Instrumentelle Multi-Element-Aktivierungsanalyse von biologischem Gewebe und ihre Anwendung zur Metallose-Untersuchung

314 Z. Anal. Chem., Band 261, Heft 4/5 (1972)

Antwort: Die Identifizierung erfolgte nicht nut mit Originalsubstanzen, sondern auch dutch die Kombination GLC/MS.

Literatur 1. Grimmer, G., Hildebrandt, A. : J. Chromatog. 20, 89--99

(1965); vgl. diese Z. 227, 443 (1967). 2. Grimmer, G., Hildebrandt, A., BShnke, H.: ErdSl und

Kohle. August 1972 (ira Druck).

3. Hettche, H. 0., Grimmer, G.: Sehriftenreihe der Landes- anstalt ftir Immissions- und Bodennutzungsschutz des Landes l~ordrhein-Westfalen in Essen, Heft 12, 92--108 (1968).

Profi Dr. G. Grimmer Bioehemisches Institut fiir Umweltcarcinogene D-2070 Ahrensburg, Sieker LandstraBe 19 Bundesrepublik Deutschland

Z. Anal. Chem. 261, 314--328 (1972) �9 by Springer-Verlag 1972

Instrumentelle Multi-Element-Aktivierungsanalyse yon biologischem Gewebe und ihre Anwendung zur Metallose-Untersuchung*

Franz Lux und Roll Zeisler

Institut fiir Radioehemie der Technischen Universit~t Miinehen, Garehing

Eingegangen am 2. August 1972

Instrumental Multi-Element Activation Analysis o/ Biological Tissue and Its Application to the Investigation o] Metallosis. Applied to the investigation of metallosis the practical usefulness has been tested of multi. element determinations in biological tissue by instrumental activation analysis, using reactor irradiation and ~-speetrometry by means of a 35 em a Ge(Li) well type detector.

In one sample (100--200 mg fresh tissue, lyophylized) 9 elements can be determined instrumentally in one run (detection limits in ppm in parenthesis): Cr (0.1), Fe (5), Co (0.01; 0.001 ff measured 6 months after irradiation), Ni (0.5), Zn (0.5), Mo (0.07), Ag (0.1), Sb (0.01), Ta (0.005). Only the manganese determination (0.01) needs a chemical step for the 241qa-separation. The different elements were present in a range of 0.01 to 3000 ppm For high counting rates with a low error q due to counting statistics the overall standard deviations were s __~ 0.5 ~ q-values are given for various contents of the different elements, because for low contents a is dominant.

The metallic components of V4A-steel (Fe, Cr, lqi, Mo, Mn) can be determined instrumentally by a single analysis of one sample only. The results of this determination of main components by instrumental activation analysis are in good agreement with the results obtained by other analytical methods.

38 clinical cases of metallosis have been investigated. The metallic components of V4A-steel as well as the biological trace elements Co, Zn, Sb were determined in tissue samples taken at different distances from the implant. These activation analyses together with investigations by electron diffraction and by electron micro- scopy lead to the following conclusions: Crystallites are split off from the implant by transcrystalline corrosion and further decomposed to micro-crystallites. After the complete corrosive destruction of the V4A-micro- crystallites nickel and molybdenum are quickly removed. Chromium is removed at a lower rate. Iron forms

* Auszugsweise vorgetragen unter dem Titel ,,Untersuchung der MetaIlose mit Hilfe instrumenteller aktivierungsanalytiseher l~Iulti-Element-Bestimmung" auf der Tagung ,,Biochemische Analytik 72", Miinehen 25.--28. April 1972.

Abstracts of the IUPAC International Congress on Analytical Chemistry, Kyoto 1972, April 3--7, p. 437.

Vorl~ufige Mitteilungen: VI. Internationales Symposium ffir Mikroehemie, Graz, 7.--11. September 1970. 2nd Symposium on the Recent Developments in Neutron Activation Analysis, Churchill College, Cambridge, U.K., June

28--July 1, 1971.

F. Lux und R. Zeisler: Instrumentelle Multi-Element-Aktivierungsanalyse yon biologischem Gewebe 315

a compound in the cells. This compound is slowly degraded. In metallosis tissue the zinc content is remarkably decreased probably due to a displacement of the enzyme bonded zinc by the components of the implant. This could influence the development of metallosis. The tissue content of the biologically unessential antimony remains unchanged by metallosis.

Zusammen/assung. Am konkreten Fall der Metalloseuntersuchung wurden die praktisehen MSgliehkeiten der instrumentellen aktivierungsanalytischen Multi-Element-Bestimmung in biologischem Gewebe bei Reaktor- bestrahhmg und ~-Spektrometrie mit Hilfe eines 35 cm a Ge(Li)-Bohrlochdetektors ermittelt. Es werden in einem Arbeitsgang in einer Probe (100--200 mg Frisehgewicht, gefriergetrocknet) instrumentell 9 Elemente bestimmt (Nachweisgrenzen in ppm in Klammern): Cr (0,1), Fe (5), Co (0,01, 1V[essung 6 Monate naeh Be- strahlung 0,001), Ni (0,5), Zn (0,5), Mo (0,07), Ag (0,1), Sb (0,01), Ta (0,005). Nut die Manganbestimmung (0,01) erfordert eine chemische Operation zur ~4Na-Abtrenntmg. Die einzelnen Elemente lagen nebeneinander in einem Gehaltsbereich yon 0,01 bis 3000 ppm vor. Ffir hohe Z~hlraten mit kleinem z/ihlstatistisehen Fehler a ist die Gesamtstandardabweichung s ~ 0,50/0. a-Werte fiir verschiedene Gehalte der einzelnen Elemente werden angegeben.

Die metallisehen Komponenten des V4A-Stahls (Fe, Cr, Ni, Mo, Mn) kSnnen instrumentell in einer Probe bestimmt werden. Die Ergebnisse dieser instrnmentellen aktivierungsanalytischen Haupt- und Nebenbestand- teilsbestimmung stimmen gut mit den Werten yon Vergleichsanalysen nach Schiedsanalyseverfahren fiberein.

Es wurden 38 klinische Metallosef/ille untersucht. In Gewebeproben aus verschiedenen Abst~nden vom Implantat wurden die metallischen V4A-Stahl-Bestandteile sowie die biologisehen Spurenelemente Co, Zn, Sb bestimmt. Aus den Aktivierungsanalysen sowie aus Elektronenbeugungs- und Etektronenmikroskopie- Untersuchungen folgt: Durch transkristalline Korrosion werden Kristallite yore Implantat abgespalten und welter aufgespalten zu Mikrokristalliten. Nach korrosivem Zusammenbruch der V4-A-Mikrokristallite werden Nickel und Molybd~n rasch entfernt; Chrom wird langsamer abtransportiert. Eisen bildet in den Zellen eine Verbindung, die dann langsam abgebaut ~-ird. Im Metallosegewebe ist der Zinkgehalt stark erniedrigt. Ver- mutlieh wird das enzymgebundene Zink durch die Implantatbestandteile verdri~ngt. Das kann die Metallose- Entstehung beeinflussen. Der Gewebegehalt des biologisch nieht essentiellen Antimons s sich durch die Metallose nicht.

Analyse yon Biolog. Gewebe; Aktivierungsanalyse; N[ulti-Element-Bestimmung, N[etallose-Untersuch.

1. Problemstellung 1.1. Zur Aktivierungsanalyse yon biologischem Gewebe

Die Anwendung der Aktivierungsanalyse in den Lebenswissenschaften (life science) hat in den letzten Jahren stark zugenommen [20]. Ein Zeiehen dafiir ist, dab vonder Internationalen Atomenergie-Organisa- tion (IAEO) seit 1967 2 Symposien fiber dieses Thema abgehalten wurden (Symposium on Nuclear Activa- tion Techniques in the Life Sciences, Amsterdam, 8.--10. Mai 1967 [27] und Ljubljana, 10.--14. April 1972).

Auf dem besonders interessierenden Gebiet der Untersuehung yon menschliehem und tierischem Gewebe wurde die Aktivierungsanalyse bisher vorwiegend auf Grund zweier ihrer Vorzfige eingesetzt, die schon immer anerkannt waren: hohe Nachweis- empfindlichkeit und weitgehende Blindwertfreiheit. Dementsprechend erfolgten in den meisten F/~llen gezielte Bestimmungen eines oder einiger weniger Spurenelemente, z.B. in einem bestimmten Organ,

meist unter Benutzung radiochemischer Trennungen, um zu einer maximalen Nachweisempfindllehkeit zu gelangen.

