Interferenzmikroskopische Untersuchungen der Trockenmassenkonzentration in isolierten Mitoseapparaten und lebenden Spermatocyten von Pales ferruginea (Nematocera)

Chromosoma (Berl.) 30, 305 316 (1970)

Interferenzmikroskopische Untersuchungen der Trockenmassenkonzentration in isolierten Mitoseapparaten und lebenden Spermatocyten

yon Pales j:~rruginea (Nematocera) W E ~ E ~ M ~ 3 L L ~

Max-Planck-Institut fiir Zellbiologie, Institut Tiibingen

Eingegangen am 3. Mgrz 1970/Angenommen am 8. Mgrz 1970

Interference-microscopical Studies of Dry Mass Concentrat ion in Isolated Mitotic Apparatuses and Living Spermatocytes

of Pales [erruginea ( Nematocera ) Abstract. Using a modification of Kane's (1962, 1965) hexylenglycol (HG) iso-

lation method mitotic apparatuses (MA) were isolated from spermatocytes of Pales [erruginea. The isolated MAs from metaphase had a greater dry mass concentration (d.m.c.) than those of prometaphase. In anaphase the d.m.c, was higher between the syntelic chromosomes and their poles than in the interzonal region. A nearly even d.m.c, distribution was observed in the partial spindle of amphitelic chromosomes throughout the whole of anaphase. In living spermatoeytes the lower d.m.e, of the nucleus, as compared with the ground cytoplasm, disappeared within a few min- utes after nuclear membrane breakdown. No apparent change in d.m.c, was observed during the rest of the division of these living cells and no changes comparable with those in isolated MAs were observed.

Einleitung

W~hrend der Zellteilung wird der Mitoseapparat (MA) auf- und wieder abgebaut (z.B. Dietz, 1969). Es war daher naheliegend, zu ver- suchen, diese Vorg/inge mit Hilfe der Interferenzmikroskopie an lebenden Zellen quant i ta t iv zu erfassen (Ambrose, 1963 ; Ambrose und Bajer, 1961). Diese Arbeiten ergaben, dab die Trockenmassenkonzentra t ion (TMK) der Spindel in der lebenden Zelle yon der Prometaphase bis zur Anaphase ann/~hernd gleieh bleibt. Ein st/~rkerer TMK-Anst ieg findet sieh erst bei der Phragmoplas tenbi ldung in der Interzonalregion.

Da diese Arbeiten geringe TMK-Xnderungen ergaben, wurde vermutet , dab in der lebenden Zelle die interferenzmikroskopisehe TMX-Best im- mung im MA dureh das Cytoplasma gest6rt wurde und dab daher Beob- aehtnngen an isolierten MA mehr Aufsehlug geben kSnnten. Unseres Wissens hat bisher nu t Rus t ad (1959) isolierte MA in Abh~ngigkeit vom Teilungsstadium interferenzmikroskopisch untersueht. Er isolierte sic mit Hilfe der Alkohol-Digitonin-Methode aus Seeigeleiern. Es ersehien daher

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notwendig, MA eines weiteren Objekts mi t der sehonenderen Hexylengly- kol (I tG)-Methode (Kane, 1962, 1965) zu isolieren und intefferenzmikro-

skopisch zu untersuchen.

Material und Methoden Die Untersuchungen wurden an Spermatocyten I und II der Miicke Pales/erru-

ginea durchgefiihrt. Die Tiere stammten aus den Zuchten des hiesigen Institutes. Fiir die Isolation der Mitoseapparate (MA) aus den Spermatocyten wurde folgende

