Maleinimid-funktionalisierte wasserlösliche Derivate

Maleinimid-funktionalisierte wasserlösliche Derivate

klinisch etablierter Zytostatika – albuminbindende

Prodrugs für eine verbesserte Chemotherapie

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde

der Fakultät für Chemie und Pharmazie

der Albert-Ludwigs-Universität

Freiburg im Breisgau

vorgelegt von

André Warnecke aus Hannover

2002

Die vorliegende Arbeit entstand im Zeitraum von Juni 1998 bis April 2002 am Institut für

Makromolekulare Chemie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau unter der

Leitung von Herrn Prof. Dr. R. Mülhaupt in Kooperation mit der Klinik für Tumorbiologie,

Freiburg im Breisgau.

Vorsitzender des Prüfungsausschusses: Prof. Dr. G. E. Schulz

Referent: Prof. Dr. R. Mülhaupt

Koreferent: Prof. Dr. C. Unger

Tag der Bekanntgabe des Prüfungsergebnisses: 16. Mai 2002

Für Silke

Danksagung

Mein herzlicher Dank gilt:

Meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Rolf Mülhaupt für die freundliche Aufnahme in

seinen Arbeitskreis und die Unterstützung bei der Durchführung meiner Dissertations-

arbeit.

Herrn Prof. Dr. Clemens Unger für die Übernahme des Koreferats und das große

Engagement für die Sicherung meiner finanziellen Unterstützung.

Herrn Dr. Felix Kratz, der mir alle nötigen Freiräume beim Anfertigen meiner Arbeit

sowie beim Verfassen des Manuskripts gewährt hat, für die sehr gute und freundschaft-

liche Zusammenarbeit.

Herrn Dr. M. Kowalski und Herrn A. Hasenhindl für die Aufnahme der zahlreichen

NMR-Spektren.

Herrn V. Brecht für die Messung des 195Pt-Spektrums.

Herrn D. Bernd für die Durchführung der Elementaranalysen.

Herrn Dr. J. Wörth und Herrn C. Warth für die Aufnahme der Massenspektren.

Frau Gerlinde Bing für die Durchführung des Zellkulturversuchs.

Der Firma Oncotest (Freiburg) sowie der EPO GmbH (Berlin) für die Durchführung der

Tierversuche.

Frau Karin Scheuermann und Frau Cornelia Stockmar für verschiedene HPLC-Studien.

Meinen Schwerpunktspraktikanten Martin Schmider und Alexander Potdevin für die

Unterstützung bei diversen Synthesen.

Herrn Peter Lazar, der sich auch von so manch mißlungener Mitsunobu-Reaktion nicht

einschüchtern ließ und mich mit chemischen Vorstufen vom feinsten versorgte.

Herrn Dr. Rainer Haag für wertvolle Tips & Tricks.

Herrn Prof. Dr. Dr. Kh. Merkle von der Firma ribosepharm (München) für eine frucht-

bare Kooperation.

Weiterhin gilt mein herzlicher Dank:

Meinen aktuellen und ehemaligen Kollegen Katja Riebeseel, Paula C. A. Rodrigues,

M. Thomas Schütte, Luzia Frey und Peter Lazar für die schöne gemeinsame Zeit,

geteilte Freud – geteiltes Leid.

Der KTB-Crew Cornelia Stockmar, Karin Scheuermann und Jürgen Schwab für ihre

große Hilfsbereitschaft, vor allem als Telefonzentrale.

Den Laborkollegen Holger Türk, Michael Krämer, André Hebel, Conrad Siegers,

Sebastian Roller, Katrin Armbruster, Béla Olàh samt Gruppenleiter Dr. R. Haag für die

angenehme Atmosphäre, spannende Seminare und leckere Backwaren.

Meinen Büronachbarn Frank Schön, Steffen Geppert und Kaifu Luo für Lektionen in

Fränkisch, Raketenbau und Mandarin.

Meinem Freund David Lengeler für die geduldige Vermittlung seines Lebensmottos

("Hoch die ").

Silke Jäger für die schöne gemeinsame Zeit jenseits der Chemie.

Publikationen

F. Kratz, A. Warnecke, K. Riebeseel, P. C. A. Rodrigues in Polymeric Biomaterials,

"Anticancer drug conjugates with macromolecular carriers", second edition, S. Dumitriu Ed.,

Marcel Dekker, New York 2001, 851–893.

Posterbeiträge

A. Warnecke, P. Schumacher, C. Unger, R. Mülhaupt, F. Kratz:

"Entwicklung neuartiger Albumin-Konjugate von Camptothecin-Analoga"

DPhG Jahrestagung 1999, 6.–9. Oktober, Frankfurt a. M..

A. Warnecke, R. Mülhaupt, C. Unger, F. Kratz:

"Synthesis of Novel Acid-Sensitive Albumin Conjugates with the Alkylating Agent Benda-

mustine"

4th International Symposium on Polymer Therapeutics, 5.–7. Januar, 2000, London.

A. Warnecke, R. Mülhaupt, F. Kratz:

"Wasserlösliche heterobifunktionelle Crosslinker auf Oligo(ethylenglykol)-Basis – Grundlage

für ein neuartiges Prodrug-Konzept"

GDCh Jahrestagung 2001, 23.–29. September, Würzburg.

Verzeichnis der Abkürzungen

Ac Acetyl

ATP Adenosintriphosphat

b breit (NMR, IR)

Bn Benzyl

Boc tert.-Butoxycarbonyl

Boc2O Di-tert.-butyldicarbonat

BOP (Benzotriazol-1-yloxy)-

tris(dimethylamino)phosphonium-

Hexafluorophosphat

BrdU 5-Brom-2'-desoxyuridin

Bz Benzoyl

CPT Camptothecin

d Dublett (NMR)

δ chemische Verschiebung

DACH 1,2-Diaminocyclohexan

DEAD Diethylazodicarboxylat

DIAD Diisopropylazodicarboxylat

DIPC N,N’-Diisopropylcarbodiimid

DMAP 4-Dimethylaminopyridin

DMF N,N-Dimethylformamid

DNA engl. deoxyribonucleic acid

EPR engl. enhanced permeability and

retention

eq engl. equivalent

Et3N Triethylamin

ges. gesättigt

GPC Gelpermeationschromatographie

h engl. hour

HMDS Hexamethyldisilazan

HPLC engl. high performance liquid

chromatography

HPMA N-(2-Hydroxypropyl)methacryl-

amid

HSA Humanserumalbumin

i.p. intraperitoneal

IR Infrarot

i.v. intravenös

J Kopplungskonstante

m Multiplett (NMR), mittelstark

(IR)

MALDI engl. matrix-assisted laser

desorption/ionazation

MeOH Methanol

MTD maximal tolerable Dosis

ν Wellenzahl

NHS N-Hydroxysuccinimidyl

NMR engl. nuclear magnetic resonance

p Pentett (NMR)

PBS engl. phosphate buffered saline

PEG Poly(ethylenglykol)

PMB 4-Methoxybenzyl

q Quadruplett (NMR)

quant. quantitativ

RENCA engl. renal cell carcinoma

RNA engl. ribonucleic acid

RP engl. reversed phase

RT Raumtemperatur

s Singulett (NMR), stark (IR)

s.c. subkutan

ss sehr stark (IR)

t Triplett

t1/2 Halbwertszeit (50 %-Wert)

t90 90 %-Wert

TBAF Tetrabutylammoniumfluorid

TFA Trifluoressigsäure

THF Tetrahydrofuran

TMS Tetramethylsilan

TOF engl. time of flight

w schwach (IR)

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung .................................................................................................................... 1

1.1 Krebserkrankungen und die antitumorale Chemotherapie........................................... 1

1.2 Der EPR-Effekt – Makromoleküle als Träger für Zytostatika..................................... 3

1.3 Albuminbindende Zytostatika-Derivate – Grundlage für ein neuartiges doppeltes

Prodrug-Konzept .......................................................................................................... 5

1.4 Wasserlösliche heterobifunktionelle Crosslinker....................................................... 10

1.5 Camptothecin – vom Inhaltsstoff des chinesischen Xi-Shu-Baums bis zum

modernen Chemotherapeutikum ................................................................................ 12

1.5.1 Historisches......................................................................................................... 12

1.5.2 Wirkungsmechanismus und Struktur-Wirkungs-Beziehungen........................... 14

1.5.3 Stabilisierung des Lactonrings durch Veresterung der 20-Hydroxygruppe........ 16

1.5.4 Makromolekulare Camptothecin-Prodrugs......................................................... 18

1.6 Bendamustin – ein Stickstofflost-Alkylanz der 2. Generation................................... 21

1.6.1 Historisches......................................................................................................... 21

1.6.2 Wirkungsmechanismus ....................................................................................... 22

1.7 Antineoplastisch wirksame Platin(II)-Komplexe....................................................... 24

1.7.1 Allgemeines und historische Entwicklung.......................................................... 24

1.7.2 Metabolismus, Wirkungsmechanismus und Struktur-Wirkungs-Beziehungen.. 25

1.7.3 Makromolekulare Platinkomplexe...................................................................... 27

1.8 Aufgabenstellung und Zielsetzungen......................................................................... 30 2 Ergebnisse und Diskussion ............................................................................................. 32

2.1 Heterobifunktionelle Crosslinker auf Oligo(ethylenglykol)-Basis ............................ 32

2.1.1 Allgemeines ........................................................................................................ 32

2.1.2 Überlegungen zur Synthesestrategie................................................................... 33

2.1.3 Allgemeine Synthesestrategie ............................................................................. 35

2.1.4 Synthese der Maleinimidoalkohole..................................................................... 36

2.1.5 Synthese eines Maleinimidoaldehyds ................................................................. 37

2.1.6 Synthese eines Maleinimidocarbonsäurehydrazids ............................................ 39

2.1.7 Synthese der Maleinimidocarbonsäuren ............................................................. 40

2.1.8 Charakterisierung der heterobifunktionellen Crosslinker ................................... 43

2.1.9 Die Mitsunobu-Reaktion mit Maleinimid – Versuch einer Optimierung........... 44

2.1.10 Zusammenfassung............................................................................................... 46

2.2 Albuminbindende Camptothecin-Prodrugs................................................................ 49

2.2.1 Allgemeines ........................................................................................................ 49

2.2.2 Synthese und Charakterisierung der albuminbindenden

Camptothecin-Prodrugs ...................................................................................... 50

2.2.3 Untersuchung der Wasserlöslichkeit................................................................... 54

2.2.4 Untersuchungen der albuminbindenden Eigenschaften...................................... 57

2.2.5 Stabilitätsuntersuchungen ................................................................................... 61

2.2.6 Biologische Eigenschaften.................................................................................. 63


2.3 Wasserlösliche makromolekulare Bendamustin-Prodrugs ........................................ 69

2.3.1 Allgemeines ........................................................................................................ 69

2.3.2 Synthese und Charakterisierung der albuminbindenden

Bendamustin-Prodrugs........................................................................................ 70

2.3.3 Synthese und Charakterisierung eines Bendamustin-Hydrazons........................ 74

2.3.4 Untersuchung der albuminbindenden Eigenschaften.......................................... 75

2.3.5 Synthese und Charakterisierung eines Bendamustin-PEG35k-Konjugats............ 77

2.3.6 Biologische Eigenschaften.................................................................................. 80


2.4 Wasserlösliche Platin-Prodrugs mit einem albuminbindenden

Cyclobutan-1,1-dicarboxylatliganden........................................................................ 88

2.4.1 Allgemeines ........................................................................................................ 88

2.4.2 Synthese und Charakterisierung albuminbindender Platin(II)-Prodrugs ............ 91

2.4.3 Wasserlöslichkeit ................................................................................................ 97

2.4.4 Zellbiologische Untersuchungen ........................................................................ 98

2.4.5 Zusammenfassung............................................................................................... 99 3 Zusammenfassung und Ausblick ................................................................................. 101 4 Experimentelles.............................................................................................................. 114

4.1 Materialien und Methoden ....................................................................................... 114

4.1.1 Verwendete Reagenzien.................................................................................... 114

4.1.2 Verwendete Geräte und Materialien ................................................................. 114

4.1.3 Chromatographie............................................................................................... 115

4.1.4 HPLC-Methode zur Optimierung der Mitsunobu-Reaktion ............................. 116

4.1.5 HPLC-Untersuchung der albuminbindenden Eigenschaften der

Camptothecin-Prodrugs .................................................................................... 117

4.1.6 HPLC-Bestimmung der Plasmastabilität der

Camptothecin-Albumin-Konjugate................................................................... 117

4.1.7 HPLC-Untersuchung der albuminbindenden Eigenschaften der

Bendamustin-Prodrugs...................................................................................... 117

4.1.8 UV-spektrometrische Bestimmung der Wasserlöslichkeit der

Camptothecin- und Bendamustin-Prodrugs ...................................................... 118

4.1.9 UV-spektrometrische Bestimmung des Beladungsfaktors des

Bendamustin-PEG-Konjugats........................................................................... 118

4.1.10 BrdU-Assay (Zellkulturversuch Platin-Prodrug) .............................................. 119

4.1.11 In-vivo-Studien an einem HT-29-Xenograft-Modell (CPT-Prodrugs)............. 119

4.1.12 In-vivo-Studien an einem LXFS-650-Xenograft-Modell

(Bendamustin-Prodrugs) ................................................................................... 120

4.1.13 In-vivo-Studien an einem MAXF-401-Xenograft-Modell

(Bendamustin-Prodrugs) ................................................................................... 121

4.2 Organisch-chemische Synthesen.............................................................................. 122

4.2.1 Heterobifunktionelle Crosslinker auf Oligo(ethylenglykol)-Basis ................... 122

4.2.2 Albuminbindende Camptothecin-Prodrugs....................................................... 141

4.2.3 Synthese einer nicht-albuminbindenden CPT-Modellverbindung.................... 146

4.2.4 Makromolekulare Bendamustin-Prodrugs ........................................................ 150

4.2.5 Albuminbindende Platin(II)-Prodrugs .............................................................. 156 5 Literatur ......................................................................................................................... 165 Anhang .................................................................................................................................. 176

Krebserkrankungen und die antitumorale Chemotherapie 1

1 Einleitung

1.1 Krebserkrankungen und die antitumorale Chemotherapie

Ähnlich wie in den vorhergehenden Jahren wurden 1998 rund 350.000 Krebsneuer-

krankungen in Deutschland registriert (s. Abb. 1.1).[1] Während diese Zahl in den letzten drei

Jahrzehnten annähernd konstant geblieben ist, beobachtet man bei der Anzahl der

krebsbedingten Todesfälle einen ähnlichen Trend – trotz intensiver Forschungsbemühen zur

Entwicklung verbesserter Therapiemöglichkeiten.[2,3] Mit einer durchschnittlichen Mortalität

von ca. 60 % stellen Krebsleiden nach den Herz-Kreislauf-Erkrankungen die zweithäufigste

Todesursache dar.

Abb. 1.1 Prozentualer Anteil der häufigsten Krebsarten an allen Krebsneuerkrankungen von 1998

in Deutschland (Quelle: Robert Koch Institut)[1]

Die Ursachen für die hohe Sterblichkeit bei Krebserkrankungen liegen in der häufig zu spät

gestellten Diagnose maligner Tumore sowie den eingeschränkten Therapiemöglichkeiten,

welche im wesentlichen auf der operativen Entfernung des Tumorgewebes, Bestrahlung und

der Anwendung chemotherapeutischer Maßnahmen basieren. Während die ersten beiden Me-

thoden technisch weitestgehend optimiert worden sind, erhofft man, zukünftige Fortschritte in

der Krebsbehandlung vor allem durch Entwicklung neuer antitumoraler Wirkstoffe zu er-

reichen.

Die für die Behandlung von Krebserkrankungen zugelassenen Arzneistoffe nutzen die

für Tumorzellen charakteristische Eigenschaft des unkontrollierten Wachstums und greifen in

die Stoffwechselvorgänge während der Zellteilung ein oder schädigen die DNA. In beiden

Fällen wird die Duplikation des genetischen Codes verhindert, die Zelle stirbt ab. Solche

Wirkstoffe werden als Zytostatika (zellteilungshemmende Substanzen) bezeichnet.

2 Einleitung

Anders als bei der Chemotherapie bakterieller Infektionen unterscheiden sich Tumorzellen

nur geringfügig von gesunden Zellen. Da die "klassischen" Zytostatika nicht tumorspezifisch

wirken und sich nach Applikation gleichmäßig im gesamten Organismus verteilen, wird bei

einer Therapie mit solchen Substanzen stets auch gesundes Gewebe geschädigt. Davon sind

hauptsächlich Zellen mit einer hohen Teilungsrate betroffen, vor allem Zellen des Knochen-

marks, der Schleimhäute und Haarwurzeln, was sich in ausgeprägten Nebenwirkungen (u. a.

Immunsuppression, Diarrhöen, Erbrechen und Haarausfall) äußert, die abhängig vom Grad

ihrer Schwere sogar einen Abbruch der Therapie bedingen können. Bei Zytostatika handelt es

sich demnach um Substanzen, deren heilendes und toxisches Potential nahe beieinander liegt.

Die negativen Erfahrungen der meisten Patienten, die sich einer solchen Behandlung unter-

zogen haben mögen ein Grund für den schlechten Ruf sein, den die Chemotherapie innerhalb

der Bevölkerung genießt.

Bislang existieren nur wenige Zytostatika, die mit kurativem Erfolg eingesetzt werden

können (z. B. Cisplatin bei Hodenkarzinomen, vgl. 1.7). In den meisten Fällen, vor allem in

fortgeschrittenen Stadien der Krankheit, verfolgt man mit einer Chemotherapie das Ziel einer

Lebensverlängerung sowie einer Verbesserung der Lebensqualität des Patienten. Um die

medikamentöse Behandlung von Krebserkrankungen effektiver zu gestalten, müßten die

Nebenwirkungen verringert und/oder die Wirksamkeit erhöht werden. Ein vielversprechender

Ansatz zur Verbesserung der Chemotherapie besteht in dem schon Anfang des 20.

Jahrhunderts von Paul Ehrlich propagierten Drug Targeting, was soviel bedeutet wie

gezielter Wirkstofftransport. Übertragen auf die antitumorale Chemotherapie beinhaltet Drug

Targeting den Einsatz von Transportsystemen für ein gezieltes Einschleusen von Zytostatika

ins Tumorgewebe, wo diese ihre Wirkung entfalten, während das gesunde Gewebe verschont

bleibt.

Die Entwicklung solcher Transportsysteme war in den letzten drei Jahrzehnten Gegen-

stand intensiver Forschungsbemühungen. Neben dem erfolgreichen Einsatz von liposomalen

Formulierungen von Zytostatika[4,5] sowie der Kopplung von Wirkstoffen an monoklonale

Antikörper, welche an tumorspezifische Antigene binden,[6-10] wurde in zunehmendem Maße

das Potential von Makromolekülen als Träger für Zytostatika erkannt.

Der EPR-Effekt – Makromoleküle als Träger für Zytostatika 3

1.2 Der EPR-Effekt – Makromoleküle als Träger für Zytostatika

Die Entwicklung makromolekularer Prodrugs (Wirkstofformulierungen, die den eigentlichen

Wirkstoff erst am Wirkort freisetzen) von Zytostatika fußt auf der 1955 von Busch et al.

gemachten Entdeckung der Anreicherung radioaktiv markierter Plasmaproteine in Tumorge-

webe.[11] Obwohl die Ursache für diesen Effekt seinerzeit noch nicht bekannt war, wurden

schon Ende der sechziger Jahre erste Zytostatika-Protein-Konjugate synthetisiert und hin-

sichtlich ihrer Antitumoraktivität untersucht.[12] Waren Arbeiten über solche makromoleku-

laren Prodrugs damals noch rar, setzte sich Mitte der siebziger Jahre ein neuer Trend durch.

Beeinflußt durch die Pionierarbeiten des Polymerchemikers Ringsdorf, der ein Modell für

makromolekulare Arzneistoffe auf der Basis synthetischer Polymere vorgestellt hatte,[13]

wurde in der darauffolgenden Zeit in zunehmendem Maße der Einsatz synthetischer Makro-

moleküle als Träger für Zytostatika erprobt.[14-19] Infolge dieses Aufschwungs konnten von

Maeda et al. der Mechanismus für die Akkumulation von Molekülen mit einem Molekular-

gewicht >30–40 kDa in soliden Tumoren aufgeklärt werden.[20,21] Demnach ist diese An-

reicherung ein passiver Effekt, der aus den anatomischen Unterschieden zwischen Tumor-

gewebe und gesundem Gewebe resultiert.

Abbildung 1.2 zeigt den schematischen Aufbau eines Blutgefäßes, das im oberen

Bereich an normales Gewebe, im unteren Bereich an Tumorgewebe angrenzt (Quelle:[22]).

Blutgefäße im gesunden Gewe-

be weisen mit wenigen Ausnah-

men eine geschlossene Endo-

thelschicht auf, die zwar das

Eindringen niedermolekularer

Verbindungen, nicht aber das

von Makromolekülen erlaubt,

während die lückenhafte Endo-

thelschicht im Bereich von Tu-

morgewebe sowohl für kleine

als auch für große Moleküle

durchlässig ist. Dieser Unter-

schied hat zur Folge, daß

Makromoleküle bevorzugt in Tumorgewebe eindringen. Da dieses in der Regel kein

abführendes lymphatisches System besitzt, kommt es aufgrund des mangelnden Abtransports

Abb. 1.2 Schematische Darstellung eines Blutgefäßes, das im oberen Teil

an Normalgewebe, im unteren Teil an Tumorgewebe angrenzt

4 Einleitung

zu einer Anreicherung der Makromoleküle. Dieser Mechanismus der Akkumulation von

Makromolekülen wird EPR-Effekt (engl. enhanced permeability and retention) genannt und

wird zusätzlich durch die Pharmakokinetik begünstigt. Da Moleküle ab einem Moleku-

largewicht von 30–40 kDa von der Niere nicht mehr nennenswert glomerulär filtriert werden,

verlängert sich ihre Plasmahalbwertszeit,[23,24] wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Auf-

nahme und Anreicherung des Makromoleküls im Tumorgewebe erhöht wird.

Der EPR-Effekt ist im wesentlichen unabhängig von der chemischen Natur der

Trägermoleküle, wie aus den Studien über Poly(ethylenglykole) (PEG),[25] N-(2-Hydroxy-

propyl)methacrylamid-Copolymere (HPMA-Copolymere)[26] und Serumalbumin[27] hervor-

geht (EPR wurde auch für die passive Anreicherung von Partikeln wie Liposomen verant-

wortlich gemacht[21]).

Wenngleich in den letzten Jahren wesentlich mehr Arbeiten über eine Bindung von

Zytostatika an synthetische Polymere wie HPMA-Copolymere,[28] PEG,[29] Styrol-Malein-

säureanhydrid-Copolymer (SMA),[30] Polyaminosäuren (z. B. Poly(lysin), Poly(cystein))[31,32]

oder chemisch modifizierte Naturstoffe wie Carboxymethyldextran[33] oder Chitosan[34] als

über einen Einsatz von Serumproteinen als Träger für Zytostatika veröffentlicht wurden,

konnten indessen auch auf diesem Gebiet große Fortschritte verzeichnet werden.[35] Hierbei

ist besonders das Humanserumalbumin (HSA) hervorzuheben, dessen Konjugat mit Metho-

trexat eine klinische Phase-I-Studie durchlaufen hat.[36]

Während bei synthetischen Polymeren als wichtigste Anforderungen Biokompatibilität

und Bioabbaubarkeit im Vordergrund stehen, gelten für Biopolymere diese Eigenschaften per

se. Nachteilig wirken sich dagegen u. a. der hohe Preis von gereinigten Serumproteinen und

die oftmals auftretenden Schwierigkeiten der selektiven Kopplung des Wirkstoffs an den

Träger aus. Ein neuartiges Prodrug-Konzept, das im folgenden Kapitel vorgestellt wird, ist in

der Lage, diesen Nachteilen entgegen zu wirken.

Albuminbindende Zytostatika-Derivate – Grundlage für ein neuartiges doppeltes Prodrug-Konzept 5

1.3 Albuminbindende Zytostatika-Derivate – Grundlage für ein neuartiges

doppeltes Prodrug-Konzept

Obwohl bereits seit fast einem halben Jahrhundert bekannt ist, daß sich Plasmaproteine in

Tumorgewebe anreichern[11,37] und infolgedessen einige Zytostatika-Albumin-Konjugate

synthetisiert wurden[38,39] sowie deren Wirksamkeit in Tierversuchsmodellen[40,41] bzw.

klinischen Studien[36] belegt werden konnte, hat bis heute keine dieser Verbindungen die

Marktreife erlangt. (Dasselbe gilt für Wirkstoffkonjugate mit synthetischen Polymeren und

monoklonalen Antikörpern, von denen einige Vertreter mehrere klinische Phasen durchlaufen

haben.[17,42,43]) Die Ursachen hierfür sind u. a. ökonomischer Natur und eine direkte

Konsequenz aus dem makromolekularen Charakter solcher Prodrugs, welcher die Erfüllung

der strengen Kriterien einer Zulassung als Arzneistoff erschwert. Dies betrifft zum einen die

aufwendige Analytik (die Bildung wohldefinierter Konjugate ist schwer nachzuweisen,

Methoden müssen eigens entwickelt und etabliert werden), zum anderen die kostenintensive

Herstellung, Reinigung und Lagerung. Bei Konjugaten mit Biomolekülen, welche aus

humanem Blut gewonnen werden, besteht zudem das Risiko einer Kontamination durch

Krankheitserreger. Auch kann die Verabreichung körperfremder Proteine eine Immunantwort

beim Patienten auslösen.

i.v.

proteinbindendes Wirkstoffderivat

Rasche und selektive Bindung an endogenes

Albumin

Cystein34

Wirkstoff

Wirkstoff Serum-albumin –S–

Wirkstoff zirkuliert als makromolekulares

Prodrug

Abb. 1.3 Doppeltes makromolekulares Prodrug-Konzept[44]

Um die oben beschriebenen Nachteile zu beseitigen und die wirtschaftliche Attraktivität des

ansonsten vielversprechenden makromolekularen Prodrug-Ansatzes zu erhöhen, wurde von

6 Einleitung

Kratz ein neuartiges doppeltes Prodrug-Konzept entwickelt, das körpereigenes (endogenes)

Serumalbumin als Träger für Zytostatika benutzt.[44] Dabei wird ein niedermolekulares

albuminbindendes Wirkstoffderivat intravenös appliziert. In der Blutbahn findet anschließend

eine rasche Kopplung an endogenes Serumalbumin statt, bei der das eigentliche Prodrug, das

Albumin-Wirkstoff-Konjugat, generiert wird (s. Abb. 1.3). Die Anwendbarkeit dieses Pro-

drug-Konzeptes basiert auf zwei Säulen:

1. der Fähigkeit von N-Alkylmaleinimiden, als doppelt aktivierte Michael-Systeme sehr

schnell und spezifisch mit Thiolgruppen unter Ausbildung stabiler Thioetherbindungen zu

reagieren (s. Abb. 1.5)[45,46]

2. den besonderen Eigenschaften von Serumalbumin (s. Kasten), das im Blut in hoher

Konzentration vorliegt und genau eine freie Thiolgruppe aufweist (Cystein34)

Humanserumalbumin (HSA) Humanserumalbumin ist ein globuläres Protein mit einem Molekulargewicht von 66.4 kDa und liegt mit einer

Konzentration von 32–50 g/L im menschlichen Blutplasma vor.[47] Im Organismus erfüllt es vielfältige

Aufgaben: Einerseits fungiert es aufgrund seiner Fähigkeit, eine ganze Palette von Substanzen reversibel zu

binden, als multifunktionelles Transportprotein für Fettsäuren, Bilirubin, Hämatin und verschiedene Metall-

kationen. Andererseits trägt es zur Erhaltung des osmotischen Drucks sowie des pH-Werts bei.[48]

Obwohl man bereits 1839 HSA als Hauptkomponente des

1989 die Aufklärung der Struktur mittels Röntgenbeugu

serumalbumin aus einem einzelnen nicht-glykosiliertem

zusammensetzt und 17 Disulfidbrücken sowie eine freie

menschlichen Blut zu 30 % in oxidierter Form vor – an Cyst

besitzt die Thiolgruppe von Cystein34 einen bemerke

pKa(Cystein) = 8.5, pKa(Glutathion) = 8.9). Die Beobachtu

Blutserum besitzt, ist u. a. auf diese Anomalie zurückzuführe

Abb. 1.4 Struktur von HSA, Cys34 ist rot hervorgehoben

(Quelle: Brookhaven Protein Database)

menschlichen Blutes identifiziert hatte, gelang erst

ng (s. Abb. 1.4).[49-51] Danach besteht Human-

Polypeptidstrang, der sich aus 585 Aminosäuren

Cysteingruppe (Cys34) aufweist. Diese liegt im

ein oder Glutathion gebunden.[47] Im freien Zustand

nswert niedrigen pKa von 7 (zum Vergleich:

ng, daß Albumin die reaktivste Thiolgruppe im

n.[52]


Da die Reaktionsgeschwindigkeit von Maleinimiden mit Thiolen bei physiologischem pH ein

Maximum annimmt,[53] eignet sich diese Kopplungsgruppe im besonderen Maße für einen

Einsatz als proteinbindende Kom-

ponente. Eine mögliche Konkurrenz-

reaktion mit Aminen ist unter diesen

Bedingungen um den Faktor 1000

langsamer[54,55] und daher vernach-

lässigbar. Weitere günstige Voraussetzungen für eine gezielte Kopplung von Maleinimid-

tragenden Wirkstoffderivaten ergeben sich aus den Beobachtungen, daß Serumalbumin den

größten Anteil aller freien Thiolgruppen stellt[47] und aufgrund des niedrigen pKa-Werts von

7[52] auch die reaktivsten Thiolgruppen im menschlichen Blut aufweist. So konnte z. B. von

Yasuzawa et al. gezeigt werden, daß ein Großteil von KW-2149, einem Derivat des

Zytostatikums Mitomycin C mit einer Disulfidbindung, nach Applikation durch Sulfid-

Disulfid-Austausch zum entsprechenden Albumin-Konjugat reagiert. MALDI-TOF-spektro-

metrische Untersuchungen der durch Trypsin- bzw. Carboxypeptidase-P-Spaltung erhaltenen

Fragmente des Konjugats belegten hierbei die selektive Bindung an Cys34.[56] Obwohl diese

Konjugatbildung nicht geplant war, wird sie dafür verantwortlich gemacht, daß KW-2149

eine größere therapeutische Bandbreite als Mitomycin C besitzt.

N

O

O

R' N

O

O

R'

SR

R SH +

Abb. 1.5 Reaktion von Thiolen mit N-Alkylmaleinimiden

Im Gegensatz dazu gelang Kratz et al. eine gezielte in-vitro- und in-vivo-Kopplung des

Maleinimid-tragenden Doxorubicin-Derivats DOXO-HYD an Albumin (Formel s. Abb. 1.6),

die durch HPLC-Untersuchungen bestätigt werden konnte.[44]

O

O

OH

OH

CH2OHOH

OO

O

NH2

CH3

OCH3

HCl

HCl

O

O

OH

OH

CH2OHOH

OO

O

NH2

CH3

OCH3

DOXO-HY DOXO-EMCH

H

H

NHN

ON

O

ON

O

O

HN

O

N

D

Abb. 1.6 Strukturen der albuminbindenden Prodrugs DOXO-HYD und DOXO-EMCH mit einer

säurelabilen Carboxylhydrazonbindung (das Doxorubicin-Gerüst ist in roter Farbe darge-

stellt)

8 Einleitung

Aufgrund der höheren Empfindlichkeit von N-Arylmaleinimiden gegenüber N-Alkylmalein-

imiden bezüglich einer basenkatalysierten Öffnung des Maleinimidrings bei physiologischem

pH, welche zum unreaktiven Maleaminsäure-Derivat führt,[55] wurde die Weiterentwicklung

von DOXO-HYD trotz vielversprechender Tierversuchsdaten gestoppt. Statt dessen wurde die

Einsatzmöglichkeit des schon seit längerem bekannten DOXO-EMCH (Formel s. Abb.

1.6),[57] einem aliphatischen Pendant zu DOXO-HYD, hinsichtlich einer Verwendung als

albuminbindendes Prodrug untersucht.[58] Dabei ließ sich zeigen, daß bereits nach 60 s

Inkubation mit humanem Blutplasma ein großer Teil des DOXO-EMCH an Albumin gebun-

den vorlag, während eine Kopplung an andere Serumproteine nicht zu beobachten war (s.

Abb. 1.7).

Abb. 1.7 Chromatogramm von menschlichem Blutplas-

ma, das zuvor 60 s lang mit DOXO-EMCH

inkubiert wurde (POROS®-20-PI-Anionenaus-

tauschersäule). Die Auftrennung der einzelnen

Serumproteine mit HSA als Hauptkomponente

läßt sich anhand der UV-Absorption bei

280 nm verfolgen. Durch Messung der für das

Anthracyclin-Gerüst von DOXO-EMCH

charakteristischen UV-Absorption bei 495 nm

wird die selektive Kopplung an HSA belegt.

-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

λ = 280 nm

UV-

Abso

rptio

n (λ

= 2

80 n

m)

Zeit [s]

0,00

0,05

0,10

0,15

UV-Absorption (λ = 495 nm

)

λ = 495 nm

Transferrin HSA

Die Antitumoraktivität von DOXO-EMCH wurde in mehreren Tierversuchsstudien an Mäu-

sen getestet.[58] Sowohl in einem MDA-MB-435-Mammakarzinom-Modell als auch in einem

RENCA-Modell (engl. renal cell carcinoma) erwies sich DOXO-EMCH als hochwirksam und

der Stammverbindung Doxorubicin deutlich überlegen. In letztgenanntem Tiermodell wurden

Nacktmäusen ca. 106 Tumorzellen in die linke Niere injiziert. Nach zehn Tagen begann die

Behandlung mit jeweils vier Applikationen Doxorubicin und DOXO-EMCH (Tag 10, 14, 17

und 21). Anschließend (Tag 24) wurden die Mäuse seziert, um die Größe der Nierentumore

zu bestimmen. Abbildung 1.8 zeigt die Nieren von jeweils einer repräsentativen Maus der

Doxorubicin-behandelten (links) bzw. DOXO-EMCH-behandelten (rechts) Gruppe, wobei die

jeweils links abgebildeten Organe tumorfreie Kontrollnieren sind. Beim Vertreter der mit

Doxorubicin behandelten Gruppe ist die rechte Niere durch einen makroskopisch deutlich

sichtbaren Tumor gekennzeichnet. Hingegen läßt sich die rechte Niere des mit DOXO-EMCH

behandelten Tieres kaum vom gesunden Organ unterscheiden. Man beobachtet eine Total-

remission des eingepflanzten Tumors.


Abb. 1.8 Vergleich der Wirksamkeit von Doxorubicin (4x10 mmol/kg) (links) und DOXO-EMCH

(4x20 mmol/kg) (rechts) im RENCA-Modell am Beispiel von jeweils einem repräsen-

tativen Vertreter aus der Gruppe der 12 behandelten Tiere

Obgleich in diesem Tierversuch DOXO-EMCH (4x20 mmol/kg) doppelt so hoch dosiert

wurde wie Doxorubicin (4x10 mmol/kg), war im Falle des Prodrugs keine Toxizität zu

beobachten, während bei den Mäusen der Doxorubicin-behandelten Gruppe bereits eine deut-

liche Körpergewichtsreduktion zu verzeichnen war. Eine zusätzlich getestete Applikation von

4x20 mmol/kg Doxorubicin führte zu einer Sterblichkeitsrate von 92 %, womit die maximal

tolerable Dosis (MTD) deutlich überschritten wurde.

Diese Ergebnisse zeigten, daß mit DOXO-EMCH ein hochwirksames, gutverträgliches

albuminbindendes Prodrug gefunden wurde, dessen therapeutisches Potential es im Rahmen

einer weiterführenden klinischen Entwicklung noch auszuloten gilt. Das dem zugrunde lie-

gende doppelte makromolekulare Prodrug-Konzept sollte sich indes auch auf andere Wirk-

stoffe übertragen lassen. Dabei sind jedoch einige Gesichtspunkte zu berücksichtigen, die als

Anforderungen an albuminbindende Prodrugs folgendermaßen formuliert werden können:

1. der Wirkstoff sollte eine zur Derivatisierung geeignete funktionelle Gruppe aufweisen

2. Vorliegen einer Sollbruchstelle zwischen Wirkstoff und albuminbindender Einheit mit

ausreichender Stabilität in der Blutbahn und Spaltbarkeit am Wirkort (z. B. säurelabile

Carboxylhydrazonbindung im Falle von DOXO-EMCH)

3. hohe Wasserlöslichkeit des Prodrugs, um eine intravenöse Applikation zu ermöglichen

Werden geeignete Wirkstoffe zur Entwicklung einer albuminbindenden Formulierung nach

den Kriterien 1 und 2 ausgewählt, so läßt sich die Forderung nach hoher Wasserlöslichkeit

aufgrund des hydrophoben Charakters der meisten Zytostatika nicht problemlos erfüllen.

(Doxorubicin bildet hierbei eine Ausnahme.) Vielmehr gilt es in solchen Fällen, einen

größeren Wert auf das Design des Verbindungsmoleküls (Crosslinker) zwischen Wirkstoff

und Albumin zu legen, wie im folgenden Kapitel erläutert wird.

