Kultivierung von E. coli HisN-GatDH und Rhodobacter sphaeroides D

im Fermenter zur Produktion von Galaktitol-Dehydrogenase

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- 2 -

Einleitung:

Die Synthese optisch aktiver Alkohole gewinnt auf Grund der spezifischen, chiralen Eigenschaften dieser

Alkohole zunehmend an Bedeutung. Verwendet werden können sie als Ausgangssubstanzen (chiral building

blocks) für Synthesen von Pharmazeutika, Pheromonen und Pestiziden. Die biologische Aktivität solcher

Verbindungen hängt von ihrer Konfiguration ab, weshalb die richtige chirale Verbindung als Ausgangssubstrat

zur Synthese von entscheidender Bedeutung ist.

Rhodobacter sphaeroides D bildet neben anderen Dehydrogenasen auch Galaktitol-Dehydrogenase (GatDH), ein

Enzym mit breiter Subtratspezifität, das neben der Galaktitol-Oxidation auch eine Reihe von Hydroxyketonen zu

weitgehend enantiomerenreinen zweiwertigen Alkoholen reduziert.

Im Versuch soll die Herstellung von 1,2-Propandiol aus 1-Hydroxy-2-Propanon durchgeführt werden. Dabei wird NADH2 zu NAD oxidiert. Als Regenerationssystem verwendet man die Formiatdehydrogenase, die aus

Formiat unter NAD-Reduktion CO2 bildet. Das Regenerationssystem hat drei Vorteile: a) Formiat ist billig, b)

FDH ist preiswert und c) das CO2 verschwindet als Gas aus der Lösung und vermeidet so eine

Endprodukthemmung der Reaktion.

Für die Bereitstellung der GatDH zu Produktionszwecken werden Enzympräparationen aus Fermenter-Kulturen

von Rhodobacter sphaeroides D und E. coli HisN-GatDH hergestellt. In den E. coli Stamm BL21(DE3)Gold

wurde ein GatDH-Gen mit einem N-terminalen His6-Tag einkloniert, um eine höhere Enzymproduktion bei

erleichterter Reinigung zu erzielen.

NAD NADH2O

HOHO

OH

OH

OH

OHHOHO

OH

OH

OH

Galaktitol L-Tagatose

Galaktitol-DH

OHC

CC

HOH

OHC

CC

O

NADH + H+ NAD +

1-Hydroxy-2-Propanon (Hydroxyaceton)

1,2-(S)-Propandiol

GatDH

pH 6,5

- 3 -

Exponentielles Wachstum einer Kultur

Das Wachstum einer Bakterien- oder Hefekultur verläuft nicht linear, sondern die Anzahl und Biomasse der

Mikroorganismen nehmen exponentiell zu, nämlich mit jeder Generation um den Faktor zwei (21, 22,...). Dabei

entstehen innerhalb von 10 Generationen aus einer Zelle etwa 1000 (210 = 1024) Nachkommen, innerhalb von 20

Generationen etwa 1 Million usw. Tatsächlich wird das Wachstum fast immer und schnell durch Mangel an

Nährstoffen begrenzt. Normalerweise teilen sich die Zellen in einer Kultur nicht synchron. Das heißt, die

Zellzahl nimmt nicht ruckartig entsprechend den Zweierpotenzen zu, sondern kontinuierlich.

Ganz sicher gilt dieses für den Zuwachs an Biomasse (meist als Trockenmasse bestimmt), Protein oder gebildete

Produkte, denn die Zellen wachsen, bevor sie sich teilen. Neugebildete Enzyme erhöhen sofort die

Stoffwechselaktivität und damit den zweiten Zuwachs. Bei unendlich kurzen Zeitabständen würde als

Zuwachsfaktor die natürliche Zahl e = 2.718... erreicht, die zur Beschreibung von exponentiellen

Wachstumsprozessen oft benötigt wird (oft in Form des natürlichen Logarithmus zur Basis e: loge = ln, wobei

gilt: ln e = 1).

Die mathematische Beschreibung von Wachstumsprozessen ist einfach. Der momentane Zuwachs an x

(Biomasse, Protein etc.) zu einem Zeitpunkt t wird geschrieben als dx/dt und hängt ab von der aktuellen

vorhandenen Menge an x und der Wachstumsrate µ. Er wird beschrieben durch:

dx/dt = µ x [1] Integriert über einen größeren Zeitraum von t0 bis t (Kontostand nach einiger Zeit) ergibt sich unter Verwendung des natürlichen Logarithmus: ln(xt) = ln(x0) + µ (t-t0) [2] bzw. In exponentieller Schreibweise : xt = x0

. e µ(t-t0) [3]

- 4 -

Abbildung 2: Wachstumskurve einer Batch-Kultur

Will man aus einem gemessenen Zuwachs die Wachstumsrate bestimmen, kann die logarithmische Form der Gleichung folgendermaßen umgeformt werden: ln(xt/x0) ln(xt) – ln (x0) µ = _____________ = ___________________ t – t0 t – t0 [4] Für die Verdopplungszeit td (die Zeit t – t0, für die xt/x0 = 2 ist) ergibt sich einfach: ln 2 µ = __________

td [5] bzw. ln 2 td = __________

µ [6]

Wachstumskurve

Zeitachse (linear)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Mes

swer

te (

loga

rith

mis

ch)

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

2

3

4

5

6

7

8

9

0.1

1

10

xt

x0

t0 t

µ =ln xt - ln x0

t - t0

Anlauf- (lag)

Phase

logarithmische (log)

Phase

stationäre

Phase

Absterbe-

Phase

- 5 -

Als Ertrag kann die Biomasse, die Produktmenge oder in diesem Fall die Gesamtunits an GatDH aus dieser Fermentation angegeben werden.