Bekanntlich hat die Entwicklung der Ge(Li)- Detektoren die weitgehend instrumentelle Durch- ffihrung von Aktivierungsanalysen, und zwar aueh yon aktivierungsanalytisehen Multi-Element-Bestim- mungen, ermSglicht. Damit hat die Aktivierungs- analyse ftir Gewebeuntersuchungen zwei weitere auf diesem Gebiet besonders wiehtige Vorteile zu bieten:

a) Die instrumentelle Durehfiihrung ermSglicht viele Analysen. GroBe Analysenzahlen sind ffir konkrete Aussagen bei biologisehen Fragestellungen wegen der in diesem Bereich notwendigen statisti- schen Sicherung wesentlich.

b) Multi-Element-Bestimmungen liefern Resultate, die fiber die gezielte Untersuchung des Verhaltens eines Elementes oder einer Elementgruppe hinaus auch das damit zusammenhi~ngende und unter Umsts nieht erwartete Verhalten anderer Elemente zeigen.


In instrumentellen Multi-Element-Bestimmungen lessen sieh allerdings im Gegensatz zu Verfahren mit radiochemischer Trennung nicht die maximal mSg- lichen Nachweisgrenzen der Aktivierungsanalyse erreichen, da infolge der Untersehiede in den Kon- zentrationen und in den Aktivierungsbedingungen sowie dutch des Vorliegen vieler Radionuklide beim Messen unter Umst~nden die Messung mancher Radionuklide dureh die anderen Aktivi t~ten s tark gestSrt wird. Fiir sehr viele Fragestellungen sind die erreiehbaren Nachweisgrenzen aber ausreichend. Aul~erdem bleibt auf jeden Fall der Vorteil der weit- gehenden Blindwertfreiheit erhalten.

Bisher wurde erst fiber relativ wenige instrumentelle aktivierungsanalytische Multi-Element-Bestim- mungen in Gewebe berichtet [4,6,14,15,22,25]. Ein Grund daffir kann sein, dab eine rationelle Durch- ffihrung solcher Analysen eine Computer-Auswer- tung der Gamma-Spektren erfordert. Dieses Problem wird aueh in unserem Laborator ium bearbeitet [21].

Wir haben die praktische EinsatzmSglichkeit der instrumentellen aktivierungs-analytisehen Multi- Element-Best immung in Gewebe am Beispiel der Metallose-Untersuchung geprfift.

1.2. Die Metallose und ihre bisherige analytische Unter- suchung Unter Metallose versteht man alle Sch~den des Gewebes und des Knochenregenerates, die auf Anwesenheit einer Allen- these (eines Implantats) aus Metall zur fickzuffihren sind. Diese Sch~den kSnnen sich morphologisch, mechanisch, physi- kalisch, physikaliseh-chemisch oder biologisch ~ul]ern [26].

Die in der ehirurgischen Praxis wiehtige Verwendung yon Allenthesen ist die Osteosynthese, d.h. das Fixieren yon Knochenbrfiehen mit l~iigeln, Platten, Sehrauben usw. aus V4A-Stahl. Das ffihrt fast immer zu einer histologiseh nach- weisbaren Metallose [34].

Die analytische Untersuchung yon Metallosegewebe in der Naehbarsehaft yon Edelstahl-Implantaten ergab folgende Resultate:

Dureh halbquantitative Methoden (Berliner Blau-Reak- tion) wurde die Ablagerung yon Eisen in metatlotisch ver- ~ndertem Gewebe nachgewiesen [5,23]. Bei signifikanter Metallose mit reaktiver Entziindung und starker Eisen- ablagerung im Metallosegewebe besteht kein Zweifel fiber die Herkunft des Eisens aus dem Osteosynthese-Metall. Dieser Kausalzusammenhang ist im Falle geringer Eisen- speieherung im metallotischen Gewebe nieht eindeutig, da das Eisen auch aus m6glichen H~,mosiderinrfickst~,nden nach Blutungen stammen kann [8, 36].

Emissionsspektroskopiseh wurde Metallosegewebe yon klinischen l~illen [12] und aus Tierexperimenten [10,26] untersucht, wobei es sich um Gewebe aus der Nachbarsehaft versehiedenartiger Implantatmaterialien handelte. In den ersten Emissionsspektralanalysen yon klinischem Material waren im Falle yon Edelstahlimplantaten (V2A-Stahl) keine Implantatbestandteile im Implantat-nahen Gewebe

gefunden worden [12]. Ansonsten wurde stets eine Anreiehe- rung yon mehreren Bestandteilen des jeweiligen Implantats im Metallosegewebe festgestellt. Die Arbeit yon Ferguson et al. [10] enth~lt statistiseh gesicherte Ergebnisse fiber des Verhalten yon 9 Implantatmaterialien in Tierversuchen, die aueh die Korrosion des in der Chirurgie verwendeten Edel- stahles (bier AISI 316) im Gewebe zeigen.

F fir eine weitere Kl~rung der Zusammenh~nge zwisehen der Ablagerung yon Implantat-Bestandteilen im Gewebe und der Ausbfldung der Metallose bestand die Notwendigkeit einer umfangreichen Analyse yon klinischem Material. Die Emissionsspektralanalyse erfordert eine zeitraubende Proben. vorbereitung [10]. Als geeigneter bog sich die Aktivierungs- analyse an, die mit einer einfaehen Probenvorbehandlung auskommt. Mit ihrer Hilfe wurde aueh bereits die Anreiche- rung yon Chrom und Mangan im Metallosegewebe yon V4A-Implantaten untersucht [19]. Eine detafllierte Kl~rung des Metalloseproblems erforderte jedoch eine Bestimmung nahezu aller Bestandteile des V4A-Stahles in den Gewebe- proben.

1.3. Die besondere Eignung der Aktivierungsanalyse zur MetaUose. Untersuchung

Naeh den Ausfiihrungen in Absehnit t 1.2. erschien die instrumentelle aktivierungsanalytisehe Multi- Element-Best immung besonders geeignet ffir die Metallose-Untersuehung und andererseits dieses medi- ziniseh-biologisehe Problem ein geeigneter Fall zum Testen der MSglichkeiten des Analysenverfahrens (vgl. Tab.1 und 2, Abschnitt 2 .1, 2 und 3):

Untersuchung des Verhaltens einer bekannten Elementgruppe (Implantatbestandtefle) in einem Konzentrationsbereieh von mehreren Zehnerpoten- zen;

gleichzeitige Untersuchung des Verhaltens mSg- liehst vieler Spurenelemente, deren Konzentrat ion betr~chtlieh niedriger als die der Implanta tbes tand- teile zu erwarten ist;

Notwendigkeit vieler Analysen und damit instrumentelle Methode erforderlieh;

einfache Probenvorbereit tmg.

Unter methodischen Gesichtspunkten interessierte besonders, wie viele Elemente unter den erw~hnten Konzentrationsverhs instrumentell in einer Probe best immt werden kSnnen.'

2. Analysenmethodik

Die Analysenmethode wurde ffir Experimente mit verschiedenartigen Implantatmater ia l ien ausgearbei- tet, deren Verhalten zum Tell nur in Tierversuehen ermittelt werden kann. Uber die Ergenisse der noch nieht abgeschlossenen Tierversuehe wird jedoeh erst in einer sp~teren Arbeit beriehtet werden.

F. Lux und I~. Zeisler: Instrumentelle Multi-Element-Aktivierungsanalyse yon biologisehem Gewebe 317

Tabelle I. Probenarten und zu bestimmende Stoffe

Probenart Zu bestimmende Stoffe

V4A-Stahl zur Kontrolle der Herstellerangaben

Menschliehes und tierisehes Gewebe (vgl. Abschnitt 3)

m6glichst alle Bestandteile yon V4A- Stahl

m6glichst alle Bestandteile yon V4A- Stahl, m6glichst viele biologische Spurenelemente, Gehalte an Silber und Tantal (verwendet als Rein- implantate)

2.1. Analysenau/gabe, Probenarten, er/aflte Elemente

Die Ana lysenaufgabe zeigt Tab. 1. T a b . 2 enth~l~ Angaben , welche yon den ffir die

MetaUose-Untersuchung in teress ierenden E lemen ten un te r der B edingung einer we i tgehend ins t rumente l l en Analysendurchf f ih rung ta t s~chl ich erfaBt wurden.

Danach wurden yore V4A-Stah l alle meta l l i schen Bes tandte f le bes t immt .

2.2. Probennahme und Probenvorbereitung

2.2.1. V4A-Stahl. Von aus dem K6rper entfernten Implan- taten wurden kleine Stiicke abgesehnitten oder abges~gt oder es wurde etwas Material abgefeilt. YIerkliche Kontami-

nation durch die Werkzeuge konnte nieht erfolgt sein, da in keiner V4A-Stahlprobe Kobalt und Wolfram gefunden wurden; Werkzeugst~hle sind hochlegierte Kobalt-Wolfram- St~hle. Die Proben wurden mit Methanol, 6 M Salzs~ure und bidestilliertem Wasser gewasehen. Einwaage in die Bestrah- lungsbeh~ilter (Polyi~thylenbeutel, Tab. 3, Absehnitt 2.3.).

