Ionenfalle (Ion trap) - Universität Wien · Reinigung für Säuren (HNO3, HCl) oder H2O 1. Spurenelementanalytik Sl lik Probenvorbereitung 1. Spurenelementanalytik 2. Festphasenextraktion

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Ionenfalle (Ion trap)

Das Prinzip einer Ionenfalle beruht darauf, Ionen in einem Quadrupolfeld (Ringelektrode mit zwei Endkappen) "gefangen" zu halten.

Je nach Art der einwirkenden Felder kann man entweder nur Ionen einer bestimmten Masse gefangen halten, oder aber sämtliche Ionen in der Falle vorrätig halten und durch geeignete Veränderung der Felder Ionen mit einer bestimmten Masse dazu zu bringen, die Falle zu verlassen.

Dadurch ist es möglich, gezielt den Vorrat der Ionen massenaufgetrennt zu scannen.

Helium‐Gas (geringes Vakuum) hilft bei der Stabilisierung der Ionen.

Ionenfalle (Ion trap)

An die Ringelektroden wird eine variable Hochfrequenzspannung angelegt, die beiden Endkappen sind geerdet. Die Ionen treten in die Falle ein sie Die Ionen treten in die Falle ein, sie zirkulieren auf 3‐dimensionalen, stabilen Bahnen innerhalb des Elektrodenraums.

Zur Detektion werden die Ionen nacheinander (die kleineren zuerst) durch Anlegen einer zusätzlichen Wechselspannung auf den Endkappen p g ppinstabil gemacht und aus der Ionenfalle durch eine Öffnung auf den Detektor „geschossen“ => der zugehörige Ionenstrom wird gemessen.

Ein Fang‐und Messzyklus dauert in etwa 300ms!

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Die besprochenen Ionisierungstechniken sind meist sehr schonend, deshalb entstehen bei der Ionisierung keine Fragmente

Tandem‐Massenspektrometrie (MS/MS)

entstehen bei der Ionisierung keine Fragmente.

Information über die Struktur des Moleküls:=> Molekül zur Fragmentierung anregen=> Tandem Massenspektrometer

2‐stufige Massenanalyse:1.) Ionensorte wird aus einer Mischung ausgewählt2.) Fragmente werden analysiert (entstehen durch Stoß mit Inert‐Gasmolekülen (Helium oder Argon)

Um die Selektivität zu erhöhen kann man zwei Massenspektrometer hintereinander schalten (Tandem MS). Zwischen den beiden Analysatorenwird eine sogenannte Kollisionszelle eingebaut Dadurch bekommen die


wird eine sogenannte Kollisionszelle eingebaut. Dadurch bekommen die Ionen durch ein Inertgas zusätzlich Energie und zerfallen zu spezifischen anderen, leichteren Ionen.

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Die zu bestimmende Probe wird im ersten Massenspektrometer mit Hilfe von EI oder CI ionisiert. Dabei entsteht eine sehr große Anzahl verschiedener Ionen, von denen jene Masse im ersten Massenspektrometer (manchmal auch Massenfilter genannt) ausgewählt wird, die die substanzspezifischen


g g , pIonen enthält. Die ausgewählten Ionen werden dann in eine Stoßkammer geleitet, wo sie mit einem neutralen Gas (in der Regel Argon) zusammenstoßen und weiter zerfallen. Diese Zerfallsprodukte werden im nachgeschalteten zweiten Spektrometer weiter aufgetrennt und registriert.


Man kann nun die beiden Massenspektrometer in unterschiedlicher Weise koppeln, so dass man verschiedene Scans bekommt:

Daughter Scan (oder product‐ion scan): Hier werden alle Tochterionen eines Mutterions registriert. Dieser Scan ist der am meisten bekannte Scan, bei dem das erste MS fix auf eine Masse eingestellt ist und das zweite MS den Bereich bis zur Muttermasse abscannt.

Parent Scan (oder precursor‐ion scan): Dabei wird das erste MS gescannt während das zweite auf einer fixen Masse steht. Dadurch werden alle für ein bestimmtes Tochterion in Frage kommenden Mutterionen registriert. Die Darstellung des Spektrums erfolgt so, dass man auf der x‐Achse die Masse des Mutterions aufträgt.