Der Ertragskoeffizient ergibt sich dann aus erhaltenem Produkt pro eingesetztem Substrat, d.h. Units GatDH

pro g verbrauchtem Malat.

Aufgabe:

In einem Fermenter wird Rhodobacter sphaeroides D kultiviert und dabei die Wachstumsrate, die

Verdopplungszeit und die Gesamtaktivität (Ausbeute/Ertrag) bestimmt. Daneben werden die Substratabnahme,

die Bakterienmasse und die Entwicklung der Galaktitol-Dehydrogenase-Aktivität gemessen und in der

Auswertung die Wachstumsrate, die Verdopplungszeit und der Ertragskoeffizient bestimmt. Die Galaktitol-

Dehydrogenase wird im Rohektrakt für die Produktion von 1,2-(S)-Propandiol eingesetzt.

Vorbereitung:

Die Praktikanten sollen sich anhand der angegebenen Literatur über das Funktionsprinzip von Fermentern, das

bakterielle Wachstum und die Galaktitol-Dehydrogenase informieren.

Literatur:

Madigan, M.T., Martinko, J.M., Stahl, D.A., Clark, D.P. (2013) Brock Mikrobiologie, Pearson, San

Francisco, CA, USA

Fuchs, G. (Hrsg.) („Schlegel“) (2007) Allgemeine Mikrobiologie, Thieme Verlag, Stuttgart

Cypionka, H. (2010) Grundlagen der Mikrobiologie, Springer Verlag, Berlin

Fiechter, A. (1981) Batch and continuous culture of microbial, plant and animal cells. in: Rehm, H.J., Reed, G.

(Hrsg.): Biotechnology, Vol 1, pp. 453-505, Verlag Chemie, Weinheim F1 35.1

Clark, D.P., Pazdernik, N.J. (2009) Molekulare Biotechnologie, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg

Rennberg, R., (2010) Biotechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg

Antranikian, G. (Hrsg.) (2006), Angewandte Mikrobiologie, Springer Verlag, Berlin

Hass, V.C., Pörtner, R. (2009), Praxis der Bioprozesstechnik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg

Czichos, J. (2004) What's so funny about microbiology, http://www.joachim-czichos.de/

Schneider, K.H., Jäkel, G., Hoffmann, F. und Giffhorn, F. (1995) Enzyme evolution in Rhodobacter

sphaeroides: selection of a mutant expressing a new galactitol dehydrogenase and biochemical characterization

of the enzyme. Microbiology, 141, 1865-1873.

Huwig, A., S. Emmel, G. Jakel, and F. Giffhorn. (1997) Enzymatic synthesis of L-tagatose from galactitol

with galactitol dehydrogenase from Rhodobacter sphaeroides D. Carbohydrate Research 305, 337-339.

Kohring, G.-W., P. Wiehr, M. Jeworski, and F. Giffhorn. (2003). Stereoselective oxidation of aliphatic diols

and reduction of hydroxy-ketones with galactitol dehydrogenase from Rhodobacter sphaeroides D. Commun

Agric Appl Biol Sci. 68, 309-312.

Carius, Y., Christian, H., Faust, A., Zander, U., Klink, B.J., Kornberger, P., Kohring, G.W., Giffhorn, F.,

Scheidig, A.J. (2010) Insight into substrate differentiation of the sugar metabolising enzyme galactitol

dehydrogenase from Rhodobacter sphaeroides D based on the crystal structures of free and substrate bound

enzyme, J. Biol. Chem. 285, 20006-20014

Schmidt, F.R. (2005) Optimization and scale up of industrial fermentation processes. Appl. Microbiol.

Biotechnol. 68, 425–435.

- 6 -

Durchführung Vorbereitung:

Der Bioreaktor wird zusammengebaut, mit 1500 ml Nährmedium befüllt und 45 min bei 121°C autoklaviert.

Desweiteren müssen autoklaviert werden:

- ein in Alufolie eingewickelter Trichter zum Animpfen

- drei 500 ml Erlenmeyerkolben zur Probennahme für die Trockengewichts-, Protein-

und GatDH-Bestimmung

Vorkultur:

Die Vorkultur wurde mit einer Einzelkolonie des jeweiligen Stammes beimpft und 24 h auf dem Schüttler

inkubiert. Sie wird im Praktikum von den Betreuern zur Verfügung gestellt.

Kultivierung im Chemostaten (1. Woche E. coli, 2. Woche Rhodobacter):

Kultivierungsbedingungen: Temperatur: E. coli: 28°C,

Rhodobacter: 28°C

Rührerdrehzahl: E. coli: 800 Upm

Rhodobacter: 600 Upm

Belüftung: 2 vvm (Einstellung „3“ am Rotameter bei 1,5 l Volumen)

(vvm: Volumen Luft x Volumen Flüssigkeit-1 x Minute-1)

pH-Kontrolle

(Antischaum-Kontrolle)

Der Fermenter wird nach dem Zeitplan angeimpft und entsprechende Proben gezogen. Isopropylthiogalactosid

(IPTG) nach Zeitplan zur Induktion der GatDH-Bildung in E. coli zugeben. Für die Trockengewichts-

bestimmung werden zunächst 30 ml Kultur und später, wenn die Kultur dicht gewachsen ist, entsprechend

weniger Volumen über einen Filter abgesaugt. Für die O.D.- und Malatbestimmung (Rhodobacter) werden 2 ml

gebraucht: 1 ml zur Extinktionsmessung und 1 ml wird in Reaktionsgefäßen abzentrifugiert. Der Überstand wird

wie beschrieben behandelt und für die spätere Malatbestimmung (Rhodobacter) eingefroren. Eine Probe von 50

ml wird für die GatDH-Aktivitätsuntersuchung genommen, abzentrifugiert und das Pellet eingefroren. Nach 24 h

wird der Fermenter abgeerntet und das gewaschene Pellet aufgeschlossen oder eingefroren. (Das Volumen für

den Aufschluss wird vom Betreuer angegeben.)