2.2.2. Gewebe. Proben yon etwa 1 g wurden bei der Opera- tion nach Abtrennung yore Patienten bzw. vom Tier un- mittelbar in Quarzr6hrchen yon 1 cm ~ gegeben, die beid- seitig mit Sflieongummistopfen versehlossen wurden (Trans- portbeh~lter).

Im Labor wurden die ffir die Bestrahlung geeigneten l~Iengen (vgl. Tab.3, Absehnitt 2.3.) in die Bestrahlungs- beh~Iter (Quarz oder Poly~thylen) eingewogen und in diesen gefriergetrocknet, wobei der Wasserverlust 75 4-6o/0 des Gewebe-l~risehgewiehtes betrug. Wegen der ersiehtiich stark schwankenden Trocknungsgrade ersehien es sinnvoller, die Angaben der Metatlgehalte auf das Frisehgewieht der Gewebeproben zu beziehen.

Die fiir Transport- und BestrahlungsbehElter verwendeten Quarzr6hrehen wurden dureh Abextrahieren mit konz. SalpetersEure (24h) gereinigt. Die PolyiithylenbehElter wurden nieht gereinigt.

Die Probenentnahme erfolgte mit Hflfe ehirnrgischer Instrumente. Eine dadurch hervorgerufene Gewebekontami- nation miiBte sich in einem hohen Chrom- und Molybd~n- gehalt (V4A-Bestandteile) in den Vergleichsgewebe-Proben Eul3ern (Tab.8, Absehnitt 3.). Die gefundenen Chromwerte yon 0,t -- 1 ppm k6nnten erh6ht sein (Literaturwert :,,kleiner

Tabelle 2. Aktivierungsanalytische Daten yon Implantatbestandteilen und yon ausgew~hlten biologischen Spurenelementen

Element Herkunft Bezugsnuklid Aktivierungsverh~ltnisse

V4A-Stahl (7)

Fe 66 ~ (X) 59Fe Cr 17,5 ~ (X) 51Cr Ni 12 S/o (X) 58Co Mo 2,3 ~ (X) sgMo

99roTe Mn 1 ~ (X) 5SMn C 0,6 ~ si 0,3% (x)

P 0,03% S 0,01 o/o

Ag Reimnetall- (X) Ta implan~ate

tl/2 ~-Energie keV [11]

45,6 d 1099,3; 1291,5 27,8 d 320,1 71,3 d 811,1 66,7 h

6,01 h 140,4 155 m 846,7 praktisch keine Reaktion mit Reaktorneutronen

alSi 157 m 1266,2 nieht erfaBbar: 3~ 3,09o/0, a~ ~ 0,12 barn 31Si: nur 0,07 ~ fl--~-t~bergang [18]

asp reiner fl--Strahler asS reiner fl--Strahler a~S 5,07 m 3105,3 nicht erfaBbar:

asS: 0,014~ a~a ~ 0,I barn

n~ 255 d 657,7; 884,7 lS2Ta 115 d 1121,2; 1221,3

Co Biol. Spttrenelement s0Co 5,26 a 1173,2; 1332,5 Zn Biol. Spurenelement ssZn 243 d 1115,5 Sb Biol. Spurenelement l~Sb 64,3 h 564,1

~4Sb 60,3 d 602,7; 1691,1

Na Biol. Nebenstandteil, 24Na 15,0 h 1368,4; 2754,1 1000 ppm

(X) auoh biologisehes Spurenelemen~ [3].

318 Z. Anal. Chem., Band 26i, Heft 4/5 (1972)

0,075ppm" [3]). Ihnen wiirden naeh der V4A-Stahl- Zusammensetzung (Tab.2, Absclmitt 2.1.) Molybd~n- gehalte von 0,013--0,13 ppm ent~preehen. Die Molybd/in- Nachweisgrenze liegt bei 0,07 ppm (Tab.4, Absehnitt 2.7.). Es wurde in keiner Vergleichsgewebe-Probe Molybd~n gefunden. Demnach ist auf jeden Fall fiir Metallosegewebe das Kontaminationsproblem durch die chirurgisehen Instru- mente nicht gegeben.

2.2.3. Standards. Es wurden Multi-Element-Standards in Form yon 2 Standardl6sungen verwendet,

LSsung I : Cr, Fe, Ni, Zn, Mo; 0,1 M Salzs~ure. L6sung I I : Co, Ag, Sb, Hg; 10 -a M Weins~ure. Fiir die Tantal- und Manganbestimmung dienten Einzel-

standards. LSsung I I I : Ta20~ in 10 -3 M Weins~urel6sung auf-

geschl~mmt, nach Absetzen des Ta~Oa iiberstehende LSsung als Standardl5sung verWendet. 0,050 ~g Ta/ml aktivierungs- analytisch.

L6sung IV: MnCl~-LSsung. Von L6sung I, I I und I I I wurden je 0,1 ml in gesonderte

Quarzampullen pipettiert und im Trockenschrank bei 60~ eingetrocknet.

Von LSsung IV wurde 0,1 ml auf Filterpapier eingetroeknet und das Filterpapier in einen 5 • 5 mm Poly~thylenbeutel ein- geschweil~t.

2.3. Bestrahlungsi und Me/3bedingungen, Gehaltsangaben

Die Bestrahlungs- und Mel~bedingungen sind in Tab. 3 zusammengestell t .

Die Gehal tsangaben in p p m sind jeweils Gewich$s- ppm. Bei den Gewebeanalysen wurde aus den

in Abschn. 2.2.2. genannten Grfinden stets a u f das Gewebe-Frischgewicht bezogen. Li tera turwer te entsprechend umgerechnet .

2.4. St6rreaktionen

D a der F R M als leichtwassermoderierter Reak to r eine hohe epithermische NeutronenfluBdichte ha t [28], miissen St6rungen durch (n,p)- oder (n,a)- Reakt ionen prinzipiell berficksichtigt werden. Au f Grund der kernphysikalischen und der Konzentra- tionsverh/~ltnisse kommen als StSrreaktionen prak- ~isch in Be t rach t :

5~Fe(n,p)5~Mn (I) 54Fe(n,cc)slCr (II)

e~176 ( I I I )

Reakt ion (I) wird in Absehni t t 3.5. behandel~. Ffir Reakt ion (II) erh~il~ man au f Grund der

abgesch~tzten Coulombsehwelle Ecoul und dem Q-Wert [9] eine Sehwellenergie Es yon 10,6 MeV [37]. Da im F R M die Fluf~diehte yon Neu~ronen mit dieser oder h6herer Energie nur sehr gering ist [28], war kein merklieher Einflul~ yon Reak t ion (II) zu erwarten. I n Testanalysen war in bes~rahltem p.a. Fe~03 kein a~Cr meBbar.

Durch Reak~ion ( I I I ) wird unter den a m F R M gegebenen NeutronenfluBverh/fltnissen [28] im Nickel ein Kobal tgehal t yon 500 p p m vorget/~usch$ (Be-

Tabelle 3. Bestrahlungs- und Mel3bedingungen. Gewebe: 100--200 mg Frischgewieh~; 36 h Gefrier~roeknung: 75 4- 6~ Gewiehtsabnahme. Forsehungsreaktor Miinehen (FRM); 0,5--2,3.1013 n . em -~. s -1 [28]. 35 em a Ge(Li)-Detektor mit Bohrloeh

6 ram, 4096-Kanal-Analysator

Probe Verpackung Bestrahlungs- Abklingzeit MeBzeit Bemerkung zeit (h) min

V4A-Stahl Poly~thylenbeutel 2--6 keine fiir Mn 10 20 ~tg--l,5 mg 5 x 5 m m dann I d fiir Fe, 40

Cr, 1~i, Mo (Zerfall yon 5aMn)

instrumentelle Durch- ffihrung Messung im Bestrahlungs- beh~lter a

Gewebe: Cr, Fe, Co, Ni, Zn, Mo, Quarzampulle Ag, Sb, Ta, aul3en ~ 6 mm

100--200 5--7 d 80--800 (Zerfall yon 24Na)

Mn Poly~thylenbeutel 2 infolge radio- 10 • 5 mm chemischer 24Na-

Abtrennung 1 h

10

instrumentelle Durchffih- rung, Messung im Bestrahlungsbeh~l~er a

radioehemische 2~Na- Abtrennung (vgl. hi2 in Tab. 2)

Standards (vgl. Abschnitt 2.2.3.) Quarzamptille je nach entspreehend Probe 10 Messung im I, I I und I I I auBen ~ 4 mm Probenart Bestrahlungsbeh~ilter a

Mn (Standard IV) Polyiithylenbeutel 2 entsprechend Probe 10 Messung im 5 • 5 mm Bestrahlungsbeh/~lter a

a Die verwendeten Verpaekungsmaterialien Quarz und Poly~thylen enthielten keine stSrenden Mengen der zu bestimmenden Elemente.