10 Einleitung

1.4 Wasserlösliche heterobifunktionelle Crosslinker

Der aus dem englischen Sprachraum stammende Begriff Bioconjugation, für den eine

adäquate deutsche Übersetzung nicht existiert, beschreibt die kovalente Verknüpfung zweier

oder mehrerer Moleküle (darunter mindestens ein Biomolekül), um deren Eigenschaften

(physikalische, chemische oder pharmazeutische) zu kombinieren. Bioconjugation stellt

heutzutage einen wichtigen Bestandteil der modernen Life Sciences dar, deren vielfältige

Anwendungen von der Proteinchemie und Immunologie bis zur Medizin und Biotechnologie

reichen und häufig der selektiven Verknüpfung von Biomolekülen bedürfen. Aus diesem

Grunde wurden in den letzten drei Jahrzehnten zahlreiche Methoden entwickelt, die mit Hilfe

sogenannter Crosslinker (Verbindungsmoleküle) eine gezielte Kopplung von (Bio)Molekülen

durch Bindung des Linkers an spezifische funktionelle Gruppen ermöglichen.[55,59,60]

Crosslinker mit zwei Bindungsstellen werden als homobifunktionell oder heterobi-

funktionell bezeichnet – je nachdem, ob sie gleichartige oder verschiedene Bindungsstellen

besitzen. Glutaraldehyd ist wahrscheinlich das bekannteste Beispiel für einen homobi-

funktionellen Crosslinker, der Aminogruppen tragende Moleküle durch Bildung von

Iminbindungen miteinander verknüpft. Homobifunktionelle Crosslinker sind jedoch in der

Regel nicht zur Darstellung von Wirkstoff-Polymer-Konjugaten geeignet, bei denen es auf

eine definierte Zusammensetzung ankommt. Theoretisch betrachtet ist eine quantitative

Kopplung unter Benutzung homobifunktioneller Linker sogar unmöglich.[61] Für die Synthese

albuminbindender Prodrugs ist daher der Einsatz heterobifunktioneller Crosslinker, welche

zuerst an eine geeignete funktionelle Gruppe des Wirkstoffs gebunden werden, um

anschließend selektiv in vivo an die Cys34-Gruppe von HSA zu koppeln, von entscheidender

Bedeutung.

Obgleich inzwischen eine Vielzahl von Crosslinkern kommerziell erhältlich ist, schien

es für die Entwicklung proteinbindender Prodrugs unumgänglich, maßgeschneiderte heterobi-

funktionelle Crosslinker zu synthetisieren, welche den folgenden Anforderungen genügen

sollten:

1. Vorhandensein einer Maleinimidgruppe als thiolbindender Einheit

2. Vorliegen einer geeigneten Funktionalität zur Kopplung an die verschiedenen

Zytostatika(-Derivate)

3. hohe Wasserlöslichkeit, um eine intravenöse Applikation der zumeist hydrophoben

Zytostatika zu ermöglichen

Wasserlösliche heterobifunktionelle Crosslinker 11

Crosslinker mit einer Maleinimidgruppe und einer Carboxylgruppe sind kommerziell

erhältlich (z. B. ε-Maleinimidocapronsäure (EMC) / Pierce). Leider weisen diese Ver-

bindungen eine schlechte Wasserlöslichkeit auf. Berücksichtigt man, daß Bioconjugation,

d. h. die Kopplung an Biopolymere, als "Chemie im wäßrigen Medium" angesehen werden

kann, verwundert die Tatsache, daß sich wasserlösliche heterobifunktionelle Crosslinker nicht

etabliert haben (sieht man von einer gewissen Anzahl wasserlöslicher N-Hydroxysulfo-

succinimidylester (Sulfo-NHS-Ester) ab, die zur Kopplung an Aminogruppen geeignet sind

und die wasserlösliche Komponente während der Kopplungsreaktion verlieren). Das Angebot

an käuflichen Crosslinkern mit einem wasserlöslichen Rückgrat beschränkt sich auf die bei-

den in Abbildung 1.9 dargestellten homobifunktionellen Verbindungen.

NO

ON

O

O

O

On = 1,2

Abb. 1.9 Kommerziell erhältliche homobifunktionelle Crosslinker mit Maleinimidgruppen und ei-

nem wasserlöslichen Oligo(ethylenglykol)-Rückgrat der Firma Pierce (Rockford, USA)

Solche Derivate von Tri- bzw. Tetraethylenglykol weisen aufgrund ihres Polyether-Rückgrats

eine hohe Löslichkeit sowohl in Wasser als auch in organischen Solventien auf. Hetero-

bifunktionelle Derivate von Oligo(ethylenglykolen) sollten daher als Crosslinker für die

Darstellung albuminbindender Prodrugs geeignet sein, da die Kopplung an den Wirkstoff

bequem in organischen Medien erfolgen kann, während die Wasserlöslichkeit des so erhal-

tenen Wirkstoffderivats für eine intravenöse Applikation gesteigert wird. Zudem ist das Poly-

ether-Rückgrat chemisch inert und nicht-immunogen.[62] Durch Verwendung längerkettiger

Homologer als Ausgangssubstanzen der Synthese läßt sich die Kettenlänge des Linkers leicht

variieren.

In den folgenden drei Kapiteln werden Zytostatika vorgestellt, für die im Rahmen der

vorliegenden Arbeit albuminbindende Formulierungen entwickelt wurden.

12 Einleitung

1.5 Camptothecin – vom Inhaltsstoff des chinesischen Xi-Shu-Baums bis

zum modernen Chemotherapeutikum

1.5.1 Historisches

Xi Shu ist ein in Südchina beheimateter Baum, der von Botanikern zur Familie der Nyssaceae

gezählt wird und als Camptotheca acuminata, der einzigen Spezies der Gattung Camptotheca

Decaisne bezeichnet wird (s. Abb. 1.10). Im deutschen bedeutet Xi Shu soviel wie

"glücklicher Baum" oder "Baum der Freude".[63]

Als 1957 das amerikanische National Cancer

Institute (NCI) ein Programm zur Überprüfung der

tumorhemmenden Eigenschaften von Pflanzen starte-

te und infolgedessen 1000 Pflanzenextrakte hinsicht-

lich ihrer Antitumoraktivität untersucht wurden,

konnte nur bei einem aus Xi-Shu-Blättern gewon-

nenen Rohextrakt in zwei Tumorsystemen eine hohe

Wirksamkeit nachgewiesen werden. Bei weiter-

führenden Untersuchungen Anfang der sechziger Jahre wurde eine hohe Aktivität gegenüber

L1210-Leukämie-Zellen beobachtet. Doch erst 1966 gelang es Wall und Wani, die chemische

Struktur der hierbei wirksamen Komponente durch Röntgenstrukturanalyse aufzuklären.[64]

Durch Extraktion des Xi-Shu-Holzes erhielten sie eine blaßgelbe Substanz, die sie in

Anlehnung an den Gattungsnamen Camptothecin

nannten.

Abb. 1.10 Camptotheca acuminata

Camptothecin (CPT) ist ein pentacyclisches

Alkaloid, das aus einer Chinolin-Einheit (Ring A

und B), einer Pyridon-Einheit (Ring D) sowie

dem Lactonring E aufgebaut ist (s. Abb. 1.11).

Ferner besitzt dieser Naturstoff ein stereogenes

Zentrum an C-20 mit S-Konfiguration und eine Hydroxygruppe. Bereits 1971 gelang die erste

Totalsynthese von 20(R,S)-Camptothecin,[65] der bis zum heutigen Tag viele weitere (auch

solche, die zu enantiomerenreinem CPT oder A,B-Ring modifizierten Camptothecin-

Derivaten führen) gefolgt sind. Jedoch dauerte es sehr lange, bis Camptothecin klinische

Anwendung fand, obschon Ende der sechziger Jahre erste klinische Phase-I-Studien

durchgeführt wurden. Statt Camptothecin, dessen Wasserlöslichkeit nur 0.0025 mg/mL

2120

1918

1716a 16

1514

1312

11

10

98

76

5

32N

N O

O

OHO

A B C D E

Abb. 1.11 20(S)-Camptothecin

Camptothecin – vom Inhaltsstoff des chinesischen Xi-Shu-Baums bis zum modernen Chemotherapeutikum 13

beträgt,[66] wurde damals das wasserlösliche Natriumsalz mit geöffnetem Lactonring (Ring E)

verabreicht. Da man eine nicht tolerable, nicht voraussagbare und wenig gut beherrschbare

Toxizität beobachtete (Kolitiden, hämorrhagische Zystitis, Diarrhöen),[67,68] wurde die

Weiterentwicklung von Camptothecin als Arzneistoff zunächst gestoppt. Erst 15 Jahre später,

nachdem der Wirkungsmechanismus, die Hemmung der Topoisomerase I (s. 1.5.2), aufge-

klärt worden war, flammte das Interesse an Camptothecin-Derivaten wieder neu auf. Man

hatte festgestellt, daß Variationen an C-7, C-9 und C-10 keinen Einfluß auf die inhibito-

rischen Eigenschaften haben,[69] der Lactonring jedoch intakt bleiben muß (s. 1.5.3). So

konnten Camptothecin-Abkömmlinge maßgeschneidert werden, die eine erhöhte Wasserlös-

lichkeit sowie eine verbesserte Pharma-

kokinetik aufweisen, während CPT als

Arzneistoff bis heute ohne Bedeutung

geblieben ist.

Zwei Camptothecin-Analoga, die

klinische Relevanz erlangt haben, sind

Topotecan (Hycamtin) und Irinotecan

(CPT-11, Campto) (s. Abb. 1.12).

Beide können als wasserlösliche Hydro-

chloride verabreicht werden. Während

Topotecan eine ähnliche Wirksamkeit

wie Camptothecin aufweist, ist Irino-

tecan ein Prodrug, das in der Leber

durch Spaltung des Carbamats zum

aktiven Metaboliten 7-Ethyl-10-hy-

droxycamptothecin (SN-38) umgewan-

delt wird. Beide Medikamente lösen in

vielen Fällen die für Zytostatika ty-

pischen Nebenwirkungen wie Neutropenie, Thrombopenie, Anämie, Alopezie, Übelkeit und

Diarrhöen aus. In Deutschland ist Topotecan für die Behandlung des platinrefraktären

Ovarialkarzinoms zugelassen.[70-72] Irinotecan darf seit 1998 gegen fortgeschrittene Dick-

darmtumore nach erfolgloser Therapie mit 5-Fluoruracil eingesetzt werden.[73]

N

N O

O

OHO

Topotecan

Irinotecan

N

N O

O

OHO

OO

N

N

HO

N HCl

HCl

Abb. 1.12 Camptothecin-Derivate mit klinischer Relevanz

14 Einleitung

1.5.2 Wirkungsmechanismus und Struktur-Wirkungs-Beziehungen

Camptothecin wirkt im Gegen-

satz zu vielen anderen Zyto-

statika sehr spezifisch. Obwohl

schon seit längerem bekannt

war, daß CPT sowohl die

RNA- als auch die DNA-

Synthese in Säugetierzellen

inhibiert,[74] konnte der Wir-

kungsmechanismus erst 1985

aufgeklärt werden: Nachdem eine Hemmung der RN

wurde,[75] vermuteten Hsiang et al., daß DNA-Top

als mögliche molekulare Targets von Camptotheci

tigte sich im Falle der DNA-Topoisomerase I. Hs

Grundlegende biolo

und genetische Rek

komplementären P

sierung der DNA. D

die sogenannten Top

1. Typ-I-Topoisom

DNA aus

2. Typ-II-Topoiso

der DNA unter

Abb. 1.13 Wirkungsmechanismus von Camptotheci

DNA-Topoisomerasen gische Vorgänge wie Transkription, Replikation

ombination erfordern eine lokale Trennung der

olynucleotidstränge und damit eine Entspirali-

iese Aufgabe erfüllt eine Klasse von Enzymen,

oisomerasen. Hierbei unterscheidet man:

erasen führen transiente Einzelstrangbrüche der

merasen führen transiente Doppelstrangbrüche

ATP-Hydrolyse aus

A- und DNA-Polymerase ausgeschlossen

oisomerasen vom Typ I oder II (s. Kasten)

n in Frage kämen. Dieser Verdacht bestä-

iang und Mitarbeiter konnten zeigen, daß

Camptothecin nicht-kovalent

und reversibel an den Kom-

plex aus Topoisomerase I

und DNA bindet und da-

durch DNA-Einzelstrangbrü-

che induziert (s. Abb.

1.13).[76] Infolgedessen wird

die DNA-Replikation unter-

brochen; die Zelle stirbt ab.

n

Die exakte Struktur

dieses ternären Komplexes

aus CPT, Topoisomerase I

und DNA ist noch nicht

bekannt. Bislang wurden

mehrere Modelle postuliert,

die derzeit kontrovers disku-

tiert werden.[77-79]


A B C D E

N

N O

O

OHO

R1R2

R3

R4

intakter Lactonringerforderlichintakter Lactonringerforderlich

SauerstoffatomerforderlichSauerstoffatomerforderlich

SubstituentenerhöhenAktivität

SubstituentenerhöhenAktivität

Senkung derAktivität durchSubstitution

Senkung derAktivität durchSubstitution

Verbesserung der Aktivitätdurch AlkylierungVerbesserung der Aktivitätdurch Alkylierung

(R)-Isomerinaktiv(R)-Isomerinaktiv

7-gliedriger RingstabilisiertLactonform

7-gliedriger RingstabilisiertLactonform

PyridonringerforderlichPyridonringerforderlich

OH-/MeO-Substituentenerhöhen, sperrigeGruppen senkenAktivität

OH-/MeO-Substituentenerhöhen, sperrigeGruppen senkenAktivität

Erhöhung der Aktivitätdurch Stickstoff-Substituenten

Erhöhung der Aktivitätdurch Stickstoff-Substituenten

(M)ethylendioxy-Gruppe erhöhtAktivität

(M)ethylendioxy-Gruppe erhöhtAktivität

Abb. 1.14 Übersicht der wichtigsten Struktur-Wirkungs-Beziehungen von Camptothecin-Derivaten[69]

Das Wissen über den Wirkungsmechanismus von Camptothecin erwies sich als wertvoll für

die Entwicklung neuartiger CPT-Derivate, da die zytotoxischen Eigenschaften mit dem Maß

der Topoisomerase-I-Inhibition korrelieren und dieses zum Abschätzen der Wirksamkeit

herangezogen werden kann. So konnten mit Hilfe der Aktivitätsdaten etlicher Camptothecin-

Derivate Struktur-Wirkungs-Beziehungen erarbeitet werden, von denen die wichtigsten in

Abbildung 1.14 dargestellt sind.[69] Hingegen konnte die Rolle der für eine Derivatisierung

prädestinierten 20-OH-Gruppe noch nicht vollständig geklärt werden.[79] Ebenso existieren

widersprüchliche Angaben zur Wirksamkeit aliphatischer 20-O-Ester von Camptothecin:

Während für das schon 1966 synthetisierte 20-O-Acetat[64] eine marginale Aktivität ver-

glichen mit CPT berichtet wurde,[80] wiesen eine Reihe von Fettsäureestern, darunter das 20-

O-Propionat, eine hohe Wirksamkeit in Nacktmausmodellen auf.[81] Dabei ist für solche 20-

O-Acyl-CPT-Derivate eine Wirkungsweise als Prodrugs wahrscheinlich und im Falle anderer

CPT-Ester experimentell eindeutig belegt.[82]

16 Einleitung

1.5.3 Stabilisierung des Lactonrings durch Veresterung der 20-Hydroxygruppe

Ein Grund für die anfangs zögerliche Entwicklung von Camptothecin-Derivaten als

Arzneistoffe lag in den schlechten Ergebnissen der Phase-I-Studie, die mit dem Natriumsalz

von CPT (geöffneter Lactonring) durchgeführt wurde (vgl. 1.5.1). Inzwischen ist bekannt, daß

durch Öffnung des Lactonrings die Wirksamkeit drastisch herabgesetzt, während die Toxizität

um ein Vielfaches erhöht wird.[83,84] Bedauerlicherweise unterliegen Camptothecin sowie A-

und B-Ring modifizierte Derivate wie Topotecan einer Ringöffnung auch unter physio-

logischen Bedingungen (s. Abb. 1.15).

N

N O

O

OHO N

N

O

OHO

OH

O-pH 7.4

Abb. 1.15 Reversible Öffnung des Lactonrings von CPT bei physiologischem pH-Wert

Hierbei stellt sich ein Gleichgewicht zwischen offenkettigem und geschlossenem E-Ring ein,

das im Organismus zusätzlich durch das Vorliegen von Serumproteinen beeinflußt wird. Es

konnte gezeigt werden, daß die offenkettige Hydroxycarbonsäure-Form von Camptothecin

(und Topotecan) im Gegensatz zum Lacton mit einer hohen Affinität an Humanserumalbumin

bindet, wodurch sich das Gleichgewicht zu Ungunsten des intakten Lactonrings ver-

schiebt.[85,86] Für CPT wird daher eine Halbwertszeit in menschlichem Blutplasma von nur

11 min beobachtet. Interessanterweise scheint die aktive Lacton-Form in Mäuseplasma

weitaus stabiler zu sein. Während nach Inkubation mit menschlichem Blutplasma bereits nach

vier Stunden kein Camptothecin mehr nachweisbar ist, liegen nach derselben Zeitspanne in

Mäuseplasma noch 18 % der ursprünglichen Konzentration als Lacton vor.[81] Dieser

Unterschied in den Plasmastabilitäten wurde zur Erklärung der Diskrepanz zwischen den

Ergebnissen der Nacktmaus-Tierversuche und der klinischen Studien am Menschen

herangezogen.

Cao et al. konnten in ihren Versuchen zeigen, daß eine Veresterung der 20-OH-Gruppe

die Stabilität des Lactonrings drastisch erhöht.[81] So liegt Camptothecin-20-O-propionat nach

6 Stunden Inkubation mit menschlichem Blutplasma zu 56 % in der aktiven Lacton-Form vor.

Jedoch läßt sich auch hier ein Unterschied zwischen humanem und murinem Plasma

beobachten; nach 6 Stunden Inkubation mit Mäuseplasma liegt der Vergleichswert mit 85 %

deutlich höher. Durch mechanistische Untersuchungen konnten Zhao et al. diese Ergebnisse


theoretisch untermauern, indem sie eine Reihe von 20-O-Derivaten von CPT (Ester, Car-

bonate, Carbamate und Ether) synthetisierten und HPLC-Hydrolysestudien in Pufferlösungen

bei verschiedenen pH-Werten durchführten.[87] Hierbei konnte bis pH 9.0 bei keinem der 20-

O-Acyl-Derivate (Ester, Carbonate und Carbamate) eine Öffnung des E-Rings beobachtet

werden, während das Ether-Derivat bei pH 9.0 zu 45 % in der inaktiven offenkettigen Form

vorlag. Auf der Basis dieser Ergebnisse postulierten Zhao et al. einen möglichen Reaktions-

mechanismus für die basenkatalysierte Lacton-Hydrolyse, bei dem die Ausbildung von

Wasserstoffbrücken eine entscheidende Bedeutung für die Stabilität des Übergangszustandes

besitzt (s. Abb. 1.16).

N

N O

O

ORO N

N

O

ORO

OH

O-O

ORO

OH

HO

H

O

OO

OH

HO

H

O

R

H O

H

OOH

HO

H

OH O

H

O

R

OOH

HO

H

O

HO

OH-

geringste Stabilität mittlere Stabilität größte Stabilität

R = Acyl R = Alkyl R = H

Abb. 1.16 Von Zhao et al. postulierter Mechanismus der basenkatalysierten Lacton-Hydrolyse[87]

Im Falle von Camptothecin besitzt der Übergangszustand, bedingt durch die Ausbildung einer

intramolekularen Wasserstoffbrückenbindung unter Einbeziehung der 20-OH-Gruppe, die

größte Stabilität. Ist die Hydroxygruppe derivatisiert (acyliert oder alkyliert), kann der

Übergangszustand nur durch Wassermoleküle stabilisiert werden. Dabei ist die Bildung eines

siebengliedrigen Ringes im Falle des Ether-Derivats entropisch gegenüber der des Neunrings

beim Acyl-Derivat begünstigt, woraus die Abstufung in den Hydrolysegeschwindigkeiten

resultiert. Diese Besonderheiten lassen sich bei der Entwicklung von makromolekularen

Prodrugs in idealer Weise ausnutzen, da eine durch Veresterung der 20-Hydroxygruppe von

CPT realisierte Kopplung an Polymere gleichzeitig eine Stabilisierung der Lacton-Form

bewirkt. Dadurch kann Camptothecin anschließend im Tumorgewebe in seiner aktiven Form

freigesetzt werden.

18 Einleitung

1.5.4 Makromolekulare Camptothecin-Prodrugs

Der Ansatz, Makromoleküle als Träger für Zytostatika zu verwenden, wurde bereits 1996 auf

Camptothecin übertragen. Damals gelang es Greenwald et al. von der Firma Enzon (New

Jersey, USA), PEG-Dicarbonsäure der molaren Masse von 40 kDa mit der 20-Hydroxygruppe

von CPT zu verestern (PEG-α-CPT; s. Abb. 1.17).[82] Das auf diese Weise erhaltene Konjugat

setzt in Rattenplasma Camptothecin mit einer Halbwertszeit von zwei Stunden frei, während

es in PBS pH 7.4 über einen langen Zeitraum stabil ist (t1/2 = 27 h). Demzufolge stellt die

Esterbindung eine Sollbruchstelle dar und ermöglicht eine kontrollierte Freisetzung von CPT.

Bemerkenswert waren jedoch die Ergebnisse der in-vivo-Studien, welche mit dem Konjugat

in tumortragenden Nacktmäusen durchgeführt wurden: Während in einem P388-Leukämie-

modell bei Verabreichung des CPT-PEG-Konjugats eine etwa ebenso große Wirksamkeit wie

die einer liposomalen Formulierung von Camptothecin zu beobachten war, ließ sich in einem

HT-29-Kolorektal-Tumormodell eine deutliche Überlegenheit des PEG-Konjugats gegenüber

Camptothecin (liposomal), Topotecan und 5-Fluoruracil feststellen.[88,89] Lediglich die PEG-

Formulierung erzielte hierbei Totalremissionen der eingepflanzten Tumore, ohne daß eine

Toxizität zu beobachten war.

N

NO

O

OO

N

N O

O

OO

O

OO

O

n

N

NO

O

OO

N

N O

O

OO O

OO

O

HN

O

NH

O n

PEG-α-CPT

PEG-β-CPT

Abb. 1.17 PEG40k-Konjugate von Camptothecin mit hoher Antitumorwirksamkeit


Um anhand einer Variation der Sollbruchstelle Struktur-Wirkungs-Beziehungen zu erarbeiten

und gegebenenfalls einen geeigneteren Kandidaten für die weitere klinische Entwicklung zu

finden, synthetisierten Greenwald et al. Camptothecin-PEG40k-Konjugate, bei denen CPT

über verschiedene zusätzliche Spacermoleküle an Poly(ethylenglykol)dicarbonsäure gekop-

pelt wurde.[88] Hierbei erzielte lediglich ein Konjugat, das aus der Kopplung von

Camptothecin-20-O-glycinat an PEG40k-Dicarbonsäure über eine Amidbindung gewonnen

wurde (PEG-β-CPT, s. Abb. 1.17), eine ähnlich gute in-vitro- und in-vivo-Wirksamkeit wie

das zuvor beschriebene PEG-α-CPT. Jedoch zeigte sich die Plasmastabilität derjenigen von

PEG-α-CPT deutlich überlegen (t1/2 = 6 h in Rattenplasma versus t1/2 = 2 h für PEG-α-CPT).

Des weiteren beobachtete man eine verbesserte Pharmakokinetik, so daß sich PEG-β-CPT als

geeigneter Kandidat für die weitere Entwicklung empfahl und diese Erwartungen in mehreren

zusätzlichen Tierversuchsmodellen bestätigen konnte.[90] Ein Austausch von Glycin gegen die

Aminosäuren Alanin, Phenylalanin, Methionin, Glutaminsäure, Leucin und Prolin führte zu

CPT-PEG-Konjugaten, die zwar gegenüber PEG-β-CPT keine Verbesserung der Wirksamkeit

zeigten, jedoch eine höhere Stabilität in humanem Blutplasma aufwiesen.[91] So bewirkte ein

Austausch von Glycin gegen Alanin eine Steigerung der Halbwertszeit in humanem Blutplas-

ma von 4 h auf 7 h. Obwohl sich dieses Konjugat in einem LS174T-Kolon-Xenograft-Modell

PEG-β-CPT unterlegen zeigte, wurde es in weiteren Tierversuchsmodellen ausgiebig getestet

und schließlich aufgrund der höheren Plasmastabilität für die weitere klinische Entwicklung

ausgewählt. Gegenwärtig wird PEG-Ala-CPT unter dem Handelsnamen Prothecan® in einer

klinischen Phase-II-Studie getestet.[92]

Ein anderes Camptothecin-Polymer-Konjugat, welches über eine ähnliche Sollbruch-

stelle wie PEG-β-CPT verfügt, ist das von Fraier et al. (Pharmacia & Upjohn) beschriebene

MAG-Camptothecin, ein wasserlösliches Copolymer aus N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid

(HPMA), N-[N-(2-Hydroxypropyl)glycylamido]methacrylamid und 20-O-(Methacryloyl-

glycyl-6-aminohexanoylglycyl)camptothecin (s. Abb. 1.18). Das Konjugat, von dem bislang

noch keine biologischen Aktivitäten publiziert worden sind, zeichnet sich durch eine hohe

Wasserlöslichkeit bei einem CPT-Gehalt von ca. 10 % aus.[93] Gegenwärtig wird MAG-CPT

in einer klinischen Phase-I-Studie getestet.[94]

20 Einleitung

N

N O

O

OO O

HN

O

NH

O

NH

O

HN

O

NH

OOH

NH

O

OH

N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid N-[N-(2-Hydroxypropyl)glycylamido]methacrylamid

20-O-(Methacryloylglycyl-6-aminohexanoylglycyl)camptothecin

Abb. 1.18 Monomere, aus denen MAG-CPT zusammengesetzt ist

Ebenfalls aus den Forschungslaboratorien von Pharmacia & Upjohn (Mailand) stammt ein

HPMA-Copolymer, bei dem Camptothecin über einen lysosomal-spaltbaren Tetrapeptid-

spacer (Gly-Phe-Leu-Gly) an das Polymer gebunden wurde.[95] Die veröffentlichten Ergeb-

nisse der in-vivo-Studien zeigten eine den PEG-Konjugaten vergleichbar gute Wirksamkeit

und Verträglichkeit im HT-29-Kolorektal-Tumormodell.

Erst kürzlich wurde die Wirksamkeit eines Konjugats beschrieben, bei dem Campto-

thecin über die 20-Hydroxygruppe an Poly(L-glutaminsäure) gekoppelt wurde. Diese Verbin-

dung zeigte eine signifikante Aktivität und eine Überlegenheit gegenüber CPT in einem

H322-Lungenkrebs-Xenograft.[96] Daneben wurde über ein analoges Konjugat berichtet, das

eine Bindung von Camptothecin an Poly(L-glutaminsäure) über einen Glycin-Spacer auf-

weist.[97] Auch hierbei konnte eine Steigerung der in-vivo-Wirksamkeit gegenüber Campto-

thecin in verschiedenen Tumormodellen belegt werden.

Neben den hier beschriebenen makromolekularen Prodrugs von Camptothecin, bei

denen man die gegebene 20-OH-Gruppe für die Bindung an das Polymer ausnutzte, wurde

noch über ein Carboxymethyldextran-Konjugat von 10-Hydroxycamptothecin[33,98-100] sowie

über HPMA-Copolymer-Konjugate von 9-Aminocamptothecin[101] berichtet, die an dieser

Stelle aus Gründen der Vollständigkeit Erwähnung finden sollten. Bislang liegen jedoch keine

Beispiele für Camptothecin-Konjugate mit Serumproteinen vor.

Bendamustin – ein Stickstofflost-Alkylanz der 2. Generation 21

1.6 Bendamustin – ein Stickstofflost-Alkylanz der 2. Generation

1.6.1 Historisches

Obwohl der inzwischen weltweit geächtete Einsatz von chemischen Kampfstoffen im

1. Weltkrieg zu Tausenden von Toten führte, diente später eine Substanz, welche seinerzeit

unter den Namen Gelbkreuz, Lost oder Senfgas Angst und Schrecken verbreitete, als

Leitstruktur für die Entwicklung einer Klasse von Zytostatika – den Stickstofflost-

Alkylanzien. Damals hatten Ärzte bei der Obduktion von Soldaten, die nach Kontakt mit dem

Kampfstoff ihr Leben verloren hatten, eine Verminderung der weißen Blutkörperchen

(Leukopenie), Knochenmarkschädigungen, eine Auflösung des lymphatischen Gewebes so-

wie Geschwüre des Gastrointestinaltrakts diagnostiziert.[102] Diese Befunde gaben Anlaß zu

der Vermutung, daß Senfgas rasch proliferierende Zellen schädigt und verwandte Verbindun-

gen als Antitumormittel Verwendung finden könnten.

Während in den dreißiger Jahren durchgeführte klinische Untersuchungen an Lost

(Struktur s. Abb. 1.19) zeigten, daß diese Verbindung für einen systemischen Einsatz am

Menschen zu toxisch ist,[103] führte der Austausch von Schwefel gegen Stickstoff zu

Derivaten, die aufgrund einer deutlich niedrigeren Toxizität klinische Bedeutung erlangt

haben. Eine Auswahl solcher Verbindungen (Stickstofflost-Derivate) ist in Abbildung 1.19

dargestellt.

N

Cl

Cl N

N

COOH

HCl

Bendamustin-Hydrochlorid

Cl

S

Cl

Cl

N

Cl

CH3

Cl

N

Cl

COOH

Lost (Senfgas) Stickstofflost (Mechlorethamin) Chlorambucil

Abb. 1.19 Strukturformeln von Senfgas (Lost) und einer Auswahl an Stickstofflost-Derivaten

Der einfachste Vertreter dieser Verbindungsklasse, das Stickstofflost, ist sehr hydrolyse-

empfindlich und wird in der Blutbahn rasch deaktiviert. Durch Austausch der Methylgruppe

gegen einen stabilisierenden Phenylrest konnte die Reaktivität verringert werden.[104] Um

eine ausreichende Wasserlöslichkeit zu gewährleisten, wurde eine Carboxylgruppe eingeführt,

die sich jedoch aufgrund ihrer elektronenziehenden Eigenschaft nicht direkt am Aromaten

befinden darf, da sonst die Reaktivität um ein Vielfaches gesenkt würde. Das Zytostatikum

Chlorambucil, das in den 50er Jahren entwickelt wurde, weist mit drei Methylengruppen

zwischen Benzolring und Carbonsäure ein optimales Verhältnis zwischen Wasserlöslichkeit

und Wirksamkeit auf, wie durch entsprechende Studien gezeigt werden konnte.[105] Da es sich

22 Einleitung

direkt vom Stickstofflost ableitet, ist Chlorambucil ein Stickstofflost-Derivat der 1. Genera-

tion. Es wird heute noch zur Behandlung der chronisch lymphatischen Leukämie, bei Morbus

Hodgkin sowie bei Non-Hodgkin-Lymphomen eingesetzt.

Bendamustin, das 1963 von Ozegowski et al. am Institut für Mikrobiologie und

Experimentelle Therapie in Jena entwickelt wurde,[106] kombiniert die alkylierenden Eigen-

schaften der Stickstofflostgruppe mit einer möglichen Purin-antagonistischen Wirkung einer

integrierten Benzimidazol-Einheit. Das Zytostatikum, welches unter dem Handelsnamen

Ribomustin® von der Firma ribosepharm (München) vertrieben wird, weist eine dem struk-

turell verwandten Chlorambucil ähnliche therapeutische Bandbreite auf (Morbus Hodgkin,

Non-Hodgkin-Lymphome, Plasmozytome, chronisch-lymphatische Leukämie und Mamma-

karzinome[107,108]). Es unterscheidet sich jedoch von diesem durch höhere Wasserlöslichkeit

(Applikation als stabiles Hydrochlorid) und niedrigere Toxizität.

Bislang existieren noch keine Beispiele für makromolekulare Formulierungen von

Bendamustin.

1.6.2 Wirkungsmechanismus

Für die Wirksamkeit von Bendamustin werden einerseits die Funktion des Benzimidazolrings

als Purin-Antagonist, andererseits die alkylierenden Eigenschaften der Stickstofflost-Einheit

verantwortlich gemacht. Als bifunktionelles Alkylanz ist Bendamustin nicht nur in der Lage,

einzelne nucleophile Gruppen der

DNA zu alkylieren, es kann auch die

Vernetzung benachbarter DNA-

Stränge hervorrufen (engl. cross-

linking).[109]

Die Alkylierungsreaktion von

Stickstofflost-Derivaten verläuft in

zwei Schritten über ein intermediäres

Aziridinium-Kation (s. Abb. 1.20),

dessen Bildung der geschwindig-

keitsbestimmende erste Schritt ist, der

von einer nucleophilen Ringöff-

nungsreaktion gefolgt wird. Dabei greift das Aziridinium-Ion eine nucleophile Gruppe einer

DNA-Base an, woraus eine stabile kovalente Verknüpfung resultiert. Aufgrund des

Cl

N

Cl

R N

Cl

R

Nu

N R

Nu

Nu

1. Alkylierung

2. Alkylierung

Nu-

Nu-

N+

Cl

R

Cl-

N+ R

NuCl-

Nu- = nucleophile Gruppe einer DNA-Base

Abb. 1.20 Mechanismus der alkylierenden Wirkung von

Stickstofflost-Derivaten

Bendamustin – ein Stickstofflost-Alkylanz der 2. Generation 23

bifunktionellen Charakters des Stickstofflost-Derivats kann die Alkylierung bei Vorhan-

densein geeigneter Nucleophile zweimal erfolgen und so eine Quervernetzung der DNA

bewirken, die schließlich zum Zelltod führt.

Liegen hingegen keine besseren Nucleophile als Wasser vor, findet eine langsame

Hydrolyse des Aziridinium-Ions statt, die zum inaktiven Dihydroxystickstofflost-Derivat

führt.[110] Die Geschwindigkeit dieser Reaktion ist sowohl von der Chloridionen-Kon-

zentration als auch vom pH-Wert abhängig. Für Bendamustin-Lösungen (0.25 mg/mL) beob-

achtet man in 0.9 %iger NaCl-Lösung eine langsame Zersetzung (4 °C: t90 = 120 h, 23 °C:

t90 = 9 h).[111]

24 Einleitung

1.7 Antineoplastisch wirksame Platin(II)-Komplexe

1.7.1 Allgemeines und historische Entwicklung

Antineoplastisch wirksame Platinkomplexe nehmen aufgrund ihrer anorganischen Natur eine

Sonderstellung unter den klinisch etablierten Zytostatika ein. Hervorzuheben sind hierbei die

in Deutschland zugelassenen Arzneistoffe cis-Diammindichloroplatin(II) (Cisplatin) und

Diamminplatin(II)-cyclobutan-1,1-dicarboxylat (Carboplatin) (Struktur s. Abb. 1.21), von

denen das erstgenannte bei männlichen Patienten mit Hodenkrebs eine Heilungsrate von

über 90 % erzielt. Angesichts dieser beachtlichen

Wirksamkeit scheint es ungewöhnlich, daß die

Entdeckung der zytotoxischen Eigenschaften von

Platinkomplexen nicht durch Screening geschah,

sondern dem Zufall zu verdanken ist.

Obgleich Cisplatin schon seit 1844 bekannt

ist,[112] wußte man bis Ende der sechziger Jahre des

20. Jahrhunderts nicht um seine tumorinhibierende

Wirkung. Zu dieser Zeit untersuchte Rosenberg den

Einfluß elektrischer Felder auf das Wachstum von

E. coli und beobachtete unter bestimmten Versuchsbedingungen ein Anwachsen der

Bakterien auf das 300fache ihrer Länge, ohne daß sie sich dabei teilten. Für diese Erscheinung

war jedoch nicht – wie zunächst vermutet – das elektrische Feld verantwortlich, sondern ein

Platinkomplex, der sich (bedingt durch den Versuchsaufbau) aus einer Oxidation des

Elektrodenplatins in Gegenwart von Ammoniumchlorid als Leitsalz und Sonnenlicht

bildete.[113] Diese Verbindung wurde später als cis-Diammintetrachloroplatinat(IV) identifi-

ziert (s. Abb. 1.21) – das oktaedrische Pendant zu Cisplatin.[114,115]

PtCl

Cl

H3N

H3N

CisplatinPt

H3N

H3N O

O

O

O

CarboplatinPt

Cl

Cl

H3N

H3N

Cl

Cl

cis-Diammintetra-chloroplatinat(IV)

Abb. 1.21 Strukturen wichtiger Pt-Komplexe

Diese Ergebnisse veranlaßten Rosenberg zu der Annahme, daß der entstandene Platin-

komplex nicht ausschließlich die bakterielle Zellteilung hemmt, und so überprüfte er den

Einfluß von cis-Diammintetrachloroplatinat(IV) und drei weiteren einfachen cis-konfigurier-

ten Diam(m)inplatinkomplexen (darunter auch Cisplatin) auf deren antitumorale Wirksamkeit

im Tiermodell.[116] In allen Fällen, besonders bei Cisplatin, konnte bei den Versuchstieren

eine deutliche Verringerung der Tumorgröße und eine Verlängerung der Lebenszeit

beobachtet werden.[117] Bereits 1971 wurde Cisplatin in ersten klinischen Studien mit großem

Erfolg getestet.[118] Heute ist diese Verbindung weltweit eines der drei meistverwendeten

Antineoplastisch wirksame Platin(II)-Komplexe 25

Zytostatika und wird neben Hodenkrebs (s. o.) erfolgreich bei Ovarialkarzinomen, Tumoren

im Kopf-/Halsbereich und Bronchialkarzinomen eingesetzt.[119] Chemotherapien mit

Cisplatin sind jedoch von zahlreichen Nebenwirkungen begleitet, von denen sich die

Nephrotoxizität dosislimitierend auswirkt.

