In vitro Verdauungsstudien im RUSITEC mit Pansensaft vom Rind … · 2019-01-10 · II 3.2.4 Versuchsdurchführung ... Kap. Kapitel KF-30 Kontrollfermenter (Fer-menter 1 u. 2) Lauf

Tierärztliche Hochschule Hannover

In vitro Verdauungsstudien im RUSITEC mit Pansensaft vom Rind zum Vorkommen von

phenolhaltigen Substanzen aus Grassilagen sowie deren Bindungsverhalten mit Eiweißen

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Corinne Hunsche

Ibbenbüren

Hannover 2017

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Hoedemaker Klinik für Rinder Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Dr. M. Höltershinken Klinik für Rinder Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Hoedemaker

2. Gutachter: PD Dr. S. Leonhard-Marek

Tag der mündlichen Prüfung: 17.11.2017

Gefördert durch den Milchförderungsfonds Hannover-Braunschweig

Meiner Familie

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis .......................................................................... V

1 Einleitung ................................................................................................. 1

2 Schrifttum ................................................................................................. 2

2.1 Phenolische Substanzen – Einführung ...................................................... 3

2.1.1 Struktureller Aufbau ................................................................................... 3 2.1.2 Klassifizierung............................................................................................ 5 2.2 Entstehung von phenolischen Substanzen: Stoffwechselwege in

Grassilagen, Gräsern und Heu .................................................................. 6 2.2.1 Phenylalaninstoffwechsel .......................................................................... 7

2.2.2 Phenylpropanoidstoffwechsel .................................................................. 10 2.2.3 Flavonoidstoffwechsel ............................................................................. 14 2.3 Fähigkeiten zur Komplexbildung .............................................................. 21

2.3.1 Komplexformen ........................................................................................ 21

2.3.2 Einflüsse auf die Komplexbildung ............................................................ 23 2.3.3 Phenol-Proteinkomplex ............................................................................ 26 2.3.4 Einfluss phenolischer Substanzen auf Sojaproteine ................................ 28

2.3.4.1 Glycinin und Trypsininhibitoren ................................................................ 28 2.3.4.2 β-Conglycinin ........................................................................................... 30

2.3.5 Enzymhemmung durch phenolische Substanzen .................................... 30 2.3.6 Einfluss von Pepsin und dem pH-Wert auf die Struktur der Sojaproteine 32 2.4 Aufnahme von phenolischen Substanzen: Auswirkungen auf den

Wiederkäuer ............................................................................................ 33

3 Eigene Untersuchungen ....................................................................... 40

3.1 Versuchsziel ............................................................................................ 40 3.2 Material und Methoden ............................................................................ 40

3.2.1 Rumen Simulation Technique (RUSITEC) ............................................... 41 3.2.1.1 Aufbau und Funktionsweise ..................................................................... 41

3.2.1.2 Inbetriebnahme ........................................................................................ 41 3.2.1.3 Dauerbetrieb ............................................................................................ 42

3.2.1.4 Zusammensetzung der Pufferlösung ....................................................... 44 3.2.2 Spendertier .............................................................................................. 44 3.2.2.1 Identität .................................................................................................... 44 3.2.2.2 Haltung und Fütterung ............................................................................. 44 3.2.2.3 Pansensaftentnahme ............................................................................... 45

3.2.3 Futterkomponenten .................................................................................. 45

3.2.3.1 Herkunft und Beschaffenheit der Grassilagen ......................................... 45

3.2.3.1.1 Kontrollsilage ........................................................................................... 45 3.2.3.1.2 Schadsilage ............................................................................................. 45 3.2.3.2 Herkunft und Beschaffenheit der Maisstärke ........................................... 48 3.2.3.3 Herkunft und Beschaffenheit des Sojaproteins ........................................ 48 3.2.3.4 Herkunft und Beschaffenheit des Kraftfutters .......................................... 48

Inhaltsverzeichnis

II

3.2.4 Versuchsdurchführung ............................................................................. 49 3.3 Analytik .................................................................................................... 52 3.3.1 Bestimmung der flüchtigen Fettsäuren .................................................... 52

3.3.2 Enzymatische Bestimmung des Phenolgehalts in der Fermenterflüssigkeit sowie nach Fermentation in der Überstandsflüssigkeit ............................ 55

3.3.2.1 Bestimmung des Gesamtphenolgehalts in der Fermenterflüssigkeit ....... 55 3.3.2.2 Bestimmung des o-Diphenolgehalts in der Fermenterflüssigkeit ............. 58 3.3.2.3 Bezeichnung der drei Testgruppen der Überstandsgefäße ..................... 62

3.3.2.4 Enzymatischer Verdau der Überstandsflüssigkeit: Einfluss von Pepsin auf den Gehalt an phenolischen Substanzen ................................................ 62

3.3.2.5 Bestimmung des Gesamtphenolgehalts in der Überstandsflüssigkeit ..... 63 3.3.2.6 Kalibrierung ............................................................................................. 63 3.3.2.7 Methodenüberprüfung ............................................................................. 64

3.3.2.8 Bestimmung des o-Diphenolgehalts in der Überstandsflüssigkeit ........... 64 3.3.2.9 Kalibrierung ............................................................................................. 65

3.3.2.10 Überprüfung der Methode ........................................................................ 65 3.3.3 Abschließende Beurteilung der neuen Methode ...................................... 66 3.3.4 Statistische Datenauswertung ................................................................. 66

4 Ergebnisse ............................................................................................. 67

4.1 Flüchtige Fettsäuren ................................................................................ 67 4.1.1 Essigsäurekonzentration ......................................................................... 68

4.1.2 Essigsäureproduktion .............................................................................. 69 4.1.3 Propionsäurekonzentration ...................................................................... 70 4.1.4 Propionsäureproduktion ........................................................................... 71

4.1.5 n-Buttersäurekonzentration ..................................................................... 72 4.1.6 n-Buttersäureproduktion .......................................................................... 73

4.1.7 n-Valeriansäurekonzentration .................................................................. 74 4.1.8 n-Valeriansäureproduktion ....................................................................... 75

4.1.9 Hexansäurekonzentration ........................................................................ 76 4.1.10 Hexansäureproduktion ............................................................................. 77 4.1.11 Summe der flüchtigen Fettsäuren: Konzentration .................................... 78 4.1.12 Summe der flüchtigen Fettsäuren: Produktion ......................................... 79

4.2 Gehalt an phenolischen Substanzen in den Fermentern ......................... 80 4.2.1 Gesamtphenolgehalt in den Fermentern ................................................. 80 4.2.2 o-Diphenolgehalt in den Fermentern ....................................................... 81 4.3 Gehalt an phenolischen Substanzen in der Überstandsflüssigkeit nach

Pepsinverdau ........................................................................................... 82

4.3.1 Gesamtphenolgehalt in der Überstandsflüssigkeit nach Pepsinverdau ... 83 4.3.2 o-Diphenolgehalt in der Überstandsflüssigkeit nach Pepsinverdau ......... 86 4.4 Ergebnisüberblick .................................................................................... 89

5 Diskussion ............................................................................................. 91

5.1 Intention der Arbeit .................................................................................. 91 5.2 Kritische Betrachtung des Versuchsaufbaus ........................................... 91 5.2.1 Das RUSITEC-System ............................................................................ 91

5.2.2 Eingesetzte Grassilagen .......................................................................... 92

Inhaltsverzeichnis

III

5.3 Kritische Betrachtung der verwendeten Parameter ................................. 93 5.3.1 Flüchtige Fettsäuren ................................................................................ 93 5.3.2 Gesamtphenole im Fermenter ................................................................. 93

5.3.3 o-Diphenole im Fermenter ....................................................................... 94 5.4 Einfluss des Verdauungsenzyms Pepsin auf den Gehalt an phenolischen

Substanzen in der Überstandsflüssigkeit ................................................. 95 5.5 Gesamtphenole und o-Diphenole im Überstand ...................................... 95 5.6 Auswirkungen von Schadsilagen und Sojaprotein auf das

Fermentationsmuster der flüchtigen Fettsäuren ...................................... 97 5.6.1 Übersicht ................................................................................................. 97 5.6.2 Einfluss ausgewählter Pansenbakterien auf den Gehalt an flüchtigen

Fettsäuren ............................................................................................... 98 5.6.3 Einordnung der Produktion der flüchtigen Fettsäuren (L39-42) im

Gesamtprojekt ....................................................................................... 103 5.7 Auswirkungen der Schadsilagen auf das Reaktionsverhalten phenolischer

Substanzen ............................................................................................ 104 5.7.1 Reaktionswege phenolischer Substanzen im Pansen ........................... 104 5.7.2 Reaktionswege phenolischer Substanzen im Labmagen ...................... 107 5.8 Einflüsse phenolischer Substanzen auf das Pansenmikrobiom und somit

auf den Gehalt der flüchtigen Fettsäuren ............................................... 108 5.9 Ausblick ................................................................................................. 110

6 Zusammenfassung .............................................................................. 111

7 Summary .............................................................................................. 113

8 Schrifttumsverzeichnis ....................................................................... 115

9 Anhang ................................................................................................. 135

9.1 Bisherige Dissertationen aus dem Pansenlabor .................................... 135

9.2 Probenentnahme und Parameterverteilung ........................................... 136 9.3 Parameterverteilung .............................................................................. 138

9.4 Einfluss von Pepsin auf den Gehalt an phenolischen Substanzen: Messung ohne und mit Pepsinverdau .................................................... 139

9.5 Pepsininkubation zu zwei verschiedenen Zeitpunkten ........................... 143 9.6 Kalibrationsgerade zur Ermittlung des Gesamtphenolgehalts in der

Überstandsflüssigkeit ............................................................................. 144 9.7 Methodenüberprüfung: 4-Hydroxyphenylessigsäure ............................. 144 9.8 Kalibrationsgerade zur Ermittlung der o-Diphenolgehalt in der

Überstandsflüssigkeit ............................................................................. 145 9.9 Methodenüberprüfung: Chlorogensäure ................................................ 145

9.10 Ergebnisse ............................................................................................. 146

9.10.1 Statistische Daten .................................................................................. 146

9.11 Relevante Ergebnisse aus vorherigen Disserationen ............................ 165 9.11.1 Essigsäure ............................................................................................. 165 9.11.2 Essigsäureproduktion ............................................................................ 166 9.11.3 Propionsäurekonzentration .................................................................... 167 9.11.4 Propionsäureproduktion ......................................................................... 168 9.11.5 n-Buttersäurekonzentration ................................................................... 169

Inhaltsverzeichnis

IV

9.11.6 n-Buttersäureproduktion ........................................................................ 170 9.11.7 n-Valeriansäurekonzentration ................................................................ 171 9.11.8 n-Valeriansäureproduktion ..................................................................... 172

9.11.9 Hexansäurekonzentration ...................................................................... 173 9.11.10 Hexansäureproduktion ........................................................................... 174 9.11.11 Summe der flüchtigen Fettsäuren: Konzentration .................................. 175 9.11.12 Summe der flüchtigen Fettsäuren: Produktion ....................................... 176 9.11.13 Gesamtphenolgehalt im Fermenter ....................................................... 177

9.11.14 o-Diphenolgehalt im Fermenter ............................................................. 178 9.12 Vorkommen von Aminosäuren und GABA in den eingesetzten Gras-

silagen ................................................................................................... 179

10 Danksagung ......................................................................................... 181

Abkürzungsverzeichnis

V


A. bidest. Aqua bidestillata Abb. Abbildung ADF acid detergent fiber (saure

Detergens-Faser) Art.-Nr. Artikelnummer BRENDA BRaunschweig ENzyme

DAtabase bspw. beispielsweise bzw. beziehungsweise C Kohlenstoff °C Grad Celsius ca. circa cm Zentimeter CO2 Kohlenstoffdioxid d. h. das heißt EC enzyme commission

numbers; Klassifizierungs-system für Enzyme

EtOH Ethanol etc. et cetera F Fermenter Fa. Firma FIP-U/g Enzymeinheit FlFS flüchtige Fettsäuren FMOC Fluorenylmethoxycarbonyl g Gramm GABA Gamma-Aminobuttersäure GC Gaschromatograph ggf. ggr.

Gegebenenfalls geringgradig

h Stunde(n) H Wasserstoff HCL hgr.

Salzsäure hochgradig

HPLC high-performance liquid chromatography

K-30 Kontrollsilage Lauf 31–34 K-32 Kontrollsilage Lauf 35–38 k. A. Keine Angabe Kap. Kapitel KF-30 Kontrollfermenter (Fer-

menter 1 u. 2) Lauf 31–34 KF-32 Kontrollfermenter (Fer-

menter 1 u. 2) Lauf 35–38 kg Kilogramm

L Lauf l Liter LC/MS liquid chromatography/

mass spectrometry Lsg. Lösung M Molekulargewicht (g/mol) ME metabolizable energy

(umsetzbare Energie) mg mgr.

Milligramm mittelgradig

min Minute(n) MJ Megajoule ml Milliliter mm Millimeter mmol/l Millimol µl Mikroliter mol Mol mS mit Sojazulage n Anzahl N Stickstoff NDF neutral detergent fiber

(neutrale Detergens-Faser)

NEL Nettoenergie-Laktation NfE nitrogen free extractives

(N-freie Extraktstoffe) NH2 Aminogruppe NH3 Ammoniak nm Nanometer NPN Nicht-Protein-Stickstoff Nr. Nummer O Sauerstoff o- ortho- p Signifikanz der Differenz PCR Polymerasekettenreaktion pH pH-Wert Ra Rohasche RE Reineiweiß Rfa Rohfaser Rfe Rohfett Rp Rohprotein RUSITEC RUmen SImulation

TEChnique S-31 Schadsilage Lauf 31–34 S-33 Schadsilage Lauf 35–38


VI

S-35 Schadsilage Lauf 39-42 s Standardabweichung s. siehe Sek Sekunde Seradest ionenfreies Wasser sp. Art/Spezies/species (keine

weitere Artendefinition möglich)

sp. nov. Neue Spezies spp. Species pluralis Std. s.u.

Stunde siehe unten

Syn. Synonym Tab. Tabelle TF-31 Testfermenter (Fermenter

3 u. 4) Lauf 31–34 TF-33 Testfermenter (Fermenter

3 u. 4) Lauf 35–38 TF-35 Testfermenter (Fermenter

3 u. 4) Lauf 39-42 TF-31mS Testfermenter mit Sojazu-

lage (Fermenter 5 u. 6) Lauf 31–34

TF-33mS Testfermenter mit Sojazu-lage (Fermenter 5 u. 6) Lauf 35–38

TF-35mS Testfermenter mit Sojazu-lage (Fermenter 5 u. 6) Lauf 39-42

TS Trockensubstanz u. und Ü Überstand u. a. unter anderem uS Ursprüngliche Substanz

(Frischsubstanz) VDLUFA Verband deutscher

landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten

versch. verschiedene vgl. verglichen Vgl. Vergleich VK Variationskoeffizient Vol. % Volumenprozent x̅ arithmetischer Mittelwert x g mal Erdbeschleunigung z. B. zum Beispiel

% Prozent >/< größer/kleiner als ≈ gleich/equal to */#/° schwach signifikant

(p < 0,05) **/##/°° signifikant (p < 0,01) ***/###/°°° hoch signifikant

(p < 0,001) x Multiplikationszeichen

Einleitung

1

1 Einleitung

Seit einigen Jahren tritt auf Milchviehbetrieben in Norddeutschland ein unspezifi-

sches Krankheitsbild (Absinken der Milchleistung, Anstieg der Zellzahl, Fressunlust,

Klauenprobleme, Verdauungs- und Fertilitätsstörungen, atypisches Festliegen der

Tiere etc.), beschrieben als „Faktorenerkrankung Milchviehherde“, auf.

Untersuchungen des Grundfutters haben ergeben, dass erkrankte Tiere mit einer

Grassilage gefüttert wurden, die einen Reineiweißanteil (RE) am Rohprotein (RP)

von unter 50 % aufweisen. Nach Absetzen oder Verschneiden der Silage sowie

Supplementierung mit Sojaextraktionsschrot konnte die Herdengesundheit verbes-

sert werden (EICKEN 2005a; EICKEN u. TIEDEMANN 2013).

Ergebnisse aus in vitro Versuchen des Pansenlabors der Klinik für Rinder, Stiftung

Tierärztliche Hochschule Hannover, sollen zur Klärung beitragen, ob Silagen mit ei-

nem Reineiweißgehalt am Rohprotein unter 50 % negative Einflüsse auf die Funktion

des Pansens haben. In vorangegangenen Versuchen wurden bereits Auswirkungen

der Schadsilagefütterung (im Vergleich zur Kontrollsilage) auf den Kohlenhydrat-

stoffwechsel, Polypeptidabbau und den Proteinstoffwechsel überprüft sowie Analy-

sen zu Abwehrstoffen von Pflanzen durchgeführt.

In der vorliegenden Arbeit werden Auswirkungen einer Schadsilagefütterung und ei-

ner Supplementierung mit Sojaprotein auf den Gehalt an phenolischen Substanzen

an zwei in vitro Entnahmeorten (im Fermenter = Pansen, im Überstand = Labmagen)

sowie auf den Kohlenhydratstoffwechsel in vitro untersucht. Phenolische Substanzen

zählen zu den sekundären Pflanzeninhaltsstoffen (McMANUS et al. 1981; STICHER

et al. 2015). Sie werden in der Vakuole gespeichert oder liegen gebunden an der

Zellwand vor. Sie sind in der Lage, komplexe Verbindungen mit anderen Stoffen ein-

zugehen. Hierzu werden sie durch Enzyme, Polyphenoloxidasen, zu reaktiven Stof-

fen, den Chinonen, katalysiert (LE BOURVELLEC u. RENARD 2012).

Gerade in der Wiederkäuerernährung sind diese Verbindungen von großem Interes-

se. Auf Grund der hohen Variabilität im Vorkommen der phenolischen Substanzen

sind ihre Stoffwechselwege sowie Wirkungen im Tier bislang nicht eindeutig geklärt.

Neben negativen Aspekten wie der schlechteren Futteraufnahme durch Vorhanden-

sein bestimmter Phenolsäuren sowie die geringere Verfügbarkeit nutzbaren Proteins

durch die Bindung der Phenolsäuren an Eiweiße werden auch positive Wirkungen

wie antioxidative und antiinflammatorische Effekte beschrieben (HO et al. 1992;

RAWEL et al. 2005).

.

Schrifttum

2

2 Schrifttum

Die folgenden Abschnitte befassen sich mit dem Vorhandensein phenolischer Sub-

stanzen in Gräsern und ihren chemischen Eigenschaften, Komplexe mit anderen

Substanzen (u.a. Proteine) bilden zu können, sowie ihren Auswirkungen auf den

Wiederkäuer. ÖZMEN (2014) und GÖRES (2016; vorherige Arbeiten im Pansenlabor

der Klinik für Rinder, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover s. Tab. 9.1) wiesen

ein Vorkommen von phenolischen Substanzen in Grassilagen, Gräsern, Heu und

Pansensaft nach. ÖZMEN (2014) konnte aufzeigen, dass diese Substanzen im Gras

als Einzelkomponenten vorliegen, im Pansensaft jedoch nicht mehr. Eine Erklärung

hierfür könnte ihre Fähigkeit zur Komplexbildung sein.

Schrifttum

3

2.1 Phenolische Substanzen – Einführung

Phenolische Substanzen zählen zu den niedermolekularen Naturstoffen (Syn. Se-

kundärmetabolite; WALD 2003; STICHER et al. 2015), sie kommen nur in bestimm-

ten Pflanzengruppen und Entwicklungsstadien vor (WATZL u. LEITZMANN 2005).

Es gibt verschiedene Faktoren (Pflanzenspezies, Erntezeitpunkt, Boden und Klima),

die den spezifischen Gehalt an sekundären Pflanzeninhaltsstoffen in einer Pflanze

beeinflussen (WALD 2003). Phenolische Substanzen sind nicht am Primärstoffwech-

sel (Energiestoffwechsel, Zellwachstum und -teilung) der Pflanze beteiligt, sondern

im sekundären Stoffwechsel (Syn. spezieller Stoffwechsel; McMANUS et al. 1981),

ihre Funktionalität liegt im Bereich der Wechselwirkungen einer Pflanze mit der Um-

welt (STICHER et al. 2015). Zunächst entstehen Sekundärmetabolite durch eine zu-

fällige Mutation. Ansammlungen dieser Stoffe können Pflanzen oft für sich als phy-

siologischen Vorteil nutzen (STICHER et al. 2015). Sie nutzen sie als Wachstumsre-

gulatoren und Farbstoffe (WATZL u. LEITZMANN 2005) sowie zu ihrem eigenen Er-

halt (WALD 2003; STICHER et al. 2015). Sie setzen die Stoffe als Schutzmechanis-

mus u.a. gegen den Befall von pathogenen Mikroorganismen oder vor Fraßfeinden

ein (STICHER et al. 2015). Phenolische Substanzen sind auch wegen ihrer pharma-

kologischen Wirkungen in den Fokus gerückt (HARBORNE u. WILLIAMS 2000;

STICHER et al. 2015). Sie können z.B. antioxidativ, antimikrobiell, antikanzerogen

und antithrombotisch wirksam sein (HO et al. 1992; RAWEL et al. 2005; STICHER et

al. 2015).

2.1.1 Struktureller Aufbau

Phenolische Substanzen weisen eine große strukturelle Vielfalt auf (STICHER et al.

2015). Die große Anzahl an unterschiedlichen phenolischen Substanzen entsteht

durch die vielfältige Ableitung (Methylierung, Hydroxylierung und Glykosylierung) der

Strukturen von einem Grundgerüst (WOLLENWEBER 1982; DIXON u. PAIVA 1995).

Dieses besteht aus einem aromatischen Ring, an dem eine oder mehrere Hydro-

xylgruppen sowie funktionelle Gruppen (Ether, Aldehyde, Ester, Glykoside) gebun-

den sind (Tab. 2.1; HO et al. 1992).

Viele phenolische Substanzen besitzen zwei oder mehr Hydroxylgruppen

(HO et al. 1992), die in ortho-Stellung zueinander liegen. Hierbei handelt es sich um

sogenannte o-Diphenole (HOLLOWAY 1979). McMANUS et al. (1981) beschreiben

die ortho-Dihydroxygruppen der phenolischen Substanzen als die entscheidenden

Stellen, an denen eine Komplexbildung mit anderen Substanzen möglich ist.

Schrifttum

4

Tab. 2.1: Summen- und Strukturformeln ausgewählter phenolischer Substanzen

Phenolische Substanz mit Summenformel

Strukturformel

Phenol C6H5OH

Gallussäure C7H6O5

p-Cumarsäure C9H8O3

Kaffeesäure C9H8O4

Ferulasäure C10H10O4

Apigenin C15H10O5

Diosmetin C16H12O6

Schrifttum

5

2.1.2 Klassifizierung

Es gibt zahlreiche Untergruppen von phenolischen Substanzen (HO et al. 1992;

HUEP 2008; HUNGER 2014; ÖZMEN 2014), die über die unterschiedlichsten Stoff-

wechselwege entstehen (s. Kap. 2.2). Zu den jeweiligen Untergruppen gehören wie-

derum unzählige Substanzen, die durch Bindung von verschiedenen funktionellen

Gruppen und anderen Substanzen entstehen können. Tabelle 2.2 zeigt eine Über-

sicht der wichtigsten Untergruppen.

Tab. 2.2: Ausgewählte Untergruppen phenolischer Substanzen (mit Beispielen)

Untergruppe Beispiele

Hydroxybenzoesäuren Gallussäure: genutzt zur Synthese von hydrolysierbaren Tanninen Salicylsäure p-Hydroxybenzoesäure Vanillinsäure

Hydroxyzimtsäuren Kaffeesäure Ferulasäure Cumarsäure

Ester aromatischer Hydroxycarbonsäu-ren

Chlorogensäure: Ester zwischen China- und Kaffeesäure

Cumarine Cumarin

Chalkone Isoliquiritigenin

Flavanone Hesperitin Naringenin

Flavonole

Kaempferol Quercetin Rutin

Leucoanthocyanidine Leucocyanidin

Anthocyane Cyanidin

Flavanole Catechin Epicatechin

Proanthocyanidine (kondensierte Tannine)

Aus Catechin entstehend

Flavanonole

Taxifolin Aromadendrin

Isoflavone Daidzein Genistein

Schrifttum

6

2.2 Entstehung von phenolischen Substanzen: Stoffwechselwege in

Grassilagen, Gräsern und Heu

Der Stoffwechselweg phenolischer Substanzen kann in drei Abschnitte unterteilt

werden (DIXON u. PAIVA 1995; HERRMANN 1995; FRANGNE et al. 2002;

ÖZMEN 2014):

Im ersten Abschnitt werden Aminosäuren gebildet, diese stellen eine Verbindung

zwischen dem Grundstoffwechsel und dem sekundären Stoffwechsel dar (STICHER

et al. 2015). Aminosäuren entstammen dem Shikimsäureweg (s. Tab. 2.3), daneben

gibt es die Möglichkeit, aromatische Verbindungen über den Acetat-Malonat-Weg

oder dem Acetat-Mevalonat-Weg zu bilden (HERRMANN u. WEAVER 1999;

STICHER et al. 2015).

Aus ihnen gehen im zweiten Abschnitt die niedermolekularen Naturstoffe, u.a. die

Zimtsäurederivate, hervor (Tab 2.4; ÖZMEN 2014).

Der dritte Abschnitt befasst sich mit dem Stoffwechselweg komplexer Phenole, u.a.

den Flavonen und Flavonolen (Tab. 2.5).

Die von ÖZMEN (2014) dargestellten Substanzen wurden in Extrakten von Grassila-

gen, Gräsern und Heu mittels LC-ESI-MS/MS- und FMOC-HPLC-Methode ermittelt.

Hierbei konnten einige bekannte, im Stoffwechselweg von Pflanzen (z.B. Legumino-

sen) entstehende, phenolische Substanzen in Grassilagen, Gräsern und Heu nicht

identifiziert werden, da sie zum einen nicht gebildet (z.B. Cumarin) oder direkt abge-

baut (z.B. Zimtsäure) werden. Auf weitere Synthesewege, wie z.B. die Entstehung

der einzelnen kondensierten Tannine, wird hier nicht näher eingegangen, da sie,

verglichen mit den Phenolsäuren p-Cumar- und Ferulasäure, eine untergeordnete

Rolle in Gräsern spielen (LOWRY et al. 1993; ÖZMEN 2014). Sie sind in vorange-

gangenen Studien vor allem in Leguminosen ermittelt worden (BARRY u. MANLEY

1984b; BARRY 1985; WAGHORN et al. 1994; WANG et al. 1994; MIN et al. 2005;

WAGHORN 2008). Näheres zum Reaktionsweg in Pflanzen und Gräsern

s. ÖZMEN (2014).

Zusätzlich wurden die Proben von ÖZMEN (2014) mittels dem Langzeitinkubations-

system RUSITEC (näheres hierzu s. Kap. 3) fermentiert und anschließend auf das

Vorhandensein der zuvor identifizierten Substanzen untersucht. Außer den im ersten

Abschnitt gebildeten Aminosäuren L-Phenylalanin und L-Tyrosin sowie ein biogenes

Amin und ein Abbauprodukt der Flavonoide konnten keine phenolischen Substanzen

(als ungebundene Reinsubstanz) im Fermenterinhalt von ÖZMEN (2014) nachge-

wiesen werden.

Schrifttum

7

2.2.1 Phenylalaninstoffwechsel

Im ersten Abschnitt (Phenylalaninstoffwechsel) werden die Aminosäuren

L-Phenylalanin, L-Tyrosin und L-Tryptophan über den Shikimsäureweg als Endpro-

dukte gebildet (HERRMANN u. WEAVER 1999; ÖZMEN 2014). Die in der Pflanze

als Nebenprodukte vorkommenden Substanzen (Gallussäure und Chinasäure) sowie

das Zwischenprodukt (Phenylbrenztraubensäure) konnten nicht in allen von

ÖZMEN (2014) analysierten Extrakten identifiziert werden. Ein Vorhandensein der

über den Shikimsäureweg im ersten Abschnitt des Stoffwechsels gebildeten Sub-

stanzen wurden auch in Fermenterproben (Probengewinnung mit Hilfe eines Lang-

zeitinkubationssystems) untersucht (ÖZMEN 2014, s. Tab. 2.3). Wie in vorangegan-

genen Untersuchungen, GRESNER (2011) und THEERMANN (2011), wurden nur

die Aminosäuren L-Phenylalanin und L-Tyrosin im Fermenterinhalt nachgewiesen,

alle anderen Substanzen wurden nicht identifiziert (ÖZMEN 2014).

Schrifttum

8

Tab. 2.3: Biosynsthese der identifizierten Substanzen (ÖZMEN 2014): 1. Abschnitt (Phenylalaninstoffwechsel)

1. Abschnitt: Phenylalaninstoffwechsel

Phenolische Substanz

Hervorgehend aus

Bedingt durch (Enzym)

Info Vorkommen Literatur

Phenylbrenz-traubensäure

Prephensäure (über Shikim- und Chorismin-säure)

Decarboxylierung, Wasserabspaltung, Prephenat-Dehydratase (EC1 4.2.1.51)

Zwischenprodukt, nicht in Grassila-gen, da vollständi-ge Umwandlung zu Phenylalanin und Tyrosin

Gras, Heu HERRMANN 1995; DOSSELAERE u. VANDERLEYDEN 2001; ÖZMEN 2014

L-Phenylalanin Phenylbrenz-traubensäure

Transaminierung Endprodukt im Shikimsäureweg

Grassilagen, Gras, Heu, Fermenter

HERRMANN 1995; HERRMANN u. WEAVER 1999; ÖZMEN 2014

L-Tyrosin Phenylbrenz-traubensäure

Transaminierung Endprodukt im Shikimsäureweg

Grassilagen, Gras, Heu, Fermenter

HERRMANN 1995; HERRMANN u. WEAVER 1999; ÖZMEN 2014

L-Tryptophan Indol Tryptophan-Synthase (EC 4.2.1.20) mit Aminosäure Serin

Endprodukt im Shikimsäureweg

Grassilagen, Gras, Heu

CRAWFORD u. YANOFSKY 1958; ANDERSON et al. 1991; ÖZMEN 2014

1 BRaunschweig ENzyme Database; URL: www.brenda-enzymes.org

Schrifttum

9

Fortsetzung Tab. 2.3

Gallussäure 5-Dehydro-shikimsäure

Oxidation, Enoli-sierung

Nebenprodukt; nicht in Grassila-gen, da Verbrauch bei Gallotannin-synthese (zur Bil-dung von hydroly-sierbaren Tanni-nen) oder an Zu-cker gebunden

Gras, Heu ÖZMEN 2014

Chinasäure 5-Dehydro-chinasäure

Reduktion, 5-Dehydroquinat-Dehydratase (EC 1.1.1.24)

Nebenprodukt; nicht in Grassila-gen, da Reaktion mit veresterter Kaf-feesäure zur Ent-stehung von Chlo-rogensäure

Gras, Heu ÖZMEN 2014

Schrifttum

10

2.2.2 Phenylpropanoidstoffwechsel

Im zweiten Abschnitt (s. Tab. 2.4) konnten einige der Phenylpropanoide, hierzu zäh-

len die Phenolcarbonsäuren (z.B. Hydroxyzimtsäuren), in Grassilagen, Gräsern und

Heu identifiziert werden (ÖZMEN 2014). Diese Gruppe kennzeichnet ein

C6C3-Grundgerüst. Es gibt Substanzen, wie die Benzoesäure und die Zimtsäure, die

nicht in Grassilagen identifiziert werden konnten, da sie durch Veresterung an Phe-

nolsäuren gebunden oder umgewandelt werden und sich somit der Analyse entzie-

hen (DIXON u. PAIVA 1995; STICHER et al. 2015). Die Ferulasäure kommt als Zwi-

schenprodukt vor, sie wird während der Ligninsynthese verbraucht

(RALPH et al. 1994; ÖZMEN 2014).

Schrifttum

11

Tab. 2.4: Biosynthese der identifizierten Substanzen (ÖZMEN 2014): 2. Abschnitt (Phenylpropanoidstoffwechsel)

2. Abschnitt: Phenylpropanoidstoffwechsel


Hervorgehend aus



Zimtsäure Phenylalanin L-Phenylalanin-Ammoniaklyase (PAL, EC 4.3.1.24), oxidative Desami-nierung

Nicht in Grassila-gen, da schneller Umbau zur p-Cumarsäure

Gras, Heu ÖZMEN 2014; STICHER et al. 2015

Benzoesäure trans-Zimtsäure Abspaltung C2-Fragment

Derivatbildung: Salicylsäure, 3-Hydroxybenzoe-säure, 3,4-Dihydroxy-benzoesäure, wer-den in Grassilagen durch Veresterung an Phenolsäure gebunden

DIXON u. PAIVA 1995; ÖZMEN 2014

Salicylsäure Benzoesäure Derivat der Ben-zoesäure

ÖZMEN 2014

Schrifttum

12


p-Cumarsäure trans-Zimtsäure oder L-Tyrosin

Enzymatische Hyd-roxylierung des Aromaten in pa-ra-Stellung (der Zimtsäure) zum Propensäurerest oder Tyrosin-Ammoniaklyase (TAL, EC 4.3.1.23) katalysierte Desa-minierung

Grassilage, Gras DIXON u. PAIVA 1995; ÖZMEN 2014; STICHER et al. 2015

Kaffeesäure p-Cumarsäure Hydroxylierung durch Phenolase

Schlüsselsubstanz zur Bildung der Cumarine, Chloro-gensäure, Feru-lasäure, Sinapin-säure und Lignine


BARRIÈRE et al. 2007; DIXON u. PAIVA 1995; ÖZMEN 2014

Chlorogensäure Kaffeesäure Chinasäure Grassilagen, Gras, Heu

ÖZMEN 2014

Ferulasäure Kaffeesäure Methylierung mit Hilfe von Kaffee-säure-O-Methyl-transferase

Zwischenprodukt in Grassilagen, Gras und Heu für Ligninsynthese

Grassilagen, Gras RALPH et al. 1994; ÖZMEN 2014

Cumarin p-Cumarsäure In Grassilagen, Gras und Heu nicht gebildet

ÖZMEN 2014

5-Hydroxy-ferulasäure

Ferulasäure In Grassilagen, Gras und Heu nicht gebildet

ÖZMEN 2014

Schrifttum

13


Sinapinsäure 5-Hydroxy-ferulasäure

In Grassilagen, Gras und Heu nicht gebildet

ÖZMEN 2014

Schrifttum

14

2.2.3 Flavonoidstoffwechsel

Der dritte Abschnitt der Synthese (Flavonoidstoffwechsel) beginnt mit der Bildung

eines Naringeninchalkon aus drei Molekülen Malonyl-CoA, einem Molekül

p-Cumaroyl-CoA (aus p-Cumarsäure) und unter Abspaltung von Kohlenstoffdioxid,

aus dem das Naringenin hervorgeht (LEWINSOHN et al. 1989; PETER et al. 1991).

In Grassilagen hingegen konnte das Naringenin nicht identifiziert werden, da es

wahrscheinlich schnell zu Apigenin (Flavon), Genistein (5-Hydroxyisoflavonoid) und

Kaempferol (Flavonol) dehydriert (s. Kap. 2.2: weitere Substanzen durch schnelle

Verstoffwechselung nicht gefunden; ÖZMEN 2014). Die in Pflanzen beschriebenen

weiteren aus Naringenin hervorgehenden Substanzen (u.a. Stilbene, Aurone, Flava-

none und Anthocyane) wurden von ÖZMEN (2014) nicht gefunden. Aus Apigenin,

Genistein und Kaempferol werden mittels unterschiedlicher enzymatischer Synthe-

sen verschiedene Glykoside (Zwischenprodukte), Rutinoside und weitere Flavone,

Flavonole und Isoflavonole gebildet (ÖZMEN 2014). Die Flavonole und Isoflavone

konnten allerdings nur in wenigen Extrakten nachgewiesen werden (sie sind als Ne-

benprodukte anzusehen), es wurden hauptsächlich Flavone gebildet (ÖZMEN 2014).

Tabelle 2.5 zeigt die im dritten Abschnitt identifizierten (und nicht identifizierten) Sub-

stanzen.

Schrifttum

15

Tab. 2.5: Biosynthese der identifizierten Substanzen (ÖZMEN 2014): 3. Abschnitt (Flavonoidstoffwechsel)

3. Abschnitt: Flavonoidstoffwechsel


Hervorgehend aus



Naringenin 5,7,4’-Trihydroxy-chalkon, Chalkon aus drei Molekülen Malo-nyl-CoA und ein Molekül p-Cumaroyl-CoA (aus p-Cumar-säure)

Chalkon-Isomerase (EC 5.5.1.6)

Keine Identifizie-rung in Grassila-gen, Gras und Heu auf Grund voll-ständiger Dehydra-tation des C-Ringes; dehy-driert zu Apigenin, Kaempferol und Genistein

LEWINSOHN et al. 1989; DIXON u. PAIVA 1995; ÖZMEN 2014; STICHER et al. 2015

Apigenin 5,7,4’-Trihydroxy-chalkon

Flavon-Synthase (EC 1.14.11.22)

Grassilagen: Reaktion läuft vor allem in Richtung der Flavone

Grassilagen, Heu BENAVENTE-GARCIA et al. 1993; ÖZMEN 2014

Genistein 5,7,4’-Trihydroxy-chalkon

2-Hydroxy-isoflavanon-Dehydratase

Nebenprodukt Grassilagen DIXON u. PAIVA 1995; ÖZMEN 2014

Biochanin A Genistein Isoflavon-Methyl-transferase

Nebenprodukt; Bildung nur in Grassilagen

Grassilagen ÖZMEN 2014

Daidzein Naringenin 2-Hydroxy-isoflavanon-Dehydratase

Vollständiger Ver-brauch zur Formo-nonetinsynthese



Formononetin Daidzein Isoflavon-Methyl-transferase

Nebenprodukt; Bildung nur in Grassilagen


Schrifttum

16


Kaempferol 5,7,4’-Trihydroxy-chalkon und Dihydroflavanol

Flavanon 3-Hydroxylase (EC 1.14.11.9)

Nebenprodukt Grassilagen, Gras, Heu

ÖZMEN 2014

Quercetin Kaempferol Flavon-Synthase (EC 1.14.11.22)

Nebenprodukt


Quercetin 3-O-Glucosid

Quercetin Flavonol 3-O-Glycosyl-transferase (EC 2.4.1.91)

ÖZMEN 2014

Rutin Quercetin 3-O-Glucosid

Flavonol 3-O-Glycosid-L-Rham-nosyltransferase (EC 2.4.1.159)

Nebenprodukt; Identifizierung in einer Grassilage, zwei Heuproben und einem Gras


ÖZMEN 2014

Vitexin (Flavon 8-C-Glycosid)

Apigenin Enzym nicht cha-rakterisiert

Direkte Derivatisie-rung der C-Atome des Grundgerüstes am entsprechen-den C-Glycosid ist sehr selten → nicht in allen Gras-silagen vorhanden, kein Vorkommen in Gras und Heu


Schrifttum

17


Apigenin 7-O-Glycosid

Apigenin Glykosylierung mittels Flavon 7-O-ß-Glycosyl-transferase (EC 2.4.1.81)

Zwischenprodukt; keine Identifizie-rung in Grassila-gen, da Flavon 7-O-Glykoside sehr schnell durch Enzyme zu Flavon 7-O-Rutinoside umgewandelt wer-den

BENAVENTE-GARCIA et al. 1993; ÖZMEN 2014; STICHER et al. 2015

Apigenin 7-O-Rutinosid

Apigenin 7-O-Glycosid

Flavanon 7-O-Glycosid-2‘‘-O-ß-L-Rhamnosyl-transferase (EC 2.4.1.236)

Grassilagen, Gras und Heu: Glycosy-lierung häufig an Hydroxylgruppen


LEWINSOHN et al. 1989; BAR-PELED et al. 1991; BENAVENTE-GARCIA et al. 1993; ÖZMEN 2014

Saponarin (Apigenin 6-C-Glucosid-7-O-Glucosid)

Apigenin 7-O-Glykosid



LEWINSOHN et al. 1989; BAR-PELED et al. 1991; BENAVENTE-GARCIA et al. 1993; ÖZMEN 2014

Schrifttum

18


Acacetin Apigenin Methoxylierung mittels Apigenin 4‘-O-Methyl-transferase (EC 2.1.1.75)

Grassilagen, Heu LEWINSOHN et al. 1989; BENAVENTE-GARCIA et al. 1993; ÖZMEN 2014

Acacetin 7-O-Glycosid

Acacetin Flavon 7-O-ß-Glycosyltrans-ferase

Zwischenprodukt; keine Identifizie-rung in Grassila-gen, da Flavon 7-O-Glycoside sehr schnell durch Enzyme zu Flavon 7-O-Rutinoside umgewandelt wer-den

BENAVENTE-GARCIA et al. 1993; ÖZMEN 2014

Aaciin (Acacetin 7-O-Rutinosid)

Acacetin 7-O-Glycosid


Hauptprodukt; Grassilagen, Gras und Heu: Glycosy-lierung häufig an Hydroxylgruppen


BAR-PELED et al. 1991; ÖZMEN 2014

Luteolin Apigenin Hydroxylierung mittels Flavonoid 3‘-Monooxygenase (EC 1.14.13.21)



Schrifttum

19


Luteolin 7-O-Glycosid

Luteolin Zwischenprodukt; keine Identifizie-rung in Grassila-gen, da Flavon 7-O-Glycoside sehr schnell durch Enzyme zu Flavon 7-O-Rutinoside umgewandelt wer-den

STICHER et al. 2015

Luteolin 7-O-Rutinosid



Grassilagen, Gras und Heu: Glycosy-lierung häufig an Hydroxylgruppen


BAR-PELED et al. 1991; ÖZMEN 2014

Orientin (Flavon 8-C-Glycosid)


Direkte Derivatisie-rung der C-Atome des Grundgerüstes am entsprechen-den C-Glycosid ist sehr selten → nicht in allen Gras-silagen vorhanden, kein Vorkommen in Gras

Grassilagen, Heu ÖZMEN 2014

Isoorientin Luteolin 7-O-Glycosid


ÖZMEN 2014

Diosmetin Luteolin Grassilagen, Gras, Heu

ÖZMEN 2014

Schrifttum

20


Diosmetin 7-O-Glycosid

Zwischenprodukt; Keine Identifizie-rung in Grassila-gen, da Flavon 7-O-Glycoside sehr schnell durch Enzyme zu Flavon 7-O-Rutinoside umgewandelt wer-den

ÖZMEN 2014; STICHER et al. 2015

Diosmin (Diosmetin 7-O-Rutinosid)


Hauptprodukt; Grassilagen, Gras und Heu: Glycosy-lierung häufig an Hydroxylgruppen


ÖZMEN 2014

Schrifttum

21

2.3 Fähigkeiten zur Komplexbildung

Pflanzen sind in der Lage, phenolische Substanzen zu speichern und zu ihrem eige-

nen Vorteil einzusetzen. Diese Substanzen können wasserlöslich sein, somit in der

Vakuole gespeichert werden, bzw. nicht wasserlöslich sein (STICHER et al. 2015).