F. Lux und R. Zeisler: Instrumentelle Multi-Element.Aktiviertmgsanalyse yon biologischem Gewebe 319

strahlung eines Nickelstandards in fiblieher Weise ohne und mit Cadmiumumhfillung [37]. Ffir Metal- losegewebe folgt daraus: Von 100ppm l~iekel werden 0,005 p p m Kobal t und yon 0,5 ppm Nickel (Niekel-Naehweisgrenze, Tab.4, Abschnitt 2.7.) wet- den 0,000025 ppm Kobal t vorgetiiuseht. Die im Metal- losegewebe gefundenen Kobaltgehalte (Tab.7, Ab- schnitt 3.) sind durehweg hSher als die yon den zugehSrigen Nickelgehalten vorget/~uschten Kobalt- gehalte, so da$ die St6rreaktion I I I vernaehl/issigt werden kann.

2.5. Manganbestimmung

Fiir die Manganbestimmung sind 2 Tatsachen zu berficksichtigen:

a) Das in der Aktivierungsanalyse yon biologisehem Material bekannte Problem der ~41~a-Abtrennung [20] t r i t t hier auf (vgl. Tab. 3, Abschnitt 2.3.). Darauf wird in Abschnitt 2.6. n/iher eingegangen.

b) Durch die sehon erw/ihnte Kernreaktion aSFe(n,p)~Mn [StSrreaktion (I), Absehnitt 2.4.] wird unter den am FRM gegebenen l~eutronenflul~- verh/iltnissen [28] yon einem Eisengehalt yon 1000 ppm nach vorgenommenen Testanalysen ein Mangangehalt yon etwa 3 p p m vorget/iuseht [~)t~/q5 s : (0,5--1,4)-10~a/(0,8--3,7) .1012 je nach Bestrah- lungsposition]. I m Falle hoher Eisengehalte im Metallosegewebe (vgl. Tab. 7, Absehnitt 3) mfissen die Proben in einer thermisehen S/iule bestrahlt werden. Ffir Proben mit niedrigen Eisengehalten und hohen Mangangehalten kann die StSrung ffir eine gegebene Bestrahlungsposition auf Grund einer Testbestrahinng mit und ohne Cadmiumumhfillung in iiblieher Weise korrigiert werden [37].

Die Manganbestimmungen mfissen wegen der geschilderten speziellen Verh/~ltnisse in gesonderten Proben vorgenommen werden. Das soll in einer eigenen Analysenserie geschehen. Bis jetzt wurden nur einige wenige Mangananalysen durchgeffihrt.

2.6. ~Na-Abtrennung

Diese Abtrennung im Zuge der Manganbestimmung ist der einzige chemische Schritt der angewendeten Analysenmethodik.

Die a~Mn-Halbwertszeit yon 155 min erfordert eine mSglichst schnelle Durchffihrung der gesamten chemischen Prozedur.

2.6.1. Naflveraschung. I)er arbeits- und aufwandmgflig einfaehste AufsehluB yon Gewebe ist die NaBveraschung [24]. Die Behandlung nur mi~ Wasserstoffperoxid [30--32] dauert zu lange. Beim AufsehluB mit konz. oder rauehender Sehwefelsi~ure und Wasserstoffperoxid entstehen sehwerlSs.

liche Rfickst~'nde, und die sehwefelsauere LSsung ist ffir die S~ulen-Chromatographie fiber Antimonpentoxid wenig geeignet. Beim Abrauchen der Schwefels~ure wurden in einer nachgesehalteten Wasehflasche 2~Na und aSCl naeh- gewiesen. Dies lie~ beffirchten, dab auch andere Bestandteile mitgerissen wurden.

Die Proben wurden daher mit rauchender Salpeters~ure/ Wasserstoffperoxid aufgeschlossen [24]:

Der Aufschlu~ erfolgt in einer Destillationsapparatur [37]. In den Kolben wird eine Mn(NO~)2-LSsung (10 mg Mn) gegeben und eingetrocknet. AnsehlieBend wird die bestrahlte Gewebeprobe in den Kolben eingebracht und der leere Poly~thy|enbeutel zurfickgewogen. Es wird je 1 ml rauchender Salpet~rs~ure pro 10 mg Troekengewebe zugegeben und ansehlie~end die Salpeters~ure vorsichtig bis zur Troekne abdestilliert. Diese Prozedur wird wiederholt. Die zurfiekge- bliebene kohleartige Masse wird mit 1 m] rauchender Sall~eter- s~ure pro 10 mg Trockengewebe tropfenweise aufgenommen (manehma| unter Feuererseheinungen). Es wird dann die gleiche Menge Wasserstoffperoxid (30~ zugetropft. Dieses Gemiseh wird vorsiehtig erwgrmt, wobei sieh die dunkelbraune LSsung heller f/irbt. Man gibt vorsichtig weiteres Wasserstoffperoxid zu, bis die LSsung farblos ist. Zur Sieherheit wird eingedampft und der ProzeB mit rauchender Salpetersgure/Wasserstoffperoxid wiederholt. Naeh dem Abdampfen verbleibt ein weiller bis gelblicher, in Wasser 15slieher Rfiekstand. Der Riickstand wird in 0,5 ml 6 M Salzsgure aufgenommen, 2mal mit 0,5 ml 6 M Salzsgure nachgespfilt. Zeitbedarf 10 rain. Weiterverarbeitung fotgender Abschnitt.

2.6.2. Tre~nung. Es wurde nach der Methode yon Girardi [13] gearbeitet:

S~ule yon 6 mm Durehmesser gefiillt mi~ 1 g hydratisier- tern Antimonpentoxid (HAP); 1 g HAP hglt 31 mg Natrium zurfick. Die 6 M salzsaure Aufschlu615sung und die Waseh- 15sungen (Absehnitt 2.6.1.) werden auf die S~ule aufgegeben. Eiution mit 30 ml 6 1~I Salzs~ure. Naeh Testversuchen mit ~Mn als Leitisotop wird bei Verwendung von 10 nag Mangan- trigger nur 0,3~ des Mangans auf der Sgule zurfiekgehalten. ])as Eluat wird in einem Kolben gesammelt, auf 0,5 ml eingedampft und die LSsung in ein Reagensglas (ffir die Messung) gebraeht. Der Kolben wird noch 2real mit je 0,25 ml 61VI Salzs;4ure ausgewasehen, so dal3 sich im Reagens- glas eine Gesamtmenge yon 1 ml ProbenlSsung ergibt. Bei diesem Veffahren verhi~It sieh die im Kolben zurfiekbleibende Aktivit~t zur Aktivit~t der MeB16sung wie etwa 1:1000.

Auger den Kontrollen einzelner Schritte wurde das ge- samte Aufbereitunsverfahren in fiblieher Weise mit aeMn als Leitisotop und 10 bzw. 100 rag getroelmetem Fleiseh getestet. Danaeh betri~g~ tier Manganverlust wi~hrend des gesamten Aufbereitungsveffahrens nut 0,5--1,3%, Man kann daher das Verfahren ohne Ausbeutebestimmung des Triggers dureh- ffihren, so dab sieh eine starke Vereinfaehung des Analysen- gangs ergibt.

Zeitsehema:

I Bestrahlung H Veraschung H ~4Na-Abtrennung I

2 h 10 min 30 min

4 maamPr~ H "SPe tru n [ , 20 min 10 min


Tabelle 4. Nachweisgrenzen fiir die in Tab.3 angegebenen 5 in % Bestrahlungs- und Mel3bedingungen -100,

ppm

Cr 0,1 Bin 0,01 Fe 5 Co 0,01

0,001 a Ni 0,5 Zn 0,5 Mo 0,07 Ag 0,1 Sb 0,01 Ta 0,005

a Messung 6 Monate nach Bestrahlung.

2.7. Naehweisgrenzen

Die erreichten Naehweisgrenzen zeigt Tab.4. Als Nachweisgrenzen werden zum Teil immer noch

aus Wirkungsquerschnitten und NeutronenfluBdich- ten errechnete Werte angegeben. Die Daten der Tab. 4 sind experimentelle Werte ffir eine instrumentelle Multi-Element-Bestimmung unter den am FRM gegebenen NeutronenfluBverhi~Itnissen sowie den in Tab.3 (Abschnitt 2.3.) angegebenen Bestrahlungs- und MeBzeiten. Die Nachweisgrenzen werden stark yore hohen Compton- und Bremsstrahlungsunter- grund beeinfluBt, der yon der betr/ichtlichen Beta- Aktivit/~t z.B. des a2p herrfihrt.