Carboplatin zählt zu den antitumoral wirksamen Platinkomplexen der zweiten Gene-

ration. Es unterscheidet sich von Cisplatin durch einen Austausch der beiden Chloroliganden

gegen einen chelatisierenden Cyclobutan-1,1-dicarboxylatliganden. Daraus resultiert sowohl

eine veränderte Pharmakokinetik als auch ein von Cisplatin abweichendes Toxizitätsprofil.

Da Carboplatin weniger toxisch ist, wird es in Therapieanwendungen höher dosiert, wobei

sich hierbei die Myelosuppression dosislimitierend auswirkt. Hauptanwendungsgebiete sind

Ovarialkarzinome, Bronchialkarzinome und Krebserkrankungen im Kopf- und Halsbereich.

Zwischen Cis- und Carboplatin besteht jedoch eine Kreuzresistenz, da ihre Wirkungsmecha-

nismen im Wesentlichen identisch sind, wie im folgenden erläutert wird.

1.7.2 Metabolismus, Wirkungsmechanismus und Struktur-Wirkungs-Beziehungen

Cis- und Carboplatin besitzen einen ähnlichen Aufbau: Beide sind quadratisch-planare

Komplexe des Platins der Oxidationsstufe +II mit zwei relativ inerten Amminliganden in cis-

Stellung. Schon in frühen Arbeiten konnte gezeigt werden, daß diese Konfiguration essentiell

für die Wirksamkeit der Platinkomplexe ist, da die zu Cisplatin isomere trans-Verbindung

(trans-Diammindichloroplatin(II)) keine Aktivität aufweist.[114] (Dieses Kriterium gilt jedoch

nicht für einige antitumoral wirksame Platinkomplexe der dritten Generation wie z. B. trans-

[Pt(py)2Cl2] py = Pyridin.[120]) Ein weiteres strukturelles Merkmal ist das Vorliegen zweier

labil gebundener Liganden (Cl– im Falle von Cisplatin, RCOO– bei Carboplatin), die im

Körper langsam unter Bildung von Aquokomplexen dissoziieren.

PtCl

Cl

H3N

H3N

Cisplatin

PtOH2

Cl

H3N

H3N

+

PtOH2

OH

H3N

H3N

+

PtOH2

OH2

H3N

H3N

2+

PtOH

Cl

H3N

H3N

-Cl- -Cl-

-H+-H+

Abb. 1.22 Hydrolyse-Reaktionen von Cisplatin bei niedriger Chloridionen-Konzentration

26 Einleitung

Im Falle von Cisplatin verläuft diese Hydrolyse über mehrere Zwischenstufen und ist im

hohem Maße von der Chloridionen-Konzentration abhängig. Nach intravenöser Applikation

bleibt Cisplatin aufgrund der hohen Cl–-Konzentration des Blutplasmas (ca. 100 mM)

zunächst stabil und kann als ungeladene Verbindung leicht die Zellmembran passieren, um

anschließend durch passive Diffusion in das Zytoplasma vorzudringen.[121] Die dort

vorherrschende deutlich niedrigere Cl–-Konzentration (ca. 4 mM) führt dazu, daß die

Chloroliganden von Cisplatin sukzessiv unter Bildung geladener Aquokomplexe abgespalten

werden (s. Abb. 1.22).[122] Diese können durch eine nachfolgende Deprotonierung zu

ungeladenen Hydroxykomplexen weiterreagieren. Als wirksame Spezies wurden die

geladenen Aquokomplexe, vor allem cis-[Pt(NH3)2Cl(H2O)]+ identifiziert. Diese binden an

die DNA durch Substitution eines Aquoliganden durch die Stickstoffatome der DNA-

Basen.[121] Dabei werden die N-7-Positionen der Purinbasen Guanin und Adenin aufgrund

ihrer ausgeprägten Nucleophilie bevorzugt angegriffen. Findet anschließend eine zweite

Substitution durch eine (benachbarte) Base statt, kommt es zu Quervernetzungen, wobei man

zwischen Intrastrang- und Interstrang-Vernetzungen unterscheidet.

Mit Hilfe von Experimenten, bei denen mit Cisplatin behandelte Lachssperma-DNA

enzymatisch gespalten, die so erhaltenen Fragmente chromatographisch gereinigt und mittels 1H-NMR-Spektroskopie analysiert wurden, ließen sich Aussagen über die Struktur der

erhaltenen Cisplatin-DNA-Addukte sowie deren Häufigkeit machen (s. Abb. 1.23).[123]

C

C G

G

3' 5'

5' 3'

PtNH3

NH3

T

C G

A

3' 5'

5' 3'

PtNH3

NH3

PtNH3

NH3

C

N N

G

3' 5'

C G

5' 3'

C

G C

G

3' 5'

5' 3'

PtNH3

NH3

Intrastrang-Quervernetzungd(GpG)-Addukt

(47–50 %)

Intrastrang-Quervernetzungd(ApG)-Addukt

(23–28 %)

Intrastrang-Quervernetzungd(GpNpG)-Addukt

Interstrang-Quervernetzung

(8–10 %)

C

5' 3'

G

3' 5'

Pt

OH2

NH3

NH3

Monoaddukt(2–3 %)

Abb. 1.23 Nachgewiesene Cisplatin-DNA-Addukte (die relativen Häufigkeiten sind in Klammern

angegeben)[123]


Demzufolge treten Intrastrang-Quervernetzungen, bei denen zwei benachbarte Guaninreste

bzw. ein Guanin- und ein Adeninrest miteinander verknüpft werden (d(GpG)-Addukte bzw.

d(GpA)-Addukte) mit der größten Häufigkeit auf. Weitaus seltener beobachtet man 1,3-

Intrastrang-Addukte (d(GpNpG)) und Interstrang-Addukte sowie das Produkt einer mono-

funktionellen Bindung an Guanin. Ein ähnliches Ergebnis lieferte auch die Untersuchung von

Leukozyten Cisplatin-behandelter Krebspatienten.[124]

Durch zahlreiche Arbeiten, in denen die Struktur solcher Platin-DNA-Addukte mittels

Röntgenbeugung und NMR-Spektroskopie aufgeklärt wurde, konnte gezeigt werden, daß die

Anlagerung von Cisplatin schwerwiegende Konformationsänderungen der DNA bewirkt.[121]

Diese äußern sich u. a. in einem Abknicken der Doppelhelix am Ort der d(GpG)-Platin-

Verbrückung um 40–70°, was zu einer effektiven Hemmung der DNA-Replikation und damit

letztlich zum Zelltod führt.

Neben der hier beschriebenen Wirkungsweise von Cisplatin wurden in jüngster Zeit

auch alternative Mechanismen diskutiert, ohne daß dabei die Bedeutung der DNA als

Hauptangriffspunkt in Frage gestellt wurde.[125]

Über den Metabolismus von Carboplatin ist hingegen weniger bekannt. Man vermutet

jedoch, daß durch eine dem Cisplatin verwandte Hydrolyse-Reaktion der Cyclobutan-1,1-

dicarboxylatligand unter Bildung analoger Aquokomplexe abgespalten wird.[126] Hierfür

spricht die Beobachtung, daß sich die nach Reaktion von Carboplatin mit DNA gebildeten

Addukte durch die gleichen Antikörper erkennen lassen wie die Cisplatin-Addukte.[127,128]

Unterschiede zwischen Cis- und Carboplatin bestehen jedoch in der Hydrolysegeschwin-

digkeit der labilen Liganden, welche sich auf die unterschiedliche Zytotoxizität der beiden

Verbindungen auswirkt (in Zellkulturexperimenten (L1210-Leukämie-Zellinie) zeigte Cis-

platin eine ca. 45fach höhere Wirksamkeit als Carboplatin[129]). Ferner sind bei Cisplatin

Proteinwechselwirkungen stärker ausgeprägt als bei Carboplatin. So resultieren wahrschein-

lich einige der für Cisplatin typischen Nebenwirkungen (Nephrotoxizität, Neurotoxizität und

Ototoxizität) aus der Blockade wichtiger Enzyme.[127]

1.7.3 Makromolekulare Platinkomplexe

Die Bestrebungen zur Erhöhung der therapeutischen Wirksamkeit von cis-konfigurierten

Platin(II)-Komplexen mündeten in der Entwicklung mehrer makromolekularer Formulierun-

gen, von denen die wichtigsten im folgenden kurz skizziert werden. Hierbei hat sich eine

Bindung von Platin an ein Diamino-funktionalisiertes Polymer ohne zusätzliche Sollbruch-

28 Einleitung

stelle als unvorteilhaft erwiesen, da die starke Koordination durch solche Liganden eine Ab-

spaltung der aktiven Spezies in vivo verhindert.[130] Hingegen ließen sich Carboxylat-

funktionalisierte Polymere, welche eine Komplexierung von Platin durch Carboxylgruppen

ermöglichen, aufgrund der labileren Bindung zwischen Metall und Polymer erfolgreicher

einsetzen. Ein solches Trägerpolymer ist Carboxymethyldextran (Struktur s. Abb. 1.24), das

durch Alkylierung von Dextran mit Chloressigsäure gewonnen wird, wobei sich die Anzahl

der eingeführten Carboxylgruppen durch sorgfältige Kontrolle der Reaktionsbedingungen

steuern läßt.

O

HOOCCH2O

O

OCH2COOH

HOOCCH2O

n

Abb. 1.24 Struktur von Carboxymethyldextran mit einer vollständigen Beladung der Hydroxygruppen

Von Schechter et al. wurden in einer frühen Arbeit Carboxymethyldextrane mit Molekular-

gewichten von 10 kDa und 40 kDa und einer durchschnittlichen Beladung von einer Carb-

oxylgruppe auf zwei Glucose-Einheiten mit Cisplatin und cis-Diammindiaquoplatin(II)

umgesetzt.[131] Die dabei erhaltenen makromolekularen Platin-Prodrugs wiesen einen Pt-

Gehalt von bis zu 15 mmol Platin pro Gramm Polymer auf und zeigten im Falle des

höhermolekularen Konjugats in Tierversuchen eine gegenüber Cisplatin gesteigerte Wirksam-

keit.[132]

n

O

RO

O

OR

RO

O

HO

O

OH

HO

m

HOOC COOH

R =

O

HO

O

OH

HO

O O

COOH COOH

n m

DCM-DEX

OX-DEX

Abb. 1.25 Auf Dextran basierende Polymere mit chelatisierenden Dicarboxylatgruppen


In späteren Arbeiten, die sich auf Dextran als Träger für immobilisiertes Platin stützten,

wurde das Polymer derart modifiziert, daß eine Koordination des Platins durch chelatisierende

Carboxylgruppen ermöglicht wurde. Dextran-Derivate mit solchen Ligandengruppen erhält

man durch Alkylierung des Polymers mit Brommalonsäurediethylester und nachfolgender

Spaltung der Estergruppen[133] (DCM-DEX) oder durch Periodatspaltung von einzelnen

Glucoseeinheiten mit anschließender Oxidation der Aldehydgruppen[134] (OX-DEX, s. Abb.

1.25).

Auf diese Weise modifizierte Dextrane ließen sich mit cis-[Pt(NH3)2](NO3)2 zu den

entsprechenden makromolekularen Platinkomplexen umsetzen, welche ein Molekulargewicht

von 30 kDa und einen Platin-Gehalt von 22 % (OX-DEX) bzw. 9 % (DCM-DEX)

aufwiesen.[135] Platin-tragendes DCM-DEX wurde in einem murinen Colon-26-Xenograft-

Modell hinsichtlich seiner antitumoralen Aktivität

getestet, wobei es eine signifikant höhere Wirksam-

keit als Cisplatin aufwies.[136]

Als weitere makromolekulare Träger für Pla-

tin(II)-Komplexe wurden unter anderem Poly(L-

glutaminsäure),[137] Dicarboxylat-funktionalisiertes

Poly(phosphazen)[138] und Poly(ethylenglykol)[139]

sowie verschiedene HPMA-Copolymere einge-

setzt.[130,140] Unter den letztgenannten Polymeren

erwies sich eine Komplexierung von Platin durch

einen Aminomalonsäureliganden, der über ein

enzymatisch-spaltbares Tetrapeptid (Gly-Phe-Leu-

Gly) an den Träger gebunden wurde, als erfolgreich

(s. Abb. 1.26). Dieses makromolekulare Prodrug

weist einen Platingehalt von 7.5 % bei einem

Molekulargewicht von 24.4 kDa auf und zeigte eine

gesteigerte Wirksamkeit in in-vivo-Experimen-

ten.[140] Es wird derzeit in einer klinischen Phase-I-

Studie am Menschen getestet.[141]

HC CH2

O

NH

HC CH2

O

NH

CH2

O

NH

OPt

O

CH2 C

CH3

C O

NH

CH2

O

NH

OO

NH3H3N

CH2 C

CH3

C O

NH

CH2

CH2OH

CH3

95 5

Abb. 1.26 Platin-Polymer-Konjugat auf

HPMA-Basis mit enzymatisch-spaltbarer

Sollbruchstelle

Bislang existieren jedoch weder Beispiele für makromolekulare Carboplatin-Analoga,

d. h. makromolekulare Prodrugs mit einer komplexierenden Cyclobutan-1,1-dicarboxylat-Ein-

heit, noch albuminbindende Platin(II)-Komplexe mit Dicarboxylatliganden.

30 Einleitung

1.8 Aufgabenstellung und Zielsetzungen

Aufgrund der vielversprechenden Tierversuchsergebnisse, die mit einem albuminbindenden

Doxorubicin-Prodrug (DOXO-EMCH, vgl. 1.3) erzielt wurden, schien es interessant, das dem

zugrunde liegende doppelte Prodrug-Konzept auf andere Zytostatika zu übertragen. Als für

diesen Zweck geeignete Wirkstoffe wurden der Naturstoff Camptothecin, das Stickstofflost-

Alkylanz Bendamustin sowie Platinkomplexe mit Cyclobutan-1,1-dicarboxylatliganden

(Carboplatin-Analoga) ausgewählt.

Zum Erreichen einer für die intravenöse Applikation befriedigenden Wasserlöslichkeit

sollten zunächst maßgeschneiderte heterobifunktionelle Crosslinker auf Oligo(ethylenglykol)-

Basis synthetisiert werden, welche einerseits einen

Maleinimidrest zur Bindung an die Cystein34-

Gruppe von endogenem HSA, andererseits geeig-

nete Funktionalitäten zur Anbindung der Wirk-

stoff(derivat)e aufweisen (s. Abb. 1.27). Dabei

sollte ausgehend von Tri-, Tetra-, und Hexa-

ethylenglykol eine möglichst einfache und flexible

Synthesestrategie entwickelt werden, die sowohl

eine Variation der Kettenlänge als auch der Endgruppen

täten für die Anbindung von Wirkstoff(derivat)en wurd

und Carboxylhydrazidgruppen gewählt.

Auf diese Weise erhaltene heterobifunktionelle

sollten mit Camptothecin-20-O-glycinat zu albuminbinde

Abb. 1.28) (proteinbindende Analoga von PEG-β-CPT, v

O

O

NH

ON

N O

O

O

Abb. 1.28 Zielmoleküle: Albuminbindende Ca

Albuminbindende Bendamustin-Prodrugs sollten durc

Hydrochlorid mit Maleinimidoalkoholen synthetisiert

Darstellung des Carboxylhydrazids von Bendamustin u

NO

O

OR

n

n = 3-6

R = CH2OH, COOH, CH2COOH, CHO, C(O)NHNH2

Abb. 1.27 Zielmoleküle:

Heterobifunktionelle Crosslinker auf

Oligo(ethylenglykol)-Basis

erlaubt. Als geeignete Funktionali-

en Carboxyl-, Aldehyd-, Hydroxy-

Crosslinker mit Carboxylgruppen

nden Prodrugs umgesetzt werden (s.

gl. 1.54):

ON

O

O

3-60,1

mptothecin-Derivate

h Veresterung von Bendamustin-

werden. Daneben sollte durch die

nd anschließender Umsetzung mit

Aufgabenstellung und Zielsetzungen 31

Maleinimidoaldehyden der Zugang zu säurelabilen Bendamustin-Derivaten ermöglicht wer-

den (s. Abb. 1.29):

N

NCH3

N

Cl

ClHN

N

O

OO

N

O

O

2-5

N

NCH3

N

Cl

Cl OO

N

O

O

O2-5

Abb. 1.29 Zielmoleküle: Albuminbindende Bendamustin-Derivate

Da bislang noch keine makromolekularen Prodrugs von Bendamustin bekannt waren, sollte

zusätzlich ein PEG-Konjugat durch eine einfache Veresterung von Bendamustin mit

Poly(ethylenglykol) der molaren Masse 35 kDa hergestellt, charakterisiert und in anschließen-

den Tierversuchsstudien zu Vergleichzwecken herangezogen werden.

Ein weiterer synthetischer Schwerpunkt der

vorliegenden Arbeit lag in der Entwicklung albumin-

bindender Carboplatin-Analoga. Da dieser Wirkstoff

über keine funktionellen Gruppen zur Derivatisie-

rung verfügt, sollte zunächst eine Synthesestrategie

zur Darstellung eines Hydroxy-substituierten Cyclo-

butan-1,1-dicarboxylatliganden erarbeitet werden.

Dieser sollte anschließend mit Maleinimidocarbonsäure

Platinkomplexen zu albuminbindenden Platin(II)-Prodrugs

Ab

Weitere Ziele der vorliegenden Arbeit lagen in der U

sowie der albuminbindenden Eigenschaften der erhaltene

Camptothecin-Derivate sollte zusätzlich die Plasmastabilit

ten Daten der analogen PEG-Konjugate verglichen werden

ten in in-vitro- und in-vivo-Modellen hinsichtlich ihrer tu

tersucht werden.

O

O

O

O

OR

OPt

N

O

O

NH2R'

NH2R'

b. 1.30 Zielmoleküle: Albuminbindende

Carboplatin-Analoga

n verestert und mit geeigneten

umgesetzt werden (s. Abb. 1.30).

ntersuchung der Wasserlöslichkeit

n Wirkstoffderivate. Im Falle der

ät bestimmt und mit den publizier-

. Ferner sollten geeignete Kandida-

morhemmenden Eigenschaften un-

32 Ergebnisse und Diskussion


2.1 Heterobifunktionelle Crosslinker auf Oligo(ethylenglykol)-Basis

2.1.1 Allgemeines

Aufgrund ihres chemisch inerten Ether-Rückgrats, das eine Löslichkeit sowohl in wäßrigen

als auch in den meisten organischen Medien ermöglicht, sollten heterobifunktionelle Cross-

linker auf Oligo(ethylenglykol)-Basis für die Generierung albuminbindender Zytostatika-

Prodrugs geeignet sein. Dabei erfolgt die Anbindung des Wirkstoffs über eine geeignete

(aktivierte) Funktionalität in organischen Lösungsmitteln, während eine anschließende Kopp-

lung an Serumalbumin über eine Maleinimidgruppe im wäßrigen Milieu der Blutbahn reali-

siert wird:

2-5

OO

N

O

O

1. Schritt

2. Schritt

Wirkstoff

Anbindung des Wirkstoffs im organischen Lösungsmittel

SHSerumalbumin

Kopplung an Serumalbumin in der Blutbahn (wäßrig)

Abb. 2.1 Einsatzmöglichkeit heterobifunktioneller Maleinimid-tragender Crosslinker

Als Ausgangsverbindungen für die Synthese der heterobifunktionellen Crosslinker eignen

sich Tri-, Tetra-, Penta- und Hexaethylenglykol, die in Reinform kommerziell erhältlich sind.

Jedoch fällt beim Vergleich der Preise auf (Aldrich, Katalog 2000/2001), daß beide länger-

kettige Homologe um ein Vielfaches teurer sind (Pentaethylenglykol: 410,80 DM, Hexa-

ethylenglykol: 257,80 DM, jeweils für 25 g) als die beiden kürzerkettigen Alkohole (Tri-

ethylenglykol: 23,70 DM, Tetraethylenglykol: 27,40 DM, jeweils pro Liter(!)). Daher wurden

die im folgenden beschriebenen Synthesen zuerst mit Tri- und Tetraethylenglykol als

Ausgangssubstanzen entwickelt und später auf Hexaethylenglykol übertragen. Pentaethylen-

glykol wurde aufgrund seines unverhältnismäßig hohen Preises nicht verwendet.

Heterobifunktionelle Crosslinker auf Oligo(ethylenglykol)-Basis 33

2.1.2 Überlegungen zur Synthesestrategie

2.1.2.1 Überblick

Die Idee, Oligo(ethylenglykole) als Rückgrat für wasserlösliche Crosslinker oder Spacer-

moleküle einzusetzen, ist nicht neu, und somit existiert eine Anzahl von Veröffentlichungen,

in denen die Darstellung unsymmetrisch funktionalisierter Oligo(ethylenglykole)[142-147]

sowie homobifunktioneller N-Hydroxysuccinimidylester (NHS-Ester)[148] beschrieben wurde.

Jedoch sind bislang lediglich zwei Beispiele für Maleinimid-tragende Oligo(ethylenglykole)

bekannt: Frisch et al. veröffentlichten die Darstellung einer Maleinimidocarbonsäure, die

ausgehend von Triethylenglykol in einer fünfstufigen Synthese mit einer Gesamtausbeute von

19 % erhalten wurde,[147] während Walker eine Maleinimidgruppe über eine Mitsunobu-

Reaktion in Pentaethylenglykol einführte:[149]

NO

OO

O

O

O

OHN

OO COOH

O

O

Abb. 2.2 Von Frisch et al. (links) und Walker et al. (rechts) synthetisierte Maleinimidverbindungen

Die dabei zur Einführung der Maleinimidgruppe angewandten Reaktionen werden im folgen-

den näher betrachtet.

2.1.2.2 Methoden zur Einführung von Maleinimidgruppen

Die hohe (erwünschte) Reaktivität von Maleinimiden führt auch zu vielfältigen Nebenreaktio-

nen wie der basenkatalysierten Ringöffnung zur Maleaminsäure, der Addition von Nucleophi-

len an die Doppelbindung sowie Autopolymerisationsreaktionen, welche für die Empfindlich-

keit dieser Substanzklasse verantwortlich sind. Bei der Einführung von Maleinimidgruppen

müssen diese Besonderheiten berücksichtigt werden.

Die meisten Reaktionen gehen von primären Aminen aus, die zunächst mit Malein-

säureanhydrid zum Maleaminsäure-Derivat umgesetzt werden:

O

O

O

H2N R

COOH

NH

R

O

+

Abb. 2.3 Reaktion von primären Aminen mit Maleinsäureanhydrid


Anschließend erfolgt eine Ringschlußreaktion unter Wasserabspaltung, die entweder durch

Acetanhydrid (Methode a),[150] durch Triethylamin unter Bedingungen der azeotropen

Wasserabscheidung (Methode b),[151] durch Hexamethyldisilazan (HMDS) und Lewis-Säure

(Methode c)[152] oder durch Mikrowellenbestrahlung (Methode d)[153] katalysiert wird:

N

O

O

R

COOH

NH

R

O a) Ac2Ob) Et3N, Toluol

c) HMDS, ZnBr2, Benzold) Mikrowellen

Abb. 2.4 Maleinimid-Synthesen durch Ringschlußreaktionen

Alle obengenannten Methoden besitzen den Nachteil relativ harscher Reaktionsbedingungen

und sind daher nur für unempfindliche Substrate geeignet.

Eine mildere Methode stellt die Umsetzung mit N-Methoxycarbonylmaleinimid in

wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung dar:[154]

N

O

O

RN

O

O

O

OCH3

H2N R+NaHCO3 aq.

Abb. 2.5 Reaktion von primären Aminen mit N-Methoxycarbonylmaleinimid

Eine sorgfältige Kontrolle der Reaktionsbedingungen ist hierbei von entscheidender Bedeu-

tung, da die Bildung des Maleinimids in Konkurrenz zur basenkatalysierten Ringöffnung

steht.[147]

Da Amine als Ausgangssubstanzen für Maleinimidsynthesen schwerer zugänglich sind

als die analogen Alkohole, können Reaktionen, in denen Hydroxygruppen durch Maleinimide

substituiert werden, als besonders wertvoll angesehen werden – vor allem im Hinblick auf

eine Derivatisierung von Oligo(ethylenglykolen). So gelang es Walker, die von Mitsunobu

entdeckte Alkylierungsreaktion[155] auf die Maleinimidsynthese anzuwenden:[149]

N

O

O

RNH

O

O

HO R+DEAD, PPh3

THF

Abb. 2.6 Mitsunobu-Reaktion mit Maleinimid


Dabei zeigte sich, daß diese Umsetzung nicht so gradlinig verläuft wie die seit langem

bekannte Reaktion mit ähnlichen Substraten wie z. B. Phtalimid (zur Umwandlung von

Alkoholen in Amine bei gleichzeitiger Inversion). Die eingesetzten Alkohole ließen sich nur

in mittelmäßigen Ausbeuten (31–73 %) zu den entsprechenden Maleinimiden umsetzen.

Walker gelang jedoch eine Optimierung der Reaktionsbedingungen und damit eine Steigerung

der Ausbeute auf 83–90 % je nach verwendetem Alkohol.[156] Als entscheidend wurde hierbei

die Durchführung bei –78 °C, eine modifizierte Stöchiometrie und Reihenfolge der Zugabe

der einzelnen Komponenten bewertet.

2.1.3 Allgemeine Synthesestrategie

Bei der Synthese der heterobifunktionellen Crosslinker wurde mit Ausnahme des einstufigen

Verfahrens zur Darstellung der Maleinimidoalkohole (s. 2.14) eine gemeinsame Strategie

verfolgt, die aus drei Hauptschritten besteht:

HOO

OH

2,3,5

HOO

O RPG

2,3,5

NO

O RPG

O

O 2,3,5

NO

O R

O

O 2,3,5

1. Schritt

2. Schritt

3. Schritt

unsymmetrische Alkylierung

Mitsunobu-Reaktion

Abspaltung derSchutzgruppe

R = CHO, COOH, CH2COOH, CONHNH2 PG = Schutzgruppe

Abb. 2.7 Allgemeine Synthesestrategie zur Darstellung der heterobifunktionellen Crosslinker

Im ersten Schritt erfolgt eine unsymmetrische Alkylierung des Oligo(ethylenglykols), bei der

die erste (geschützte) Funktionalität in das Molekül eingefügt wird. (Im Falle des Malein-

imidocarbonsäurehydrazids besteht dieser erste Schritt aus einer dreistufigen Synthesesequenz

(s. 2.16).) Der Vorteil einer Alkylierung der Alkohole gegenüber einer ebenfalls möglichen

Oxidation der OH-Gruppe liegt in der dabei erreichbaren Kettenverlängerung. So führt z. B.

eine Monoalkylierung von Hexaethylenglykol mit Chloressigsäure zu Heptaethylenglykol-

Monocarbonsäure, während eine oxidative Alternativsynthese von Heptaethylenglykol

ausgehen müßte – einer Verbindung, die kommerziell nicht erhältlich ist.


Im zweiten Schritt erfolgt die Einführung der Maleinimidgruppe mit Hilfe der Mitsunobu-

Reaktion, bevor im dritten und letzten Schritt die zweite Funktionalität selektiv entschützt

wird. Dabei muß die Empfindlichkeit der Maleinimidgruppe berücksichtigt werden, die z. B.

eine Schutzgruppenabspaltung unter basischen Bedingungen nicht zuläßt. In den folgenden

Abschnitten werden diese Synthesen im einzelnen beschrieben.

2.1.4 Synthese der Maleinimidoalkohole

Die Synthese der Maleinimidoalkohole 1 und 2 erfolgte analog zu der von Walker et al.

beschriebenen Umsetzung von Pentaethylenglykol mit Maleinimid unter Mitsunobu-Bedin-

gungen[149,156] (s. Abb. 2.8).

HOO

H

n

NH

O

O

Ph3P, DIAD

THF / -78 °C

1: n = 4 (24 %)2: n = 6 (46 %)

+2 NO

H

O

O n

Abb. 2.8 Synthese von 1 und 2 mit Hilfe der Mitsunobu-Reaktion

Dazu wurde Triphenylphosphin in wasserfreiem THF vorgelegt, auf –78 °C gekühlt und

DIAD zugetropft. Anschließend wurden im Abstand von 5 Minuten zuerst ein Überschuß an

Tetra- bzw. Hexaethylenglykol (zwei Äquivalente) und danach Maleinimid zugegeben. Die

Maleinimidoalkohole 1 und 2 wurden nach säulenchromatographischer Reinigung an

Kieselgel als farblose Öle erhalten, die zu Polymerisationsreaktionen neigen, jedoch bei

–20 °C über einen längeren Zeitraum stabil sind.

Die Ursache für die niedrigen Ausbeuten (24 % (1) und 46 % (2)) gegenüber derjenigen

der literaturbeschriebenen Synthese des Pentaethylenglykol-Derivats (Ausbeute: 66 %) sind

wahrscheinlich auf die modifizierte Prozedur (–78 °C statt Raumtemperatur, veränderte

Reihenfolge der Zugabe) zurückzuführen. (Für eine weiterführende Diskussion s. 2.1.9.)

Die Maleinimidoalkohole 1 und 2 eignen sich zur Bindung an Wirkstoffe mit einer

freien Carbonsäuregruppe, wie z. B. die Alkylanzien Chlorambucil oder Bendamustin. Eine

Veresterung mit zuletzt genanntem führt zu wasserlöslichen Bendamustin-Prodrugs, auf deren

Synthese, Charakterisierung und biologische Eigenschaften in Kapitel 2.3 näher eingegangen

wird.


2.1.5 Synthese eines Maleinimidoaldehyds

Seit längerer Zeit ist bekannt, daß Aldehyde, die in α-Stellung eine elektronenziehende

Alkoxygruppe tragen, keine hohe Stabilität aufweisen und zu Polymerisationsreaktionen

neigen.[157] Daher wurde bei der Darstellung des Maleinimidoaldehyds (5) eine Synthese-

strategie angewendet, bei der erst im letzten Schritt der Aldehyd freigesetzt wird.

Abbildung 2.9 zeigt den Syntheseweg zum Maleinimidoaldehyd 5. Im ersten Schritt

erfolgte eine Monoalkylierung mit Bromacetaldehyddiethylacetal, wodurch die Einführung

einer geschützten Aldehyd-Funktion gelang. Dazu wurde ein fünffacher Überschuß an

Triethylenglykol mit Natriumhydrid deprotoniert und mit dem Alkylierungsmittel versetzt.

20stündiges Erhitzen unter Rückfluß in Dioxan lieferte nach säulenchromatographischer

Reinigung das Diethylacetal 3, das in einer Ausbeute von 70 % erhalten wurde. Anschließend

konnte die Maleinimidgruppe mit Hilfe der Mitsunobu-Reaktion eingeführt werden.

HOO

H

3

NO

O

O

OEt

OEt3

HOO

OEt

OEt3

NO

O

OCHO

3

THF / -78 °C

Ph3P, DIAD

BrOEt

OEt+

NaH

Dioxan / Rückfluß

HN

O

O3 (70 %)

4 (66 %)5 (75 %)

H2SO4 (50 %)

Aceton

OH

5

Abb. 2.9 Synthese des Maleinimidoaldehyds 5

Die Freisetzung des Aldehyds durch säurekatalysierte Hydrolyse des Diethylacetals 4 in

Aceton erwies sich zunächst als problematisch, da anfängliche Versuche unter Verwendung

des Standardreagenz' para-Toluolsulfonsäure zwar eine quantitative Spaltung erzielten, die

Isolierung des Produkts jedoch aufgrund einer rasch stattfindenden Polymerisation beim

Einengen der Reaktionsmischung unmöglich war. Erfolgreicher war hingegen der Einsatz von

50 %iger Schwefelsäure als Katalysator. Diese läßt sich durch Zugabe von Calciumhydroxid

quantitativ vor dem Entfernen des Lösungsmittels als festes Calciumsulfat abtrennen. Nach

säulenchromatographischer Reinigung des Rohprodukts wurde der Maleinimidoaldehyd 5 in


einer Ausbeute von 75 % erhalten. Diese Verbindung ist jedoch so empfindlich, daß nur eine

10 %ige Lösung von 5 in THF eine Lagerung (ein bis zwei Wochen bei –20 °C) übersteht.

2.1.5.1 Anwendung

Auf dem Gebiet der Bioconjugation werden Aldehyde (z. B. Glutaraldehyd) normalerweise

als spezifische Kopplungsreagenzien für primäre Amine eingesetzt, die nach Ausbildung

einer Iminbindung mit Natriumborhydrid zum sekundären Amin reduziert werden (reduktive

Aminierung).[55] Für die Entwicklung wasserlöslicher proteinbindender Zytostatika-Prodrugs

ist jedoch die Reaktion mit Carboxylhydraziden bedeutsamer, welche zur Ausbildung von

Hydrazonbindungen führt. Hierbei übernimmt die Hydrazonbindung die Rolle einer säure-

labilen Sollbruchstelle, die unter physiologischen Bedingungen (pH 7.4) stabil, nach Auf-

nahme in die Tumorzelle – bedingt durch den bis zu 3 Einheiten niedrigeren endosomalen

bzw. lysosomalen pH-Wert – gespalten wird und damit eine Freisetzung des Wirkstoffs

erlaubt.[44,158]

Durch Umsetzung von 5 mit Benzoylhydrazid konnte das Modellhydrazon 6

synthetisiert werden (s. Abb. 2.10), das im Gegensatz zum Aldehyd 5 stabil ist und dessen

photometrisch bestimmte Wasserlöslichkeit von 2.3 mg/mL bemerkenswert hoch liegt. Für

die parenterale Applikation albuminbindender Prodrugs wäre für die meisten Zytostatika eine

Löslichkeit dieser Größenordnung ausreichend.

NO

O

OCHO

3

NO

O

O

NNH

O

3

H2N NH

O

THF

5 6 (48 %)

Abb. 2.10 Synthese eines Modellhydrazons (6)

5 sollte sich daher – trotz seiner hohen Neigung zu Autopolymerisation – zur Darstellung

säurelabiler Prodrugs durch Umsetzung mit Carboxylhydrazid-tragenden Zytostatika-Deriva-

ten eignen. Das Stickstofflost-Alkylanz Chlorambucil ist ein Beispiel für ein Zytostatikum mit

einer Carboxylgruppe, das sich zum Carboxylhydrazid derivatisieren läßt.[159] Beyer et al.

konnten zeigen, daß Chlorambucil-Hydrazid zur Darstellung säurelabiler Albumin- und

Transferrin-Konjugate geeignet ist.[39,159] In Kapitel 2.3.3 ist die Umsetzung von Benda-

mustin-Hydrazid, einer dem Chlorambucil-Hydrazid analogen Verbindung, mit 5 zur Syn-

these eines potentiell säurelabilen albuminbindenden Prodrugs beschrieben.


2.1.6 Synthese eines Maleinimidocarbonsäurehydrazids

Die Darstellung eines Boc-geschützten Maleinimidocarbonsäurehydrazids (10) gelang

ausgehend von Triethylenglykol in einer vierstufigen Synthese (s. Abb. 2.11). Im ersten

Schritt erfolgte eine literaturbeschriebene Alkylierung des Oligo(ethylenglykols) mit Diazo-

ethylacetat unter Lewis-Säure-Katalyse,[160] die in guten Ausbeuten den Monoethylester 7

lieferte. Anschließend ließ sich 7 in hohen Ausbeuten zum Hydrazid 8 umsetzen, das mit Di-

tert.-butyldicarbonat (Boc2O) quantitativ zum Boc-geschützten Hydrazid 9 reagierte. Durch

Anwendung der Mitsunobu-Reaktion auf 9 wurde das Boc-geschützte Maleinimidohydrazid

10 als farbloses Öl in einer Ausbeute von 33 % erhalten.

HOO

H

3N+

OEt

N-O HO

OOEt

O3

HOO

HN

O

NH2

3

HOO

HN

O

NHBoc

3

NO

HN

O

NHBoc

O

O 3

+BF3*Et2O

CH2Cl2

Hydrazin MeOH

Boc2O

CH2Cl2

NH

O

O Ph3P, DIAD

THF / -78 °C

7 (70 %)

8 (85 %)9 (100 %)

10 (33 %)

OH

5

Abb. 2.11 Synthese des Maleinimidohydrazids 10

Durch Behandlung mit Trifluoressigsäure (TFA) läßt sich die Boc-Schutzgruppe von 10 leicht

und quantitativ entfernen, wie durch Dünnschichtchromatographie gezeigt werden konnte. Es

empfiehlt sich jedoch nicht, das Hydrazid (als Trifluoracetat) zu isolieren, da die

überschüssige TFA nur schwer entfernt werden kann und Maleinimide in Gegenwart von

Säure zu Polymerisationsreaktionen neigen. Ebensowenig ist es ratsam, durch Zugabe von


Base das Hydrazid freizusetzen, da dieses als gutes Nucleophil an die reaktive Maleinimid-

Doppelbindung addieren kann, was ebenfalls zur Polymerisation führt.