Die eingefrorenen Pellets aus der Wachstumskurve werden aufgeschlossen und anschließend die GatDH-

Aktivität und der Proteingehalt für die Entwicklung der Volumen- und spezifischen Aktivität bestimmt. Die

geernteten Zellen nach Abschluss der Fermentation werden aufgeschlossen und die GatDH gereinigt. Mit der

Enzympräparation wird die Reduktion von Hydroxyaceton und/oder 1-Hydroxy-2-Butanon durchgeführt.

Auswertung Das Protokoll sollte im Stil von Veröffentlichungen in FEMS Microbiol. Lett. (jedoch in

deutscher Sprache) geschrieben werden und folgende Daten enthalten: - Wachstumskurve, bei der die OD650, das Trockengewicht, die Malatkonzentration (Rhodobacter) und die

GatDH Volumenaktivität halblogarithmisch gegen die Zeit aufgetragen werden

- Alle Meßwerte und die daraus berechneten Ergebnisse, wie Wachstumsrate, Verdopplungszeit, Ertrag,

Ertragskoeffizient (für Bakterienmasse und GatDH-Aktivität)

- Grafik der Fermentationswerte aus der Iris-Datei

- GatDH-Aufreinigungstabelle und SDS-Gel für Reinheitskontrolle

- HPLC- und GC-Daten der 1-Hydroxy-2-Propanon Reduktion.

Abstract = Zusammenfassung der Ergebnisse, Einleitung = Theoretischer Hintergrund mit Literaturzitaten,

Material und Methoden: nur Änderungen gegenüber dem Script, Ergebnisse: Text, Tabellen und Grafiken,

Diskussion = Würdigung der Ergebnisse vor dem Hintergrund der Literatur mit Zitaten, Literaturverzeichnis)

- 7 -

Methoden

Nährmedium (Rhodobacter Fermentation):

Malat 9.0 g KH2PO4 1.0 g

NH4Cl 1.0 g

MgSO4*7H2O 0.4 g

NaCl 0.4 g CaCl2*2H2O (autoklavierte Stammlösung) 0.05 g

Spurenelementlösung SL4 1.0 ml

Vitaminlösung 1.0 ml H2O dest ad 1000.0 ml pH 6.8

Antischaum wird zu titriert (poly-1,2-Propandiol in Ethanol, 1:50)

Spurenelementlösung SL 4 (PFENNIG und LIPPERT, 1966; 10-fach konzentriert)

EDTA 5,0 g FeSO4 x 7 H2Odeion 2,0 g

ZnSO4 x 7 H2Odeion 0,1 g

MnCl2 x 4 H2Odeion 0,03 g

H3BO3 0,3 g

CoCl2 x 6 H2Odeion 0,2 g

CuCl2 x 2 H2Odeion 0,01 g

NiCl2 x 5 H2Odeion 0,02 g

Na2MoO4 x 2 H2Odeion 0,03 g

Vitaminlösung (SCHLEGEL, 1985; 10-fach konzentriert)

Biotin 2 mg

Nicotinsäure 20 mg

Thiamin 10 mg

4-Aminobenzoesäure 10 mg

Pantothenat 5 mg

Pyridoxamin 50 mg

Cyanocobalamin 20 mg H2Odeion ad 100 ml

Die Vitaminlösung wird unmittelbar nach der Herstellung sterilfiltriert und anschließend bei 4° C aufbewahrt.

Messung der Bakterienmasse: Die Entwicklung der Bakterienmasse im Bioreaktor wird durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm (E.

coli) oder bei 650 nm (Rhodobacter) verfolgt (1 ml Proben). Die Messung erfolgt gegen steriles Medium. Die

Bakteriensuspension muss gegebenenfalls soweit verdünnt werden, dass die optische Dichte unter 0.3 liegt.

Trockengewichtsbestimmung:

Membranfilter (Porengröße: 0.45 µm) werden über Nacht im Trockenschrank getrocknet und anschließend

ausgewogen. Die Filter werden in die Filtrierapparatur montiert und 30 ml (bei gut gewachsener Kultur

10-5 ml) Bakteriensuspension filtriert. Es wird mit ca 20 ml dest. Wasser gewaschen, ein erkennbares Filtrat

muss vorhanden sein. Anschließend werden die Filter über Nacht im Trockenschrank getrocknet und danach

ausgewogen. Kontrolle: 20 ml dest. Wasser filtrieren.

- 8 -

Bestimmung der Malatkonzentration:

Zur Bestimmung der Malatkonzentration werden 1 ml Proben aus dem Bioreaktor bei 13000 x g in

Reaktionsgefäßen abzentrifugiert und anschließend durch eine Membran mit einer Ausschlussgröße von 10.000

Dalton zentrifugiert, um die Proteine weitgehend abzutrennen. Die gereinigte Probe kann eingefroren oder sofort

mit der HPLC (siehe unten) analysiert werden.

Zellaufschluss für geerntetes Pellet:

Zellaufschluss E. coli:

- Geerntete Zellen 2 x waschen:

- Pellets in 100 ml 20 mM BisTris-Puffer, 25 mM Imidazol (pH 6,5) resuspendieren

15 min bei 5500 x g und 4°C abzentrifugieren

- Pellets in 30 ml 20 mM BisTris-Puffer, 25 mM Imidazol (pH 6,5) resuspendieren,

gelöstes Pellet in 50 ml Falcon geben.