Modifikation des Isolationsmediums yon Kane (1962, 1965) verwendet: 7 Gew.-% Hexylenglykol (HG), 0.05 M Phosphatpuffer, pH 6.1. Der herauspr~parierte Hoden wurde in einem Tropfen dieses Mediums auf dem Objekttr~ger aufgerissen und die Hodenflfissigkeit mit dem Isolationsmedium vermischt. Das Deckglas wurde mit Immersions61 am Schallrfissel eines Branson Sonifiers (Typ S-125) befestigt. Dann wurde der Objekttr~ger yon unten so an das Deckglas herangeffihrt, dab sich der Flfissigkeitstropfen zwischen Deckglas und Objekttriiger ausbreiten konnte. Sobald das ganze Pr~parat am Schallriissel hing, wurde der Sonifier auf der niedrigsten Energiestufe auI3erhalb der Hauptresonanz betrieben. Nach 10--20 sec fiel das Pr~- parat (Objekttr~ger zusammen mit dem Deekglas) yore Schallrfissel ab oder wurde nach dieser Zeit abgel6st und war ffir die Beobachtung bereit 1. Es wurde zuerst mit einem schwachen Objektiv (Phako 16) abgesucht, weil der Hodeninhalt dureh die Zugabe des Isolationsmediums stark verdiinnt worden war.

Ffir die Lebendaufnahmen wurden die Spermatocyten unter Paraffin61 auf dem Deckglas ausgestrichen (Michel, 1943; Forer, 1965).

Die Mikrophotographien wurden mit einem Photomikroskop II yon Zeiss aufge- nommen (Zeiss Intefferenz-Einrichtung fiir durchfallendes Licht: Pol.-Int. I I I 100/1,0, Beleuchtungsapertur auf 0,25 eingestellt; Lichtquelle: HBO 200W/4; Cal- flex Reflexionsw~rmeschutzfi]ter (Zeiss) und VG 9 Grfinfilter). Als Aufnahmematerial ffir isolierte MA wurde Agepe FF (Agfa-Gevaert) (Entwicklung: Rodinal 1:59, 20~ 8 min), ffir Lebendaufnahmen Plus-X Pan (Kodak) verwendet.

Visuelle Messungen ergaben, daB die Gangunterschiede in den MA (Chromo- somen ausgenommen) kleiner als 0,4A waren. Das erlaubte, die Interferenzeinstel- lungen und die Aufnahmebedingungen so zu w~hlen, daB innerhalb jedes einzelnen Positivs der folgende qualitative Zusammenhang zwischen der Schw~rzung der photographisehen Schicht und der Trockenmasse im Pr~parat besteht: Je dunkler eine Objektstelle wiedergeben ist, desto mehr Trockenmasse hatten die abbildenden Lichtstrahlen am betreffenden Ort in Richtung der optischen Achse durchdrungen.

Von quantitativen Messungen wurde aus zwei Griinden vorl~ufig abgesehen: 1. Die Unterschiede zwischen den interessierenden Stadien waren so groB, dab sie direkt aus den Abbildungen hervorgehen. 2. Die Ieineren Unterschiede innerhalb der einzelnen Stadien liegen sich jedoch nicht quantitativ erfassen, weil die MA aus den Spermatocyten von Pales fiir diesen Zweck noch nicht genfigend reproduzierbar isoliert werden konnten.

Resultate

1. Isolation yon Mitoseapparaten aus Spermatocyten von Pales

I n den Vorversuchen zeigte sich, dab die Isol ierbarkei t der MA vom Tei lungss tad ium abhi~ngt. Mit dem Einsetzen der Anaphase k o n n t e n die MA ohne Ultraschal l n icht mehr sauber isoliert werden. H a t t e die Zell-

1 Ultraschall wurde bereits von Miki (1963) zur Isolation yon MA aus ~thanol- fixierten Seeigeleiern benfitzt.

Interferenzmikroskopie der Spermatocyten yon Pales 307

durehsehnfirung begonnen, blieb in der Interzonalregion um die MA sehr dichtes Material erhalten, das aueh der Ultrasehallbehandlung widerstand. Praktiseh eytoplasmafreie MA aus Prometaphase- bis Anaphasestadien konnten deshalb erst gewonnen werden, naehdem die Pr~parate in der besehriebenen Weise besehallt wurden. MA aus Pr~paraten, die nieht mit Ultrasehall behandelt worden waren, untersehieden sieh yon den behan- delten MA bei den durehgeffihrten interferenzmikroskopisehen Unter- suehungen nur dureh ihre viel st/irkere Verunreinigung mit Cytoplasma- bestandteilen.

