Act a histochem. 71, 253 - 255 (1982)

Institut fill' Anatomie und Biologie del' Medizinischen Akademie Magdeburg, DDR (Direktor : P rof. Dr. se. med. A. DORN),

und Institut filr Pathologie del' Universitat Oulu, Finnland (Direktor: Prof. Dr. K. DAMMERT)

Kurze Originalmitteilung

Immunhistochemischer Nachweis von C-Peptid in den LANGERHANSschen Inseln des menschlichen Pankreas

Immunohistochemical evidence of C-peptide in Langerhans' islets of the human panCl"eaS

Von GERDA KOSTMANN, ALFRED DORN, HANS·GERT BERNSTEIN,

ARI RINNE und MIKKO JARVINEN

Mit 2 Abbildungen

(Eingega ngen am 20. Januar 1982)

Zusammenfassung

Mit Hilfe einer mcdifizie rten PAP·Teehnik naeh STERNBERGER (1979) konnte in den B· Zellen del' LAl'WERHANssehen Inseln des menschlichen Pankreas eine C·Peptid/C·Peptid·like· immunoreactivity im Cytoplasm a lokalisiert werden. An benachbal' t en Schnitten konnte mit gleicher T echnik in denselben Zellen au ch die Insulin/lnsulin·like·immunoreactivity nachgewiesen

werden.

Summary

C-peptide/C.peptide-like immunoreactivity was demonstra ted in the cytoplasm of B-cells of LANGERHANS' islets of human pancreas by use of a modified (four-step variant) of STERNBERGERS PAP-technique. Furthermore, it was shown b y immunost a ining of adjacent slices for insulin/ insulin-like immunoreactivity tha t both a ntigenes are present in the same cell type.

Es ist hinreichend bekannt, daB die Biosynthese des Peptidhormons Insulin tiber die intracelluliire proteolytische Spaltung des Proinsulins in das aktive Insulin und das in seiner biologischen Bedeutung noch unzureichend bekannte C-peptid (con­necting peptide) erfolgt (Zusammenfassende Darstellungen STEINER et al. 1979, BEYER et al. 1979). Obwohl die Isolierung des C-Peptids (SUNDBY und MARKUSSEN 1969, CLARK et al. 1969) aus dem Pankreas und seine Synthese im Laboratorium (NAITHANI und HE DING 1979) gelang, stehen Versuche zur Lokalisation des Pep­tids in der humanen B-Zelle aus. Lediglich KANAZAWA et al. (1979) haben an Ratten B-Zell-Kulturen mit Hjlfe der indirekten Immunfluorescenz einen kurzen Befund zum Vorkommen des C-Peptids mitget eilt. Wir mochten immunhistochemisch die celluliire Verteilung und die Lokalisation des C-Peptids in menschlichen LANGER­HANsschen Inseln demonstrieren .

254 G. KOSTMAl'irl'ir u. a.

Material und Methode

Humanes, intra operationem entnommenes Pankreasgewebe wurde in BOUIN-Losung fixiert, m Paraffin eingebettet und in 6!lm dicke Schnitte zerlegt. Nach Entparaffinierung und PBS­SpUIung der Schnitte erfolgte eine Beschichtung des Gewebes mit synthetischem humanen Anti­C-Peptid-Serum (Novo Lab. Res., Bagsvaerd, Danemark) in einer Verdiinnung von 1: 1000 bis 1: 3000 bei +4°C fiir 15 h. Nach mehrmaligem Waschen in PBS wurden die Schnitte mit Anti­Meerschweinchen-Globulin vom Kaninchen (Verdiinnung 1: 20) und nach erneutem Waschen in PBS mit Anti-Kaninchen-Serum vom Schwein (Verdiinnung 1: 20) in Modifikation der iib­lichen PAP-Technik nach STERl'irBERGER (1979) beschichtet. Die letztgenannten Inkubations­schritte erfolgten bei Raumtemperatur. Die Schnitte wurden erneut in PBS gespiilt, es schloLl

sich eine Inkubation mit dem PAP-Komplex an (30 min) und nach zwischengeschaltetem SpUIen der Schnitte in PBS wurde die Behandlung mit 3,3'-Diaminobenzidin mit H 20 2 (3 min) und Os04 [(5 min); (GRAHAM und KARNOVSKI 1966)] angeschlossen. An Nachbarschnitten wurde der im­munhistochemische Insulinnachweis mit Hilfe der PAP-Technik durchgefiihrt. Die Praparate wurden nach Entwasserung in Balsam eingeschlossen.