Neutral Loss Scan:Tochterionen, die durch Abspaltung eines bestimmten Neutral‐teilchens entstehen, werden registriert; Im Spektrum wird wieder die Masse des Vorläuferions angezeigt

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Flugzeit‐Massenspektrometer (time of flight –TOF)

Ein Flugzeitmassenspektrometer (engl. time of flight ‐TOF) basiert auf der Tatsache, dass Teilchen gleicher kinetischer Energie mit unterschiedlicher Geschwindigkeit fliegen, wenn sie unterschiedliche Masse aufweisen.

Beschleunigt man Ionen in einem elektrischen Feld mit der Spannung V so haben die Ionen beim Verlassen des Feldes die kinetische Energie q∙V (q ist die Ladung eines Ions), die gleich ½∙m∙v2 sein muss:und daraus

m = Masse des Teilchens v = Geschwindigkeit des Teilchens V = Feldspannung q = Ladung des Teilchens t = Flugzeit L = Länge der Flugbahn


Die Hauptvorteile liegen:p g

• im großen Massenbereich• alle Ionen werden gleichzeitig gemessen (kann allerdings

auch ein Nachteil sein)• => sehr schnelle Messungen möglich• hohe Massengenauigkeit (1‐5ppm)

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LC MS


Interface

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MALDI–TOF

Hauptsächlich für Transkriptom und Proteom‐Analysen

I MS M d fi d k i b i h iIm MS Mode findet keine, bzw. nur eine sehr geringeFragmentierung statt; vergleichbar mit ESI‐TOF

Unselektives Fragmentieren

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Was wird nun tatsächlich gemessen:

Ein Massenspektrum ist eine zweidimensionale Darstellung von Ionenhäufigkeitvs Ionenmasse zu Ladungs‐Verhältnis (m/z) Die bei der Ionisierung einer Substanzvs. Ionenmasse zu Ladungs Verhältnis (m/z). Die bei der Ionisierung einer Substanzerzeugten Ionen werden entweder gleichzeitig oder zeitlich nacheinander registriert.Die jeweilige Intensität wird aus der Fläche oder der Höhe der Signale, dersog. Peaks, ermittelt und normalerweise auf den Signalstärksten Peak im Spektrum,den sog. Basispeak (base peak) normiert (rel. Int. %).

Massenspektren werden sowohl als Strichspektren, oder als Profilspektren (Peakform)dargestellt.

Zusätzlich können beliebige Spuren einer Masse mitgemessen werden, z.B.: m/z 440,m/z 444, etc. Achtung: gemessen wird entweder im positiven, oder im negativen Mode, d.h. die Masse erhöht sich (M+H), oder verringert sich (M‐H) um eine Ladungseinheit.

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Fragmentierung

Unter Fragmentierung versteht man einen Prozess, bei dem in der Kollisionszelle eine relativ hohe Energie angelegt wird, beider die Moleküle (Mutterionen) spezifisch zerfallen (Tochterionen).

Das Muster der Fragmentierung ist für jedes Molekül charakteristisch und kannals Fingerprint einer Verbindung angesehen werden.

i Fragmentierung:

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Fragmentierung

Fragmentierung am Beispiel Koffein: m/z 194 (M+)

Fragmentierung

Fragmentierung am Beispiel Folsäure: m/z 444 (M‐)

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Fragmentierung

Fragmentierungsmuster der Tetrahydrofolsäure m/z 444

Mutterion: 5‐MTHF (m/z): 444 (M‐)Tochterionen: m/z 315.1167

m/z 400.1707

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PROBENVORBEREITUNG UND UMGANG MIT BIOLOGISCHEN MATERIALIEN

Blutabnahme und ‐aufarbeitung

• Für größere Mengen an Blut:

• Venipunktion (einmalig) oderK th d ( fl )• Katheder (venflow)

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Blutabnahme und ‐aufarbeitung

• Für größere Mengen an Blut: • Venipunktion (einmalig) oder• Katheder (venflow)• Katheder (venflow)

