 500 ml Bechergläser wird jeweils ein Waschmittel in ca. 60 oe warmenWasser aufgelöst und der belichtete Röntgenfilm. der zuvor klein geschnippseitworden ist, zugegeben. Nach einiger Zeit tritt das kolloidale Silber in derEmulsion .Persil' aus dem Trägermaterial aus und färbt somit die Emulsionschwarz.

Die enthaltenen Enzyme spalten die Gelatine, die als Trägermaterial undSeilutzschicht für die Silberhalogenide dient.

Durch die Hydrolyse der Gelatine, wird das fein verteilte Silber frei gesetzt, daßso als Indikator für die Funktion der Enzyme dient.

AgX + h v ----. Ag + 'l2 X2

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Hinweis Bei dieser Datei handelt es sich um ein Protokoll ... · EinleitunK Die hier vorliegende Ausarbeitung beschäftigt sich mit dem Thema,,Proteine und Enzyme". Sie besteht aus