Als lösliche Subtstanzen kommen sie in der Vakuole vor, als nicht lösliche als Be-

standteil von Lignin oder der Pflanzenzellwand (BORNEMAN et al. 1986). Wenn die

Zellstruktur der Pflanze herabgesetzt ist, durch Alterung, Ernte, oder Schädigung

durch Feinde, können diese Stoffe mit anderen Substanzen reagieren und Komplexe

bilden (HO et al. 1992; RAWEL et al. 2002).

Komplexe können durch einfache phenolische Substanzen gebildet werden (Mono-

phenole), sowie durch o-Diphenole und o-Chinone. Die beiden letztgenannten ent-

stehen durch enzymatische Oxydation mittels Polyphenoloxidase, einem in der

Pflanze ubiquitär vorkommenden Enzym (HASLAM 1974; LE BOURVELLEC u.

RENARD 2012). Dieses Enzym besteht aus Catecholoxidase (EC 1.10.3.1) und Lac-

case (EC 1.10.3.2). Die Catecholoxidase katalysiert sowohl die Reaktion von Mono-

phenolen zu o-Diphenolen (können über ortho-Gruppen andere Substanzen stärker

binden; McMANUS et al. 1981; RAWEL et al. 2007; STICHER et al. 2015) als auch

die aus o-Diphenolen entstehenden o-Chinone (HO et al. 1992; KROLL et al. 2001;

RAWEL et al. 2007; LE BOURVELLEC u. RENARD 2012; STICHER et al. 2015).

O-Chinone sind die reaktiveren Substanzen, sie sind in der Lage kovalente Bindun-

gen einzugehen (ROHN et al. 2006; PRIGENT et al. 2008). Durch kovalente Bindun-

gen können irreversible Komplexe entstehen (s. Kap. 2.3.1). RAWEL et al. (2002)

sprechen sogar davon, dass die Vorstufe der Komplexbildung, die Bildung von Chi-

nonen aus Diphenolen, erforderlich ist, um reaktivere Partner herzustellen.

2.3.1 Komplexformen

Phenolische Substanzen können mit weiteren Stoffen (z.B. mit Proteinen) u.a. rever-

sible und irreversible Komplexe bilden (HASLAM 1974; AUSTIN et al. 1989;

HASLAM 1996; TSAI u. SHE 2006; LE BOURVELLEC u. RENARD 2012; AYDEMIR

u. YEMENICIOGLU 2013). Diese unterscheiden sich anhand der Bindung, die zwi-

schen der phenolischen Substanz und dem Reaktionspartner entsteht (s. Tab. 2.6;

HASLAM 1974; PEREZ-MALDONADO et al. 1995; HOFMANN et al. 2006; LE

BOURVELLEC u. RENARD 2012). Ob es bevorzugte Bindungsarten und -stellen

gibt, ist bis heute nicht vollständig geklärt. Es wird angenommen, dass u.a. die Kon-

zentration der vorliegenden Reaktionspartner von entscheidender Rolle ist

(s. Abb. 2.1; HASLAM 1974; BAXTER et al. 1997; LE BOURVELLEC u.

RENARD 2012). SIEBERT et al. (1996) und LE BOURVELLEC u. RENARD (2012)

unterstellen eine schrittweise entstehende Komplexbildung, die initial durch eine re-

Schrifttum

22

versible Bindung (s. Tab. 2.6) der Reaktionspartner gestartet wird. Liegen multidenta-

le phenolische Substanzen (mehrere funktionelle Gruppen besitzend) sowie Proteine

in hoher Konzentration vor, können phenolische Substanzen an mehreren Proteinen

binden, diese Quervernetzungen entstehen durch irreversible, kovalente Bindungen

(s. Abb. 2.1; TSAI u. SHE 2006). Charakteristisch für die kovalenten Bindungen sind

die o-Chinone. Zur Entstehung irreversibler Komplexe wird, nach HO et al. (1992),

die Unterstützung von zusätzlichen Reagenzien (z.B. metallische Ionen) benötigt.

Tab. 2.6: Mögliche Bindungen der Reaktionspartner im Komplex und die daraus resultierende Komplexform

Komplexform Bindung Eigenschaft Literatur

Reversibel Wasserstoffbrücken-bindung (hydrogene Bindung)

Hydroxylgruppen der Phenole und Amid- oder Carbonylgrup-pen der anderen Stof-fe sind optimale Re-aktionspartner zur Bildung von Wasser-stoffbrückenbindun-gen

McMANUS et al. 1981; SIEBERT et al. 1996; BEVERIDGE et al. 2000; AYDEMIR u. YEMENICIOGLU 2013; OZDAL et al. 2013

Hydrophobe Wech-selwirkung

Wechselwirkung zwi-schen dem aromati-schen Ring der phe-nolischen Substanz und der hydrophoben Seite des Proteins; vermutlich stärkste Kraft der reversiblen Bindung

SIEBERT et al. 1996; LE BOURVELLEC u. RENARD 2012; AYDEMIR u. YEMENICIOGLU 2013

Van-der-Waals-Kraft Schwache Bindung, beeinflusst durch das umgebende Medium

CHARLTON et al. 2002

Ionenbindung Anion der Phenole mit Kation der Protei-ne

HASLAM 1996

Irreversibel Kovalente Bindung Kondensation der oxidierten phenoli-schen Gruppen mit den nukleophilen Gruppen (-SH, -OH, -NH2) der Proteine; Entstehung neuer Substanzen möglich

HASLAM 1974; RAWEL et al. 2002; RAWEL et al. 2005; ROHN et al. 2006; AYDEMIR u. YEMENICIOGLU 2013

Schrifttum

23

2.3.2 Einflüsse auf die Komplexbildung

Es gibt Faktoren, wie z.B. den pH-Wert, die Konzentration, die molekulare Größe, die

Temperatur, die die Komplexbildung fördernd oder hemmend beeinflussen. Diese

Einflüsse können vom umgebenden Medium, von der phenolischen Substanz selber

oder vom Reaktionspartner stammen (s. Tab. 2.7). Der Einfluss der Temperatur ist

nicht eindeutig geklärt. PRIGENT et al. (2003) sowie TSAI und SHE (2006) sagen,

dass die Auswirkungen der Temperatur sehr unterschiedlich sein können, sie sind

abhängig von den chemischen Eigenschaften der Reaktionspartner.

Schrifttum

24

Tab. 2.7: Einflüsse auf die Komplexbildung

Einfluss Auswirkung auf Komplexbildung

Literratur fördernd hemmend

pH-Wert pH 3,5-7,5: stabiler Komplex; pH-Wert im Bereich des iso-elektrischen Punktes des Pro-teins

pH <3,5: Komplex zerfällt JONES u. MANGAN 1977; RAWEL et al. 2005; OZDAL et al. 2013

Temperatur Zu hohe Temperatur kann zur Proteindenaturierung führen

RAWEL et al. 2005

Mit steigender Temperatur (5°C, 25°C, 60°C) sinkt die Bindungskapazität

PRIGENT et al. 2003

Temperatur um 40°C HOFMANN et al. 2006

38°C: reversible Komplexe 5°C: irreversible Komplexe

PEREZ-MALDONADO et al. 1995

Proteinstruktur Flexible, offene Struktur und hoher Gehalt von Prolin

Starre Moleküle HO et al. 1992; HASLAM 1996; SHAHIDI u. NACZK 2004; HOFMANN et al. 2006

Molekulare Größe Größere phenolische Substan-zen weisen höhere Bindungs-affinität auf und können an mehr als einer Stelle binden (multidentaler Ligand)

HASNI et al. 2011; OZDAL et al. 2013

Flexibilität des Phenols Geringe molekulare Flexibilität HO et al. 1992

Schrifttum

25


Salze und metallische Ionen

Aluminium, Kalzium → binden sich an beide Komponenten:

Proteine: an die Kar-boxylgruppen

phenolischen Substanz: über deren ortho-di-hydroxy Gruppen

HO et al. 1992; HASLAM 1996

Aceton Löst hydrogene Bindung (s. Tab. 2.6) auf

HO et al. 1992; OZDAL et al. 2013

Formamid Löst hydrogene Bindung auf HO et al. 1992

Saponine Fördern die Entwicklung einer hydrophoben Schicht an der Proteinoberfläche, die Anhäu-fung und die Ausfällung des Komplexes

HO et al. 1992

Tertiäre Amidgruppen der Co-Substrate

Fördern Phenol-Proteinbin-dung

HO et al. 1992; HOFMANN et al. 2006

Polysaccharide: Pektin, Polygalacturonsäure, Gummiarabikum, Dex-transulfat, Xanthan, Car-rageen

Kapseln phenolische Substan-zen ein, sodass diese keine Komplexbildung mit anderen Substanzen eingehen können

McMANUS et al. 1985; HO et al. 1992; LUCK et al. 1994

Natriumkasein Konkurriert mit Protein HO et al. 1992

N,N-dimethylformamid Harnstoff

Hydrogene Bindung-Akzeptor LE BOURVELLEC u. RENARD 2012

Dioxan Nichtpolarer Stoff LE BOURVELLEC u. RENARD 2012

Cytochrom C Kann den Komplex dissoziie-ren

LE BOURVELLEC u. RENARD 2012

Schrifttum

26

2.3.3 Phenol-Proteinkomplex

Die Phenol-Proteinbindung wird von mehreren Faktoren beeinflusst (s. Tab. 2.7).

Wichtig ist hier die Konzentration der Proteine (s.u., KAWAMOTO u.

NAKATSUBO 1997). Hinzu kommen die individuellen Eigenschaften verschiedener

Proteine und Phenole, wie die Hydrophobizität, der isoelektrische Punkt, die funktio-

nellen Gruppen, der strukturelle Aufbau (TSAI u. SHE 2006; OZDAL et al. 2013) so-

wie die Bedingungen der Umgebung (s. Tab. 2.7; KAWAMOTO u.

NAKATSUBO 1997).

Kleine, strukturell eher geschlossene, kugelige Proteine haben nur eine geringe Affi-

nität, phenolische Substanzen zu binden (HASLAM 1996). Proteine mit einer offe-

nen, flexiblen Struktur, die zudem prolinreich sind, weisen deutlich höhere Bindungs-

vorlieben auf (HO et al. 1992; HASLAM 1996; SHAHIDI u. NACZK 2004). Treffen

phenolische Substanzen und Proteine aufeinander, können die phenolischen Sub-

stanzen über ihre funktionellen Gruppen und ihren aromatischen Kern einen Kom-

plex formen, der, wie oben beschrieben, reversibel oder irreversibel ist.

Liegen nur wenige Proteine vor, agieren die phenolischen Substanzen (mit mehreren

funktionellen Gruppen) als eine Art Monolayer, der am Protein an einer oder mehre-

ren Stellen reversibel bindet und somit eine weniger hydrophile Oberfläche bildet als

die des Proteins, anschließend kommt es zur Ausfällung des Komplexes in Lösung

(s. Abb. 2.1; McMANUS et al. 1981; SPENCER et al. 1988; HASLAM 1996;

STICHER et al. 2015). Sind viele Proteine vorhanden, können die phenolischen Sub-

stanzen (mit mehreren funktionellen Gruppen) als multidentale Liganden an der Pro-

teinoberfläche agieren, d.h., eine phenolische Substanz kann an mehrere Proteine

binden (s. Kap. 2.3.1; McMANUS et al. 1981; HASLAM 1996). Durch Quervernet-

zungen mehrerer Proteine bildet sich eine hydrophobe Oberfläche, der Komplex prä-

zipitiert in Lösung (s. Abb. 2.1; HASLAM 1996; STICHER et al. 2015). Eine nicht vor-

handene Präzipitation bedeutet jedoch nicht, dass keine Komplexe vorhanden sind

(SHAHIDI u. NACZK 2004). Der multidentale Komplex kann zu einer strukturellen

Änderung der Reaktionspartner führen (SPENCER et al. 1988; PRIGENT et

al. 2003). Aber auch einfache phenolische Substanzen können mit Proteinen reagie-

ren und diese in Lösung ausfällen. Sie müssen in Lösung in einer Konzentration vor-

handen sein, die das Gleichgewicht zugunsten der Phenol-Proteinkomplexe halten

und somit eine hydrophobe Schicht auf der Oberfläche der Proteine bilden kann

(s. Abb. 2.2; HASLAM 1974; McMANUS et al. 1981; SPENCER et al. 1988).

Die Komplexbildung führt neben der strukturellen Veränderung auch zur Änderung

der Funktion und Eigenschaft der Substanz (RAWEL et al. 2005; OZDAL et al. 2013).

Zudem können Proteine in ihrer Löslichkeit und Verdaulichkeit beeinträchtigt werden

(OZDAL et al. 2013).

Schrifttum

27

Abb. 2.1: Phenol-Proteinkomplexbildung, phenolische Substanz mit zwei oder mehr funktionellen Gruppen: a) reversible Bindung, b) irreversible Bin-dung; modifiziert nach McMANUS et al. (1981)

Abb. 2.2: Phenol-Proteinkomplexbildung, einfaches Phenol; modifiziert nach McMANUS et al. (1981)

Protein

Protein

Protein

Protein

Protein


(viele funktionelle Gruppen)

a) Es liegen wenige Proteine vor,

Phenole agieren als Monolayer

b) Es liegen viele Proteine vor,

Phenole verbinden Proteine

(„cross-link“)

Protein

Einfaches Phenol

Protein

Schrifttum

28

2.3.4 Einfluss phenolischer Substanzen auf Sojaproteine

In dieser Arbeit wurden die Auswirkungen einer Fütterung von Silagen mit einem

RE-Anteil am RP von <50 %, aufgewertet durch eine Sojaproteinzulage, auf die Fer-

mentationsvorgänge im Verdauungstrakt in vitro getestet (s. Kap. 3). Speziell für die-

se Arbeit ist die Bindung von phenolischen Substanzen mit Sojaproteinen bedeutend.

RAWEL et al. (2002) untersuchten die Reaktionen verschiedener Phenolsäuren und

Flavonoide mit Sojaproteinen (s. Kap 2.3.4.1). Die wichtigsten in der Sojabohne vor-

kommenden Proteine sind das Glycinin (11S-Speicherproteinfamilie) und

β-Conglycinin (Glycoprotein, 7S-Speicherproteinfamilie; TSUMURA et al. 2004;

MO et al. 2006; RAWEL et al. 2007; MARUYAMA et al. 2015; GAN et al. 2016). Hin-

zu kommen das γ-Conglycinin, die Trypsininhibitoren und Lectine (nähere Informati-

onen zum Aufbau des Sojaproteins s. GÖRES 2016). Glycinin hat eine, verglichen

mit β-Conglycinin, kompaktere Konformation, die zur Limitierung der funktionellen

Eigenschaften führt (CUI et al. 2013).

2.3.4.1 Glycinin und Trypsininhibitoren

RAWEL et al. (2002) wiesen nach, dass Glycinin und Trypsininhibitoren durch Chlo-

rogen-, Kaffee- und Gallussäure sowie verschiedene Flavonoide, Flavone, Apigenin,

Kaempferol, Quercetin und Myricetin komplexiert werden und überwiegend über

kovalente Bindungen, an den nukleophilen Seitenketten der Proteine, verbunden

sind. Nach ALU’DATT et al. (2014) wurden hauptsächlich p-Cumar-, Syringasäure

und Hesperidin, gebunden an Sojaproteinisolaten, gefunden, Gallus-, Hydroxyben-

zoe-, Kaffee-, Syringa-, p-Cumar- und Ferulasäure an Leinsamproteinisolaten.

Zwischen den von RAWEL et al. (2002) getesteten Proteinen und Phenolsäuren so-

wie Quercetin und Myricetin entstehen während der Komplexierung neben den kova-

lenten Bindungen vermutlich auch nicht-kovalente Bindungen (s. Tab. 2.6), die auf

die Caroboxyl- bzw Hydroxylgruppen (Flavonoide) zurückzuführen sind. Die neuen

Komplexe weisen einen in den niedrigeren pH-Bereich verschobenen isoelektrischen

Punkt sowie höhere molekulare Fraktionen auf. Die isoelektrischen Punkte von Gly-

cininkomplexen verschieben sich von pH 5 zu pH 3,5, die isoelektrischen Punkte der

Trypsininhibitorkomplexe sinken über einen größeren pH-Bereich. Die Glycininkom-

plexe (Glycinin und Chlorogensäure, sowie Glycinin und Quercetin) haben ähnliche

Löslichkeiten (in Ethanol und deionisiertem Wasser), die Trypsininhibitorkomplexe

(Trypsininhibitoren und Chlorogensäure, Kaffeesäure, Gallussäure und Quercetin)

weisen stark voneinander abweichende Löslichkeiten auf.

Weiterhin konnten RAWEL et al. (2002) nachweisen, dass die phenolischen Sub-

stanzen unterschiedlich mit den Proteinen reagieren. Die Reaktivität von Chlorogen-

und Kaffeesäure ist in etwa gleich, Flavonoide hingegen reagieren schneller, bedingt

durch die Anzahl und Position der Hydroxylgruppen. Quercetin und Myricetin können

über ihre Hydroxylgruppen am B- und C-Ring mehr Bindungen, verglichen mit Flavo-

Schrifttum

29

ne und Apigenin, mit den Tryptophanseitenketten der Proteine eingehen. Eine Pro-

teinderivatisierung (sowohl Glycinin als auch die Trypsininhibitoren) mit phenolischen

Substanzen hat eine Reduzierung des Tryptophangehalts zur Folge (s.u., RAWEL et

al. 2002). Der Tryptophangehalt von Glycinin liegt bei 33,1 nmol mg-1 protein, bindet

Chlorogensäure am Glycinin, sinkt er auf 11,6 nmol mg -1 protein. Bindet Quercetin

am Glycinin, liegt er nur bei 6,9 nmol mg –1 protein. Seitens der Proteine werden auch

Bindungen mit phenolischen Substanzen über die α-Amino- und ε-Lysinseitenketten

(stark nukleophile Reaktionsseiten) vermutet (RAWEL et al. 2002).

Weiterhin fanden RAWEL et al. (2002) auch Einwirkungen auf den Gehalt an Thi-

olgruppen (vom Glycinin) heraus. Diese werden nicht zu Disulfidbrücken umgebaut,

sie reagieren mit den phenolischen Substanzen. Die oben genannten Phenolsäuren

reagieren ähnlich mit den Thiolgruppen, bei den Flavonoiden hingegen zeigen nur

Apigenin und Kaempferol eine Reaktivität, deren Mechanismus jedoch noch uner-

forscht ist.

RAWEL et al. (2002) geben anhand der Analysen von Tryptophan, der freien Amino-

gruppen und der Thiolgruppen eine Prognose zur Reaktion der phenolischen Sub-

stanzen mit der Gesamtheit der Proteinseitenketten. Demnach kann man, unter Vor-

behalt, folgende Reihenfolge zur Reaktivität und Bindungsstärke festlegen:

Gallussäure > Chlorogensäure ≈ Quercetin > Myricetin > Kaffeesäure > Kaempferol

> Apigenin > Flavone.

Weiterhin konnte ein Einfluss der phenolischen Substanzen auf die Struktur von Gly-

cinin dargestellt werden. Normalerweise setzt sich unverändertes Glycinin aus

α-Helix (14 %), β-Strang (35 %), β-Schleife (20 %) und ungeordneter Struktur (31 %)

zusammen (RAWEL et al. 2002). Chlorogensäure führt zu jeglicher Art von Verände-

rungen der sekundären Struktur, Kaffee- und Gallussäure senken geringfügig den

Anteil der α-Helix-Fraktion. Flavone senken die Anteile der α-Helix- und

β-Strang-Fraktionen. Apigenin, Kaempferol und Quercetin hingegen steigern den

Anteil der α-Helix- und β-Strang-Fraktionen. Myricetin wirkt sich negativ auf die

α-Helix aus, steigert wiederum die Anteile der β-Strang- und β-Schleife-Fraktionen.

Die Ergebnisse von RAWEL et al. (2002) zeigten auf, dass die Veränderungen der

Proteinstruktur abhängig vom Komplexpartner, also der jeweiligen phenolischen

Substanz, sind.

Schrifttum

30

2.3.4.2 β-Conglycinin

GAN et al. (2016) untersuchten die Bindung von β-Conglycinin mit p-Cumarsäure,

Kaffeesäure, Gallussäure und Chlorogensäure. β-Conglycinin besitzt eine trimere

Struktur (PICARIELLO et al. 2013; MARUYAMA et al. 2015), bestehend aus den

Untereinheiten α, α' und β. Die α-,α'-Untereinheiten, Präpro-Formen, besitzen neben

der Kerndomaine eine Erweiterung am N-Terminus, die β-Untereinheit, Prä-Form,

besteht nur aus der Kernregion (MARUYAMA et al. 1998, 2015). Alle Untereinheiten

sind N-glykosyliert und besitzen Mannose-Glykane (PICARIELLO et al. 2013;

MARUYAMA et al. 2015). GAN et al. (2016) stellten folgende Einteilung der Un-

tereinheiten von β-Conglycinin auf: α-Helix (19 %, α und α‘), β-Faltblatt (28,7 %) und

zufällige Wicklungen (35,3 %). β-Conglycinin weist eine hohe Affinität gegenüber

Fettsäuren, Phospholipiden und aromatischen Verbindungen auf. Kaffee- und Gal-

lussäure binden 7S-Speicherproteine effektiver als p-Cumarsäure, da sie eine Hyd-

roxylgruppe mehr besitzen, alle vier genannten phenolischen Verbindungen führen

durch ihre Bindung kaum zu Veränderungen der Proteinstruktur (im Vergleich zu

Glycinin). GAN et al. (2016) stellten die These auf, dass die Proteinstruktur nicht

durch phenolische Substanzen verändert oder zerstört wird. Diese Phenolproteinbin-

dungen beeinflussen den enzymatischen Proteinverdau (Pepsin und Trypsin) nicht.

2.3.5 Enzymhemmung durch phenolische Substanzen

Phenolische Substanzen können die Wirkmechanismen eines Enzyms auf unter-

schiedliche Weise hemmen (HASLAM u. LILLEY 1988). Sie können so bspw. die

Verdaulichkeit von phenolreichen Pflanzen herabsetzen. HASLAM und

LILLEY (1988) beschreiben als mögliche hemmende Einflüsse Enzympräzipitation

durch phenolische Substanzen, eine Phenol-Substratkomplexbildung und eine En-

zym-Inhibitorkomplexbildung. Letztere wird in Abbildung 2.3 dargestellt. Binden keine

phenolischen Substanzen am Enzym, kann es das Substrat aufnehmen und verar-

beiten (Produkte; s. Abb. 2.3, unterer Weg). Kommt es jedoch zur Bindung der phe-

nolischen Substanzen (Inhibitor) am Enzym, kann ein löslicher, aber inaktiver Kom-

plex entstehen, sodass zwar Substrat am Enzym gebunden wird, dieses aber nicht

wieder verlässt. Die Aktivität der Enzyme ist gehemmt (HASLAM u. LILLEY 1988).

Schrifttum

31

Abb. 2.3: Enzymhemmung durch phenolische Substanzen; modifiziert nach HASLAM u. LILLEY (1988)

Es gibt Substanzen, die können die hemmende Wirkung der phenolischen Substan-

zen auf die Enzyme herabsetzen. Proteine, wie Lysozym, Soja und Rinderserumal-

bumin, sowie einige Alkaloide können einen Komplex mit den phenolischen Substan-

zen eingehen, sodass diese die Enzyme nicht inaktivieren können (HASLAM u.

LILLEY 1988).

MARTINEZ-GONZALEZ et al. (2017) sagen, dass die Interaktionen zwischen Enzy-

men und phenolischen Substanzen noch nicht ausreichend erforscht sind. Sie gehen

davon aus, dass die reversiblen Bindungen (Van-der-Waals-Kräfte, Ionenbindungen,

etc., s. Tab. 2.6) die Enzym-Phenol-Bindungen regulieren. Des Weiteren hat die An-

zahl an Hydroxylgruppen einen Einfluss, mit steigenden Hydroxylgruppen steigt

bspw. die Bindung von Flavonoiden mit Trypsin. Flavonoide zeigen zudem, auf

Grund ihrer komplexeren Struktur, einen stärkeren inhibitorischen Effekt auf Enzyme

als Phenolsäuren (MARTINEZ-GONZALEZ et al. 2017).

Enzym

Substrat

phenolische

Substanzen (Inhibitor)

Produkte

Enzym + Substrat

Schrifttum

32

2.3.6 Einfluss von Pepsin und dem pH-Wert auf die Struktur der Sojaprote-

ine

Der Wiederkäuer nimmt phenolische Substanzen über das Grundfutter auf. Das Fut-

ter gelangt, nachdem es den Pansen (erster in vitro Entnahmeort, s. Kap.1) und das

weitere Vormagensystem passiert hat, in den Labmagen (zweiter in vitro Entnahme-

ort). Die Auswirkungen von Pepsin und des pH-Wertes stehen hier besonders im Fo-

kus, da ein Einfluss dieser auf verschiedene Fütterungsmodelle (s. Kap. 3) getestet

wurde. Saure Milieubedingungen (pH 2-3) führen zu einer Entfaltung der Protein-

struktur, sodass auch gerade die verborgenen Strukturen im Inneren des Proteins für

enzymatische Reaktionen zugänglich werden (CUI et al. 2013). Dies allein führt je-

doch nicht zur vollständigen Zerlegung des Proteins, sodass eine enzymatische Re-

aktion notwendig ist (CUI et al. 2013).

Das Reaktionsoptimum von Pepsin liegt im sauren pH-Bereich (pH 1,5-2;

BAKER 1954; CUI et al. 2013), sodass ein niedriger pH-Wert günstige Umgebungs-

bedingungen für enzymatische Reaktionen bietet.

Wie oben beschrieben, besteht das Sojaprotein hauptsächlich aus Glycinin und

β-Conglycinin (70 %; TSUMURA et al. 2004). Die verschiedenen Untereinheiten des

Proteins führen zu einem zeitlich separierten enzymatischen Abbau. Bereits

BAKER (1954) beschrieb einen Proteinabbau, der diese These unterstreicht. Es wird

ein Enzym-Substratkomplex beschrieben, der normalerweise zwei Produkte entlässt.

Hier kommt es jedoch nur zur Freisetzung eines Produktes, das andere ist weiterhin

am Enzym gebunden und es wird erst später entlassen. CUI et al. (2013) fanden

heraus, dass die Glycininfraktion im sauren Milieu von Pepsin hydrolysiert werden

kann. Bereits nach zehn Minuten kam es zu ersten Spaltungen innerhalb des Pro-

teins, nach 120 Minuten war Glycinin vollständig zerlegt. β-Conglycinin hingegen

zeigte innerhalb seiner drei Untereinheiten sehr unterschiedliche Reaktionsmuster.

Die α-Untereinheit verschwand mit steigender Inkubationszeit, die α‘- und

β-Untereinheiten zeigten nur mäßige Auswirkungen einer enzymatischen Reaktion

auf ihre Bindungen (CUI et al. 2013; YANG et al. 2016). YANG et al. (2016) legen

allerdings dar, dass gerade β-Stränge anfällig sind für Hydrolysen mittels Pepsin.

GAN et al. (2016) schildern, dass das im Sojaprotein vorkommende Glycopeptid

β-Conglycinin (7S) mit phenolischen Substanzen reagiert. Das Protein kann dennoch

ungehindert von den Enzymen Pepsin und Trypsin abgebaut werden, da die phenoli-

schen Substanzen und Enzyme an verschiedenen Stellen am Protein binden (es

kommt zu keiner Enzymhemmung, da es keine direkte Phenol-Enzymbindung geben

soll). Dieser Abbau ist sowohl bei pH-Wert 2 und 4 möglich.

Schrifttum

33

2.4 Aufnahme von phenolischen Substanzen: Auswirkungen auf den

Wiederkäuer

Wiederkäuer nehmen phenolische Substanzen über das Grundfutter auf. Durch den

Zerfall der Pflanzenzelle treten diese in Wechselwirkung mit anderen Stoffen, wie

den Proteinen aus der Pflanze selbst, aber auch mit Speichelproteinen

(McNABB et al. 1996; WAGHORN 2008). Die Wechselwirkung mit Speichelproteinen

tritt vor allem bei Tieren, die ihre Nahrung selektiv aufnehmen, auf

(AUSTIN et al. 1989; HAGERMAN u. ROBBINS 1993). Diese Tiere haben eine im

Verhältnis zu ihrem Körpervolumen große Glandula parotis, über die Speichel mit

einer hohen Konzentration an prolinreichem Protein produziert wird

(WAGHORN 2008). Diese Proteine besitzen eine hohe Bindungskapazität gegen-

über Tanninen, besonders kondensierten Tanninen (Entstehung über Flavonoidbio-

synthese, s. Kap. 2.2). Diese Methode nutzen sie, um den seitens der Pflanze entwi-

ckelten chemischen Schutz gegen Blattverlust umgehen zu können und die antinutri-

tiven Effekte hoher Tanninkonzentrationen zu reduzieren. Einige dieser Tiere, wie

der Elch, haben sehr spezifische Speichelproteine. Diese binden nur die phenoli-

schen Substanzen, die normalerweise in ihrer Nahrung (Weide, Espe oder Birke)

vorkommen. Domestizierte Kühe und Schafe (grasende Tiere) besitzen diese beson-

dere Fähigkeit nicht (AUSTIN et al. 1989). Als mögliche Ursachen werden die Do-

mestikation, Zucht und Selektion genannt (WAGHORN 2008). Hier können phenoli-

sche Substanzen verschiedene Effekte, die sowohl begünstigend als auch hemmend

sein können, ausüben. So kann bereits die freiwillige Futteraufnahme reduziert sein

(ULYATT et al. 1977; BARRY u. DUNCAN 1984; WAGHORN 2008).

Vorangegangene Studien befassen sich überwiegend mit dem Vorhandensein von

Proanthocyanidinen (kondensierte Tannine, entstehen im Flavonoidstoffwechsel aus

Dihydroquercetin und Catechin) in Leguminosen. Es fehlt jedoch eine weitere Diffe-

renzierung der Substanzen und es geht nicht hervor, welche phenolischen Substan-

zen im Einzelnen und in welchem Umfang zu bestimmten Auswirkungen führen. Die-

se Gruppe phenolischer Substanzen kommt auch in Gräsern vor, allerdings in deut-

lich geringeren Konzentrationen und es zeigen sich möglicherweise schwächere

Auswirkungen (ROSS u. JONES 1974; AERTS et al. 1999; WAGHORN 2008).

BORNEMAN et al. (1986) untersuchten einen Einfluss einiger, für Gräser bedeutsa-

meren, Phenolsäuren (u.a. p-Cumarsäure, Ferulasäure) auf die Pansenbakterienpo-

pulation. Sie fanden sowohl positive wie auch negative Einflüsse heraus. Nichtzellu-

lolytische Bakterien scheinen eine größere Toleranz gegenüber phenolischen Sub-

stanzen zu besitzen als zellulolytische Bakterien (BORNEMAN et al. 1986). Auch

LOWRY et al. (1993) untersuchten Gräser auf das Vorhandensein und die Auswir-

kungen von Phenolsäuren. Sie fanden keinen nachteiligen Effekt dieser Substanzen

auf den Metabolismus der Pansenbakterien. Die dort aufgezeigten Auswirkungen der

Schrifttum

34

Phenolsäuren bezogen sich auf einen hohen Stickstoffverlust, besonders bei Fütte-

rung von stickstoffarmen Futtermitteln.

Tabelle 2.8 gibt eine Übersicht bekannter Auswirkungen phenolischer Substanzen

auf den Wiederkäuer. Diese sind sehr abhängig von dem Typ und der Konzentration

der vorkommenden phenolischen Substanz sowie der Futterkomposition, der aktuel-

len körperlichen Verfassung des Tieres und dem Vorhandensein weiterer Stoffe

(WAGHORN 2008). Negative Auswirkungen zeigen sich bei einer hohen Konzentra-

tion an phenolischen Substanzen in der Trockenmasse (AERTS et al. 1999).

Schrifttum

35

Tab. 2.8: Postulierte Auswirkungen phenolischer Substanzen auf den Wiederkäuer

Phenolische Substanz Vorkommen Effekt Literatur

Proanthocyanidine Lotus corniculatus

Verhindern Proteinabbau (Desaminierung) durch Pansenmikroorganismen

BARRY u. MANLEY 1984; BARRY u. McNABB 1999; WAGHORN 2008

Proanthocyanidine Lotus pedunculatus

Binden Proteine, sodass diese unlöslich werden

BARRY u. DUNCAN 1984; WAGHORN 2008

Proanthocyanidine Lotus corniculatus Hedysarum coronarium

Verringern Gefahr der Pansentympanie und schaumige Gärung

ROSS u. JONES 1974; ULYATT et al. 1977; JOHN u. LANCASHIRE 1981; BARRY u. DUNCAN 1984; MIN et al. 2003

Proanthocyanidine Lotus corniculatus

Erhöhen duodenalen Proteinfluss, indem sie den Proteinabbau im Pansen reduzie-ren

JOHN u. LANCASHIRE 1981; BARRY u. DUNCAN 1984; WAGHORN et al. 1987; PEREZ-MALDONADO et al. 1995; AERTS et al. 1999; WAGHORN 2008

Proanthocyanidine Lotus corniculatus Onobrychis coronarium

Reduzieren die proteolytische Bakterienpo-pulation

MIN et al. 2003; WAGHORN 2008

Proanthocyanidine Lotus pedunculatus Onobrychis coronarium

Reduzieren Aminosäureabsorption im Duo-denum

WAGHORN et al. 1994; WAGHORN 2008


Erhöhen Nettoabsorption essentieller Ami-nosäuren

WAGHORN et al. 1987; MIN et al. 2003

Schrifttum

36


Proanthocyanidine Lotus corniculatus Lotus pedunculatus

Erhöhen postruminale NPN-Absorption ULYATT et al. 1977; JOHN u. LANCASHIRE 1981; BARRY 1984; MIN et al. 2003

Proanthocyanidine Lotus pedunculatus Acacia aneura

Setzen die freiwillige Futteraufnahme und Trockenmasseaufnahme herab

BARRY u. DUNCAN 1984; PRITCHARD et al. 1988; WAGHORN et al. 1994

Proanthocyanidine Lotus pedunculatus Reduzieren Faserverdaulichkeit im Pansen BARRY et al. 1986


Verringern scheinbare Verdaulichkeit von strukturierten Kohlenhydraten, organischer Masse, Trockenmasse, Stickstoff

BARRY u. DUNCAN 1984; BARRY u. MANLEY 1984; PRITCHARD et al. 1988; WAGHORN et al. 1994; PEREZ-MALDONADO et al. 1995

Proanthocyanidine Setzten Schmackhaftigkeit des Futters her-ab

BARRY u. DUNCAN, 1984; PEREZ-MALDONADO et al. 1995


Erhöhen Milchproduktion und Laktosege-halt ab Mitte der Laktation

BARRY u. McNABB 1999; MIN et al. 2003


Gesteigerte Ovulationsrate (k. A. zum Me-chanismus)

BARRY u. McNABB 1999; MIN et al. 2003

Proanthocyanidine Lotus pedunculatus Senken die Körpermassezunahme BARRY u. McNABB 1999

Proanthocyanidine Lotus corniculatus Erhöhen das Lebendgewicht bei Lämmern (k. A. zum Mechanismus)

WAGHORN 2008

Schrifttum

37



Steigern Wolleproduktion (k. A. zur Ursa-che)

TERRILL et al. 1992; MIN et al. 2003; WAGHORN 2008


Reduzieren Wolleproduktion PRITCHARD et al. 1988; BARRY 1985

Proanthocyanidine Lotus corniculatus Lotus pedunculatus

Erhöhen Absorption von pflanzlichem Me-thionin und Cysteine

WANG et al. 1994


Senken die negativen Auswirkungen (k. A.) von Endoparasiten

BARRY u. McNABB 1999; MIN et al. 2003; WAGHORN 2008

Proanthocyanidine Reduzieren Stickstoffverdaulichkeit WAGHORN 2008

Proanthocyanidine Erhöhen Stickstoffkonzentration in Faeces WAGHORN 2008

Proanthocyanidine Reduzieren Stickstoffausscheidung über den Harn

WAGHORN 2008

Proanthocyanidine Lotus spezies Verbessern Toleranz gegenüber Endopa-rasiten, reduziert Einsatz von chemischen Anthelmintika

AERTS et al. 1999; BARRY u. McNABB 1999; WAGHORN 2008

Proanthocyanidine Reduzieren Produktion und Konzentration der flüchtigen Fettsäuren im Pansen

WAGHORN 2008

Proanthocyanidine Können von Pansenmikroorganismen nicht verdaut werden

WAGHORN 2008

Proanthocyanidine Lotus spezies Hemmen Enzyme, sodass diese nicht in der Lage sind, Proteine zu spalten

HASLAM u. LILLEY 1988; WAGHORN 2008

Hydrolisierbare Tanni-ne

Pansenmikroflora: Gute Adaption und Ver-daulichkeit dieser phenolischen Substan-zen

LOWRY et al. 1993; WAGHORN 2008

Schrifttum

38


Sinapinsäure Cynodon dactylon Keine signifikanten Effekte auf Ruminococ-cus albus 7, stimulieren das Wachstum von Lachnospira multiparus D-32

BORNEMAN et al. 1986

Syringasäure Cynodon dactylon Stimuliert Wachstum von Ruminococcus albus 7, Ruminococcus flavefaciens FD-1, Butyrivibrio fibrisolvens 49, Lachnospira multiparus D-32, in Anwesenheit von Kohlenhydraten


Vanillinsäure Cynodon dactylon Keine signifikanten Effekte auf Ruminococ-cus albus 7, stimulieren das Wachstum von Lachnospira multiparus D-32


Hydroxyzimtsäure Cynodon dactylon Stimuliert Wachstum von Ruminococcus albus 7, Ruminococcus flavefaciens FD-1, Butyrivibrio fibrisolvens 49, Lachnospira multiparus D-32, in Anwesenheit von Kohlenhydraten;


p-Hydroxybenzaldehyd Cynodon dactylon Toxisch für Ruminococcus albus 7, Rumi-nococcus flavefaciens FD-1, Butyrivibrio fibrisolvens 49, Lachnospira multiparus D-32


p-Hydroxybenzoesäure Cynodon dactylon Stimuliert Wachstum von Ruminococcus albus 7, Ruminococcus flavefaciens FD-1, Butyrivibrio fibrisolvens 49, Lachnospira multiparus D-32, in Anwesenheit von Kohlenhydraten


Schrifttum

39


Gallussäure Decarboxylierung zu Pyrogallol, Phloroglu-cinol, Acetat, Butyrat


Ellagsäure Decarboxylierung zu Pyrogallol, Phloroglu-cinol, Acetat, Butyrat


p-Cumarsäure Cynodon dactylon Toxisch für Ruminococcus albus 7, Rumi-nococcus flavefaciens FD-1, Butyrivibrio fibrisolvens 49, Lachnospira multiparus D-32: Langsames Wachstum; keine Adap-tion nach drei 24-Std.-Phasen


p-Cumarsäure Urochloa mozambicen-sis Heteropogon contortus

Geringe Reduzierung der Futteraufnahme, keine Beeinflussung der mikrobiellen Aktivi-täten im Pansen, Ausscheidung als Hippur-säure (Exkremente)


Ferulasäure Cynodon dactylon Hemmt Ruminococcus albus 7, stimulieren das Wachstum von Lachnospira multiparus D-32


Ferulasäure Urochloa mozambicen-sis Heteropogon contortus

Keine Reduzierung der Futteraufnahme, keine Beeinflussung der mikrobiellen Aktivi-täten im Pansen, Ausscheidung als Hippur-säure (Exkremente)


Eigene Untersuchungen

40

3 Eigene Untersuchungen

3.1 Versuchsziel

Ziel der Untersuchungen war, die Auswirkungen von Grassilagen mit unterschiedli-

chen Reineiweißgehalten am Rohprotein sowie einer Zulage von Sojaprotein auf den

Gehalt an phenolischen Substanzen zu verschiedenen Verdauungszeitpunkten zu

untersuchen, sowie den Kohlenhydratstoffwechsel darzustellen, um möglicherweise

weitere Ursachen für die „Faktorenerkrankung im Milchviehbetrieb“ zu finden. Mit

Hilfe des Langzeitinkubationssystems RUSITEC wurde das Probenmaterial gewon-

nen und mittels den unten beschriebenen Methoden aufbereitet.