Bei der Entwieklung eines Mediums zur Isolation der MA aus Sper- matoeyten yon Pales wurde der bereits yon Kane (1965) fiir die Isolation yon MA aus Seeigeleiern beschriebene Zusammenhang zwisehen pH-Wert und Hexylenglykol (HG)-Konzentration des Mediums best/itigt. Da die Spermatoeyten nur in kleinsten Mengen zur Verffigung standen, wurden die MA in einem Tropfen Isolationsmedium auf dem Objekttrgger isoliert. Deshalb war es nieht m6glich, die Bedingungen flit die optimale Isolation der MA ebenso seharI zu formulieren wie Kane (1965). In vielen Versuehen erwies sieh aber bei ptI 6,1 eine tIG-Konzentrat ion yon 7 Gew.-% als optimal; bei pH 6,4 konnten mit 12 Gew.- % bei pH 7,0 mit 15 % Gew.- % HG saubere MA gewonnen werden. Kane (1965) beobaehtete bei Seeigel- eiern erst bei 6,4 und h6heren pH-Werten eine komplette Dispersion des Cytoplasmas. Aueh aus den Spermatoeyten yon Pales liegen sieh die MA bei pH 6,4 etwas leiehter und sauberer isolieren als bei pI-I 6,1. Da jedoeh MA bei der HG-Isolation aus Seeigeleiern bei pH 6,1 nut 40 % ihrer Troekenmasse verlieren (Forer und Goldman, 1969) und im Isolations- medium bei pH 6,1 bis 6,2 stabiler sind als bei 6,3 und h6heren pIt-Werten (Goldman und Rebhun, 1969), wurde der gr56te Tell der Versuche bei pH 6,1 durehgefiihrt.

Wurde das Isolationsmedium mit 0,01 M Phosphat (Kane, 1965) auf pH 6,1 gepuffert, so sahen die MA aus, als ob sie in der N~he von pH 6,4 isoliert worden w~ren. Um diese Erseheinung zu verhindern, mugte die Pufferkonzentration auf 0,05 M erh6ht werden. Mit Phosphat und mit Morpholino/~thansulfons/iure (MES) (Good et al., 1966) gepufferte Medien ergaben gleieh gute Resultate.

Wurde dem Isolationsmedium 0,5--1,0 mM CaC12 oder MgC12 zuge- setzt, waren die Chromosomen kleiner und diehter. Aueh die MA schienen etwas kontrahiert zu sein und waren weniger sauber isoliert. Durch Saeeharose konnte ebenfal]s keine siehtbare Verbesserung erzielt werden. Deshalb wurden stabilisierende Zus/~tze (z. B. Goldman und l~ebhun, 1969) weggelassen.

Fiir die Untersuehung der MA wurde daher 7 Gew.-% HG, 0,05 M Phosphatpuffer, pH 6.1, als Standardmedium gew/~hlt. Dureh die besehrie- bene UltrasehMlbehandlung konnten in diesem Medium sauber isolierte

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MA erhalten werden. In l~bereinstimmung mit Beobaehtungen an MA aus Seeigeleiern (z. B. Kane und Forer, 1965 ; Sawada und l~ebhun, 1969) ver- iinderten sich diese MA innerhalb yon 30--50 min naeh Isolationsbeginn hSchstens unbedeutend. Ihre Stabilit/it war damit ffir die durehgefiihrten Untersuehungen ausreichend.

In 0,6 M KC1-L6sung, die unter dem Deekglas durehgesaugt wnrde, konnten die isolierten MA nut teilweise gel6st werden. Es blieben immer l~berreste der Astralregionen, der Chromosomen und cytoplasmatiseher Verunreinigungen der MA zuriiek. Die Troekenmassenkonzentration der Spindel nahm sehr stark ab. Es konnte jedoeh nicht sieher festgestellt werden, ob die Spindel ganz aufgel6st wnrde.

Auf Grund der gew~hlten Interferenz- und Aufnahmebedingungen und der Tatsache, dab es sieh bei den isolierten MA und den lebenden Zellen um abgeflaehte Objekte yon ann/~hernd konstanter Dieke handelte, konnte ffir die folgende qualitative Darstellung der Beobaehtungen angenommen werden, dab eine Objektstelle eine um so grSBere Troeken- massenkonzentration aufwies, je dunkler sie in der Abbildung wieder- gegeben ist.