2.8. Fehler

Der methodische Fehler bei dlesem instrumentellen Verfahren wird im wesentlichen dureh geometrisehe FluBdiehtegradienten, Selbstabsehirmung, MeSgeo- metrie und Selbstabsorption bestimmt. Der Ein- fluB yon Flul3diehtegradient, Meflgeometrie und Selbstabsorption im Bestrahlungsbeh/~Iter wurde durch Testanalysen mit Standards ermittelt. Die Ergebnisse zeigt Tab. 5.

Die gefundenen s-Werte zeigen, dab die getesteten Parameter keinen groBen Fehler bedingen. Der Einflul3 yon Selbstabsehirmung und Selbstabsorp- tion durch das Probenmaterial ist noch dureh eine

!

o,J o,t

i

~Fe

10 I00 I000 ppm

Abb. 1. Z/~hlstatistiseher Fehler a fiir die Bestimmung yon Cr, Fe, Ni, Mo in Kontaktgewebe (vgl. Abb.2, Abschnitt 3). Werte aus den Analysendaten (Absehni~t 3)

Testanalysenreihe mit einer Standardsubstanz wie kale zu prfifen. Eventuelle geringe Xnderungen yon s gegenfiber den Werten der Tab. 5 warden jedoeh ffir den Anwendungszweek nur yon geringer Bedeutung sein, da in den Gewebeanalysen vorwiegend folgende 2 Fakten den Fehler bedingen:

a) In den Testanalysen waren die Netto-Peak- flachenwerte sehr hoeh und die Peak- zu Unter- grundverh/iltnisse gfinstig. In den Gewebeproben sind die Mengen der zu bestimmenden Stoffe im allgemeinen erheblieh geringer als in den Testanalyse- Proben und der Untergrund ist wegen der gebildeten Fremdaktivit/iten sehr hoch. Naturgemi~13 wird dadurch ~ hoeh und dominierend. Eine Illustration dieser Verhiiltnisse gibt Abb. 1.

Nach Absehnit t 3 zeigen im Metallosegewebe die gegenseitigen Gehaltsverh/~ltnisse der V4A-Bestand- tefle Cr, Fe, Ni, Mo fiber den gesamten betraehteten Gehaltsbereieh einen gleichsinnigen Verlauf, so dab ffir ein bestimmtes Element bei ldeinerem Gehalt aueh der yon den anderen Bezugsnukliden herrfihren- de Untergrund kleiner ist. Ffir die biologisehen Spurenelemente Co, Zn, Sb gelten diese Zusammen- hange nicht. Die Gehaltsbereiche dieser Elemente lie- gen jeweils lediglieh innerhalb einer GrSBenordnung,

Tabelle 5. Standardabweichung s und z~ihlstatistischer Fehler a aus 15 Testanalysen des Standards I

Cr Fe Ni Zn Mo

1099,3 keV 1291,5 keV

t~g 3,71 361,6 100,1 9,999 13,58

8 in ~ 0,91 1,82 2,37 0,76 2,63 0,50

a in ~ 0,50 0,79 0,93 0,48 1,2 0,16

F. Lux und R. Zeisler: Instrumentelle Multi-Element-Aktivierungsanalyse yon biologisehem Gewebe 321

w/~hrend die Aktivit/~ten der Bezugsnuklide der V4A-Bestandteile sehr unterschiedlich sein k5nnen. Daher k5nnen fiir Co, Zn, Sb die a-Werte nieht entsprechend Abb. 1 dargestellt werden. Je nach den Gehalten an V4A-Bestandteilen ergaben sich experi- mentell ffir Kontaktgewebe (hSchste Gehalte an V4A-Bestandteilen) folgende a-Werte : Co 1,2--5,7~ Zn 1,4--3,7~ Sb 1,3--1,8~

b) Der Hauptfehler liegt in den starken Gehalts- inhomogenit/~ten, die schon innerhalb kleiner Ge- websbereiche auftreten. In verschiedenen Proben aus 1 cm 3 Gewebe kSnnen die Ergebnisse ffir ein bestimmtes Element bis zu 20~ differieren. Ffir das zu bearbeitende Problem ist dieser Fehler jedoch akzeptabel.

2.9. Besonderheiten bei der Hauptbestandteils- bestimmung

Die V4A-Stahl-Analysen sind aktivierungsanalytische Hauptbestandteilsbestimmungen und infissen demnach eine ausreichende Genauigkeit haben. Daffir mug vor allem die Selbstabschirmung ausgeschaltet werden. Ffir eine kugelfSrmige Einzelprobe eines Reinelementes gilt [16, 33] :

Aqk = 37,5 �9 o" N - d in ~ von ~k

~ integrale Neutronenflul~dichte in der Probe N Anzahl der Atome �9 em -3 d Korndurchmesser in Zentimeter.

Ffir eine gemisehte Probe wird fiber die a �9 N der einzelnen Nuklide summiert. Danach ist ffir eine V4A-Stahlkugel yon d _< 0,013 em die Selbstabschir- mung < 0,1~ . Ffir die schichtfSrmige Probe eines Reinelementes gilt [1,28, 38] :

1 - - e - 2 : d A' = A o d

A o gebilde~e Aktivi$~ ohne Selbstabsehirmung A" tats~ehlieh in tier Probe gebildete Aktivit~t 2: makroskopischer Wirkungsquerschnitt in 10 -~4 em -2 d Schichtdicke in Zentimeter.

F fir eine gemischte Probe wird fiber die ~ der einzelnen Elemente zu einem Gesamt -Z summiert.

A' Danach ist ffir V4A-Stahl mit d < 0,01 em Too > 0,987

bzw. die Selbstabschirmung < 0,13~ Eine praktisch brauchbare selbstabschirmungs-

freie Probenform ist demnach eine 0,01 cm dicke Schicht yon V4A-Stahlpulver auf einer F1/~che yon 0,5 • 0,5 era. Selbstabsorption t r i t t in einer solchen Probe auch nicht auf.

Zwei sonst fibliehe Verfahren zur Eliminierung oder Korrektur tier Selbstabschirmung und Selbstabsorp-

21 Z. Anal . Chem., Bd. 261

tion sind mit dem Ziel eines einfaehen instrumentellen Verfahrens nicht vereinbar:

a) Das Aufl6sen der Probe. b) Die Korrektur fiber einen inneren Standard,

z.B. dureh Normiernng auf den Eisengehalt, der ja erst mit einem anderen Analysenverfahren ermittelt werden mfigte.

Ein 1Dberblick fiber die Brauchbarkei t der aktivierungsanalytischen Hauptbestandteflsbest immung wurde mit Hilfe yon Verfahren b) gewonnen, das ffir diesen Zweck am besten geeignet ist. Die Ergebnisse sind in Tab. 6 zusammengestellt.

Die Resultate sind zufriedenstellend und lassen erwarten, dal3 die Genauigkeitsanforderungen einer Hauptbestandteflsbest immung erreicht werden kSn- nell.

2.10. Diskussion der A nalysenmethodik

Die Situation ffir die V4A-Stahlanalyse als einem Beispiel der AnwendungsmSglichkeit der Aktivie- rungsanalyse zur Hauptbestandtei lsbest immung wurde im Abschnitt 2.9. dargelegt.

In den Gewebeanalysen konnten instrumentell in einem Arbeitsgang in einer Probe 9 Elemente (Cr, Fe, Ni, Co, Zn, Mo, Ag, Sb, Ta) best immt werden, wobei im Kontaktgewebe (Abb. 2, Abschnitt 3) 6 Elemente (Implantatbestandtefle Cr, Fe, Ni, Mo, Ag, Ta) mit Gehalten yon 10- -3000ppm konzentrationsm/~gig dominierten, w/~hrend die 3 erfaBten biologischen Spurenelemente nur in Gehalten yon 0,01 p p m bis 0,9 p p m (Co, Sb) bzw. von 1--50 p p m (Zn) vorlagen (vgl. Tab. 7, Abschnitt 3).

In der Literatur wird teilweise die Best immung von mehr Elementen angegeben. Dabei wird jedoch die Einzelprobe mehrmals unter verschiedenen Be- dingungen bestrahlt und gemessen oder es werden yon einer Subs~anz mehrere Proben anMysiert und in jeder dieser Proben wird eine andere Element- gruppe erfaBt.

Eine chemisehe Operation erfordert lediglich die Mangan-Bestimmung (**Na-Abtrennung).