3.2 Material und Methoden

Das hier verwendete Probenmaterial entstammt einem Gesamtprojekt, in dessen

Zusammenhang auch die Dissertationen von GÖRES (2016), ILLE (2017),

THOMSEN (in Vorbereitung), EBHARDT (in Vorbereitung) und SCHULTE (in Vorbe-

reitung) entstanden sind. Im Anhang (Tab. 9.2 und 9.3) ist eine Übersicht über die

Probenentnahme und Parameterverteilung der einzelnen Dissertationen dargestellt.

Im Gesamtprojekt wurden in zwölf RUSITEC-Durchgängen Silagen von zwei Betrie-

ben aus Norddeutschland (s. Kap. 3.2.3.1) getestet. Die Versuchsdurchgänge unter-

liegen in ihrer Bezeichnung einem im Pansenlabor der Klinik für Rinder durchgeführ-

ten, fortlaufenden System. Ein Versuchsdurchgang, bezeichnet als „Lauf“ (L), um-

fasst 28 Versuchstage. Das Gesamtprojekt bezieht sich auf die Läufe 31-42. Das in

dieser Arbeit analysierte Probenmaterial entstammt den L35-42. Diese acht Ver-

suchsdurchgänge wurden in zwei Laufgruppen unterteilt (L35-38, L39-42).

Tabelle 3.1 gibt eine Übersicht der Bezeichnung der Läufe (L), Fermenter (F) und der

eingesetzten Silagen (Kontrollsilage: K, Schadsilage: S, mit Sojazulage: mS, näheres

hierzu s. Kap. 3.2.3.1).


41

Tab. 3.1: Bezeichnung der Läufe und Fermenter (mit Silagebeschickung)

Bezeichnung

Laufgruppe Lauf KF¹ 1+2 TF² 3+4 TFmS3 5+6

II 35, 36, 37, 38 KF-32

(beladen mit K-32)

TF-33 (beladen mit

S-33)

TF-33mS (beladen mit

S-33mS)

III 39, 40, 41, 42 KF-32

(beladen mit K-32)

TF-35 (beladen mit

S-35)

TF-35mS (beladen mit

S-35mS) 1 KF: Kontrollfermenter 2 TF: Testfermenter 3TFmS: Testfermenter mit Sojazulage

Im Folgenden werden die Materialien und Methoden der für diese Arbeit wichtigen

Parameter und RUSITEC-Durchgänge (L35-42) beschrieben. Weitere Informationen

können den in der Vergangenheit durchgeführten Arbeiten im Pansenlabor (Tab. 9.1)

entnommen werden.

3.2.1 Rumen Simulation Technique (RUSITEC)

3.2.1.1 Aufbau und Funktionsweise

Die untersuchten Proben entstammten aus dem nach CZERKAWSKI und

BRECKENRIDGE (1977) entwickelten In-vitro-Langzeitinkubationssystem RUSITEC.

Das geschlossene, semikontinuierliche Durchflusssystem simuliert die Verdauungs-

vorgänge im Pansen und ermöglicht eine über einen längeren Zeitraum bestehende

Fermentationsphase. Diese findet in sechs geschlossenen und voneinander unab-

hängigen Fermentern statt. Eine nähere Beschreibung des Aufbaus und der Funkti-

onsweise ist den Dissertationen von GAST (2010) und GRESNER (2011) zu ent-

nehmen.

3.2.1.2 Inbetriebnahme

Die Vorbereitungen vor Inbetriebnahme des RUSITEC-Systems sowie die anschlie-

ßende Beladung erfolgte in den acht Versuchsdurchläufen analog dem bei

GRESNER (2011) beschriebenen Schema. Im Gegensatz zur dort durchgeführten

Beladung mit Heu und Kraftfutter wurde hier mit Grassilage und Maisstärke beladen.

Alle Fermenter wurden zu Beginn einheitlich beschickt, um identische Bedingungen

in den Fermentern zu schaffen.

Am Tag der Inbetriebnahme (Tag 0) wurde jeder Fermenter mit zwei Nylonbeuteln

bestückt. Der eine enthielt 80 g (uS) festen Panseninhalt eines Spendertieres und

2,6 g (uS) Maisstärke, der andere war mit 10,5 g (TS) Grassilage (K-32) und

2,6 g (uS) Maisstärke befüllt. Die Fermenter wurden zusätzlich mit jeweils 500 ml


42

flüssigem Panseninhalt (s. Kap. 3.3.2.1), 200 ml RUSITEC-Puffer (s. Kap. 3.2.1.4)

und 100 ml ionenfreiem Wasser befüllt (s. Tab. 3.8).

3.2.1.3 Dauerbetrieb

Das Fermentationssystem lief über einen Versuchszeitraum von 28 Tagen, der in

verschiedene Phasen eingeteilt war (s. Tab. 3.8). Die Futterbeutel wurden während

des Dauerbetriebs mit Grassilage (10,5 g TS), Maisstärke (2,6 g uS) und Fermen-

ter 5+6 zusätzlich mit Sojaprotein (0,33 g uS) befüllt (s. Tab. 3.2).

Eine tabellarische Übersicht der täglichen Aufgaben kann Tabelle 3.2 entnommen

werden (abweichend vom täglichen Arbeitsablauf ist der bereits 24 Stunden nach

Inbetriebnahme erfolgte Austausch der Nylonbeutel mit festem Panseninhalt gegen

Nylonbeutel, die mit Grassilage befüllt waren). Für die in dieser Arbeit zu analysie-

renden Parameter wurden 6 ml Fermenterflüssigkeit zur Bestimmung der flüchtigen

Fettsäuren sowie 10 ml Fermenterflüssigkeit zur Phenol- und o-Diphenolbestimmung

entnommen. Hinzu kamen 10 ml Überstandflüssigkeit zur Bestimmung der Produkti-

on der flüchtigen Fettsäuren (FlFS) und 20 ml Überstandsflüssigkeit zur Bestimmung

der Phenol- und Diphenolgehalte.

Zusätzlich wurden aus den 6 Fermentern täglich weitere 26 ml Flüssigkeit entnom-

men, die im Rahmen der Disserationen von GÖRES (2016), ILLE (2017),

THOMSEN (in Vorbereitung), EBHARDT (in Vorbereitung) und SCHULTE (in Vorbe-

reitung) analysiert wurden. Tabelle 9.3 gibt eine Übersicht der Parameterverteilung.


43

Tab. 3.2: Übersicht der täglichen Arbeitsschritte, modifiziert nach GAST (2010), LUMPP (2011) und GÖRES (2016)

Zeit (min) Arbeitsschritt

-40 Laborvorbereitung Filtrierung der BRADFORD-Lsg. Eichung des GC-8A Eichung der pH- und Ammoniakelektrode

0 Abschaltung des RUSITEC (Hubmotor, Pufferzufuhr)

1 Abkopplung der Gasbeutel

2-45 Entnahme des Fermenters aus dem Wasserbad Öffnen des Fermenters und Entnahme der Fermenterproben Entnahme des seit 48 h inkubierten Nylonbeutels und Einset-

zen eines neu beladenen Beutels Entleerung und Spülung des herausgenommenen Nylonbeu-

tels (mit 50 ml warmer Pufferlösung) Rückführung der Spülflüssigkeit in den Fermenter Fermenterschließung und Arretierung im Wasserbad Wiederholung dieser Schritte an den Fermentern 2-6

Bestimmung des Überstandsvolumens und Entnahme der

Überstandsproben Vorlegen von 40 ml halbkonzentrierter Salzsäure in die Über-

standsgefäße

Messung des Gasvolumens in den Gasbeuteln Entnahme von 1 ml Gasprobe zur Messung der Zusammen-

setzung am GC-8A

45 Einschaltung der Pufferzufuhr

45-60 1 minütige CO2-Begasung der Fermenter mit direktem An-schluss eines leeren Gasbeutels

Einschaltung Hubmotor

60-210 Probenaufbereitung, -analytik und –asservierung Vorbereitungen für den nächsten Versuchstag (Futtermittel

und Bedarfsgegenstände) Reinigung des Arbeitsplatzes


44

3.2.1.4 Zusammensetzung der Pufferlösung

Die Pufferlösung, die dem Fermentationssystem zugeführt wurde, diente der Simula-

tion des Speichelflusses sowie der Spülung der im Innenbehälter des Fermenters

befindlichen futtergefüllten Nylonsäckchen. Der Puffer bestandt aus einer Lösung A

(4950 ml), zu der langsam tropfend unter ständigem Rühren 50 ml von Lösung B

hinzugegeben wurde. Die Zusammensetzung des Puffers entsprach der Vorgabe

von McDOUGALL (1948, Tab. 3.3).

Tab. 3.3: Zusammensetzung der Pufferlösung nach McDOUGALL (1948)

Zusammensetzung

Lösung A

49,0 g NaHCO3

(Fa. Grüssing, Filsum, Deutschland; Art.-Nr. 121435000) 46,5 g Na2HPO4 12 H2O (Fa. VWR International, Hannover, Deutschland; Art.-Nr. 28020.361) Ad 4950 ml ionenfreies Wasser (Seradest®)

Lösung B

47,0 g NaCl (Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland; Art.-Nr. 106404) 57,0 g KCl (Fa. Grüssing, Filsum, Deutschland; Art.-Nr. 12008) 12,8 g MgCl2 · 6 H2O (Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland; Art.-Nr. 105833) 5,3 g CaCl2 · 2 H2O (Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland; Art.-Nr. 102382) Ad 1000 ml ionenfreies Wasser (Seradest®)

3.2.2 Spendertier

3.2.2.1 Identität

Der für die Inbetriebnahme des RUSITEC erforderliche Pansensaft und feste Pan-

seninhalt stammte von einem pansenfistulierten Tier aus der Klinik für Rinder. Es

handelte sich hierbei um ein weibliches Rind der Rasse Deutsch Holstein, dass 2003

geboren wurde. Zum Entnahmezeitpunkt wog das nicht laktierende Tier 650 kg.

3.2.2.2 Haltung und Fütterung

Das Rind wurde zusammen mit zwei anderen Rindern in einer mit Stroh eingestreu-

ten Laufbox gehalten. Dem Spendertier wurde fünf Tage vor Versuchsbeginn zusätz-

lich täglich die Kontrollsilage, die später auch im Versuch zum Einsatz kam, zum Fut-

ter hinzugegeben. Am Tag der Beladung wurde es morgens und mittags außerdem

mit 5 kg (uS) Kontrollsilage und 800 g (uS) Kraftfutter gefüttert. Die Beschaffenheit

der Futterkomponenten kann dem Kapitel 3.2.3 entnommen werden.


45

3.2.2.3 Pansensaftentnahme

Am Tag der Inbetriebnahme des RUSITEC wurden der Pansensaft sowie der feste

Panseninhalt drei Stunden nach Fütterung (morgens und mittags) entnommen und

bis zum Gebrauch in Thermogefäßen temperiert gehalten. Die Entnahme über die

Pansenfistel erfolgte nach der von HÖLTERSHINKEN (1990) beschriebenen Tech-

nik.

3.2.3 Futterkomponenten

3.2.3.1 Herkunft und Beschaffenheit der Grassilagen

Die für die Versuchsdurchgänge verwendeten Grassilagen stammen von einem

Milchviehbetrieb aus Niedersachsen. Die Proben für die Testfermenter entstammen

jeweils vom 1. Schnitt aus 2014 und 2015 (Schadsilagen), für die Kontrollfermenter

vom 3. Schnitt 2014 (Kontrollsilage). Alle drei Schnitte kamen von derselben Fläche.

Die Verfütterung der Silage vom 1. Schnitt 2014 führte zu einer Anhäufung von un-

spezifischen Krankheiten (u.a. Reproduktionsstörungen, Klauenerkrankungen und

Stoffwechselstörungen) in den Betrieben. Die Silage vom 1. Schnitt 2015 wurde im

Betrieb mit Sojaextraktionsschrot supplementiert, ein vermehrtes Auftreten unspezifi-

scher Krankheitssymptome blieb aus. Die Fütterung der Silage vom 3. Schnitt 2014

verursachte kein Krankheitsgeschehen.

Sensorisch wiesen die Silagen nach VDLUFA-Richtlinien keine Abweichungen auf.

Analysen ergaben, dass die Silagen vom jeweils 1. Schnitt einen Gehalt an Reinei-

weiß (RE) am Rohprotein (RP) von unter 50 % aufwiesen (s. Kap. 3.2.3.1.2).

Die Silagen wurden für die Verwendung im RUSITEC-System auf eine Halmlänge

von 2 cm gekürzt und bei -20 °C gelagert.

3.2.3.1.1 Kontrollsilage

Die Kontrollsilagen wurden definiert als Silagen, deren RE-Anteil am RP > 50 % ist

(GAST 2010). Laut EICKEN (2005b, 2013) soll der RE-Anteil am RP größer als 50 %

sein, damit sie als nicht beeinträchtigt eingestuft werden können. Für L35-42

(s. Tab. 3.1) wurde Kontrollsilage (K-32) vom 3. Schnitt 2014 eingesetzt. Zusammen-

setzung der Nährstoffe, Analysen durch das Institut für Tierernährung, Stiftung Tier-

ärztliche Hochschule Hannover, s. Tab. 3.4. Aminosäurenzusammensetzung und

GABA-Gehalte, Analysen durch die Fa. EVONIK Industries®, Essen, s. Kap. 9.12.

3.2.3.1.2 Schadsilage

Die Schadsilagen wurden definiert als Silagen, deren RE-Anteil am RP < 50 % ist

(GAST 2010). Für L35-38 wurde Schadsilage (S-33) vom 1. Schnitt 2014 sowie für

L39-42 Schadsilage (S-35) vom 1. Schnitt 2015 eingesetzt. Zusammensetzung der


46

Nährstoffe, Analysen durch das Institut für Tierernährung, Stiftung Tierärztliche

Hochschule Hannover, s. Tab. 3.5. Aminosäurenzusammensetzung und GA-

BA-Gehalte, Analysen durch die Fa. EVONIK Industries®, Essen, s. Kap. 9.12.


47

Tab. 3.4: Analyse der Nährstoffzusammensetzung der verwendeten Kontrollsila-gen K-32 durch das Institut für Tierernährung, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Kontrollsilage K-32

Bezeichnung Dimension Gehalt

K-32

TS g/kg uS 525

Ra g/kg TS 80,6

Rp g/kg TS 152

RE g/kg TS 90,4

RE % vom RP % 59,5

Rfe g/kg TS 27,7

Rfa g/kg TS 279

NfE1 g/kg TS 461

NDF g/kg TS 623

ADF g/kg TS 320

ME2 MJ/kg TS 9,91

NEL MJ/kg TS 6,16

pH-Wert 4,45

Tab. 3.5: Analyse der Nährstoffzusammensetzung der verwendeten Schadsila-gen S-33 und S-35 durch das Institut für Tierernährung, Stiftung Tier-ärztliche Hochschule Hannover

Schadsilage S-33 und S-35


S-33 S-35

TS g/kg uS 253 273

Ra g/kg TS 84,7 65,4

Rp g/kg TS 213 220

RE g/kg TS 85,8 95,3

RE % vom RP % 40,3 43,3

Rfe g/kg TS 37,7 41,4

Rfa g/kg TS 281 229

NfE1 g/kg TS 384 444

NDF g/kg TS 569 460

ADF g/kg TS 301 262

ME2 MJ/kg TS 10,48 11,4

NEL MJ/kg TS 6,26 6,86

pH-Wert 3,99 4,09 1 Rechenwert; 2Rechenwert (Regressionsgleichung s. KAMPHUES et al. 2014)


48

3.2.3.2 Herkunft und Beschaffenheit der Maisstärke

Während der Versuchsphasen wurden den Futterbeuteln täglich 2,6 g uS Maisstärke,

Fa. Cerestar Deutschland GmbH, Krefeld, Deutschland, Art.-Nr. 03402 hinzugege-

ben. Diese Menge hatte sich in vorherigen Versuchen als günstig erwiesen

(GÖRES 2016).

3.2.3.3 Herkunft und Beschaffenheit des Sojaproteins

Um die während der Zulagephase gefütterteten Schadsilagen mit einem zu niedrigen

Reineiweißgehalt am Rohprotein auf den benötigten RE-Gehalt von 55 % anzuhe-

ben, wurde den Testfermentern TF-33mS und TF-35mS zusätzlich 0,33 g uS

(0,31 g TS) isoliertes Sojaprotein SUPRO® 670 IP der Firma Danisco, Niebüll,

Deutschland hinzugeben. Die Nährstoffangaben können der Tabelle 3.6 entnommen

werden.

Tab. 3.6: Nährstoffangaben Sojaprotein SUPRO® 670 IP (Herstellerangaben)


TS g/kg uS ≥ 945

Ra % 3,90

Rp % 87,0

Rfe % 4,60

Rfa % k. A.

Kalzium % 0,20

Phosphor % 0,80

Natrium % 1,40

Brennwert MJ/kg 15,8

pH-Wert 7,3–7,7

ME MJ/KG uS 16,71

1 KAMPHUES et al. 2014

3.2.3.4 Herkunft und Beschaffenheit des Kraftfutters

Die Nährstoffgehalte des Kraftfutters Prima 18 III pe, Milchleistungsfutter II (Ergän-

zungsfuttermittel für Milchkühe der Firma ForFarmers Langförden GmbH,

Vechta-Langförden, Deutschland, Art.-Nr. 810066), mit dem das Spendertier täglich

gefüttert wurde, werden in Tabelle 3.7 dargestellt (Herstellerangaben).


49

Tab. 3.7: Nährstoffangaben Kraftfutter Prima 18 III pe, Milchleistungsfutter II


Ra % 6,0

Rp % 18,0

Rfe % 4,0

Rfa % 10,5

Kalzium % 0,8

Phosphor % 0,55

Natrium % 0,25

NEL MJ/kg 6,7

Vitamin A I.E./kg 8750

Vitamin D3 I.E./kg 875

Vitamin E mg/kg 13,0

Jod als Kalziumjodat mg/kg 0,7

Mangan(II)-oxid mg/kg 26,0

Zinkoxid mg/kg 35,0

Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat

mg/kg 9,0

Cobalt(II)-carbonathydroxid

mg/kg 0,28

Natriumselenit mg/kg 0,35

3.2.4 Versuchsdurchführung

In acht Versuchsdurchgängen wurde der Einfluss von zwei Schadsilagen und einer

Kontrollsilage auf den Pansenstoffwechsel in vitro getestet. Eine Versuchsphase be-

gann mit dem Tag der Beladung (Tag 0), dem sich 28 Versuchstage anschlossen.

Jeder Versuchsdurchgang war unterteilt in Beladungsphase (Tag 0), Einlaufphase

(Tag 1-6, um stabile Fermentationsbedingungen zu erhalten), Kontrollphase

(Tag 7-8, steady state nach CZERKAWSKI u. BRECKENRIDGE 1977), Zulagephase

(Tag 9-18, Schadsilagen + ggf. Sojaprotein) und Erholungsphase (Tag 19-28, um

eine Regeneration des Fermentationssystems zu erzielen).

Die Inbetriebnahme sowie die Beladung während des Dauerbetriebs kann Tabel-

le 3.8 entnommen werden.

Die Probenentnahme (s. Kap. 3.2.1.3) erfolgte vor der Neubeladung eines jeden

Fermenters, sodass das Probenmaterial bereits 24 Stunden fermentiert wurde, bevor

ein Effekt einer Futterumstellung zu analysieren war. Ein vollständiger Effekt der Fut-

terumstellung konnte erst 48 Stunden später gemessen werden, da an jedem Tag

nur ein Futtersäckchen getauscht wurde (tabellarische Übersicht der Verschiebung

des messbaren Zulageeffekts durch den Probenentnahmezeitpunkt aus

GÖRES (2016), modifiziert nach LUMPP (2011), s. Tab. 3.9).


50

Tab. 3.8: Übersicht Fermenterbeladung während der einzelnen Versuchsphasen, nach GÖRES (2016) und ILLE (2017)

Futterzulage KF 1+2 TF 3+4 TFmS 5+6

Beladung (Tag 0)

500 ml flüssiger Panseninhalt + 200 ml RUSITEC-Puffer + 100 ml ionenfreies Wasser (Seradest®)

Futterbeutel 1: 80 g (uS) fester Panseninhalt + 2,6 g (uS) Stärke

Futterbeutel 2: 10,5 g (TS) Kontrollsilage (K-32) + 2,6 g (uS) Stärke

Einlaufphase (Tag 1-6)

10,5 g (TS) Kontrollsilage (K-32) + 2,6 g (uS) Stärke

Kontrollphase (Tag 7-8)


Zulagephase (Tag 9-18)

10,5 g (TS) Kon-trollsilage

(K-32) + 2,6 g (uS) Stärke

10,5 g (TS) Schadsilage (S-33/-35)

+ 2,6 g (uS) Stärke

10,5 g (TS) Schadsilage (S-33/-35)

+ 2,6 g (uS) Stärke + 0,33 g (uS) So-

japrotein

Erholungsphase (Tag 19-28)



51

Tab. 3.9: Verschiebung des messbaren Zulageeffekts in Abhängigkeit des Zeitpunkts der Probenentnahme, aus GÖRES (2016), Pfeil: Verschiebung des messbaren Einflusses einer Zulage auf den Folgetag

Versuchsabschnitt

Inhalt der Futterbeutel

nach der täglichen Beladung

Beutel B Einlaufphase KP Zulagephase Erholungsphase

1 K K K K K K K K K Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z K K K K K K K K K K

2 PI K K K K K K K K K Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z K K K K K K K K K

Versuchstag 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Messergebnis - PI K

K K K K K K K K K Z

Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z K

K K K K K K K K

B: Beladungstag; K: Kontrollsilage + Stärke; KP: Kontrollphase; PI: fester Panseninhalt vom Spendertier; Z: Kontrollsilage + Stärke (KF-30/-32), Schadsilage + Stärke (TF-31/-33/-35) bzw. Schadsilage + Stärke + Sojaprotein (TF-31mS/-33mS/-35mS)


52

3.3 Analytik

Die in dieser Arbeit analysierten Parameter sind als Teil eines Gesamtprojekts zu

sehen. Das durch Langzeitinkubation entstandene Probenmaterial wurde auch in

anderen Dissertationen untersucht (s. Tab. 9.1). In Tabelle 3.10 sind die in dieser

Arbeit analysierten Parameter aufgeführt.

Tab. 3.10: Parameterübersicht mit jeweils durchgeführtem Messverfahren und Va-riationskoeffizient (Messung in Serie, n=10 Standards)

Parameter Messverfahren Einheit Literatur VK (in%)

1* 2*

Essigsäure Propionsäure n-Buttersäure

n-Valeriansäure Hexansäure

FlFS-Gesamt

gaschromatogr. gaschromatogr. gaschromatogr. gaschromatogr. gaschromatogr.

rechnerisch

mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l

JENSEN (1973) RANFFT (1973)

GEISSLER et al. (1976)

MAIWORM (1994)

2,26 0,51

0,85 0,44

1,00 0,56

0,78 0,63

0,93 0,91

1,09 0,53

Phenole photometrisch mmol/l HOLLOWAY et al.

(1979) GÖRES (2016)

0,86 1,46

o-Diphenole photometrisch mg/ml ARNOW (1937) GÖRES (2016)

3,18 2,73

1*: In der Fermenterflüssigkeit

2*: In der Überstandsflüssigkeit

3.3.1 Bestimmung der flüchtigen Fettsäuren

Aus den Fermentern und Überstandsgefäßen wurden täglich je 10 ml Probe zur Be-

stimmung der Konzentrationen und Produktionen der FlFS entnommen. Zur Analyse

wurde ein Zweikanalgaschromatograph mit Flammenionisationsdetektor, Typ

GC-9AM der Firma Shimadzu, Kyoto, Japan (Analysebedingungen Tab. 3.11), ein

Autosampler der Firma Shimadzu Typ AOC-9, Kyoto, Japan und ein Integrator Firma

Shimadzu Typ C-R 4A, Kyoto, Japan, genutzt. Vorher wurden die Proben schrittwei-

se, nach dem in Abbildung 3.1 dargestellten Schema, aufbereitet (LUMPP 2011,

s. Kap. 3.4.4). Aus den Analyseergebnissen ergab sich die Konzentration der FlFS.

Die Produktion (in 24 Std.) errechnete sich aus der Konzentration und dem Volumen

im Überstand. Die vorliegende Arbeit beinhaltet die Ergebnisse der Essigsäure,

Propionsäure, n-Buttersäure, n-Valeriansäure, Hexansäure sowie der Summe der

flüchtigen Fettsäuren. Die Ergebnisse der i-Buttersäure sowie der i-Valeriansäure

sind in der Dissertation von SCHULTE (in Vorbereitung) zu finden, da diese den

N-Stoffwechsel betreffen.


53

Tab. 3.11: Analysebedingungen Zweikanalgaschromatograph mit Flammen-ionisationsdetektor, Typ GC 9AM

Injektionstemperatur 170°C

Detektortemperatur 220°C

Detektorart Flammenionisationsdetektor

Säulenofentemperatur 110°C

Trägergas Stickstoff

Trägergasfluss 55 ml/min

Synthetische Luft 0,4 kg/cm²

Wasserstoff 0,5 kg/cm²

Probenvolumen 1 µl

Autosampler Typ AOC-9

Integrator Typ C-R4A


54

6 ml Fermenterflüssigkeit

Bodensatz

verwerfen

Zentrifugation1

20 Min, 1.750 xg

4 ml Überstand abnehmen und

400 µl internen Standard2 hinzufügen

1,7 ml Überstand in Autosampler-Fläschchen3

abfüllen, Lagerung im Kühlschrank (+4 °C);

1,7 ml Überstand (Doppelprobe) in

Reagiergefäß4 abfüllen und tiefgefrieren (-20 °C)

10 ml Überstandsflüssigkeit

Zentrifugation1

20 Min, 1.750 xg

Bodensatz

verwerfen

Abb. 3.1: Schematische Darstellung der Probenaufbereitung zur Messung der FlFS (LUMPP 2011)

1 Tischzentrifuge‚ Hettich Universal Typ 1200 (Fa. Hettich, Tuttlingen, Deutschland) 2 100 ml konzentrierte Ameisensäure 98-100 % (Fa. MERCK, Darmstadt, Deutsch-

land, Art.-Nr. 1.00264.2500) und 1 ml 4-Methyl-Valeriansäure (Isocapronsäure)

(Fa. MERCK, Darmstadt, Deutschland, Art.-Nr. 806088) (LUMPP 2011) 3 Autosampler-Vials 32 × 12 mm (Fa. LAT GmbH, Garbsen, Deutschland,

Art.-Nr. 27200) mit Schraubverschluss und Septum (Fa. LAT GmbH, Garbsen,

Deutschland, Art.-Nr. 70666) 4 Reagiergefäß 2 ml (Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland)


55

3.3.2 Enzymatische Bestimmung des Phenolgehalts in der Fermenterflüs-

sigkeit sowie nach Fermentation in der Überstandsflüssigkeit

Es wurde der Gesamtphenolgehalt sowie der o-Diphenolgehalt enzymatisch be-

stimmt. Als Gesamtphenole werden nach HOLLOWAY et al. (1979) die Aminosäure

Tyrosin, freie Phenole, Phenolsäuren und Phenolamine bezeichnet. O-Diphenole

sind Substanzen mit zwei (oder mehr) OH-Gruppen, die schnell mit anderen Stoffen

reagieren (ARNOW 1937).

Um die Vergleichbarkeit der ermittelten Gehalte mit der Dissertation von GÖ-

RES (2016) zu wahren, wurde an der Konzentrationseinheit [mg/ml] für die

o-Diphenole festgehalten.

Die Proben wurden zum einen aus der Fermenterflüssigkeit, zum anderen aus der

Überstandsflüssigkeit nach Fermentation (überständiges Fermentervolumen inner-

halb von 24 Stunden, versetzt mit 40 ml halbkonzentrierter Salzsäure und Inkubation

mit dem Verdauungsenzym Pepsin, Kap. 3.3.2.4) gewonnen. Ziel war, einen Einfluss

der unterschiedlichen Silagen und Sojazulage auf die Fermentation der phenolischen

Substanzen (Kap. 2.1), zu verschiedenen Verdauungszeitpunkten, darzustellen.

Die Aufbereitung der Proben zur Phenolbestimmung im flüssigen Fermenterinhalt

wurde nach dem von GÖRES (2016) angewandten Schema durchgeführt, da auf

Grund einer identischen Durchführung eine Vergleichbarkeit verschiedener Silagen

möglich ist.

Die Proben der Überstandsflüssigkeiten wurden zuerst einem enzymatischen Verdau

unterzogen, um in vitro mit labmagenähnlichen Verhältnissen den Gehalt an phenoli-

schen Substanzen mit den von GÖRES (2016) durchgeführten Methoden zu be-

stimmen.

3.3.2.1 Bestimmung des Gesamtphenolgehalts in der Fermenterflüssigkeit

Grundlage dieser Methode sind die Gesamtphenolbestimmungen im Serum nach

HOLLOWAY et al. (1979) und MENGISTU (1990), die von GÖRES (2016) zur kolo-

rimetrischen Messung der phenolischen Substanzen im Pansensaft modifiziert wur-

de. Das Probenvolumen von 250 µl verdünnt mit Aqua bidestillata im Verhältnis 1:1

wurde in Anlehnung an MENGISTU (1990) gewählt. Die einzelnen Schritte der Auf-

bereitung der Proben können der Abbildung 3.2 entnommen werden (aus

GÖRES 2016). Wichtig ist die Anwendung der 70 %igen Perchlorsäure zur Protein-

präzipitation, da Proteine durch Anfärbung mittels Folin-Ciocalteau-Reagenz zu ei-

nem falschen Messergebnis führen könnten (GÖRES 2016). Die Färbung mittels Fo-

lin-Ciocalteau-Reagenz ist nicht spezifisch, um nur phenolische Substanzen anzufär-

ben (MENGISTU 1990). Die Aufbereitung der Blindprobe wurde auch, wie bei

GÖRES (2016) beschrieben, abweichend von der Methode nach

HOLLOWAY et al. (1979) angefertigt. Da hier besonders die Eigenextinktion des

Probenmaterials mit in Betracht gezogen werden sollte, wurde auf die Zugabe des


56

Folin-Ciocalteau-Reagenz verzichtet und stattdessen Aqua bidestillata verwendet

(GÖRES 2016). Nach Aufbereitung wurden die Proben für 60 Minuten bei Raumtem-

peratur inkubiert und anschließend photometrisch bei 578 nm in Halbmikroküvetten

(Fa. Sarstedt AG & Co., Größe 10x4,45 mm) dreifach gemessen und ein arithmeti-

scher Mittelwert gebildet (HOLLOWAY et al. 1979). Hierzu wurde ein Photometer

prietest ECO der Firma QM Lab, Steinfurt, Deutschland genutzt. Die für die Messung

erforderlichen Reagenzien werden in Tab. 3.12 aufgelistet.


57

vortexen4


Zentrifugation1

15 Min, 20.000 xg

Bodensatz verwerfen

Zentrifugation5

10 Min, 1.750 xg

jeweils 250 µl Überstand

in 2 Reagiergefäße2 überführen (Mess-

und Blindprobe);

Doppelprobe: 1,5 ml in Reagiergefäß2

tiefgefrieren (-20 °C)

jeweils 250 µl Aqua bidest. und 50 µl

Perchlorsäure 70%ig3 zugeben

Probe:

100 µl Folin-Ciocalteau-Reagenz6

zugeben

jeweils 250 µl Überstand in Reagenzglas

vorlegen und 1000 µl Aqua bidest.

zugeben

Bodensatz verwerfen

Blindwert:

100 µl Aqua bidest. zugeben

jeweils 1000 µl Natriumcarbonat-Lösung 10%ig7 zugeben

60 Min bei Raumtemperatur inkubieren

Vermessung bei 578 nm am Photometer8, 9

vortexen4

vortexen4

vortexen4

Abb. 3.2: Probenaufbereitung und modifizierte Phenolbestimmung nach HOLLOWAY et al. (1979, aus GÖRES 2016)

Zentrifugation1

20 Min, 20.000 xg


58

Erläuterungen zur Abb. 3.2: 1 Kühlzentrifuge Typ RC-5C PLUS mit Winkelkopfrotor A 2424

(Fa. Du Pont, Newtown, USA) 2 Reagiergefäß 2 ml (Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) 3 s. Tab. 3.12 4 Vortex-Mischer Typ Vortex-Genie (Fa. Scientific Industries, Bohemia, USA) 5 Tischzentrifuge‚ Hettich Universal Typ 1200 (Fa. Hettich, Tuttlingen, Deutschland) 6 s. Tab. 3.12 7 s. Tab. 3.12 8 Photometer prietest ECO (Fa. QMLab, Steinfurt, Deutschland) 9 Halbmikroküvetten 10 × 4 × 45 mm (Fa. Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutsch-

land, Art.-Nr. 81970)

Die Extinktion wurde in den Gesamtphenolgehalt [mmol/l] per Kalibrationskurve um-

gerechnet (HÖLTING 1993). Zur Ermittlung des Gesamtphenolgehaltes in den Fer-

mentern wurde die von GÖRES (2016) erstellte Kurve, Fünffachmessung von zehn

Kalibrierlevel der Referenzsubstanz 4-Hydroxyphenylessigsäure, genutzt, da die

gleiche Methode zur Analyse des Gesamtphenolgehalts im fortlaufenden System

durchgeführt wurde.

Tab. 3.12: Reagenzien zur Gesamtphenolmessung

Reagenzien Zusammensetzung

Perchlorsäure 70 % ig Perchloric acid 70 % (Fa. Fisher Scientific UK, Loughborough, UK, Art.-Nr. P/1280/PB17)

Folin-Ciocalteau-Reagenz Folin & Ciocalteau’s phenol reagent (Fa. Sigma-Aldrich, St. Louis, USA, Art.-Nr. 47641)

Natriumcarbonat-Lösung 10 % ig

10 g Natriumcarbonat (Fa. AppliChem GmbH, Darmstadt, Deutschland, Art.- Nr. A1352.1000) 100 ml Aqua bidestillata

3.3.2.2 Bestimmung des o-Diphenolgehalts in der Fermenterflüssigkeit

Das zur Bestimmung des o-Diphenolgehalts erforderliche Probenmaterial entstamm-

te dem flüssigen Fermenterinhalt des Langzeitinkubationssystems. Die Aufbereitung

der Proben begann mit einer nach GÖRES (2016) modifizierten Extraktion von

FRAISSE et al. (2011), in dem die Proben nicht wie beschrieben für eine Minute bei

80 °C im Wasserbad erhitzt wurden, sondern zur Vereinfachung des Arbeitsschrittes

im Heizblock, vorgeheizt auf 100 °C, für 8 Minuten standen und somit ungefähr eine

Temperatur von 80°C erreichten (GÖRES 2016). Die einzelnen Schritte der Extrakti-

on zeigt Abbildung 3.3 (aus GÖRES 2016). Das Schema ist sowohl für die Extraktion


59

von Pflanzenmaterial wie auch von flüssigem Fermenterinhalt erarbeitet worden. Im

Rahmen dieser Arbeit wurde nur flüssiger Fermenterinhalt bearbeitet, deshalb entfiel

die aufgeführte 15 minütige Zentrifugation nach dem Plattformschüttler.