2. Relative 2t'nderungen der Trockenmassenkonzentration ( T M K ) in den isolierten MA in Abhiingigkeit vom Teilungsstadium (Abb. 1)

Am Ende der Diakinese und in der frfihen Prometaphase konnten in der Astralregion Bereiche unterschiedlicher TMK beobachtet werden, die auch verschieden stark in 0,6 M KC1 gel6st wurden.

Die Centriolen waren als dunkle Punkte in einem helleren tIof erkennbar. Nach der KernmembranauflSsung wuchsen die Astralstrahlen rasch in den Bereich der zukfinftigen Spindel hinein (Abb. i a). W~hrend die Spindel sich ausbildete, nahm der Durchmesser der Astralregion ab und erreichte bereits nach etwa dem ersten Drittel der Prometaphase sein Minimum (Abb. 1 b). Dagegen blieb die TMK im zentralen Bereich der Astralregion ann/ihernd konstant. W/~hrend der folgenden Teilungsstad- dien ver/~nderten sich die Aster kaum.

In der frfihen Prometaphase entwickelte sich die Spindel rasch und erreichte in der Metaphase (Abb. 1 c) wahrscheinlich ihre grSgte TMK. Von der mittleren Prometaphase ab war die TMK im polw/~rtigen Drittel der Halbspindeln etwas gr6Ber als in den mehr i~quantorial gelegenen Zonen. MA aus frtihen Prometaphasestadien hatten in der Regel eine mondsichelartige Gestalt (Abb. 1 b), weft die I-Ialbspindeln im polw~rtigen Drittel gekrfimmt waren. Diese Krfimmung war sehw/ieher, wenn die t tG-Konzentrat ion kleiner als 7 Gew.-% war (pH 6,1). Prometaphase- Spindeln hat ten manchmal auch eine etwas dichtere Begrenzungssehieht. Dabei handelte es sieh wahrseheinlich um einen diinnen Mantel aus eyto- plasmatisehem Material, das der Isolation widerstanden hatte. Naeh

Abb. 1 a-- i . Isolierte Mitoseapparate aus Spermatocyten von Pales/erruginea (Inter- ferenzmikroskopie: Zeiss Po].-Int. I I I 100/1,0; Abbildungsmal~stab 1500:1). 1. Reife- teilung: a, b Prometaphase, c Metaphase, d frfihe Anaphase, die syntelen Chromo- somen wandern zu ihren Polen, e, f sp~te Anaphase, die amphitelen Chromosomen

wandem zu ihren Polen; 2. Reifeteilung: g Metaphase, h, i Anaphase

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Behandlung solcher MA mit 0,6 M KC1 war diese Schieht deutlicher erkennbar.

Vonder sp/~ten Prometaphase bis zur friihen syntelen Anaphase waren Str/~nge zu erkennen, in denen die TMK hSher war als in ihrer Umgebung. Sie gingen yon den Chromosomen aus und verbreiterten sieh zu den Polen hin meist ein wenig. Gelegentlieh erschienen sie als Doppelstr/~nge. Diese Str/~nge und die zugeh6rigen Chromosomen lagen in der Regel in weniger diehten Spalten der Spindeln. Die Spalten befanden sieh zwisehen Strgngen, die die Pole anseheinend direkt verbanden und die besonders wghrend der Prometaphase unregelm/fgig in der Spindel angeordnet waren. Vonder Metaphase his zur Mitte der syntelen Anaphase waren aueh hgufig Str/fnge zu beobaehten, die sieh strahlenartig yon den Polen gegen die ~quatorialebene erstreekten und spitz ausliefen (Abb. 1 e, d).

In der syntelen Anaphase (Abb. 1 d) war die TMK zwisehen den aus- einanderweiehenden Autosomen deutlieh geringer als zwisehen Auto- semen und Pol, zu dem sie wanderten. Zu Beginn der amphitelen Ana- phase (Abb. 1 e) lag in der Interzonalregion wenig diehtes, faserig erschei- nendes Material, sowie die erhalten gebliebene Partialspindel der Ge- sehleehtsehromosomen. Diese verlor bis zur Zelldurehsehniirung nur lang- sam an TMK und Durehmesser (Abb. 1 f). Im Gegensatz zur syntelen Anaphase war kein TMK-Untersehied zwisehen/~quatorial und polw/~rts yon den Gesehleehtsehromosomen liegenden Spindelregionen zu beobaehten.