15 min bei 5000 x g, 4°C zentrifugieren

- Pellets wiegen und in 5 ml/g feuchte Zellen 20 mM BisTris-Puffer, 25 mM Imidazol

(pH 6,5) erneut resuspendieren, 1 Spatelspitze DNase zugeben.

- Zellen im Ultraschall (6 x 15 s, 22 Micron mit Zwischenkühlung) aufschließen.

- Zelltrümmer durch 10 minütige Zentrifugation bei 4°C, 13.000 x g abtrennen.

- Rohextrakt abnehmen und erneute 10 min bei 13.000 x g und 4°C in Eppis zentrifugieren.

Gesamtvolumen bestimmen, 100 µl vom Rohextrakt für Aktivitätstest + SDS entnehmen,

Pellet-Probe aufheben

Zellaufschluss Rhodobacter:

Die geernteten Zellen werden zweimal mit 0,02 M Bis-Tris-Puffer, pH 6,5; 1 mM MgCl2 gewaschen und danach

in diesem (3 ml/g feuchte Zellen) resuspendiert. Die Zellen werden in einer vorgekühlten French-Presse (Fa.

SLM Insuments, Inc., Urbana, USA) bei 1100 N/cm2 im zweifachen Durchlauf oder im Ultraschall (6 x 1 min,

22 Micron, mit Zwischenkühlung) aufgeschlossen. Die Zelltrümmer aus den GatDH-Proben der

Wachstumskurve werden bei 13.000 x g in Reaktionsgefäßen abzentrifugiert (10 min bei 4 °C; Biofuge, Fa.

Heraeus sepatech, Osterode). Der Rohextrakt aus der Fermenterernte wird in Falconröhrchen mit 9.000 x g

abzentrifugiert (10 min bei 4°C, Sorvall Evolution RC).

3.3.2.8 SDS-PAGE

Gelelektrophoretische Untersuchungen können zur Reinheitskontrolle des aufgereinigten Enzyms durchgeführt

werden. Die Anzahl der Banden im Gel gibt Aufschluss über den erzielten Reinheitsgrad während des

Reinigungsverfahrens. Von den Proben aller wesentlichen Aufreinigungsschritte sollen die Proteine

elektrophoretisch aufgetrennt und mit Serva Blau angefärbt werden. Das Gel zeigt das Verschwinden von

Fremdproteinen im Laufe der Aufreinigung.

Folgende Stammlösungen werden angesetzt:

Lösung A: Acrylamidstammlösung (zur Verfügung gestellt)

Acrylamid 40,0 g

N,N'-Methylen-Bisacrylamid 0,6 g H2Odeionisiert ad 100 ml

Lösung B: Trenngelpuffer (entgasen)

Tris 18,2 g

SDS 0,4 g H2Odeionisiert ad 100 ml

pH8,7

- 9 -

Lösung C: Sammelgelpuffer (entgasen)

Tris 3,0 g

SDS 0,2 g H2Odeionisiert ad 100 ml

pH6,8

Lösung D (immer frisch ansetzen)

Ammoniumpersulfat 0,1 g H2Odeionisiert ad 1,0 ml

Lösung E: Elektrodenpuffer

Laufpuffer

Tris 3 g

Glycin 14,4g

SDS 1 g H2Odeionisiert ad 1000 ml

Lösung F: H2Odeionisiert 3,55 ml

Tris-HCl 0,5 M, pH6,8 1,25 ml

SDS 10% 2,0 ml

Glycerin 2,5 ml

Bromphenolblau 0,5% 0,2 ml

In einer MiniproteanTM-Plattenelektrophoreseapparatur mit einem Plattengel-Gießstand (Fa. Bio-Rad) werden

zwei Gele der Dimension 10 cm * 7 cm * 1 mm (Volumen für das Trenngel beträgt 4 ml) gleichzeitig gegossen

(unter Anleitung). Nach dem Polymerisieren werden diese Gele jeweils mit einem Sammelgel überschichtet, in

das der Kamm eingesetzt wird.

Trenngelzusammensetzung (10%):

Lösung A 2,5 ml

Lösung B 2,5 ml

H2O 5,0 ml

Lösung D 50 µl

TEMED 5,0 µl

Sammelgelzusammensetzung (5%):

Lösung A 1,25 ml

Lösung C 2,5 ml

H2O 6,25 ml

Lösung D 50 µl

TEMED 10 µl

Das Trenngel wird gegossen und vorsichtig mit Isopropanol überschichtet. Nach dem Erstarren (ca. 45 min) wird

das Isopropanol abgegossen und das Sammelgel auf das Trenngel gegossen. Den Kamm einsetzen und erstarren

lassen (ca. 25 min).

Nachdem das Gel in die Elektrophorese-Apparatur eingespannt wurde, und der Puffer eingefüllt wurde, kann der

Kamm vorsichtig entfernt werden.

- 10 -

950 µl Lösung F + 50 µl ß-Mercaptoethanol mischen. Die aufzutragende Proteinlösung (5 -25 µl) wird mit der

doppelten Menge dieser Mischung versetzt und 10 min im Thermoblock gekocht. Anschließend werden die

Proben und gleich behandelte Eichproteine in die Geltaschen gefüllt und die Elektrophorese gestartet (10

mA/Gel). Wenn die Bromphenolblaubande das Gelende erreicht hat, ist die Elektrophorese beendet. Die Platten

vorsichtig auseinander genommen, das Sammelgel entfernen und das Trenngel an einer Ecke markieren, damit

nach dem Färben eine eindeutige Zuordnung der Banden möglich ist.