2.1.6.1 Anwendung

Maleinimid-tragende heterobifunktionelle Crosslinker mit Carboxylhydrazidgruppen lassen

sich u. a. mit Wirkstoffen (oder Wirkstoffderivaten) umsetzen, die eine Aldehyd- oder Keto-

Funktion tragen. Die dabei erhaltenen albuminbindenden Wirkstoffderivate weisen säure-

labile Hydrazonbindungen auf, welche die Funktion von Sollbruchstellen einnehmen können

(vgl. 2.1.5.1).

L. Frey konnte in ihrer Diplomarbeit zeigen, daß sich das Boc-geschützte Hydrazid 10

durch Behandlung mit TFA zum Hydrazid 11 entschützen läßt, welches ohne weitere Auf-

reinigung mit dem Paclitaxel-Derivat 12 zum albuminbindenden Derivat 13 reagiert (s. Abb.

2.12).[161]

NO

HN

O

NHR

O

O 3

OH

OAc

H

OBz

OAcO

HO

OH

O

NHBz

O

O

O

ON

OH

OAc

H

OBz

OAcO

HO

OH

O

NHBz

O

O

O

N NH O

O

O

O

3

+

10: R = Boc11: R = H

TFA12 13

THF

Abb. 2.12 Synthese des von L. Frey synthetisierten Derivats von Paclitaxel

Erste Untersuchungen der Wasserlöslichkeit hatten ergeben, daß diese zwar über derjenigen

von Paclitaxel liegt, für eine parenterale Applikation ohne Löslichkeitsvermittler jedoch nicht

ausreichen würde. Mit einem ähnlichen Linker, der drei zusätzliche Ethylenglykol-Einheiten

aufwies, ließ sich die Wasserlöslichkeit verbessern.[161]

2.1.7 Synthese der Maleinimidocarbonsäuren

Die Synthese der Maleinimidocarbonsäuren erfolgte im Hinblick auf eine spätere Bindung an

ein Amin-funktionalisiertes Camptothecin-Derivat zur Darstellung albuminbindender CPT-

Prodrugs, wobei die daraus resultierende Amidbindung die Funktion einer Sollbruchstelle

einnimmt. Zur Erarbeitung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen sollte der Einfluß einer

elektronenziehenden Alkoxygruppe in α-Stellung zum Amid auf die Spaltbarkeit untersucht

werden. Aus diesem Grund wurden zwei verschiedene Typen von Maleinimidocarbonsäuren


synthetisiert – Essigsäure- und Propionsäure-Derivate. Letztgenannte tragen eine Alkoxy-

gruppe in β-Stellung zur Carbonsäure. Ein elektronenziehender Effekt auf die Carboxyl-

gruppe liegt hierbei nicht vor.

Die Synthese der Maleinimidocarbonsäuren gelang in drei Stufen: Alkylierung zur

Einführung einer als tert.-Butylester geschützten Carbonsäuregruppe, Mitsunobu-Reaktion

mit Maleinimid und Abspaltung der Schutzgruppe. Zur Darstellung der Essigsäure-Derivate

wurde im ersten Schritt die Alkylierung ein Überschuß an Tri- bzw. Hexaethylenglykol mit

tert.-Butylbromacetat alkyliert (s. Abb. 2.13).

HOO

OtBu

On

HOO

H

n

BrOtBu

O

Methode A: NaH, THF, 20h bei RT

Methode B: KH, THF, 20h unter Rückfluß+

14: n = 3 (29 %, Methode A)15: n = 6 (68 %, Methode B)

5

Abb. 2.13 Alkylierung von Tri- und Hexaethylenglykol mit tert.-Butylbromacetat

Da bekannt ist, daß Reaktionen mit diesem Alkylanz nur unter Phasentransfer-Bedingungen

befriedigende Ausbeuten liefern[148] (durch die dabei bevorzugte Bildung des dialkylierten

Produkts scheidet diese Variante für Monoalkylierungs-Reaktionen aus), wurden verschie-

dene Methoden ausprobiert: Die Verwendung von Natriumhydrid als Base und Durchführung

bei Raumtemperatur (Methode A) lieferte trotz vollständigem Umsatz (DC-Kontrolle) nur

bescheidene Ausbeuten (29 %). Ähnliche Ergebnisse wurden mit Kaliumcarbonat und

Acetonitril, einer weiteren Standardmethode, erzielt. Unter Verwendung einer literatur-

beschriebenen Variante mit Kaliumhydrid als Base und Erhitzen unter Rückfluß (Methode

B)[162] konnte indes die Ausbeute auf 68 % gesteigert werden.

Als unkomplizierter erwies sich hingegen die Darstellung der Propionsäure-Derivate

16–18 durch Anwendung der bekannten Alkylierungsreaktion mit tert.-Butylacrylat.[163] Dazu

wurde ein Überschuß an Tri- Tetra- und Hexaethylenglykol mit einer katalytischen Menge

Base und tert.-Butylacrylat behandelt (s. Abb. 2.14).

HOO OtBu

O

n

HOO

H

nOtBu

O+

KOtBu (kat.)

THF

16: n = 3 (73 %)17: n = 4 (64 %)18: n = 6 (80 %)

5

Abb. 2.14 Alkylierung von Tri-, Tetra- und Hexaethylenglykol mit tert.-Butylacrylat


Die tert.-Butylester 16–18 wurden nach säulenchromatographischer Reinigung in akzeptablen

Ausbeuten von 64–80 % als farblose Öle erhalten.

Zur Einführung der Maleinimidgruppe wurden die tert.-Butylester 14–18 mit

Maleinimid unter Mitsunobu-Bedingungen umgesetzt (s. Abb. 2.15). Dabei kamen drei

unterschiedliche Methoden zum Einsatz, die aufgrund der fundamentalen Bedeutung der

Mitsunobu-Reaktion für die Synthese Maleinimid-tragender heterobifunktioneller Crosslinker

auf Oligo(ethylenglykol)-Basis ausführlich in Kapitel 2.1.9 diskutiert werden.

NO

O

O

O

O n

HOO

O

On

HOO O

O

n

NO O

OO

O n

16: n = 317: n = 418: n = 6

21: n = 3 (58 %, Methode A)22: n = 4 (68 %, Methode C)23: n = 6 (25 %, Methode B)

19: n = 3 (37 %, Methode A)20: n = 6 (31 %, Methode B)

14: n = 315: n = 6

Methode A: Ph3P, -78 °C Methode B: Ph3P (polymergeb.), 0 °C Methode C: Ph3P, RT

OHHNO O DIAD/THF

Abb. 2.15 Einführung der Maleinimidgruppe mit Hilfe der Mitsunobu-Reaktion

Die Verwendung von polymergeträgertem Triphenylphosphin bei den Hexaethylenglykol-

Derivaten (Methode C) erwies sich als notwendig, da bei Einsatz von Triphenylphosphin eine

säulenchromatographische Abtrennung des Produkts vom ebenfalls gebildeten Triphenyl-

phosphinoxid nicht möglich war. Polymergebundenes Triphenylphosphinoxid läßt sich im

Gegensatz dazu mit Hilfe einer einfachen Filtration entfernen.

Im letzten Syntheseschritt wurden die Maleinimidocarbonsäuren 24–28 durch

Abspaltung der tert.-Butylester-Schutzgruppen mit Trifluoressigsäure erhalten (s. Abb. 2.16).

Dabei erwies sich die Abtrennung von der im Überschuß eingesetzten TFA als schwierig, da

sich diese auch im Hochvakuum (trotz ihres niedrigen Siedepunkts von 72 °C) nur teilweise

entfernen ließ, wobei es wahrscheinlich zu einer Aggregatbildung mit dem Produkt kam. Der


Versuch einer säulenchromatographischen Trennung erbrachte hierbei nur unbefriedigende

Ergebnisse. Erst durch Einsatz des schwach basischen Ionenaustauschers Amberlyst A-21

gelang eine vollständige Entfernung der Trifluoressigsäure.

NO

O

O

O

O n

NO O

OO

O n

21: n = 322: n = 423: n = 6

19: n = 320: n = 6

TFA / CH2Cl2 quant.

24: n = 325: n = 6

26: n = 327: n = 428: n = 6

NO COOH

O

O n

NO

COOH

O

O n

Abb. 2.16 Abspaltung der tert.-Butylester-Schutzgruppen mit Trifluoressigsäure

Durch Anwendung dieser Methode ließen sich die Maleinimidocarbonsäuren 24–28 als

farblose Öle in quantitativer Ausbeute gewinnen. Die Lagerung muß bei –20 °C erfolgen, da

auch hier eine Neigung zu Polymerisationsreaktionen zu beobachten war (vgl. 2.1.4–2.15).

24–28 eignen sich zur Darstellung albuminbindender Camptothecin-Prodrugs, deren

Synthese und Eigenschaften in Kapitel 2.2 ausführlich diskutiert werden.

2.1.8 Charakterisierung der heterobifunktionellen Crosslinker

Die Charakterisierung der in den vorhergehenden Kapiteln beschriebenen heterobi-

funktionellen Crosslinker (1, 2, 5, 10, 24–28) sowie aller Vorstufen erfolgte mittels 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie. (Elementaranalysen konnten zur Bestätigung der vorgeschlagenen

Struktur nicht herangezogen werden, da sich bei Mehrfachbestimmungen Standardab-

weichungen von bis zu zehn Prozent ergaben.)


1H- und 13C-NMR-Spektren der Crosslinker wurden in deuteriertem Chloroform aufgenom-

men. Das Vorhandensein der Maleinimidgruppe wird durch das Signal der beiden

olefinischen Protonen als scharfes Singulett im Bereich 6.70–6.73 ppm im 1H-NMR-

Spektrum und der Resonanzen der Kohlenstoffkerne der Doppelbindung bei 134.2 ppm, der

Carbonylgruppen bei 171 ppm sowie des Kohlenstoffkerns in Nachbarschaft zum Imid-

Stickstoff bei 37.1 ppm im 13C-NMR-Spektrum belegt.

Bei den Maleinimidoalkoholen 1 und 2 erscheint das Signal der Hydroxygruppe als

breites Singulett bei 2.77 ppm (1) bzw. 2.94 ppm (2) im 1H-NMR-Spektrum. Ein charak-

teristisches Signal im 13C-NMR-Spektrum ist durch die Resonanz der CH2OH-Gruppe bei

61.7 ppm gegeben.

Das Signal des Aldehyd-Protons bei 5 erscheint als gerade noch erkennbares Triplett

(J = 0.7 Hz) bei 9.73 ppm. Im 13C-NMR-Spektrum beobachtet man eine Resonanz des

zugehörigen Carbonyl-Kohlenstoffs bei 200.99 ppm.

Charakteristisch für das Maleinimidohydrazid 10 sind die Signale der beiden NH-

Gruppen, welche jeweils als breites Singulett bei 6.71 ppm und 8.85 ppm im 1H-NMR-

Spektrum erscheinen. Die Signale der Boc-Gruppe sind durch das Singulett der drei

Methylgruppen bei 1.48 ppm im 1H-NMR-Spektrum sowie den Resonanzen bei 28.16 ppm,

81.48 ppm und 155.21 ppm im 13C-NMR-Spektrum gegeben.

Die Signale der Carboxylgruppen von 24–28 erscheinen jeweils als breites Singulett an

unterschiedlicher Position im 1H-NMR-Spektrum. Im 13C-NMR-Spektrum ist jedoch eine

charakteristische Resonanz der Carboxyl-Kohlenstoffkerne im Bereich 172–176 ppm

sichtbar.

2.1.9 Die Mitsunobu-Reaktion mit Maleinimid – Versuch einer Optimierung

Aufgrund der fundamentalen Bedeutung der Mitsunobu-Alkylierung von Maleinimid für die

Entwicklung wasserlöslicher Crosslinker auf Oligo(ethylenglykol)-Basis erschien es sinnvoll,

diese Reaktion näher zu betrachten und die Ursachen für die mit ihr erzielten geringen bis

moderaten Ausbeuten (vgl. 2.1.4–2.1.7) zu untersuchen.

1994 publizierten Walker et al. erstmalig den Einsatz der Mitsunobu-Reaktion zur

Einführung von Maleinimidgruppen.[149] Die Reaktionsführung entsprach hierbei im

wesentlichen derjenigen der Mitsunobu-Veresterung: Zugabe von DIAD (Diisopropyl-

azodicarboxylat) zu einer Lösung des Alkohols, Triphenylphosphin und Maleinimid in THF

bei Raumtemperatur. Die dabei erzielten Ausbeuten bewegten sich zwischen 31 %


(Isopropanol) und 75 % (Allylalkohol). In einer kurz darauf publizierten Arbeit berichtete

Walker von einer entscheidenden Verbesserung der Ausbeuten auf 83–90 %, die durch

Verwendung von DEAD (Diethylazodicarboxylat), Durchführung der Reaktion bei –78 °C,

Verwendung von Neopentylalkohol zur Simulation eines Überschusses an Alkohol und

modifizierter Reihenfolge der Zugabe (Triphenylphosphin, DEAD, Alkohol, Neopentyl-

alkohol und Maleinimid) erzielt wurden.[156]

Nachdem sich durch Anwendung dieser Vorgehensweise die Verbindungen 1, 2, 4, 10,

19 und 21 lediglich in Ausbeuten von 24–66 % isolieren ließen, wurden zur Optimierung der

Reaktion 3-mL-Probeansätze durchgeführt (s. 4.1.4), die mittels HPLC analysiert wurden.

Durch Umsetzung von 17 mit Maleinimid sollte der Einfluß der Reaktionstemperatur (–78 °C,

0 °C und Raumtemperatur) sowie der Reihenfolge der Zugabe der einzelnen Reaktanden

(Mitsunobu-Veresterung, modifizierte Variante nach Walker) evaluiert werden. Die Detektion

Maleinimid-haltiger Verbindungen erfolgte durch UV-Messung bei λ = 297 nm, bei der eine

charakteristische Absorption der Maleinimid-Doppelbindung auftritt. Die Konzentrationen

des gebildeten Produkts (22) wurden mit Hilfe der Eichgeraden einer Verdünnungsreihe der

Referenz ermittelt.

Die Anwendung dieser Methode erwies sich jedoch als zu ungenau, um quantitative

Bestimmungen der Ausbeuten vorzunehmen, da bei Mehrfachbestimmungen Standardab-

weichungen von ca. 10 % auftraten. Dennoch ließen sich qualitative Aussagen über den

Reaktionsverlauf treffen, die größtenteils im Widerspruch zu den Ergebnissen von Walker

stehen. So ließ sich feststellen, daß die Reaktion bereits nach 20 Minuten beendet ist und im

Gegensatz zu Walkers Beobachtungen weder die Anfangstemperatur, noch die Reihenfolge

der Zugabe eine signifikante Auswirkung auf die erzielte Ausbeute hatte (die gemessenen

Ausbeuten betrugen im Mittel 50 %, die bei –78 °C durchgeführten Reaktionen schnitten

diesbezüglich sogar schlechter ab). Walker hatte die modifizierte Reihenfolge der Zugabe, bei

der Maleinimid erst zum Schluß zur Reaktionsmischung gegeben wird, damit begründet, daß

sowohl Triphenylphosphin als gutes Nucleophil als auch der PPh3-DIAD-Komplex mit

Maleinimid reagieren könnten und damit für eine Senkung der Ausbeute verantwortlich

wären. Beide Phänomene ließen sich bei den durchgeführten Untersuchungen nicht

beobachten, da unabhängig von der Reihenfolge der Zugabe in allen Fällen nach Abschluß

der Reaktion (5 h) eine große Menge nicht-umgesetztes Maleinimid, das äquimolar eingesetzt

wurde, in der Reaktionsmischung vorlag.

Anhand dieser Ergebnisse läßt sich vermuten, daß die unbefriedigenden Ausbeuten der

Mitsunobu-Reaktion mit Maleinimid wahrscheinlich auf die geringe Reaktivität (Nucleo-


philie) dieser Verbindung zurückzuführen sind.

Ein weiteres Indiz hierfür lieferte die Beob-

achtung eines Nebenprodukts, das bei der Re-

aktion von 18 in einem Verhältnis von 1:2 zum

gewünschten Produkt (23) anfiel. Mit Hilfe

NMR-spektroskopischer Methoden ließ sich die-

se Verbindung als Kondensationsprodukt des

Alkohols mit dem reduzierten DIAD identifizieren (Struktur s. Abb. 2.17). Solche Neben-

produkte werden normalerweise nur bei Abwesenheit des Nucleophils beobachtet.[164]

O NN O

O OO

COOtBu

5

HO

Abb. 2.17 Nebenprodukt der Mitsunobu-

Reaktion mit 18

Abschließend läßt sich feststellen, daß eine Optimierung der Mitsunobu-Reaktion mit

Maleinimiden nur mit Hilfe ausführlicher mechanistischer Studien möglich ist, die jedoch im

Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht durchgeführt werden konnten. Dennoch ließ sich durch

eine rein qualitative Abschätzung zeigen, daß die literaturbeschriebene aufwendige

Durchführung bei –78 °C bei Verwendung von Oligo(ethylenglykolen) als Alkohole nicht

notwendig ist. Ebensowenig trägt die von Walker beschriebene modifizierte Reihenfolge der

Zugabe der Reaktanden zu einer merklichen Ausbeutezunahme bei. Die Synthesen von 20, 22

und 23 wurden daher nach der Methode der Mitsunobu-Veresterung durchgeführt.

2.1.10 Zusammenfassung

Heterobifunktionelle Crosslinker stellen wichtige Bausteine zur kovalenten Verknüpfung von

Biomolekülen sowie zur Bindung niedermolekularer Substanzen (z. B. Fluoreszenzmarker

oder Wirkstoffe) an Biomoleküle dar. Obwohl in den letzten drei Jahrzehnten große

Fortschritte auf dem Gebiet der Kopplungschemie unter Benutzung solcher Verbindungen

erzielt wurden,[55,59,60] schenkte man der chemischen Beschaffenheit des Linker-Rückgrats

wenig Aufmerksamkeit. So weisen kommerziell erhältliche Crosslinker zumeist ein unpolares

Alkyl- oder Aryl-Rückgrat auf – im Widerspruch zum wäßrigen Reaktionsmedium. Dagegen

sind hydrophile Crosslinker bisher rar, was durch das geringe Angebot käuflicher

wasserlöslicher Verbindungen belegt wird. Während für biochemische Kopplungszwecke

meist ein Einsatz DMF-haltiger Crosslinker-Lösungen und auftretende Fällungen mangels

fehlender (preiswerter) Alternativen in Kauf genommen werden, war es im Falle der vorliegen

Arbeit unumgänglich, wasserlösliche Maleinimid-tragende Crosslinker für die Anwendung

des in Kapitel 1.3 vorgestellten doppelten Prodrug-Konzeptes maßzuschneidern. Hierbei


kamen Oligo(ethylenglykole) aufgrund ihrer hohen Löslichkeit in organischen, aber auch

wäßrigen Medien und ihres chemisch inerten Charakters zum Einsatz.

Ausgehend von Tri-, Tetra- und Hexaethylenglykol konnte mit Hilfe einer aus drei

Hauptschritten bestehenden Synthesesequenz, welche erstens die Einführung einer geschütz-

ten Funktionalität durch unsymmetrische Alkylierung, zweitens die Einführung einer

Maleinimidgruppe durch Mitsunobu-Reaktion mit Maleinimid und drittens die Abspaltung

der Schutzgruppe beinhaltet, eine Palette von wasserlöslichen Maleinimid-tragenden

Crosslinkern verschiedener Kettenlängen synthetisiert und mittels NMR-spektroskopischer

Methoden charakterisiert werden. (Eine Ausnahme bilden die Maleinimidoalkohole 1 und 2,

die in einer einstufigen Synthese aus den entsprechenden Oligo(ethylenglykolen) gewonnen

wurden.) Eine Zusammenstellung der im Rahmen dieser Arbeit dargestellten Verbindungen

zeigt Abbildung 2.18.

NO

O

OR

n

Verbindung n R = Gesamtausbeute [%]

1 3 CH2OH 24

2 5 CH2OH 46

5 3 CHO 35

10 3 C(O)NHNHBoc 20

24 3 COOH 11

25 6 COOH 21

26 3 CH2COOH 42

27 4 CH2COOH 44

28 6 CH2COOH 20

Abb. 2.18 Im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelte heterobifunktionelle Crosslinker

Die durchgeführte Synthesestrategie erwies sich flexibel bezüglich einer Variation der

Endgruppen. So ließen sich Maleinimidoalkohole, ein Maleinimidoaldehyd, ein Maleinimido-

hydrazid und verschiedene Maleinimidocarbonsäuren synthetisieren, die sich zur Bindung an

Wirkstoffe mit freien Carboxyl-, Carboxylhydrazid-, Carbonyl-, Hydroxy- und Aminogrup-

pen eignen. Beispiele für daraus resultierende albuminbindende Wirkstoffderivate mit Ester-,

Amid- und Carboxylhydrazonbindungen werden in den Abschnitten 2.2–2.4 vorgestellt.

Daneben bildet das von Frey dargestellte Paclitaxel-Derivat mit einer Carboxyl-

hydrazonbindung einen Beleg für die generelle Verwendbarkeit des Carboxylhydrazids 10 zur

Synthese albuminbindender Wirkstoffderivate.[161]

Im Gegensatz zu den Maleinimidoalkoholen, die sich nicht für Crosslinking im

wäßrigen Medium eignen, sollten der Maleinimidoaldehyd 5, das Maleinimidohydrazid 10

(nach Abspaltung der Schutzgruppe mit TFA) und die Maleinimidocarbonsäuren 24–28 (nach

Aktivierung mit z. B. einem wasserlöslichen Carbodiimid) auch für vielfältige biochemische


Anwendungen (Kopplungsreaktionen im wäßrigen Medium) geeignet sein und damit über

kommerzielles Potential verfügen.

Gegenüber dem bislang einzigen publizierten Beispiel einer Maleinimidocarbonsäure

auf Oligo(ethylenglykol)-Basis (vgl. 2.1.2.1), das in einer aufwendigen fünfstufigen Synthese

ausgehend von 1-Chlortriethylenglykol mit einer Gesamtausbeute von 19 % synthetisiert

wurde,[147,165] erweist sich die in dieser Arbeit vorgestellte dreistufige Syntheseroute als

attraktiver und flexibler bezüglich der Wahl der Ausgangsverbindung und damit der Ketten-

länge des Linkers.

Albuminbindende Camptothecin-Prodrugs 49

2.2 Albuminbindende Camptothecin-Prodrugs

2.2.1 Allgemeines

Für die Synthese albuminbindender CPT-Prodrugs sollten die in Kapitel 2.1.7 beschriebenen

Maleinimidocarbonsäuren 24–28 verwendet werden. Die Strategie einer direkten Veresterung

mit Camptothecin, die zu proteinbindenden Analoga von PEG-α-CPT (s. 1.5.4) geführt hätte,

wurde jedoch verworfen, da aufgrund der geringen Reaktivität der tertiären 20-Hydroxy-

gruppe von CPT große Mengen des Katalysators 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) oder

Pyridin für eine rasche Umsetzung erforderlich wären.[81,88] Aus eigenen Vorarbeiten war

jedoch bekannt, daß sich Maleinimidgruppen bei Anwesenheit von Pyridin oder DMAP

zersetzen, und so verwunderte es nicht, daß die Umsetzung von 24 mit Camptothecin unter

Standardbedingungen (drei Äquivalente DIPC, zwei Äquivalente DMAP / Methode a) zu

unidentifizierbaren Produktgemischen führte, während bei Abwesenheit von DMAP

(Methode b und c) nach 24 Stunden keine Umsetzung zu beobachten war (s. Abb. 2.19).

N

N O

O

OHO

OO

ON

O

O

N

N O

O

OO

O

N O O O COOHO

O

a) DIPC, DMAPb) DIPCc) 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid

Abb. 2.19 Versuch der direkten Veresterung von Camptothecin mit 24

Die Veresterung von Camptothecin mit Maleinimidocarbonsäuren scheint daher nur auf

indirektem Weg möglich zu sein. Die empfindliche Doppelbindung von Maleinimiden läßt

sich z. B. durch Addition von Benzolselenol selektiv schützen.[166] Durch Behandlung mit

Oxidationsmitteln wie mCPBA (meta-Chlorperbenzoesäure) kann die Selenoetherbindung

unter Regenerierung der Doppelbindung wieder abgespalten werden. Obwohl in eigenen

Vorarbeiten gezeigt werden konnte, daß die Mitsunobu-Reaktion mit Phenylselenyl-

geschütztem Maleinimid zur Darstellung geschützter Analoga von 24–28 wesentlich höhere

Ausbeuten liefert als mit ungeschütztem Maleinimid (vgl. 2.1.7 und 2.1.9),[167] wurde diese

Route aufgrund des größeren synthetischen Aufwands im Rahmen der vorliegenden Arbeit

nicht weiter verfolgt.

Als wesentlich unkomplizierter erwies sich hingegen die Darstellung von PEG-β-CPT-

Analoga (vgl. 1.5.4) durch Kondensation von Camptothecin-20-O-glycinat-Trifluoracetat (30)

mit den Maleinimidocarbonsäuren 24–28. Zudem erschienen solche Derivate, deren Synthese


und Charakterisierung im folgenden Kapitel beschrieben wird, auch aufgrund der besseren

Pharmakokinetik von PEG-β-CPT gegenüber PEG-α-CPT (vgl. 1.5.4) interessanter.

2.2.2 Synthese und Charakterisierung der albuminbindenden Camptothecin-Prodrugs

Zur Darstellung der CPT-Prodrugs wurde zunächst Camptothecin-20-O-glycinat-Trifluor-

acetat (30) gemäß der Literaturvorschrift[88] in einer zweistufigen Synthese hergestellt (s.

Abb. 2.20). Dazu wurde Camptothecin mit N-Boc-Glycin in Gegenwart von N,N'-Diiso-

propylcarbodiimid (DIPC) und DMAP verestert. Anschließend wurde die Boc-Schutzgruppe

mit TFA abgespalten.

N

N O

O

OHO N

N O

O

OO

NH

O

O

O

N

N O

O

OO

NH2

O

TFA

TFA

N-Boc-GlycinDIPC, DMAP

CH2Cl2 / O°C

CPT

30

29

Abb. 2.20 Synthese von Camptothecin-20-O-glycinat-Trifluoracetat (30)

Mit Hilfe des Mukaiyama-Reagenz (2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid)[168] ließ sich 30 mit

den Maleinimidocarbonsäuren 24–28 in Ausbeuten von 54–80 % zu den CPT-Prodrugs 31–35

umsetzen (s. Syntheseschema in Abb. 2.21). Dazu wurde 30 zusammen mit den Carbonsäuren

24–28 in Gegenwart von drei Äquivalenten Triethylamin vorgelegt und anschließend bei

Raumtemperatur mit dem Mukaiyama-Reagenz versetzt. Die Aufreinigung erfolgte im Falle

der kürzerkettigen Verbindungen 31, 33 und 34 durch Umkristallisation aus Methanol (31),

bzw. Ethanol (33 und 34), während bei 32 und 35 eine säulenchromatographische Trennung

erforderlich war.


30

N

N O

O

OO

NH2

O

TFA

N

N O

O

OO

O

NH

O

O

N

O

O

n

N

N O

O

OO

O

NH

O

O

N

O

O

n

n

HOOCO

N

O

O

N+ClCH3

I-

1.5 eq

3 eq Et3N

CH2Cl2 / RT / 3h

24: n = 325: n = 6

26: n = 327: n = 428: n = 6

31: n = 3 (54 %)32: n = 6 (79 %)

33: n = 3 (66 %)34: n = 4 (80 %)35: n = 6 (89 %)

n

HOOC ON

O

O

Abb. 2.21 Synthese der CPT-Prodrugs 31–35

Die Prodrugs 31–35 wurden in Form blaßgelber, hygroskopischer, kristallin bis wachsartiger

Substanzen erhalten, die bei Lagerung im Tiefkühlfach über mehrere Monate stabil sind. Ihre

Charakterisierung erfolgte mittels 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie sowie durch Massen-

spektrometrie. Im folgenden werden am Beispiel von 34 die spektroskopischen und

analytischen Daten diskutiert.

2.2.2.1 NMR-Spektroskopie

In Abbildung 2.23 ist das 1H-NMR-Spektrum von 34 (Struktur s. Abb. 2.22) dargestellt.

Deutlich zu erkennen sind die Signale des Linkers, insbesondere die der 18 Protonen des

Tetraethylenglykol-Rückgrats, welche als breites Multiplett bei 3.31–3.70 ppm erscheinen.

Ebenso charakteristisch ist die

Resonanz der beiden Protonen

der Maleinimid-Doppelbindung

bei 7.00 ppm als scharfes Singu-

lett. Das Signal der beiden dia-

stereotopen Protonen der CH2-

Gruppe in α-Stellung zur Amidgruppe erscheint als Triplett bei 2.39 ppm mit einer nur

schwach erkennbaren Aufspaltung der chemisch nicht-äquivalenten H-Kerne. Im Gegensatz

dazu weisen die Protonen der CH2-Gruppe der Glycin-Einheit (δ = 4.02, 4.21 ppm), bedingt

2120

1918

1716a 16

1514

1312

11

10

98

76

5

32N

N O

O

OO

NH

O

ON

OO

O4

Abb. 2.22 Struktur von 34


durch die kürzere Entfernung vom Chiralitätszentrum an C20, eine unterschiedliche

chemische Verschiebung mit einer ausgeprägten geminalen Kopplung (JAB = 17.9 Hz) auf.

Das Signal des NH-Protons erscheint als Triplett bei 8.43 ppm.

(ppm)

0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0

(ppm)

7.77.87.98.08.18.28.38.48.58.6

(ppm)

4.04.14.24.3

(ppm)

2.102.202.302.40

Abb. 2.23 1H-NMR-Spektrum von 34 (DMSO-d6)

Die Signale der Protonen des CPT-Gerüsts weichen nur wenig von denjenigen des reinen

Camptothecins ab. So sind die Protonen des Chinolin-Systems (C7-H, C9–12-H) im Bereich

7.69–8.64 ppm, das Proton des Pyridonrings (C14-H) bei 7.15 ppm und die beiden CH2-

Gruppen an C5 und C17 als Singulett-Signale bei 5.23 ppm bzw. 5.50 ppm sichtbar. Die

Resonanzen der Ethylgruppe (C18,19) erscheinen erwartungsgemäß als Triplett bei 0.94 ppm

und als Quadruplett bei 2.17 ppm. Eine detailliertere Zuordnung findet sich in Kapitel 4.2.2.

Die 1H-NMR-Spektren der anderen Camptothecin-Prodrugs unterscheiden sich insofern

von dem hier diskutierten Spektrum von 34, als die Signalintensität der Protonen des

Oligo(ethylenglykol)-Linkers variiert – bedingt durch die unterschiedlichen Kettenlängen. Bei

31 und 32, die sich von 34 zusätzlich durch das Fehlen einer Methylen-Einheit unterscheiden,

beobachtet man die Abwesenheit des Tripletts bei 2.39 ppm. Statt dessen erscheint die

Resonanz der CH2-Gruppe in α-Stellung zur Amidgruppe als Singulett bei 3.94 ppm.


170.

7760

170.

5736

168.

9997

166.

9611

156.

3559

152.

1737

147.

7442

145.

8031

144.

9786

134.

4108

131.

4054

130.

2961

129.

5541

128.

7897

128.

3700

127.

8003

127.

5530

118.

8215

95.1

526

76.0

856

69.6

250

69.5

801

69.4

826

69.3

777

69.2

578

66.7

995

66.4

172

66.1

999

50.0

184

36.6

625

35.6

133

30.2

919

7.41

00

(ppm)

020406080100120140160180

Abb. 2.24 13C-NMR-Spektrum von 34 (DMSO-d6)

Das 13C-NMR-Spektrum von 34 (s. Abb. 2.24) lieferte ebenso wie das 1H-NMR-Spektrum

einen Beleg für den Strukturvorschlag. Charakteristische Signale sind unter anderem durch

die olefinischen C-Atome des Maleinimidrings (134.41 ppm), die Methylengruppe in Nach-

barschaft zum Imid-Stickstoff (36.67 ppm) sowie die Methylengruppe in α-Stellung zur

Amidgruppe (35.62 ppm) gegeben. Des weiteren erscheinen die Resonanzen des Tetra-

ethylenglykol-Rückgrats in einem engen Bereich zwischen 66.42 ppm und 69.63 ppm

(7 Signale), wobei sich das Signal des Cα-Atoms des Glycin-Linkers wahrscheinlich ebenfalls

darunter befindet. Theoretisch würde man daher 9 Signale in diesem Bereich erwarten. Die

beobachtete Differenz läßt sich durch das Auftreten von Überlagerungen erklären, die durch

gleiche chemische Verschiebungen der CH2O-Gruppen in der Mitte der Kette hervorgerufen

werden – ein Phänomen, das bei den Prodrugs 32 und 35 mit einem Hexaethylenglykol-

Linker noch stärker in Erscheinung tritt.

Neben den charakteristischen Signalen des Linkers beinhaltet das 13C-NMR-Spektrum

von 34 alle Signale des Camptothecin-Gerüsts, deren Zuordnung in Kapitel 4.2.2 ausführlich

behandelt wird. Der Unterschied in den 13C-NMR-Spektren von 31 und 32 zu dem von 34

liegt im Fehlen des Signals bei 35.62 ppm. Statt dessen erscheint die Resonanz der


Methylengruppe in α-Stellung zur Amidgruppe tieffeldverschoben im Bereich der anderen

CH2O-Gruppen.

2.2.2.2 Massenspektrometrie

Das in Abbildung 2.25 dargestellte ESI-Massenspektrum von 34 mit der Summenformel

C37H40N4O12 und der molaren Masse Mr = 732.74 g/mol zeigt als Basispeak das Molekülion

mit angelagertem Natrium ([M+Na]+, m/z = 755.2). Eine Fragmentierung ist nicht zu beob-

achten.

m/z550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000

Inte

nsitä

t (%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100755.2

757.3

862.3

Abb. 2.25 ESI-Massenspektrum von 34

2.2.3 Untersuchung der Wasserlöslichkeit

Für die parenterale Applikation albuminbindender Camptothecin-Prodrugs ist eine aus-

reichende Wasserlöslichkeit von entscheidender Bedeutung, und es erwies sich als schwierig,

diesbezügliche Vorhersagen zu treffen. Bei Verwendung von Linkern mit einem Oli-

go(ethylenglykol)-Rückgrat war lediglich zu erwarten, daß die erzielte Löslichkeit zwischen

der von reinem CPT (2.5 µg/mL[66]) und derjenigen der literaturbeschriebenen PEG40k-

Konjugate (2 mg/mL bezogen auf CPT[91]) liegen würde. Unter Berücksichtigung der bekann-


ten MTD-Werte für Camptothecin und seine Derivate sollte eine Löslichkeit von ca. 1 mg/mL

CPT für eine intravenöse Applikation ausreichend sein.

Mit Hilfe von UV-Messungen war es möglich, die Löslichkeiten der Prodrugs 33–35 in

isotonischer Kochsalzlösung zu bestimmen (s. 4.1.8). Dazu wurde zunächst anhand einer

Verdünnungsreihe der potentiell wasserlöslichsten Verbindung (35) in 0.9 %iger NaCl-

Lösung eine Eichgerade beim Absorptionsmaximum von λ = 370 nm aufgenommen. Mit der

Annahme, daß die Verbindungen 33–35 und CPT identische Absorptionskoeffizienten bei

dieser Wellenlänge aufweisen, wurden die Absorptionen gesättigter Lösungen von 33–35 und

CPT in isotonischer Kochsalzlösung bei einer Wellenlänge von λ = 370 nm bestimmt. Die

daraus resultierenden Konzentrationen sind in Tabelle 2.1 zusammengestellt.

molare Masse Anzahl der Löslichkeit Verbindung [g/mol] O-Atome [µmol/L] [µg/mL] CPT 348.36 – 11 (±1) 3.8 (±0.3) 33 688.69 3 120 (±2) 83 (±2) 34 732.74 4 185 (±3) 135 (±2) 35 820.85 6 296 (±7) 243 (±6)

Tabelle 2.1 Löslichkeiten der Prodrugs 33–35 in 0.9 %iger NaCl-Lösung

Für Camptothecin wurde eine Löslichkeit von 11 µmol/L bestimmt. Dies entspricht

3.8 µg/mL und liegt somit in der gleichen Größenordnung wie der Literaturwert von

2.5 µg/mL.[66] Mehr als 10mal so löslich ist das Prodrug 33 mit einem Triethylenglykol-

Rückgrat (120 µmol/L). Jedoch wirkt sich eine Verdopplung der Ethylenglykol-Einheiten und

damit der solubilisierenden Ether-Sauerstoffatome bei 35 lediglich in einer Erhöhung der Lös-

lichkeit gegenüber 33 um den Faktor 2.5 auf 296 µmol/L aus. Für 34 liegt die Löslichkeit er-

wartungsgemäß zwischen diesen beiden Werten (185 µmol/L).