Strange, in denen die TMK h6her war als in der iibrigen Partialspindel, verbanden die Gesehleehtsehromosomen mit den Polregionen (Abb. 1 e). In einigen F/tllen sehien derjenige Strang diehter zu sein, der das Chromo- som mit jenem Pol verband, zu dem es wanderte. Lagen die Gesehleehts- chromosomen nieht fibereinander, so war zu erkennen, dug jedes dutch je einen Strang mit beiden Polen verbunden war. Ein soleher Strang konnte als Doppelstrang ausgebildet sein. Seine Teilstr~tnge begannen dann an beiden Enden des Gesehleehtsehromosoms. Gelegentlieh war ein Ge- sehleehtsehromosom mit beiden Polen dureh je einen Doppelstrang verbunden.

In den etwas kleineren MA der 2. Reffeteilung (Abb. 1 g--i) konnten prinzipiell die gleiehen Erseheinungen wie in den MA der ersten Reife- teilung beobaehtet werden. Es fehlte j edoeh die amphitele Anaphase, we- dutch in der Anaphase (Abb. 1 h, i) der TMK-Untersehied zwisehen Aqua- torial- und Polregion, sowie das faserige Material zwisehen beiden Chromo- somengruppen besser erkennbar waren.

3. Relative ~nderungen der Troclcenma~senkonzentration ( T M K ) in den MA lebender Spermatoeyten (Abb. 2)

Die beobachteten re]ativen TMK-Untersehiede sind bei den lebenden Spermatoeyten wesentlich geringer als bei den isolierten MA. Die auf-

Abb. 2 a ~ h . 1. Reifeteilung einer Spermatocyte yon Pales ]erruginea (Interferenz- mikroskopie: Zeiss Pol.-Int. I I I 100/1,0; AbbildungsmaBstab 1500:1). Kernmem- branauflSsung ca. 9,00; a sp/~te Diakinese, b, c Prometaphase, d Metaphase, e, f frfihe Anaphase, die syntelen Chromosomen wandern zu ihren Polen, g, h sprite Anaphase,

die amphitelen Chromosomen wandern zu ihren Polen

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f/~lligste TMK-~nderung wurde im Zusammenhang mit der Kernmem- branauflSsung gefunden (Abb. 2a, b): Im Bereieh des Iriiheren Kerns nahm die TMK wiihrend einiger Minuten stark zu, bis ungef~hr der Wert erreicht war, der auch im Grundcytoplasma beobaehtet wurde. Eine weitere Zunahme bis zur Metaphase war nicht festzustellen. Von der mittleren Prometaphase (Abb. 2 c) bis zur frfihen synteien Anaphase (Abb. 2 e) sehien auch in den lebenden Spermatoeyten die TMK im polw/trtigen Drittel der Halbspindeln etwas grSBer zu sein als in der Aquatorial- region. In der syntelen Anaphase (Abb. 2e, f) war eine geringere TMK in der Interzonalregion, verglichen mit der fibrigen Spindel, nieht sicher naehweisbar.

W/ihrend der Metaphase und Anaphase war die TMK der Strange, die yon den Autosomen und den Geschlechtsehromosomen zu den Polen ffihr- ten, nur wenig grSBer als die TMK in den benachbarten Spindelbereiehen. Es wurden auch Doppelstr~nge beobaehtet. In der amphitelen Anaphase (Abb. 2g, h) versehwand der geringe TMK-Unterschied zwischen den Str/~ngen der Geschlechtschromosomen und der fibrigen Partialspindel allm~hlich.