Ais Spezifitatskontrollen wurden durchgefiihrt:

1. Absorptionstest mit synthetischem humanen C-Peptid (Behring Werke). 2. Substitution des Primar-Antiserums durch Normalserum. 3. Dilutionsteste.

Ergebnisse

Mit Hilfe der beschriebenen Technik konnten wir III den LANGERHANSschen In­seln des menschlichen Pankreas eine C-PeptidfC-Peptid-like-immunoreactivity nach­weisen. Gr6Bere Zellbezirke innerhalb einer LANGERHANSschen Insel wiesen braun­schwarze Granulationen im Cytoplasma auf. Die Zellkerne reagierten nicht (Abb. 1). Vergleichende Untersuchungen am nachfolgenden Schnitt nach Behandlung mit Insulin-Antiserum ergaben, daB es sich bei den C-Peptid-positiven Zellbezirken gleichsam urn die insulinhaltigen B-Zellen der LANGERHANSschen Inseln handelt (Abb.2). Hierbei fallt auf, daB die Reaktionsintensitat beim C-Peptid geringer ist als beim parallel durchgefiihrten immunhistochemischen Insulinnachweis. Kontroll­untersuchungen ergaben ein negatives Resultat.

Abb. l. Immunhistochemischer Nachweis von C-Peptid; humanes Pankreasgewebe. 175: l.

Abb.2. Immunhistochemischer Insulinnachweis; humanes Pankreasgewebe. 175: l.

Immunhistochemischer Nachweis von C-Peptid 255

Diskussion

Die hier vorliegenden Ergebnisse liefern ein morphologisches Korrelat zu den seit einigen Jah­ren in der Literatur diskutierten biochemischen Untersuchungen zum C-Peptid_ CLARK et a1. (1969) konnten C-Peptid aus dem humanen Pankreas isolieren. Der Umwandlungsprozef3 von Proinsulin in Insulin unter Abspaltung von C-Peptid war Gegenstand zahlreicher Untersuchun­gen (s. u. a. KEMMLE.R et a1. 1973, STEINER et a1. 1979). Viele Autoren haben sieh in der letzten Zeit auch mit der C-Peptidbestimmung zur Messung der endokrinen Funktion der B-Zellen del' L ANGERHANSschen Inseln beschaftigt (STEINER et a1. 1979, BEYER et a1. 1979 u. a.). KANAZAWA et a1. (1979) haben lichtoptische Untersuchungen zur Insulin- und C-Peptid-Abgabe an kultivier­ten B-Zellen des Pankreas del' R atte durchgefiihrt. Hier konnte mit Hille einer Zeitrafferauf­n ahmetechnik die Bewegung der Granula innerhalb einer Zelle beobachtet werden, wobei der GOLGI-Appa rat als Ausgangspunkt der hormonhaltigen Grana angesehen werden kann. Ahnlich wie bei unseren Untersuchungen zum Nachweis des C-Peptids in del' LANGERHANSschen I nseln des humanen Pankreas war ein differentes Verhalten del' Reaktionsintensitat del' B-Zellen n ach­zuweisen. Eine Lokalisation innerhalb des Cytoplasmas ist eindeutig, eine direkte Zuordnung

zu Zellstrukturen, insbesondere dem GOLGI-Apparat, sollte mit Hilfe elektronenoptischer Unter­suchungen abgeklart werden. Daraus wiirden sich auch Hinweise auf das Vorhandensein von C-Peptid in den j'i-Granula ergeben.

Literatur

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Brisbane-Toronto 1979.

Anschrift des Verfassers: Dr. m ed. GERDA KOSTMANN, Institut fiir Anatomie und Biologie del' Medizinischen Akademie Magdeburg, DDR - 3090 Magdeburg, L eipziger Straf3e 44.