60


Zentrifugation1

15 Min, 20.000 xg

Bodensatz verwerfen

Zentrifugation1

15 Min, 20.000 xg*

1000 µl Überstand + 5 ml EtOH 50%ig2

in Kulturröhrchen3 überführen;

Doppelprobe: 1,5 ml in Reagiergefäß4

tiefgefrieren (-20 °C)

8 Min erhitzen im Thermoblock5 bei 100 °C

Überstand

o-Diphenolbestimmung

Bodensatz verwerfen

50 Min mischen auf dem Plattformschüttler6

Abb. 3.3: Probengewinnung und modifizierte Extraktion nach FRAISSE et al. (2011, aus GÖRES 2016)

1 Kühlzentrifuge Typ RC-5C PLUS mit Winkelkopfrotor A 2424

(Fa. Du Pont, Newtown, USA) 2 s. Tab. 3.14 3 Einmal-Kulturröhrchen, 16 × 160 mm mit Schraubkappen (Fa. LAT GmbH, Garb-

sen, Deutschland, Art.-Nr. 192317521) und passenden Tefloninletts (Fa. LAT

GmbH, Garbsen, Deutschland, Art.-Nr. 132924811) 4 Reagiergefäß 2 ml (Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland, Art.-Nr. 72.689.003) 5 Metallblockthermostat Typ EC 2 (Fa. VLM GmbH, Bielefeld, Deutschland), Tempe-

raturbereich 0 – 210 °C, Durchmesser des Stahl-Reagenzglaseinsatzes: 17,2 mm 6 Plattformschüttler Typ 3016 (Fa. GFL, Burgwedel, Deutschland)

* Die zusätzliche Zentrifugation ist nur bei der Extraktion von Pflanzenmaterial not-

wendig

Zentrifugation1

20 Min, 20.000 xg


61

Nach der Extraktion wurden die Proben mit der von GÖRES (2016) zur

o-Diphenolbestimmung modifizierten Methode nach ARNOW (1937) aufbereitet

(Tab. 3.13). Die Modifizierung von GÖRES (2016) lag in der Benutzung von halbkon-

zentrierter Salzsäure, anstatt 0,5 molarer Salzsäure wie bei ARNOW (1937) be-

schrieben, um die Nachweisgrenze im Testverfahren zu senken. Anschließend wur-

den die Proben 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, danach photometrisch

dreifach gemessen (405 nm) und ein arithmetischer Mittelwert gebildet. Die zur Be-

stimmung erforderlichen Reagenzien werden in Tabelle 3.14 aufgelistet.

Tab. 3.13: Übersicht Erstellung Mess- und Blindprobe (Probe aus Überstand, Ex-traktion modifiziert nach FRAISSE et al. 2011)

Reagenzien Messprobe Reagenzien Blindprobe

Extrakt (Probe) 250 µl Extrakt (Probe) 250 µl

HCl (halbkonz.) 500 µl HCl (halbkonz.) 500 µl

ARNOW-Reagenz 500 µl ARNOW-Reagenz -

NaOH 2,125 mol/l 500 µl NaOH 2,125 mol/l 500 µl

Aqua bidest. 750 µl A. bidest. 1250 µl

Tab. 3.14: Reagenzien zur o-Diphenolbestimmung


Ethanol 50 % ig 100 ml

100 ml Ethanol 99,5 % vergällt mit MEK (Fa. LAT GmbH, Garbsen, Deutschland, Art.-Nr. 10576) 100 ml Aqua bidestillata

Salzsäure, halbkonzentriert

100 ml Salzsäure 37 % (Fa. Grüssing GmbH, Filsum, Deutsch-land, Art.-Nr. 130682500) 100 ml Aqua bidestillata

ARNOW-Reagenz

10 g Natriummolybdat (Fa. Sigma-Aldrich, St. Louis, USA, Art.-Nr. 243655) 10 g Natriumnitrit (Fa. Sigma-Aldrich, St. Louis, USA, Art.-Nr. 237213) 100 ml Aqua bidestillata

Natronlauge 2,125 mol/l

8,5 g Natriumhydroxid 97 % (Fa. Grüssing GmbH, Filsum, Deutsch-land, Art.-Nr. 12158) 100 ml Aqua bidestillata


62

Die Extinktion wurde zur Bestimmung des o-Diphenolgehalts [mg/ml] mit Hilfe einer

Kalibrationskurve umgerechnet (HÖLTING 1993). Zur Ermittlung des

o-Diphenolgehaltes in den Fermentern wurde die von GÖRES (2016) erstellte Kalib-

rationskurve genutzt, da die angewandte Methode identisch war.

3.3.2.3 Bezeichnung der drei Testgruppen der Überstandsgefäße

Überstandsgefäß 1+2: KF-32-Ü

Überstandsgefäß 3+4: TF-33-Ü bzw. TF-35-Ü

Überstandsgefäß 5+6: TF-33mS-Ü bzw. TF-35mS-Ü

3.3.2.4 Enzymatischer Verdau der Überstandsflüssigkeit: Einfluss von Pep-

sin auf den Gehalt an phenolischen Substanzen

In Vorversuchen wurde der Gehalt an phenolischen Substanzen in der Überstands-

flüssigkeit mit den beschriebenen Methoden zur Gesamt- und o-Diphenolmessung

mit und ohne Pepsinzugabe getestet (s. Kap. 9.4). Phenolische Substanzen und Pro-

teine können sich zu Komplexen verbinden (s. Kap. 2.3.3). Verschiedene Faktoren,

wie der pH-Wert, die Proteinstruktur, aber auch Enzyme, haben einen Einfluss auf

die Komplexbildung (s. Tab. 2.7). Diese Komplexe können unter bestimmten Bedin-

gungen gespalten werden (s. Kap. 2.3.6). CUI et al. (2013) beschreiben, dass eine

alleinige Proteinentfaltung und –zerlegung von Proteinen durch einen niedrigen

pH-Wert nicht ausreichend ist. Eine enzymatische Reaktion ist notwendig, um Pro-

teinstrukturen zu zerlegen. HASLAM u. LILLEY (1988) sowie MARTINEZ-

GONZALEZ et al. (2017) beschreiben jedoch eine Enzymhemmung durch phenoli-

sche Substanzen. Um dieses zu testen, wurden sowohl der Gesamtphenolgehalt als

auch der o-Diphenolgehalt in den Kontrollgruppen, Testgruppen mit Schadsilage und

mit Schadsilage und Sojaprotein (s. Kap. 3.3.2.5) in der Zulagephase mit und ohne

Pepsin bestimmt. Es zeigte sich ein geringgradiger Anstieg des o-Diphenolgehaltes

nach enzymatischer Verdauung durch Pepsin, sowohl in der Kontroll- als auch in den

Testgruppen. Somit ist ein alleiniger Pepsineinfluss bis maximal 40 % zu erwarten.

Der hochgradige Anstieg des Gesamtphenolgehaltes nach enzymatischer Verdau-

ung durch Pepsin entstand durch die nicht zu erklärenden niedrigen Gesamtphenol-

gehalte ohne Pepsinverdau (s. Abb. 9.1).


63

3.3.2.5 Bestimmung des Gesamtphenolgehalts in der Überstandsflüssigkeit

Die Proben zur Bestimmung des Gesamtphenolgehalts wurden ab Tag 7 täglich aus

der Überstandsflüssigkeit entnommen. Um diese einer Inkubation mit einem Verdau-

ungsenzym zu unterziehen, wurde eine nach DIAZ-HERNANDEZ et al. (1997) be-

schriebene Pepsinlösung hergestellt. Es wurde Pepsin 2 mg/ml in 0,001 M Salzsäu-

relösung (Tab. 3.15) gelöst. Die Überstandsflüssigkeit wurde im Verhältnis 1:1 mit

der Pepsin-HCl-Lösung für zwei Stunden bei 39 °C im Wärmeschrank (Firma Hera-

eus, Hanau, Deutschland) inkubiert und durch Einspannung in einen Rotor perma-

nent in Bewegung gehalten (DIAZ-HERNANDEZ et al. 1997). Die aus Vorversuchen

hervorgegangenen Ergebnisse zeigten auf, dass eine Inkubation unter zwei Stunden

nicht sinnvoll ist (Abb. 9.5). Im Anschluss wurden die Proben mittels einer Kühlzentri-

fuge Typ RC-5C PLUS mit Winkelkopfrotor A 2424 (Firma Du Pont, Newtown, USA)

für 20 Minuten bei 20.000 xg zentrifugiert. Die Proben wurden mit der von GÖRES

(2016) modifizierten Methode nach HOLLOWAY et al. (1979) aufbereitet (Abb. 3.3),

näheres hierzu s. Kap. 3.3.2.1.

Um das Verdünnungsverhältnis nicht zu verändern, wurden hier jeweils 500 µl Über-

standsflüssigkeit in zwei Reagiergefäße überführt und jeweils 50 µl Perchlorsäure

hinzugegeben. Es wurde auf die Zugabe von Aqua bidestillata verzichtet, da bereits

eine 1:1 Verdünnung durch die Pepsinlösung vorlag. Nach Aufarbeitung der Proben

erfolgte ebenfalls eine Inkubation von 60 Minuten bei Raumtemperatur und eine pho-

tometrische Messung bei 578 nm.

Tab. 3.15: Reagenzien für die Pepsin-HCL-Lösung


Pepsin Pepsin 2000 FIP-U/g (Fa. MERCK, Darmstadt, Deutschland, Art.-Nr. 7190)

Salzsäure Salzsäure (Fa. MERCK, Darmstadt, Deutschland, Art.-Nr. 1.09057.2500)

3.3.2.6 Kalibrierung

Zur Ermittlung des Gesamtphenolgehalts in der Überstandsflüssigkeit wurden zehn

Kalibrierlevel von 0,25-2,50 mmol/l mit der Referenzsubstanz

4-Hydroxyphenylessigsäure (Tab. 3.16), gelöst in Aqua bidestillata (HÖLTING 1993;

GÖRES 2016) und im Verhältnis 1:1 mit Pepsin-HCl-Lösung versetzt, hergestellt,

zwei Stunden bei 39 °C permanent rotierend inkubiert, aufbereitet und fünffach ge-

messen. Die Kalibrationskurve der Fünffachmessung wurde mit Hilfe des F-Test

nach Mandel des Dintest (Version DT 2004 DE) Programms als lineares Regressi-

onsmodell bestätigt.


64

Tab. 3.16: Referenzsubstanz der Gesamtphenole zur Erstellung der Kalibrations-geraden

Reagenz Zusammensetzung

4-Hydroxyphenylessigsäure 4-Hydroxyphenylacetic acid (Fa. Sigma-Aldrich, St. Louis, USA, Art.-Nr. H50004)

Anhand der Kalibrationskurve (Abb. 9.6) konnten die gemessenen Extinktionen als

Gesamtphenolgehalte bestimmt werden.

3.3.2.7 Methodenüberprüfung

Zur Überprüfung der Methode wurden drei Versuchsreihen nach folgendem Schema

angesetzt und nach der in Kapitel 3.3.3.1 beschriebenen Methode aufbereitet und

photometrisch gemessen:

1. 0,7 ml Überstandsflüssigkeit + 1 ml Pepsin-HCl-Lösung + 0,3 ml NaCl

2. 0,7 ml Überstandsflüssigkeit + 1 ml Pepsin-HCl-Lösung + 0,3 ml 4-Hydroxy-

phenylessigsäure (1 mg/ml)

3. 0,7 ml Überstandsflüssigkeit + 1 ml Pepsin-HCl-Lösung + 0,3 ml 4-Hydroxy-

phenylessigsäure (10 mg/ml)

Mit Zunahme der Konzentration der 4-Hydroxyphenylessigsäure stiegen auch die

Messwerte an (s. Kap. 9.7). Die Extinktion verhielt sich analog zum steigenden

mg/ml Gehalt, die Referenzsubstanz war im Messergebnis wieder zu finden.

Zur Reproduzierbarkeit und Messkontinuität wurde der Variationskoeffizient durch

zehnfache Aufbereitung sowie Messung einer Probe aus dem Überstand bestimmt.

Der VK lag bei 1,46 %.

3.3.2.8 Bestimmung des o-Diphenolgehalts in der Überstandsflüssigkeit

Die Proben zur Bestimmung des o-Diphenolgehalts entstammten dem Überstands-

volumen. Die Proben wurden ab Tag 7 täglich entnommen und mit der in

Kap. 3.3.2.5 beschriebenen Pepsin-HCl-Lösung im Verhältnis 1:1 ebenfalls für zwei

Stunden bei 39 °C permanent rotierend inkubiert. Anschließend wurde das Proben-

gemisch in der Kühlzentrifuge Typ RC-5C PLUS mit Winkelkopfrotor A 2424 (Firma

Du Pont, Newtown, USA) für 20 Minuten bei 20.000 xg zentrifugiert. Die in

Kap. 3.3.2.2 beschriebene Methode zu Messung der o-Diphenole wurde anschlie-

ßend durchgeführt.

Abweichend zur beschriebenen Methode wurden 4 ml Ethanol mit 2 ml Probe

(1 ml Probe, 1 ml Pepsin-HCl-Lösung) versetzt. Somit wurde das Verdünnungsver-

hältnis nicht beeinflusst.


65

Nach der Probenaufbereitung inkubierten die Proben für 40 Min bei Raumtempera-

tur, anschließend wurden sie photometrisch bei 405 nm gemessen.

3.3.2.9 Kalibrierung

Zur Ermittlung des o-Diphenolgehaltes in der Überstandsflüssigkeit wurde eine Kalib-

rationskurve mittels der Referenzsubstanz Chlorogensäure (Tab. 3.17), gelöst in

50 % igem Ethanol, erstellt. Es wurden zehn Kalibrierlevel (0,25-10 mg/ml) ange-

setzt, mit der Pepsinlösung im Verhältnis 1:1 für zwei Stunden bei 39 °C permanent

rotierend inkubiert, aufbereitet und photometrisch gemessen (HÖLTING 1993;

GÖRES 2016). Der F-Test nach Mandel aus dem Programm Dintest (Version

DT 2004 DE) bestätigte ein lineares Regressionsmodell.

Tab. 3.17: Referenzsubstanz der o-Diphenole zur Erstellung der Kalibrationsge-raden

Reagenz Zusammensetzung

Chlorogensäure Chlorogenic acid (Fa. Sigma-Aldrich, St. Louis, USA, Art.-Nr. C3878)

Anhand der Kalibrationskurve (Abb. 9.7) konnten die gemessenen Extinktionen als

o-Diphenolgehalte bestimmt werden.

3.3.2.10 Überprüfung der Methode

Zur Überprüfung der Methode wurden 3 Versuchsreihen nach folgendem Schema

angesetzt und nach der in Kapitel 3.3.2.2 beschriebenen Methode aufbereitet und

photometrisch gemessen:

1. 0,7 ml Überstandsflüssigkeit + 1 ml Pepsin-HCl-Lösung + 0,3 ml NaCl

2. 0,7 ml Überstandsflüssigkeit + 1 ml Pepsin-HCl-Lösung + 0,3 ml Chlorogen-

säure (1 mg/ml)

3. 0,7 ml Überstandsflüssigkeit + 1 ml Pepsin-HCl-Lösung + 0,3 ml Chlorogen-

säure (10 mg/ml)

Mit Konzentrationsanstieg der Chlorogensäure erhöhten sich die Messwerte

(s. Kap. 9.9). Die Extinktion verhielt sich analog zum steigenden mg/ml Gehalt, die

Referenzsubstanz war im Messergebnis wieder zu finden.

Zur Reproduzierbarkeit und Messkontinuität wurde der Variationskoeffizient durch

zehnfache Aufbereitung sowie Messung einer Probe aus dem Überstand bestimmt.

Der VK lag bei 2,73 %.


66

3.3.3 Abschließende Beurteilung der neuen Methode

Mit der neuen Methode konnte ein Einfluss der Schadsilagen und Sojazulage auf den

Gehalt an phenolischen Substanzen an einem weiteren in vitro Entnahmeort darge-

stellt werden. Da es sich sowohl bei der Messung der Gesamtphenole als auch der

o-Diphenole um einen Summenparameter handelt, kann mit dieser Methode jedoch

nicht eindeutig festgestellt werden, welche phenolischen Substanzen im Einzelnen in

welchem Ausmaß möglicherweise einer Reaktion mit Pepsin unterzogen werden.

Des Weiteren können auch andere, in der gemessenen Probe vorhandene, Substan-

zen die Messkinetik beeinflussen, indem sie mit angefärbt werden, und in den ge-

messenen Extinktionswerten enthalten sind. GÖRES (2016) zeigt auf, welche pheno-

lischen Substanzen als Reinstoffe mit der Messung dargestellt werden können, so-

dass eine Abschätzung erfolgen kann, welche phenolischen Substanzen überhaupt

vorliegen könnten.

3.3.4 Statistische Datenauswertung

Die statistische Datenauswertung umfasst die beschreibende Statistik der arithmeti-

schen Mittelwerte (x̅) sowie der Standardabweichungen (s) und die Berechnung der

Differenzsignifikanzen (p) mittels t-Test für verbundene Stichproben. Hierfür wurden

die Messergebnisse tabellarisch erfasst (Microsoft Excel 2010, Fa. Microsoft,

Redmond, WA, USA) und mit dem Programm SAS Enterprise Guide, Version 7.1

(Fa. SAS Institute Inc., Cary, NC, USA), statistisch ausgewertet. Die Berechnung er-

folgte analog zu den Dissertationen von GAST (2010), GRESNER (2011) und

GÖRES (2016). Das Ergebnis pro Messtag setzt sich aus den zwei Fermentern mit

identischer Fütterung (F1 + F2, F3 + F4, F5 + F6) von jeweils vier RUSITEC-

Durchläufen (L35-38, L39-42) zusammen (n =8).

Ergebnisse

67

4 Ergebnisse

Im Folgenden werden die Ergebnisse der Analysen der getesteten Kontroll- und

Schadsilagen dargestellt. Insgesamt wurden acht Läufe, eingeteilt in zwei Laufgrup-

pen (L35-38 und L39-42), durchgeführt. Pro Lauf standen sechs Fermenter zur Ver-

fügung, zwei Fermenter wurden jeweils identisch beladen (s. Kap. 3.2.1.2 und

3.2.1.3).

Die Ergebnisse werden für jeden analysierten Parameter für eine Laufgruppe darge-

stellt, der angegebene Wert ist ein Mittelwert aus acht Messwerten (n=8). Die Zula-

gephase wird durch einen schwarzen Balken in den Diagrammen hervorgehoben. Im

Kapitel 9.10.1 sind die Einzelwerte dargestellt. Die Kennzeichnung der signifikanten

Unterschiede zwischen den Fermenter- und Überstandspaaren wird in den Dia-

grammen wie folgt dargestellt:

* # ° schwach signifikant (p < 0,05)

** ## °° signifikant (p < 0,01)

*** ### °°° hoch signifikant (p < 0,001)

Es werden an dieser Stelle nur die Ergebnisse der eigenen Untersuchungen aufge-

führt. Um diese im Gesamtprojekt (L31-42) einordnen und vergleichen zu können

(Kap. 5) werden im Anhang (Kap. 9.11) die dafür notwendigen Ergebnisse (L31-38)

aus der Dissertation von GÖRES (2016) dargestellt. Auch wurden die Konzentrati-

onseinheiten für eine Vergleichbarkeit identisch gewählt.

4.1 Flüchtige Fettsäuren

Es werden hier nur die Ergebnisse von L39-42 dargestellt. Die Ergebnisse der ein-

zelnen flüchtigen Fettsäuren von L31-38 sind Bestandteil der Dissertation von

GÖRES (2016), graphische Darstellung in Kapitel 9.11.

Ergebnisse

68

4.1.1 Essigsäurekonzentration

Die Essigsäurekonzentration von L39-42 lag an Tag 8 in allen drei Fermenterpaaren

bei 50,0 mmol/l. Von Tag 8-14 behielten KF-32 und TF-35 diese Konzentration in

etwa bei. Von Tag 14 auf 16 kam es in diesen Versuchsgruppen zu einem deutlichen

Konzentrationsabfall (KF-32: -4,73%; TF-35: -8,25%). Beide Gruppen behielten die-

ses niedrigere Niveau bis zum Ende der Versuchsphase bei.

Die Konzentration in TF-35mS fiel bereits von Tag 12 auf Tag 13 ab (-8,49%).

Ein deutlicher Einfluss der Schadsilage oder des Sojaproteins war nicht erkennbar.

Abb. 4.1: Mittlere Essigsäurekonzentration [mmol/l] in den Fermentern während 28-tägiger Inkubation mit Kontrollsilage, mit Schadsilage und mit Schadsilage plus Sojaprotein:

Zulagephase ( ) / / entsprechende Fermentergruppen

KF vs. TF: * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 KF vs. TFms: # p < 0,05; ## p < 0,01; ### p < 0,001 TF vs. TFms: ° p < 0,05; °° p < 0,01; °°° p < 0,001

40

45

50

55

60

65

70

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mm

ol/l

Tag

KF-32

TF-35

TF-35mS

Lauf 39–42

##

° °#

#

##

°

Ergebnisse

69

4.1.2 Essigsäureproduktion

Die Essigsäureproduktion erreichte in der Kontrollphase in allen Fermentern Werte

von 19,4-19,7 mmol/24h.

Zu Beginn der Zulagephase sank die Produktion in der Kontrollgruppe kurzzeitig um

etwa 2 mmol/24h (Tag 10-13), anschließend erreichte sie wieder ein stabiles Niveau.

Die Fermenter mit Schadsilage hingegen behielten über die gesamte Versuchsphase

ein konstantes Level.

Die Zulage des Sojaproteins hatte einen minimalen Einfluss auf die Produktion der

Essigsäure, die Werte von TF-35mS lagen geringfügig unter denen von TF-35 (bspw.

Tag 15: -7,02 %).

Abb. 4.2: Mittlere Essigsäureproduktion [mmol/24h] in den Überständen während 28-tägiger Inkubation mit Kontrollsilage, mit Schadsilage und mit Schadsilage plus Sojaprotein

(Restlegende siehe Abb. 4.1)

10

15

20

25

30

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mm

ol/2

4h

Tag

KF-32

TF-35

TF-35mS

Lauf 39–42

***** °

°°

##

#

#°

° ****** ** **** °°

Ergebnisse

70

4.1.3 Propionsäurekonzentration

Die Konzentrationen der Propionsäure in den drei Testgruppen unterschieden sich

bis Tag 9 kaum voneinander. Mit Fütterungsumstellung stiegen die Konzentrationen

in allen Testfermentern steil an (gleiches Niveau).

Die Konzentrationen der Testgruppe mit Sojazulage behielten ein relativ konstantes

Niveau über die gesamte Zulagephase.

Auffällig ist eine Veränderung der Propionsäurekonzentration in der Testgruppe

TF-35 von Tag 15 auf Tag 16. Trotz gleichbleibender Produktion innerhalb von

24 Stunden (s. Abb. 4.4) kommt es zu einem Abfall der Propionsäurekonzentration in

diesen Fermentern um -9,78 %. Dieses Niveau hielt sich über 4 Tage.

In der Erholungsphase näherten sich die Konzentrationen der Testgruppen denen

der Kontrollgruppe wieder an.

Abb. 4.3: Mittlere Propionsäurekonzentration [mmol/l] in den Fermentern während 28-tägiger Inkubation mit Kontrollsilage, mit Schadsilage und mit Schadsilage plus Sojaprotein


10

15

20

25

30

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mm

ol/l

Tag

KF-32

TF-35

TF-35mS

Lauf 39–42

*

**

***°°#

#

## # #

***

***

***

***#

###

****

##

##

##

**

##

##

##

#

##

#**

°°

Ergebnisse

71

4.1.4 Propionsäureproduktion

Bereits ab Tag 3 stellte sich eine stabile Phase um 5,92 mmol/24h ein.

Während der Zulagephase stieg die Produktion der Propionsäure in den Fermentern

mit Schadsilage auf durchschnittlich 7,79 mmol/24h an (verglichen zur Kontrolle:

+24,6 %), sie verlief relativ konstant während dieser Versuchsphase. Von Tag 16-23

lag die Produktion in TF-35mS 4,38 % über der Produktion in TF-35.

Mit Beginn der Erholungsphase erreichten die Testfermenter zügig wieder das Kon-

trollniveau.

Abb. 4.4: Mittlere Propionsäureproduktion [mmol/24h] in den Überständen wäh-rend 28-tägiger Inkubation mit Kontrollsilage, mit Schadsilage und mit Schadsilage plus Sojaprotein


2

5

8

11

14

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mm

ol/2

4h

Tag

KF-32

TF-35

TF-35mS

Lauf 39–42

*

**

***

#####

#

°

#

# #

°

°

##

#***

***

***

***

##

#

##

#

####

**

**

##

***

##

##

##

***

Ergebnisse

72

4.1.5 n-Buttersäurekonzentration

Die Konzentrationen in den Kontrollfermentern wiesen in der Kontroll- und Zulage-

phase Gehalte von 21,8 mmol/l (Mittelwert) auf, von Tag 16-25 sanken diese kontinu-

ierlich ab (Vgl. Tag 25 zu Tag 8: -20,9 %).

Mit Beginn der Zulagephase stiegen die Konzentrationen in den Testfermentern nur

langsam an. Es zeigte sich ein deutlich verzögerter Effekt der Schadsilagezulage. An

Tag 19 lagen die Konzentrationen der Testfermenter 10,9 % (TF-35) und 4,00 %

(TF-35mS) oberhalb der Kontrolle an Tag 8.

In der Erholungsphase sanken die Konzentrationen in allen Gruppen deutlich unter-

halb des an Tag 8 erreichten Niveaus. Am Tag 25 wiesen sie einen Abfall von

20,9 % (KF-32), 21,5 % (TF-35) und 15,1 % (TF-35mS) im Vergleich zur Ausgangs-

konzentration an Tag 8 auf.

Abb. 4.5: Mittlere n-Buttersäurekonzentration [mmol/l] in den Fermentern wäh-rend 28-tägiger Inkubation mit Kontrollsilage, mit Schadsilage und mit Schadsilage plus Sojaprotein


10

15

20

25

30

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mm

ol/l

Tag

KF-32

TF-35

TF-35mS

Lauf 39–42

*

**

###

##

####

*

* *

*

##

##

*#

Ergebnisse

73

4.1.6 n-Buttersäureproduktion

Mit Beginn der Zulagephase (Tag 10) sank die Produktion in der Kontrollgruppe um

11,9 % (verglichen mit Tag 8: steadystate-Niveau) ab. Über die verbleibende Ver-

suchsphase hinweg behielt die Kontrollphase ein relativ konstantes Niveau (Aus-

nahme Tag 17, kurzzeitiger Anstieg um etwa 11,4 %), welches jedoch unterhalb des

Kontrollniveaus (Tag 8) sowie der Schadsilagengehalte, welche sich erst gegen En-

de der Zulagephase vom Kontrollniveau entfernten, lag.

Vom Tag 16 auf Tag 17 stieg die Produktion in TF-35 um 6,32 %, in TF-35mS um

3,74 % an. Am letzten Tag der Zulage sank die Produktion in den Testfermentern

bereits geringfügig wieder ab.

Die Testfermenter benötigten etwa 5 Tage um sich zu regenerieren. Am Ende der

Versuchsphase (Tag 28) lag die Produktion in KF-32 um 14,0 %, in TF-35 um 16,8 %

und in TF-35mS um 12,8 % niedriger als an Tag 8.

Über die gesamte Versuchsphase war kein Einfluss der Sojazulage auf die Produkti-

on der n-Buttersäure vorzuweisen.

Abb. 4.6: Mittlere n-Buttersäureproduktion [mmol/24h] in den Überständen wäh-rend 28-tägiger Inkubation mit Kontrollsilage, mit Schadsilage und mit Schadsilage plus Sojaprotein


4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mm

ol/2

4h

Tag

KF-32

TF-35

TF-35mS

Lauf 39–42

*

# ##

**

*

## ##

## #

#

#

****

° ** * *

**

## ##

#

Ergebnisse

74

4.1.7 n-Valeriansäurekonzentration

Die Kontrollfermenter konnten ein stabiles Niveau über die gesamte Versuchsdauer

halten (um 3,25 mmol/l).

Auch die Testfermenter erreichten bereits an Tag 4 das steady state, an Tag 8 lagen

die Konzentrationen bei 3,11 mmol/l (TF-35) und 3,41 mmol/l (TF-35mS).

Die Konzentrationen von TF-35 und TF-35mS stiegen bis Tag 12 um etwa 73,2 %

an. Von Tag 13-19 stiegen die Werte von TF-35 nur geringfügig an.

In der Testgruppe mit Sojaprotein stiegen die n-Valeriansäurekonzentrationen am

höchsten an, auffällig war hier ein kurzzeitiges Absinken der Konzentration an

Tag 16 und 17 (Konzentrationskurve verläuft wellenförmig).

Der weitere Kurvenverlauf von TF-35 und TF-35mS (Konzentrationen ab Tag 19)

ähnelt jeweils einem linearen Abfall, der sich über 6 Tage zog. An Tag 25 erreichten

diese Testgruppen wieder ihr Kontrollniveau.

Abb. 4.7: Mittlere n-Valeriansäurekonzentration [mmol/l] in den Fermentern wäh-rend 28-tägiger Inkubation mit Kontrollsilage, mit Schadsilage und mit Schadsilage plus Sojaprotein


0

2

4

6

8

10

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mm

ol/l

Tag

KF-32

TF-35

TF-35mS

Lauf 39–42

** ****

###

##

#

° °°

°**

##

##

##

##

##

##

**

*****

***° °

***

***#

##

##

#

##

##

##

***

***

***

*** *** ***

##

##

##

##

##

##

°°

°*

#

Ergebnisse

75

4.1.8 n-Valeriansäureproduktion

Die Kontrollgruppe sowie die Testgruppen erreichten bereits an Tag 4 das steady

state. Die Kontrollgruppe behielt während der 28 tägigen Versuchsphase ein stabiles

Niveau.

Analog zur Konzentration stieg auch die Produktion in den Testfermentern, vergli-

chen mit der Kontrollgruppe, deutlich an. Die Auswirkungen der Schadsilagezugabe

auf den Produktionsverlauf von TF-35 ließ sich in 3 Phasen einteilen (Tag 9-25). Es

kam zu einem zügigen Anstieg bis Tag 14 (TF-35 +91,7 %), an die sich eine relativ

konstante Phase bis Tag 19 anschloss. Von Tag 20-25 sank die Produktion wieder.

Die Produktion in TF-35mS stieg bis Tag 15 an. Tag 16 wies hier, ähnlich dem Ver-

lauf, einen Produktionsabfall von 2,13 % auf. Auffällig ist hier zudem ein weiterer Ab-

fall der Produktion noch während der Zulagephase (Tag 18 und 19). Außerdem lag

die Produktion der n-Valeriansäure in den Fermentern mit Sojazulage durchschnitt-

lich 8,89 % über der Produktion in den Fermentern ohne Sojaprotein.

Das Kontrollniveau wurde an Tag 25 erreicht. Ein Einfluss des Sojaproteins auf die

Produktion der n-Valeriansäure war erkennbar.

Abb. 4.8: Mittlere n-Valeriansäureproduktion [mmol/24h] in den Überständen während 28-tägiger Inkubation mit Kontrollsilage, mit Schadsilage und mit Schadsilage plus Sojaprotein


0

1

2

3

4

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mm

ol/2

4h

Tag

KF-32

TF-35

TF-35mS

Lauf 39–42

**

***#

##

°°°

°

° ##

##

##

##

##

##

***

******

***

##

##

** **

##

#

##

##

##

******

***°°

##

##

##

##

#*** ***

***

##

#°°

##

#

Ergebnisse

76

4.1.9 Hexansäurekonzentration

Die Konzentrationen in KF-32 behielten das an Tag 8 erreichte Niveau (1,98 mmol/l)

bis zum Ende des Versuchsdurchgangs bei.

Die Testgruppen zeigten während der Zulagephase einen wellenförmigen Kurvenver-

lauf. Mit Beginn der Schadsilagezulage stiegen die Konzentrationen der Testfermen-

ter zügig stark an, erreichten bereits an Tag 11 (TF-35) und Tag 12 (TF-35mS) ihre

höchsten Werte (Anstieg um etwa 98,0 %). Hierauf folgte ein Konzentrationsabfall in

beiden Gruppen von Tag 13 bis Tag 17 (durchschnittlich um -11,1 %). An den letzten

beiden Zulagetagen stiegen die Konzentrationen wieder an.

Genauso steil wie die Konzentrationen angestiegen sind, fielen sie mit Umstellung

der Fütterung in der Erholungsphase auch wieder ab. Bereits an Tag 22 war das

Kontrollniveau wieder erreicht (Konzentrationsabfall innerhalb von 3 Tagen um

46,9 %). In der Erholungsphase sanken die Werte der Testfermentergruppen unter

die Werte der Kontrollgruppe ab (Ausnahme: Tag 28, TF-35).

Abb. 4.9: Mittlere n-Valeriansäurekonzentration [mmol/l] in den Fermentern wäh-rend 28-tägiger Inkubation mit Kontrollsilage, mit Schadsilage und mit Schadsilage plus Sojaprotein


0

1

2

3

4

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mm

ol/l

Tag

KF-32

TF-35

TF-35mS

Lauf 39–42***

*****

#

##

##

#

°

°°

°°°*

*# #

#° ##

#

##

##

##

##

#

##

#

****

****** ***

***

##

#

##

##

##

******

°

#

##°°

Ergebnisse

77

4.1.10 Hexansäureproduktion

Die Kontrollgruppe konnte das in der Kontrollphase eingestellte Niveau über die ge-

samte Versuchsdauer beibehalten.

Die Produktion der Hexansäure zeigt analog zum Konzentrationsverlauf einen wel-

lenförmigen Verlauf, allerdings in einem deutlich geringeren Ausmaß. Mit Umstellung

der Fütterung ab Tag 9 stieg die Produktion in den Testgruppen TF-35 und TF-35mS

sehr schnell an. Bereits an Tag 11 konnte die Produktion um durchschnittlich 97,5 %

gesteigert werden. An den Tagen 14-16 zeigte sich ein Abfall der Produktion (von

durchschnittlich 1,49 mmol/24h auf 1,29 mmol/24h), an den sich eine erneute gering-

fügige Produktionssteigerung anschloss.

Beide Gruppen unterschieden sich während der Zulagephase kaum voneinander. In

der Erholungsphase lag die Hexansäureproduktion in den Testfermentern unterhalb

der Produktion in den Kontrollfermentern. Die Testgruppe mit Sojaprotein bspw. lag

18,1 % unterhalb der Kontrollgruppe (Tag 28).

Abb. 4.10: Mittlere Hexansäureproduktion [mmol/24h] in den Überständen wäh-rend 28-tägiger Inkubation mit Kontrollsilage, mit Schadsilage und mit Schadsilage plus Sojaprotein


0

0,5

1

1,5

2

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mm

ol/2

4h

Tag

KF-32

TF-35

TF-35mS

Lauf 39–42

*

**

***

#

##

#

°

#

##

##

##

##

#

##

#

##

#

##

##

##

##

#

******

******

***

***

***

** *********

##

##

##

##

°

Ergebnisse

78

4.1.11 Summe der flüchtigen Fettsäuren: Konzentration

Die Konzentrationen der FlFS lagen an Tag 8 durchschnittlich bei 98,3 mmol/l. Die

Kontrollgruppe konnte dieses Niveau nicht über die gesamte Versuchsdauer halten,

sie sank auf 90,5 mmol/l ab (Vergleich Tag 8 mit Tag 28: -7,84 %).

Mit Änderung der Silagezulage stiegen die Konzentrationen in den Testfermentern

TF-35 und TF-35mS an. Die Konzentrationen der Testgruppe TF-35 zeigten einen

auffälligen Kurvenverlauf. Von Tag 10 bis Tag 15 behielten die Konzentrationen ein

konstantes Niveau, ab Tag 16 kam es zu einem Konzentrationsabfall um etwa

6,69 mmol/l (-5,41 %, vgl. Tag 15 mit Tag 16).

Die Testfermenter mit Schadsilage und Sojaprotein wiesen einen relativ konstanten

Konzentrationsverlauf während der Zulagephase auf, es kam an Tag 18 zu einem

geringfügigen Konzentrationsanstieg (+1,80 %).

In der Erholungsphase benötigte das System etwa vier Tage um sich zu regenerie-

ren. Die Testfermenter sanken unter das an Tag 8 erreichte Kontrollniveau ab

(Tag 28, TF-35: -0,71 %, TF-35mS: -3,16 %).

Ein Einfluss des Sojaproteins auf die Konzentrationen der FlFS war insgesamt nicht

erkennbar.

Abb. 4.11: Mittlere Konzentration der Summe der flüchtigen Fettsäuren [mmol/l] in den Fermentern während 28-tägiger Inkubation mit Kontrollsilage, mit Schadsilage und mit Schadsilage plus Sojaprotein


60

80

100

120

140

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mm

ol/l

Tag

KF-32

TF-35

TF-35mS

Lauf 39–42

*

#

*

*

###

°#

#

*#

#**

##

*** **#

##

****#

##

##

#******

## ##

##

##

***

##

*

#

Ergebnisse

79

4.1.12 Summe der flüchtigen Fettsäuren: Produktion

Die Kontrollfermenter erreichten ein stabiles Niveau an Tag 8. Die Produktion sank

von Tag 8-10 um 10,8 %. Über die weiteren Versuchstage blieb die Produktion in-

nerhalb der Kontrollgruppe relativ konstant.

Die Produktion in den Testfermentern TF-35 und TF-35mS stieg, nach Erreichen ei-

nes stabilen Niveaus an Tag 8, während der Zulagephase durchschnittlich um

12,8 % an. Ein Effekt des Sojaproteins war nicht zu erkennen, die Produktion in bei-

den Testfermentergruppen war fast identisch.

In der Erholungsphase benötigten die Testfermenter etwa vier Tage um das Kontroll-

niveau wieder herzustellen, es lag jedoch um etwa 9,80 % unterhalb der Kontrolle an

Tag 8.

Abb. 4.12: Mittlere Produktion der Summe der flüchtigen Fettsäuren [mmol/24h] in den Überständen während 28-tägiger Inkubation mit Kontrollsilage, mit Schadsilage und mit Schadsilage plus Sojaprotein


10

30

50

70

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mm

ol/2

4h

Tag

KF-32

TF-35

TF-35mS

Lauf 39–42

***

***

###

##

#

## ##

##

##

***

******

***************

##

##

##

##

##

####

#

##

#

##

##

##

** *

Ergebnisse

80

4.2 Gehalt an phenolischen Substanzen in den Fermentern

Es werden die Ergebnisse von L39-42 dargestellt. Die Ergebnisse von L35-38 kön-

nen in der Dissertation von GÖRES (2016) eingesehen werden, graphische Darstel-

lung der Ergebnisse in Kapitel 9.11.

4.2.1 Gesamtphenolgehalt in den Fermentern

Der Gesamtphenolgehalt lag an Tag 8 (Kontrollphase) durchschnittlich bei

1,6 mmol/l. In den Kontrollfermentern sank dieser bis Tag 14 auf 1,41 mmol/l

(-13,5 %) und behielt dieses Niveau während der Zulagephase. Erst in der Erho-

lungsphase stieg der Gehalt in der Kontrollgruppe wieder geringfügig an, lag jedoch

unterhalb des Ausgangsniveaus (Tag 28: -3,07 %).

Die Testfermenter erreichten das steady state an Tag 8, eine Zulageänderung ab

Tag 9 bewirkte keinen Effekt. Mit Ausnahme von Tag 19 und Tag 23 blieb der Ge-

samtphenolgehalt in beiden Gruppen über die Versuchsphase konstant.

Die Zulage von Sojaprotein hatte keinen Einfluss auf den Gesamtphenolgehalt.