3. Metallose-Untersuchungen Die Untersuchungen wurden in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. J. Schuster im Klinikum reehts der Isar der Technischen Universit/it Mfinchen (Direktor Prof. Dr. G. Maurer) dureh- gefiihrk

Das Schema der Versuche zeigt Abb. 2.

Das Kontaktgewebe und das Gewebe aus 1--4 cm Ab- stand vom Implantat wurde bei Entfernung yon Implantaten entnommen (12--18 Monate nach Vornahme der Osteo- synthese). ])as unbeeinfluSte Vergleiehsgewebe wurde yon


Tabelle 6. Instrumentelle aktivierungsanaly~isehe Hauptbestandbeilsbestimmung in V4A-Stahl

~ Fe Cr Ni Mo Mn

Vergleiehsanalyse a 65,4 17,5 12,7 2,28 1,32

Probenart Gewicht Die kursiv gedruckten Werte wurden dutch Normierung auf den Eisenwert der Vergleichs- mg analyse yon 65,4~ erhalten (Eisen als innerer S~andard fdr Korrektur yon Selbstahsehirmung

und Selbstabsorption)

V4A-Nagel 400 47,08 12,42 8,91 1,88 1,13 kompakte Teilstiieke 17,25 12,38 2,34 1,57

V4A-Nagel i00 55,28 14,82 10,65 1,96 1,22 kompakte Teilstiicke 17,52 12,60 2,32 1,51

V4A-Nagel 120 60,05 16,18 11,75 2,05 1,32 Feilsp~ne 17,65 12,85 2,24 1,44


V4A-Nagel 70 62.73 16,38 11,96 2,18 1,39 Feilsp~ne 17,12 12,42 2,28 1,45


V4A-Nagel 15 64, 32 17,20 12,45 2,30 1,48 Feilsp~ne 17,46 12,66 2,34 1,50

a Materialprfifamt ffir Maschinenbau der Technischen Universit~t Miinchen, Analysendurchfiihrung nach Handbuch fiir das Eisenhiittenlaboratorium, herausgegeben vom ChemikerausschuB des Vereins Deutscher Eisenhiittenleute.

frischverletzten Patien~en vor Durchfiihnmg der Osteo- synthese entnommen; yon diesen PatienCen wurde noch kein Metallosegewebe analysiert.

Es wurde stets Bindegewehe entnommen. ])as Kontakt- gewebe stammte aus der unmittelbaren Nachharschaft der Implantate, z.B. aus Plattenlagem, aus dem Nagelinneren U S W .

Die Einzelergebnisse der klinischen Versuche sind in Tab. 7 und 8 zusammengestellt.

In Tab.9 sind fiir implantatnahes Metallose- gewebe und Vergleichsgewebe die aus einer HAu- fungskurve erhaltenen geome~rischen Mittelwerte der Resultate aus Tab. 7 und 8 zusammengefaBt. Fiir den

Erfa~te I

Elemente I

I I +

I Untersuchte

Proben I

I I I I I

I

I AhB. 2. Schema

I

Metallische Bestandteile yon V4A - Stahl I

Fe, Cr, Ni, Me, Mn I essentiell

Kontrolle der

Zusammensetzung

Biologische Spurenelemente

Co, Z~/

Hetallosegewebe

Kon~akt- Gewebe aus Abstan4

gewebe 1, 2, ~,, 4 c=

vom Implantat

Patienten mit

~;4A- Implantaten

38 F~lle

unspezifisch

Sb

Unbeeinflu~%es

Vergleichsgewebe

Patienten vor

Implantation

10 F~lle

der klinisehen Yersuche

F. Lux u n d R. Zeisler: Instrumentel le Multi-Element-Akfivierungsanalyse yon biologischem Gewebe 323

Tabelle 7. Klinische Versuche, Gehalte in ppm im Metallosegewebe (Frischgewicht)

Nr. a Gewebeart Fe Cr Ni Mo Mn Co b Zn Sb

1 K G KG

2 KG E 2

3 K G E l 0

4 KG 'KG E 2 E 3

5 KG KG E 2 E 2

9

10

11

12

13

14

15

2 1 '

K G schwarz verf~rbt KG E 1

K G schwarz veff~rbt E 1

E 1

K G KG E 3 E 3

K G E 2

KG E 1

KG

K G E 1

KG1 KG1 KG1 E 1 E 1 Epithelgewebe E 2 Epithelgewebe E 2 Epithelgewebe E 2 E 3 E 3 KG~

KG KG c KG

K G Nagelinneres K G KG KGc E 2 E 3

257 131 338 153

107 10,2 13,6 0,87

406 54,6 82,9 + 306 11,1 42,7 + 350 2,10 - - 210 0,72 - -

460 85,2 -- 48,2 440 72,4 -- 42,0

75 3,8 - - 0,45 30 2,9 - - 0,40

3760 680 47,0 120 225 38,1 10,5 9,87

56 28,9 -- 3,42

3360 601 25,2 200 835 37,8 -- - -

I240 40,3 -- 3,14

109 11,1 -- + 158 7,3 -- +

97 5,9 - - - -

55 2,9 -- - -

405 139 47,3 15,5 202 15,0 - - 1,1

369 42,4 39,9 5,35 226 18,4 -- 3,2

421 51,7 30,7 5,5

745 121 43,7 11,0 325 18,1 -- 0,5

522 116 55,4 8,2 409 68,7 42,9 7,0 540 187,7 114 29,6 194 18,5 13,5 28,6 144 36,3 14,2 3,32

26 6,5 -- 0,52 52 0,90 -- - -

193 8,6 -- 1,2 84 2,3 - - 0,67 79 3,3 -- 0,54

215 5,5 11,4 +

2580 221 119 29,2 13900 5020 2400 655 2050 228 35,5 35,0

370 67,2 42,0 6,37 635 105,8 72,1 13,7

1120 64,7 43,4 8,88 2850 744 459 92,7

426 13,3 -- 1,47 382 4,28 -- 0,60

0,23 0,26

0,30 0,08

0,25 0,02

0,72 +

0,63 +

0,36

+ +

+ + + + +

+ + + + + +

5,1 5,2 8,0

12,8

6,5 18,4

7,2 16,8

+

5,7 10,9

15,1 13,7 17,5 17,3

1,6 8,2 9,0

17,7 24,4 24,0 26,9

23,0

10,3

12,7 7,9 8,5 7,2

15,8 17,3

0,81 0,63 0,67 0,62 0,17 0,22 0,25


Tabelle 7 (Fortsetzung)

Nr. a Gewebeart Fo Cr Ni Mo Mn Co b Zn Sb

16 KG Nagelinneres 869 174 108,5 22,3 + 30,5 KG l~agelinneres 698 133 105,7 21,6 + 18,7 KG 147 14,1 10,2 1,83 + 10,5 KG 262 22,3 14,4 3,03 + 7,6 E 3 171 11,1 - - 0,97 -}- 9,4 E 3 171 1,75 -- + Jr 15,5

17 KG 1770 480 287 66,3 -{- 21,9 0,34 KG 194 46,4 37,7 -~ -}- 25,1 0,27

18 KG 148 5,41 + - - -}- 13,8 0,42 KG 160 3,48 + - - -t- 10,0 0,38

19 KG yon Platte 225 47,7 35,1 3,18 + 17,5 0,57 KG yon Schraubenkopf 525 139 81,5 + -}- 22,3 0,62

20 KG Nagelinneres 1140 318 195 24,2 0,25 19,3 0,25

21 KG 160 2,29 2,90 + + 14,0 0,22 KG 190 8,49 5,53 + 0,017 12,6 0,32

22 KG 1150 122 96 12,3 0,81 9,3 0,61 E 2 180 22,2 - - 1,5 -}- 14,3 0,53

23 KG 334 68,5 35,6 11,4 0,93 16,2 0,61 KG mit Knochen 306 42,2 46,7 -t- 0,37 36,7 0,65

24 KG 525 4,87 + + -}- 11,0 0,26 KG 514 5,68 ~- + 0,052 13,1 0,46

25 KG Knochenmark 304 39,1 - - - - + 46,0 KG Knoehenmark 286 41,0 - - - - 0,20 44,3

26 KG 170 0,79 -- 1,72 -- 9,5

27 E 3 161 1,20 -- 0,22 -- 22,5

28 KG 890 41,5 23,6 6,75 6,1

29 E 2 210 12,5 - - 0,84 23,5 E 3 190 12,1 -- 0,43 30,2

30 KG 2450 920 11,8 2,27 KG 1240 326 8,34 1,93

31 E 4 Epithelgewebe 27 0,42 -- -}- 4,8

32 KG 328 58,4 37,8 0,88 0,21 4,3 0,33 E 4 84 0,93 - - ~- -}- 17,9 0,22 E 4 33 0,33 - - + + 22,4 0,25

33 KG 5940 82,4 27,5 4,75 - - 3,8 0,56 E 1 470 2,05 - - -~ - - 12,9 0,19

34 KG 1140 113 54,3 2,31 0,09 6,6 0,38

35 KG 182 38,4 28,4 0,38 0,86 4,5 0,21 KG Eitriges Gewebe 60 8,88 5,72 + 0,11 8,9 0,31

36 KG 1240 222 " 73,5 42,0 0,54 8,1 0,36

37 KG 700 5,5 24,5 -t- 0,61 6,1 0,42

38 KG 1410 7,13 - - + -]- 4,2 0,58 E 4 172 1,29 -- 0,09 -k- 27,9 0,43

a Nr. = •r. des klinisehen Falls. b Kobaltwerte auf Grund StSrreaktion (III) Abschnitt 2.4. korrigiert. c Fe/Cr]Ni/Mo im u vermutlieh makroskopisehe V4A-Partikel im Gewebe. KG: Kontaktgewebe. E 1, E 2, E 3, E 4: Metallosegewebe aus 1, 2, 3 bzw. 4 cm Entfernung vom Implantat. + qualitativ naehweisbar; - - nieht naehweisbar.