Diskussion

Hexylenglykol (HG) wurde zuerst yon Kane (1962) f~r die Isolation yon MA aus Seeigeleiern verwendet. Sisken et al. (1967)entwickelten die Methode weiter ffir HeLa-Zellen und Amnionzellen des Menschen, Stubble- field und Mittermayer (1969) ffir Fibroblasten. In der vorliegenden Ar- beit wurde eine Modifikation beschrieben, mit der die MA aus Spermato- cyten yon Pales direkt auf dem Objekttr/~ger isoliert werden konnten. Bei diesem Obj ekt wurde ebenfalls der Zusammenhang zwischen pH-Wert und HG-Konzentrat ion des Isolationsmediums gefunden, der yon Kane (1965) f/ir Seeigeleier beschrieben worden war. Qualitativ konnten auch die Untersuchungen yon Forer und Goldman (1969) an Seeigeleiern best~- tigt werden. Ffir Isolationsmedien mit pH-Werten yon 6,1--7,1 fanden sie eine Abnahme der MA-Gesamttrockenmasse yon 60 auf 15% der in vivo vorhandenen Masse. Das zeigte, dab sich die MA aus Spermatocyten yon Pales bezfiglich ihrer Isolierbarkeit und Gesamttrockenmasse ~hnlich wie die MA der Seeigeleier verhielten.

Nach Forer (Literaturzusammenstellung, 1969) ist die Trockenmassen- konzentration (TMK) in der Spindel ungef~hr gleich gro$ wie im Cyto- plasma. Auch in den lebenden Spermatocyten yon Pales (Abb. 2) konnte qualitativ zwischen der Spindel und dem Grundcytoplasma keinTMK-Un- terschied festgestellt werden. Die inhomogenen Cytoplasmabereiche waren jedoch deutlich dichter als die Spindel. J~hnliche Verh/iltnisse fanden Mitchison und Swann (1953) bei Eiern yon Psammechinus miliaris. I m MA und in der klaren Zone yon zentrifugierten Eiern war die TMK etwa


15% niedriger als im granuli~ren Cytoplasma. Ambrose (1963), Ambrose und Bajer (1961) und Longwell und Mota (1960) erhielten dagegen bei Pollenmutterzellen und Endospermzellen Ifir die Spindel eine h6here TMK als fiir das Cytoplasma. Diese untersehiedliehen l~esultate der einzelnen Autoren sind wahrseheinlieh auf die Versehiedenheit der untersueh- ten Objekte und die verwendeten MeBmethoden zurfiekzufiihren.

In den lebenden Spermatocyten stieg naeh der Kernmembranaufl6sung die TMK im Bereieh des zukiinltigen MA innerhalb weniger Minuten auf ungef~hr den Weft an, der auch im Grundcytoplasma beobaehtet wurde (Abb. 2 a, b). Das gab einen Hinweis darauf, dag bei den Spermatoeyten von Pales wahrseheinlieh ein Teil des Materials, das fiir den Aufbau des MA ben6tigt wird, aus dem Cytoplasma stammen k6nnte. Dagegen land Ambrose (1963) bei Endospermzellen yon Leueojum aestiveum L. einen voriibergehenden TMK-Abfall w/thrend der Kernmembranaufl6sung.

In der sp/~ten Anaphase beobaehtete Rustad (1959) bei isolierten MA aus Seeigeleiern eine stark erh6hte TMKin der Interzonalregion. TMK-Zu- nahmen wurden aueh bei der Phragmoplastenbildung beobaehtet (Am- brose, 1963 ; Ambrose und Bajer, I961 ; Longwell und Mota, 1960). Gleieh- zeitig stieg in diesen Zellbereiehen aueh die t~NS-Konzentration (Shima- mura und Ota, 1956 ; Rustad, 1959 ; Staatz, 1969). Diese Vorg~nge stehen vermutlich nieht mehr mit dem Auf- und Abbau des MA, sondern eher mit der Zelldurehsehnfirung und Phragmoplastenbildung im Zusammenhang.

Die interferenzmikroskopisehen Untersuehungen an den isolierten MA aus Spermatoeyten yon Pales (Abb. 1) ergaben eine Zunahme der TMK in der Spindel w/thrend der Prometaphase. In der syntelen Anaphase waren die polw/trts yon den Chromosomen liegenden Spindelbereiehe deutlieh diehter als die Interzonalregion. Dagegen entstanden in der amphitelen Anaphase h6chstens unbedeutende TMK-Untersehiede in der Partialspindel der Gesehleehtsehromosomen. Aus dem Vergleieh dieser Befunde mit den polarisationsmikroskopisehen Untersuehungen yon Inou6 (i964) an Zellen aus versehiedensten Organismen und yon Dietz (1963) an Spermatoeyten yon Pales crocata folgt, dab die ~nderungen der TMK und der Doppelbreehung in der Spindel parallel verlaufen. Ferner zeigten MA aus Seeigeleiern vor und naeh der Isolation bei pH 6,1--6,4 die gleiehe Doppelbreehung (Forer und Goldman, 1969; Goldmanund l~ebhun, 1969). Es kann daher angenommen werden, dag aueh die bei pH 6,1 isolierten MA aus Spermatoeyten yon Pales/erruginea einen grogen Teil des doppelbreehenden Materials enthielten, das in vivo im MA lokalisiert war.