Abb. 4.13: Mittlere Gesamtphenolkonzentration [mmol/l] in den Fermentern wäh-rend 28-tägiger Inkubation mit Kontrollsilage, mit Schadsilage und mit Schadsilage plus Sojaprotein


0,5

1

1,5

2

2,5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mm

ol/l

Tag

KF-32

TF-35

TF-35mS

Lauf 39–42

*

**

# ##

° °°

°

°°°

##

# ### #

Ergebnisse

81

4.2.2 o-Diphenolgehalt in den Fermentern

Im Vergleich zum Gesamtphenolgehalt stieg der o-Diphenolgehalt in der

Einlaufphase bis einschließlich Tag 5 an, und pendelte sich dann auf ein Niveau von

4,52 mg/ml ein (KF-32, Tag 8). Die Kontrollfermenter behielten, mit Ausnahme von

geringen Schwankungen, ein relativ konstantes Niveau über die gesamte

Versuchsphase.

Die Testfermenter hingegen wiesen nach Umstellung der Fütterung (Tag 9) ein

Absinken des o-Diphenolgehaltes auf. An Tag 16 wurden die niedrigsten

o-Diphenolgehalte gemessen (Vgl. zu KF-32 an Tag 16: TF-35: -7,24 %,

TF-35mS: -4,75 %).

Die o-Diphenolgehalte in den Testfermentern mit Sojaprotein lagen geringfügig

oberhalb der gemessen Werte in TF-35 (während Zulagphase durchschnittlich

+1,30 %). Es war kein wesentlicher Effekt auf den o-Diphenolgehalt durch das

Sojaprotein nachzuweisen.

In der Erholungsphase erreichten die Testfermenter wieder das Kontrollniveau.

Abb. 4.14: Mittlerer o-Diphenolgehalt [mg/ml] in den Fermentern während 28-tägiger Inkubation mit Kontrollsilage, mit Schadsilage und mit Schadsilage plus Sojaprotein


3,5

4

4,5

5

5,5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mg/m

l

Tag

KF-32

TF-35

TF-35mS

Lauf 39–42

°° ° °°***

Ergebnisse

82

4.3 Gehalt an phenolischen Substanzen in der Überstandsflüssigkeit

nach Pepsinverdau

Es werden die Ergebnisse der Gesamtphenole sowie o-Diphenole von L35-38 und

L39-42 dargestellt. Die Messung der Phenolgehalte in der Überstandsflüssigkeit

nach Pepsinverdau erfolgte ab Tag 7 fortlaufend bis zum Versuchsende (Tag 28).

Bezeichnung der drei Testgruppen s. Kapitel 3.3.2.3.

Ergebnisse

83

4.3.1 Gesamtphenolgehalt in der Überstandsflüssigkeit nach Pepsinverdau

L35-38 (Abb. 4.15): Alle Gehalte in den Überstandsproben erreichten ein stabiles

Niveau an Tag 8 (KF-32-Ü: 1,31 mmol/l). Der Gesamtphenolgehalt in der Kontroll-

gruppe blieb, mit kleinen Schwankungen, über die gesamte Versuchsphase stabil.

Die Umstellung der Fütterung ab Tag 9 führte in TF-33-Ü zu einem langsamen An-

stieg des Gesamtphenolgehaltes (bis Tag 13: +16,4 %). Von Tag 14-18 hielten sich

die Werte dann in einem konstanten Bereich. Diese Testgruppe wies, verglichen mit

KF-32-Ü und TF-33mS-Ü, die höchsten Gesamtphenolgehalte auf (Tag 19:

1,69 mmol/l, 40,8 % über KF-32-Ü, 11,9 % über TF-33mS-Ü).

Der Gesamtphenolgehalt in TF-33mS lag während der Zulagephase mittig zwischen

den Gehalten der Kontrollgruppe und der Testgruppe ohne Sojazulage, der Gehalt

stieg nur geringfügig an. Es war ein deutlicher Einfluss der Sojasupplementation

während der Zulagephase erkennbar (-12,7 % unterhalb von TF-33-Ü).

In der Erholungsphase konnten beide Testgruppen zügig wieder das Kontrollniveau

erreichen.

Abb. 4.15: Mittlere Gesamtphenolkonzentration [mmol/l] in der Überstandsflüssig-keit nach Pepsinverdau während 28-tägiger Inkubation mit Kontrollsila-ge, mit Schadsilage und mit Schadsilage plus Sojaprotein:

Zulagephase ( ) / / entsprechende Fermentergruppen

KF-Ü vs. TF-Ü: * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 KF-Ü vs. TFms-Ü: # p < 0,05; ## p < 0,01; ### p < 0,001 TF-Ü vs. TFms-Ü: ° p < 0,05; °° p < 0,01; °°° p < 0,001

0,5

1

1,5

2

2,5

0 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mm

ol/l

Tag

KF-32-Ü

TF-33-Ü

TF-33mS-Ü

Lauf 35–38

*

**

***

# ## ##

#

°°°

°°°

* *

******

***

***

***

******

***### ####

##

°

°°°°°° °°

°°°°

Ergebnisse

84

L39-42 (Abb. 4.16): An Tag 8 lagen die Gesamtphenolgehalte in KF-32-Ü, TF-35-Ü

und TF-35mS-Ü bei durchschnittlich 1,48 mmol/l. Trotz kontinuierlicher Fütterung mit

der Kontrollsilage sank der Gesamtphenolgehalt in den Überständen der Kontrolle zu

Beginn der Zulagephase (Tag 8-10) ab (-17,2 %), behielt bis Tag 19 ein konstantes

Niveau. Mit Beginn der Erholungsphase regenerierten sich die Werte, der Ge-

samtphenolgehalt entsprach wieder dem Kontrollniveau.

Auch in der Testgruppe TF-35-Ü änderte sich der Gesamtphenolgehalt mit Beginn

der Zulagephase. Durch Fütterung von S-35 stiegen die Werte bis Tag 13 (+58,7 %

gegenüber KF-32-Ü an diesem Tag) an. Während der weiteren Zulagephase

schwankte der Gesamtphenolgehalt geringfügig um diesen Wert. Mit Beginn der Er-

holungsphase fielen die Werte von TF-35-Ü direkt wieder ab.

Die Testgruppe mit Sojazulage (TF-35mS-Ü) hielt über die ganze Versuchsdauer,

auch während der Zulagephase, ein konstantes Niveau, das sich nicht vom Kontroll-

niveau (Tag 8) unterschied.

Abb. 4.16: Mittlere Gesamtphenolkonzentration [mmol/l] in der Überstandsflüssig-keit nach Pepsinverdau während 28-tägiger Inkubation mit Kontrollsila-ge, mit Schadsilage und mit Schadsilage plus Sojaprotein


0,5

1

1,5

2

2,5

0 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mm

ol/l

Tag

KF-32-Ü

TF-35-Ü

TF-35mS-Ü

Lauf 39–42

**

***# ## ##

#

°°°

°°° ************

******

******

**

# ## ##

#

##

#

##

##

##

##

#

°

°°°°°°°°°°°°

°°°°°°

Ergebnisse

85

Auffällig war in beiden Laufgruppen ein deutlich niedrigerer Phenolgehalt in den

Überständen mit Schadsilage und Sojaprotein, verglichen mit den Überständen mit

Schadsilage, sodass ein deutlicher Einfluss des Sojaproteins ersichtlich war. Die in

L39-42 verwendete Schadsilage (S-35) führte, verglichen mit der in L35-38 zugeleg-

ten Schadsilage (S-33), zu den höchsten Phenolgehalten in der Überstandsflüssig-

keit (der höchste Gesamtphenolgehalt aus L39-42 lag 0,25 mmol/l über dem maxi-

malen Wert aus L35-38). In der dritten Laufgruppe fiel zudem ein Absinken der Kon-

trollgruppe über einen Zeitraum von 11 Tagen (Tag 9-19) auf.

Ergebnisse

86

4.3.2 o-Diphenolgehalt in der Überstandsflüssigkeit nach Pepsinverdau

L35-38 (Abb. 4.17): Auffällig war ein geringfügiges Absinken der Kontrollgruppe

(KF-32-Ü), trotz kontinuierlicher Fütterung mit der gleichen Silage, über die Dauer

der 28 tägigen Versuchsphase von 6,75 mg/ml (Tag 8) auf 5,88 mg/ml (Tag 28,

Rückgang von 12,9 %).

Nach Umstellung der Fütterung ab Tag 9 spiegelten die gemessenen o-Diphenol-

werte von TF-33-Ü einen wellenförmigen Kurvenverlauf wieder. Es gab einen zügi-

gen Anstieg bis Tag 11 (+12,4 %), einen kurzzeitigen Rückgang an Tag 14 (-3,26 %),

dem ein erneuter Anstieg um 7,15 % folgte. Auffällig war hier ein kontinuierlicher

Rückgang des o-Diphenolgehaltes ab Tag 18 (noch während der Zulagephase), der

sich auch in der Erholungsphase fortsetzte. An Tag 28 lagen die Werte von TF-33-Ü

12,0 % unterhalb des Kontrollniveaus.

Im Gegensatz hierzu lagen die Gehalte unter Sojazulage (TF-33mS-Ü) in der Zula-

gephase deutlich unterhalb der Werte aus TF-33-Ü (durchschnittlich 0,8 mg/ml nied-

riger). Die Gehalte in TF-33mS-Ü stiegen während der Zulagephase, durchschnittlich

nur um 0,1 mg/ml an, es lag ein relativ konstantes Niveau vor. Verglichen mit

TF-33-Ü war ein deutlicher Effekt durch das Sojaprotein erkennbar. Erst in der Erho-

lungsphase sanken die Werte dieser Gruppe ab, auch hier fielen die gemessenen

Werte unter das Kontrollniveau ab.

Abb. 4.17: Mittlerer o-Diphenolgehalt [mg/ml] in der Überstandsflüssigkeit nach Pepsinverdau während 28-tägiger Inkubation mit Kontrollsilage, mit Schadsilage und mit Schadsilage plus Sojaprotein


5

5,5

6

6,5

7

7,5

8

8,5

9

0 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mg/m

l

Tag

KF-32-Ü

TF-33-Ü

TF-33mS-Ü

Lauf 35–38

*

**

***#

####

#

°°° °°°

*** **

*********

***

# ##

°°°°

°°°°°°

Ergebnisse

87

L39-42 (Abb. 4.18): Trotz konstanter Zulage in der Kontrollgruppe fielen die Werte in

KF-32-Ü von Tag 9-19 deutlich unter das Kontrollniveau ab. Tag 11 wies die nied-

rigsten Gehalte auf, hier kam es zu einem Absinken von 12,8 % Die Gehalte der

Kontrollgruppe erreichten erst zu Beginn der Erholungsphase das ursprüngliche Ni-

veau.

Der o-Diphenolgehalt in TF-35-Ü hingegen zeigte einen deutlichen Anstieg bis

Tag 12 (+28,5 %). An Tag 13 gab es einen geringgradigen Rückgang der Werte

(-6,68 % gegenüber Tag 12), dieses Niveau wurde bis Tag 18 relativ konstant gehal-

ten. Von Tag 19-23 fielen die Werte konstant ab, Tag 23 wies, verglichen mit Tag 18,

einen Rückgang von 21,9 % auf. In der weiteren Erholungsphase pendelten sich die

Werte um das Kontrollniveau ein.

Die Testfermenter TF-35mS-Ü wiesen einen geringfügigen Rückgang im

o-Diphenolgehalt auf (bis Tag 23), der sich danach wieder dem Kontrollniveau annä-

herte. Durchschnittlich lag der o-Diphenolgehalt in TF-35-Ü 23,1 % über dem in

TF-35mS-Ü. Es war ein deutlicher Einfluss vom Sojaprotein auf den Gehalt an

o-Diphenolen sichtbar, während der Zulagephase lagen die Werte von TF-35mS-Ü

16,8 % unterhalb von TF-35-Ü.

Abb. 4.18: Mittlerer o-Diphenolgehalt [mg/ml] in der Überstandsflüssigkeit nach

Pepsinverdau während 28-tägiger Inkubation mit Kontrollsilage, mit

Schadsilage und mit Schadsilage plus Sojaprotein:

Restlegende siehe Abb. 4.15

° °

5

5,5

6

6,5

7

7,5

8

8,5

9

0 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mg/m

l

Tag

KF-32-Ü

TF-35-Ü

TF-35mS-Ü

Lauf 39–42

*

*****

# ##

#

°°

°°°

*

******

***

****

*********

##

# # #

#

#

°°°

°°°°°°°°°°°

°

Ergebnisse

88

Auffällig war das Absinken der Gehalte in der Kontrollgruppe während der geänder-

ten Zulagephase der Testfermenter in L39-42, bei L35-38 hingegen kam es zu einem

kontinuierlichen, aber deutlich geringeren, Rückgang der Kontrollwerte. Die

o-Diphenolgehalte (Testgruppen) in der Zulagephase lagen im Durchschnitt während

L35-38 in TF-33-Ü bei 7,59 mg/ml, während L39-42 in TF-35-Ü bei 7,78 mg/ml. In

TF-33mS-Ü lagen die Werte von L35-38 bei 6,81 mg/ml und in TF-35mS-Ü von

L39-42 bei 6,32 mg/ml. Einflüsse der Schadsilagen sowie des Sojaproteins auf den

o-Diphenolgehalt waren deutlich erkennbar. In beiden Laufgruppen fiel zudem der

o-Diphenolgehalt der Testgruppen TF-33-Ü und TF-35-Ü bereits vor Ende der Zulage

ab.

Ergebnisse

89

4.4 Ergebnisüberblick

Die Essigsäurekonzentrationen und –produktionen wurden weder durch die Fütte-

rung der Schadsilagen noch der Sojasupplementationen beeinflusst.

Die Propionsäurekonzentration hingegen wies einen Einfluss durch die Fütterung von

S-35 während der Zulagephase auf. Hier fiel ein Absinken an Tag 16 auf. Die Test-

gruppe mit Sojazulage hingegen verlief konstant. Die Produktion zeigte keinen Effekt

durch Zulage des Sojaproteins.

Die Zulage des Sojaproteins hatte keinen Effekt auf die n-Buttersäureergebnisse. Bei

der n-Valeriansäure konnte sowohl in der Produktion nach 24 Stunden wie auch in

der Konzentration ein Einfluss der Sojasupplementation aufgezeigt werden, die Wer-

te unterschieden sich von denen ohne Sojazulage.

Die Ergebnisse der Hexansäure wurden nicht durch die Sojazulage beeinflusst.

Die Konzentration der Gesamtsumme der flüchtigen Fettsäuren zeigte ab Tag 16

einen geringfügigen Sojaeinfluss. Die Produktion in 24 Stunden hingegen war kein

Einfluss des Sojaproteins erkennbar.

Der Gesamtphenol- sowie der o-Diphenolgehalt in den Fermentern wurden nicht

durch das Sojaprotein beeinflusst.

Es war ein deutlicher Einfluss des Sojaproteins auf den Gesamtphenolgehalt in der

Überstandsflüssigkeit nach Pepsinverdau (L35-38 und L39-42) erkennbar. In

TF-33mS-Ü und TF-35mS-Ü kam es, verglichen mit TF-33-Ü und TF-35-Ü, nur zu

einem leichten Anstieg im Gesamtphenolgehalt

Ein Effekt der Sojazulage war auch im o-Diphenolgehalt in der Überstandsflüssigkeit

(L35-38 und L39-42) deutlich sichtbar. Die o-Diphenolgehalte in den Testfermentern

mit Sojazulage lagen deutlich unter den Gehalten in den Testfermentern ohne So-

jazulage.

Ergebnisse

90

Tab. 4.1: Tägliche Abweichungen der Testfermentermittelwerte von den Kontroll-fermentermittelwerten (in Prozent) der Tage 11-19, flüchtige Fettsäuren

Ko

nzen

tration FlFS TF-35 TF-35mS

Essigsäure +0,24 -0,27

Propionsäure +19,6 +21,7

n-Buttersäure +10,7 +8,08

n-Valeriansäure +64,3 +79,0

Hexansäure +67,3 +64,0

Summe der FlFS +15,7 +16,0

Pro

du

ktio

n/2

4h

FlFS TF-35 TF-35mS

Essigsäure +8,31 +5,61

Propionsäure +28,5 +30,1

n-Buttersäure +14,1 +11,9

n-Valeriansäure +77,8 +93,3

Hexansäure +82,8 +77,9

Summe der FlFS +22,8 +22,1

Tab. 4.2: Tägliche Abweichungen der Testfermentermittelwerte von den Kontroll-fermentermittelwerten (in Prozent) der Tage 11-19, Phenole im Fermen-ter

Gehalt im Fermenter

Parameter TF-35 TF-35mS

Gesamtphenole +7,28 +7,97

o-Diphenole -3,49 -2,32

Tab. 4.3: Tägliche Abweichungen der Überstandsmittelwerte von den Kontrollmit-telwerten (in Prozent) der Tage 11-19, Phenole im Überstand nach Pepsinverdau

Gehalt im Überstand

Parameter TF-33 TF-33mS TF-35 TF-35mS

Gesamtphenole +35,7 +15,9 +52,2 +24,8

o-Diphenole +21,1 +8,61 +39,5 +13,3

Diskussion

91

5 Diskussion

5.1 Intention der Arbeit

In der vorliegenden Arbeit wurde mittels dem In-vitro-System RUSITEC die Auswir-

kungen der Fütterung von Grassilagen (RE-Anteil am RP über sowie unter 50%) und

einer Zulage von Sojaprotein auf den Gehalt an phenolischen Substanzen, an zwei

verschiedenen in vitro Entnahmeorten, sowie auf den Gehalt an flüchtigen Fettsäu-

ren untersucht. Der Schwerpunkt der Untersuchungen lag auf der Analyse des Stoff-

wechselweges phenolischer Substanzen und der Auswertung eines Einflusses einer

Sojasupplementation, um somit Reaktionsschritte dieser Stoffgruppe näher charakte-

risieren zu können.

5.2 Kritische Betrachtung des Versuchsaufbaus

5.2.1 Das RUSITEC-System

Das RUSITEC-System bietet die Möglichkeit, mehrere Parameter (FlFS, phenolische

Substanzen, Ammoniak, pH-Wert, Gasvolumina etc.) von unterschiedlichen Futter-

mitteln zeitgleich bestimmen zu können. Die Fermentation findet über einen

28-tägigen Versuchsdurchgang, unterteilt in vier Phasen (Einlaufphase Tag 0-6, Kon-

trollphase Tag 7-8, Zulagephase Tag 9-18, Erholungsphase Tag 19-28, analog zu

GAST 2010, GRESNER 2011 und LUMPP 2011), statt. Diese Einteilung erwies sich

als geeignet (u.a. einpendeln des Systems auf konstantes Niveau sowie Erholungs-

zeitraum).

Der RUSITEC wurde an Tag 0 mit Panseninokulum von einem fistulierten Spender-

tier beladen. Die Proben aller Läufe, die aus verschiedenen Kompartimenten des

RUSITEC entnommen worden sind, spiegeln ein dynamisches Bild wider. Bis zum

Ende der Kontrollphase (Tag 8) wurden alle Fermenter identisch beladen

(s. Tab. 3.8; abweichend zu GAST 2010; GRESNER 2011; LUMPP 2011), um im

gesamten System einheitliche Grundbedingungen zu erzeugen. Die Umstellung der

Fütterung in den Fermentern 3+4 sowie 5+6 ab Tag 9 und die hieraus resultierenden

Ergebnisse basierten somit auf gleicher Grundlage, sodass Vergleiche zwischen den

Fermenterpaaren möglich waren.

Zur Kontrolle einer gleichmäßigen Beladung sowie konstanten Pufferzufuhr wurden

täglich die Überstandsgefäße entleert und deren Volumina2 bestimmt. Die Messung

2 laut persönlicher Mitteilung von Katharina Ebhardt, Hannover am 31.01.2017

Diskussion

92

des innerhalb von 24 Stunden produzierten Gasvolumens sowie dessen Zusammen-

setzung3 dienten der Überprüfung der Dichtigkeit des Systems. Zur Überwachung

stabiler Fermentationsbedingungen wurden die pH-Werte4, Ammoniakkonzentratio-

nen5 und die flüchtigen Fettsäuren der Fermenterflüssigkeiten ebenfalls täglich ge-

messen.

Eine kritische Bewertung des Systems, bezogen auf die Fähigkeit, in vitro die in vivo

Verhältnisse zu simulieren, ist in den Dissertationen von SCHIRMER (1990),

KRAKOW (1992), BECKER (1994), MAIWORM (1994), ELIAS (1999), GAST (2010),

GRESNER (2011) und LUMPP (2011) bereits ausführlich diskutiert worden.

5.2.2 Eingesetzte Grassilagen

Die Einteilung der eingesetzten Grassilagen K-32, S-33 und S-35 in Kontroll- und

Schadgruppe erfolgte nach den von EICKEN (2005a) veröffentlichten Ergebnissen.

Die Silagen mit einem Reineiweißgehalt am Rohprotein von unter 50 % wurden als

Schadsilagen bezeichnet, mit über 50 % RE am RP als Kontrollsilage (GAST 2010).

Alle drei Silagen stammten von einem Betrieb in Norddeutschland mit Schwerpunkt

Milchviehhaltung. Dort verursachten die verfütterten Silagen ein Krankheitsbild das

der „Faktorenerkrankung Milchviehherde“ (EICKEN 2005a) entsprach. Das Grundfut-

ter (zur Analyse mittels RUSITEC-System) wurde vom sensorisch nicht auffälligen

Fahrsiloanschnitt entnommen und bis zum Einsatz im Langzeitinkubationssystem

bei -20°C gelagert. Die in allen acht Durchgängen eingesetzte Kontrollsilage K-32

entstammte dem dritten Schnitt 2014. Die Schadsilage S-33 kam vom ersten Schnitt

2014, S-35 vom ersten Schnitt 2015. Alle drei Silagen stammten von denselben Flä-

chen, im Gegensatz zu den Dissertationen von GAST (2010), GRESNER (2011),

LUMPP (2011) und WICHERN (2011). Einflüsse des Standortes sowie der Zusam-

mensetzung des Silos konnten ausgeschlossen werden, auch war ein Vergleich zwi-

schen 2014 und 2015 desselben Standortes möglich. Somit sind die hier neu ge-

wonnen Ergebnisse aussagekräftiger, da weniger Einflüsse vorhanden waren und

kontinuierlich mit Grassilagen gefüttert wurde.

Die Analyse des Futters erfolgte mittels nasschemischer Analyseverfahren (Richtli-

nien der VDLUFA). Die Methode nach BARNSTEIN (1900) wurde zur Ermittlung des

Reineiweißgehaltes angewendet (VDLUFA III Methode 4.4.1; NAUMANN u.

BASSLER 2012).

Im Gesamtprojekt wurden zudem K-30 und S-31 eingesetzt, Silagen, die von einem

anderen Betrieb stammen als den oben erwähnten, jedoch auch von derselben Flä-

che (1. und 3. Schnitt 2014). Auch diese wurden mit Hilfe der oben genannten Me-

thoden analysiert.



5 laut persönlicher Mitteilung von Christopher Schulte, Hannover am 31.01.2017

Diskussion

93

5.3 Kritische Betrachtung der verwendeten Parameter

Das zur Beladung an Tag 0 verwendete Inokulum (fester und flüssiger Panseninhalt)

stammte von nur einem fistulierten Rind. Die Ergebnisse der verwendeten Parameter

haben somit möglicherweise eine geschwächte Aussagekraft bezogen auf eine weit-

reichende Analyse.

5.3.1 Flüchtige Fettsäuren

Die Methode zur Messung der Konzentration der flüchtigen Fettsäuren wurde bereits

bei MAIWORM (1994), LUMPP (2011) und GÖRES (2016) ausführlich geprüft und

als geeignet befunden. Die eigenen VK von 0,44-2,26 % unterstützen die bisherigen

Aussagen (s. Kap. 3.3).

5.3.2 Gesamtphenole im Fermenter

Zur Bestimmung des Gesamtphenolgehaltes im Pansensaft (s. Kap. 3.3.2.1) wurde

die bei GÖRES (2016) beschriebene Methode angewendet. Diese Methode ist in

ihrer Ausführung einfach, schnell und gut reproduzierbar. Sie kann als Routineunter-

suchung ohne außergewöhnliches Equipment auch in der Praxis eingesetzt werden

(HOLLOWAY et al. 1979). Ein VK von 0,86 % zeigt, dass sich die Methode bereits

bei GÖRES (2016) als geeignet erwiesen hat. Die kolorimetrische Ermittlung des

Gesamtphenolgehalts liefert, im Gegensatz zu hoch spezifischen, zeitintensiven

Messverfahren (bspw. chromatographische Bestimmung einzelner Phenolsäuren),

direkte Ergebnisse (s. Kap. 3.3.2.1; HOLLOWAY et al. 1979; MENGISTU 1990).

Durch den Einsatz derselben Methode im Gesamtprojekt (L31-42) war eine Ver-

gleichbarkeit der Effekte der eingesetzten Silagen möglich (s. Kap. 4, 5.7 und 9.11).

Bei dieser Methode handelte es sich um die Bestimmung eines Summenparameters

(s. Kap. 3.3.2.1 und 4.2.1). Daher konnte keine Aussage darüber getroffen werden,

welche phenolischen Substanzen im Einzelnen angefärbt werden.

HOLLOWAY et al. (1979) sprechen von der Bestimmung freier phenolischer Sub-

stanzen mittels der Folin-Ciocalteau-Färbung und wiesen darauf hin, dass bestimmte

phenolische Substanzen unterschiedlich stark durch das Folin-Ciocalteau-Reagenz

angefärbt werden (p-Hydroxyphenylbrenztraubensäure und Tyrosin färben sich stark

an, Phenol hat die geringste Farbintensität). Zudem prüfte GÖRES (2016) die Mes-

sung verschiedener phenolischer Substanzen mittels der oben genannten Methode

und erhielt ebenfalls deutlich unterschiedliche Farbintensitäten der einzelnen Stoffe,

sodass ggf. eine Eingrenzung möglich wäre. Die Bestimmung des Summenparame-

ters war an dieser Stelle ausreichend, da sie der Überprüfung des Gehaltes an phe-

nolischen Substanzen in verschiedenen Silagen sowie der Überprüfung eines Soja-

proteineinflusses diente.

Diskussion

94

5.3.3 o-Diphenole im Fermenter

Der Gehalt an o-Diphenolen in der Fermenterflüssigkeit wurde mittels der bei

GÖRES (2016) beschriebenen Methode bestimmt (s. Kap. 3.3.2.2), da hier erstmalig

Substanzen im Pansensaft und nicht in Pflanzenmaterial direkt bestimmt wurden. Die

Extraktion nach FRAISSE et al. (2011) gilt als einfach in ihrer Ausführung, außerdem

können größere Probenmengen gleichzeitig aufgearbeitet werden

(FRAISSE et al. 2007), sodass der hier gewonnene Probenumfang (s. Kap. 3.3.2)

zeitnah bearbeitet werden konnte. Entscheidend war bei dieser Probenanzahl zudem

eine gute Wiederholbarkeit der Methode. Ein VK von 3,18 % zeichnete diese Metho-

de bereits bei GÖRES (2016) als geeignet aus, sodass sie auch in dieser Arbeit an-

gewendet wurde. Hierdurch konnte zusätzlich ein Vergleich der im Gesamtprojekt

eingesetzten Silagen erfolgen (s. Kap. 4, 5.8 und 9.11). Eine kolorimetrische Be-

stimmung der o-Diphenole hatte den Vorteil, dass die Ergebnisse unmittelbar vorla-

gen.

Nach McMANUS et al. (1981), RAWEL et al. (2002) und STICHER et al. (2015) gel-

ten vor allem die o-Diphenole als reaktive Substanzen, sodass nach Bestimmung der

Gesamtphenole eine Analyse einer bestimmten Gruppe phenolischer Substanzen

erfolgte. Auch bei dieser Methode handelte es sich um die Bestimmung eines Sum-

menparameters. Es ist jedoch nicht näher erläutert, ob freie phenolische Substanzen

oder auch maskierte Substanzen (durch Komplexbildung, s. Kap. 2.3) in die Messki-

netik einbezogen werden. Es konnte lediglich eine strukturelle Eingrenzung der ge-

messenen Substanzen erfolgen, da ARNOW (1937) die Messung von phenolischen

Substanzen mit zwei oder drei OH-Gruppen mittels dieser Methode beschreibt (phe-

nolische Substanzen mit nur einer OH-Gruppe reagieren zu langsam oder gar nicht

mit den beschriebenen Reagenzien), allerdings gehören auch der Gruppe der

o-Diphenole viele verschiedene Substanzen an (s. Kap. 2.1). ARNOW (1937) und

auch GÖRES (2016) beschreiben die unterschiedliche Anfärbbarkeit und Farbge-

bung verschiedener o-Diphenole mittels der genannten Methode, sodass unter Vor-

behalt eine nähere Eingrenzung möglich wäre. Zur zeitnahen und praxistauglichen

Analyse des o-Diphenolgehaltes verschiedener Silagen war diese Methode gut ge-

eignet.

Diskussion

95

5.4 Einfluss des Verdauungsenzyms Pepsin auf den Gehalt an phenoli-

schen Substanzen in der Überstandsflüssigkeit

In Vorversuchen zeigte sich, dass der Gehalt an phenolischen Substanzen nach en-

zymatischen Verdau mittels Pepsin im Überstand (Labmagen) höher war, als ohne

enzymatischem Verdau in diesem (s. Kap. 9.4). Der Gehalt an o-Diphenolen war

nach Pepsinzugabe bis zu 40 % höher. Dies zeigt, dass phenolische Substanzen

keine hemmende Wirkung auf Pepsin haben. Pepsin ist in der Lage, Phenol-

Proteinkomplexe zu spalten, sodass freie phenolische Substanzen durch die Messki-

netik erfasst werden konnten. Der Gesamtphenolgehalt der Kontrollgruppe, die über

die gesamte Versuchsphase identisch gefüttert wurde, lag nach zweistündigem Pep-

sinverdau zwischen 80 %-180 % über dem Gesamtphenolgehalt ohne Pepsinverdau.

Dieser massive Anstieg wird durch nicht zu erklärende niedrigere Werte in der Kon-

trollgruppe bedingt (s. Kap. 9.4).

5.5 Gesamtphenole und o-Diphenole im Überstand

Die Proben aus den Überstandsflüssigkeiten wurden mit einer Pepsin-HCL-Lösung

versetzt und für zwei Stunden permanent rotierend bei 39° C inkubiert und anschlie-

ßend nach den oben beschriebenen Methoden (s. Kap. 3.3.2.5 und 3.3.2.8;

ARNOW 1937; HOLLOWAY et al. 1979; MENGISTU 1990; GÖRES 2016) aufberei-

tet und gemessen. In der Routine der Probenmessungen sowie durch einen VK von

1,46 % (Gesamtphenolmessung) und 2,73 % (o-Diphenolmessung) erwiesen sich

diese Methoden als geeignet und praktikabel in ihrer Durchführung.

Auf Grund des in der Überstandsflüssigkeit vorherrschenden niedrigen pH-Wertes

(pH-Wert 1,19) wurde der enzymatische Verdau mittels Pepsin durchgeführt

(s. Kap. 3.3.2.5 und 3.3.2.6). Das Reaktionsoptimum von Pepsin liegt im pH-Bereich

von 1,5-2,5 (BAKER 1954; CUI et al. 2013). Mit steigendem pH-Wert lässt die en-

zymatische Aktivität nach (BEYER et al. 1976). Außerdem spaltet Pepsin relativ un-

spezifisch (STEINHART u. KIRCHGESSNER 1973b). Diese Eigenschaft erwies sich

als günstig, da nicht bekannt war, welche Substanzen im Einzelnen (Proteine, phe-

nolische Substanzen, etc.) zur Spaltung vorlagen. Einige Proteine weisen beispiels-

weise nur partiell zu spaltende Strukturen auf (s. Kap. 2.3.6). Die vorliegenden Prote-

ine, möglicherweise als Phenol-Proteinkomplexe (s. Kap. 2.3.3), ändern durch einen

niedrigen pH-Wert ihre Struktur, sodass bislang versteckte Seiten im Inneren hervor-

treten (Proteinentfaltung), jedoch wird Pepsin zur Spaltung vorhandener Bindungen

benötigt (s. Kap. 2.3.6; CUI et al. 2013). In Vorversuchen zeigte sich ein erhöhter

Wert an phenolischen Substanzen nach Hinzugabe von Pepsin-HCL-Lösung, vergli-

Diskussion

96

chen mit Proben ohne Pepsin (s. Kap. 3.3.2.4), sodass eine Wirkung des Enzyms

ersichtlich war.

Bereits bei STEINHART und KIRCHGESSNER (1973a) ergab sich eine relativ kurze

enzymatische Aktivitätszeit als sinnvoll, da in vitro gespaltene Produkte nicht weiter

transportiert werden und die entstandenen Spaltungen mittels Pepsin reversibel sind.

Es kann sich mit der Zeit ein Gleichgewicht zwischen Edukten und Produkten einstel-

len (Akkumulation). Aus Vorversuchen ergab sich, dass eine Inkubationszeit unter

zwei Stunden nicht sinnvoll ist, da das Enzym dennoch eine gewisse Zeit benötigt,

um vorliegende Bindungen zu spalten. CUI et al. (2013) beschreiben eine

120 minütige Reaktionszeit zur vollständigen enzymatischen Hydrolyse von Glycinin

(s. Kap. 2.3.6). Somit haben sich die zwei Stunden Inkubationszeit als sinnvoll erwie-

sen.

Diskussion

97

5.6 Auswirkungen von Schadsilagen und Sojaprotein auf das Fermenta-

tionsmuster der flüchtigen Fettsäuren

5.6.1 Übersicht

Um nachfolgend eine Einordnung von L39-42 im Gesamtprojekt vornehmen zu kön-

nen und Ursachen für die hier vorliegenden Fermentationsmuster zu finden, wurden

zuerst die Ergebnisse der Futtermittelanalysen (s. Tab. 3.4, 3.5, 9.28 und 9.29) aus

allen drei Laufgruppen verglichen. Aus den Ergebnissen der Futtermittelanalyse kön-

nen die Fermentationsmuster für L31-34, L35-38 und L39-42 nicht abgeleitet werden

(s. Kap. 5.6.3). Der höhere energetische Eintrag von S-35 (11,4 MJ/kg TS) findet sich

in der Produktion der Summe aller Fettsäuren nicht wieder. Setzt man den prozentu-

alen Reineiweißanteil am Rohprotein als Maß für die Dauer vom programmierten

Zelltod (s. Kap. 5.6.2) fest, so ist die Silage S-35 (RE vom RP: 43,3 %) diesem am

kürzesten ausgesetzt (dann S-31 mit RE vom RP: 42,9 %, s. GÖRES 2016 und S-33

mit RE vom RP: 40,3 %). Schaut man sich die steigenden GABA-Gehalte

(s. Tab. 9.28) an, so kann man die drei Laufgruppen des Gesamtprojekts folgender-

maßen einordnen: S-35 (6,44 g/kg TS), S-31 (8,88 g/kg TS) und S-33 (9,63 g/kg TS).

In der Silage S-35 ist die geringste GABA-Produktion abgelaufen. Dieser Wert ent-

spricht nicht der später aufgeführten Einordung von L39-42 in das Gesamtprojekt

(s. Kap. 5.6.3, S-35 liegt zwischen S-31 und S-33). Die Konzentration der flüchtigen

Fettsäuren im Fermenter scheint abhängig von der Apoptose (REAPE et al. 2008

unterscheiden zwischen Apoptose und Nekrose als Formen des Zelltods, Apoptose:

kontrolliertes Zellsterben, auch als programmierter Zelltod bezeichnet), jedoch nicht

von der Dauer selbst, zu sein.

Um dennoch Ursachen für die vorliegenden Fermentationsmuster (Auswirkung einer

Schadsilagezulage hinsichtlich der veränderten Produktion von flüchtigen Fettsäu-

ren) zu finden, wird in Anlehnung an die bereits ausführlichen Diskussionen bei

LUMPP (2011; Einsatz von heterogenen Grassilagen und Heuzulage) und GÖRES

(2016) den Pansenbakterien eine entscheidender Einfluss auf die Produktion der

flüchtigen Fettsäuren zugesprochen.

Im Folgenden wird eine Übersicht einiger Pansenbakterien angeführt, die als wahr-

scheinlichste Verursacher gelten (LUMPP 2011; GÖRES 2016; ILLE 2017) und an-

schließend eine abschließende Einordnung der vorliegenden Ergebnisse (L39-42) im

Gesamtprojekt durchgeführt.

Diskussion

98

5.6.2 Einfluss ausgewählter Pansenbakterien auf den Gehalt an flüchtigen

Fettsäuren

Durch vorangegangene Analysen in den Dissertationen von LUMPP (2011), GÖ-

RES (2016) und ILLE (2017) zu verschiedenen Wirkungen auf den Kohlenhydrat-

stoffwechsel wird ein Einfluss der Schadsilagen auf die Pansenbakterienflora, die

wiederum das Fermentationsmuster der flüchtigen Fettsäuren beeinflussen, als am

wahrscheinlichsten angesehen.

GAST (2010) und COENEN (2017) unterstellten, dass in den Silagen, die als

Schadsilagen gefüttert wurden, bereits eine Apoptose stattgefunden hat. Diese Fa-

sern und auch Proteinfragmente sind zugänglicher für einige Bakterienspezies,

bspw. Prevotella sp., da ein cellulolytischer Vorverdau durch erstbesiedelnde Bakte-

rien nicht mehr erfolgen muss (GAST 2010; ILLE 2017). Diese Bakterien haben ei-

nen selektiven Vorteil, andere Spezies werden in den Hintergrund gedrängt. Mög-

licherweise werden auch Bakterien, die vorher eher eine Nischenfunktion einge-

nommen haben, aktiviert und in ihrem Wachstum gefördert, sodass sich das Fermen-

tationsmuster im Pansen bei unterschiedlicher Grassilagefütterung individuell ändert

(s. L31-34 und L35-38; s. GÖRES 2016). Ausführliche Beschreibungen der einzelnen

Spezies und deren Vorkommen in den RUSITEC-Fermentern können in den oben

genannten Dissertationen nachgelesen werden. Nachfolgend werden die von

LUMPP (2011), GÖRES (2016), ILLE (2017) beschriebenen wichtigsten Bakterien-

spezies, die zur Produktion flüchtiger Fettsäuren beitragen, zusammenfassend auf-

geführt (s. Tab. 5.1).