Färbung der Proteinbanden in den Gelen durch die Ein-Schritt-Coomassie-Färbung:

Für diese Färbemethode müssen in jeder aufgetragenen Probe 20 µg Protein enthalten sein. Das Protein im Gel

wird gleichzeitig fixiert und gefärbt.

Benötigte Lösungen:

Fixierer: Methanol 300 ml

Essigsäure 75 ml H2Odest. 625 ml

Färbelösung: Coomassie Brillant Blue R-250 1% in H2Odest.

Durchführung: Die Coomassie-Lösung wird bis zu einer Endkonzentration von 0.0004 - 0,0008% zum Fixierer

hinzugegeben. Die Färbung der Proteinbanden erfolgt in dieser Lösung durch eine zweistündige Inkubation des

Gels in dieser Lösung, oder durch Behandlung in der Mikrowelle (3 x 30 sec mit 30 sec Intervallen). Danach

wird die Hintergrundfärbung im Fixierbad über Nacht ausgewaschen.

Galaktitol-Dehydrogenase-(GatDH) Aktivität:

Eine Probe von 50 ml wird für die GatDH-Aktivitätsuntersuchung genommen, abzentrifugiert und das Pellet

eingefroren. Nach Auftauen und Zellaufschluss erfolgt die Messung in Kunststoffküvetten mit 1 cm

Schichtdicke im Photometer bei 340 nm. Es wird die Extinktionzunahme durch NADH-Bildung gemessen, die

bei der Rückreaktion durch Oxidation des Diols entsteht.

Reaktionsansatz (1 ml) für Oxidationsreaktion:

Puffer (200 mM Bis-Tris, pH 9.0, 1mM MgCl2) 500 µl

NAD+-Lösung (90 mM Stammlösung in H2O) 20 µl

Rohextrakt 100 µl

H2O 280 µl

(R,S)-1,2Hexandiol (1 M Stammlösung) 100 µl

Katalytische Aktivität SI-Einheit: Katal (früher: Unit)

1 Katal ist als die Enzymmenge definiert, die einen Umsatz von 1 mol pro Sekunde katalysiert.

1 Unit entspricht der Enzymmenge, die einen Umsatz von 1 µmol pro Minute katalysiert.

Spezifische katalytische Aktivität

Einheit: Katal/g (Unit/mg)

Die spezifische Aktivität entspricht der auf den Proteingehalt bezogenen katalytischen Aktivität. Sie ist ein Maß

für die Reinheit der Enzympräparation.

- 11 -

Die Volumenaktivität U/ml wird nach folgender Formel berechnet:

E * VKüvette

U/ml = ______t_____________ E * Vk

* VProbe * d * t * Vp * d

E t-1: Extinktionsänderung min-1; : Extinktionskoeffizient; VKüvette: Gesamtvolumen der Küvette: 1 ml;

VProbe: Probevolumen: 0,1 ml; d: Schichtdicke der Küvette: 1 cm; NADH (340 nm) = 6,3 ml * µmol-1 * cm-1

Die spezifische Aktivität ist die Volumenaktivität dividiert durch den Proteingehalt [U/mg].

1-Hydroxy-2-Propanon oder 1-Hydroxy-2-Butanon Reduktionsaktivität der GatDH:

Die Reaktion wird im 5 ml-Ansatz bei 37°C auf einem Schüttler durchgeführt. Zu Beginn und am Ende der

Reaktion werden 100 µl Proben entnommen, zentrifugiert und mit der HPLC bestimmt. Nach 24 h wird der

Umsatz abzentrifugiert und anschließend ein Aliquot durch eine Membran mit einer Ausschlussgrösse von

10.000 Dalton zentrifugiert, um die Proteine weitgehend abzutrennen. Die gereinigte Probe kann mit der HPLC

analysiert werden.

Reaktionsansatz (5 ml):

1-Hydroxy-2-Propanon (Hydroxy-Aceton) 100 mM

(oder 1-Hydroxy-2-Butanon 100 mM)

Ammonium-Formiat 100 mM

FDH 4 U/ml

NAD 2 mM

NADH 0,1 mM Bistris-HCl, 1mM MgCl2, pH 6.5 100 mM

GatDH-Lösung nach Entsalzung 1 ml

(oder RE von R. sphaeroides mit Proteaseinhibitor 2 ml)

HPLC-Bestimmung:

Die Analytik von 1-Hydroxy-2-ketonen und 1,2-Diolen wird mit einer Ionen-Verteilungs-Chromatographie mit

H2O als Eluent durchgeführt. Die Säule (Nucleogel Sugar 810 Ca, 300 x 7,8 mm, Fa. Macherey & Nagel) wird

bei einer Temperatur von 80 °C gehalten und die Elution erfolgt bei einer Flußrate von 0,7 ml/min. Die

Detektion wird mit einem Brechungsindexdetektor (Wissenschaftlicher Gerätebau Dr. Ing. Knauer, Berlin)

durchgeführt, an den ein Integrator (Chromatopac C-R6, Fa. Shimadzu, Koyoto, Japan) angeschlossen ist.

Malat wird mit einer Protonenaustausch-Säule bestimmt (Eluent H2Odest + 5 mM H2SO4, Flußrate 0,5 ml/min).

Die Identifizierung der Substanzen erfolgt durch den Vergleich der Retentionszeiten und Konzentrationen

können nach Kalibrierung der HPLC bestimmt werden. Für Malat wird eine Kalibrierungskurve (1, 7, 15mg/ml)

aufgenommen, die Hydroxyketone und Diole werden qualitativ nach Retentionszeiten bestimmt.

Proteinbestimmung: Der Proteingehalt wird nach der Lowry-Methode bestimmt.