• Für kleinere Mengen:• Kapillarblut (aus der Fingerspitze)

Probennahme: Blut ‐Gerinnungshemmung

• Heparinplasma (Li‐Heparin)• EDTA‐Plasma (K2EDTA)• Zitrat‐Plasma (3.8% Zitronensäure)

• Serum mit/ohne Trenngel

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Probennahme: Separation von Plasma und Erythrozyten

• Zentrifugation (bei relativ niedriger g‐Zahl)• Eventuell Waschen• Weitere Auftrennung (Differential(ultra)zentrifugation)(Differential(ultra)zentrifugation)

Probenaufbereitung: Plasma

7 min am Rotationsver-

Probennahme: Separation von Plasma und Erythrozyten

20 - 150 µlHexan(3 ml)

dampfer (38-40°C/150 mb) Teil

Ethanol(Proteinfällung)

HPLC-Fließmittel

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Probennahme: Auftrennung der Lipoproteine

• Differential(ultra)zentrifugation

Plasma VLDL

(Ch)

NaBr-Lösung

LDL

HDL

Unter dem Begriff Probenvorbereitung

Probenvorbereitung

Probenvorbereitung werden Analysenschritte zusammengefasst, die notwendig sind, um mit dem vorgesehenen Messverfahren richtige Ergebnisse erzielen zu können.

Man unterscheidet „directprocedures“ und „multi stage procedures“

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S l l ik

Probenvorbereitung

1. Spurenelementanalytik

2. Festphasenextraktion (solid phase extraction, SPE) in Hinblick auf LC/MS Analysen

3. Biologische Materialien

4. Probenvorbereitung für die LC/MS‐Analyse


Trockene Veraschung:

Proben werden in geeigneten Gefäßen (Porzellan, Platin) unter Hitzezufuhr (500‐1000°C) verascht

Zur Bestimmung des Aschegehalts (Differenzwägung)

Zur Bestimmung von Mengenelementen (Na, K, Ca, Mg)

U i fü di A l flü h i Ungeeignet für die Analyse von flüchtigen Spurenelementen (J, Se)

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Trockene Veraschung:

Muffelofen


Nasse Veraschung:

Proben werden unter Zugabe eines Oxidationsmittels verascht (in der Regel eine Mischung aus H2O2 und HNO3)

Aufschluss erfolgt durch Erhitzung in der Mikrowelle oder unter Hochdruckoder unter Hochdruck

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Nasse Veraschung:

Mikrowellen‐aufschlussgerät


Nasse Veraschung:

Rotoren und Reaktionsgefäße für Mikrowellenaufschluß

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Nasse Veraschung:

Hochdruck‐aufschlussgerät

Probenvorbereitung für spezielle chemische Anforderungen:

PFA (Perfl oralko trade name Teflon)


PFA (Perfluoralkoxy; trade name: Teflon)

• Hochreines Polymer (Herstellung erfolgt unter Ausschlussvon Weichmachern und Füllstoffen)

• sehr gute chemische Beständigkeit gegen fast alle Chemikalien• hohe thermische Stabilität von ‐270°C bis +250°C• extrem glatte Oberflächen herstellbar ‐> leicht zu reinigen‐> keine memory Effektey

• autoklavierbar und sterilisierbar

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Säure Ausdämpf Apparatur: zur Reinigung und Vorbereitungvon Probengefäßen in der Ultra‐Spurenanalytik


Vessel Cleaner (Reinigung von Mikrowellengefäßen)

Säurereinigung

Vessel Cleaner (Reinigung von Mikrowellengefäßen)


How does it work?Vapor rises from the bath and condenses on the vessels; droplets carrying impurities and return to the acid bath.

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Säurereinigung: sub‐boiling Reinigung für Säuren (HNO3, HCl) oder H2O


S l l ik

Probenvorbereitung





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Principles of SPE

2. Festphasenextraktion

SPE is an extraction process whereby an aqueous sample is

filtered filtered through a thin bed of sorbent particles, the analytes of

interest are removedremoved from the liquid matrix, and concentratedconcentrated

onto the sorbent.

Once concentrated, the analytes are removedremoved by an eluting

solvent.