Diskussion

99

Tab. 5.1: Fähigkeiten ausgewählter Pansenbakterien zur Produktion von flüchtigen Fettsäuren; Übersicht aus LUMPP (2011), GÖRES (2016) und ILLE (2017)

Essigsäure Propionsäure n-Buttersäure n-Valeriansäure Hexansäure Literatur M

eg

as

pae

ra e

lsd

en

ii

Essigsäure-bildner (Stäm-me LC1, AW106, J1 und L8: Laktatfer-mentation)

Im Stoffwechsel von M. elsdenii entsteht Propion-säure über Laktatfermen-tation, Akrylat-weg (Stäm-me LC1, AW106, J1 und L8, nicht aus Glukose)

n-Buttersäure-bildner (aus Laktat: Stamm L8, Hauptmetabolit aus Glukose), jedoch ist prozen-tualer Anteil von M. elsdenii gering

n-Valerian-säurebildner (aus Laktat: Stamm L8)

Hexan-säurebildner (aus Glukose: alle Stämme, aus Laktat: Stamm J1)

SCHEIFINGER u. WOLIN 1973; ALLISON 1978; FORSBERG 1978; MAROUNEK et al. 1989; HINO et al. 1991; LUMPP 2011; WANG et al. 2012; GÖRES 2016

Eu

bac

teri

um

rum

inan

tiu

m

Wichtiger n-Buttersäure-bildner: benötigt Ammoniak und Fettsäuren (n-Valeriansäure) als Wachstums-faktoren

VAN GYLSWYK 1990; SCHWIERTZ et al. 2002; GÖRES 2016

Diskussion

100


Eu

bac

teri

um

lim

os

um

Benötigt Essig-säure zur Bil-dung verzweig-ter FS

Bildet aus Amino-säuren und Es-sigsäure n-Buttersäure

Bildet n-Valerian-säure aus Ami-nosäuren und Essigsäure sowie aus C-1-Kompo-nenten

Bildet Hexan-säure aus Ami-nosäuren und Essigsäure so-wie aus C-1-Kompo-nenten

GENTHNER et al. 1981; SCHWIERTZ et al. 2002; LUMPP 2011

Eu

bac

teri

um

pyru

va

tivo

ran

s

Nutzt Essigsäu-re und Amino-säuren zur Bil-dung von n-Valerian- und Hexansäure

Schnelle Umset-zung von Propi-onsäure (zur Bil-dung von n-Valerian- und Hexansäure)

Bildet aus n-Buttersäure und Aminosäuren n-Valerian- und Hexansäure

Bildet n-Valeriansäure (aus Essig-, Propion- und But-tersäure sowie Aminosäuren)

Bildet Hexan-säure (aus Es-sig-, Propion- und Buttersäure sowie Amino-säuren)

WALLACE et al. 2003; WALLACE et al. 2004; LUMPP 2011

Bu

tyri

vib

rio

fib

ris

olv

en

s

Wichtiger n-Buttersäure-bildner (aus Am-moniak und freien Aminosäuren)

LI et al. 2012; GÖRES 2016

Diskussion

101


Se

len

om

on

as

rum

inan

tiu

m

Propionsäure: Entstehung aus Kohlenhydraten und Laktat über Succinatweg (Decarboxy-lierung)

SCHEIFINGER u. WOLIN 1973; STEWART 1999; PETRI et al. 2012; WANG et al. 2012; GÖRES 2016

Clo

str

idiu

m s

pp

.

Clostridium kluyveri wandelt Ethanol und Propionsäure zu Essigsäure um; Clostridium aminophilum sp. nov.: Endpro-dukt Essigsäure

Clostridium kluyveri bildet vermehrt (zu-sammen mit Fib-robacter succino-genes S85 und Ruminococcus flavefaciens FD-1) n-Buttersäure (aus Ethanol und Essigsäure oder Propionsäure so-wie aus Cellulo-se); Clostridium aminophilum sp. nov.: Endprodukt: n-Buttersäure

Clostridium kluyveri wandelt Ethanol und Propionsäure zu n-Valeriansäure um

Clostridium kluyveri bildet vermehrt (zu-sammen mit Fib-robacter succi-nogenes S85 und Ruminococ-cus flavefaciens FD-1) Hexan-säure (aus Ethanol und Es-sigsäure oder Propionsäure sowie aus Cellu-lose)

BORNSTEIN u. BARKER 1948; PASTER et al. 1993; KENEALY et al. 1995; LUMPP 2011; GÖRES 2016

Diskussion

102


Pre

vo

tella

sp

. Produziert Es-sigsäure

Produziert Propionsäure

Produziert Hex-ansäure

BLADEN et al. 1961a; BLADEN et al. 1961b; STEWART et al. 1997; ILLE 2017

Ru

min

ob

ac

ter

am

ylo

ph

ilu

s

Bildet Essig-säure

Wachstum unter n-Buttersäure-zufuhr

STEWART et al. 1997; LI et al. 2012; ILLE 2017

Diskussion

103

5.6.3 Einordnung der Produktion der flüchtigen Fettsäuren (L39-42) im Ge-

samtprojekt

Aus vorangegangenen RUSITEC-Läufen (L31-38) war ersichtlich, dass die Fütterun-

gen fünf verschiedener Grassilagen das Fermentationsmuster der Mikroorganismen

im Pansen unterschiedlich gerichtet beeinflusst haben (GÖRES 2016; ILLE 2017).

Die Ergebnisse von L31-34 und L35-38 ergaben in der Produktion von Propion- und

n-Buttersäure deutliche Unterschiede (eingesetzte Grassilagen stammten von zwei

unterschiedlichen Betrieben in Norddeutschland). GÖRES (2016) beschreibt eine für

Schadsilagen im Vergleich zu Kontrollsilagen erhöhte Propionsäurebildung zu Lasten

der n-Buttersäurebildung in L31-34, in L35-38 rückte vor allem die n-Buttersäure in

den Vordergrund, zum Nachteil der Propionsäurebildner. Die weiteren Fettsäuren

unterschieden sich in diesen beiden Laufgruppen nicht erheblich voneinander (deut-

licher Anstieg sowohl bei n-Valerian- und Hexansäure, geringfügiger Anstieg der Es-

sigsäure).

Die Ergebnisse der dritten Laufgruppe (L39-42) stehen, nach Analyse dieser Ergeb-

nisse, im Gesamtprojekt mittig zwischen den Ergebnissen der anderen beiden Lauf-

gruppen (L31-34, L39-42, L35-38). Geringfügig tendieren sie zu L31-34. Das vorher

mittels der Futtermittelanalyse ergebene Ranking von S-35, S-31 und S-33 kann hier

nicht bestätigt werden, sodass ein Einfluss der Dauer der Apoptose ausgeschlossen

werden kann.

Auffällig war in L39-42 ein leicht erhöhter Propionsäureanstieg (s. Kap. 4.1.4), vergli-

chen mit der n-Buttersäureproduktion, der jedoch unter der Propionsäureproduktion

von L31-34 lag (s. Kap. 9.11.4). Die n-Buttersäure zeigte einen eher verspäteten Ef-

fekt auf die Futterumstellung, dort stieg die Produktion nicht auffällig an

(s. Kap. 4.1.6). Für die Ergebnisse von L39-42 kann somit eine Bakterienflora zu

Gunsten der Propionsäurebildner vorgelegen haben (nicht so ausgeprägt wie in

L31-34). Unter den hier vorherrschenden Bedingungen kommen hierfür nach

LUMPP (2011), GÖRES (2016) und ILLE (2017) vor allem Selenomonas ruminanti-

um und Prevotella sp. in Frage. Oftmals liegen entweder die Propionatbildner oder

die Butyratbildner vor, das Wachstum des einen geht zu Lasten des anderen

(LI et al. 2012; GÖRES 2016). Prevotella sp. zeigt bspw. ein schwächeres Wachstum

unter Butyratzufuhr (LI et al. 2012; ILLE 2017).

Die Produktion von n-Valerian- und Hexansäure zeigte einen L31-34 entsprechenden

hohen Anstieg, Essigsäure blieb relativ unverändert unter Schadsilagezulage

(s. Kap. 4.1.2). Eine Erklärung für den verhältnismäßig hohen Anstieg ist bisher nicht

möglich (GÖRES 2016), nach Tab. 5.1 kämen jedoch Megasphaera elsdenii und Eu-

bacterium sp. in Frage.

Die tatsächlich vorherrschende Bakterienflora in den Fermentern des RUSI-

TEC-Systems kann zu diesem Zeitpunkt nicht eindeutig genannt werden

(LUMPP 2011; GÖRES 2016; ILLE 2017). Weitere mikrobiologische Analysen (re-

Diskussion

104

al-time PCR) zur Bestimmung des vorliegenden Mikrobioms könnten Aufschlüsse

geben.

5.7 Auswirkungen der Schadsilagen auf das Reaktionsverhalten pheno-

lischer Substanzen

Im Folgenden werden die Ergebnisse der Messungen der phenolischen Substanzen

in der Fermenter- sowie Überstandsflüssigkeit diskutiert. Dabei werden die Fermen-

ter mit dem Pansen und die Überstände, auf Grund der enthaltenen Salzsäure und

dem enzymatischen Verdau, mit weiter kaudalen Verdauungsprozessen (Labmagen)

gleichgesetzt.

5.7.1 Reaktionswege phenolischer Substanzen im Pansen

In Pflanzen liegen die phenolischen Substanzen gebunden an Hemicellulose oder

Lignin bzw. frei in den Vakuolen vor (HARTLEY 1972; BORNEMAN et al. 1986). In

bestimmten Situationen (Stress, Ernte, Fraßfeinde) werden sie zum Schutz der

Pflanze freigesetzt (s. Kap. 2.3). Auf Grund der Apoptose (s. Kap. 5.6.1 und 5.6.2;

GAST 2010; COENEN 2017) sind die normalerweise noch an der Zellwand gebun-

denen Substanzen frei. Diese können mit den, in Schadsilagen vermehrt vorkom-

menden Proteinbruchstücken, Komplexe eingehen (s. Kap. 2.3.3). Über das Raufut-

ter nimmt der Wiederkäuer diese sehr differenziert auf die vorliegende Pansenflora

wirkenden Substanzen auf (AKIN et al. 1988; MUELLER-HARVEY et al. 1988;

USHIDA et al. 1990). Somit könnten die Mikroorganismen im Pansen mit ungewohn-

ten Bedingungen, hervorgerufen durch neu gebildete Komplexe auf Grund der

Apoptose sowie der hemmenden Wirkung phenolischer Substanzen auf Pansenbak-

terien, konfrontiert werden.

USHIDA et al. (1990) sprechen vor allem den phenolischen Substanzen mit unhy-

drierten Propionseitenketten (bspw. p-Cumar-, Ferula- und Zimtsäure) deutlich hem-

mende Effekte, wie die Reduzierung des Hemicelluloseverdaus auf Grund enzymati-

scher und bakterieller Blockaden, zu (weitere Wirkungen phenolischer Substanzen

auf Pansenbakterien s. Tab. 5.2 und GÖRES 2016).

Diskussion

105

Tab. 5.2: Wirkungen phenolischer Substanzen auf Bakerienspezies

Phenolische Substanzen Wirkungen auf Bakterien-

spezies Literatur

p-Cumarsäure Hemmende Wirkung auf Bac-teroides succinogenes, Rum-inococcus flavefaciens und Ruminococcus albus; hoch-gradig hemmende Wirkungen auf cellulolytische und xylano-lytische Bakterien

AKIN 1982; CHESSON et al. 1982; AKIN et al. 1988; USHIDA et al. 1990

Ferulasäure Hemmende Wirkung auf Bac-teroides succinogenes, Rum-inococcus flavefaciens und Ruminococcus albus; nur ge-ringe hemmende Wirkung auf cellulolytische Bakterien, re-duziert Wachstum der xylano-lytische Bakterien

AKIN 1982; CHESSON et al. 1982; USHIDA et al. 1990

Zimtsäure Hemmende Wirkung auf Bac-teroides succinogenes, Ru-minococcus flavefaciens und Ruminococcus albus

CHESSON et al. 1982; AKIN et al. 1988; USHIDA et al. 1990

Sinapinsäure Keine toxische Wirkung AKIN 1982

Vanillinsäure Hemmende Wirkung auf Bac-teroides succinogenes

AKIN et al. 1988

Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass es einen Anteil phenolischer Substanzen

gibt, der im Pansen ungebunden ankommt (Gesamtphenolbestimmung nach

HOLLOWAY et al. 1979, s. Abb. 4.13). Auf Grund der Fähigkeit phenolischer Sub-

stanzen Komplexe mit anderen Stoffen, speziell Proteinen, einzugehen

(s. Kap. 2.3.3), wird vermutet, dass Phenol-Proteinkomplexe im Pansen vorliegen,

sich der dort durchgeführten Messkinetik jedoch entziehen (HOLLOWAY et al. (1979)

sprechen nur von einer Anfärbung freier Substanzen). Einige dieser Phenol-

Proteinkomplexe können enzymatisch im Labmagen gespalten werden, sodass es zu

einem geringfügigen Anstieg des o-Diphenolgehaltes in der Kontrollgruppe im Über-

stand, verglichen mit dem Fermenter, kommt (s. Kap. 4.2.2 und 4.3.2). Hingegen im

Gesamtphenolgehalt kam es mit der hier benutzten Methode zu keinem Anstieg (kei-

ne Erhöhung in der Kontrollgruppe im Überstand verglichen mit dem Fermenter).

Lediglich die in allen Silagen (Kontroll- und Schadsilagen) vorkommenden freien

phenolischen Substanzen wären somit gemessen worden.

Diskussion

106

Die nach alleiniger Schadsilagefütterung im Pansen befindlichen Phenol-Protein-

komplexe können von den Pansenbakterien vermutlich nicht abgebaut werden und

gelangen in den Labmagen.

Im Gegensatz hierzu sind im Pansen nach Schadsilage- und Sojaproteinfütterung

zwei Stoffwechselwege denkbar. Zum einen können hier die neu gebildeten Komple-

xe von den Pansenbakterien durch Hinzugabe des Sojaproteins dennoch erkannt

und abgebaut werden (Komplexe liegen eventuell anders vor). Durch Zugabe des

Sojaproteins kommt es möglicherweise nicht zur Bindung von weiteren phenolischen

Substanzen sondern zu Quervernetzungen und somit zur Verstärkung der Bindung,

zwischen den schon bestehenden Phenol-Proteinkomplexen (s. Abb. 2.1), da es

kaum einen Unterschied im Gehalt an freien phenolischen Substanzen im Fermenter

durch Zulage des Sojaproteins gibt (vgl. mit Kontrollgruppe). Würde Soja weitere

freie phenolische Substanzen binden, hätte es hier einen Unterschied geben müssen

(s. Tab. 4.2, bspw. Gesamtphenolgehalt vgl. zur Kontrolle in TF-35: 7,28 %, in

TF-35mS: 7,97 %).

Auf Grund der Quervernetzungen mit Sojaproteinen könnten Nischenbakterien ange-

sprochen werden, die in der Lage sind, die neuen Komplexe zu spalten und sofort

abzubauen, sodass sie in der Messung nicht auftauchen. Auf Grund der vorhande-

nen Aktivität von Mikroorganismen, vor allem der Ruminococcus sp., könnte es zu

einer Modifizierung der phenolischen Strukturen zu weniger toxischen Formen kom-

men (Variante 1; AKIN et al. 1988).

Zum anderen könnten diese Phenol-Proteinkomplexe aus überwiegend irreversiblen

Bindungen bestehen, sodass die Bakterien nicht in der Lage sind, diese aufzu-

schlüsseln und deshalb gelangen sie unverändert in den Labmagen (Variante 2).

Die Ergebnisse von ÖZMEN (2014), Untersuchungen des flüssigen Fermenterinhal-

tes auf das Vorhandensein von ungebundenen, als Reinsubstanzen vorliegenden,

phenolischen Substanzen, könnten die hier vorgelegten Theorien unterstützen

(s. Kap. 2.2). Da keine Einzelsubstanzen identifiziert werden konnten, (evtl. kaum

freie phenolische Substanzen in den Silagen), wäre es möglich, dass diese gebun-

den vorlagen, im Pansen umgehend bearbeitet wurden und sodass sie entweder in

veränderter Form frei vorlagen oder direkt abgebaut wurden, sich somit der Messung

entzogen. Eine andere Ursache könnte ein nicht durchzuführender Komplexabbau

sein, sodass diese in den Labmagen gelangen.

Diskussion

107

5.7.2 Reaktionswege phenolischer Substanzen im Labmagen

Tab. 5.3: Gesamtphenolgehalt Kontrollgruppe vgl. mit Testgruppen

Gesamtphenolgehalt: Vergleich zur Kontrollsilage

Lauf Schadsilage Schadsilage mit

Sojaprotein

L35-38 mgr. /hgr. Anstieg ggr. Anstieg

L39-42 hgr. Anstieg mgr. Anstieg

Tab. 5.4: o-Diphenolgehalt Kontrollgruppe vgl. mit Testgruppen

o-Diphenolgehalt: Vergleich zur Kontrollsilage

Lauf Schadsilage Schadsilage mit

Sojaprotein

L35-38 mgr. Anstieg ggr. Anstieg

L39-42 mgr. /hgr. Anstieg ggr. Anstieg

Im „Labmagen“ (2. in vitro Entnahmeort) könnten die entstandenen Phenol-

Proteinkomplexe nach ausschließlicher Schadsilagefütterung ankommen. Hier wer-

den diese auf Grund des vorherrschenden niedrigen pH-Wertes und der enzymati-

schen Aktivität von Pepsin freigesetzt (s. Kap. 2.3.6). In Vorversuchen konnte eine

enzymatische Hemmung in den Überstandsflüssigkeiten durch phenolische Substan-

zen ausgeschlossen werden (s. Kap. 5.4). Hieraus resultiert eine erhöhte Anzahl

freier phenolischer Substanzen im Labmagen (s. 4.3.1 und 4.3.2).

Das erhöhte Auftreten dieser Stoffe wirkt sich möglicherweise schädlich auf den Or-

ganismus aus, auf Grund fehlenden oder zeitlich verzögerten Abbaus können sie

eventuell ihre toxische Wirkungsweise (USHIDA et al. 1990) ausüben. Es gab nur

geringfügige Unterschiede nach alleiniger Schadsilagefütterung (in den Überständen)

zwischen L35-38 und L39-42. Beide wiesen deutlich erhöhte Gehalte sowohl gegen-

über der Kontrollgruppe als auch der Schadsilagefütterung mit Sojasupplementation

auf.

Im „Labmagen“ lagen nach Schadsilage- und Sojaproteinfütterung kaum erhöhte

Phenolgehalte vor. Die Werte blieben während der Zulagephase fast auf Kontrollni-

veau. Dem Sojaprotein kann somit eine besondere Wirkung zugesprochen werden.

Entstehen die hier vorliegenden Ergebnisse durch den im Pansen vorgestellten Re-

aktionsmechanismus „Variante 1“, gelangen geringfügig freie phenolische Substan-

zen als Restprodukte des im Pansen stattgefundenen Phenol-Proteinkomplexabbaus

in den Labmagen. Sollten wenige Komplexe in den Labmagen gelangen, könnten

diese dort enzymatisch aufgeschlossen und sofort abgebaut werden, ohne dass sie

ihre toxischen Wirkungen im Verdauungstrakt entfalten konnten.

Die in „Variante 2“ angesprochenen irreversiblen Phenol-Proteinkomplexe, die starke

Quervernetzungen mit Soja aufweisen, könnten unverändert in den „Labmagen“ ge-

langen. Dort werden sie auf Grund ihrer starken Bindungen entweder gar nicht en-

Diskussion

108

zymatisch, oder, bedingt durch die besonderen Eigenschaften der Sojaprotein-

untereinheiten, zeitlich verzögert abgebaut werden (s. Kap. 2.3.6). So werden wei-

terhin Komplexe vorliegen, die sich der Messung entziehen, sodass es keine Verän-

derungen in der Ergebnisanalyse gibt.

Das Besondere am Sojaprotein ist, dass seine Untereinheiten zeitlich verzögert ab-

gebaut werden können (s. Kap. 2.3.6). Eine zweistündige Reaktionszeit wäre ausrei-

chend, um das Sojaprotein enzymatisch zu spalten, jedoch kann es auf Grund seiner

besonderen Bindung zu phenolischen Substanzen zu einem verlängerten oder un-

vollständigen Abbau gekommen sein. Sollten die phenolischen Substanzen vorwie-

gend an den α‘-und β-Untereinheiten des β-Conglycinin gebunden werden, können

enzymatische Aktivitäten ohne Auswirkungen bleiben (CUI et al. 2013). Die noch be-

stehenden Komplexe, bzw. die durch unvollständige enzymatische Aktivitäten noch

bestehenden Teilkomplexe, gelangen in den Dünndarm und werden dort aufge-

schlüsselt oder ausgeschieden.

HUNGER (2014) untersuchte Serumproben auf den Gehalt an Flavonoiden. Sie

konnte bei den untersuchten Gruppen verschieden chronisch kranker Rinder gegen-

über Kontrolltieren keine erhöhten Werte feststellen. Dies spricht zum einen dafür,

dass nicht die Flavonoide die entscheidenden Substanzen im Krankheitsgeschehen

sind, sondern möglicherweise die als sehr reaktiv und toxisch beschriebenen Phe-

nolsäuren p-Cumar-, Ferula-, und Zimtsäure. Die Ergebnisse von HUNGER (2014)

könnten für eine Ausscheidung möglicher Phenol-Proteinkomplexe über Faeces

sprechen.

5.8 Einflüsse phenolischer Substanzen auf das Pansenmikrobiom und

somit auf den Gehalt der flüchtigen Fettsäuren

Durch die Apoptose in Schadsilagen (GAST 2010; COENEN 2017) und dem Einfluss

phenolischer Substanzen kann es zu einem Shift in der Bakterienpoulation (von

„ruminococcus- zu bacteroides-liebenden Morphoptypen“) kommen (MUELLER-

HARVEY et al. 1988; USHIDA et al. 1990).

Außerdem sind toxische Effekte auf Bakterienspezies durch phenolische Substanzen

beschrieben (s. Tab. 5.2; CHESSON et al. 1982).

In Anwesenheit von p-Cumar- und Ferulasäure konnten bakteriozide und bakteriosta-

tische Effekte bei Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens und Bacteroides

succinogenes nachgewiesen werden. Vor allem die p-Cumarsäure wirkt hochgradig

toxisch sowohl auf cellulolytische als auch auf xylanolytische Bakterien (AKIN 1982;

CHESSON et al. 1982; AKIN et al. 1988; USHIDA et al. 1990). Hemicellulolytische

Bakterienspezies hingegen weisen eine höhere Toleranzgrenze gegenüber diesen

Substanzen auf als cellulolytische Bakterien (JUNG 1985).

Diskussion

109

Die Veränderungen in der ruminalen Bakterienflora wirken sich auf die Produktion

der flüchtigen Fettsäuren aus (MUELLER-HARVEY et al. 1988). Bakterien, die ge-

wöhnlich am Abbau pflanzlicher Kohlenhydrate beteiligt sind, können in den Hinter-

grund rücken, bzw. durch toxische Wirkungen gehemmt oder sogar vollständig elimi-

niert werden. Es kann zu Veränderungen im Fermentationsmuster kommen.

GÖRES (2016) beschreibt für die Laufgruppen 31-34 und 35-38 zwei verschiedene

Fermentationsmuster durch Fütterung von zwei Grassilagen, die analytisch kaum

Abweichungen aufweisen (s. Kap. 5.6.3). Dies spricht für ein individuelles Fermenta-

tionsmuster jeder Grassilage, möglicherweise bedingt durch z.B. vorliegende Sum-

menparameter.

Ein hoher Anteil phenolischer Substanzen im Pansen scheint sich laut GÖ-

RES (2016) negativ auf Propionsäurebildner auszuwirken. Die n-Buttersäurebildner

hingegen scheinen eine gewisse Toleranz gegenüber den toxischen Effekten zu be-

sitzen (GÖRES 2016). Jedoch sollte nicht nur von freien phenolischen Substanzen

gesprochen werden, sondern vom generellen Vorkommen dieser Substanzen, da

eine sichere Aussage über das Vorliegen (gebunden oder frei vorkommend) zu die-

sem Zeitpunkt nicht möglich ist. Die von GÖRES (2016) aufgestellte These trifft auch

für die Ergebnisse von L39-42 zu, diese Werte können mittig, mit einer Tendenz zu

L31-34, im Gesamtprojekt eingeordnet werden. Daher liegt kein drittes Fermentati-

onsmuster vor. Die Phenolgehalte sind geringfügig erhöht, jedoch anscheinend nicht

ausreichend, um die Propionsäurebildner zu unterdrücken.

Diese Ergebnisse können, wie bereits bei GÖRES (2016) beschrieben, durch Analy-

sen von THEODOROU et al. (1987) bestätigt werden. Dort kam es zur Steigerung

der n-Buttersäureproduktion durch p-Cumarsäure, welche eine Minderung der Propi-

onsäureproduktion zur Folge hatte.

Ein Einfluss phenolischer Substanzen auf das vorliegende Mikrobiom ist als sehr

wahrscheinlich anzusehen.

Diskussion

110

5.9 Ausblick

Die vorliegenden Ergebnisse weisen einen Einfluss von Grassilagen auf das Fer-

mentationsmuster im Pansen nach. Auch ist ein Zusammenhang der Gehalte an

phenolischen Substanzen und flüchtigen Fettsäuren darstellbar. Für detaillierte Aus-

sagen sind weitere Analysen zum Vorkommen einzelner und gebundener phenoli-

scher Substanzen sowohl in der Fermenterflüssigkeit als auch in der Überstandsflüs-

sigkeit notwendig.

Angeknüpft an die Ergebnisse von WICHERN (2011), HUNGER (2014),

ÖZMEN (2014) und EBHARDT (in Vorbereitung) wurden je eine Überstandsprobe

aus der Kontrollgruppe und der Schadsilagegruppe mittels der LC-MS analysiert. Es

wurden in dieser ersten Analyse keine Unterschiede gefunden. Weitere Untersu-

chungen sind hier notwendig, da für diesen stichprobenartigen Versuch Fehlerquel-

len wie der niedrige pH-Wert, die passende Säule, Einspritzzeiten und Standards,

etc. nicht berücksichtigt werden konnten.

Eine detaillierte Aufschlüsselung des Reaktionsverhaltens phenolischer Substanzen

im Verdauungstrakt ist sinnvoll um weitere Erkenntnisse zur Ursachenfindung des

noch ungeklärten Krankheitsgeschehens auf Milchviehbetrieben in Norddeutschland

zu erlangen und den Einfluss einzelner Substanzen am Geschehen darzulegen, um

zukünftig vorbeugend einwirken zu können.

Zusammenfassung

111

Hunsche, Corinne (2017): In vitro Verdauungsstudien im RUSITEC mit Pansensaft

vom Rind zum Vorkommen von phenolhaltigen Substan-

zen aus Grassilagen sowie deren Bindungsverhalten mit

Eiweißen

6 Zusammenfassung

Hintergrund der hier vorliegenden Arbeit ist ein auf norddeutschen Milchvieh-

betrieben aufgetretenes Krankheitsgeschehen (Rückgang der Futteraufnahme, Ab-

sinken der Milchleistung, Verdauungs- und Reproduktionsstörungen, mangelnde

Klauengesundheit etc.), beschrieben als „Faktorenerkrankung Milchviehherde“.

Die Ursache der unspezifischen Erkrankung wird auf die Verfütterung von Grassila-

gen, die sensorisch eine gute bis sehr gute Qualität aufweisen, jedoch einen zu nied-

rigen Reineiweißanteil (RE) am Rohprotein (RP; < 50 %) enthalten, zurückgeführt. In

diesen, als Schadsilagen deklarierten Futtermitteln, findet die Apoptose statt, d.h.,

der Faseraufschluss ist bereits fortgeschritten und Proteine gelangen als kleinere

Fragmente in den Pansen. Dies kann zu erheblichen Veränderungen im Fermentati-

onsmuster des ruminalen Mikrobioms führen, sodass bestimmte Substanzen mög-

licherweise verändert oder unvollständig abgebaut werden und somit einen Anteil am

Krankheitsgeschehen haben.

Ziel dieser Arbeit war, Auswirkungen der Schadsilagen auf den Gehalt an phenoli-

schen Substanzen (an zwei unterschiedlichen in vitro Entnahmeorten) und flüchtigen

Fettsäuren sowie einen Einfluss einer Aufwertung des Reineiweißgehaltes mittels

Sojaprotein zu analysieren.

Zur Probengewinnung wurde das RUSITEC-System genutzt. Im künstlichen Pansen

wurden im Gesamtprojekt in zwölf Versuchsdurchgängen (Läufe) Grassilagen,

Schadsilagen (< 50 % RE/RP, 1. Schnitt 2014, 1. Schnitt 2015) und Kontrollsilagen

(> 50 % RE/RP, 3. Schnitt 2014), von Flächen von zwei Betrieben, getestet. Die Läu-

fe (L) wurden in drei Gruppen eingeteilt, bezeichnet nach einem fortlaufenden Sys-

tem (L31-34, L35-38, L39-42). Ein Durchgang erstreckte sich über 28 Tage, die sich

in Einlauf- und Kontrollphase (bis Tag 8), Zulagephase (Tag 9-19) sowie Erholungs-

phase (Tag 20-28) unterteilten. Die Kontrollfermenter (KF) wurden kontinuierlich mit

Kontrollsilage und Stärke gefüttert, während der Zulagephase wurden in den Test-

fermentern Schadsilage und Stärke (TF) sowie Schadsilage, Stärke und Sojaprotein

(TF-mS) zugelegt.

Die Produktion der flüchtigen Fettsäuren wurden mittels einem Zweikanalgaschroma-

tographen bestimmt. Zur kolorimetrischen Messung des Gehalts an freien phenoli-

schen Substanzen wurden die Methoden von HOLLOWAY et al. (1979), modifiziert

von GÖRES (2016) zur Messung des Gesamtphenolgehalt, sowie von

Zusammenfassung

112

ARNOW (1937) und FRAISSE et al. (2011), modifiziert von GÖRES (2016) zur Be-

stimmung des o-Diphenolgehalts, genutzt. Die Proben der Überstandsflüssigkeit

(„Labmagen“-Bedingungen) wurden mit Pepsin-HCL-Lösung versetzt.

Die Zulage der Schadsilagen führte in L39-42 zu geringen Veränderungen der Essig-

säureproduktion (TF: +8,31 %, TFmS: +5,61 %), hochgradigem Anstieg der

n-Valeriansäure (TF: +77,8 %, TFmS: +93,3 %) und Hexansäure (TF: +82,8 %,

TfmS: +77,9 %). Diese Ergebnisse entsprachen den vorangegangenen Versuchen

(L31-38, GÖRES 2016).

Die Propionsäureproduktion war mittelgradig erhöht (TF 35: +28,5 %, TF 35mS:

+30,1 %) bei geringgradig erhöhter n Buttersäureproduktion (TF 35: +14,1 %, TF

35mS: +11,9 %) und geringgradig erhöhtem Gesamtphenolgehalt (TF 35: +7,28 %,

TF 35mS: +7,97 %). Bei der Propion- und n-Buttersäureproduktion sowie dem Gehalt

an phenolischen Substanzen im Fermenter kam es im Gesamtprojekt zu einer unter-

schiedlich gerichteten Beeinflussung des Fermentationsmusters. Diese Ergebnisse

von L31-38 (GÖRES 2016) lassen auf das Vorliegen von zwei Fermentationsmustern

schließen, bei dem die Ergebnisse von L39-42 mittig, mit einer Tendenz zu den Er-

gebnissen von L31-34, zwischen L31-38 eingeordnet werden können, ohne dass ein

neues Fermenationsmuster vorliegt. Das Sojaprotein hatte keinen Einfluss auf die

Produktion der flüchtigen Fettsäuren sowie den Gehalt an phenolischen Substanzen

im Fermenter.

Unter „Labmagen“-Bedingungen kam es nach reiner Schadsilagezulage zu einem

massiven Anstieg der phenolischen Substanzen (in L35-42), mit Sojaproteinzulage

hingegen stiegen die Werte kaum.

Die möglicherweise nach reiner Schadsilagefütterung überwiegend in Komplexen

gebundenen phenolischen Substanzen können erst im Labmagen abgebaut werden,

sodass es hier zu einem massiven Anstieg an freien Substanzen kommen könnte.

Mit Sojaproteinzulage können diese Komplexe hingegen entweder im Pansen voll-

ständig eliminiert werden oder überhaupt nicht aufgeschlossen werden, sodass sie

sich der Messung unter labmagenähnlichen Verhältnissen entziehen und ausge-

schieden werden könnten.

Der Anstieg an phenolischen Substanzen im Labmagen ist möglicherweise eine Ur-

sache des Krankheitsgeschehens.

Summary

113

Hunsche, Corinne (2017): In vitro digestibility studie using the RUSITEC with rumen

fluid of a cattle to analyse the content of phenolic sub-

stances in grass silages and their binding with proteins

7 Summary

Background of this thesis is the occurrence of unspecific clinical symptoms (de-

creased milk yield, decreased fertility, digestive disorders) in dairy cattle herds in the

North of Germany, described as “Faktorenerkrankung Milchviehherde” (“factorial dis-

eases in dairy herds”).

The feeding of grass silages without any sensory deficiency, but containing less than

50 % true protein in total crude protein (TP/CP) constitutes a potential cause due to

the apoptosis in these silages. Feeding these silages may lead to a change in the

ruminal microbiome.

The aim of this study was to analyze effects of these silages (< 50 % TP/CP) and soy

protein on phenolic substances (at two places of in vitro digestion) and volatile fatty

acids.

The RUSITEC was used during twelve digestive experiments pooled into three run

blocks (L31-34, L35-38, L39-42) to ferment control silage (> 50 % TP/CP) and starch

(KF), grass silage (< 50 % TP/CP) and starch (TF), and grass silage (< 50 % TP/CP)

and starch and soy protein (TFmS). The 28 days of one digestive experiment were

divided into three stages: The initial and stable phase (eight days, with control silage

being fed), the trial phase (ten days, with control silage and grass silage

< 50 %TP/CP as well as soy protein being fed) and the final stage (ten days, with

control silage being fed).

Production of volatile fatty acids was detected via gas chromatography. The method

of HOLLOWAY et al. (1979) modified by GÖRES (2016) was used to analyze the

total contents of phenolic substances. Contents of o-diphenols were measured using

the methods of ARNOW (1937) and FRAISSE et al. (2011), modified by

GÖRES (2016). Furthermore, pepsin hydrochloric acid solution was added to sam-

ples of the supernatant to simulate conditions of the abomasum.

Feeding grass silage (< 50 % TP/CP) caused a minor increase in production of acetic

acid during L39-42 (TF: +8.31 %, with added soy protein TFmS: +5.61 %, compared

with control) as well as a high increase in productions of n valerate (TF: +77.8 %,

TFmS: +93.3 %) and capronate (TF: +82.8 %, TfmS: +77.9 %). These results corre-

spond to the results of L31-38 (GÖRES 2016).

Summary

114

Production of propionate was moderately increased (TF: +28.5 %, TFmS: +30.1 %)

and production of n butyrate increased slightly (TF: +14.1 %, TFmS: +11.9 %), simi-

lar to the contents of total phenolic substances (TF: +7.28 %, TFmS: +7.97 %).

The results of L31-38 imply the existence of two different patterns of fermentation in

the rumen, whereas results of L39-42 can be positioned centrally in relation to

L31-38, with a tendency to L31-34, while not revealing a new fermentation pattern.

Soy protein did neither affect production of volatile fatty acids nor content of phenolic

substances.

The content of total phenolic substances and o-diphenolics in the supernatant

(L35-42) increased considerably when only grass silage (< 50 % TP/CP) and starch

were fed. When soy protein was added, there were no distinct effects on the contents

of phenolic substances.

Feeding grass silage (< 50 % TP/CP) with possibly phenolic substances to be bound

in complexes, leading to them being undegradable in the rumen but not in the abo-

masum. This can account for the higher measured contents of phenolic substances

in the supernatant.

In contrast to this, added soy protein potentially caused these phenolic complexes to

be either completely degradable in the rumen or not degradable at all, thus evading

measurement under abomasum-like conditions, and being excreted.

The increase of phenolic substances in the abomasum could be a cause for the un-

specific clinical symptoms in dairy cattle herds.

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115

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Fermentation im Pansensaft vom Rind.


Anhang

135

9 Anhang

9.1 Bisherige Dissertationen aus dem Pansenlabor

Tab. 9.1: Literaturschwerpunkte und Autoren aus dem Pansenlabor der Klinik für Rinder, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Literaturschwerpunkt Autor/Jahr

Kohlenhydratstoffwechsel Zelluloseabbau Enzyme des Kohlenhydratstoffwechsels

ZIPORI 1989, DIRKSEN 1990, KRAKOW 1992, ODENKIRCHEN 1992,

Stickstoffstoffwechsel HÖLTERSHINKEN 1990

Der Pansen als Ökosystem SCHIRMER 1990

Purinstoffwechsel FELDMANN 1992

Antibiotikawirkungen auf Pansenfermentations-vorgänge

KRAMER 1993

Fremdbakterien im Pansen Bedeutung der Pansenbakterien Interaktionen zwischen Pansenbakterien

RAAZ 1993 MAURUSCHAT 1996 FRANK 1998

Wirkungen von Pansenstimulantien auf die Pansenfermentation

BECKER 1994

Mykotoxinwirkungen auf die Pansenfermentation MAIWORM 1994

Einfluss von Saccharomyces cerevisae auf die Pansenfermentation

DE FIGUEIREDO 1994

Thiaminstoffwechsel PLITT 1995, WITTE 1998

Aminosäurestoffwechsel BRÖCKER 1996

Kompartimentsysteme des Pansens ELIAS 1999

Einfluss von Schwefel auf die Fermentationsvor-gänge des Pansens

MITTROWANN 1999

Chronische Pansenazidose, Amylase RATHJENS 1999

Bedeutung der Pansenprotozoen HÖHLING 2000

Der ruminale intermediäre Wasserstoff TIADEN 2000

Vitaminstoffwechsel im Pansen WENDELKEN 2000

Lipidstoffwechsel mittel- und langkettiger Fettsäu-ren

JASPER 2000

Vergleich aller weltweit durchgeführten RUSITEC-Versuche

HÜBNER 2001

Wachstumsstoffe für Pansenbakterien JANSON 2000

Bedeutung der Pansenpilze WULFF 2001

Bedeutung der Rohfaser im Pansen KRAUSE 2002

Sauerstoff im Pansen MÜLLER-ÖZKAN 2002

Energiegebundene Reaktionen im Pansenstoff-wechsel

CHAWANIT 2003

Anhang

136


Rohprotein- u. Reineiweißgehalte in Grassilagen GAST 2010

Wachstumshemmende Stoffe für Pansenbakte-rien

LUMPP 2011

Proteinstoffwechsel im Pansen GRESNER 2011, GRESNER et al. 2014, 2015

GABA THEERMANN 2011

Auswirkungen von Futterentzug auf die Pansen-fermentation

WICHERN 2011

Symbiose von Protozoen u. Bakterien; Fremdbak-terien im Pansen

IRLE 2011

Abwehrstoffe von Pflanzen ÖZMEN 2014 (Dr. rer. nat. Univ. Hannover)

Ab- u. Umbau von Flavonoiden im Pansen HUNGER 2014

Eigenschaften von Proteinen in Soja, Gras und Raps

GÖRES 2016

Pansenbakterien im Eiweißstoffwechsel; Polypep-tidabbau und zugehörige Enzyme; Bacteriocine

ILLE 2017

Aminstoffwechsel in Futterpflanzen, An- und Um-bau von Aminen im Pansen

THOMSEN (in Vorbereitung)

Abbau und Toxizität von Schadsubstanzen im Pansen

EBHARDT (in Vorbereitung)

Vorkommen und Wirkungen von nichtproteinoge-nen Aminosäuren

SCHULTE (in Vorbereitung)

Zeolithwirkungen bei Nutztieren KALLMEYER (in Vorberei-tung)

9.2 Probenentnahme und Parameterverteilung

Diese Arbeit ist im Rahmen eines Gesamtprojekts entstanden, dass neben den hier

bearbeiteten Parametern von L35-42 auch L31-34 mit einbezieht. Die Tabelle 9.2

gibt eine Übersicht der im Rahmen der RUSITEC-Durchläufe gemessenen Parame-

ter.

Anhang

137

Tab. 9.2: Übersicht Probenentnahme während einer Versuchsphase

Parameter

pH NH3 FlFS-Ferm.

FlFS-Überst.

Gase Bakt. Pro-tein

Poly-ami-ne

Über-stän-

de

En-zym-akt.