Von der sp/~ten Prometaphase bis zur frfihen Anaphase wurden in den isolierten MA Str/~nge beobaehtet, in denen die TMK h6her war als in ihrer Umgebung. Sie verbanden die Chromosomen mat den Polregionen oder verliefen direkt zwischen den Polen. Obwohl immer wieder aueh Doppelstrgnge gesehen wurden, die yon Autosomen und Geschleehtsehro-

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mosomen ausgingen und sich nach den Polen erstreckten, konnte nie ganz ausgeschlossen werden, dab es sich bei der Verdoppelung der Strange n i c h t u m einen Fokussierungsartefakt handelte. Dagegen lieB sich ein- deutig feststellen, dab diese StrAnge an den gleichen Stellen im MA lagen und wiihrend derselben Teilungsphasen sichtbar waren wie die yon Dietz (1963) bei Spermatocyten yon Pales crocata beschriebenen doppelbrechenden Chromosomenfasern. Es ist daher wahrscheinlich, dab diese dichteren StrAnge in den isolierten MA aus jenen MA-Bereichen stammen, in denen bei den lebenden Spermatocyten die doppelbreehenden Chromosomen- fasern verlaufen.

Aus dem Unterschied zwischen der TMK-Verteilung in isolierten MA (Abb. 1) und den MA lebender Zellen (Abb. 2) folgt, dal3 der MA-Bereich bei der Isolation Substanz entsprechend einem Muster verlor, das yon der Teilungsphase abhing. Daraus kann auf eine teilungsphasenabh~ngige Sehwankung der Konzentrat ion der Bindungen geschlossen werden, die fiir die Stabiliti~t der einzelnen MA-Regionenim Isolationsmedium verant- wortlich sind. Falls diese Folgerungen richtig sind, kSnnten die beobachteten TMK-Xnderungen in den isolierten MA teilweise auf das dynamisehe Gleichgewicht zurfickgeffihrt werden, das yon Went (1966) vermute t und von Inou6 und Sato (1967) und Dietz (1969) postuliert wurde.

Forer (1969) vermutete, dab man durch die Isolation t in MA-Skelett erhi~lt. Die vorliegendeninterferenzmikroskopischenUntersuchungenzei- gen, dab die mit Hexylenglykol isolierbare MA-Struktur w~hrend der Zell. teilung auf- und wieder abgebaut wird. Wie oben dargestellt wurde, ent- hi~lt diese isolierbare MA-Struktur wahrscheinlich einen wesentlichen Teil des doppelbrechenden Materials, das in vivo im MA vorhanden ist. Zwi- schen der Sti~rke der Doppelbrechung, wit sie yon Inou6 (1953) beobachtet wurde, und der cytochemisch best immten Konzentrat ion protein- gebundener Sulfhydrylgruppen fanden Kawamura und Dan (1958) bei Eiern yon 4 Echinodermenarten eine qualitative Korrelation. Es ist daher denkbar, dab proteingebundene Sulfhydrylgruppen in der isolierbaren MA-Struktur in erhShter Konzentrat ion vorhanden w/~ren und ffir dig strukturelle Organisation und Stabilit~t des MA yon Bedeutung skin k6nnten.

tterrn Dr. R. Dietz bin ich ffir wertvolle Diskussion zu Dank verpflichtet.

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316 W. M/iller: Interferenzmikroskopie der Spermatocyten von Pales

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Interferenzmikroskopische Untersuchungen der Trockenmassenkonzentration in isolierten Mitoseapparaten und lebenden Spermatocyten von Pales ferruginea (Nematocera)