Reagenz A: 3 % Na2CO3 in 0,1 N NaOH 50,0 ml

1 % CuSO4 x 5 H20 1,0 ml

2 % K-Na-Tartrat 1,0 ml

Die Bestandteile werden kurz vor Gebrauch gemischt.

Reagenz B: 1 Teil Folin-Ciocalteus-Phenolreagenz mit 2 Teilen H2O mischen

=

- 12 -

Das Probevolumen (der Verdünnungen 1:10, 1:50) von 0,5 ml wird mit 2,5 ml Reagenz A versetzt. Nach 10 min

wird 0,25 ml Reagenz B hinzu gegeben und weitere 20 min inkubiert (jeweils gut mischen). Die Extinktion wird

bei 546 nm gegen den Leerwert gemessen, und eine Eichkurve wird im Bereich von 10 - 200 ug BSA/ml

aufgenommen (10, 25, 50, 100, 150, 200 µg/ml aus einer 1 mg/ml Stammlösung).

Aktivitätsberechnungen:

50 mL Probe, zentrifugieren+ 4 mL Aufschlußpuffer→ 4 mL Rohextrakt

Aktivitätsbestimmung U/mL0.1 mL RE/ KüvetteU/mL * 10 (* Verdünnung )  U/mL RE* 4  U pro 50 mL Kultur * 20 = U/L Kultur (Gesamtaktivität)

ProteinbestimmungVerdünnung 10x, 50x, 100x, 200xWenn 100x in der Eichkurve liegt:Bestimmte mg/mL * 100mg/ml RE

Spezifische Aktivität: U/mL RE

mg/mL RE= U/mg

- 13 -

Gesamtaktivität am Ende der Fermentation:

Ca. 1000 mL Probe, zentrifugieren+ 50mL Aufschlußpuffer→ 50mL Rohextrakt

Aktivitätsbestimmung U/mL0.1 ml RE/ KüvetteU/mL * 10 (* Verdünnung )  U/ml RE* 50 U pro 1000 mL Kultur (Gesamtaktivität)

ProteinbestimmungVerdünnung 10x, 50x, 100x, 200xWenn 100x in der Eichkurve liegt:Bestimmte mg/mL * 100mg/ml RE

Malat: 9 g/L ( 9 mg/mL); Ertrag: U/L pro verbrauchtem Malat g/L  U/g Malat

- 14 -

Zeitplan

1. Woche 2. Woche

Mo

Zusammenbau des Fermenters Medium herstellen Autoklavieren Lsg herstellen:

Lsg für GatDH-Test Lsg. für Ketonumsatz

Filterpapiere in TS Eichung Malat (2 Gruppen)

Mo

Zusammenbau des Fermenters Medium herstellen Autoklavieren Lsg herstellen:

Lsg für GatDH-Test Lsg. für Ketonumsatz

Filterpapiere in TS Eichung Malat (2 Gruppen)

Di

Filter wiegen

9°° Ferm. animpfen mit Rhodobacter (ohne O2-Regelung) [OD, Malat, GatDH, TG] 12°° [OD] 14°° [OD, Malat, GatDH] 1630 [OD, TG, GatDH, Malat, pH]

Eichung Malat (weitere Gruppe) TG Filter in TS

Di

Filter wiegen

9°° Ferm. animpfen mit Rhodobacter (ohne O2-Regelung) [OD, Malat, GatDH, TG] 12°° [OD] 14°° [OD, Malat, GatDH] 1630 [OD, TG, GatDH, Malat, pH]

Eichung Malat (weitere Gruppe) TG Filter in TS

Mi

10°° [OD, TG] 13°° [OD, Malat, TG, GatDH, pH]

Fermenter-Ernte, Aufschluß der Zellen Aktivitätsbestimmung HPLC-Messung Malatproben TG Filter in TS

Mi

10°° [OD, TG] 13°° [OD, Malat, TG, GatDH, pH]

Fermenter-Ernte, Aufschluß der Zellen Aktivitätsbestimmung HPLC-Messung Malatproben TG Filter in TS

Do

TG Filter wiegen Eichung für Keton Umsatz Ansatz für Keton Umsatz mit GatDH

und RE (mit Proteaseinhibitor) Proteineichgerade Proteinbestimmung

Do

TG Filter wiegen Eichung für Keton Umsatz Ansatz für Keton Umsatz mit GatDH

und RE (mit Proteaseinhibitor) Proteineichgerade Proteinbestimmung

Fr

Ernte Ketonumsatz HPLC Keton, Diol Gelelektrophorese

Fr

Ernte Ketonumsatz HPLC Keton, Diol Gelelektrophorese

- 15 -

Wachstum

OD (Zunahme)

Trockengewicht (Zunahme)

Malat-Konzentration (Abnahme)

GatDH-Aktivität (Oxidation von 1,2-Hexandiol) (Zunahme) Volumenaktivität (auf 1,5 l beziehen)

Proteinbestimmung spezifischen Aktivität

Ertragsbestimmung

Vergleich O2-Regelung

Fermenterernte und Zellaufschluss

Reinigung der GatDH (Aufreinigungstabelle und SDS-Gel) Hydroxyketonumsatz (Reduktion von 1-Hydroxy-2-Propanon zu S-1,2-Propandiol) Nachweis mit HPLC

GatDH-Produktion und Aktivität

- 16 -

Minifors Fermenter

Zuluft

Abluft

pO2-Elektrode

pH-Elektrode

Rotameter

Rührer

Pumpenköpfe

Vorrats- Flaschen

Probe- nahme

Temperaturfühler

- 17 -

- 18 -

Kurzanleitung Minifors (im Zweifelsfall Manual/Betreuer befragen!)