Phe-nole (Fer-men-ter)

o-Di-phenole

(Fer-menter)

Phe-nole

(Über-stand)

o-Di-phe-nole

(Über-stand)

Pro-to-zo-en

Phe-nol-ami-ne Tag

1 Einlauf x x x x x x x x x






7 Kontrolle x x x x x x x x x x x x x x x

8 Kontrolle x x x x x x x x x x x x x x x

9 Zulage x x x x x x x x x x x x x x x

10 Zulage x x x x x x x x x x x x x x x 11 Zulage x x x x x x x x x x x x x x 12 Zulage x x x x x x x x x x x x x x x 13 Zulage x x x x x x x x x x x x x x 14 Zulage x x x x x x x x x x x x x x x 15 Zulage x x x x x x x x x x x x x x 16 Zulage x x x x x x x x x x x x x x x 17 Zulage x x x x x x x x x x x x x x 18 Zulage x x x x x x x x x x x x x x x 19 Auslauf x x x x x x x x x x x x x x 20 Auslauf x x x x x x x x x x x x x x x 21 Auslauf x x x x x x x x x x x x x x 22 Auslauf x x x x x x x x x x x x x x x 23 Auslauf x x x x x x x x x x x x x x 24 Auslauf x x x x x x x x x x x x x x x 25 Auslauf x x x x x x x x x x x x x x 26 Auslauf x x x x x x x x x x x x x x x 27 Auslauf x x x x x x x x x x x x x x 28 Auslauf x x x x x x x x x x x x x x x

Anhang

138

9.3 Parameterverteilung

Diese Parameter wurden in dieser Arbeit (Hunsche: HU) und in den Dissertationen von GÖRES (GÖ), ILLE (IL),

THOMSEN (TH), EBHARDT (EB), SCHULTE (SC) bearbeitet. Die Aufteilung ist der Tabelle zu entnehmen.

Tab. 9.3: Parameterverteilung der Läufe 31-42

Parameter

pH NH

3 FlFS-Ferm.

FlFS-Überst.

Gase

Bakt. Pro-tein

Poly-ami-ne

Über-stän-

de

En-zym-akt.

Phe-nole (Fer-

menter)

o-Di-phenole

(Fer-menter)

Phe-nole

(Über-stand)

o-Di-phe-nole

(Über-stand)

Pro-to-zo-en

Phe-nol-ami-ne Tag

Lauf 31-34 IL TH GÖ/TH GÖ/TH GÖ IL TH TH IL GÖ GÖ - - - -

Lauf 35-38 IL TH GÖ/TH GÖ/TH GÖ IL TH TH IL GÖ GÖ HU HU SC EB

Lauf 39-42 EB SC HU/SC*

HU/SC*

EB SC - EB - HU HU HU HU SC EB

SC*: Analyse der i-Säuren

Anhang

139

9.4 Einfluss von Pepsin auf den Gehalt an phenolischen Substanzen:

Messung ohne und mit Pepsinverdau

Tab. 9.4: Gesamptphenolkonzentration in der Überstandsflüssigkeit (Ü), ohne Pepsin

Gesamtphenolkonzentration L39 [mmol/l]

Ü1 Ü2 Ü3 Ü4 Ü5 Ü6

Tag 9 0,57 0,51 0,53 0,58 0,56 0,60

Tag 10 0,67 0,52 0,61 0,60 0,49 0,49

Tag 11 0,55 0,56 0,58 0,55 0,49 0,53

Tag 12 0,42 0,52 0,51 0,61 0,65 0,52

Tag 13 0,43 0,47 0,55 0,53 0,55 0,57

Tag 14 0,52 0,52 0,60 0,52 0,66 0,61

Tag 15 0,54 0,72 0,54 0,55 0,54 0,55

Tag 16 0,74 0,52 0,63 0,58 0,52 0,58

Tag 17 0,46 0,46 0,55 0,62 0,53 0,59

Tag 18 0,51 0,56 0,59 0,55 0,62 0,59

Tag 19 0,63 0,58 0,60 0,60 0,63 0,63

Abb. 9.1: Mittlere Gesamtphenolkonzentration [mmol/l] in der Überstandsflüssig-keit

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

[mm

ol/

l]

Tag

L 39 Phenole

F1 + F2

F3 + F4

F5 + F6

Anhang

140

Tab. 9.5: Gesamtphenolkonzentration in der Überstandsflüssigkeit, mit Pepsin

Gesamtphenolkonzentration L39 [mmol/l]

Ü1 Ü2 Ü3 Ü4 Ü5 Ü6

Tag 9 1,48 1,48 1,58 1,61 1,44 1,72

Tag 10 1,35 1,12 1,83 1,90 1,48 1,48

Tag 11 1,28 1,23 1,67 1,85 1,30 1,57

Tag 12 1,28 0,97 1,61 1,91 1,43 1,67

Tag 13 1,30 1,01 1,44 1,94 1,46 1,69

Tag 14 1,30 1,06 1,57 1,81 1,40 1,52

Tag 15 1,32 1,06 1,72 1,80 1,48 1,35

Tag 16 1,29 1,23 1,85 1,95 1,46 1,51

Tag 17 1,31 1,27 1,98 1,87 1,80 1,52

Tag 18 1,36 1,36 1,81 1,61 1,71 1,50

Tag 19 1,51 1,17 1,85 1,73 1,65 1,53

Abb. 9.2: Mittleree Gesamtphenolkonzentration [mmol/l] in der Überstandsflüs-sigkeit, mit Pepsin

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

[mm

ol/

l]

Tag

L39 Phenole

F1 + F2

F3 + F4

F5 + F6

Anhang

141

Tab. 9.6: o-Diphenolgehalt in der Überstandsflüssigkeit, ohne Pepsin

o-Diphenolgehalt L39 [mg/ml]

Ü1 Ü2 Ü3 Ü4 Ü5 Ü6

Tag 9 4,69 4,63 4,21 4,18 3,97 4,50

Tag 10 3,57 4,35 4,32 3,97 4,78 4,29

Tag 11 4,42 4,76 4,19 4,52 4,19 4,17

Tag 12 3,88 6,03 3,48 3,84 4,15 3,95

Tag 13 4,12 4,23 4,47 4,29 4,64 4,52

Tag 14 4,83 4,19 5,50 4,13 5,59 4,59

Tag 15 4,36 4,28 4,56 4,69 5,01 4,80

Tag 16 4,87 4,91 4,49 4,30 5,16 4,09

Tag 17 4,82 4,89 4,91 4,94 4,98 4,83

Tag 18 5,07 4,77 4,71 4,69 4,57 5,00

Tag 19 5,61 5,34 5,80 5,22 4,87 5,26

Abb. 9.3: Mittlerer o-Diphenolgehalt [mg/ml] in der Überstandsflüssigkeit

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

[mg/

ml]

Tag

o-Diphenole L39

F1 + F2

F3 + F4

F5 + F6

Anhang

142

Tab. 9.7: o-Diphenolgehalt in der Überstandsflüssigkeit, mit Pepsin

o-Diphenolgehalt L39 [mg/ml]

Ü1 Ü2 Ü3 Ü4 Ü5 Ü6

Tag 9 5,41 5,55 6,52 6,17 5,57 6,00

Tag 10 6,60 6,97 8,29 7,30 6,80 6,77

Tag 11 5,94 5,18 7,97 7,83 6,89 6,62

Tag 12 5,39 5,67 7,73 7,42 6,80 6,68

Tag 13 4,93 6,77 7,62 7,17 6,79 6,47

Tag 14 5,22 6,12 8,32 7,19 6,68 5,56

Tag 15 5,24 5,87 8,31 7,09 6,87 5,34

Tag 16 5,12 5,87 7,13 8,25 6,11 5,74

Tag 17 5,52 5,61 8,45 7,01 5,68 5,97

Tag 18 5,44 6,07 7,22 8,27 6,59 6,05

Tag 19 5,72 6,12 8,46 7,48 6,42 6,42

Abb. 9.4: Mittlerer o-Diphenolgehalt [mg/ml] in der Überstandsflüssigkeit, mit Pepsin

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

[g/l

]

Tag

o-Diphenole L39

F1 + F2

F3 + F4

F5 + F6

Anhang

143

9.5 Pepsininkubation zu zwei verschiedenen Zeitpunkten

Abb. 9.5: Konzentrationsreihe Gesamtphenolstandard (4-Hydroxyphenylessig-säure), Inkubation Gesamtphenolstandard mit Pepsin-HCl-Lösung für 20 Minuten ( ) und 2 Stunden ( )

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25

Ko

nzen

trati

on

[m

mo

l/l]

Extinktion

20 MinutenInkubation

2 StundenInkubation

Anhang

144

9.6 Kalibrationsgerade zur Ermittlung des Gesamtphenolgehalts in der

Überstandsflüssigkeit

Abb. 9.6: Kalibrationskurve der Referenzsubstanz 4-Hydroxyphenylessigsäure (Fünffachmessung) zur Ermittlung der Gesamtphenolgehalte

9.7 Methodenüberprüfung: 4-Hydroxyphenylessigsäure

Tab. 9.8: 6-fache Messung Gesamtphenolkonzentration [mmol/l] bei steigender Einwaage von 4-Hydroxyphenylessigsäure

Einwaage Gesamtphenolkonzentration [mmol/l]

0 mg/ml 0,81 0,82 0,81 0,78 0,83 0,82

1 mg/ml 1,74 1,78 1,75 1,74 1,77 1,76

10 mg/ml 7,47 7,47 7,47 7,48 7,47 7,47

y = 0,3892x + 0,0615 R² = 0,9981

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00

Exti

nkti

on

Konzentration [mmol/l]

Anhang

145

9.8 Kalibrationsgerade zur Ermittlung der o-Diphenolgehalt in der Über-

standsflüssigkeit

Abb. 9.7: Kalibrationskurve der Referenzsubstanz Chlorogensäure (Fünffach-messung) zur Ermittlung der o-Diphenolgehalte

9.9 Methodenüberprüfung: Chlorogensäure

Tab. 9.9: 6-fache Messung o-Diphenolgehalt [mg/ml] bei steigender Einwaage von Chlorogensäure

Einwaage o-Diphenolgehalt [mg/ml]

0 mg/ml 5,31 5,11 5,02 5,03 5,31 5,20

1 mg/ml 6,28 6,06 6,11 6,00 6,20 6,03

10 mg/ml 7,94 7,24 7,26 7,23 7,58 7,51

y = 0,0821x + 0,1487 R² = 0,9932

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Exti

nkti

on

Konzentration [mg/ml]

Anhang

146

9.10 Ergebnisse

9.10.1 Statistische Daten

Die Mittelwerte (x̅), Standartabweichungen (s) und Signifikanzen der Differenzen

(p-Werte) der in dieser Arbeit gemessenen Parameter von L35-42 werden in den fol-

genden Tabellen dargestellt.

Folgende Abkürzungen werden zusätzlich in den Tabellen benutzt:

n Anzahl eingerechneter Mittelwerte KF-32 Kontrollfermenter Lauf 35-42 (Fermenter 1+2) TF-33 Testfermenter Lauf 35-38 (Fermenter 3+4) TF-33mS Testfermenter mit Sojazulage L35-38 (Fermenter 5+6) TF35 Testfermenter Lauf 39-42 (Fermenter 3+4) TF-35mS Testfermenter mit Sojazulage L39-42 (Fermenter 5+6) KF-32/TF-33 Differenzsignifikanz zwischen KF-32 und TF-33 KF-32/TF-33mS Differenzsignifikanz zwischen KF-32 und TF-33mS TF-33/TF-33mS Differenzsignifikanz zwischen TF-33 und TF-33mS KF-32/TF-35 Differenzsignifikanz zwischen KF-32 und TF-35 KF-32/TF-35mS Differenzsignifikanz zwischen KF-32 und TF-35mS TF-35/TF-35mS Differenzsignifikanz zwischen TF-35 und TF-35mS

Die Tabellen werden hier entsprechend der in Kapitel 4 dargestellten Reihenfolge der

Ergebnisse aufgeführt.

Anhang

147

Tab. 9.10: Essigsäurekonzentration [mmol/l] während L39-42

Tag

KF-32 TF-35 TF-35mS p-Werte

n x̅ s n x̅ s n x̅ s KF-32/ TF-35

KF-32/ TF-

35mS

TF-35/ TF-

35mS

1 8 56,5 8,82 8 55,8 6,89 8 55,6 7,57 0,612 0,620 0,843 2 8 56,7 3,39 8 55,1 2,97 8 58,4 4,57 0,300 0,198 0,048 3 8 60,6 3,91 8 59,4 3,91 8 56,5 5,97 0,405 0,086 0,110 4 8 56,2 3,41 8 59,7 5,60 8 56,3 6,13 0,050 0,908 0,019 5 8 56,3 5,94 8 54,7 8,70 8 51,6 7,26 0,581 0,012 0,257 6 8 54,9 5,98 7 56,0 5,95 8 53,9 6,47 0,830 0,404 0,117 7 8 51,4 6,60 8 50,0 6,24 8 52,6 5,19 0,495 0,313 0,259 8 8 50,1 6,65 8 50,4 5,47 8 49,4 5,42 0,845 0,708 0,293 9 8 49,3 6,91 8 51,1 6,04 8 49,4 3,73 0,246 0,905 0,260 10 8 49,7 4,59 8 49,7 4,91 8 50,4 4,67 0,993 0,750 0,816 11 8 46,8 3,13 8 49,6 5,78 8 47,8 4,97 0,221 0,501 0,493 12 8 49,0 4,07 8 49,0 4,35 8 48,8 3,34 0,998 0,885 0,830 13 8 49,8 1,86 8 48,7 2,73 8 44,6 3,12 0,191 0,003 0,012 14 8 49,1 2,96 8 48,7 5,45 8 45,7 1,56 0,837 0,002 0,134 15 8 46,6 5,31 8 48,3 1,98 7 47,3 5,48 0,463 0,713 0,779 16 7 46,8 4,88 8 44,7 3,59 8 46,1 3,94 0,483 0,751 0,105 17 8 44,9 4,83 8 44,7 4,11 8 47,1 5,31 0,862 0,503 0,396 18 8 43,6 4,32 8 45,3 4,14 8 48,0 2,72 0,296 0,021 0,180 19 8 46,9 2,37 8 45,2 2,78 8 46,9 2,89 0,309 0,999 0,350 20 8 46,4 2,40 8 44,7 2,86 8 44,7 1,38 0,248 0,211 0,954 21 8 45,0 2,16 8 46,2 4,18 8 46,8 3,28 0,569 0,241 0,673 22 8 45,7 1,95 8 44,9 3,30 8 46,4 2,75 0,318 0,658 0,348 23 8 46,9 3,09 8 45,6 3,52 8 46,6 2,44 0,436 0,846 0,438 24 8 45,9 3,60 8 44,7 3,27 8 46,6 1,82 0,472 0,645 0,246 25 8 44,2 3,34 8 42,6 3,72 8 43,9 2,51 0,474 0,855 0,419 26 8 45,4 3,37 8 45,7 4,53 8 47,0 1,87 0,847 0,147 0,369 27 8 44,3 4,19 8 43,7 3,31 8 44,9 4,29 0,687 0,741 0,523 28 8 45,1 3,79 8 48,3 5,19 8 47,4 2,84 0,156 0,167 0,700

Anhang

148

Tab. 9.11: Essigsäureproduktion [mmol/24h] während L39-42

Tag


n x̅ s n x̅ s n x̅ s KF-32/ TF-35

KF-32/ TF-

35mS

TF-35/ TF-

35mS

1 8 22,3 1,57 8 22,0 1,45 8 22,0 1,63 0,503 0,656 0,908 2 8 19,6 1,94 8 19,5 0,96 8 19,4 0,92 0,935 0,751 0,710 3 8 20,9 1,60 8 21,3 1,45 8 20,7 1,44 0,533 0,831 0,300 4 8 21,7 1,42 8 21,6 1,86 8 21,5 1,12 0,828 0,643 0,843 5 6 20,4 2,14 6 20,6 1,90 6 20,2 1,26 0,602 0,772 0,415 6 8 20,9 1,61 8 21,2 2,16 8 19,9 0,97 0,607 0,018 0,040 7 8 19,8 2,28 8 20,0 1,53 8 20,0 1,36 0,720 0,708 0,980 8 8 20,7 2,15 8 20,0 2,24 8 19,9 1,80 0,206 0,106 0,790 9 8 19,5 2,09 8 19,7 2,16 8 19,6 2,01 0,381 0,759 0,848

10 8 18,2 1,30 8 19,9 1,47 8 19,5 1,30 0,001 0,001 0,423 11 8 18,2 0,96 8 21,0 0,95 8 19,9 0,55 0,000 0,001 0,015 12 8 17,9 1,28 8 20,0 1,34 8 19,6 1,54 0,005 0,025 0,540 13 8 17,8 1,42 8 19,8 1,75 8 18,9 1,31 0,004 0,073 0,141 14 8 19,4 1,17 8 20,8 1,52 8 20,2 1,78 0,007 0,111 0,104 15 8 18,9 1,09 8 20,5 0,82 8 19,1 0,77 0,001 0,727 0,004 16 8 17,9 1,01 8 20,0 0,84 8 19,8 2,12 0,000 0,069 0,665 17 8 20,2 1,10 8 20,4 0,92 8 20,3 1,93 0,733 0,908 0,871 18 8 18,1 1,41 8 19,4 0,7 8 19,6 1,24 0,114 0,064 0,612 19 8 18,2 1,04 8 19,0 1,06 8 19,0 1,48 0,151 0,294 0,954 20 8 19,3 1,39 8 19,0 1,49 8 18,8 0,61 0,653 0,325 0,755 21 8 18,9 0,49 8 18,9 0,96 8 18,5 0,47 0,961 0,125 0,268 22 8 19,0 0,65 8 18,4 0,92 8 18,8 0,97 0,099 0,743 0,389 23 8 19,0 1,17 8 19,7 1,04 8 18,7 0,59 0,241 0,528 0,032 24 8 18,4 1,31 8 19,2 0,81 8 18,2 0,49 0,174 0,707 0,004 25 8 17,8 0,62 8 18,5 1,41 8 18,1 1,22 0,225 0,631 0,660 26 8 18,6 0,54 8 18,3 1,17 8 18,3 0,91 0,548 0,533 0,958 27 8 18,6 1,35 8 18,0 1,10 8 18,4 1,00 0,122 0,574 0,141 28 8 18,1 1,44 8 17,7 1,29 8 18,4 1,54 0,568 0,489 0,247

Anhang

149

Tab. 9.12: Propionsäurekonzentration [mmol/l] während L39-42

Tag


n x̅ s n x̅ s n x̅ s KF-32/ TF-35

KF-32/ TF-

35mS

TF-35/ TF-

35mS

1 7 18,4 2,05 7 19,2 0,9 7 18,9 1,88 0,185 0,199 0,540 2 8 19,1 1,16 8 18,7 0,64 8 19,0 1,05 0,457 0,705 0,485 3 8 18,4 1,32 8 18,5 0,8 8 17,9 0,91 0,916 0,215 0,099 4 8 16,9 1,40 8 17,8 1,22 8 16,9 1,13 0,099 0,896 0,001 5 8 16,5 1,87 8 16,3 2,68 8 15,1 1,66 0,873 0,002 0,201 6 8 16,3 1,25 8 16,1 1,66 8 15,9 1,27 0,579 0,247 0,431 7 8 16,4 2,15 8 15,7 1,66 8 15,6 1,34 0,118 0,126 0,767 8 8 15,4 2,07 8 15,6 1,42 8 15,8 1,53 0,725 0,316 0,672 9 8 16,0 2,17 8 15,6 1,92 8 16,1 1,28 0,362 0,921 0,307

10 8 16,1 1,73 8 18,5 2,19 8 18,4 1,90 0,000 0,012 0,951 11 8 15,5 1,44 8 20,0 1,94 8 18,8 2,00 0,003 0,005 0,203 12 8 16,3 0,95 8 19,8 1,88 8 20,6 1,32 0,001 0,000 0,285 13 8 16,7 0,83 8 19,8 1,34 8 19,1 1,13 0,000 0,000 0,222 14 8 16,4 1,35 8 19,6 1,66 8 19,3 1,16 0,004 0,005 0,646 15 8 16,1 1,45 8 20,1 1,32 8 18,9 2,01 0,001 0,012 0,269 16 8 15,6 1,79 8 18,2 1,60 8 19,4 1,97 0,000 0,001 0,098 17 8 15,9 1,43 8 18,4 1,74 8 20,0 1,83 0,002 0,002 0,070 18 8 15,8 2,04 8 18,4 1,24 8 20,0 1,05 0,001 0,001 0,021 19 8 16,4 1,52 8 18,7 0,77 8 19,8 0,93 0,008 0,001 0,089 20 8 16,8 1,34 8 17,2 0,93 8 18,0 0,88 0,492 0,104 0,124 21 8 16,2 1,23 8 16,7 0,77 8 17,7 1,06 0,385 0,052 0,075 22 8 15,9 1,23 8 16,2 1,11 8 17,1 1,01 0,535 0,024 0,058 23 8 16,0 0,77 8 16,3 1,32 8 17,0 0,91 0,475 0,013 0,175 24 8 16,0 1,17 8 16,0 1,49 8 16,7 1,20 0,969 0,297 0,377 25 8 15,9 0,98 8 15,5 1,74 8 16,1 1,48 0,657 0,751 0,443 26 8 16,6 0,68 8 16,5 1,52 8 16,9 0,71 0,871 0,400 0,551 27 8 15,9 0,67 8 16,4 1,04 8 16,5 0,95 0,339 0,259 0,859 28 8 16,1 0,85 8 17,8 1,39 8 17,1 1,26 0,015 0,124 0,370

Anhang

150

Tab. 9.13: Propionsäureproduktion [mmol/24h] während L39-42

Tag


n x̅ s n x̅ s n x̅ s KF-32/ TF-35

KF-32/ TF-

35mS

TF-35/ TF-

35mS

1 8 7,34 0,56 8 7,34 0,38 8 7,34 0,43 0,976 0,995 0,960 2 8 6,41 0,50 8 6,49 0,39 8 6,39 0,30 0,756 0,951 0,475 3 8 6,41 0,49 8 6,56 0,46 8 6,30 0,38 0,401 0,622 0,105 4 8 6,18 0,53 8 6,15 0,63 8 6,09 0,38 0,860 0,396 0,644 5 6 5,86 0,76 6 5,83 0,61 6 5,64 0,30 0,900 0,348 0,272 6 8 5,85 0,60 8 5,83 0,48 8 5,52 0,30 0,909 0,026 0,036 7 8 5,58 0,80 8 5,61 0,52 8 5,56 0,45 0,814 0,919 0,740 8 8 6,09 0,88 8 5,77 0,81 8 5,72 0,55 0,113 0,073 0,757 9 8 6,03 0,81 8 5,87 0,80 8 5,95 0,56 0,080 0,547 0,532

10 8 5,76 0,61 8 6,69 0,66 8 6,63 0,41 0,000 0,000 0,726 11 8 5,85 0,60 8 7,96 0,59 8 7,54 0,22 0,000 0,000 0,126 12 7 5,70 0,75 7 7,67 0,65 8 7,93 0,82 0,004 0,003 0,716 13 8 5,68 0,63 8 7,79 0,47 8 7,65 0,59 0,000 0,000 0,648 14 8 6,23 0,56 8 8,13 0,30 8 7,95 1,08 0,000 0,004 0,636 15 8 6,06 0,61 8 7,94 0,39 8 7,72 0,57 0,000 0,002 0,449 16 8 5,76 0,67 8 7,57 0,68 8 7,88 0,96 0,000 0,001 0,405 17 8 6,61 0,91 8 7,76 0,46 8 8,29 0,84 0,001 0,000 0,041 18 8 6,21 0,93 8 7,54 0,51 8 7,92 0,50 0,006 0,000 0,147 19 8 6,14 0,76 8 7,35 0,30 8 7,71 0,56 0,002 0,001 0,175 20 8 6,54 0,84 8 7,00 0,40 8 7,29 0,46 0,210 0,024 0,152 21 8 6,34 0,39 8 6,58 0,32 8 6,82 0,28 0,281 0,014 0,210 22 8 6,20 0,47 8 6,22 0,22 8 6,57 0,41 0,845 0,030 0,013 23 8 6,10 0,37 8 6,41 0,40 8 6,43 0,41 0,047 0,073 0,911 24 8 5,94 0,44 8 6,40 0,49 8 6,24 0,39 0,055 0,107 0,424 25 8 5,88 0,25 8 6,25 0,52 8 6,23 0,53 0,078 0,139 0,970 26 8 6,12 0,20 8 6,29 0,34 8 6,32 0,44 0,323 0,413 0,911 27 8 6,08 0,53 8 6,24 0,51 8 6,36 0,32 0,487 0,083 0,458 28 8 5,91 0,46 8 6,15 0,57 8 6,33 0,51 0,359 0,145 0,384

Anhang

151

Tab. 9.14: n-Buttersäurekonzentration [mmol/l] während L39-42

Tag


n x̅ s n x̅ s n x̅ s KF-32/ TF-35

KF-32/ TF-

35mS

TF-35/ TF-

35mS

1 8 14,0 2,32 8 13,4 1,44 8 13,6 1,72 0,126 0,310 0,471 2 8 16,6 1,34 8 15,4 1,81 8 16,6 2,35 0,135 0,943 0,083 3 8 19,9 1,31 8 19,7 1,72 8 20,2 1,53 0,797 0,610 0,426 4 8 21,8 1,42 8 22,0 2,08 8 21,5 2,25 0,705 0,679 0,368 5 8 22,8 2,17 8 21,5 2,84 8 20,6 2,76 0,183 0,013 0,401 6 8 23,3 0,91 8 22,4 2,33 8 22,2 1,88 0,211 0,096 0,840 7 8 23,0 2,61 8 23,0 1,74 8 22,6 1,97 0,985 0,657 0,540 8 8 22,7 1,15 8 22,7 1,59 8 23,0 1,12 0,979 0,691 0,664 9 8 21,9 1,92 8 22,5 1,42 8 22,8 1,31 0,341 0,414 0,756 10 8 22,1 1,38 8 21,9 1,84 8 22,2 1,24 0,806 0,781 0,758 11 8 20,7 1,69 8 22,8 3,25 8 22,3 1,50 0,188 0,066 0,704 12 8 22,1 2,29 8 23,7 1,81 8 21,7 1,63 0,033 0,773 0,063 13 8 21,7 1,67 8 22,9 1,53 8 22,0 2,04 0,265 0,831 0,350 14 8 21,7 1,95 8 22,4 0,95 8 22,9 1,79 0,378 0,309 0,566 15 8 22,0 1,78 7 23,9 1,98 8 23,2 2,09 0,061 0,261 0,404 16 8 21,6 1,73 8 23,0 2,29 8 23,0 2,03 0,168 0,022 0,954 17 8 21,3 0,87 8 23,7 2,14 8 23,5 2,13 0,012 0,044 0,855 18 8 19,8 1,44 8 24,0 3,71 8 24,4 2,00 0,014 0,000 0,740 19 8 20,3 0,99 7 25,2 2,12 8 23,6 1,82 0,004 0,002 0,078 20 8 19,7 1,62 8 22,1 1,54 8 22,8 1,19 0,047 0,002 0,486 21 8 19,2 2,00 8 22,1 1,11 8 21,6 1,30 0,013 0,022 0,419 22 8 18,8 2,58 8 20,7 1,56 8 21,8 1,66 0,021 0,004 0,191 23 8 19,3 3,16 8 20,5 1,99 8 20,7 1,37 0,182 0,096 0,602 24 8 19,0 2,18 8 19,5 1,99 8 19,7 1,70 0,423 0,214 0,732 25 8 18,0 2,63 8 17,8 1,48 8 19,3 2,38 0,886 0,210 0,094 26 8 18,5 1,54 8 18,9 1,18 8 19,9 1,17 0,542 0,011 0,054 27 8 19,2 1,18 8 18,9 0,94 8 19,6 1,33 0,458 0,455 0,243 28 8 20,2 1,89 8 21,0 1,31 8 20,9 1,32 0,210 0,500 0,887

Anhang

152

Tab. 9.15: n-Buttersäureproduktion [mmol/24h] während L39-42

Tag


n x̅ s n x̅ s n x̅ s KF-32/ TF-35

KF-32/ TF-

35mS

TF-35/ TF-

35mS

1 8 4,90 0,60 8 4,67 0,51 8 4,81 0,62 0,025 0,515 0,159 2 8 5,51 0,68 8 5,38 0,26 8 5,40 0,40 0,581 0,560 0,861 3 8 6,88 0,54 8 6,78 0,77 8 6,77 0,66 0,713 0,689 0,953 4 8 7,87 0,42 8 7,58 0,79 8 7,79 0,71 0,225 0,693 0,300 5 6 8,16 0,78 6 7,92 0,58 6 8,10 0,79 0,147 0,818 0,508 6 8 8,89 0,44 8 8,74 0,60 8 8,28 0,50 0,635 0,003 0,212 7 8 8,65 0,73 8 8,71 0,61 8 8,65 0,36 0,791 0,964 0,803 8 8 9,16 0,44 8 8,92 0,78 8 8,88 0,78 0,315 0,175 0,920 9 8 8,77 0,59 8 8,82 0,77 8 8,83 0,71 0,815 0,837 0,974 10 8 8,07 0,40 8 8,58 0,42 8 8,71 0,66 0,009 0,025 0,623 11 8 8,15 0,84 8 9,25 0,59 8 9,12 1,29 0,019 0,010 0,815 12 8 8,04 0,82 8 9,35 0,95 8 8,65 1,30 0,006 0,174 0,015 13 8 8,00 0,93 8 9,12 0,93 8 8,65 1,01 0,014 0,096 0,216 14 8 8,48 0,88 8 9,47 0,63 8 9,72 1,06 0,039 0,004 0,491 15 8 8,56 1,06 8 9,25 0,61 8 9,35 0,86 0,224 0,120 0,756 16 8 8,22 0,66 8 9,50 0,66 8 9,35 1,01 0,003 0,002 0,710 17 8 9,16 0,64 8 10,1 1,05 8 9,70 1,09 0,058 0,034 0,496 18 8 8,11 0,53 8 9,81 1,31 8 9,70 1,12 0,014 0,002 0,796 19 8 7,92 0,61 7 9,36 1,41 8 9,31 1,21 0,080 0,014 0,689 20 8 8,07 0,91 8 9,34 0,96 8 9,17 0,97 0,029 0,010 0,724 21 8 7,77 0,77 8 8,69 0,71 8 8,56 0,42 0,029 0,009 0,692 22 8 7,58 0,93 8 8,13 0,49 8 8,29 0,62 0,027 0,012 0,443 23 8 7,73 1,17 8 8,40 0,87 8 8,08 0,57 0,089 0,246 0,136 24 8 7,59 0,91 8 7,94 1,18 8 7,70 0,59 0,296 0,682 0,459 25 8 7,13 0,91 8 7,52 0,63 8 7,63 0,92 0,082 0,124 0,744 26 8 7,44 0,82 8 7,55 0,64 8 7,77 0,71 0,669 0,254 0,379 27 8 7,76 0,83 8 7,54 0,60 8 7,88 0,68 0,312 0,636 0,077 28 8 7,88 0,70 8 7,62 0,44 8 7,99 0,84 0,103 0,762 0,265

Anhang

153

Tab. 9.16: n-Valeriansäurekonzentration [mmol/l] während L39-42

Tag


n x̅ s n x̅ s n x̅ s KF-32/ TF-35

KF-32/ TF-

35mS

TF-35/ TF-

35mS

1 8 1,59 0,26 8 1,55 0,16 8 1,54 0,16 0,451 0,413 0,716 2 8 2,47 0,22 8 2,33 0,33 8 2,31 0,30 0,369 0,301 0,906 3 8 2,96 0,31 8 3,20 0,25 8 3,09 0,30 0,006 0,108 0,275 4 8 3,58 0,18 8 3,69 0,26 8 3,59 0,35 0,394 0,948 0,273 5 8 3,54 0,36 8 3,52 0,65 8 3,39 0,50 0,885 0,186 0,489 6 8 3,64 0,35 8 3,52 0,68 8 3,48 0,43 0,540 0,236 0,800 7 8 3,46 0,50 8 3,55 0,37 8 3,43 0,49 0,448 0,887 0,384 8 8 3,21 0,46 8 3,11 0,49 8 3,41 0,34 0,557 0,324 0,098 9 8 3,13 0,46 8 3,09 0,24 8 3,36 0,35 0,836 0,228 0,011

10 8 3,23 0,38 8 3,91 0,61 8 4,13 0,69 0,003 0,001 0,264 11 8 3,23 0,36 8 4,75 0,92 8 5,05 1,01 0,001 0,000 0,212 12 8 3,58 0,69 8 5,47 1,07 8 5,65 1,24 0,000 0,000 0,353 13 8 3,60 0,68 8 5,67 0,85 8 6,26 0,97 0,000 0,000 0,015 14 8 3,59 0,65 8 5,63 0,94 8 6,66 0,83 0,000 0,000 0,028 15 8 3,69 0,62 8 5,89 1,08 8 6,74 1,01 0,000 0,000 0,053 16 8 3,63 0,68 8 6,05 0,75 8 6,47 1,07 0,000 0,000 0,135 17 8 3,59 0,65 8 6,18 0,95 8 6,35 0,86 0,000 0,000 0,409 18 8 3,32 0,64 8 6,27 1,26 8 6,73 1,25 0,000 0,000 0,009 19 8 3,55 0,53 8 6,25 1,01 8 6,95 0,91 0,000 0,000 0,038 20 8 3,47 0,53 8 5,31 0,86 8 5,96 0,71 0,000 0,000 0,001 21 8 3,19 0,55 8 4,68 0,51 8 4,98 0,65 0,000 0,000 0,138 22 8 3,12 0,67 8 4,02 0,32 8 4,38 0,43 0,001 0,001 0,048 23 8 3,16 0,59 8 3,78 0,39 8 3,97 0,37 0,029 0,004 0,369 24 8 3,09 0,47 8 3,39 0,24 8 3,54 0,39 0,137 0,016 0,293 25 8 3,03 0,64 8 3,18 0,51 8 3,27 0,57 0,482 0,326 0,655 26 8 3,32 0,59 8 3,35 0,27 8 3,49 0,42 0,890 0,475 0,413 27 8 3,07 0,42 8 3,32 0,33 8 3,35 0,44 0,011 0,066 0,861 28 8 3,09 0,37 8 3,68 0,27 8 3,49 0,29 0,001 0,024 0,172

Anhang

154

Tab. 9.17: n-Valeriansäureproduktion [mmol/24h] während L39-42

Tag


n x̅ s n x̅ s n x̅ s KF-32/ TF-35

KF-32/ TF-

35mS

TF-35/ TF-

35mS

1 8 0,59 0,08 8 0,56 0,04 8 0,56 0,04 0,540 0,477 0,320 2 8 0,73 0,06 8 0,78 0,05 8 0,75 0,03 0,062 0,426 0,020 3 8 1,07 0,13 8 1,15 0,12 8 1,09 0,09 0,242 0,563 0,175 4 8 1,30 0,05 8 1,36 0,15 8 1,35 0,07 0,325 0,061 0,789 5 6 1,33 0,06 6 1,32 0,10 6 1,35 0,10 0,730 0,527 0,237 6 8 1,43 0,13 8 1,46 0,17 8 1,37 0,10 0,593 0,225 0,115 7 8 1,33 0,17 8 1,37 0,16 8 1,36 0,09 0,244 0,528 0,734 8 8 1,32 0,08 8 1,28 0,16 8 1,34 0,10 0,530 0,487 0,128 9 8 1,29 0,08 8 1,24 0,14 8 1,34 0,07 0,335 0,178 0,079 10 8 1,15 0,05 8 1,38 0,13 8 1,52 0,14 0,000 0,000 0,059 11 8 1,23 0,10 8 1,92 0,17 8 1,91 0,27 0,000 0,000 0,928 12 7 1,35 0,15 8 2,09 0,25 8 2,19 0,34 0,002 0,001 0,495 13 8 1,32 0,17 8 2,25 0,19 8 2,50 0,23 0,000 0,000 0,041 14 8 1,39 0,17 8 2,53 0,28 8 2,77 0,29 0,000 0,000 0,170 15 8 1,34 0,16 8 2,42 0,18 8 2,82 0,25 0,000 0,000 0,006 16 8 1,32 0,13 8 2,48 0,13 8 2,76 0,30 0,000 0,000 0,045 17 8 1,44 0,09 8 2,68 0,33 8 2,95 0,18 0,000 0,000 0,022 18 8 1,35 0,12 8 2,62 0,34 8 2,87 0,31 0,000 0,000 0,026 19 8 1,38 0,13 8 2,59 0,38 8 2,71 0,35 0,000 0,000 0,304 20 8 1,34 0,16 8 2,41 0,28 8 2,55 0,31 0,000 0,000 0,231 21 8 1,35 0,21 8 2,01 0,18 8 2,15 0,16 0,000 0,000 0,126 22 8 1,30 0,23 8 1,65 0,08 8 1,78 0,10 0,002 0,000 0,006 23 8 1,27 0,24 8 1,54 0,13 8 1,59 0,17 0,003 0,000 0,261 24 8 1,25 0,25 8 1,41 0,20 8 1,39 0,19 0,059 0,064 0,791 25 8 1,20 0,23 8 1,27 0,14 8 1,35 0,22 0,122 0,007 0,077 26 8 1,28 0,24 8 1,36 0,19 8 1,37 0,16 0,155 0,078 0,720 27 8 1,32 0,23 8 1,38 0,16 8 1,38 0,18 0,241 0,318 0,909 28 8 1,31 0,24 8 1,41 0,15 8 1,41 0,11 0,115 0,221 0,980

Anhang

155

Tab. 9.18: Hexansäurekonzentration [mmol/l] während L39-42

Tag


n x̅ s n x̅ s n x̅ s

KF-32/ TF-35

KF-32/ TF-

35mS

TF-35/ TF-

35mS

1 8 0,61 0,16 8 0,47 0,10 8 0,45 0,04 0,039 0,018 0,616 2 8 1,16 0,35 8 0,94 0,31 8 0,80 0,14 0,186 0,016 0,176 3 8 1,10 0,22 8 1,10 0,25 8 1,31 0,31 0,893 0,040 0,010 4 8 1,34 0,48 8 1,31 0,45 8 1,33 0,54 0,585 0,902 0,845 5 8 1,44 0,71 8 1,47 0,41 8 1,27 0,50 0,898 0,190 0,081 6 8 1,61 0,72 8 1,48 0,66 8 1,41 0,50 0,169 0,069 0,610 7 8 1,93 0,73 8 1,80 0,63 8 1,83 0,67 0,336 0,527 0,839 8 8 1,98 0,85 8 1,93 0,68 8 2,20 0,58 0,666 0,180 0,080 9 8 2,19 0,82 8 2,12 0,59 8 2,21 0,75 0,677 0,835 0,463

10 8 2,17 0,75 8 3,30 0,81 8 3,11 0,69 0,001 0,000 0,395 11 8 2,12 0,68 8 3,87 1,12 8 3,55 0,88 0,001 0,001 0,072 12 8 2,46 0,65 8 3,81 0,94 8 3,97 0,80 0,000 0,000 0,343 13 8 2,22 0,82 8 3,71 0,90 8 3,93 0,53 0,000 0,000 0,290 14 8 2,09 0,60 8 3,37 0,68 8 3,58 0,60 0,000 0,000 0,092 15 8 2,10 0,58 8 3,64 0,48 8 3,35 0,69 0,000 0,000 0,218 16 8 2,06 0,55 8 3,21 0,70 8 3,34 0,39 0,001 0,000 0,594 17 8 2,10 0,48 8 3,38 0,62 8 3,06 0,39 0,000 0,000 0,029 18 8 2,01 0,55 8 3,48 0,71 8 3,36 0,70 0,000 0,000 0,314 19 8 2,12 0,39 8 3,77 0,68 8 3,43 0,52 0,000 0,000 0,009 20 8 2,17 0,36 8 3,01 0,59 8 2,68 0,48 0,007 0,024 0,009 21 8 2,04 0,46 8 2,36 0,42 8 2,36 0,39 0,132 0,041 0,975 22 8 1,94 0,28 8 1,88 0,33 8 1,94 0,50 0,623 0,975 0,767 23 8 1,99 0,27 8 2,04 0,37 8 1,82 0,43 0,746 0,420 0,384 24 8 2,05 0,32 8 1,79 0,25 8 1,60 0,33 0,069 0,022 0,134 25 8 2,14 0,45 8 1,86 0,36 8 1,72 0,52 0,069 0,227 0,568 26 8 2,15 0,28 8 2,02 0,26 8 1,89 0,36 0,289 0,129 0,310 27 8 2,17 0,36 8 2,04 0,24 8 1,68 0,29 0,154 0,010 0,033 28 8 2,12 0,33 8 2,52 0,38 8 1,92 0,28 0,045 0,175 0,000