Diese Ergebnisse waren zunächst enttäuschend, da die angestrebte Wasserlöslichkeit

von ca. 1 mg/mL (bezogen auf CPT) nicht annähernd erreicht wurde. (Rechnet man die

Löslichkeit von 35 in CPT-Äquivalente um, so ergibt sich ein Wert von 0.103 mg/mL). Damit

stellte sich die Frage, wieviel Ethylenglykol-Einheiten notwendig gewesen wären, um das

erwünschte Löslichkeitsverhalten zu erreichen. Trägt man die molaren Löslichkeiten gegen

die Anzahl der Ethylenglykol-Einheiten auf, so ergibt sich im Bereich zwischen 3 und 6

Sauerstoffatomen ein linearer Zusammenhang (s. Abb. 2.26).


3 4 5 6

0

50

100

150

200

250

300

350

Konz

entra

tion

[µm

ol/L

]

Anzahl der Ethylenglykol-Einheiten

Abb. 2.26 Auftragung der Löslichkeiten von 33–35 gegen die Anzahl der Ethylenglykol-Einheiten

Unter der Voraussetzung, daß diese Linearität auch jenseits von 6 Ethylenglykol-Einheiten

weiter bestünde, ließe sich die gesuchte Anzahl an Ethylenglykol-Einheiten durch Extra-

polation der Geraden abschätzen: Eine Konzentration von 1 mg/mL CPT entspricht

2.87 mmol/L. Eingesetzt in die Geradengleichung, die man aus der linearen Regression erhält,

gelangt man zu einem hypothetischen Wert von ca. 49 für die Anzahl der erforderlichen

Ethylenglykol-Einheiten. Poly(ethylenglykol) mit 49 Monomereinheiten, d. h. PEG mit einem

Molekulargewicht von 2150 Da, ist nur in polydisperser Form erhältlich. Daher wäre die

praktizierte Synthesestrategie mit mehreren säulenchromatographischen Reinigungsschritten

auf die Verwendung einer solchen Ausgangsverbindung nicht übertragbar. Zudem wäre der

Einfluß eines solch langen Spacermoleküls auf das Kopplungsverhalten, die Wirksamkeit und

Immunogenität nicht vorhersagbar.

Um eine geeignete Formulierung von 32 und 35 für die Tierversuchsstudien zu finden,

wurde der Zusatz verschiedener Löslichkeitsvermittler ausprobiert. Die mit Abstand besten

Ergebnisse erzielte eine Mischung aus 40 % PEG600 und 60 % isotonischer Kochsalzlösung

mit der Vorgehensweise, daß zunächst das Prodrug in PEG600 gelöst wurde und man

anschließend mit NaCl-Lösung verdünnte. Damit ließen sich bis zu 2 mg der Prodrugs in

einem Volumen von 1 mL lösen.

Somit konnte die Löslichkeit von 35 letztlich durch Verwendung von PEG600 als

Löslichkeitsvermittler um den Faktor 10 gesteigert werden.


2.2.4 Untersuchungen der albuminbindenden Eigenschaften

2.2.4.1 Allgemeines

Die Ermittlung der albuminbindenden Eigenschaften von 31–35 erfolgte in vitro anhand von

HPLC-Untersuchungen an humanem Plasma, das zuvor mit den CPT-Prodrugs inkubiert

wurde. Um eine physikalische Bindung an HSA, über die für die offenkettige Form von

Camptothecin berichtet wurde (vgl. 1.5.3), auszuschließen, wurden zusätzlich Messungen mit

inaktiviertem Plasma (durch vorherigen Zusatz von ε-Maleinimidocapronsäure) sowie mit

einer potentiell nicht-albuminbindenden Modellverbindung ohne Maleinimidgruppe durchge-

führt.

2.2.4.2 Synthese und Charakterisierung einer nicht-Maleinimid-tragenden

Modellverbindung

Als ein potentiell nicht-albuminbindendes Camptothecin-Derivat wurde die zu 33 analoge

Verbindung mit einer Hydroxy- statt einer Maleinimidgruppe gewählt. Die Darstellung

erfolgte mit Hilfe einer fünfstufigen Synthesesequenz ausgehend von Triethylenglykol (s.

Abb. 2.27).

HOO

OOR

OO

OORR'OOC

N

N O

O

OO

O

NH

O

O

OO

OR

tBuOK, tButylacrylat

THF

30, 3eq Et3N

CH2Cl2 / RT / 3hN+ClCH3

I-

Na, BnBrR = H

36: R = Bn (78 %)TFA / CH2Cl2

37: R' = tBu (57 %)

38: R' = H (100 %)

39: R = Bn (60 %)

40: R = H (61 %)Pd/C, Cyclohexen

EtOH

Abb. 2.27 Synthese der nicht-albuminbindenden Modellverbindung 40

40 wurde mittels 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektroskopie sowie durch Anwendung der

Massenspektrometrie charakterisiert.


2.2.4.3 HPLC-Studien

Zur Evaluierung der albuminbindenden Eigenschaften der CPT-Prodrugs 31–35 wurden

HPLC-Untersuchungen an einer C18-RP-HPLC-Säule durchgeführt, welche sich aufgrund der

Porengröße von 300 Å zur Trennung von Plasmaproteinen eignet. Durch Gradientenelution

ließ sich humanes Blutplasma in seine Proteinkomponenten auftrennen (s. 4.1.6). Abbildung

2.28 zeigt ein Chromatogramm von Blutplasma, das bei zwei verschiedenen Wellenlängen

aufgenommen wurde.

0 10 20 30 40 50 60

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

Plasmaproteine

HSA

λ = 254 nm λ = 370 nm

UV-

Abso

rptio

n

Zeit [min]

Abb. 2.28 Chromatogramm von humanem Blutsplasma (Detektion bei 254 nm und 370 nm;

Chromatographiesäule: Symmetry® 300–5 250x4.6 mm von Waters; Fluß: 1.2–

1.8 mL/min; Eluent A: 30 % 200 mM K2HPO4 pH 7, 70 % Acetonitril; Eluent B: 72.5 %

200 mM K2HPO4 pH 7, 28.5 % Acetonitril; Gradient: 26 min Eluent B isokrat., 15 min

0–100 % Eluent A linear)

Durch die Absorption bei 254 nm lassen sich die Plasmaproteine detektieren, wobei

Humanserumalbumin als scharfer Peak mit einer Retentionszeit von ca. 32 min zu erkennen

ist. Die Komponenten des menschlichen Blutplasmas weisen bei 370 nm lediglich eine

marginale UV-Absorption auf. Daher läßt sich diese Methode zum Nachweis von

Camptothecin-Derivaten (λmax = 370 nm) neben Plasmaproteinen verwenden.

Zum Nachweis einer schnellen Kopplung der CPT-Prodrugs an HSA wurde humanes

Blutplasma jeweils 1 min mit 32, 33 und 35 bei 37 °C inkubiert und anschließend mit Hilfe

der oben beschriebenen HPLC-Methode untersucht. Abbildung 2.29 zeigt das


Chromatogramm des reinen Prodrugs (35) sowie das von Plasma, welches zuvor mit dem

Prodrug inkubiert wurde (jeweils bei gleicher Konzentration von 35, dargestellt sind nur die

Messungen der Absorption bei 370 nm).

0 10 20 30 40 50 60

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

HSA+35

35

35 nach 1 min Inkubation

mit Plasma

UV-

Abso

rptio

n (λ

= 3

70 n

m)

Zeit [min]

Abb. 2.29 Chromatogramme von 35 und mit 35 inkubiertem humanem Plasma (λ = 370 nm)

Deutlich ist zu erkennen, daß der für 35 charakteristische Peak bei ca. 18 min nach Inkubation

mit HSA nahezu vollständig verschwunden ist. Statt dessen beobachtet man ein UV-Signal

bei der Retentionszeit des Albumins (ca. 32 min), womit gezeigt werden konnte, daß 35 sehr

schnell und quantitativ an HSA bindet. Zusätzlich ist aus dem Chromatogramm ersichtlich,

daß keine nennenswerte Bindung an andere Plasmaproteine erfolgt. Ein fast identisches

Chromatogramm wurde erwartungsgemäß im Falle von 32, aber auch bei der kürzerkettigen

Verbindung 33 erhalten.

Um eine unspezifische Wechselwirkung des Camptothecin-Gerüsts mit HSA auszu-

schließen, wurde das oben beschriebene Experiment mit der nicht-Maleinimid-tragenden

Modellverbindung 40 wiederholt. Dabei wurde das in Abbildung 2.30 dargestellte Chromato-

gramm erhalten. Man beobachtet bei 370 nm lediglich den Peak des freien Camptothecin-

Derivats mit einer Retentionszeit von ca. 8 min. (Durch eine Vergleichsmessung mit 40

wurde diese Retentionszeit bestätigt.) Ansonsten unterscheidet sich das Chromatogramm bei

dieser Wellenlänge nur unwesentlich von dem des reinen Plasmas (vgl. Abb. 2.28).


0 10 20 30 40 50 60

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

HSA

40

λ = 254 nm λ = 370 nm

UV-

Abso

rptio

n

Zeit [min]

Abb. 2.30 Chromatogramm von humanem Blutplasma, das zuvor 1 min lang mit 40 inkubiert wurde

Den endgültigen Beweis dafür, daß die Maleinimidgruppe für die Bindung der CPT-Prodrugs

verantwortlich ist, lieferte ein Kopplungsexperiment, bei dem alle SH-Gruppen von humanem

Plasma durch Zusatz eines Überschusses an EMC (ε-Maleinimidocapronsäure) gezielt

blockiert wurden.

0 10 20 30 40 50 60-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

HSA

35

λ = 254 nm λ = 370 nm

UV-

Abso

rptio

n

Zeit [min]

Abb. 2.31 Chromatogramm von "blockiertem" Blutplasma, das 5 min lang mit 35 inkubiert wurde

(Unterschiede in den Retentionszeiten zu den oben abgebildeten Chromatogrammen resul-

tieren aus der Durchführung auf einer anderen HPLC-Anlage)


Abbildung 2.31 zeigt das Chromatogramm, das nach einer fünfminütigen Inkubation dieses

"blockierten Plasmas" mit 35 erhalten wurde. Ähnlich wie bei der nicht-Maleinimid-

tragenden Verbindung 40 läßt sich auch in diesem Fall keine Bindung des Prodrugs 35 an

Humanserumalbumin feststellen. Das Auftreten zusätzlicher Peaks bei 370 nm mit einer

kürzeren Retentionszeit ist wahrscheinlich auf eine partielle Hydrolyse des Maleinimidrings

sowie der Glycyl-Amidbindung oder auf eine Bindung an andere Plasmaproteine zurück-

zuführen.

Aus diesen Ergebnissen läßt sich folgern, daß die im Rahmen dieser Arbeit

synthetisierten Camptothecin-Derivate aufgrund der Maleinimidgruppen sehr schnell und

selektiv an HSA binden und damit albuminbindende Formulierungen des Wirkstoffs dar-

stellen. Da sowohl bei den längerkettigen Verbindungen (32 und 35) als auch bei dem

kurzkettigen Derivat 33 bereits nach einer Inkubationszeit von 1 min eine nahezu quantitative

Kopplung an Humanserumalbumin beobachtet wurde, scheint der Einfluß der Kettenlänge des

Crosslinkers auf die Geschwindigkeit der Kopplungsreaktion vernachlässigbar. Somit wurde

auf weiterführende kinetische Untersuchungen dieser Reaktion verzichtet.

2.2.5 Stabilitätsuntersuchungen

Entscheidend für die biologische Wirksamkeit der synthetisierten Prodrugs ist die

Plasmastabilität der entsprechenden Albumin-Konjugate. Diese sollte idealerweise groß

genug sein, um eine Anreicherung des Makromoleküls im Tumorgewebe durch den EPR-

Effekt zu ermöglichen. Da die Spaltbarkeit der hierbei entscheidenden Amidbindung des

Glycyl-Spacers bereits an ähnlichen makromolekularen Prodrugs (z. B. PEG-β-CPT, vgl.

1.5.4) untersucht wurde,[91] sollte ein Vergleich mit diesen Literaturdaten Aufschluß über das

Ausmaß einer Stabilisierung durch die Protein-Umgebung im Falle der Albumin-Konjugate

geben.

Die Stabilitätsuntersuchungen wurden an den im Tierversuch getesteten Prodrugs 32

und 35 (vgl. 2.2.6) mit Hilfe der für die Kopplungsstudien entwickelten HPLC-Methode

durchgeführt (s. 4.1.7). Dazu wurde humanes Blutplasma zunächst 1 min lang mit den

Camptothecin-Derivaten inkubiert, um die entsprechenden Albumin-Konjugate zu generieren.

Anschließend wurden die Proben mittels HPLC untersucht und aus den Peakflächen der

Absorptionen bei 370 nm (Signale bei ca. 32 min Retentionszeit) der Nullwert bestimmt.

Weitere HPLC-Messungen der bei 37 °C gelagerten Lösungen erfolgten jeweils nach 4, 20,

28 und 48 h. Abbildung 2.32 zeigt beispielhaft die für 35 erhaltenen Chromatogramme.


Deutlich sichtbar ist die langsame Abnahme des Konjugat-Peaks bei 32 min sowie die

Bildung von CPT-Hydrolyseprodukten (Peaks bei ca. 4 min Retentionszeit).

0 10 20 30 40 50 60

1 min

20 h

48 h28 h

4 h

Zeit [min]

Abb. 2.32 Chromatogramme von humanem Plasma mit 35, aufgenommen nach den jeweils angegebenen Zeiten

Damit die Abnahme der Peakflächen zur Berechnung der Halbwertszeiten herangezogen

werden konnte, mußte zuvor ausgeschlossen werden, daß Hydrolyse-Produkte als Addukte

mit Serumalbumin von der HPLC-Säule eluiert werden und dadurch eine höhere Konzen-

tration an Albumin-Konjugat vortäuschen. Obwohl die starke nicht-kovalente Bindung der

Hydroxycarbonsäure-Form von CPT an HSA schon seit längerem bekannt ist (vgl. 1.5.3),

konnte in einem Vergleichsexperiment, bei dem humanes Plasma 0.5 h bzw. 17 h mit Camp-

tothecin inkubiert wurde, keine UV-Absorption bei 370 nm im Bereich des Albumin-Peaks

nachgewiesen werden. Dies ist wahrscheinlich auf eine Spaltung des Addukts (hervorgerufen

durch Änderungen der Tertiärstruktur von HSA) bei Aufnahme in die mobile Phase mit ihrem

hohen Anteil an Acetonitril zurückzuführen.

Da auf diese Weise gezeigt werden konnte, daß nur kovalent gebundenes Camptothecin

durch die angewandte HPLC-Methode erfaßt wird, ließen sich die Halbwertszeiten der

Albumin-Konjugate von 32 und 35 bei 37 °C anhand der Abnahme der Peakflächen ermitteln:

32: t1/2 = 9 h

35: t1/2 = 15 h

Aus diesem signifikanten Unterschied der Plasmastabilitäten ist ersichtlich, daß ein Einfluß

der elektronenziehenden Alkoxygruppe im Falle von 32 die Hydrolyse beschleunigt und

daher nicht zu vernachlässigen ist. PEG-β-CPT, das eine identische Sollbruchstelle wie 32

enthält, weist hingegen eine offenkundig niedrigere Plasmahalbwertszeit von 4 h auf.[91] Im


Falle der Albumin-Konjugate läßt sich daher ein deutlicher Stabilisierungseffekt verzeichnen,

der wahrscheinlich auf die Proteinumgebung zurückzuführen ist. 32 und 35 weisen sogar

höhere Stabilitäten als PEG-Ala-CPT (Prothecan®) auf, das aufgrund seiner gegenüber PEG-

β-CPT gesteigerten Halbwertszeit von 7 h als Kandidat für klinische Studien ausgewählt

wurde.[92]

2.2.6 Biologische Eigenschaften

Zum Nachweis der Wirksamkeit der dargestellten albuminbindenden CPT-Prodrugs wurden

die beiden wasserlöslichsten Verbindungen 32 und 35 von der EPO GmbH (Berlin) unter

Leitung von I. Fichtner in einem HT-29-Kolorektal-Xenograft-Modell an tumortragenden

Nacktmäusen untersucht und mit Camptothecin verglichen. Vorab wurde die Eignung von

PEG600 als Löslichkeitsvermittler (vgl. 2.2.3) in einer ersten Toxizitätsstudie geprüft. Eine

weitere Verträglichkeitsuntersuchung wurde zur Bestimmung der MTD von 32, 35 und CPT

durchgeführt.

2.2.6.1 Toxizitätsuntersuchungen

Die Verwendung von PEG600 als Löslichkeitsvermittler zur Applikation wasserunlöslicher

Arzneistoffe erwies sich am Menschen als verträglich.[169] Zur Überprüfung der

Einsatzmöglichkeit dieser Verbindung in Tierversuchen an Nacktmäusen wurde eine

Toxizitätsstudie durchgeführt, bei der isotonische Kochsalzlösung mit einem PEG600-Anteil

von 40 % in Dosen von 0.2 und 0.4 mL i.v. sowie 0.6 und 0.8 mL i.p. verabreicht wurde.

Dabei beobachtete man eine unerwartet hohe Toxizität (Tremor, Konvulsionen, Ataxie und

Exitus bei 0.6 mL i.v. bzw. 0.8 mL i.p.), so daß von einer Verwendung des PEG600 zur

Zubereitung wasserlöslicher Formulierungen von 32 und 35 abgesehen werden mußte. Daher

wurden die Prodrugs 32 und 35 sowie CPT in den folgenden Tierversuchen als Mikro-

suspension in isotonischer Kochsalzlösung mit einem 10 %igen Zusatz von Tween 80

eingesetzt, einer Mischung, die sich bereits bei früheren in-vivo-Studien mit Camptothecin

bewährt hatte.[95]

Zur Bestimmung der MTD von 35 und CPT wurde eine Dosisfindungsstudie an

Nacktmäusen durchgeführt, bei der sich die literaturbeschriebene Maximaldosis für Campto-

thecin[95] von 12.5 mg/kg bei jeweils viermaliger Applikation im Abstand von vier Tagen

bestätigte. Dagegen wurde die MTD von 35 in diesem Experiment nicht erreicht. In der


höchsten Dosierung (einmalige Gabe von 20 mg/kg (CPT-Äquivalente)) ließ sich keine

Toxizität beobachten.

2.2.6.2 In-vivo-Studien an einem HT-29-Kolorektal-Xenograft-Modell

Die Untersuchung der antitumoralen Eigenschaften der albuminbindenden CPT-Prodrugs 32

und 35 erfolgte in einem HT-29-Kolorektal-Xenograft-Modell an Nacktmäusen (jeweils acht

Tiere pro Gruppe), denen vorab ca. 107 Zellen einer HT-29-Zellinie (humaner Darmtumor)

s.c. injiziert wurden (s. 4.1.11). Nach etwa 10 Tagen entwickelten sich daraus sichtbare

Tumore, deren Größe vermessen werden konnte und als Maß für die Wirksamkeit

herangezogen wurde.

Die Dosierungen wurden anhand der Ergebnisse der Dosisfindungsstudie auf

12.5 mg/kg für Camptothecin und 12.5 mg/kg sowie 25 mg/kg (CPT-Äquivalente) für die

Prodrugs 32 und 35 festgelegt (jeweils vier Applikationen als Mikrosuspension in

isotonischer Kochsalzlösung/Tween 80 9:1 im Abstand von vier Tagen). An Tag 13 nach

Implantation der Tumorzellen wurde mit der Behandlung begonnen. Die durchschnittliche

Tumorgröße betrug zu diesem Zeitpunkt ca. 100 mm2. In Abbildung 2.33 und Tabelle 2.2 sind

die Ergebnisse dieser Studie zusammengefaßt.

↑↑↑↑

13 17 21 25 29 33 370

1

2

3

4

5

6

7

8 Kontrolle CPT (12.5 mg/kg) 32 (12.5 mg/kg) 32 (25 mg/kg) 35 (12.5 mg/kg) 35 (25 mg/kg)

rel.

Tum

orvo

lum

en

Tag

Abb. 2.33 Entwicklung des rel. Tumorvolumens in Nacktmäusen, denen ein HT-29-Kolorektal-

Xenograft implantiert wurde (Applikation der Wirkstoffe erfolgte an den mit Pfeilen

gekennzeichneten Tagen)


Aus der Auftragung des relativen Tumorvolumens gegen die Zeit der Beobachtung (Abb.

2.33) ist zu erkennen, daß sich die Tumorgröße der Tiere aus der unbehandelten

Kontrollgruppe bis zum Ende der Studie ungefähr verachtfacht hatte. Ein sehr ähnliches

Ergebnis lieferte die Gruppe, welche mit 4x12.5 mg/kg Camptothecin behandelt wurde. CPT

erwies sich daher in diesem Tiermodell als unwirksam. Im Gegensatz dazu zeigten die

Prodrugs 32 und 35 bereits bei der äquimolaren Dosierung eine moderate Wirksamkeit. Durch

Verdopplung der Dosis ließ sich indes eine deutliche Antitumoraktivität belegen, wobei sich

beide Prodrugs als gleichwertig hinsichtlich ihrer Wirksamkeit erwiesen.

Verbindung Dosis

[mg/kg] Todesfälle Körpergewichtsände- rung [%] (Tag 13–17)

T/C [%] maximal

CPT 12.5 0/8 +4 89 (Tag 31) 32 12.5 0/8 +2 71 (Tag 34) 32 25 0/8 0 57 (Tag 31) 35 12.5 0/8 +4 83 (Tag 38) 35 25 0/8 +1 47 (Tag 34)

Tab. 2.2 Ergebnisse des Tierversuchs an Nacktmäusen, denen ein HT-29-Darmtumor-Xenograft

implantiert wurde

In allen Fällen wurde keine signifikante Toxizität beobachtet, was sich anhand der

unveränderten Körpergewichte sowie eines Ausbleibens toxizitätsbedingter Todesfälle

belegen ließ (vgl. Tabelle 2.2). Ebenso konnten keine hämatologischen Effekte beobachtet

werden. Allenfalls bei den hohen Dosierungen von 32 und 35 sowie bei Camptothecin war

eine geringe Anämie zu verzeichnen. Aus diesen Ergebnisse läßt sich folgern, daß in allen

Fällen die MTD unterschritten wurde, was im Falle von Camptothecin die zuvor bestimmte

Maximaldosis von 12.5 mg/kg widerlegt (vgl. 2.2.6.1).

Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß die Prodrugs 32 und 35 eine gesteigerte

Wirksamkeit bezüglich Camptothecin auch bei äquimolarer Dosierung aufweisen. Beide

Prodrugs erwiesen sich als gut verträglich und gleichwertig hinsichtlich ihrer Wirksamkeit.

Da bei dem Versuch die MTD dieser Verbindungen nicht erreicht wurde, kann deren

therapeutisches Potential nur durch zusätzliche in-vivo-Studien unter Einsatz höherer

Dosierungen (z. B. 37.5 mg/kg) abgeschätzt werden.



Das in den letzten Jahren sprunghaft gestiegene Interesse an makromolekularen

Camptothecin-Prodrugs führte zur Entwicklung von Polymer-Konjugaten mit verschiedenen

Trägersystemen, wobei sich eine Bindung des Wirkstoffs an den Träger über einen Glycin-

Spacer als besonders vorteilhaft erwies.[88,90,93,94,97] Bislang waren jedoch keine Beispiele für

Camptothecin-Konjugate mit Serumproteinen und daher auch keine albuminbindenden CPT-

Prodrugs bekannt. Da Camptothecin eine äußerst geringe Wasserlöslichkeit aufweist, wurden

zur Entwicklung solcher Wirkstofformulierungen die eigens maßgeschneiderten wasser-

löslichen Maleinimidocarbonsäuren 24–28 verwendet. Diese ließen sich mit Camptothecin-

20-O-glycinat-Trifluoracetat zu den entsprechenden albuminbindenden CPT-Prodrugs 31–35

umsetzen (s. Abb. 2.34).

N

N O

O

OO

O

NH

O

O

N

O

O

n

N

N O

O

OO

O

NH

O

O

N

O

O

n

31: n = 3 (54 %)32: n = 6 (79 %)

33: n = 3 (66 %)34: n = 4 (80 %)35: n = 6 (89 %)

Abb. 2.34 CPT-Prodrugs 31–35

Die Verbindungen 31–35 unterscheiden sich zum einen in der Länge des

Oligo(ethylenglykol)-Linkers, zum anderen sollte durch den Einbau einer zusätzlichen

Methylengruppe in α-Stellung zur Amidbindung bei 33–35 der Einfluß auf deren Spaltbarkeit

untersucht werden. Die Charakterisierung erfolgte durch 1H-NMR- und 13C-NMR-

Spektroskopie sowie mit Hilfe der Massenspektrometrie.

Durch UV-Messungen ließen sich die Löslichkeiten von 33–35 und CPT in isotonischer

Kochsalzlösung bestimmen. Dabei stellte sich heraus, daß 33 zwar eine gegenüber

Camptothecin mehr als zehnfach gesteigerte molare Löslichkeit aufweist (33: 120 µmol/L,

CPT: 11 µmol/L), der angestrebte Wert von 2.87 mmol/L (entspricht einem CPT-Gehalt von

1 mg/mL) jedoch auch von der längerkettigen Verbindung 35 nicht erreicht wurde (35:

297 µmol/L). Eine Auftragung der molaren Löslichkeiten gegen die Anzahl der Ethylen-

glykol-Einheiten und damit der solubilisierenden Sauerstoffatome des Oligo(ethylenglykol)-

Linkers zeigte einen linearen Zusammenhang im Bereich zwischen 3 und 6 Sauerstoffatomen.

Daraus läßt sich schließen, daß zur Erreichung der angestrebten Wasserlöslichkeit eine

wesentlich höhere Anzahl an Ethylenglykol-Einheiten notwendig gewesen wäre. Gleichwohl


ließen sich durch 40 %igen Zusatz von PEG600, dessen intravenöser Einsatz als Löslich-

keitsvermittler am Menschen als verträglich eingestuft wurde,[169] bis zu 2 mg/mL des Pro-

drugs (35) (entspricht 0.85 mg/mL CPT) lösen.

Mit Hilfe von RP-HPLC-Experimenten ließ sich die Fähigkeit der Prodrugs, schnell und

selektiv an Humanserumalbumin zu koppeln, eindeutig belegen. Diese Untersuchungen, bei

denen humanes Plasma mit den CPT-Derivaten 32, 33 und 35 bei 37 °C inkubiert und

anschließend chromatographisch in seine Komponenten aufgetrennt wurde, zeigten, daß un-

abhängig von der Kettenlänge des Linkers bereits nach 1 min Inkubationszeit eine nahezu

quantitative Bindung an HSA stattfindet. Eine physikalische Wechselwirkung mit dem Pro-

tein konnte hierbei ausgeschlossen werden, da eine nicht-Maleinimid-tragende Modellverbin-

dung (40), die sich von 33 lediglich durch Austausch der Maleinimidgruppe gegen eine

Hydroxygruppe unterscheidet, in einem analogen Experiment keine Bindung an Albumin

aufwies. Zusätzlich konnte anhand eines Versuchs, bei dem SH-inaktiviertes Plasma (durch

Blockierung aller Thiolgruppen mit einem Überschuß an ε-Maleinimidocapronsäure) einge-

setzt wurde, gezeigt werden, daß unter diesen Bedingungen 35 auch nach 5minütiger Inku-

bation nicht an HSA bindet.

Durch HPLC-Untersuchungen des Zerfalls der Albumin-Konjugate der beiden wasser-

löslichsten Verbindungen (32 und 35) ließen sich die Halbwertszeiten in humanem Plasma bei

37 °C bestimmen:

32: t1/2 = 9 h

35: t1/2 = 15 h

Damit liegen die Stabilitäten der hierbei beobachteten makromolekularen Prodrugs deutlich

über der von PEG-β-CPT (Halbwertszeit 4 h), das über eine identische Sollbruchstelle

verfügt. Dieses Phänomen läßt sich durch den stabilisierenden Einfluß der Proteinumgebung

erklären, während der Unterschied zwischen den Plasmastabilitäten der Albumin-Konjugate

von 32 und 35 wahrscheinlich auf den elektronenziehenden Effekt der Alkoxygruppe in

α-Stellung zur Amidbindung bei 32 zurückzuführen ist.

In Nacktmaus-Tierversuchstudien an einem HT-29-Kolorektal-Xenograft zeigten die

Prodrugs 32 und 35 trotz der unterschiedlichen Plasmastabilitäten vergleichbar gute

Wirksamkeiten, während sich CPT hierbei als unwirksam erwies. So konnte bereits bei

äquimolarer Dosierung (bzgl. CPT) von 32 und 35 eine moderate Aktivität verzeichnet

werden (T/C maximal: 71 % (32) bzw. 83 % (35)). Indes ließ sich bei Verabreichung der

doppelten Dosis eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums beobachten (T/C maximal:

57 % (32) bzw. 47 % (35)). Die Prodrugs zeigten dabei nur eine geringe Toxizität (Anämie


bei hoher Dosierung) und erwiesen sich somit als gut verträglich, was auch durch das

Ausbleiben toxizitätsbedingter Todesfälle unterstrichen wird. Da die MTD der Prodrugs in

diesem Experiment nicht erreicht wurde, kann deren therapeutisches Potential nur durch

zusätzliche in-vivo-Studien unter Einsatz höherer Dosierungen abgeschätzt werden.

Wasserlösliche makromolekulare Bendamustin-Prodrugs 69

2.3 Wasserlösliche makromolekulare Bendamustin-Prodrugs

2.3.1 Allgemeines

Obwohl Albumin-Konjugate von Chlorambucil eine gute in-vitro-Wirksamkeit aufwiesen,[39]

schien dieses Zytostatikum aufgrund seiner geringen Wasserlöslichkeit und schlechten

Nachweisbarkeit durch photometrische Bestimmungsmethoden ungeeignet für die Entwick-

lung albuminbindender Prodrugs

und/oder PEG-Konjugate. Das

strukturell verwandte Stickstoff-

lost-Derivat Bendamustin (siehe

Abb. 2.35) weist einerseits – be-

dingt durch das Vorliegen als

Hydrochlorid – eine höhere Wasserlöslichkeit auf, andererseits zeigt sein Benzimidazolring

eine Fluoreszenz, die einen Nachweis in Gegenwart von Serumproteinen ermöglicht.

Chlorambucil

Cl

N

Cl

COOH


N

Cl

ClCOOH

N

N

HCl

Abb. 2.35 Strukturelle Unterschiede zwischen Chlorambucil

und Bendamustin

Bendamustin besitzt wie Chlorambucil eine freie Carboxylgruppe, die sich zur

Veresterung mit PEG oder den Maleinimidoalkoholen 1 und 2 eignet. Daß für die daraus

resultierenden Esterbindungen die Funktion einer Sollbruchstelle wahrscheinlich ist, konnte

im Falle von Chlorambucil dadurch belegt werden, daß Prednimustin (Struktur s. Abb. 2.36),

ein Konjugat aus Chlorambucil und

dem Corticoid Prednisolon, das

Zytostatikum in vivo freisetzt.[170]

Die Kinetik der Ester-Spaltung

deutet hierbei auf einen en-

zymatischen Mechanismus hin.[171]

Weitere Hinweise für die Spalt-

barkeit lieferten Chlorambucil-

Transferrin-Konjugate, bei denen das Zytostatikum über eine Esterbindung an das

Serumprotein gebunden wurde. Die Konjugate zeigten eine der Stammverbindung vergleich-

bare in-vitro-Wirksamkeit.[159]

O

H

HH

HO OHO

O

ON

Cl

Cl

Prednisolon Chlorambucil

Abb. 2.36 Struktur von Prednimustin

Ferner sollte die Carboxylgruppe von Bendamustin in das Carboxylhydrazid überführ-

bar sein. Durch Reaktion mit dem Aldehyd-tragenden Crosslinker 5 sollte man auf diese

Weise zu einem albuminbindenden Bendamustin-Prodrug mit einer säurelabilen Sollbruch-

stelle analog zu den publizierten Chlorambucil-Albumin-Konjugaten gelangen.[39]


2.3.2 Synthese und Charakterisierung der albuminbindenden Bendamustin-Prodrugs

2.3.2.1 Synthese der Bendamustin-Ester 41 und 42

Zur Darstellung von Bendamustin-Prodrugs mit einer Esterbindung als Sollbruchstelle wurde

Bendamustin-Hydrochlorid mit den beiden Maleinimidoalkoholen 1 und 2 nach zwei ver-

schiedenen Methoden umgesetzt (s. Abb. 2.37).

N

NCH3

N

Cl

Cl OO

N

O

O

On

N

NCH3

N

Cl

ClCOOH

HCl

Methode A: 1, DIPC, Et3N, CH2Cl2

Methode B: 2, BOP, Et3N, CH2Cl2

Bendamustin-Hydrochlorid 41: n = 3 (42 %, Methode A)42: n = 5 (74 %, Methode B)

Abb. 2.37 Synthese der Bendamustin-Ester 41 und 42

Dazu wurden die Maleinimidoalkohole 1 und 2 mit Bendamustin-Hydrochlorid unter Zugabe

von Triethylamin und DIPC (Methode A) bzw. BOP (Methode B) verestert. Nach säulen-

chromatographischer Reinigung ließen sich die Bendamustin-Ester 41 und 42 als braune Öle

gewinnen, die durch 1H-NMR-, 13C-NMR- und Massenspektrometrie charakterisiert wurden.

(Die Elementaranalyse als Charakterisierungsmethode ließ sich aus den in Kapitel 2.1.8 be-

schriebenen Gründen nicht heranziehen.) Im folgenden werden am Beispiel von 42 die spek-

troskopischen und analytischen Daten diskutiert.


Das in Abbildung 2.39 dargestellte 1H-NMR-Spektrum von 42 (Struktur s. Abb. 2.38) zeigt

die Signale des Bendamustin-Gerüsts sowie die des Crosslinkers. Auffallend ist das breite

Multiplett bei 3.55–3.78 ppm, in dessen

Bereich die Signale der 22 Protonen des

Oligo(ethylenglykol)-Rückgrats, die drei

Protonen der Methylgruppe des Benz-

imidazolrings (C10-H) sowie die 8 Protonen

der Stickstofflost-Einheit (C1a,1b,2a,2b-H)

liegen. Lediglich die Signale der beiden

Protonen der COOCH2-Gruppe erscheinen tieffeldverschoben als Triplett bei 4.23 ppm

(J = 4.7 Hz). Das Vorhandensein der Maleinimidgruppe wird durch das scharfe Singulett der

olefinischen Protonen bei 6.69 ppm belegt, während sich die Signale bei 2.19, 2.53 und 2.93

1a 2a

1b 2b

3

4 5

6

789

10

1112

1314N

NCH3

N

Cl

Cl OO

N

O O5

Abb. 2.38 Struktur von 42

O


ppm den Wasserstoffkernen des Buttersäurerests (C11–13) zuordnen lassen. Im Bereich der

Aromaten erscheinen erwartungsgemäß drei Signale, hervorgerufen durch die Aryl-Protonen

C4-H, C5-H, C8-H.

(ppm)0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5

(ppm)2.22.42.62.83.0

(ppm)6.806.907.007.107.20

Abb. 2.39 1H-NMR-Spektrum von 42 (aufgenommen in CDCl3)

Das 13C-NMR-Spektrum von 42 (s. Abb. 2.40) zeigt neben den Signalen des Bendamustin-

Gerüsts die charakteristischen Resonanzen des Maleinimidrings bei 170.66 und 134.15 ppm.

Daneben beobachtet man die Signale der Methylenoxygruppen des Oligo(ethylenglykol)-

Rückgrats in einem engen Bereich zwischen 67.82 und 70.61 ppm. Eine vollständige Zuord-

nung der Signale findet sich in Kapitel 4.2.3 des experimentellen Teils.


173.

1489

170.

6606

154.

5765

143.

4840

142.

6446

134.

1528

129.

5584

110.

7836

109.

7568

103.

3262

70.6

108

70.5

584

70.5

359

70.0

487

69.0

894

67.8

152

63.6

031

54.8

565

40.8

185

37.1

310

33.1

587

29.8

010

26.4

433

22.5

534

(ppm)0102030405060708090100110120130140150160170

Abb. 2.40 13C-NMR-Spektrum von 42 (aufgenommen in CDCl3)



C32H46Cl2N4O9 und der molaren Masse Mr = 701.64 g/mol (exakte Masse: 700.26 g/mol)

zeigt nur eine geringe Fragmentierung. Als Basispeak erscheint das Molekülion mit ange-

lagertem Wasserstoffatom ([M+1]+, m/z = 701.1). Ferner beobachtet man das Molekülion mit

angelagertem Natrium ([M+Na]+, m/z = 723.1) mit einer Intensität von 41 %. Der Peak bei

m/z = 665.1 läßt sich als Molekülion mit einem abgespaltenen Chloratom deuten

([M–Cl]+). Alle Signale zeigen die für eine Verbindung mit zwei Chloratomen typische

Isotopen-Verteilung.


m/z300 400 500 600 700 800 900 1000

Inte

nsitä

t (%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

340

377.1665.1

701.1


2.3.2.4 Untersuchung der Wasserlöslichkeit

Die Bestimmung der Wasserlöslichkeit von 41 und 42 erfolgte analog zu den Camptothecin-

Prodrugs spektrophotometrisch in isotonischer Kochsalzlösung (vgl. 2.2.3, 4.1.8). Da sich die

Absorptionskoeffizienten von Bendamustin-Hydrochlorid, 41 und 42 bei λ = 330 nm nicht

unterscheiden, konnte die Bestimmung der Konzentration der beiden Prodrugs in einer gesät-

tigten Lösung anhand einer Eichgerade aus der Verdünnungsreihe einer Bendamustin-Lösung

erfolgen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2.3 zusammengestellt.

molare Masse Anzahl der Löslichkeit Verbindung [g/mol] O-Atome [mmol/L] [µg/mL] 41 613.53 3 0.49 (±0.02) 300 (±15) 42 701.64 5 1.11 (±0.06) 780 (±40)

Tabelle 2.3 Löslichkeiten der Prodrugs 41 und 42 in 0.9 %iger NaCl-Lösung

Obwohl die gemessenen Werte deutlich über denen der CPT-Prodrugs mit vergleichbarer

Kettenlänge liegen (vgl. 2.2.3), muß beachtet werden, daß die MTD von Bendamustin-

Hydrochlorid ebenfalls höher als die von CPT liegt (MTD (Bendamustin-Hydrochlorid,

Nacktmaus): jeweils 25 mg/kg i.v. an zwei aufeinanderfolgenden Tagen, MTD (Campto-

thecin, Nacktmaus): ca. 12.5 mg/kg im Abstand von vier Tagen).