F. Lux und R. Zeisler: Instrumentelle Multi-Element-Aktivierungsanalyse yon biologischem Gewebe 325

Tabelle 8. Klinische Versuche, Gehalte in ppm im Vergleichs- gewebe (Frischgewieht), Ni- und Mo-Gehalt jeweils unterhalb Naehweisgrenze (Ni < 0,5 ppm; Mo < 0,07 ppm)

Nr. a Gewebeart Fe Cr Co Zn Sb

1 Bindegewebe 110 0,80 23,5 Bindegewebe 132 0,90 21,5

2 Bindegewebe 14,6 0,50 30,7

3 Fascie 65,8 0,22 32,2 Epithelgewebe 98,0 0,38 4,01

4 Muskel + Fascie 228 1,05 8,40

5 Bindegewebe 30,8 0,10 + 27,9 0,60

6 Epithelgewebe 157 0,34 -- 5,48

7 Bindegewebe 56,2 0,22 + 16,4 0,27 Bindegewebe 64,1 0,18 + 14,2 0,26

8 Bindegewebe 156 0,63 + 20,3 0,15 Bindegewebe 147 0,26 0,049 19,7 0,16 Bindegewebe 79,8 0,22 0,050 18,4 0,26 Bindegewebe 53,3 0,33 0,012 23,3 0,24

9 Bindegewebe 82,0 0,52 + 11,4 0,34

10 Epithelgewebe 23,6 0 ,72 0,002b 5 ,72 0,30 Epithelgewebe 19,0 0,34 0,002 b 6,11 0,25

a Nr. ----- Nr. des klinischen Falles. b Messung 6 Monate nach Bestrahlung. + qualitativ nachweisbar. -- nicht nachweisbar.

Vergleieh der Gehaltsverhaltnisse der Implanta t - bestandtefle ha Metallosegewebe und im V4A-Stahl wurden die im Metallosegewebe gefundenen Metall- gehalte auf den Molybd~ngehalt yon 2 , 3 p p m normiert, der numeriseh dem Molybd~n-Prozentsatz im V4A-Stahl entspricht. Molybd~n hat yon den instrumentell best immbaren V4A.Bestandteilen die

niedrlgste Naehweisgrenze, und die Molybd~ngehal~e werden yore Molybdangrundpegel (Vergleiehsgewebe) nieht meBbar beeinfluBt.

Man sieht aus Tab.9, dai~ im Fall der V4A- Implan ta te die Verh~ltnisse der Chrom-, Molybd~n- und Nickelgehalte im Kontaktgewebe die gleichen wie im V4A-Stahl sind. Dagegen ist das Verhaltnis des Eisens zu den anderen V4A-Komponenten ha Kontaktgewebe doppelt so grog wie im V4A-Stahl. Auf die Verh~ltnisse in 1 em Abstand vom Implan ta t wird bei der Diskussion der Abb. 3 eingegangen.

Bei den biologischen Spurenelementen f~llt auf, dab im Metallosegewebe der Gehalt des essentiellen Spurenelements Zink stark verringert ist, w~hrend der Antimongehalt unver~indert bleibt. Die biologische Funktion yon Antimon ist noch ungekl~rt. Die Analysendaten fiber die Kobaltgehalte sind noeh nicht ausreiehend, um Sehlul~folgerungen fiber die Ge- haltsver~nderungen dieses Elementes ziehen zu k6nnen.

In Abb. 3 ist nach den Ergebnissen der Tab. 7 und der Tab. 8 die Abnahme der Metallgehalte im Gewebe mit zunehmendem Abstand yore Implan ta t dargestellt. Der Netto-Eisengehalt im Gewebe n immt often- siehtlieh mit zunehmendem Abstand vom Implan ta t viel weniger stark ab, als die Gehalte yon Chrom und Molybdan abnehmen. Nach Tab. 9 ist in 1 em Abstand yore Implan ta t die relative Abnahme des Chrom- gehaltes gerlnger als die des Molybd~ngehaltes. Das ist in Abb. 3 infolge der logarithmischen Darstellung nieht deutlich zu erkennen. Mit zunehmenden Absti~nden werden naeh Abb. 3 die Abnahmen der Chrom- und Molybd~ngehalte etwa gleieh.

Nickel konnte nur in Kontaktgewebe gefunden werden. Unter der Annahme eines i~hnlichen Ver- haltens yon Nickel, Chrom und Molybd~n h~tte

Tabelle 9. Geometrische Mittelwer~e der Metallgehalte in implantatnahem Metallosegewebe und Vergleichsgewebe. Vergleich mi~ den Gehalten im V4A-Stahl durch Normierung der MaBzahlen auf Mo = 2,3

Vergleichsgewebe Kontaktgewebe V4A-Stahl

ppm ( ) ~ Literatur- ppm normiert auf ~176 werte [3] a Mo = 2,3

Fe 50 (40) 580 130 65,5 Cr 0,4 (< 0,075) 85 19,1 17,5 Ni -- (< 0,25) 50 10,8 12,0 Mo 0,07 (< 0,25) 10 2,3 2,3

Me~allosegewebe 1 cm Abstand vom Implantat

normiert auf ppm Mo = 2,3

270 305 21 24

2,3 2,6

Co 0,02 (0,075) 0,7 Zn 25 (40) 6,5 Sb 0,25 (0,035) 0,38

0,02 12 0,20

a Literaturwerte wurden auf Frischgewich* umgerechnet (vgl. Abschnitt 2.2.2.).

326 Z. Anal. Chem., Band 261, Heft 4/5 (!972)

ppm

100

10

Fe

Vergleichs - g e w e b e

- Fe ~J t Fe

1

/v/o

I /do nicht 2 3 ,~ Ecm.7 r~chweisl~ar Abstand vom 3mplantat

Abb.3. Gehalte der V4A-Stahl-Bestandteile im Metallose- gewebe in Abh~ngigkeit vom Abstand des Gewebes vom Implantat. Geometrische Mittel =j= s der Werte aus Tab.7 und 8 (aus H~ufungskurve). Fehlergrenze der Abstands- angaben dureh Probennahme bedingt

*~ Netto-Fe ~ Gesamteisen abzfiglieh Fe im Vergleichs- gewebe. Diese Korrektur ist fiir einen Vergleich des Verhal- tens der versehiedenen Elemente nur beim Eisen notwendig, da lediglich der Fe-Normalgehalt in jedem Gewebe sehr hoch ist

5Tickel in Gewebeproben aus l und 2 cm Abstand veto Imp lan t a t gefunden werden mfissen (vgl. Nachweisgrenzen Tab.4, Abschnitt 2.7.). Demnach seheinen die Nickelgehalte mi t zunehmendem Ab- stand vom Imp lan t a t relativ am st~rksten abzuneh- IIlen.

Zum Studium des zeitlichen Verlaufs der Metallose und des speziellen Einflusses jedes einzelnen Elemen- tes auf die Metallose werden Tierexperimente dureh- gefiihrt. Als Versuchstiere dienen Hasen. Uber diese noch nicht abgeschlossenen Untersuehungen wird zu einem sp~teren Zei tpunkt beriehtet werden.