Zusammen- oder Abbau:

- Kabelverbindungen dürfen beim Schrauben nicht verdrillt oder geknickt werden (Zerstörung der Isolierung Crazy Data!)

- Pumpenköpfe vorsichtig aufsetzen und abnehmen (Einrasthebel zusammendrücken)

- Verbindung zum Antrieb hochklappen

- Schrauben am Heizblech lösen und Blech abnehmen

- Bei abgenommenen Kabeln, Pumpenköpfen, Luftleitungen und Wasserleitungen kann die Platte mit Fermenter und Vorratsflaschen nach oben von der Konsole genommen werden (der Einraststift am hinteren Blech muss aus der Verankerung gehoben werden)

- Drei Handschrauben am Deckel lösen und abnehmen

- Der Fermenterdeckel muss immer so auf dem Tisch liegen, dass die Rührwelle in die Luft zeigt!

- Gefäß kann entnommen, gereinigt oder mit Medium gefüllt werden

- Deckel wieder aufsetzen

- Alle Verbindungen nur mit der Hand anziehen (keine Werkzeuge!)

- Unter den Blindstopfen muss eine Dichtung sein

- pH Elektrode eichen und einbauen (siehe Seite 5)

- Antischaum Sonde (mit innen liegender Zudosierung), mit mindestens 1 cm Abstand zum oberen oder unteren Anschlag einbauen (sonst Kurzschluss und permanente Zudosierung)

- O2 Elektrode einbauen

- Vorratsflaschen füllen

- Probennehmer anbauen

- Zum Autoklavieren

- Zuluftschlauch mit kräftiger Metallklemme verschließen

- Alle Verbindungen zu Vorratsflaschen und Probennehmer verschließen

- Abluftleitung verschließen

- !!!!!! Einen Blindstopfen zum Druckausgleich öffnen !!!!!!!

- Rührwellenkopf mit neuer Alufolie abdecken (es darf keine Feuchtigkeit eindringen)

- Elektrodenanschüsse mit neuer Alufolie abdecken (es darf keine Feuchtigkeit eindringen)

- Oliven/Filter bei Gasver- und Entsorgung, an den Vorratsflaschen und am Probennehmer mit Alufolie abdecken

- Autoklavieren (2 l mindestens 40 min)

- 19 -

Nach dem Autoklavieren

- gelösten Blindstopfen sofort nach Öffnen des Autoklaven aufschrauben

- Platte mit Fermenter in die Konsole einbauen (der Einraststift am hinteren Blech muss in den Verankerungschlitz greifen)

- Verbindung zum Antrieb herunterklappen und Heizblech anschrauben

- Verschluss an der Entlüftung öffnen

- Wasseranschlüsse an den Kühler der Entlüftung anbringen und Wasser aufdrehen

- Belüftung an der Konsole auf niedrigen Wert stellen, Verbindung zum Fermenter herstellen und erst dann die Metallklemme lösen (sonst kann Medium zurücksteigen!)

- Pumpenköpfe auf den entsprechenden Pumpen einrasten und Klemmen zu Vorratsflaschen öffnen, Schläuche füllen (siehe Seite 5)

- Verbindungen zu Messelektroden aufschrauben (Kabel nicht verdrillen oder knicken)

- Anschlüsse für Antischaum am Deckel und dem Messfühler einstecken

- Temperaturfühler bis ganz unten in die entsprechende Hülse stecken

- O2-Elektrode eichen (siehe Seite 6)

- Laptop anschließen

- Fermentationsparameter über Konsole oder Laptop einstellen

- Getrennt autoklavierte Lösungen zugeben

- Animpfen und Fermentation starten

Nach dem Ernten

- Wasser und Luft abstellen

- Alle Verbindungen lösen

- Platte mit Fermenter ausbauen

- Elektroden ausbauen, waschen und wie vorgeschrieben aufbewahren

- Fermenter auseinanderbauen (der Fermenterdeckel muss immer so auf dem Tisch liegen, dass die Rührwelle in die Luft zeigt)

- Alles vorsichtig aber gründlich waschen

- Die Schläuche der Pumpen mit Wasser durchspülen

- Trocknen lassen und wieder zusammenbauen

Die Gleitringdichtung des Rührers muss einmal monatlich mit Glycerin geschmiert werden (siehe Manual!)

- 20 -

Manuelle Einstellungen

F-Taste wählt Funktionen:

RPM (Drehzahl), °C, pH, pO2, AF (Antischaum), Pumpen

RPM (Drehzahl)

- Mit Drehzahl (Sollwert) einstellen

- Mit An/Aus stellen (Rührer)

Blättern

- Cas (Cascade) wird verwendet für pO2 gesteuerte Fermentation.

- cHi ist der schnellste Rührwert, mit einstellen

- cLo ist der langsamste Rührwert, mit einstellen

- OUT Reglerausgang 0-100%

- (für O2-Zufütterung muss eine Flasche angeschlossen sein und o2 im Pumpenmenu auf AUT gestellt sein)

°C (Temperatur)

- Mit Temperatur (Sollwert) einstellen

- Mit An/Aus stellen (Temperaturegelung)

Blättern

- OUT Reglerausgang 0-100%

- 21 -

pH

- Mit gewünschten pH-Wert (Sollwert) einstellen

- Mit An/Aus stellen (Pumpensteuerung)

Blättern

- OUT Reglerausgang 0-100%

- CAL

- +,+ 2 Punkt Eichung

- Elektrode in 1. Referenzpuffer, warten bis die Anzeige stabil ist, Wert mit einstellen

- Enter mit

- Elektrode in 1. Referenzpuffer, warten bis die Anzeige stabil ist, Wert mit einstellen

- Enter mit

- PF Proportionalfaktor (wird nicht verstellt)

- iF Integralfaktor (wird nicht verstellt)

- dEb deadband ≙ Fenster ohne pH-Regelung; gewünschter pH-Wert

hier eingestelltem Wert

- aLr Alarmgrenzen in Parameter Einheiten (pH oder pO2)

Während der Kalibrierung muss der Temperaturfühler in die pH-Standardlösung eingetaucht sein.