Im Gegensatz zu den CPT-Prodrugs ließ sich die Löslichkeit von 42 durch Ansäuern mit

verdünnter Salzsäure auf pH 3.5 drastisch steigern, was durch Bildung des Hydrochlorids

erklärt werden kann. Der für die Durchführung der Tierversuche geforderte Wert von

1.85 mg/mL konnte durch Anwendung dieser Methode problemlos erreicht werden.

2.3.3 Synthese und Charakterisierung eines Bendamustin-Hydrazons

Durch Reaktion des mit DIPC aktivierten Bendamustin-Hydrochlorids mit Hydrazino-

ameisensäure-tert.-butylester (BocNHNH2) konnte das Boc-geschützte Hydrazid 43 in

akzeptabler Ausbeute erhalten werden, das sich durch Entfernung der Boc-Schutzgruppe mit

Trifluoressigsäure zum Hydrazid 44 umsetzen ließ (s. Abb. 2.42). 44 wurde ohne weitere

Aufreinigung zur Synthese des Hydrazons 45 verwendet.

N

NCH3

N

Cl

ClCOOH

HCl


N

NCH3

N

Cl

Cl

O

HN

NHBoc

N

NCH3

N

Cl

ClHN

N

O

OO

N

O

O

2

N

NCH3

N

Cl

Cl

O

HN

NH3+

CF3COO-

TFA / CH2Cl2

BocNHNH2, Et3N, DMAP, DIPC

CH2Cl2 / 0 °C

43 (70 %)

4445 (11 %)

5, Molekularsieb 0.4 nm

THF

Abb. 2.42 Synthese eines Bendamustin-Hydrazons (45)

Dazu wurde 44 mit einem Überschuß des Maleinimidoaldehyds 5 in Anwesenheit von

Molekularsieb (4 Å) umgesetzt. Die überschüssige TFA wurde durch Zusatz des schwach

basischen Ionenaustauschers Amberlyst A-21 abgefangen. Nach säulenchromatographischer

Reinigung ließ sich das Hydrazon 45 gewinnen.

45 wurde durch 1H-NMR-, 13C-NMR-Spektroskopie und Massenspektrometrie charak-

terisiert. Die in DMSO-d6 aufgenommenen NMR-Spektren lassen auf ein Vorliegen von 45

als E/Z-Isomerengemisch schließen, da man hierbei Signalverdopplungen der Protonen bzw. 13C-Kerne in Nähe der Hydrazonbindung beobachtet. Mit zunehmendem Abstand der betref-

fenden Kerne verringert sich dieser Effekt. Für eine ausführliche Interpretation der NMR-

Spektren sei an dieser Stelle auf das Kapitel 4.2.3 des experimentellen Teils verwiesen.


Die Untersuchung der Wasserlöslichkeit von 45 ergab einen ähnlich niedrigen Wert wie für

den analogen Ester 41 (Löslichkeit in isotonischer Kochsalzlösung <300 µg/mL (bestimmt

durch Einwaage)). Dieses Ergebnis ist insofern überraschend, als die für das Modellhydrazon

6 bestimmte Löslichkeit von 2.3 mg/mL um ein Vielfaches unterschritten wurde (vgl.

2.1.5.1). Da vermutet werden kann, daß sich die Wasserlöslichkeit eines längerkettigen

Homologen von 45 (z. B. ein Hexaethylenglykol-Derivat) nicht signifikant von der des

längerkettigen Esters 42 (vgl. 2.3.2.4) unterscheidet (im Gegensatz zu letztgenanntem ist

jedoch aufgrund der Säurelabilität eine Überführung in das Hydrochlorid nicht möglich),

wurde auf die Synthese eines solchen Derivats verzichtet. Der Zugang zu säurelabilen

albuminbindenden Bendamustin-Prodrugs scheint daher auf diesem Wege nicht realisierbar.

2.3.4 Untersuchung der albuminbindenden Eigenschaften

Die Untersuchung der albuminbindenden Eigenschaften der Prodrugs 41 und 42 erfolgte mit

Hilfe einer von Kratz beschriebenen chromatographischen Methode (vgl. 1.3),[44] bei der sich

die einzelnen Proteinkomponenten humanen Plasmas auf einer POROS®-Anionenaus-

tauschersäule durch Gradientenelution (Variation der Ionenstärke) in Abhängigkeit von ihrer

Ladung auftrennen lassen (s. 4.1.7). Proteingebundene Bendamustin-Derivate lassen sich

anhand der Fluoreszenz-Emission des Benzimidazolrings bei λ = 400 nm nachweisen. Bei

dieser Wellenlänge zeigt humanes Plasma eine vernachlässigbare Eigenfluoreszenz.

Um die Retentionszeiten der ungebundenen Prodrugs zu bestimmen, wurden zunächst

Lösungen von 41 und 42 auf der Chromatographiesäule untersucht. Dabei stellte sich heraus,

daß die Proben nicht von der Säule eluiert wurden. Die nachfolgende Betrachtung der

Albumin-Bindungseigenschaften konnte daher nur unter qualitativen Gesichtspunkten durch-

geführt werden. Dazu wurde humanes Plasma mit Lösungen von Bendamustin, 41 und 42

jeweils 30 s und 60 s lang inkubiert. Anschließend wurden die Proben unmittelbar auf die

Ionenaustauschersäule gegeben. Bei gleichzeitiger Messung der UV-Absorption bei

λ = 254 nm und des Fluoreszenzsignals bei λ = 400 nm ließen sich sowohl die Plasmaproteine

(UV) als auch Bendamustin-Derivate (Fluoreszenz) detektieren.


200 400 600 800 1000 1200 1400

0

20

40

60

80

100

Zeit [s]

Fluo

resz

enz

(400

nm

) Fluoreszenz

0,00

0,05

0,10

0,15

UV-Absorption (254 nm

) UV

Abb. 2.43 Chromatogramm von humanem Plasma, das zuvor 60 s lang mit Bendamustin-Hydro-

chlorid (10 µM) inkubiert wurde

Das in Abbildung 2.43 dargestellte Chromatogramm zeigt die Auftrennung von humanem

Plasma, das 60 s mit Bendamustin-Hydrochlorid inkubiert wurde (Konzentration: 10 µM).

Serumalbumin ist als Hauptkomponente des menschlichen Blutes als starke UV-Absorption

bei einer Retentionszeit von ca. 700 s sichtbar. Das Fluoreszenzsignal zeigt ungebundenes

Bendamustin als breiten Peak bei t = 1100 s und einen kleineren Peak mit einer Schulter im

Bereich des Albumin-Signals. Daraus läßt sich schließen, daß Bendamustin unspezifische

Wechselwirkungen mit HSA eingeht.

Führt man diesen Versuch mit den Prodrugs 41 und 42 durch, so gelangt man zu einem

deutlich anderen Ergebnis. Ein repräsentatives Chromatogramm, das nach 30 s Inkubation

von Plasma mit 41 (Konzentration: 5 µM) aufgenommen wurde, ist in Abbildung 2.44

dargestellt (Versuche mit 42 lieferten annähernd identische Chromatogramme, weshalb auf

eine graphische Darstellung verzichtet wurde). Deutlich zu erkennen ist das starke

Fluoreszenzsignal im Bereich des Albumin-Peaks, was auf das Vorliegen einer kovalenten

Bindung an HSA schließen läßt. Dagegen erweist sich die Bindung an andere Plasmaproteine

als vernachlässigbar. Obwohl ungebundenes 41 nicht sichtbar gemacht werden kann (s. o.),

läßt sich anhand eines Vergleichs der Fluoreszenz-Intensität mit dem Bendamustin-Versuch

zeigen, daß die Bindung an Serumalbumin im Falle des Prodrugs um ein Vielfaches stärker

ausgeprägt ist (die untersuchte Konzentration von 41 betrug genau die Hälfte von der des

Bendamustins).


0 200 400 600 800 1000 1200 1400

0

20

40

60

80

100

120

Zeit [s]

Fluo

resz

enz

(400

nm

) Fluoreszenz

0,00

0,05

0,10

0,15

UV-Absorption (254 nm

) UV

Abb. 2.44 Chromatogramm von humanem Plasma, das zuvor 30 s lang mit 41 (5 µM) inkubiert wurde

Die Ursache für das Auftreten von Schultern beim Fluoreszenzsignal der Albumin-Konjugate

von 41 und 42 konnte nicht restlos geklärt werden. Ein möglicher Grund hierfür könnte in

einer partiellen Hydrolyse der Stickstofflost-Einheit von Bendamustin liegen mit dem Resul-

tat einer Verschiebung der Retentionszeit.

2.3.5 Synthese und Charakterisierung eines Bendamustin-PEG35k-Konjugats

Im Gegensatz zu den niedermolekularen Bendamustin-Prodrugs mußte bei der Synthese und

Charakterisierung des PEG35k-Konjugats der polymere Charakter dieser Verbindung

berücksichtigt werden. Dies hatte zur Folge, daß präzise Analytik-Methoden wie die NMR-

Spektroskopie und die Massenspektrometrie nicht zur Anwendung kommen konnten. (Bei

einer Molmasse von ca. 35000 g/mol müßte man bei maximaler Beladung mit Bendamustin

500 mg des Konjugats in 1 mL Lösungsmittel lösen, um zu einer für NMR-Untersuchungen

befriedigenden Bendamustin-Konzentration von 10 mg/mL zu gelangen. Ebensowenig eignet

sich MALDI-TOF-Spektrometrie für Moleküle dieser Größe.) Daher wurde die Synthese zur

Optimierung der Reaktionsbedingungen zunächst mit Hexaethylenglykol als Modell für PEG

entwickelt, da hierbei der Reaktionsverlauf besser verfolgt und die Ausbeute (bzw. der

Beladungsfaktor) mit größerer Genauigkeit bestimmt werden kann. Die Struktur des auf

diesem Weg erhaltenen Diesters konnte mit Hilfe der Standard-Analytik-Methoden bestätigt

werden.


2.3.5.1 Synthese

Zur Darstellung eines Bendamustin-PEG-Konjugats wurden zunächst Probeansätze mit

Hexaethylenglykol durchgeführt. Dabei stellte sich heraus, daß sich die Verwendung von

DIPC als Kopplungsreagenz (89 % Ausbeute) gegenüber der von 2-Chlor-1-methylpyridi-

niumiodid (Mukaiyama-Reagenz) (71 % Ausbeute) als vorteilhafter erwies. So ließ sich

Bendamustin-Hydrochlorid mit Poly(ethylenglykol) der molaren Masse 35000 g/mol in Ge-

genwart von Triethylamin, DIPC und DMAP umsetzen (s. Abb. 2.45).


N

NCH3

N

Cl

ClCOOH

HClPEG35k, Et3N, DIPC, DMAP

CH2Cl26

n

N

NCH3

N

Cl

Cl

O

OOH

HO

OHn

+

(43 %) (10 %)

N

NH3C

N

Cl

Cl

O

N

NCH3

N

Cl

Cl

O

OO

n

46 (47 %)

Abb. 2.45 Umsetzung von Bendamustin-Hydrochlorid mit PEG35k

Im Unterschied zur Synthese des Hexaethylenglykol-Derivats wurde eine längere Reaktions-

zeit (20 Stunden) gewählt. Die Reinigung erfolgte durch Fällung mit Diethylether und zwei-

fache Umkristallisation aus 2-Propanol.

Wie nachfolgende Untersuchungen zeigten (s. 2.3.5.3), wurde neben dem erwünschten

Diester 46 auch der Monoester und ein geringer Anteil nicht-umgesetztes PEG erhalten. Eine

Abtrennung dieser "Verunreinigungen" ist jedoch im präparativen Maßstab nicht möglich.

2.3.5.2 GPC-Messungen

46 wurde mit Hilfe von GPC-Messungen charakterisiert. Die Detektion erfolgte durch

Messung der UV-Absorption bei λmax = 330 nm. Durch Einsatz einer semianalytischen

Sephadex®-LH-20-Säule konnte das Vorliegen von Bendamustin bzw. niedermolekularen

Bendamustin-Derivaten als Verunreinigungen ausgeschlossen werden.


2.3.5.3 Bestimmung des Beladungsfaktors durch UV-Spektroskopie

Die Bestimmung des Beladungsfaktors erfolgte mit Hilfe der UV-Spektroskopie, wobei zu-

nächst der Absorptionskoeffizient von Bendamustin-Hydrochlorid ermittelt wurde (s. 4.1.9).

Durch Aufnahme einer Eichgeraden, die man aus UV-Messungen einer Verdünnungsreihe

von Bendamustin-Hydrochlorid in Methanol bei λmax = 330 nm erhielt, wurde der Absorp-

tionskoeffizient berechnet:

ε330 = 8150 (± 410) M–1cm–1

Anschließend wurde die Absorption einer Lösung des erhaltenen PEG-Konjugats mit einer

definierten Einwaage bei λ = 330 nm bestimmt. Vorab konnte gezeigt werden (durch Beob-

achtung der Absorption einer Lösung von Bendamustin bei Zugabe von PEG35k), daß die

Anwesenheit von PEG keine Änderung der UV-Absorption von Bendamustin bewirkt. Unter

der Voraussetzung, daß diese auch durch Veresterung nicht beeinflußt wird, konnte anhand

der linearen Regression der Eichgeraden die Konzentration an Bendamustin in der metha-

nolischen Lösung des Konjugats berechnet werden. Für eine angenommene Molmasse von

35700 g/mol (vollständiger Umsatz) ließ sich der Beladungsfaktor bestimmen:

Beladung: 1.37 (± 0.07) Bendamustin-Äquivalente pro Molekül PEG

Da ein Molekül PEG zwei zur Verfügung stehende Hydroxygruppen besitzt, entspricht eine

Beladung von 1.37 einer Ausbeute von 68.5 % (bezogen auf alle OH-Gruppen). Durch eine

einfache statistische Betrachtung läßt sich daraus die Zusammensetzung des erhaltenen

Produkts berechnen (s. Anhang):

Zusammensetzung des erhaltenen Produkts:

10 % PEG35k(OH)2, 43 % PEG35k(OH)(Bendamustin), 47 % PEG35k(Bendamustin)2 (46)

Dieses Ergebnis liegt deutlich unter der Ausbeute, die für die Modellverbindung durch

Umsetzung mit Hexaethylenglykol erzielt wurde, was letztlich zeigt, daß die Verwendung

von kurzkettigen Oligo(ethylenglykolen) als Modelle für PEG nur bedingten Erfolg ver-

spricht. Die erzielte Beladung von 1.37 reichte dennoch für die Untersuchung der tumor-

hemmenden Eigenschaften in Nacktmausmodellen aus. Da 46 den Hauptbestandteil des

Bendamustin-Konjugats ausmacht, wird im folgenden auch die erhaltene Mischung aus PEG,

Mono- und Diester mit 46 bezeichnet.


2.3.6 Biologische Eigenschaften

2.3.6.1 Allgemeines

Zur Untersuchung der antitumoralen Eigenschaften wurden das Bendamustin-Prodrug 42 und

das PEG-Konjugat 46 in Tierversuchsstudien in einem LXFS-650-Xenograft-Modell (klein-

zelliges Lungenkarzinom) sowie in einem MAXF-401-Xenograft-Modell (Mammakarzinom)

von der Firma Oncotest (Freiburg) an Nacktmäusen getestet. Vorab wurde in zwei Dosis-

findungsstudien die MTD von Bendamustin-Hydrochlorid, dem albuminbindenden Prodrug

42 und dem PEG-Konjugat 46 bestimmt.

2.3.6.2 Toxizitätsuntersuchungen

In einer ersten Dosisfindungsstudie (durchgeführt von der Firma Klinge Pharma (München))

wurden jeweils fünf Nacktmäusen eine Dosis von 10 mg/kg bzw. 20 mg/kg (Bendamustin-

Äquivalente) des PEG-Konjugats 46 an zwei aufeinanderfolgenden Tagen intravenös

verabreicht. Der Wirkstoff erwies sich in beiden Dosierungen als gut verträglich, was durch

das Ausbleiben von Todesfällen belegt wurde. Lediglich bei der höheren Dosierung war eine

moderate Körpergewichtsreduktion (93 % an Tag 6) zu beobachten. Die MTD von 46 wurde

jedoch in dieser Studie nicht erreicht.

In einem zweiten Tierversuch (durchgeführt von der Firma Oncotest (Freiburg)) wurden

jeweils zwei Nacktmäuse an zwei aufeinanderfolgenden Tagen mit Bendamustin (25 mg/kg,

12.5 mg/kg), 46 (25 mg/kg, 12.5 mg/kg) und 42 (25 mg/kg, 12.5 mg/kg) behandelt. Während

die Applikation von Bendamustin von allen Tieren gut vertragen wurde (allenfalls bei der

hohen Dosierung ließ sich eine Gewichtsreduktion (84 % an Tag 7) beobachten), war in der

mit 46 behandelten Gruppe (niedrige Dosierung) ein Todesfall zu verzeichnen. Hingegen

erwies sich 46 in der hohen Dosierung als gut verträglich (keine Todesfälle, minimale

Körpergewichtsreduktion). Das albuminbindende Prodrug zeigte jedoch bei dieser Studie eine

unerwartet hohe Toxizität. Nach Injektion des Wirkstoffs in die Schwanzvene, kam es bei

beiden Dosierungen zu einem massiven Aufquellen der Schwänze mit nachfolgenden

nekrotischen Veränderungen. Diese Nebenwirkungen erwiesen sich in der hohen Dosierung

als letal (Exitus an Tag 1 bzw. Tag 3), während die Versuchstiere der niedrig dosierten

Gruppe die Studie überlebten. Anhand dieser Ergebnisse wurde für die anschließenden

Tierversuche folgendes Dosierungsschema vorgeschlagen:


Substanz Dosis

[mg/kg] Tag

Bendamustin 40 0 Bendamustin 20 0

46 40 0 46 20 0 42 20 0 42 10 0

Tab. 2.4 Dosierungsschema für die Nacktmaus-Tierversuche (die Dosen von 42 und 46 sind in

Bendamustin-Äquivalenten angegeben)

2.3.6.3 Ergebnisse des LXFS-650-Tierversuchs

Zum Nachweis der antitumoralen Eigenschaften des albuminbindenden Prodrugs 42 und des

PEG-Konjugats 46 wurden die Substanzen und Bendamustin als Vergleich in einem LXFS-

650-Xenograft-Modell an Nacktmäusen getestet. Vorab wurden den Versuchstieren jeweils

20 mg LXFS-650-Tumorgewebe (kleinzelliges Lungenkarzinom) s.c. implantiert. Nach dem

Heranwachsen der Tumore (Tag 23 nach Implantation) wurde mit der Behandlung begonnen.

Die Größe der Tumore betrug zu diesem Zeitpunkt 49–65 mm2 (s. 4.1.12).

0 2 4 6 8 10 12 14 160,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0 Kontrolle Bendamustin (40 mg/Kg) Bendamustin (20 mg/Kg) 46 (40 mg/Kg) 46 (20 mg/Kg) 42 (20 mg/Kg) 42 (10 mg/Kg)

rel.

Tum

orvo

lum

en

Tag

Abb. 2.46 Entwicklung des rel. Tumorvolumens in Nacktmäusen, denen ein LXFS-650-Xenograft

(kleinzelliges Lungenkarzinom) implantiert wurde (Applikation der Wirkstoffe erfolgte an

Tag 0)


Die Applikation der Wirkstoffe erfolgte als einmalige intravenöse Gabe in isotonischer

Kochsalzlösung nach dem in Tabelle 2.4 beschriebenen Dosierungsschema (im Falle der

jeweils höheren Dosierungen als zwei Injektionen im Abstand von 2 h). In Abbildung 2.46

und Tabelle 2.4 sind die Ergebnisse dieser Studie zusammengefaßt.

Aus der Auftragung der rel. Tumorvolumina gegen die Zeit der Beobachtung ist

ersichtlich, daß sich die Größe der Tumore der unbehandelten Kontrollgruppe innerhalb von

16 Tagen fast verfünffacht hat. Das Prodrug 42 erwies sich in diesem Tumormodell als

nahezu unwirksam. Zudem wurden nach Injektion die in Abschnitt 2.3.6.2 beschriebenen

Nebenwirkungen (Aufquellen der Schwänze, Nekrose) beobachtet, weshalb das Experiment

an Tag 16 gestoppt wurde. Das PEG-Konjugat 46 zeigte hingegen eine deutliche Wirksamkeit

(T/Cmax = 31 % bei der hohen Dosierung). Als akute Nebenwirkungen war ähnlich wie bei 42

ein Aufquellen der Schwänze unmittelbar nach der Injektion zu beobachten, das jedoch im

Vergleich zu letztgenanntem wesentlich schwächer ausgeprägt war. Abgesehen davon erwies

sich 46 als gut verträglich: die Anzahl der Todesfälle unterschied sich nicht von der

Kontrollgruppe, und auch bei hoher Dosierung war keine Körpergewichtsreduktion zu

verzeichnen. Allerdings konnten die Ursachen für die starke Gewichtsreduktion der mit der

niedrigen Dosis behandelten Tiere nicht geklärt werden.

Verbindung Dosis


T/C [%] maximal

Kontrolle – 1/6 +4 – Bendamustin 40 2/6 –16 23 (Tag 16) Bendamustin 20 3/6 +5 28 (Tag 13)

46 40 1/6 +4 31 (Tag 13) 46 20 0/6 –20 46 (Tag 13) 42 20 4/6 –19 75 (Tag 16) 42 10 4/6 +1 52 (Tag 13)

Tabelle 2.5 Ergebnisse des Nacktmaus-Tierversuchs an einem LXFS-650-Xenograft

Bendamustin zeigte in diesem Tumormodell die höchste Wirksamkeit (in beiden Dosie-

rungen). Bei der Dosis von 40 mg/kg war an Tag 16 eine Tumorstasis zu verzeichnen. Jedoch

lassen die hohe Anzahl von Todesfällen (2/6 bzw. 3/6) und die beobachtete Körperge-

wichtsreduktion darauf schließen, daß die applizierte Dosis signifikant toxisch wirkt.


2.3.6.4 Ergebnisse des MAXF-401-Tierversuchs

Eine zusätzliche Tierversuchsstudie an einem MAXF-401-Xenograft-Modell gab weiteren

Aufschluß über das chemotherapeutische Potential der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten

Bendamustin-Derivate. Vor Beginn der Behandlung wurden den Versuchstieren jeweils

20 mg MAXF-401-Tumorgewebe (Mammakarzinom) s.c. implantiert. Nach dem Heranwach-

sen der Tumore (Tag 23 nach Implantation) wurde mit der Behandlung begonnen wie oben

beschrieben. Die Größe der Tumore betrug zu diesem Zeitpunkt 134–169 mm2 (s. 4.1.13). In

Abbildung 2.47 und Tabelle 2.5 sind die Ergebnisse dieser Studie zusammengefaßt.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 Kontrolle Bendamustin

(40 mg/Kg) Bendamustin

(20 mg/Kg) 46 (40 mg/Kg) 46 (20 mg/Kg) 42 (20 mg/Kg) 42 (10 mg/Kg)

rel.

Tum

orvo

lum

en

Tag

Abb. 2.47 Entwicklung des rel. Tumorvolumens in Nacktmäusen, denen ein MAXF-401-Xenograft

(Mammakarzinom) implantiert wurde (Applikation der Wirkstoffe erfolgte an Tag 0)

Im Falle der Kontrollgruppe wurde die Studie nach 21 Tagen abgebrochen (T/Cmax-Werte in

Tabelle 2.6 beziehen sich daher nur auf die Tage 0–21). Wie in dem im vorherigen Kapitel

beschriebenen Tierversuch zeigte das albuminbindende Prodrug 42 die schwächste Aktivität

und schwerwiegende Nebenwirkungen, weshalb das Experiment an Tag 35 abgebrochen

wurde.


Verbindung Dosis


T/C [%] maximal

Kontrolle – 0/6 +4 – Bendamustin 40 2/6 –5 3 (Tag 21) Bendamustin 20 2/6 +7 5 (Tag 21)

46 40 2/6 –6 4 (Tag 21) 46 20 1/6 +5 6 (Tag 21) 42 20 3/6 –7 21 (Tag 14) 42 10 2/6 +2 59 (Tag 21)

Tabelle 2.6 Ergebnisse des Nacktmaus-Tierversuchs an einem MAXF-401-Xenograft

Bendamustin und das PEG-Derivat 46 erwiesen sich in diesem Modell hinsichtlich ihrer

Wirksamkeit und Toxizität als nahezu gleichwertig. Beide zeigten sowohl in der niedrigen als

auch in der hohen Dosierung eine große antitumorale Wirksamkeit. In allen Fällen beobachte-

te man Totalremissionen der eingepflanzten Tumore (ab Tag 35) bei allen überlebenden Ver-

suchstieren.


Bendamustin, ein Stickstofflost-Derivat der 2. Generation, das in den 60er Jahren in Ost-

deutschland entwickelt wurde und sich von dem bekannteren Chlorambucil lediglich durch

Austausch des Benzolrings gegen einen Benzimidazolring unterscheidet, eignet sich aufgrund

seiner freien Carboxylgruppe zur Synthese albuminbindender Prodrugs. Für die durch Um-

setzung der Carbonsäuregruppe mit Alkoholen resultierende Esterbindung ist eine Funktion

als Sollbruchstelle wahrscheinlich, da für eine ähnliche Verbindung (Prednimustin, ein Kon-

jugat aus Chlorambucil und Prednisolon mit analoger Esterbindung) eine in-vivo-Freisetzung

des Wirkstoffs beobachtet wurde. Ferner läßt sich Bendamustin aufgrund der Fluoreszenz des

Benzimidazol-Gerüsts neben anderen Blutkomponenten detektieren, wodurch ein Nachweis

der albuminbindenden Eigenschaften der Prodrugs möglich wird.

Durch Veresterung von Bendamustin-Hydrochlorid mit den Maleinimidoalkoholen 1

und 2 ließen sich die albuminbindenden Prodrugs 41 und 42 synthetisieren (s. Abb. 2.48), die

durch NMR-spektroskopische Methoden sowie durch Massenspektrometrie charakterisiert

wurden.


41: n = 3 (42 %)42: n = 5 (74 %)

N

NCH3

N

Cl

Cl OO

N

O

O

On

N

NH3C

N

Cl

Cl

O

N

NCH3

N

Cl

Cl

O

OO

n

46

Abb. 2.48 Bendamustin-Prodrugs mit Ester-Sollbruchstelle

Eine UV-spektrometrische Bestimmung der Wasserlöslichkeit ergab Werte, welche zwar

deutlich höher als die der Camptothecin-Prodrugs vergleichbarer Kettenlänge liegen, für eine

intravenöse Applikation jedoch nicht ausreichten. Im sauren Milieu (pH 3.5) ließ sich indes

die Löslichkeit der längerkettigen Verbindung (42) durch Bildung des Hydrochlorids steigern,

so daß der zur Durchführung der Tierversuche (s. u.) geforderte Wert (1.85 mg/mL) erreicht

wurde.

Durch HPLC-Untersuchungen ließ sich ein qualitativer Nachweis für die albumin-

bindenden Eigenschaften von 41 und 42 erbringen. Dazu wurde humanes Blutplasma 30–60 s

mit den Prodrugs inkubiert und anschließend auf der Chromatographiesäule in seine Protein-

komponenten aufgetrennt. Durch simultane Messung der UV-Absorption bei λ = 280 nm

sowie des Fluoreszenz-Signals bei λ = 400 nm konnte gezeigt werden, daß 41 und 42 an

HSA, jedoch nur in vernachlässigbarer Weise an andere Plasmaproteine binden.

Neben den beiden Prodrugs mit Ester-Sollbruchstelle (41 und 42) wurde zusätzlich ein

Derivat mit säurelabiler Carboxylhydrazonbindung hergestellt. Dazu wurde Bendamustin-

Hydrochlorid mittels einer zweistufigen Synthese in das entsprechende Carboxylhydrazid

(44) überführt, das anschließend mit dem Maleinimidoaldehyd 5 zum proteinbindenden

Prodrug 45 (s. Abb. 2.49) umgesetzt wurde.


45

N

NCH3

N

Cl

ClHN

N

O

OO

N

O

O

2

Abb. 2.49 Bendamustin-Prodrug mit einer Carboxylhydrazonbindung

Die Charakterisierung erfolgte durch NMR-spektroskopische Methoden sowie durch

Massenspektrometrie. Eine Untersuchung von 45 hinsichtlich seiner antitumoralen

Eigenschaften ließ sich jedoch aufgrund der schlechten Wasserlöslichkeit dieser Verbindung,

welche ähnlich niedrig wie die des analogen Esters lag, nicht realisieren. Da im Gegensatz zu

42 eine Überführung in das Hydrochlorid aufgrund der Säurelabilität der Carboxylhydrazon-

bindung nicht möglich war, wurde auf die Synthese des homologen Hexaethylenglykol-

Derivats verzichtet. Der Zugang zu säurelabilen albuminbindenden Bendamustin-Prodrugs

scheint daher nur unter Verwendung anderer Linker-Systeme realisierbar.

Da bislang keine makromolekularen Formulierungen von Bendamustin bekannt waren,

schien die Synthese eines Poly(ethylenglykol)-Konjugats durch eine einfache Veresterung

von Bendamustin mit PEG interessant, da ein solches Konjugat über die gleiche

Sollbruchstelle wie 41 und 42 verfügt und daher in Tierversuchsstudien zu Vergleichs-

zwecken herangezogen werden kann. So ließ sich durch Umsetzung von Bendamustin-

Hydrochlorid mit PEG der molaren Masse 35 kDa das entsprechende Polymer-Konjugat (46)

(s. Abb. 2.48) synthetisieren. Die Charakterisierung des Konjugats erfolgte durch GPC-

Messungen an Sephadex® LH20, wobei eine Verunreinigung mit niedermolekularen Benda-

mustin-Derivaten ausgeschlossen werden konnte. Mit Hilfe UV-spektroskopischer

Messungen ließ sich der Beladungsfaktor zu 1.37 bestimmen (theoretisch 2), was sich als

ausreichend zur Durchführung erster Tierversuchsstudien erwies.

Die antitumoralen Eigenschaften des längerkettigen albuminbindenden Prodrugs 42 und

des PEG-Konjugats 46 wurden in einem LXFS-650- und einem MAXF-401-Xenograft-

Modell an Nacktmäusen bestimmt (Lungenkarzinom bzw. Mammakarzinom). Bendamustin-

Hydrochlorid diente in beiden Versuchen als Vergleichssubstanz. Die Applikation erfolgte

intravenös in Dosen von 20 mg/kg und 40 mg/kg (Bendamustin, 46) sowie 10 mg/kg und

20 mg/kg (42), nachdem 42 in einer zuvor durchgeführten Toxizitätsstudie stärkere

Nebenwirkungen gezeigt hatte.


In den Tierversuchsstudien erwies sich das albuminbindende Prodrug 42 als inaktiv bis mäßig

wirksam. Auffallend waren jedoch die starken Nebenwirkungen, die unmittelbar nach der

Injektion mit 42 auftraten (Aufquellen der Schwänze, Nekrose) und vermutlich für die hohe

Sterblichkeit der behandelten Tiere verantwortlich war.

Bendamustin und das PEG-Konjugat 46 zeigten hingegen eine vielfach höhere Aktivität

und erwiesen sich in den betrachteten Tiermodellen als nahezu gleichwertig hinsichtlich ihrer

Wirksamkeit. Während in dem LXFS-650-Modell eine Tumorstasis erreicht wurde, waren im

MAXF-401-Modell Totalremissionen der eingepflanzten Tumore bei allen überlebenden

Versuchstieren zu verzeichnen. Beide Verbindungen zeigten zudem ein ähnliches Toxizitäts-

profil.

Da das PEG-Konjugat 46 und das albuminbindende Prodrug 42 über identische

Sollbruchstellen verfügen, überrascht die beobachtete Diskrepanz in ihrer Wirksamkeit und

ihrem Toxizitätsprofil. Ob dieser Unterschied aus den verwendeten Trägersystemen resultiert,

konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit jedoch nicht geklärt werden. Ebenso läßt sich das

therapeutische Potential von 46 nur durch weiterführende Studien abschätzen.


2.4 Wasserlösliche Platin-Prodrugs mit einem albuminbindenden

Cyclobutan-1,1-dicarboxylatliganden

2.4.1 Allgemeines

In der Vergangenheit konnten von Schütte et

al. albuminbindende Platin(II)-Komplexe syn-

thetisiert werden, bei denen die Bindung an

Platin durch Maleinimid-tragende Ethylen-

diamin- bzw. Propylendiamin-Derivate reali-

siert wurde (s. Abb. 2.50).[172-174] Die durch

Umsetzung mit HSA erhaltenen korrespon-

dierenden Albumin-Konjugate erwiesen sich

jedoch in Zellkulturexperimenten an vier

verschiedenen Tumorzellinien als nahezu

inaktiv.[174] Schütte führte diese Ergebnisse auf

die fundamentale Bedeutung der Sollbruchstelle für die Wirksamkeit Platin-haltiger

makromolekularer Prodrugs mit polymergebundenen Diaminliganden zurück. Dabei

vermutete er, daß die von ihm eingesetzten säurelabilen Carboxylhydrazonbindungen eine zu

geringe Spaltbarkeit aufwiesen.

N

O HN

NH2

PtO

O

OCl

Cl

N

O

NH

PtNH

N

R

HN

O

O

Cl

Cl

O

O

R = H, CH3

Abb. 2.50 Von Schütte et al. synthetisierte

albuminbindende Platin(II)-Komplexe

PolymerNH2

Pt

H2N

Cl

Cl

Sollbruchstelle

Polymer

O

O

O

O

RPt

NH2R'

NH2R'

Sollbruchstelle

Sollbruchstelle

Abb. 2.51 Position der Sollbruchstelle bei Platin-haltigen Polymer-Konjugaten. Die Komplexierung

über eine polymergebundene Ethylendiamin-Einheit (links) erfordert den Einbau einer

zusätzlichen Sollbruchstelle zwischen Pt-Komplex und Polymer

Im Gegensatz dazu ist bei makromolekularen Platin-Prodrugs, bei denen die Bindung von

Platin an das Polymer über einen labiler gebundenen Dicarboxylatliganden erfolgt, die

Sollbruchstelle bereits in den Komplex integriert (s. Abb. 2.51). Nach einer analog zu

Carboplatin verlaufenden intrazellulären Hydrolyse (vgl. 1.7.2) kann hierbei der aktive

Aquokomplex freigesetzt werden. Schütte versuchte daher im Rahmen seiner Dissertation, die

Wasserlösliche Platin-Prodrugs mit einem albuminbindenden Cyclobutan-1,1-dicarboxylatliganden 89

in Abbildung 2.52 dargestellten albuminbindenden Platin(II)-Komplexe mit Malonatliganden

zu synthetisieren, was jedoch an der Hydrolyseempfindlichkeit aromatischer Maleinimide

scheiterte.[174]

N

O

O

O

O

O

O

Pt

NH3

NH3 O

O

O

O

Pt

H3N

NH3

N

O

O

Abb. 2.52 Von Schütte geplante albuminbindende Pt(II)-Komplexe

In der vorliegenden Arbeit wurde dieses Thema erneut aufgegriffen. Im Unterschied zu den

von Schütte angestrebten Zielverbindungen sollte hierbei jedoch im Hinblick auf eine

Anwendbarkeit als albuminbindende Prodrugs ein größerer Wert auf hohe Wasserlöslichkeit

gelegt werden. Zudem sollte als platinbindende Einheiten substituierte Cyclobutan-1,1-

dicarboxylatliganden zum Einsatz kommen, wodurch man zu proteinbindenden Carboplatin-

Analoga gelangt.

Als bislang einziges Beispiel für

einen Platinkomplex mit einem

funktionalisierten Cyclobutan-1,1-

dicarboxylatliganden wurde von

Hanessian und Wang ein Cephalos-

porin-Konjugat veröffentlicht, zu

dessen Darstellung 13 Synthese-

schritte erforderlich waren (Struktur s. Abb. 2.53).[175] Im Rahmen der vorliegenden Arbeit

sollte eine einfachere, allgemein anwendbare Syntheseroute entwickelt werden, wie im

folgenden erläutert wird.