SPE Column


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What are the Benefits of SPE?


What are the Benefits of SPE?

SPE uses less solvent than LLE

SPE is faster (at least 5 times)

High capacity

Total SPE costs are considerably less than LLE

High selectivity: broad choice of bonded phases and solvents

Automation much easier

Silicagel‐Phases


Reversed Phase

C18

Adsorption

Si‐OH

Normal Phase

NH2

CNC‐OH(OH)

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Anion Exchange

N+

Phases:


N+

NH2

Cation Exchange

C6H5‐SO3H

COOH

SO3H

BiochromatographyBiochromatography

WP PEI (NH2)

WP Butyl (C4)

WP CBX (COO)

SephadexG‐25

4 Steps in


4 Steps in SPE

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O li SPE LC Online SPE‐LC

S l l ik

Probenvorbereitung





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3. Probenvorbereitung: biologische Materialien

Biologische Materialien:Gewebeproben, Vollblut, Plasma, Erythrozyten, Urinp , , , y y ,

Homogenisieren:MörserMixerLyseN2 (flüssig Stickstoff)Glass BeadsMühlen

Gewebehomogenisierung

Potter ElvehjemHomogenisator

Ultraschall‐homogeni‐sator

Blender Hochleistungs‐homogenisator

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3. Probenvorbereitung: biologische Materialien

Lösen fester Bestandteile:

ProteinfällungFettextraktionFiltrationZentrifugationSPE

S l l ik

Probenvorbereitung





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Welche Probenvorbereitung ist die richtige?


Welche Probenvorbereitung ist die richtige?

Manuell oder automatisch?

On‐line oder off‐line?

Verdünnen oder Aufkonzentrieren?

Warum Probenvorbereitung?


Warum Probenvorbereitung?

Minimierung der Matrixeffekte

Eliminierung von Störsubstanzen

Aufkonzentrieren des Analyten

Verdünnen des Analyten

Belastung des LC/MS‐Systems wird verringert (geringere Kosten in der Erhaltung)

Genauere Ergebnisse

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Manuelle oder automatisierte Probenvorbereitung ?


Automatisierung


Probenvorbereitung: off‐line‐ SPE‐ LLE‐Manuell oder automatisiert

Probenvorbereitung: on‐lineProbenvorbereitung: on‐line‐ SPE ‐mehrdimensionale SPE ‐ Säulenschaltung

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Proteinfällung

l


Vorteile:

hohe Wiederfindungsrate bei geeignetem Fällungsreagenz

universell einsetzbar

schnell durchführbar

geringe Fehlerquellen, da keine komplizierten Bauteile oder Schaltungen verwendet werden

Nachteile:

schwer automatisierbar

Ionische Matrix bleibt erhalten ‐> Belastung des LC/MS Systems

Verdünnen (DiluteandShoot)

Vorteile:


Vorteile:

Alle Komponenten bleiben für die Messung erhalten (Analyt und Matrix!)

geringer Aufwand für die Probenvorbereitung

leicht automatisierbar

kostengünstig

Nachteile:

Die Matrix muss chromatographisch abgetrennt werden

Belastung der analytischen Säule und des MS mit der Matrix

hohe Empfindlichkeit des MS erforderlich

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Vorteile:


Festphasenextraktion

Vorteile:

leicht automatisierbar

direktes Einsetzen der Probe beim on‐line Betrieb

Abtrennung der Matrix

Nachteile:

schlechte Wiederfindungsrate bei polaren Analyten

hoher Zeitaufwand beim Einengen des Eluates hoher Zeitaufwand beim Einengen des Eluates

Kosten für die Kartuschen (Einmalkartuschen)

höherer Zeitaufwand für die Methodenentwicklung als bei der Proteinfällung

nicht universell einsetzbar

Flüssig‐Flüssig‐Extraktion (LLE)

V t il


Vorteile:

kostengünstiger als SPE

schnelleres Einengen des Eluates als bei der SPE

Matrix wird abgetrennt

Nachteile:

schlechter automatisierbar als SPE

schlechte Wiederfindungsrate bei polaren Analyten

nicht universell einsetzbar

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