Die Elektrode nach Gebrauch abspülen, mit der Silkonkappe (mit 3 M KCl gefüllt) verschließen und in der Schachtel aufbewahren.

Pumpen

Blättern

- Aci Säurepumpe

- bas Basepumpe

- AF Antischaumpumpe

- FEd Fütterungspumpe

- Pumpzeiten mit einstellen; mit An/Aus wird die Pumpe gestartet (AUT) und die Schläuche können gefüllt werden (mit +)

- o2 in AUT-Stellung heißt: O2-Zugabe, wenn Flasche angeschlossen

- 22 -

pO2

- Mit gewünschten pO2-Wert einstellen

- Mit An/Aus stellen (Belüftung über Rührergeschw./O2-Ventil steuern)

Blättern

- OUT Reglerausgang 0-100%

- CAL Kalibrierung kann erst erfolgen, wenn die Elektrode im Medium 4-6 Stunden lang bei eingeschalteter Konsole polarisiert/inkubiert wurde

- +,+ 2 Punkt Eichung

- Medium mit N2 begasen, warten bis Anzeige stabil ist, 0% Wert einstellen

- Enter mit

- Medium mit O2 (oder Luft) begasen, warten bis die Anzeige stabil ist, 100% Wert einstellen

- Enter mit

Oder:

- + 1 Punkt Eichung

- Medium bei gewünschter Temperatur und höchster Drehzahl mit Luft (oder O2) begasen, warten bis die Anzeige stabil ist, 100% Wert einstellen

- Enter mit

- PF Proportionalfaktor (normal 1; Wert erhöhen, wenn der Rührer nicht schnell genug nachgeregelt wird, bis 5)

- iF Integralfaktor (normal 0; Wert erhöhen, wenn der Rührer nicht schnell genug nachgeregelt wird, Einfluss geringer als PF)

- dEb deadband ≙ Fenster ohne pO2-Regelung; gewünschter pO2-Wert

hier eingestelltem Wert

- aLr Alarmgrenzen in Parameter Einheiten (pH oder pO2)

Elektrode vorsichtig behandeln – die Silkonmembran darf nicht durch mechanische Einwirkung verletzt werden! Deshalb immer nach Ausbau sofort die grüne Kappe aufsetzen.

Elektrode in der Schachtel aufbewahren.

AF (Antischaum)

- Mit An/Aus stellen (Pumpensteuerung)

Blättern

- dT Wartezeit in sec. (etwa 5, um zu warten ob der Schaum zusammenfällt)

- Pt Pumpzeit in sec. (etwa 2, Pumpzeit zwischen den Warteintervallen)

- 23 -

Datenbearbeitung

- Programm „History“ aufrufen und entsprechendes File laden

- „File“ und „Generate Report“ anklicken

- Gewünschte Parameter auswählen

- Weiter

- Weiter

- Gewünschten Datentakt angeben

- Fertigstellen

- Datenspalten markieren, kopieren und in gewünschtes spreadsheat einfügen

- In Sigmaplot Zeitachse generieren:

- „Transforms“ und „User-Defined“ anklicken

- col(x)=data(von,bis,Schritt) ≙ col(x)=data(0,Anzahl der Zeilen * Datentakt,Datentakt)

- Umrechnung auf Stunden z.B. col(x)=col(x)/60, wenn der Datentakt in Minuten angegeben war

- 24 -

Manuelle Steuerung einer Fermentation am Computer (Seite 78)

- kann nur bei gestartetem Fermenter benutzt werden - Parameter müssen am Fermenter gestartet sein (nicht auf „OFF“) - Aktiven Parameter mit rechter Maustaste anklicken - Häckchen bei „Setpoint remote“ (Häckchen bei „Sensor data“ belassen) - Setpoint ändern, Apply und OK - → Parameter wird geändert

Steuerung einer Fermentation ohne Bedingungen (Seite 77)

- Im Startmenü unter Infors „Follow File Generator“ auswählen - Fermenter wählen - Parameter auswählen - Auf Tabellen-Taste drücken - Eingabe von Beginn (+ Wert) - Eingabe von Ende (+ Wert) - Nächster Parameter - Eingabe von Beginn (+ Wert) - Eingabe von Ende (+ Wert) - Etc. - Tabelle schließen - Über Taste „Hinzufügen“ können zusätzliche Punkte einfach erstellt werden - Über Taste „Punkte bearbeiten“ entsprechend geändert werden (drag) - Auf diese Art den Verlauf aller Parameter definieren - Methode abspeichern - Beim Start einer Fermentation Methode in „Follow File“ aufrufen

Steuerung einer Fermentation mit Bedingungen (Control sequence)

(kann nur bei gestartetem Fermenter geschrieben werden)

- Öffnen über „Edit“ „Control sequence“ und “Edit current” (meist leer) oder “Import” (Aufruf einer fertigen Sequenz, die geändert werden kann)

- Gewünschte Kontrollsequenz erstellen (IRIS NT ab Seite 79) - Wenn die Sequenz fertig ist, Fenster schließen und „apply“ wählen - Zurück im Standard Menü kann die Sequenz über „Edit“ „Control sequence“

und “Export” abgespeichert werden (Extention .seq) (Vielleicht auch über „save as“ Seite 80)

- Beim Start einer Fermentation Sequenz in „Control sequence“ aufrufen