NH2

Pt

H2N

HN

N

S

COOH

O

O

OO

O

O

O

O

Abb. 2.53 Von Hanessian und Wang entwickeltes

Cephalosporin-Konjugat

2.4.1.1 Synthesestrategie

Die zur Darstellung wasserlöslicher albuminbindender Platin(II)-Prodrugs entwickelte

Syntheseroute (s. Abb. 2.54) wurde flexibel hinsichtlich eines Einsatzes verschiedener

Crosslinker gestaltet. Dabei wird die Verknüpfung zwischen platinbindender und albumin-

bindender Einheit durch Veresterung einer geschützten 3-Hydroxycyclobutan-1,1-dicarbon-

säure mit Maleinimidocarbonsäuren realisiert.


X X

OH

X X

OPG

PG'O OPG'

OO

PG'O OPG'

OO

OPG

PG'O OPG'

OO

OHHOOCR

N

O

O

RN

O

OO

O

PG'O OPG'

OO

RN

O

OO

O

O O

OHOH

PtH2N NH2

R'

NO3O3NR

N

O

OO

O

O O

OOPt

H2N NH2R'

PG, PG' = Schutzgruppen

X = Abgangsgruppe (z. B. Br, OTos)

Abb. 2.54 Synthesestrategie zur Darstellung albuminbindender Pt(II)-Prodrugs

Der Aufbau der komplexierenden Cyclobutan-1,1-dicarbonsäure-Einheit erfolgt mit Hilfe der

Malonestersynthese. Diese Reaktion, bei der ein Malonsäureester unter basischen Bedingun-

gen mit einem 1,3-Dihalogenpropan umgesetzt wird, gilt als Standard zur Darstellung substi-

tuierter Cyclobutane.[176] Ebenso ließ sich in der Vergangenheit zeigen, daß durch Verwen-

dung eines 1,3-Dihalogenpropans mit einer geschützten Hydroxy-Funktion in 2-Position der

Zugang zu 1,1-disubstituierten 3-Hydroxycyclobutanen möglich ist.[177,178]

Bei der Wahl der Schutzgruppen (PG und PG' in Abb. 2.54) muß beachtet werden, daß

die Abspaltung der Carbonsäure-Schutzgruppen (PG') unter sauren Bedingungen erfolgen

muß, da eine Behandlung unter basischen Bedingungen einerseits die Esterbindung,

andererseits den Maleinimidring angreifen würde. Zudem müssen PG und PG' orthogonal

gewählt werden, um eine selektive Abspaltung zu ermöglichen. Somit empfehlen sich

Trialkylsilylgruppen als Alkohol-Schutzgruppen, da sie basenstabil sind sowie leicht und

selektiv durch Fluorid-Ionen entfernt werden können. Als Schutzgruppe für die Carboxyl-

gruppen wurde der Einsatz von tert.-Butylestern und 4-Methoxybenzylestern (PMB-Ester) in

Betracht gezogen, da sich beide im Gegensatz zu den meisten anderen Alkylestern im Sauren

abspalten lassen.


Die abschließende Komplexbildung erfolgt nach der von Pasini et al. beschriebenen Metho-

de, bei der ein Diam(m)inplatin(II)-dinitratkomplex mit Malonaten oder Cyclobutan-1,1-di-

carbonsäure umgesetzt wird.[179]

2.4.2 Synthese und Charakterisierung albuminbindender Platin(II)-Prodrugs

Die Darstellung der albuminbindenden Pt(II)-Prodrugs wurde gemäß der Synthesestrategie

ausgehend von 1,3-Dibrom-2-propanol durchgeführt. Im ersten Schritt erfolgte die Ein-

führung einer tert.-Butyldimethylsilyl-Schutzgruppe (TBS) unter Standardbedingungen,[180]

die den geschützten Alkohol 47 in quantitativer Ausbeute lieferte (s. Abb. 2.55).

Et3N, CH2Cl2

50: R = PMB (92 %)

51: R = H (89 %)TFA, Anisol

48: R = TBS (26 %)

49: R = H (88 %)TBAF

KH, Dioxan

TBSCl, Imidazol

DMF

4

OR

RO

O

O

ON

O

O

O

O

N O OH

O

O

O4

PMBO OPMB

O O

PMBO OPMB

O O

OR

Br Br

OTBS

Br Br

OH

I-N+

CH3

Cl

N OH

O

O

O

OR

RO

O

O

ON

O

O

O

47 (100%)

52: R = PMB (74 %)


27

Abb. 2.55 Synthese der Cyclobutan-1,1-dicarboxylatliganden 51 und 53

Dieser wurde anschließend in einer Malonestersynthese nach einer literaturbeschriebenen

Methode umgesetzt.[178] Dabei erwies sich jedoch die Verwendung des käuflichen Di-tert.-

butylmalonat als ungeeignet, da unter den drastischen Reaktionsbedingungen (NaH, 120 h

Rückfluß) Zersetzung eintrat. Statt dessen konnte das von Hanessian et al. beschriebene

Bis(4-methoxybenzyl)malonat erfolgreich eingesetzt werden, das zuvor durch Alkylierung

von Malonsäure mit 4-Methoxybenzylchlorid hergestellt werden mußte.[175] Nach


säulenchromatographischer Reinigung des Rohprodukts wurde das Cyclobutan-Derivat 48

erhalten. Anschließend gelang die Abspaltung der TBS-Schutzgruppe mit Tetrabutyl-

ammoniumfluorid (TBAF), die das Cyclobutanol-Derivat 49 in hoher Ausbeute lieferte. 49

stellt aufgrund seiner freien Hydroxygruppe eine universell einsetzbare Ligandenvorstufe dar,

die sich auch zur Darstellung anderer Platin(II)-Polymer-Konjugate eignen sollte (z. B. durch

Veresterung mit PEG-Dicarbonsäure, Abspaltung der Schutzgruppen und nachfolgender

Komplexbildung). Im Falle der vorliegenden Arbeit wurde 49 mit der Maleinimidocarbon-

säure 27 und ε-Maleinimidocapronsäure (EMC) unter Verwendung der von Mukaiyama

entwickelten Methode verestert und damit die albuminbindende Maleinimidgruppe einge-

führt.[168] Zur Gewinnung der freien Liganden 51 und 53 gelang schließlich die Abspaltung

der PMB-Schutzgruppen unter Friedel-Crafts-Bedingungen (TFA, Anisol).

Zur Synthese des entsprechenden Platin(II)-Prodrugs wurde als Diaminligand race-

misches trans-DACH (trans-1,2-Diaminocyclohexan) gewählt, da es gegenüber Ammin-

liganden den Vorteil besitzt, 1H-NMR- und 13C-NMR-spektroskopisch erfaßbar zu sein, wo-

durch sich eine erfolgreiche Komplexierung mit den Dicarboxylatliganden 51 und 53 besser

verfolgen läßt. Platin(II)-Komplexe mit DACH-Liganden (z. B. Oxaliplatin) haben sich zu-

dem in der Vergangenheit gegenüber Cisplatin-resistenten Zellinien bewährt.[181]

Für die Umsetzung mit 51 und 53 mußte zunächst das reaktive trans-DACH-Platin(II)-

dinitrat gemäß der Literaturvorschrift[179,182] in einer zweistufigen Synthese ausgehend von

Kaliumtetrachloroplatinat hergestellt werden (s. Abb. 2.56).

K2PtCl4

NH2

NH2

KI

H2N

PtNH2

I

IH2N

PtNH2

ONO2

ONO2

trans-DACH

AgNO3

[Pt trans-DACH] I2 [Pt trans-DACH] (NO3)2

Abb. 2.56 Synthese von trans-DACH-Platin(II)-dinitrat

Zur abschließenden Komplexbildung (s. Abb. 2.57) wurde eine wäßrige Lösung von

[Pt trans-DACH](NO3)2 mit 51 bzw. 53 versetzt und der pH-Wert mit 0.1 M KOH auf 5.5

eingestellt, wobei das EMC-Derivat (55) in Form eines farblosen Niederschlags ausfiel, der

durch Zentrifugation und nachfolgendem Waschen mit wenig Wasser gereinigt werden

konnte.


OH

HO

O

O

ON

O

O

O

4

OH

HO

O

O

ON

O

O

O

O

4

NH2

Pt

H2N

ON

O

O

O

OO

O

O

O

NH2

Pt

H2N

ON

O

O

OO

O

O

O

[Pt trans-DACH] (NO3)2

H2N

PtNH2

ONO2

ONO2

51

53 55 (67 %)

54 (19 %)

Abb. 2.57 Synthese der albuminbindenden Platin(II)-Komplexe 54 und 55

Aufgrund der hohen Wasserlöslichkeit (vgl. 2.4.3) ließ sich das Tetraethylenglykol-Derivat

52 nicht durch Fällung isolieren. Die Aufreinigung erfolgte daher durch HPLC an einer

präparativen Säule (Nucleosil® 100-7 C18), einer Methode, die sich in der Vergangenheit

auch zur Trennung anderer wasserlöslicher Platinkomplexe bewährt hatte.[183] Als Laufmittel

wurde hierbei Wasser/Acetonitril 80:20 mit 0.05 % Trifluoressigsäure eingesetzt. Der Säure-

zusatz erwies sich als notwendig, da bereits bei neutralem pH eine signifikante Zersetzung

durch Öffnung des Maleinimidrings zur Maleaminsäure zu beobachten war.

Die Charakterisierung der Platinkomplexe 54 und 55 sowie aller Vorstufen erfolgte

mittels 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektroskopie. Bei 51, 54 und 55 wurde zusätzlich die

Massenspektrometrie, bei 47–49, 52, 54 und 55 Elementaranalysen herangezogen. Am Bei-

spiel von 54 als Prototyp eines wasserlöslichen albuminbindenden Platin-Prodrugs werden im

folgenden die analytischen Daten diskutiert. Zur Bestätigung der vorgeschlagenen Struktur

wurden von 54 zusätzlich ein 195Pt-NMR-Spektrum sowie ein Infrarotspektrum aufgenom-

men.



Von 54 wurden 1H-, 13C- und 195Pt-NMR-Spektren in D2O aufgenommen. In Abbildung 2.58

ist das 1H-NMR-Spektrum von 54 (Struktur s. Abb. 2.57) dargestellt. Deutlich zu erkennen

sind die Signale des Linkers, insbesondere die der 18 Protonen des Tetraethylenglykol-

Rückgrats, welche als breites Multiplett bei 3.54–3.84 ppm erscheinen. Ebenso charakteris-

tisch ist die Resonanz der beiden Protonen der Maleinimid-Doppelbindung bei 6.85 ppm als

scharfes Singulett sowie das Triplett der Methylengruppe in α-Stellung zur Ester-Carbonyl-

gruppe bei 2.66 ppm.

(ppm)4.854.904.955.00

(ppm)1.01.21.41.61.82.02.22.4

(ppm)2.62.83.03.23.4

(ppm)0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0

Abb. 2.58 1H-NMR-Spektrum von 54 (D2O)

Den Protonen des Cyclobutanrings läßt sich das 'Pentett' bei 4.93 ppm (CHOR) sowie die

beiden Multipletts der diastereotopen Methylengruppen bei 2.80–2.93 ppm bzw. 3.34–

3.50 ppm zuordnen. Die Signale des DACH-Liganden erscheinen als schlecht aufgelöste

Multipletts bei 0.98–1.35 ppm, 1.44–1.62 ppm und 2.28–2.48 ppm (Cyclohexyl-Gerüst).

Hingegen sind die Protonen der komplexierenden Aminogruppen nicht sichtbar.

Das 13C-NMR-Spektrum von 54 (s. Abb. 2.59) lieferte einen weiteren Beleg für die

angenommene Struktur. Charakteristische Signale sind unter anderem durch die olefinischen


C-Atome des Maleinimidrings (134.86 ppm) sowie die beiden chemisch nicht-äquivalenten

Carboxylatgruppen des Cyclobutan-1,1-dicarboxylatliganden (180.30 ppm und 180.47 ppm)

gegeben. 18

0.46

9418

0.30

4517

4.10

6217

3.38

67

134.

8629

70.0

094

69.9

720

69.7

321

68.0

233

66.5

168

65.3

701

63.0

542

50.7

101

38.7

182

38.5

383

37.3

691

34.9

108

32.2

201

24.2

980

(ppm)0102030405060708090100110120130140150160170180190

Abb. 2.59 13C-NMR-Spektrum von 54 (D2O)

Des weiteren erscheinen die Resonanzen des Tetraethylenglykol-Rückgrats in einem engen

Bereich zwischen 65.37 ppm und 70.01 ppm (6 Signale). Die beobachtete Differenz zu den

theoretisch erwarteten 8 Signalen läßt sich durch das Auftreten von Überlagerungen erklären,

die durch gleiche chemische Verschiebungen der CH2O-Gruppen in der Mitte der Kette

hervorgerufen werden.

Die tetraedrische Koordination von Platin(II) wurde durch Aufnahme eines 195Pt-NMR-

Spektrums von 54 belegt. Das in Abbildung 2.60 dargestellte Spektrum (Standard: K2PtCl4)

weist als einziges Signal eine Absorption bei –311 ppm auf, welches im Bereich anderer

Platin(II)-Malonatkomplexe mit DACH-Liganden liegt.[179] Charakteristisch für Platinkom-

plexe mit Stickstoffliganden ist das Auftreten von breiten Signalen, dessen Ursache in dem

starken elektrischen Quadrupolmoment des 14N-Kerns liegt.


Abb. 2.60 195Pt-NMR-Spektrum von 54 (D2O)



C27H41N3O12Pt und der molaren Masse Mr = 794.71 g/mol zeigt als Basispeak das Molekülion

mit angelagertem Natrium ([M+Na]+, m/z = 816.9) und belegt damit die angenommene

Struktur.

m/z300 400 500 600 700 800 900

Inte

nsitä

t [%

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

368.1382.1

510.2

816.9

820.4



2.4.2.3 Infrarotspektroskopie

Abbildung 2.62 zeigt das von 54 aufgenommene IR-Spektrum (KBr). Die starke Absorption

bei ν = 1627 cm–1 läßt sich der C=O-Streckschwingung, die bei ν = 1353 cm–1 der C–O-

Streckschwingung des Carboxylatliganden zuordnen (Lit.:[184] ν = 1615 cm–1 bzw.

ν = 1380 cm–1 für DACH-Platin(II)-cyclobutan-1,1-dicarboxylat). Die C=O-Streckschwin-

gung der Maleinimidgruppe erzeugt eine weitere charakteristische Bande bei ν = 1709 cm–1

(Lit.: ν = 1700 cm–1 für Maleinimid[185]).

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0,70

0,75

(Mal-C=O)

↑

↑

↑(C-O)

(C=O)

Tran

smis

sion

Wellenzahl [cm-1]

Abb. 2.62 IR-Spektrum von 54 (KBr)

2.4.3 Wasserlöslichkeit

Im Falle der Platinkomplexe 54 und 55 bestand keine Notwendigkeit einer exakten Bestim-

mung der Wasserlöslichkeit durch Anwendung spektroskopischer Methoden (vgl. 2.2.3 und

2.3.2.4). Bei der Aufreinigung des Tetraethylenglykol-Derivats 54 war bereits ersichtlich, daß

diese Verbindung eine sehr hohe Wasserlöslichkeit besitzt (>>100 mg/mL). Im Gegensatz

dazu weist der Komplex 55 als Derivat der unpolaren EMC lediglich eine marginale Lös-

lichkeit auf (<1 mg/mL) und eignet sich daher nicht für einen Einsatz als albuminbindendes

Prodrug. So beschränkte sich die im folgenden beschriebene Untersuchung der in-vitro-

Aktivität auf 54.


2.4.4 Zellbiologische Untersuchungen

Zur Bestimmung der Antitumoraktivität wurde von G. Bing an der Klinik für Tumorbiologie

in Freiburg mit der Platinkomplexverbindung 54 ein Zellkulturexperiment an der humanen

Lungenkarzinom-Zellinie LXFL 529 durchgeführt. Als Vergleichssubstanz diente hierbei das

klinisch etablierte Carboplatin. Beide Substanzen wurden jeweils bei Konzentrationen von

0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 150 und 300 µmol/L mit Hilfe des BrdU-Assays untersucht (s. 4.1.10).

In Abbildung 2.63 ist der Prozentsatz der behandelten, nach 48 h noch lebenden Zellen

bezogen auf die unbehandelte Kontrolle (T/C-Wert) gegen die Konzentration der Wirkstoffe

aufgetragen.

1 10 100-20

0

20

40

60

80

100

120

IC50

Carboplatin 52

T/C

[%]

Konzentration [µmol/L]

Abb. 2.63 Ergebnisse der in-vitro-Studie des Platin-Prodrugs 52 an der humanen Lungenkarzinom-

Zellinie LXFL 529

Aus diesen Ergebnissen ließen sich mit Hilfe einer sigmoidalen Interpolation die jeweiligen

IC50-Werte (Konzentrationen, bei der die Hälfte der Zellen abgetötet wurden) abschätzen:

Carboplatin: 54 (±7) µmol/L

54: 14 (±4) µmol/L

Daraus ist ersichtlich, daß mit dem albuminbindenden Platinkomplex 54 ein Wirkstoff

vorliegt, welcher in der untersuchten Zellinie gegenüber dem Arzneistoff Carboplatin eine

deutlich höhere Wirksamkeit aufweist. Da jedoch die in-vitro-Aktivitäten verschiedener

Platinkomplexe je nach Art der Krebszellinie stark variieren können[186] und bei den beiden

betrachteten Spezies unterschiedliche wirksame Komponenten (Diaquokomplexe) nach


Abspaltung vom Dicarboxylatliganden entstehen, wäre eine Vergleich der Wirksamkeit von

54 mit der Stammverbindung trans-DACH-Platin(II)-cyclobutan-1,1-dicarboxylat aussage-

kräftiger. Dieser konnte aus Zeitgründen und mangels der kommerziellen Verfügbarkeit von

trans-DACH-Platin(II)-cyclobutan-1,1-dicarboxylat im Rahmen der vorliegenden Arbeit

nicht mehr durchgeführt werden. Anhand der Größenordnung der gemessenen IC50-Werte

wäre hierbei jedoch zu vermuten, daß 54 eine der Stammverbindung gleichwertige

Wirksamkeit aufweist.


In der Vergangenheit synthetisierte albuminbindende Platin(II)-Komplexe, bei denen die

Bindung an Platin durch Maleinimid-tragende Ethylendiamin- bzw. Propylendiamin-Derivate

realisiert wurde, besitzen gegenüber Platin(II)-Komplexen mit albuminbindenden

Dicarboxylatliganden den Nachteil, daß bei erstgenannten Verbindungen eine Sollbruchstelle

zwischen platinbindender und albuminbindender Einheit eingeführt werden muß. Im Gegen-

satz dazu ist bei Platinkomplexen mit Dicarboxylatliganden die Sollbruchstelle bereits in den

Komplex integriert. Durch intrazelluläre Hydrolyse dieser im Vergleich zu Diaminen labil

gebundenen Liganden analog zu Carboplatin kann der aktive Aquokomplex freigesetzt

werden. Frühere Versuche, albuminbindende Platinkomplexe mit Malonatliganden zu synthe-

tisieren scheiterten an der Empfindlichkeit aromatischer Maleinimide. Daher wurde in der

vorliegenden Arbeit der Versuch unternommen, einen Hydroxy-funktionalisierten Cyclobu-

tan-1,1-dicarboxylatliganden zu synthetisieren, welcher sich zur Veresterung mit Malein-

imidocarbonsäuren eignet. Durch anschließende Umsetzung mit Diamin-Platin(II)-Kom-

plexen sollten albuminbindende Carboplatin-Analoga dargestellt werden.

Die Synthese der komplexierenden Einheit erfolgte durch

zweifache Alkylierung des 4-Methoxybenzyldiesters von

Malonsäure (PMB-Malonat) mit TBS-geschütztem 1,3-Di-

brompropanol. Nach Abspaltung der Silyl-Schutzgruppe wurde

mit 49 eine geschützte Hydroxy-funktionalisierte Cyclobutan-

1,1-dicarbonsäure erhalten (s. Abb. 2.64), die als universell

einsetzbarer Baustein für Carboplatin-Derivate angesehen wer-

den kann. Durch Veresterung mit der unpolaren käuflichen

EMC (ε-Maleinimidocapronsäure) bzw. der wasserlöslichen

Maleinimidocarbonsäure 27 (Tetraethylenglykol-Derivat), und

PMBO OPMB

O O

OH

49

Abb. 2.64 PMB-geschützte

Hydroxycyclobutan-1,1-

dicarbonsäure


anschließender Abspaltung der PMB-Schutzgruppen ließen sich mit 52 und 53 zwei erste

thiolbindende Cyclobutan-1,1-dicarboxylatliganden synthetisieren. Die abschließende Kom-

plexbildung erfolgte mit [Pt trans-DACH](NO3)2 (DACH: 1,2-Diaminocyclohexan) nach

einer literaturbeschriebenen Variante. Die daraus resultierenden Platinkomplexe 54 und 55

ließen sich in Ausbeuten von 19 % bzw. 67 % gewinnen (s. Abb. 2.65).

54

4

NH2

Pt

H2N

ON

O

O

O

OO

O

O

ONH2

Pt

H2N

ON

O

O

OO

O

O

O

55

Abb. 2.65 Albuminbindende Carboplatin-Analoga

Erwartungsgemäß zeigte das EMC-Derivat 55 eine niedrige Wasserlöslichkeit, während sich

das Tetraethylenglykol-Derivat 54 als sehr wasserlöslich erwies (>>100 mg/mL). Jedoch

konnte wegen des Löslichkeitsverhaltens von 54 die Produktisolierung nicht durch eine

einfache Fällung erfolgen. Die Reinigung dieses Komplexes mußte daher durch präparative

RP-HPLC durchgeführt werden.

Die Charakterisierung der Platinkomplexe erfolgte durch 1H- und 13C-NMR-spektros-

kopische Methoden, Massenspektrometrie und Elementaranalysen (im Falle von 54 zusätzlich

durch 195Pt-NMR- sowie IR-Spektroskopie). Dabei bestätigte sich die angenommene Struktur.

Zur Bestimmung der in-vitro-Aktivität von 54 wurde ein Zellkulturversuch an einer

LXFL-529-Zellinie (Lungenkarzinom) durchgeführt. Darin wies 54 eine hohe Zytotoxizität

auf, die über der von Carboplatin lag (54: IC50 = 14 µM, Carboplatin: IC50 = 50 µM). Mit 54

liegt daher ein vielversprechender Kandidat für eine weiterführende Entwicklung als albumin-

bindendes Prodrug vor.

101

3 Zusammenfassung und Ausblick Obwohl die Chemotherapie maligner Tumore eine der wichtigsten Behandlungsmöglichkeiten

von Krebserkrankungen darstellt, wird sie nur in seltenen Fällen mit kurativem Ziel einge-

setzt. Die Hauptursache hierfür liegt in den dosislimitierenden Nebenwirkungen der verwen-

deten Zytostatika. Diese verteilen sich als niedermolekulare Verbindungen gleichmäßig im

Organismus und schädigen dabei auch gesundes Gewebe. In den letzten drei Jahrzehnten

wurden daher Transportsysteme für Zytostatika entwickelt, die ein Drug Targeting von Zyto-

statika ermöglichen. Neben tumorspezifischen Antikörpern erwiesen sich Makromoleküle mit

einem Molekulargewicht >40 kDa als besonders geeignete Trägermoleküle, die sich aufgrund

eines als EPR-Effekt bezeichneten passiven Phänomens in Tumorgewebe anreichern. Aus

diesem Grund zeigen Konjugate von Zytostatika mit synthetischen Polymeren und Biopoly-

meren eine gegenüber dem reinen Wirkstoff veränderte Pharmakokinetik verbunden mit

höherer Wirksamkeit und einer Verringerung der Nebenwirkungen. Trotz vielversprechender

erster klinischer Studien hat bislang keines dieser Prodrugs die Marktreife erlangt, was z. T.

auf den polymeren Charakter dieser Verbindungen zurückgeführt werden kann. Daraus resul-

tierende Nachteile liegen in der aufwendigen Analytik, der kostenintensiven Herstellung und

Reinigung sowie – im Falle von synthetischen Polymeren – in der oftmals nicht vorhandenen

Bioabbaubarkeit. Bei Konjugaten mit Biomolekülen, welche aus humanem Blut gewonnen

werden, besteht das Risiko einer Kontamination mit Krankheitserregern. Ferner kann die

Applikation körperfremder Proteine eine Immunantwort beim Patienten auslösen.

Ein neuartiges doppeltes Prodrug-Konzept, bei dem durch intravenöse Applikation

eines albuminbindenden Wirkstoffderivats eine quantitative Kopplung an endogenes Human-

serumalbumin in vivo erreicht wird, beseitigt einige der für makromolekulare Prodrugs typi-

schen Nachteile. So lassen sich aufgrund des niedermolekularen Charakters solcher Verbin-

dungen einfache Methoden zur Charakterisierung heranziehen. Zudem besteht bei diesen

Prodrugs kein Infektionsrisiko, und die Wahrscheinlich von Immunreaktionen ist aufgrund

der Kopplung an körpereigenes Serumalbumin gering.

Die Grundlage für das doppelte Prodrug-Konzept bildet zum einen der Einsatz von

N-Alkylmaleinimiden als Kopplungsgruppen, welche aufgrund des doppelt aktivierten

Michael-Systems sehr schnell und selektiv an Thiolgruppen binden. Zum anderen trägt die

einzigartige Struktur von Humanserumalbumin (HSA) zur Anwendbarkeit dieses Konzeptes

bei. HSA verfügt über genau eine freie Thiolgruppe, die – bedingt durch einen vergleichs-

weise niedrigen pKa-Wert von 7 – eine hohe Reaktivität aufweist. Zudem bildet es mit einer

102 Zusammenfassung und Ausblick

Konzentration von 32–50 g/L den Hauptproteinanteil des menschlichen Blutes und stellt

damit gleichzeitig die größte Anzahl freier Thiolgruppen zur Verfügung.

Abbildung 3.1 zeigt den allgemeinen Aufbau eines albuminbindenden Prodrugs, das

man durch Kopplung von Wirkstoff(derivat)en an einen Maleinimid-tragenden Crosslinker

(Verbindungsmolekül) erhält. Die Bindung zwischen Wirkstoff(derivat) und Linker dient

hierbei als Sollbruchstelle, die idealerweise im Blut eine ausreichende Stabilität aufweisen

sollte und nach Erreichen des Tumorgewebes unter Freisetzung des Wirkstoffs gespalten

wird.

Sollbruchstelle

Crosslinker

N

O

O

Wirkstoff

Abb. 3.1 Schematischer Aufbau eines albuminbindenden Prodrugs

Eine erste Erprobung dieses Konzeptes anhand eines albuminbindenden Doxorubicin-Deri-

vats mit einer säurelabilen Carboxylhydrazonbindung erwies sich als vielversprechend. Diese

Verbindung zeigte in verschiedenen Tiermodellen eine deutliche Überlegenheit gegenüber

Doxorubicin. Mittels HPLC-Studien an humanem Blutplasma, das zuvor mit dem Prodrug

inkubiert wurde, konnte eine eindeutige selektive in-vitro-Kopplung an HSA belegt werden.

Daher schien es interessant, diesen Ansatz auch auf andere Zytostatika zu übertragen, um

dabei die Reichweite und Grenzen der Anwendbarkeit zu bestimmen. Als für diesen Zweck

geeignete Zytostatika wurden die Wirkstoffe

Camptothecin, Bendamustin und Carboplatin aus-

gewählt:

Camptothecin (CPT) (Struktur s. Abb. 3.2)

ist ein pentacyclischer Naturstoff, der durch Inhi-

bition der Topoisomerase I die DNA-Synthese

hemmt. Aufgrund seiner schlechten Wasserlös-

lichkeit besitzen jedoch lediglich die halbsynthetischen Derivate Topotecan und Irinotecan

klinische Relevanz. Da CPT eine freie Hydroxygruppe aufweist, die sich zur Bindung an

Makromoleküle eignet, ließen sich bereits in der Vergangenheit erfolgreich makromolekulare

Formulierungen dieses Zytostatikums auf der Grundlage synthetischer Polymere entwickeln,

2120

1918

1716a 16

1514

1312

11

10

98

76

5

32N

N O

O

OHO

A B C D E

Abb. 3.2 20(S)-Camptothecin

103

von denen ein PEG-Konjugat (Prothecan®) gegenwärtig eine klinische Phase-II-Studie

durchläuft. Der Einbau eines Aminosäure-Spacers (insbesondere Glycin) zwischen CPT und

Polymer erwies sich dabei als besonders geeignet, da man zeigen konnte, daß die aus der

Verknüpfung mit Carboxyl-tragenden Polymeren resultierende Amidbindung die Funktion

einer Sollbruchstelle einnimmt und eine kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffs ermöglicht.

Bendamustin (Struktur s. Abb. 3.3) ist ein Stickstofflost-Alkylanz der 2. Generation,

dessen Wirksamkeit einerseits den alkylierenden Eigenschaften der Stickstofflostgruppe,

andererseits der Purin-antagonistischen Wirkung des Benzimidazolrings zugeschrieben wird.

Die freie Carboxylgruppe eignet sich zur Kondensation mit Alkoholen. Für die daraus

resultierenden Esterbindungen ist eine Funktion als Sollbruchstelle wahrscheinlich, da Ester-

Derivate des strukturell verwandten Chlorambucil (Struktur s. Abb. 3.3) eine Spaltbarkeit in

vivo aufwiesen. Bislang waren keine makromolekularen Prodrugs von Bendamustin bekannt.

Chlorambucil

Cl

N

Cl

COOH


N

Cl

Cl N

N

COOH

HCl

Abb. 3.3 Strukturen der Stickstofflost-Alkylanzien Bendamustin und Chlorambucil

Carboplatin (Struktur s. Abb. 3.4) nimmt aufgrund seiner anorganischen Natur eine

Sonderstellung unter den klinisch etablierten Zytostatika ein. Sein Wirkungsmechanismus

gleicht dem des Cisplatin (cis-[Pt(NH3)2Cl2]) und beruht auf

Quervernetzung von DNA-Basen. Da es über keine derivatisierbaren

funktionellen Gruppen verfügt, setzt die Anwendung von

Carboplatin als albuminbindendes Prodrug ein Derivatisierung des

Cyclobutanrings voraus. In der Vergangenheit synthetisierte albu-

minbindende Platin(II)-Komplexe, bei denen die Bindung an Platin

durch Maleinimid-tragende Ethylendiamin- bzw. Propylendiamin-Deri

besitzen gegenüber Platin(II)-Komplexen mit albuminbindenden Dica

Nachteil, daß bei erstgenannten Verbindungen eine Sollbruchstelle zwis

und albuminbindender Einheit eingeführt werden muß. Im Gegensatz

komplexen mit Dicarboxylatliganden die Sollbruchstelle bereits in den

Obgleich über makromolekulare Platinkomplexe mit Malonatligand

existierten bislang keine Beispiele für echte Carboplatin-Analoga, d.

PtH3N

H3N O

O

O

O

Abb. 3.4 Struktur von

Carboplatin

vate realisiert wurde,

rboxylatliganden den

chen platinbindender

dazu ist bei Platin-

Komplex integriert.

en berichtet wurde,

h. makromolekulare


Platinkomplexe, bei denen die Komplexierung durch Cyclobutan-1,1-dicarboxylatliganden

realisiert wird.

Bereits im Vorfeld war aufgrund der begrenzten kommerziellen Verfügbarkeit wasser-

löslicher heterobifunktioneller Crosslinker ersichtlich, daß ein Einsatz der oben beschriebenen

Zytostatika als albuminbindende Prodrugs die Entwicklung maßgeschneiderter Crosslinker

erfordert. Diese sollten einerseits eine Maleinimidgruppe zur Bindung an HSA, andererseits

geeignete Funktionalitäten zur Anbindung der verschiedenen Wirkstoff(derivate) tragen.

Zudem sollten sie ein wasserlösliches Rückgrat aufweisen, um für die intravenöse Appli-

kation der hydrophoben Zytostatika geeignete Formulierungen zu entwickeln. Derivate von

Oligo(ethylenglykolen) empfahlen sich für diesen Zweck, da sie sowohl in organischen als

auch in wäßrigen Medien eine hohe Löslichkeit aufweisen.

Die Zielsetzungen der vorliegenden Arbeit lagen in der Entwicklung wasserlöslicher albumin-

bindender Formulierungen der Zytostatika Camptothecin, Bendamustin und Carboplatin. Für

diesen Zweck sollten maßgeschneiderte heterobifunktionelle Crosslinker auf Oligo(ethylen-

glykol)-Basis synthetisiert werden, die eine Maleinimidgruppe zur Bindung an HSA sowie

eine geeignete Funktionalität zur Anbindung des Wirkstoffs aufweisen. Ferner sollten die

erhaltenen Prodrugs hinsichtlich ihrer Wasserlöslichkeit sowie ihrer albuminbindenden und

antitumoralen Eigenschaften untersucht werden.

In der vorliegenden Arbeit gelang die Synthese einer Palette neuartiger wasserlöslicher

Maleinimid-tragender Crosslinker ausgehend von Tri-, Tetra- und Hexaethylenglykol mit

Hilfe einer aus drei Hauptschritten bestehenden Synthesesequenz. Diese umfaßte die Einfüh-

rung einer geschützten Funktionalität durch unsymmetrische Alkylierung, die Einführung

einer Maleinimidgruppe durch Mitsunobu-Reaktion mit Maleinimid und die Abspaltung der

Schutzgruppe (s. Abb. 3.5). (Eine Ausnahme bildeten die Maleinimidoalkohole, die in einer

einstufigen Synthese aus den entsprechenden Oligo(ethylenglykolen) gewonnen wurden.)

105

HOO

OH

2,3,5

HOO

O RPG

2,3,5

NO

O RPG

O

O 2,3,5

NO

O R

O

O 2,3,5

1. Schritt

2. Schritt

3. Schritt

unsymmetrische Alkylierung

Mitsunobu-Reaktion

Abspaltung derSchutzgruppe

R = CHO, COOH, CH2COOH, CONHNH2 PG = Schutzgruppe

Abb. 3.5 Allgemeine Synthesestrategie zur Darstellung der heterobifunktionellen Crosslinker

Die durchgeführte Synthesestrategie erwies sich flexibel bezüglich einer Variation der

Endgruppen. So ließen sich Maleinimidoalkohole, ein Maleinimidoaldehyd, ein Maleinimido-

hydrazid und verschiedene Maleinimidocarbonsäuren synthetisieren, die sich zur Bindung an

Wirkstoffe mit freien Carboxyl-, Carboxylhydrazid-, Carbonyl-, Hydroxy- und Amino-

gruppen eignen. Die Charakterisierung dieser Verbindungen erfolgte mit Hilfe NMR-

spektroskopischer Methoden. Eine Zusammenstellung der im Rahmen dieser Arbeit darge-

stellten Verbindungen zeigt Abbildung 3.6.

NO

O

OR

n

Verbindung n R = Gesamtausbeute [%]

1 3 CH2OH 24

2 5 CH2OH 46

5 3 CHO 35

10 3 C(O)NHNHBoc 20

24 3 COOH 11

25 6 COOH 21

26 3 CH2COOH 42

27 4 CH2COOH 44

28 6 CH2COOH 20

Abb. 3.6 Im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelte heterobifunktionelle Crosslinker

Die Maleinimidoalkohole 1 und 2 sowie der Maleinimidoaldehyd 5 wurden im Hinblick auf

eine Umsetzung mit Bendamustin bzw. Bendamustin-Hydrazid synthetisiert, während die

Carbonsäuren 24–28 für die Derivatisierung von Camptothecin-20-O-glycinat und eines

Hydroxy-funktionalisierten Cyclobutan-1,1-dicarboxylatliganden vorgesehen waren. Einen

Beleg für die generelle Verwendbarkeit des Carboxylhydrazids 10 zur Synthese albumin-


bindender Wirkstoffderivate bildete das von Frey im Rahmen ihrer Diplomarbeit syntheti-

sierte Paclitaxel-Derivat mit einer Carboxylhydrazonbindung.

Ferner sollten der Maleinimidoaldehyd 5, das Maleinimidohydrazid 10 (nach Abspal-

tung der Schutzgruppe mit TFA) und die Maleinimidocarbonsäuren 24–28 (nach Aktivierung

mit z. B. einem wasserlöslichen Carbodiimid) auch für andere biochemische Anwendungen

(Kopplungsreaktionen im wäßrigen Medium) geeignet sein. Die im Rahmen dieser Arbeit

synthetisierten Verbindungen könnten somit das bisherige mangelhafte Angebot kommerziell

erhältlicher wasserlöslicher Crosslinker erweitern.

Nachdem erste Versuche einer direkten Veresterung der tertiären Hydroxygruppe von

Camptothecin mit Maleinimidocarbonsäuren an der Empfindlichkeit der Maleinimidgruppe

gescheitert waren, ließen sich albuminbindende CPT-Prodrugs durch Umsetzung der

Maleinimidocarbonsäuren 24–28 mit Camptothecin-20-O-glycinat-Trifluoracetat (30) in

Gegenwart des Mukaiyama-Reagenz' 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid in guten Ausbeuten

gewinnen (s. Abb. 3.7).