Anhang

156

Tab. 9.19: Hexansäureproduktion [mmol/24h] während L39-42

Tag



KF-32/ TF-35

KF-32/ TF-

35mS

TF-35/ TF-

35mS

1 8 0,22 0,08 8 0,16 0,03 8 0,15 0,03 0,040 0,038 0,320 2 8 0,27 0,06 8 0,26 0,01 8 0,26 0,05 0,761 0,760 0,857 3 8 0,40 0,06 8 0,39 0,07 8 0,39 0,06 0,738 0,570 0,957 4 8 0,48 0,12 8 0,48 0,14 8 0,46 0,12 0,781 0,121 0,582 5 6 0,56 0,15 6 0,55 0,15 6 0,54 0,14 0,781 0,323 0,471 6 8 0,59 0,22 8 0,53 0,16 8 0,53 0,18 0,157 0,047 0,942 7 8 0,60 0,19 8 0,59 0,18 8 0,62 0,20 0,965 0,427 0,349 8 8 0,72 0,27 8 0,72 0,22 8 0,71 0,22 0,932 0,654 0,899 9 8 0,77 0,24 8 0,81 0,24 8 0,80 0,23 0,312 0,283 0,895

10 8 0,81 0,24 8 1,06 0,22 8 1,04 0,30 0,000 0,001 0,795 11 8 0,84 0,29 8 1,46 0,28 8 1,39 0,25 0,000 0,000 0,281 12 7 0,76 0,25 8 1,48 0,32 8 1,51 0,33 0,001 0,000 0,774 13 8 0,75 0,24 8 1,53 0,25 8 1,46 0,23 0,000 0,000 0,290 14 8 0,76 0,23 8 1,46 0,25 8 1,45 0,26 0,000 0,000 0,908 15 8 0,81 0,27 8 1,38 0,29 8 1,34 0,20 0,000 0,000 0,595 16 8 0,75 0,18 8 1,27 0,22 8 1,31 0,14 0,000 0,000 0,625 17 8 0,78 0,18 8 1,37 0,23 8 1,31 0,19 0,000 0,000 0,295 18 8 0,78 0,14 8 1,37 0,25 8 1,32 0,19 0,000 0,000 0,345 19 8 0,74 0,12 8 1,35 0,26 8 1,26 0,22 0,000 0,000 0,096 20 8 0,80 0,16 8 1,18 0,20 8 1,08 0,19 0,000 0,001 0,080 21 8 0,80 0,15 8 0,94 0,12 8 0,87 0,17 0,001 0,208 0,176 22 8 0,75 0,12 8 0,77 0,13 8 0,70 0,10 0,622 0,343 0,112 23 8 0,79 0,14 8 0,72 0,10 8 0,65 0,09 0,169 0,062 0,118 24 8 0,81 0,16 8 0,72 0,10 8 0,62 0,06 0,073 0,039 0,073 25 8 0,76 0,12 8 0,69 0,11 8 0,65 0,09 0,002 0,096 0,450 26 8 0,80 0,17 8 0,75 0,16 8 0,63 0,14 0,094 0,095 0,179 27 8 0,84 0,19 8 0,77 0,15 8 0,63 0,08 0,060 0,018 0,037 28 8 0,83 0,23 8 0,82 0,11 8 0,68 0,09 0,765 0,092 0,021

Anhang

157

Tab. 9.20: Summe der flüchtigen Fettsäuren, Konzentration [mmol/l] während L39-42

Tag



KF-32/ TF-35

KF-32/ TF-

35mS

TF-35/ TF-

35mS

1 8 93,8 13,1 8 92,7 9,40 8 92,4 10,8 0,569 0,592 0,879 2 8 99,3 5,88 8 95,4 5,75 8 100 8,48 0,183 0,687 0,080 3 8 107 6,36 8 106 5,00 8 103 6,85 0,597 0,176 0,069 4 8 104 6,08 8 110 9,06 8 104 9,12 0,070 0,982 0,025 5 8 106 9,88 8 102 15,0 8 96,6 12,0 0,497 0,002 0,227 6 8 105 8,01 8 102 13,6 8 102 10,2 0,435 0,164 0,942 7 8 101 11,7 8 99,1 9,41 8 101 8,86 0,500 0,889 0,580 8 8 98,2 9,62 8 98,2 8,42 8 98,4 6,67 0,973 0,918 0,923 9 8 96,7 11,3 8 98,7 9,29 8 98,2 5,09 0,449 0,619 0,824

10 8 97,5 7,23 8 103 9,31 8 104 8,14 0,031 0,100 0,869 11 8 92,1 5,58 8 110 11,1 8 104 7,39 0,014 0,006 0,199 12 8 97,7 6,46 8 110 7,96 8 109 5,91 0,002 0,006 0,709 13 8 97,9 3,74 8 110 5,54 8 105 5,61 0,000 0,026 0,082 14 8 97,3 5,48 8 110 7,99 8 108 2,91 0,003 0,001 0,679 15 8 94,6 7,08 8 112 7,08 8 108 10,1 0,008 0,001 0,512 16 8 91,9 9,92 8 105 7,42 8 109 8,82 0,001 0,000 0,146 17 8 91,9 6,26 8 107 6,30 8 112 9,21 0,000 0,005 0,293 18 8 88,8 8,01 8 107 8,54 8 114 4,24 0,000 0,000 0,064 19 8 93,4 3,49 8 108 8,60 8 112 4,31 0,006 0,000 0,282 20 8 92,9 3,15 8 100 5,14 8 104 3,54 0,019 0,002 0,126 21 8 89,8 3,86 8 98,9 5,58 8 101 3,92 0,027 0,003 0,166 22 8 89,5 5,57 8 93,4 5,01 8 97,9 3,07 0,077 0,011 0,074 23 8 91,5 6,58 8 93,2 5,61 8 95,6 3,20 0,606 0,169 0,292 24 8 90,0 5,44 8 90,0 4,03 8 93,1 4,89 1,00 0,259 0,215 25 8 87,1 7,32 8 85,0 6,00 8 88,8 6,89 0,637 0,616 0,222 26 8 89,8 5,22 8 90,6 6,62 8 93,7 3,41 0,824 0,013 0,208 27 8 88,4 3,97 8 88,1 4,16 8 89,2 4,68 0,895 0,611 0,708 28 8 90,5 6,00 8 97,5 7,95 8 95,1 4,71 0,050 0,115 0,575

Anhang

158

Tab. 9.21: Summe der flüchtigen Fettsäuren, Produktion [mmol/24h] während L39-42

Tag



KF-32/ TF-35

KF-32/ TF-

35mS

TF-35/ TF-

35mS

1 8 36,1 2,71 8 35,4 2,43 8 35,6 2,78 0,377 0,616 0,744 2 8 33,5 3,21 8 33,4 1,56 8 33,1 1,60 0,941 0,747 0,697 3 8 37,0 2,64 8 37,6 2,71 8 36,6 2,55 0,623 0,784 0,337 4 8 39,2 2,08 8 38,9 3,28 8 38,9 2,10 0,730 0,669 0,990 5 6 38,0 3,69 6 38,0 3,22 6 37,6 2,26 1,000 0,682 0,622 6 8 39,6 2,61 8 39,8 3,49 8 37,4 1,58 0,854 0,006 0,050 7 8 37,7 4,02 8 38,1 2,94 8 38,0 2,14 0,682 0,764 0,830 8 8 39,8 3,44 8 38,5 4,17 8 38,3 3,07 0,166 0,071 0,878 9 8 38,0 3,55 8 38,1 4,03 8 38,2 3,24 0,802 0,818 0,926

10 8 35,5 2,06 8 39,6 2,65 8 39,3 1,51 0,000 0,000 0,705 11 8 35,7 2,23 8 44,2 1,54 8 42,3 1,62 0,000 0,000 0,073 12 8 35,9 3,63 8 43,2 2,96 8 42,9 3,87 0,002 0,003 0,885 13 8 35,0 2,78 8 44,0 3,38 8 42,5 2,97 0,000 0,000 0,235 14 8 37,9 2,49 8 46,4 2,10 8 46,3 4,31 0,000 0,000 0,936 15 8 37,3 2,50 8 45,7 0,96 8 44,5 1,44 0,000 0,000 0,054 16 8 35,5 1,93 8 45,1 2,27 8 45,4 4,66 0,000 0,000 0,833 17 8 39,8 2,41 8 46,6 2,03 8 47,2 3,92 0,000 0,000 0,606 18 8 36,1 2,85 8 44,9 1,45 8 46,0 2,43 0,000 0,000 0,311 19 8 35,9 2,00 8 44,0 2,81 8 44,4 2,87 0,001 0,000 0,733 20 8 37,6 2,92 8 42,4 2,67 8 42,8 1,98 0,013 0,000 0,757 21 8 36,8 1,22 8 40,0 1,86 8 40,0 0,56 0,005 0,000 0,908 22 8 36,4 1,65 8 37,6 1,21 8 38,8 1,80 0,045 0,023 0,129 23 8 36,5 2,68 8 38,9 2,02 8 37,7 1,48 0,062 0,179 0,066 24 8 35,6 2,53 8 37,5 2,36 8 36,1 1,55 0,117 0,480 0,056 25 8 34,2 1,69 8 35,9 1,76 8 35,8 2,90 0,091 0,187 0,914 26 8 35,7 1,60 8 35,9 1,74 8 36,1 2,11 0,797 0,624 0,732 27 8 36,1 2,95 8 35,4 2,13 8 36,4 2,21 0,416 0,669 0,082 28 8 35,4 2,74 8 35,2 2,26 8 36,5 3,03 0,837 0,383 0,253

Anhang

159

Tab. 9.22: Mittlerer Gesamtphenolgehalt [mmol/l] in den Kontrollfermentern, Test-fermentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fermentern aus vier Läufen (L39-42)

Tag



KF-32/ TF-35

KF-32/ TF-

35mS

TF-35/ TF-

35mS

1 8 1,77 0,13 8 1,84 0,14 8 1,79 0,13 0,070 0,544 0,103 2 8 1,74 0,13 8 1,73 0,10 8 1,72 0,13 0,849 0,494 0,533 3 8 1,73 0,10 8 1,74 0,14 8 1,70 0,10 0,782 0,217 0,289 4 8 1,71 0,10 7 1,74 0,16 8 1,72 0,07 0,614 0,738 0,644 5 8 1,66 0,10 8 1,70 0,14 8 1,71 0,13 0,494 0,409 0,913 6 8 1,73 0,16 8 1,75 0,11 7 1,66 0,08 0,632 0,530 0,022 7 8 1,67 0,11 8 1,54 0,10 8 1,59 0,07 0,004 0,073 0,028 8 8 1,63 0,13 8 1,55 0,13 8 1,60 0,10 0,124 0,560 0,252 9 8 1,53 0,12 8 1,48 0,16 7 1,54 0,14 0,075 0,301 0,010

10 8 1,52 0,12 8 1,52 0,15 8 1,55 0,14 0,981 0,513 0,627 11 8 1,48 0,10 8 1,54 0,08 8 1,45 0,12 0,218 0,501 0,061 12 7 1,45 0,15 8 1,54 0,15 8 1,54 0,15 0,459 0,407 0,984 13 8 1,45 0,16 8 1,56 0,20 8 1,57 0,15 0,153 0,042 0,877 14 8 1,41 0,17 7 1,57 0,13 7 1,63 0,21 0,091 0,003 0,369 15 8 1,42 0,14 8 1,56 0,07 8 1,62 0,08 0,086 0,004 0,155 16 8 1,45 0,13 8 1,54 0,10 8 1,54 0,14 0,137 0,043 0,948 17 7 1,51 0,11 8 1,56 0,05 8 1,55 0,11 0,315 0,385 0,828 18 8 1,40 0,16 8 1,49 0,11 8 1,52 0,15 0,118 0,012 0,558 19 8 1,48 0,13 8 1,64 0,12 8 1,68 0,10 0,083 0,014 0,584 20 7 1,39 0,13 8 1,53 0,12 8 1,59 0,10 0,138 0,013 0,353 21 8 1,43 0,20 8 1,60 0,13 8 1,57 0,10 0,012 0,061 0,345 22 8 1,41 0,24 8 1,51 0,17 8 1,52 0,20 0,052 0,108 0,814 23 8 1,45 0,17 8 1,42 0,25 8 1,54 0,23 0,632 0,106 0,005 24 8 1,47 0,22 8 1,53 0,25 8 1,58 0,26 0,262 0,026 0,038 25 8 1,47 0,21 8 1,43 0,22 8 1,54 0,30 0,350 0,209 0,127 26 8 1,43 0,24 8 1,50 0,20 8 1,47 0,23 0,137 0,093 0,623 27 8 1,51 0,17 8 1,53 0,18 8 1,54 0,19 0,438 0,189 0,833 28 8 1,58 0,18 8 1,55 0,15 8 1,57 0,15 0,291 0,572 0,313

Anhang

160

Tab. 9.23: Mittlerer o-Diphenolgehalt [mgl/ml] in den Kontrollfermentern, Testfer-mentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fer-mentern aus vier Läufen (L39-42)

Tag



KF-32/ TF-35

KF-32/ TF-

35mS

TF-35/ TF-

35mS

1 8 3,38 0,32 8 3,42 0,36 8 3,46 0,24 0,735 0,503 0,724 2 8 3,92 0,29 8 3,71 0,22 8 3,96 0,53 0,241 0,872 0,276 3 8 4,11 0,20 8 4,20 0,31 8 3,97 0,35 0,471 0,187 0,190 4 8 4,21 0,47 8 4,16 0,52 7 4,36 0,36 0,710 0,157 0,006 5 8 4,47 0,43 8 4,68 0,41 8 4,46 0,30 0,266 0,959 0,162 6 8 4,41 0,43 8 4,30 0,38 8 4,38 0,45 0,187 0,611 0,356 7 8 4,43 0,50 8 4,47 0,32 8 4,31 0,42 0,696 0,085 0,039 8 8 4,52 0,53 7 4,49 0,46 8 4,53 0,33 0,331 0,912 0,909 9 8 4,41 0,22 8 4,44 0,33 8 4,47 0,39 0,810 0,543 0,839

10 8 4,47 0,28 8 4,45 0,34 8 4,57 0,28 0,813 0,430 0,057 11 8 4,36 0,18 8 4,35 0,23 8 4,23 0,20 0,940 0,146 0,301 12 8 4,54 0,22 8 4,29 0,25 8 4,30 0,26 0,083 0,159 0,976 13 8 4,31 0,34 8 4,33 0,35 8 4,32 0,30 0,786 0,937 0,844 14 8 4,50 0,33 8 4,23 0,31 7 4,43 0,61 0,040 0,741 0,190 15 7 4,41 0,36 7 4,30 0,23 8 4,30 0,18 0,071 0,442 0,594 16 8 4,42 0,27 8 4,10 0,30 8 4,21 0,29 0,010 0,069 0,043 17 8 4,36 0,21 8 4,21 0,20 8 4,30 0,34 0,048 0,577 0,184 18 7 4,31 0,45 8 4,18 0,22 8 4,21 0,17 0,428 0,556 0,693 19 8 4,39 0,27 8 4,22 0,26 8 4,38 0,32 0,194 0,933 0,372 20 8 4,57 0,44 8 4,49 0,43 8 4,33 0,40 0,507 0,355 0,563 21 8 4,39 0,34 8 4,43 0,34 8 4,39 0,23 0,697 0,996 0,757 22 8 4,50 0,57 8 4,45 0,20 8 4,31 0,30 0,791 0,321 0,157 23 7 4,48 0,52 8 4,50 0,49 7 4,28 0,41 0,945 0,834 0,036 24 8 4,55 0,67 8 4,69 0,67 8 4,52 0,64 0,468 0,734 0,492 25 8 4,57 0,32 8 4,49 0,43 8 4,49 0,44 0,396 0,399 0,918 26 8 4,61 0,43 7 4,60 0,54 8 4,57 0,36 0,885 0,679 0,948 27 8 4,56 0,29 8 4,44 0,53 8 4,40 0,47 0,363 0,286 0,826 28 8 4,37 0,53 8 4,31 0,45 8 4,32 0,38 0,551 0,674 0,896

Anhang

161

Tab. 9.24: L35-38: Mittlere Gesamtphenolkonzentration [mmol/l] in den Überstän-den nach Pepsinverdau der Kontrollgruppe, Testgruppe und Testgrup-pe mit Sojazulage, Mittelwert aus zwei Überständen aus vier Läufen

Tag



KF-32/ TF-33

KF-32/ TF-

33mS

TF-33/ TF-

33mS

7 8 1,34 0,10 8 1,42 0,12 8 1,36 0,12 0,036 0,796 0,120 8 8 1,31 0,11 8 1,40 0,17 8 1,35 0,14 0,186 0,260 0,562 9 7 1,28 0,09 8 1,40 0,13 8 1,39 0,06 0,063 0,023 0,739

10 8 1,25 0,12 8 1,55 0,11 8 1,46 0,06 0,001 0,007 0,036 11 7 1,25 0,09 8 1,51 0,05 7 1,35 0,11 0,001 0,262 0,011 12 8 1,17 0,05 8 1,62 0,08 8 1,32 0,12 0,000 0,018 0,001 13 8 1,21 0,16 8 1,63 0,12 8 1,30 0,12 0,000 0,257 0,002 14 7 1,20 0,19 8 1,62 0,09 8 1,39 0,12 0,002 0,035 0,006 15 7 1,17 0,14 8 1,64 0,08 8 1,40 0,16 0,000 0,007 0,004 16 8 1,17 0,15 8 1,59 0,12 8 1,38 0,17 0,000 0,050 0,009 17 7 1,24 0,12 8 1,66 0,12 8 1,43 0,11 0,000 0,008 0,000 18 8 1,18 0,11 8 1,67 0,09 8 1,45 0,13 0,000 0,004 0,004 19 8 1,20 0,10 8 1,69 0,10 8 1,51 0,10 0,000 0,001 0,009 20 8 1,33 0,17 8 1,51 0,18 7 1,47 0,04 0,117 0,117 0,984 21 8 1,29 0,16 7 1,34 0,18 8 1,32 0,22 0,020 0,543 0,331 22 8 1,20 0,19 7 1,25 0,22 8 1,23 0,14 0,167 0,745 0,997 23 8 1,23 0,16 8 1,28 0,13 8 1,26 0,18 0,308 0,601 0,626 24 8 1,24 0,15 8 1,34 0,13 8 1,33 0,17 0,040 0,069 0,823 25 8 1,31 0,11 8 1,40 0,11 8 1,36 0,14 0,127 0,234 0,383 26 8 1,39 0,13 8 1,33 0,17 7 1,22 0,20 0,340 0,128 0,139 27 8 1,30 0,12 8 1,45 0,17 8 1,37 0,17 0,142 0,457 0,131 28 8 1,38 0,12 8 1,50 0,12 8 1,53 0,14 0,026 0,057 0,695

Anhang

162

Tab. 9.25: L39-42: Mittlere Gesamtphenolkonzentration [mmol/l] in den Überstän-den nach Pepsinverdau der Kontrollgruppe, Testgruppe und Testgrup-pe mit Sojazulage, Mittelwert aus zwei Überständen aus vier Läufen

Tag



KF-32/ TF-35

KF-32/ TF-

35mS

TF-35/ TF-

35mS

7 8 1,49 0,13 8 1,47 0,17 8 1,54 0,17 0,849 0,477 0,437 8 8 1,45 0,12 8 1,47 0,19 8 1,51 0,14 0,784 0,418 0,655 9 8 1,36 0,17 8 1,51 0,14 8 1,43 0,16 0,066 0,394 0,297

10 8 1,20 0,10 8 1,69 0,16 8 1,46 0,24 0,000 0,011 0,035 11 8 1,24 0,09 8 1,83 0,16 8 1,47 0,09 0,000 0,003 0,000 12 8 1,19 0,13 8 1,85 0,13 8 1,56 0,13 0,000 0,000 0,000 13 7 1,21 0,11 7 1,92 0,11 7 1,55 0,11 0,000 0,012 0,001 14 8 1,23 0,12 8 1,86 0,15 8 1,52 0,08 0,000 0,001 0,000 15 8 1,21 0,09 7 1,90 0,11 7 1,54 0,06 0,000 0,000 0,000 16 8 1,26 0,07 7 1,94 0,09 8 1,49 0,09 0,000 0,001 0,000 17 8 1,22 0,08 8 1,94 0,11 8 1,54 0,12 0,000 0,000 0,000 18 8 1,26 0,09 7 1,86 0,12 7 1,58 0,11 0,000 0,000 0,008 19 8 1,29 0,12 7 1,81 0,21 8 1,60 0,08 0,002 0,001 0,015 20 8 1,46 0,08 7 1,55 0,21 8 1,49 0,06 0,300 0,560 0,384 21 8 1,40 0,15 8 1,55 0,11 8 1,47 0,17 0,004 0,212 0,091 22 8 1,45 0,17 8 1,49 0,10 8 1,54 0,13 0,573 0,128 0,174 23 8 1,44 0,17 8 1,46 0,12 8 1,55 0,13 0,668 0,191 0,180 24 8 1,50 0,10 8 1,50 0,15 8 1,53 0,13 0,968 0,467 0,539 25 8 1,52 0,18 8 1,49 0,12 8 1,52 0,13 0,530 0,973 0,477 26 8 1,51 0,18 8 1,47 0,15 8 1,51 0,14 0,641 0,958 0,281 27 8 1,44 0,06 8 1,52 0,08 8 1,49 0,07 0,060 0,257 0,575 28 8 1,43 0,09 8 1,42 0,19 8 1,39 0,23 0,871 0,647 0,782

Anhang

163

Tab. 9.26: L35-38: Mittlerer o-Diphenolgehalt [mgl/ml] in den Überständen nach Pepsinverdau der Kontrollgruppe, Testgruppe und Testgruppe mit So-jazulage, Mittelwert aus zwei Überständen aus vier Läufen

Tag



KF-32/ TF-33

KF-32/ TF-

33mS

TF-33/ TF-

33mS

7 8 6,32 0,58 8 6,69 0,16 8 6,51 0,74 0,097 0,496 0,437 8 8 6,75 0,83 8 6,86 0,44 8 6,79 0,58 0,678 0,888 0,765 9 8 6,59 0,57 7 6,65 0,20 8 6,61 0,39 0,722 0,960 0,866

10 8 6,44 0,67 7 7,08 0,27 8 6,92 0,46 0,012 0,025 0,288 11 8 6,39 0,63 8 7,59 0,50 6 6,83 0,41 0,002 0,060 0,003 12 8 6,16 0,50 8 7,68 0,53 7 6,40 0,46 0,000 0,200 0,000 13 8 6,28 0,71 8 7,66 0,68 8 6,83 0,39 0,004 0,054 0,006 14 8 6,16 0,49 7 7,41 0,52 7 6,75 0,52 0,001 0,037 0,021 15 8 6,19 0,41 8 7,94 0,63 7 6,94 0,33 0,000 0,000 0,002 16 8 6,33 0,37 8 7,89 0,44 7 6,79 0,37 0,000 0,070 0,000 17 8 6,25 0,58 8 7,81 0,25 8 6,92 0,23 0,000 0,012 0,000 18 8 6,29 0,36 8 7,33 0,53 8 6,99 0,58 0,001 0,021 0,408 19 8 6,36 0,46 8 7,02 0,33 8 6,83 0,38 0,016 0,009 0,396 20 8 6,03 0,63 7 6,72 0,59 8 6,56 0,52 0,079 0,133 0,601 21 8 6,03 0,56 8 6,45 0,60 7 6,51 0,46 0,237 0,252 0,326 22 8 5,83 0,40 8 6,16 0,91 8 6,02 0,49 0,417 0,384 0,654 23 8 6,03 0,28 8 6,33 0,33 7 6,22 0,62 0,143 0,394 0,427 24 7 6,03 0,32 8 6,15 0,42 8 6,18 0,27 0,614 0,338 0,881 25 7 5,99 0,38 8 5,85 0,37 8 6,04 0,51 0,328 0,878 0,356 26 8 5,78 0,56 7 5,72 0,64 7 5,81 0,71 0,857 0,659 0,831 27 8 5,73 0,41 8 5,90 0,49 8 6,01 0,80 0,270 0,241 0,663 28 8 5,88 0,69 8 5,94 0,35 8 5,93 0,90 0,780 0,871 0,982

Anhang

164

Tab. 9.27: L39-42: Mittlerer o-Diphenolgehalt [mgl/ml] in den Überständen nach Pepsinverdau der Kontrollgruppe, Testgruppe und Testgruppe mit So-jazulage, Mittelwert aus zwei Überständen aus vier Läufen

Tag



KF-32/ TF-35

KF-32/ TF-

35mS

TF-35/ TF-

35mS

7 8 6,38 0,45 8 6,44 0,51 8 6,81 0,66 0,794 0,164 0,304 8 8 6,25 0,36 7 6,82 0,89 7 6,70 0,73 0,193 0,190 0,454 9 7 5,89 0,68 7 6,44 0,43 7 6,18 0,86 0,032 0,440 0,371

10 6 5,87 0,69 8 7,15 1,15 6 6,53 0,54 0,001 0,145 0,066 11 6 5,45 0,26 8 7,82 0,54 8 6,53 0,35 0,000 0,001 0,001 12 8 5,46 0,26 8 8,03 0,69 8 6,38 0,59 0,000 0,010 0,002 13 7 5,52 0,67 8 7,51 0,81 7 6,30 0,40 0,002 0,039 0,012 14 7 5,60 0,60 7 7,82 0,60 8 6,21 0,46 0,002 0,094 0,001 15 8 5,49 0,66 8 7,84 0,66 8 6,45 0,53 0,000 0,019 0,000 16 8 5,55 0,36 7 8,03 0,53 7 6,00 0,25 0,000 0,033 0,001 17 8 5,58 0,57 8 7,96 0,49 6 6,19 0,24 0,000 0,178 0,000 18 8 5,73 0,72 8 7,78 0,72 8 6,42 0,34 0,000 0,025 0,004 19 8 5,84 0,64 8 7,23 0,86 8 6,40 0,69 0,008 0,000 0,045 20 8 6,09 0,65 8 6,86 0,38 8 6,34 0,37 0,055 0,199 0,082 21 8 6,32 0,44 5 6,45 0,51 8 6,22 0,37 0,679 0,634 0,721 22 8 6,25 0,42 8 6,30 0,47 8 6,26 0,58 0,823 0,944 0,908 23 8 6,01 0,59 8 6,08 0,72 7 5,74 0,46 0,882 0,635 0,032 24 6 6,03 0,40 8 6,18 0,37 7 5,99 0,54 0,945 0,783 0,518 25 8 5,99 0,35 8 6,41 0,39 8 6,15 0,47 0,091 0,530 0,117 26 7 6,24 0,47 7 6,43 0,23 8 6,45 0,47 0,555 0,257 0,794 27 8 6,46 0,46 8 6,83 0,42 8 6,34 0,61 0,175 0,694 0,064 28 8 6,32 0,42 8 6,69 0,58 8 6,24 0,33 0,024 0,531 0,084

Anhang

165

9.11 Relevante Ergebnisse aus vorherigen Disserationen

Um die Ergebnisse der gemessenen Parameter im Gesamtprojekt einordnen, ver-

gleichen und diskutieren zu können, werden hier Ergebnisse aus der Dissertation

von GÖRES (2016) dargestellt. Dort wurden die Ergebnisse der flüchtigen Fettsäu-

ren sowie die Ergebnisse der Gesamt- und o-Diphenole im Fermenter von L31-34

sowie L35-38 beschrieben.

9.11.1 Essigsäure

Abb. 9.8: Mittlere Essigsäurekonzentration in den Kontrollfermentern, Testfer-mentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fer-mentern aus vier Läufen

Abb. 9.9: Mittlere Essigsäurekonzentration in den Kontrollfermentern, Testfer-mentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fer-mentern aus vier Läufen

40

45

50

55

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65

70

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

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Tag

KF-30

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Lauf 31-34

*

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mm

ol/l

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

#

*

°* *

**° °

°

Anhang

166

9.11.2 Essigsäureproduktion

Abb. 9.10: Mittlere Essigsäureproduktion in den Kontrollfermentern, Testfermen-tern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fermen-tern aus vier Läufen

Abb. 9.11: Mittlere Essigsäureproduktion in den Kontrollfermentern, Testfermen-tern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fermen-tern aus vier Läufen

10

15

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25

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0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

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Tag

KF-30

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Lauf 31-34

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Tag

KF-32

TF-33

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Lauf 35-38

°

#

* * * *** ** **

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***

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###

##

##

#

°°

°°

°°

Anhang

167

9.11.3 Propionsäurekonzentration

Abb. 9.12: Mittlere Propionsäurekonzentration in den Kontrollfermentern, Testfer-mentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fer-mentern aus vier Läufen

Abb. 9.13: Mittlere Propionsäurekonzentration in den Kontrollfermentern, Testfer-mentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fer-mentern aus vier Läufen

10

15

20

25

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0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

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Tag

KF-30

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Lauf 31-34Lauf 31-34

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*°

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*

*

** ****

***

***

***

Anhang

168

9.11.4 Propionsäureproduktion

Abb. 9.14: Mittlere Propionsäureproduktion in den Kontrollfermentern, Testfermen-tern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fermen-tern aus vier Läufen

Abb. 9.15: Mittlere Propionsäureproduktion in den Kontrollfermentern, Testfermen-tern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fermen-tern aus vier Läufen

2

5

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11

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0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

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2

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°

°

Anhang

169

9.11.5 n-Buttersäurekonzentration

Abb. 9.16: Mittlere n-Buttersäurekonzentration in den Kontrollfermentern, Testfer-mentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fer-mentern aus vier Läufen

Abb. 9.17: Mittlere n-Buttersäurekonzentration in den Kontrollfermentern, Testfer-mentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fer-mentern aus vier Läufen

10

15

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10

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Tag

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Lauf 35-38

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##

Anhang

170

9.11.6 n-Buttersäureproduktion

Abb. 9.18: Mittlere n-Buttersäureproduktion in den Kontrollfermentern, Testfermen-tern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fermen-tern aus vier Läufen

Abb. 9.19: Mittlere n-Buttersäureproduktion in den Kontrollfermentern, Testfermen-tern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fermen-tern aus vier Läufen

4

6

8

10

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0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

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Tag

KF-32

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°

Anhang

171

9.11.7 n-Valeriansäurekonzentration

Abb. 9.20: Mittlere n-Valeriansäurekonzentration in den Kontrollfermentern, Test-fermentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fermentern aus vier Läufen

Abb. 9.21: Mittlere n-Valeriansäurekonzentration in den Kontrollfermentern, Test-fermentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fermentern aus vier Läufen

0

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°°°° °°°°° °

#

Anhang

172

9.11.8 n-Valeriansäureproduktion

Abb. 9.22: Mittlere n-Valeriansäureproduktion in den Kontrollfermentern, Testfer-mentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fer-mentern aus vier Läufen

Abb. 9.23: Mittlere n-Valeriansäureproduktion in den Kontrollfermentern, Testfer-mentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fer-mentern aus vier Läufen

0

1

2

3

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0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

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#

Anhang

173

9.11.9 Hexansäurekonzentration

Abb. 9.24: Mittlere Hexansäurekonzentration in den Kontrollfermentern, Testfer-mentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fer-mentern aus vier Läufen

Abb. 9.25: Mittlere Hexansäurekonzentration in den Kontrollfermentern, Testfer-mentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fer-mentern aus vier Läufen

0

1

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Tag

KF-32

TF-33

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Lauf 35-38

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##

Anhang

174

9.11.10 Hexansäureproduktion

Abb. 9.26: Mittlere Hexansäureproduktion in den Kontrollfermentern, Testfermen-tern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fermen-tern aus vier Läufen

Abb. 9.27: Mittlere Hexansäureproduktion in den Kontrollfermentern, Testfermen-tern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fermen-tern aus vier Läufen

0,0

0,5

1,0

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0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

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mm

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4h

Tag

KF-32

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°°

°°

Anhang

175

9.11.11 Summe der flüchtigen Fettsäuren: Konzentration

Abb. 9.28: Summe der flüchtigen Fettsäuren: Mittlere Konzentration in den Kon-trollfermentern, Testfermentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mit-telwert von zwei Fermentern aus vier Läufen

Abb. 9.29: Summe der flüchtigen Fettsäuren: Mittlere Konzentration in den Kon-trollfermentern, Testfermentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mit-telwert von zwei Fermentern aus vier Läufen

60

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0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

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ol/l

Tag

KF-32

TF-33

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Lauf 35-38

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#

Anhang

176

9.11.12 Summe der flüchtigen Fettsäuren: Produktion

Abb. 9.30: Summe der flüchtigen Fettsäuren: Mittlere Produktion in den Kontroll-fermentern, Testfermentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittel-wert von zwei Fermentern aus vier Läufen

Abb. 9.31: Summe der flüchtigen Fettsäuren: Mittlere Produktion in den Kontroll-fermentern, Testfermentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittel-wert von zwei Fermentern aus vier Läufen

10

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0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

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50

70

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mm

ol/2

4h

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

°

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* * *

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°°

°°

Anhang

177

9.11.13 Gesamtphenolgehalt im Fermenter

Abb. 9.32: Mittlerer Gesamtphenolgehalt in den Kontrollfermentern, Testfermen-tern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fermen-tern aus vier Läufen

Abb. 9.33: Mittlerer Gesamtphenolgehalt in den Kontrollfermentern, Testfermen-tern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fermen-tern aus vier Läufen

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

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2,0

2,5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mm

ol/l

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

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##

####

## ##

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** ** ** ** ** *** ***

°°

Anhang

178

9.11.14 o-Diphenolgehalt im Fermenter

Abb. 9.34: Mittlerer o-Diphenolgehalt in den Kontrollfermentern, Testfermentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fermentern aus vier Läufen

Abb. 9.35: Mittlerer o-Diphenolgehalt in den Kontrollfermentern, Testfermentern und Testfermentern mit Sojazulage, Mittelwert von zwei Fermentern aus vier Läufen

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mg/m

l

Tag

KF-30

TF-31

TF-31mS

Lauf 31-34

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3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

mg/m

l

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38#

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Anhang

179

9.12 Vorkommen von Aminosäuren und GABA in den eingesetzten Gras-

silagen

Die durch die Firma EVONIK Industries (Essen) ermittelten Aminosäuregehalte der

im Gesamtprojekt L31-42 eingesetzten Grassilagen werden in den Tabellen 9.22 und

9.23 dargestellt.

Tab. 9.28: Summe gemessener Aminosäuren in den eingesetzten Grassilagen

Aminosäure Einheit K-30 K-32 S-31 S-33 S-35

Alanin g/kg TS 10,1 8,72 13,44 13,9 12,7

Arginin g/kg TS 5,79 4,25 2,69 3,5 3,56

Asparaginsäure g/kg TS 12,46 13,3 15,5 16,1 18,3

GABA g/kg TS 3,31 3,5 8,88 9,63 6,44

Glutaminsäure g/kg TS 12,6 11,3 14,4 11,4 16,9

Glycin g/kg TS 7,83 6,92 8,84 9,57 9,94

Histidin g/kg TS 2,37 2,5 2,79 3,72 3,96

Isoleucin g/kg TS 6,48 5,62 7,56 8,14 8,01

Leucin g/kg TS 11,65 10,4 14,2 14,6 14,5

Lysin g/kg TS 5,97 6,44 8,13 9,23 10,3

Methionin g/kg TS 2,33 2,24 2,9 3,02 3,36

Phenylalanin g/kg TS 7,62 6,68 8,37 9,01 8,95

Prolin g/kg TS 8,86 7,2 10,5 11,1 10,9

Threonin g/kg TS 5,77 5,83 7,69 8,38 8,29

Valin g/kg TS 8,5 7,55 11,0 11,1 10,7

Anhang

180

Tab. 9.29: Gehalte freier Aminosäuren in den eingesetzten Grassilagen

Aminosäure Einheit K-30 K-32 S-31 S-33 S-35

Alanin g/kg TS 4,21 3,54 9,15 8,74 7,35

Arginin g/kg TS 1,41 0,15 0,1 0,1 0,1

Asparaginsäure g/kg TS 4,44 5,04 9,68 7,38 6,5

Glutaminsäure g/kg TS 1,78 1,76 5,22 0,89 5,41

Glycin g/kg TS 1,40 1,51 4,24 3,67 3,79

Histidin g/kg TS 0,32 0,48 1,16 1,59 1,83

Isoleucin g/kg TS 2,01 1,66 4,53 3,98 3,27

Leucin g/kg TS 3,19 3,00 8,42 8,13 7,92

Lysin g/kg TS 1,89 2,36 5,15 5,48 6,29

Methionin g/kg TS 0,11 0,26 0,48 1,07 1,63

Phenylalanin g/kg TS 2,33 1,87 4,32 4,48 4,48

Prolin g/kg TS 5,06 3,28 8,29 7,02 6,68

Threonin g/kg TS 1,71 2,01 4,96 4,50 4,13

Valin g/kg TS 2,99 2,56 7,07 6,15 4,90

181

10 Danksagung

Ich möchte mich herzlich bei Frau Univ.-Prof. Dr. M. Hoedemaker für das Überlassen

des Themas und der wissenschaftlichen Betreuung bei der Anfertigung dieser Arbeit

bedanken.

Besonders danken möchte ich Herrn Dr. M. Höltershinken für die hilfreichen Anre-

gungen und die umfassende Betreuung dieser Arbeit zu jeder Zeit.

Für die finanzielle Unterstützung zur Durchführung der Versuche danke ich dem

Milchförderungsfond Hannover-Braunschweig.

Dem Institut für Tierernährung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover möch-

te ich für die Durchführung der Futtermittelanalysen danken.

Ein liebevoller Dank gilt meinen „Pansentierchen“ Norbert Göres, Anna Thomsen,

Marina Ille, Katharina Ebhardt, Christopher Schulte mit Gauner und Svenja Kallmey-

er. Euer offenes Ohr für Probleme jeglicher Art, die wunderbare Unterstützung und

Zusammenarbeit haben mir sehr geholfen. Ihr habt diese Zeit lebens- und liebens-

wert gemacht.

Ich bedanke mich auch bei allen Doktoranden des „Doc-Zimmer’s“. Der herzliche

Umgangston miteinander sowie die vielen humorvollen, kreativen Pausen zwischen-

durch waren eine dankbare Abwechslung. Anja & Gauni, es war eine so schöne Zeit!

Herzlichen Dank an die ehemaligen Kollegen der Klinik für Rinder und dem Institut

für Mikobiologie für das nette Arbeitsklima neben der Doktorarbeit. Silke, lieben Dank

für die gute Zusammenarbeit.

Meiner Familie, Manuel und meinen Freunden danke ich für den stetigen Rückhalt in

dieser Zeit. Ihr habt mir immer zur Seite gestanden und mir Ratschläge gegeben.

Eure moralische und finanzielle Unterstützung während des Studiums und der Dok-

torarbeit haben mir sehr geholfen. Es ist schön zu wissen, dass ihr immer für mich da

seid.

Documents

In vitro Verdauungsstudien im RUSITEC mit Pansensaft vom Rind … · 2019-01-10 · II 3.2.4 Versuchsdurchführung ... Kap. Kapitel KF-30 Kontrollfermenter (Fer-menter 1 u. 2) Lauf