4. Diskussion der Ergebnisse

4.1. Verhalten der Implantat-Bestandteile

Erg~nzend zu den aktivierungsanalytisehen Unter- suchungen wurden yon anderer Seite noch folgende Beitr~,ge geliefert:

Herr Dr. E. Fuchs z hat durch Elektronenbeugung naeh- gewiesen, dab im Metallosegewebe Kristallite des V4A- Stahls bis hinab zur GrSBe yon Mikrokristalliten im Zwischen- zellbereieh vorhanden sind. Im V4A-Stahl selbst haben die Kristallite eine GrSBe yon 10--50 [zm. Im Metallosegewebe ist die GrSJ3e der Mikrokristallite 20--200nm, d.h. sie sind um einen Faktor 50--2500 kleiner als im V4A-Stahl. Herr Dr. K.-H. Marquart2 hat elektronenmikroskopiseh Granular in den Zellen selbst geflmden. Dieses Granular zeigt kein Elektronenbeugungsbild, das der kristatlinen Struktur yen V4A-Stahl oder irgend einer anderen kristallinen Struktur zugeordnet werden kSnnte. Elek- tronenmikroskopiseh erweist sieh das Granulat teilweise als amorphe Ablagerang, teilweise als Anhiiufung yon elektronendiehten Granula, die in ihrer GrSBe und Struktur dem Ferritin entspreehen. Ferritin und Hiimosiderin sind zwei bekarmte Eisenspeicherverbindungen [2,17,35], die in strukturellem Zusammenhang st~hen; elektronenmikroskopiseh sind im H~mosiderin Ferritin-Einheiten nach- zuweisen [2,29]. Der Eisengehalt der Ferritins betr~gt etwa 23 ~ [2]. Das Granulat in den Zellen enth~lt allerdings etwa 50% Eisen.

Aus unseren aktivierungsanalytischen Daten und den oben erw~hnten Ergebnissen der anderen Unter- suchungen kann die folgende Erkl~rung abgeleitet werden: Durch transkristalline Korrosion werden Kristallite v0m Implan ta t abgespalten und weiter aufgespalten zu Mil~rokristalliten. Wenn im weiteren Fortgang der Korrosion die Struktur der V4A- Kristallite schlieJ31ieh zusammenbrieht, werden Nickel und Molybd~n raseh entfernt, das Chrom wird etwas langsamer abtransportiert .

Eisen geht eine Verbindung in den Zellen ein. Diese verbindung wird in den Zellen selbst abgebaut und das Eisen schlieBlich dureh den Stoffweehsel abtransportiert. W~hrend des langsamen Abbaus der Eisenverbindung wird laufend neues Bindegewebe gebfldet. Auf diese Weise gelangt ein Anteil der Zellen mi t noch nieht abgebauter Eisenverbindung auch in grSBere Entfernung vom Implanta t , woraus sieh eine ErhShung des Eisengehaltes aueh in welter entfernten Gewebeteilen ergibt.

Vielleieht beruht die geringere relative Abnahme des Chromgehaltes gegenfiber dem Molybdi~ngehalt im implantatnahen Gewebe (Tab.9, Abschnitt 3, 1 em Abstand) ebenfalls auf der Bildung einer biologischen Chromverbindung.

4.2. Verhalten des Z i n ~

Abb.4 zeigt den Verlauf der Eisen- und Zinkgehalte im Gewebe in Abh~ngigkeit yore Abstand des Ge,

1 Siemens-Forsehungslaboratorium, 8 l~[iinchen 25, Hof- mannstr. 51.

2 Gesellschaft ffir Strahlen- und Umweltforschung m.b.H., Abteflung fiir Allgemeine und Experimentelle Pathologie, 804:2 Neuherberg, Ingolst~dter Landstrai~e 1.

F. Lux und R. Zeisler: Instrumentelle Multi-Element-Aktivierungsanalyse yon biologisehem Gewebe 327

1.oo T - =

10 ~ ~

Vergleichs -

gewebe

q5 I 2 3 ,~ cm

Abstand vom Jrnplantat

Abb.4. Gehalte von Fe und Zn im Metallosegewebe in Ab- h/~ngigkeit veto Abstand des Gewebes veto V4A-Stahl- Implantat. Werte und Fehlergrenzen wie in Abb. 3

webes vom Implanta%. Es ist die in Abschnitt 3 bereits erw/ihnte starke Verringerung des Zink- gehaltes im Metallosegewebe sowie der gegens/~tzliche Verlauf des Gehaltes am Implantatbestandtei l Eisen zu erkennen. Ffir dis Darstellung warden dis geo- metrisehen Mittelwerte der Eisen- mid Zinkgehalte verwendet. Dis Darstellung zieht demnaeh nieht in Betracht, ob in jeder individuellen Probe ein hoher Eisengehalt mi t einem geringen Zinkgehalt oder umgekehrt vorhanden ist.

Eine Auswertung unter diesem letzteren Gesiehts- punkt ergibt keine plausiblen Zusammenh/~nge, wenn in jeder einzelnen Probe der Gesamt-Eisengehalt zum Zinkgehalt in Beziehung gesetzt wird.

Es ist naheliegend, dab die offensiehtliehe Beein- flussung des Zinkgehaltes durch den Gehalt an Eisen (und durch dis Gehalte an anderen Implan ta t - bestandteflen) auf dem ,,fin Gewebe gel6sten" Antefl dieser Stoffe beruht. Unter Beriicksiehtigung der in Absehnitt 4.1. besehriebenen Tatsaehen fiber die V4A-Stahl-Mil~rokristallite im Zwischenzellbereich ersehien es daher vernfinftig, yore Gesamt-Eisengehalt den Eisenantefl abzuziehen, der sieh noeh in den V4A-Mikrokristalliten befindet und der vermutlieh biologiseh nieht wirksam ist. Der so bereehnete Rest Fe~esamt-Fevax ist der Gehalt an biologiseh gebundenem Eisen. Die entspreehende Auswertung ist in Tab. 10 dargestellt.

Aus Tab. 10 ist zu erkennen, dab beim Vergleieh des individuellen Gehaltes yon biologiseh gebunde-

Tabelle 10. Individuelle Gehalte an biologisch gebundenem Fe und an Zn in den einzelnen Proben.

/ ~ ppm MOGewebe �9 \ 0/~O~--)V4A = ppm (Fev4A)Gewebe

ppm

Fegessmt-Fev4A Zn (biologiseh gebundenes Fe)

0 22--25 60--160 14--18

200--1000 3--10

nem Eisen mit dem individuellen Zinkgehalt in jeder einzelnen Probe eine sehr gute Ubereinstimmung zwisehen der Gehaltszunahme an biologiseh gebundenem Eisen und der Abnahme des Zinkgehalts besteht.

Auf Grund der gesehflderten Verhaltnisse kann die SehluBfolgerung diskutiert werden, dab die Ver- ringerung des Zinkgehaltes im MetaUosegewebe auf einer Verdr/~ngung des enzymgebundenen Zinks dureh die Bestandteile des Implan ta t s beruht. Das fiihrt zu einer Anderung in den enzymatisehen Vor- g/~ngen und diese Anderungen kSnnen an der Ent- wieklung der Metallose mitwirken.

Eine Weiterfiihrung dieser Untersuehungen ergibt vielleieht die MSgliehkeit, mit Hilfe der Aktivierungs- analyse zur K1/irung der Zusammenh/~nge zwisehen essentiellen Spurenelementen und enzymatisehen Funktionen beizutragen.

Der Deutsehen Forsehungsgemeinsehaft, dem Bundes- ministerium ftir Bildung und Wissenschaft sowie dem Fonds der Chemischen Industrie danken wir fiir die Unterstiitzung tier Untersuchungen.

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Z. Anal. Chem. 261, 328--332 (1972) �9 by Springer-Verlag 1972

Circulardichroismus- und 13C-NMR-Untersuchungen zur Dissoziation

von Aminosiiuren

G. Jung , M. Ottnad, W. Voelter und E. Brei tmaier

Chemisehes Institut der Universit~t Tiibingen

Eingegangen am 2.Mai 1972

Circulardichroism and lSC-NMR Investigations o] the Dissociation o/Amino Acids. The dissociation of amino acids such as histidine, methionine and of shorter peptides can be studied by pulse Fourier t ransform 18C-NMR spectroscopy. The pH-dependencies of the 18C-signals show directly the changes of the electronic charge densities of all carbon a toms caused by the dissociation process. Addit ional comparat ive studies of the p H and tempera ture dependencies of the CD spectra and the 1H-~VIR spectra give now bet ter information on the steric and electronic changes due to the dissociation of polyfunct ional amino acids and oligopeptides.

Zusammen/assung. Die Dissoziation yon Aminos/~uren wle Histidin, Methionin und kleineren Pept iden kann mit Hilfe der Impuls-Fourier-Transform-18C-NMR-Spektroskopie untersueht werden. Aus der pH-Abh/ingig- keit der laC-Signale lassen sich die dureh die Dissoziation verursaehten ~mderungen der Ladungsdiehte-

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Instrumentelle Multi-Element-Aktivierungsanalyse von biologischem Gewebe und ihre Anwendung zur Metallose-Untersuchung