30

N

N O

O

OO

NH2

O

TFA

N

N O

O

OO

O

NH

O

O

N

O

O

n

N

N O

O

OO

O

NH

O

O

N

O

O

n

n

HOOCO

N

O

O

N+ClCH3

I-

1.5 eq

3 eq Et3N

CH2Cl2 / RT / 3h

24: n = 325: n = 6

26: n = 327: n = 428: n = 6

31: n = 3 (54 %)32: n = 6 (79 %)

33: n = 3 (66 %)34: n = 4 (80 %)35: n = 6 (89 %)

n

HOOC ON

O

O

Abb. 3.7 Synthese der CPT-Prodrugs 31–35

Die Verbindungen 31–35 unterscheiden sich zum einen in der Länge des Oligo(ethylen-

glykol)-Linkers, zum anderen sollte durch den Einbau einer zusätzlichen Methylengruppe in

α-Stellung zur Amidbindung bei 33–35 der Einfluß auf deren Spaltbarkeit untersucht werden.

Die Charakterisierung erfolgte durch 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektroskopie sowie mit Hilfe

der Massenspektrometrie, wobei sich die Strukturvorschläge bestätigten.

107

Da für eine Entwicklung als albuminbindende Prodrugs das Vorliegen einer für die intra-

venöse Applikation ausreichenden Wasserlöslichkeit von entscheidender Bedeutung ist,

wurden die Löslichkeiten von 33–35 und CPT in isotonischer Kochsalzlösung UV-spektro-

metrisch bestimmt. Die dabei ermittelten Werte ergaben, daß 33 zwar eine gegenüber

Camptothecin mehr als zehnfach gesteigerte molare Löslichkeit aufweist (33: 120 µmol/L,

CPT: 11 µmol/L), der angestrebte Wert von 2.87 mmol/L (entspricht einem CPT-Gehalt von

1 mg/mL) jedoch auch von der längerkettigen Verbindung 35 nicht erreicht wurde (35:

297 µmol/L). Eine Auftragung der molaren Löslichkeiten gegen die Anzahl der Ethylen-

glykol-Einheiten und damit der solubilisierenden Sauerstoffatome des Oligo(ethylenglykol)-

Linkers zeigte einen linearen Zusammenhang im Bereich zwischen 3 und 6 Sauerstoffatomen.

Daraus läßt sich schließen, daß zum Erreichen der angestrebten Wasserlöslichkeit eine we-

sentlich höhere Anzahl an Ethylenglykol-Einheiten notwendig gewesen wäre. Jedoch ließen

sich durch 40 %igen Zusatz von PEG600, das als Löslichkeitsvermittler zur intravenösen

Applikation wasserunlöslicher Arzneistoffe Verwendung findet, bis zu 2 mg/mL (entspricht

0.85 mg/mL CPT) lösen.

Zur Untersuchung der albuminbindenden Eigenschaften der CPT-Prodrugs wurden

HPLC-Kopplungsstudien durchgeführt. Anhand dieser Experimente, bei denen humanes

Plasma mit den CPT-Derivaten 32, 33 und 35 bei 37 °C inkubiert und anschließend

chromatographisch in seine Komponenten aufgetrennt wurde, konnte gezeigt werden, daß

unabhängig von der Kettenlänge des Linkers bereits nach 1 min Inkubationszeit eine nahezu

quantitative Bindung an HSA stattfindet. Eine physikalische Wechselwirkung mit dem

Protein konnte hierbei ausgeschlossen werden, da eine nicht-Maleinimid-tragende Modell-

verbindung (40), die sich von 33 lediglich durch Austausch der Maleinimidgruppe gegen eine

Hydroxygruppe unterscheidet, in einem analogen Experiment keine Bindung an Albumin

aufwies. Zusätzlich konnte anhand eines Versuchs, bei dem SH-inaktiviertes Plasma (durch

Blockierung aller Thiolgruppen mit einem Überschuß an ε-Maleinimidocapronsäure) einge-

setzt wurde, gezeigt werden, daß unter diesen Bedingungen 35 auch nach 5minütiger Ink-

ubation nicht an HSA bindet.

Die Plasmastabilitäten der Albumin-Konjugate der beiden wasserlöslichsten Verbindun-

gen (32 und 35) wurde durch HPLC bei 37 °C bestimmt. Dabei wurden folgende Halbwerts-

zeiten ermittelt:

32: t1/2 = 9 h

35: t1/2 = 15 h


Damit liegen die Stabilitäten der hierbei untersuchten makromolekularen Prodrugs deutlich

über der des analogen PEG-Konjugats (PEG-Gly-CPT, Halbwertszeit 4 h), das über eine

identische Sollbruchstelle verfügt. Dieses Phänomen läßt sich durch den stabilisierenden

Einfluß der Proteinumgebung erklären, während der beobachtete Unterschied zwischen den

Plasmastabilitäten der Albumin-Konjugate von 32 und 35 zeigt, daß der elektronenziehende

Effekt der Alkoxygruppe in α-Stellung zur Amidbindung bei 32 nicht zu vernachlässigen ist.

In Nacktmaus-Tierversuchstudien an einem HT-29-Kolorektal-Xenograft zeigten die

Prodrugs 32 und 35 trotz der unterschiedlichen Plasmastabilitäten vergleichbar gute Wirk-

samkeiten, während sich CPT hierbei als unwirksam erwies. So konnte bereits bei äqui-

molarer Dosierung (bzgl. CPT) von 32 und 35 eine moderate Aktivität verzeichnet werden

(T/C maximal: 71 % (32) bzw. 83 % (35)). Indes ließ sich bei Verabreichung der doppelten

Dosis eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums beobachten (T/C maximal: 57 %

(32) bzw. 47 % (35)). Die Prodrugs zeigten dabei nur eine geringe Toxizität (Anämie bei

hoher Dosierung) und erwiesen sich somit als gut verträglich, was auch durch das Ausbleiben

toxizitätsbedingter Todesfälle unterstrichen wird. Da die maximal tolerable Dosis (MTD) der

Prodrugs in diesem Experiment nicht erreicht wurde, kann deren therapeutisches Potential nur

durch zusätzliche in-vivo-Studien unter Einsatz höherer Dosierungen abgeschätzt werden.

Zur Synthese albuminbindender Formulierungen von Bendamustin wurde Bendamustin-

Hydrochlorid mit den Maleinimidoalkoholen 1 und 2 verestert. Die aus der Umsetzung

gewonnenen albuminbindenden Prodrugs 41 und 42 (s. Abb. 3.8) ließen sich die durch NMR-

spektroskopische Methoden sowie durch Massenspektrometrie charakterisieren.

N

NCH3

N

Cl

Cl OO

N

O

O

On

N

NCH3

N

Cl

ClCOOH

HCl

Methode A: 1, DIPC, Et3N, CH2Cl2

Methode B: 2, BOP, Et3N, CH2Cl2

Bendamustin-Hydrochlorid 41: n = 3 (42 %, Methode A)42: n = 5 (74 %, Methode B)

Abb. 3.8 Synthese albuminbindender Bendamustin-Prodrugs mit Ester-Sollbruchstelle

Eine UV-spektrometrische Bestimmung der Wasserlöslichkeit ergab Werte, welche zwar

deutlich höher als die der Camptothecin-Prodrugs vergleichbarer Kettenlänge lagen (s. o.), für

eine intravenöse Applikation jedoch nicht ausreichten. Im sauren Milieu (pH 3.5) ließ sich

jedoch die Löslichkeit der längerkettigen Verbindung (42) durch Bildung des Hydrochlorids

steigern, so daß der zur Durchführung der Tierversuche (s. u.) geforderte Wert (1.85 mg/mL)

erreicht wurde.

109

Durch HPLC-Untersuchungen ließ sich ein qualitativer Nachweis für die albuminbindenden

Eigenschaften von 41 und 42 erbringen. Dazu wurde humanes Blutplasma 30–60 s mit den

Prodrugs inkubiert und anschließend auf der Chromatographiesäule in seine Proteinkompo-

nenten aufgetrennt. Durch simultane Messung der UV-Absorption bei λ = 280 nm sowie des

Fluoreszenz-Signals bei 400 nm konnte gezeigt werden, daß 41 und 42 an HSA, jedoch nur in

vernachlässigbarer Weise an andere Plasmaproteine binden.

Neben den beiden Prodrugs mit Ester-Sollbruchstelle (41 und 42) wurde zusätzlich ein

Derivat mit säurelabiler Carboxylhydrazonbindung hergestellt. Dazu wurde Bendamustin-

Hydrochlorid mittels einer zweistufigen Synthese in das entsprechende Carboxylhydrazid

(44) überführt, das anschließend mit dem Maleinimidoaldehyd 5 zum proteinbindenden

Prodrug 45 (s. Abb. 3.9) umgesetzt wurde.

N

NCH3

N

Cl

ClCOOH

HCl


N

NCH3

N

Cl

Cl

O

HN

NHBoc

N

NCH3

N

Cl

ClHN

N

O

OO

N

O

O

2

N

NCH3

N

Cl

Cl

O

HN

NH3+

CF3COO-

TFA / CH2Cl2

BocNHNH2, Et3N, DMAP, DIPC

CH2Cl2 / 0 °C

43 (70 %)

4445 (11 %)

5, Molekularsieb 0.4 nm

THF

Abb. 3.9 Synthese eines Bendamustin-Prodrugs mit einer Carboxylhydrazonbindung

Die Charakterisierung erfolgte durch NMR-spektroskopische Methoden sowie durch Massen-

spektrometrie. Eine Untersuchung von 45 hinsichtlich seiner antitumoralen Eigenschaften ließ

sich jedoch aufgrund der schlechten Wasserlöslichkeit dieser Verbindung, welche ähnlich

niedrig wie die des analogen Esters lag, nicht realisieren. Da im Gegensatz zu 42 eine

Überführung in das Hydrochlorid aufgrund der Säurelabilität der Carboxylhydrazonbindung

nicht möglich war, wurde auf eine Synthese des homologen Hexaethylenglykol-Derivats

verzichtet. Der Zugang zu säurelabilen albuminbindenden Bendamustin-Prodrugs scheint

daher nur unter Verwendung anderer Linker-Systeme realisierbar.

Da bislang keine makromolekularen Formulierungen von Bendamustin bekannt waren,

schien die Synthese eines Poly(ethylenglykol)-Konjugats durch eine einfache Veresterung

von Bendamustin mit PEG interessant, da ein solches Konjugat über die gleiche Sollbruch-

stelle wie 41 und 42 verfügt und daher in Tierversuchsstudien zu Vergleichszwecken


herangezogen werden kann. So ließ sich durch Umsetzung von Bendamustin-Hydrochlorid

mit PEG der molaren Masse 35 kDa das entsprechende Polymer-Konjugat (46) (s. Abb. 3.10)

synthetisieren. Die Charakterisierung des Konjugats erfolgte durch GPC-Messungen an

Sephadex® LH20, wobei eine Verunreinigung mit niedermolekularen Bendamustin-Derivaten

ausgeschlossen werden konnte. Mit Hilfe UV-spektroskopischer Messungen ließ sich der

Beladungsfaktor zu 1.37 bestimmen (theoretisch 2), was sich als ausreichend zur

Durchführung erster Tierversuchsstudien erwies.


N

NCH3

N

Cl

ClCOOH

HClPEG35k, Et3N, DIPC, DMAP

CH2Cl26

n

N

NCH3

N

Cl

Cl

O

OOH

HO

OHn

+

(43 %) (10 %)

N

NH3C

N

Cl

Cl

O

N

NCH3

N

Cl

Cl

O

OO

n

46 (47 %)

Abb. 3.10 Bendamustin-PEG35k-Konjugat

Die antitumoralen Eigenschaften des längerkettigen albuminbindenden Prodrugs 42 und des

PEG-Konjugats 46 wurden in einem LXFS-650- und einem MAXF-401-Xenograft-Modell an

Nacktmäusen bestimmt (Lungenkarzinom bzw. Mammakarzinom). Bendamustin-Hydro-

chlorid diente in beiden Versuchen als Vergleichssubstanz. Die Applikation erfolgte

intravenös in Dosen von 20 mg/kg und 40 mg/kg (Bendamustin, 46) sowie 10 mg/kg und

20 mg/kg (42), nachdem 42 in einer zuvor durchgeführten Toxizitätsstudie stärkere, vor allem

lokale Nebenwirkungen gezeigt hatte.

In den Tierversuchsstudien erwies sich das albuminbindende Prodrug 42 als inaktiv bis

mäßig wirksam. Auffallend waren jedoch die starken Nebenwirkungen, die unmittelbar nach

der Injektion mit 42 auftraten (Aufquellen der Schwänze, Nekrose) und vermutlich für die

hohe Sterblichkeit der behandelten Tiere verantwortlich war.

Bendamustin und das PEG-Konjugat 46 zeigten hingegen eine vielfach höhere Aktivität

und erwiesen sich in den betrachteten Tiermodellen als nahezu gleichwertig hinsichtlich ihrer

Wirksamkeit. Während in dem LXFS-650-Modell eine Tumorstasis erreicht wurde, waren im

MAXF-401-Modell Totalremissionen der eingepflanzten Tumore bei allen überlebenden

Versuchstieren zu verzeichnen. Beide Verbindungen zeigten zudem ein ähnliches Toxizitäts-

profil, wobei die Mortalität im Falle des PEG-Konjugats geringer war.

111

Da das PEG-Konjugat 46 und das albuminbindende Prodrug 42 über identische Sollbruch-

stellen verfügen, überrascht die beobachtete Diskrepanz in ihrer Wirksamkeit und ihrem

Toxizitätsprofil. Ob dieser Unterschied aus den verwendeten Trägersystemen resultiert, konn-

te im Rahmen der vorliegenden Arbeit jedoch nicht geklärt werden.

Frühere Versuche, albuminbindende Platinkomplexe mit Malonatliganden zu synthetisieren

scheiterten an der Empfindlichkeit aromatischer Maleinimide. Daher wurde in der vorliegen-

den Arbeit der Versuch unternommen, einen Hydroxy-funktionalisierten Cyclobutan-1,1-di-

carboxylatliganden zu synthetisieren, welcher sich zur Veresterung mit Maleinimido-

carbonsäuren eignet. Durch anschließende Umsetzung mit Diamin-Platin(II)-Komplexen

sollten albuminbindende Carboplatin-Analoga dargestellt werden.

Et3N, CH2Cl2

50: R = PMB (92 %)


48: R = TBS (26 %)

49: R = H (88 %)TBAF

KH, Dioxan

TBSCl, Imidazol

DMF

4

OR

RO

O

O

ON

O

O

O

O

N O OH

O

O

O4

PMBO OPMB

O O

PMBO OPMB

O O

OR

Br Br

OTBS

Br Br

OH

I-N+

CH3

Cl

N OH

O

O

O

OR

RO

O

O

ON

O

O

O

47 (100%)

52: R = PMB (74 %)


27

Abb. 3.11 Synthese albuminbindender Cyclobutan-1,1-dicarboxylatliganden

Die Synthese der komplexierenden Einheit erfolgte durch zweifache Alkylierung des 4-

Methoxybenzyldiesters von Malonsäure (PMB-Malonat) mit TBS-geschütztem 1,3-Dibrom-

propanol. Nach Abspaltung der Silyl-Schutzgruppe wurde mit 49 eine geschützte Hydroxy-

funktionalisierte Cyclobutan-1,1-dicarbonsäure erhalten (s. Abb. 3.11), die als universell

einsetzbarer Baustein für Carboplatin-Derivate angesehen werden kann.


Durch Veresterung mit der unpolaren käuflichen EMC (ε-Maleinimidocapronsäure) bzw. der

wasserlöslichen Maleinimidocarbonsäure 27 (Tetraethylenglykol-Derivat), und anschließen-

der Abspaltung der PMB-Schutzgruppen ließen sich mit 52 und 53 zwei erste thiolbindende

Cyclobutan-1,1-dicarboxylatliganden synthetisieren. Die abschließende Komplexbildung er-

folgte mit [Pt trans-DACH](NO3)2 (DACH: 1,2-Diaminocyclohexan) nach einer literatur-

beschriebenen Variante. Die daraus resultierenden Platinkomplexe 54 und 55 ließen sich in

Ausbeuten von 19 % bzw. 67 % gewinnen (s. Abb. 3.12).

54

4

NH2

Pt

H2N

ON

O

O

O

OO

O

O

ONH2

Pt

H2N

ON

O

O

OO

O

O

O

55

Abb. 3.12 Albuminbindende Carboplatin-Analoga

Erwartungsgemäß zeigte das EMC-Derivat 55 eine niedrige Wasserlöslichkeit (<1 mg/mL),

während sich das Tetraethylenglykol-Derivat 54 als sehr wasserlöslich erwies (>>100

mg/mL). Aufgrund des Löslichkeitsverhaltens von 54 ließ sich die Produktisolierung nicht

durch eine einfache Fällung realisieren, sondern mußte durch präparative RP-HPLC erfolgen.

Die Charakterisierung der Platinkomplexe erfolgte durch 1H- und 13C-NMR-spektros-

kopische Methoden, Massenspektrometrie und Elementaranalysen (im Falle von 54 zusätzlich

durch 195Pt-NMR- sowie IR-Spektroskopie). Dabei bestätigte sich die angenommene Struktur.

Zur Bestimmung der in-vitro-Aktivität von 54 wurde ein Zellkulturversuch an einer

LXFL-529-Zellinie (Lungenkarzinom) durchgeführt. Darin wies 54 eine hohe Zytotoxizität

auf, die über der von Carboplatin lag (54: IC50 = 14 µM, Carboplatin: IC50 = 50 µM). Mit 54

liegt daher ein vielversprechender Kandidat für eine weiterführende Entwicklung als albumin-

bindendes Prodrug vor.

In der vorliegenden Arbeit gelang die Synthese albuminbindender Prodrugs auf der Basis von

drei verschiedenen Zytostatika unter Verwendung maßgeschneiderter Crosslinker mit einem

Oligo(ethylenglykol)-Rückgrat. Dabei stellte sich das Vorliegen einer für die intravenöse

Applikation ausreichenden Wasserlöslichkeit als entscheidendes Kriterium für die präkli-

nische Entwicklung heraus und damit als limitierender Faktor für die Anwendungsbreite der

benutzten Crosslinker-Systeme. Während die erhaltenen Derivate des sehr schwerlöslichen

Camptothecins ein unbefriedigendes Löslichkeitsverhalten aufwiesen, das sich nur durch

Zusatz von Löslichkeitsvermittlern auf ein akzeptables Maß erhöhen ließ, zeigte das

113

Carboplatin-Derivat (54) eine sehr hohe Löslichkeit. Daneben wiesen die erhaltenen Benda-

mustin-Derivate Löslichkeiten auf, welche zwischen diesen beiden Extremen liegen.

Man kann aus diesem Vergleich schließen, daß die Einsatzmöglichkeit von Crosslinkern

mit einem Oligo(ethylenglykol)-Rückgrat auf solche Zytostatika beschränkt bleibt, welche

bereits eine moderate Wasserlöslichkeit besitzen. Im Falle des Platinkomplexes 54 erwies sich

die verfolgte Strategie als erfolgreich, da das aliphatische Pendant 55, welches durch Einsatz

der käuflichen EMC erhalten wurde, eine nur unzureichende Löslichkeit zeigte und sich damit

nicht für eine weitere Entwicklung eignete. Für albuminbindende Formulierungen schwer-

löslicher Wirkstoffe wie Camptothecin ist jedoch eine Verwendung anderer Linker-Systeme

zweckmäßig, gilt es doch, einen Einsatz von Löslichkeitsvermittlern, welche häufig unvorhe-

rsagbare Toxizitäten aufweisen, weitestgehend zu vermeiden.

Abschließend läßt sich anhand der erhaltenen Ergebnissen der vorliegenden Arbeit

feststellen, daß eine Übertragung des doppelten Prodrug-Konzeptes von Doxorubicin auf

andere Zytostatika generell erfolgversprechend ist. Im Falle der CPT- und Bendamustin-

Prodrugs konnte eine schnelle und selektive Bindung an Humanserumalbumin nachgewiesen

werden. Zudem verfügen die Camptothecin-Prodrugs 32 und 35 sowie das Platin-Prodrug 54

über eine vielversprechende Wirksamkeit in biologischen Modellen und eignen sich daher für

eine weiterführende präklinische Entwicklung.

114 Experimentelles

4 Experimentelles

4.1 Materialien und Methoden

4.1.1 Verwendete Reagenzien

Die eingesetzten Chemikalien und Lösungsmittel wurden von den Firmen Merck (Darmstadt),

Sigma-Aldrich und Fluka (Seelze) in handelsüblicher Qualität bezogen. Eine Aufreinigung

der Lösungsmittel war in der Regel nicht erforderlich, lediglich das verwendete Dichlor-

methan wurde über Calciumhydrid getrocknet und frisch destilliert.

Camptothecin wurde von der Firma Hande Tech Development (USA) bezogen,

Bendamustin-Hydrochlorid wurde von der Firma ribosepharm (München) zur Verfügung

gestellt. Kaliumtetrachloroplatinat war eine Spende der Degussa AG (Frankfurt a. M.).

Anisaldehyd-Entwicklerlösung zum Anfärben von DC-Platten

800 mL Ethanol, 22 mL Anisaldehyd, 14.4 mL konzentrierte Schwefelsäure

Zum Anfärben wurden die DC-Platten kurz in die Lösung eingetaucht und anschließend im

heißen Luftstrom entwickelt.

4.1.2 Verwendete Geräte und Materialien

Elementaranalysen

Die Elementaranalysen wurden mit einem Perkin-Elmer Elemental Analyzer 240 am Institut

für Makromolekulare Chemie der Universität Freiburg durchgeführt.

Massenspektrometrie

Finnigan MAT 312 Massenspektrometer mit Datensystem Finnigan MAT SS 200

Die Messungen wurden in der Abteilung für Massenspektrometrie des Instituts für Orga-

nische Chemie und Biochemie der Universität Freiburg durchgeführt.

Kernresonanzspektroskopie 1H-NMR Bruker ARX 300 300 MHz 13C-NMR Bruker ARX 300 75.4 MHz 195Pt-NMR Varian 64.4 MHz

Materialien und Methoden 115

Als Lösungsmittel für die Kernresonanzspektroskopie wurden deuteriertes Chloroform

(CDCl3), deuteriertes Dimethylsulfoxid (DMSO-d6), deuteriertes Methanol (CD3OD) und

deuteriertes Wasser (D2O) verwendet. Als interner Standard diente Tetramethylsilan (TMS,

δ ≡ 0.00 ppm) bzw. Aceton bei den in D2O gemessenen 1H- und 13C-NMR-Spektren. 195Pt-

NMR-Spektren wurden auf K2PtCl4 als Standard geeicht. Alle Messungen wurden bei

Raumtemperatur durchgeführt. Die Lage der Signale bzw. der Signalschwerpunkte ist in der

δ-Skala angegeben. 13C-NMR-Spektren wurden mit Protonenbreitbandentkopplung aufge-

nommen. 1H-NMR und 13C-NMR-Spektren wurden am Institut für Makromolekulare Chemie

der Universität Freiburg aufgenommen und anschließend mit Hilfe des Programms WIN-

NMR (Version 6.0) der Firma Bruker ausgewertet. Die Aufnahme der 195Pt-NMR-Spektren

erfolgte am Institut für Pharmazie der Universität Freiburg.

UV/VIS-Spektroskopie

Zweistrahl-Spektrophotometer U-2000 der Firma Hitachi

IR-Spektroskopie

Die Aufnahme des IR-Spektrums von 54 erfolgte als KBr-Preßling an einem Vector-22-FTIR-

Spektrometer von Bruker am Institut für Makromolekulare Chemie der Universität Freiburg.

pH-Messungen

pH-Meter 765 Calimatic der Firma Knick

4.1.3 Chromatographie

Dünnschichtchromatographie

Der Verlauf der durchgeführten Reaktionen wurde mittels Dünnschichtchromatographie

verfolgt:

Kieselgel-Fertigplatten mit Kieselgel 60 F254 (Schichtdicke 0.25 mm) auf Aluminiumfolie der

Firma Merck (Darmstadt)

Die Detektion der einzelnen Fraktionen auf den DC-Platten erfolgte durch Fluoreszenz-

löschung mit UV-Licht (λ = 254 nm), durch Fluoreszenz bei λ = 360 nm (CPT-, Benda-

mustin-Derivate) oder durch Anfärben mit Anisaldehyd-Entwicklerreagenz.

116 Experimentelles

Säulenchromatographie

Säulenchromatographische Trennungen wurden, sofern nicht anders gekennzeichnet, an

Kieselgel 60 der Firma Merck (Darmstadt) mit einer Korngröße von 0.040–0.063 mm

durchgeführt. Zur Reinigung des Bendamustin-Hydrazons 45 wurde Kieselgel 60 der

Korngröße 0.063–0.100 mm verwendet. Verwendete Lösungsmittelgemische sind bei den

entsprechenden Vorschriften angegeben.

HPLC

HPLC wurde an drei verschiedenen Anlagen betrieben:

Anlage 1

HPLC-Pumpe: Waters 590, Detektor: LKB Bromma 2151, Schreiber/Integrator:

Merck/Hitachi D-2500 Chromato-Integrator

Anlage 2

HPLC-Anlage: BioLogic DuoFlow 1082 mit Software-gesteuerter Gradientenelution und

internem UV-Detektor, externer UV-Detektor: Bischoff Lambda 1010

Anlage 3

HPLC-Pumpe: Waters 616, Detektor: Waters 996

4.1.4 HPLC-Methode zur Optimierung der Mitsunobu-Reaktion

Zur Optimierung der Mitsunobu-Reaktion wurden Probeansätze mit jeweils 50 mg

Maleinimid und entsprechenden Mengen von 17 als repräsentativem Alkohol, Triphenyl-

phosphin und Diethylazodicarboxylat in einem Lösungsmittelvolumen von 3 mL (THF)

durchgeführt. Die Bestimmung des Gehalts an Produkt (22) erfolgte durch HPLC-Analytik:

Anlage 1

Chromatographiesäule: Nucleosil® C18 100-5 250x4 mm von Macherey-Nagel (Düren)

Laufmittel: MeOH/Wasser 60:40

Fluß: 1 mL/min

Detektion: λ = 297 nm

Die Bestimmung der Endkonzentration von 22 erfolgte durch vorherige Aufnahme der

Eichgerade einer Verdünnungsreihe von 22 im Laufmittel.


4.1.5 HPLC-Untersuchung der albuminbindenden Eigenschaften der Camptothecin-

Prodrugs

Zur Untersuchung der albuminbindenden Eigenschaften wurden Stammlösungen der Campto-

thecin-Derivate in Methanol (2 mM) in das 20fache Volumen humanen Blutplasmas gegeben

und 1 min lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die so vorbereiteten Proben ohne

Verzögerung auf die HPLC-Säule aufgetragen. HPLC-Methode:

Anlage 2 oder 3

Chromatographiesäule: Symmetry® C18 300-5 250x4.6 mm von Waters

Laufmittel A: 30 % 200 mM K2HPO4 pH 7, 70 % Acetonitril

Laufmittel B: 72.5 % 200 mM K2HPO4 pH 7, 28.5 % Acetonitril

Gradient: 26 min Laufmittel B isokrat., 15 min 0–100 % Laufmittel A linear

Fluß: 1.2–1.8 mL/min

Detektion bei 254 nm und 370 nm

4.1.6 HPLC-Bestimmung der Plasmastabilität der Camptothecin-Albumin-Konjugate

Die Untersuchung der Plasmastabilitäten der Albumin-Konjugate von 32 und 35 erfolgte mit

Hilfe der in 4.1.5 beschriebenen HPLC-Methode. Dabei wurden die Konjugate durch ein-

minütige Inkubation der Prodrugs mit Blutplasma generiert, auf die HPLC-Säule aufgetragen

und aus den erhaltenen Peakflächen die Anfangskonzentrationen bestimmt. Nach 4, 20, 28

und 48 Stunden erfolgten weitere Messungen der bei 37 °C gelagerten Proben. Aus der

Abnahme der Peakflächen ließen sich anschließend die Halbwertszeiten der Albumin-Kon-

jugate von 32 und 35 berechnen.

4.1.7 HPLC-Untersuchung der albuminbindenden Eigenschaften der Bendamustin-

Prodrugs

Zur Untersuchung der albuminbindenden Eigenschaften wurden Stammlösungen der Benda-

mustin-Derivate in DMF (2 mM (41) bzw. 4 mM (Bendamustin, 42)) in das 20fache Volumen

humanen Blutplasmas gegeben und 30 s bzw. 1 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend

wurden die so vorbereiteten Proben 10 min zentrifugiert, der Überstand 20fach mit Wasser

verdünnt und auf die HPLC-Säule aufgetragen. HPLC-Methode:

118 Experimentelles

Anlage 2

Chromatographiesäule: POROS®-20-PI-Anionenaustauschersäule 100x4.6 mm

Laufmittel A: 0.01 M Trispuffer pH 8.0

Laufmittel B: 0.01 M Trispuffer pH 8.0 + 0.14 M NaCl

Gradient: 1.5 min Laufmittel A isokrat., 6 min 0–100 % Laufmittel B linear, 11 min

0–100 % Laufmittel A linear, 7.5 min Laufmittel A isokrat.

Fluß: 4.0 mL/min

Detektion bei 254 nm und Fluoreszenz (EX. 330 nm, EM. 400 nm)

4.1.8 UV-spektrometrische Bestimmung der Wasserlöslichkeit der Camptothecin- und

Bendamustin-Prodrugs

Zur Bestimmung der Wasserlöslichkeit wurde zunächst eine Eichgerade einer Verdünnungs-

reihe der jeweils wasserlöslichsten Verbindungen (35 und 42) in isotonischer Kochsalzlösung

durch Messung der UV-Absorptionen bei λ = 370 nm (CPT-Derivat) und λ = 330 nm

(Bendamustin-Derivat) aufgenommen. Anschließend wurden die zu messenden Substanzen in

isotonischer Kochsalzlösung aufgeschlämmt und 10 Minuten im Ultraschallbad bei

Raumtemperatur behandelt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert und die Absorptionen

der Überstände bei den entsprechenden Wellenlängen UV-spektrometrisch gemessen. Anhand

der Eichgeraden ließen sich daraus die Konzentrationen der Prodrugs in den gesättigten

Lösungen berechnen.

4.1.9 UV-spektrometrische Bestimmung des Beladungsfaktors des Bendamustin-PEG-

Konjugats

Zur Bestimmung des Beladungsfaktors von des PEG-Konjugats 46 wurde zunächst eine

Eichgerade einer Verdünnungsreihe von Bendamustin-Hydrochlorid in Methanol durch Mes-

sung der UV-Absorption bei λ = 330 nm aufgenommen. Anschließend wurde eine definierte

Einwaage des PEG-Konjugats 46 in einem definierten Volumen Methanol gelöst und die UV-

Absorption bei 330 nm bestimmt. Anhand der Eichgeraden ließ sich die Konzentration an

PEG-gebundenem Bendamustin und daraus der Beladungsfaktor ermitteln.


4.1.10 BrdU-Assay (Zellkulturversuch Platin-Prodrug)

Der BrdU-Assay ist eine Methode zur Bestimmung der Zellvermehrung. Das Prinzip basiert

auf dem Einbau von BrdU (5-Brom-2'-desoxyuridin), einem Nucleotidbasen-Analogon, in die

DNA der noch lebenden Zellen. Die Inkorporation läßt sich anschließend immunozyto-

chemisch mit Hilfe eines spezifischen, Peroxidase-markierten Antikörpers gegen BrdU (Anti-

BrdU-POD) unter Anwendung der ELISA-Technik (engl. enzyme-linked immunosorbant

assay) nachweisen.

Zur Bestimmung der zytotoxischen Aktivität von 54 wurden jeweils 3000 Zellen einer

LXFL-529-Zellinie pro Vertiefung einer 96-Loch-Zellkulturplatte ausgesät und nach Zugabe

von Zellkulturmedium mit 10 % fetalem Kälberserum 24 h gelagert. Anschließend wurde

48 h mit den Testsubstanzen inkubiert (54 und Carboplatin jeweils in Konzentrationen von

0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 150, 300 µM). Die Ermittlung der Anzahl, der nach dieser Zeit noch

lebenden Zellen erfolgte anhand des BrdU-Assays unter Verwendung des BrdU-Kit der Firma

Roche. Dazu wurden 10 µL BrdU-Reagenz pro Vertiefung der Zellkulturplatte zugegeben und

diese für weitere 24 h gelagert. Anschließend wurde das Medium durch vorsichtiges

Dekantieren vollständig entfernt. Die Zellen wurden durch Zugabe von 100 µL FixDenat®-

Lösung fixiert, wobei gleichzeitig die DNA denaturiert wurde. Nach 30 min wurde die

Lösung durch Dekantieren entfernt und die fixierten Zellen mit jeweils 100 µL Anti-BrdU-

POD-Lösung 90 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Durch vorsichtiges Abgießen wurde

die Antikörperlösung von der Platte entfernt und die Zellen mit jeweils 200 µL PBS pro

Vertiefung dreimal gewaschen. Anschließend wurden jeweils 80 µL Tetramethylbenzidin-

Lösung pro Vertiefung der Zellkulturplatte zugegeben und 15 min lang inkubiert. Die UV-

VIS-Absorption der Proben wurde bei 405 nm gegen eine Referenzwellenlänge von 490 nm

gemessen. Die Auswertung erfolgte mit einem ELISA-Reader der Firma Dynatech

Laboratories Inc. (Sullyfield, UK).

4.1.11 In-vivo-Studien an einem HT-29-Xenograft-Modell (CPT-Prodrugs)

Weiblichen Nacktmäusen wurden jeweils ca. 107 Zellen HT-29-Tumorgewebe subkutan

implantiert. Nach dem Anwachsen sichtbarer Tumore (nach 13 Tagen) wurde mit der Behand-

lung begonnen. Die durchschnittlichen Tumorvolumina betrugen zu diesem Zeitpunkt 90–130

mm2. Zur Behandlung wurden sechs Gruppen aus jeweils acht zufällig ausgewählten Tieren

gebildet und dabei das folgende Dosierungsschema angewendet:

120 Experimentelles

Gruppe Substanz Dosis

[mg/kg]

1 Kontrolle – 2 Camptothecin 12.5 3 32 12.5 4 32 25 5 35 12.5 6 35 25

Die Applikation der Wirkstoffe erfolgte an vier Tagen (Tag 13, 17, 21, 25) intravenös in die

Schwanzvene. Dazu wurden die Wirkstoffe als Mikrosuspension in isoton. Kochsalz-

lösung/Tween 80 9:1 verabreicht.

4.1.12 In-vivo-Studien an einem LXFS-650-Xenograft-Modell (Bendamustin-Prodrugs)

8–10 Wochen alten männlichen Nacktmäusen wurden jeweils ca. 20 mg LXFS-650-Tumor-

gewebe subkutan in beide Flanken implantiert. Nach dem Anwachsen sichtbarer Tumore

(nach 23 Tagen) wurde mit der Behandlung begonnen. Die durchschnittlichen Tumor-

volumina betrugen zu diesem Zeitpunkt 49–65 mm2. Zur Behandlung wurden sieben Gruppen

aus jeweils sechs zufällig ausgewählten Tieren gebildet und dabei das folgende Dosierungs-

schema angewendet:

Gruppe Substanz Dosis

[mg/kg]

1 Kontrolle – 2 Bendamustin 40 3 Bendamustin 20 4 46 40 5 46 20 6 42 20 7 42 10

Die Applikation der Wirkstoffe erfolgte einmalig (Tag 23) intravenös in die Schwanzvene.

Bendamustin und das PEG-Konjugat 46 wurden in isotonischer Kochsalzlösung mit Zusatz

von 0.004 mol/L NaH2PO4, das albuminbindende Prodrug 42 wurde in salzsaurer isotonischer


Kochsalzlösung (pH 3.5) verabreicht. Die Gabe der jeweils höheren Dosierungen von

Bendamustin und 46 erfolgte in Form zweier Injektionen im Abstand von zwei Stunden.

4.1.13 In-vivo-Studien an einem MAXF-401-Xenograft-Modell (Bendamustin-Prodrugs)

8–10 Wochen alten weiblichen Nacktmäusen wurden jeweils ca. 20 mg MAXF-401-

Tumorgewebe subkutan in beide Flanken implantiert. Nach dem Anwachsen sichtbarer Tu-

more (nach 18 Tagen) wurde mit der Behandlung begonnen. Die durchschnittlichen Tumor-

volumina betrugen zu diesem Zeitpunkt 134–169 mm2. Zur Behandlung wurden sieben

Gruppen aus jeweils sechs zufällig ausgewählten Tieren gebildet und dabei das in 4.1.12

beschriebene Dosierungsschema angewendet. Die Applikation der Wirkstoffe erfolgte einma-

lig (Tag 18) intravenös in die Schwanzvene. Bendamustin und das PEG-Konjugat 46 wurden

in isotonischer Kochsalzlösung mit Zusatz von 0.004 mol/L NaH2PO4, das albuminbindende

Prodrug 42 wurde in salzsaurer isotonischer Kochsalzlösung (pH 3.5) verabreicht. Die Gabe

der jeweils höheren Dosierungen von Bendamustin und 46 erfolgte in Form zweier

Injektionen im Abstand von zwei Stunden.

122 Experimentelles

4.2 Organisch-chemische Synthesen

4.2.1 Heterobifunktionelle Crosslinker auf Oligo(ethylenglykol)-Basis

Allgemeine Vorschrift zur Synthese der Maleinimidoalkohole 1 und 2

In einem Dreihalskolben mit Innenthermometer und Tropftrichter wird Triphenylphosphin (4.11 g, 15.7 mmol)

in 100 mL wasserfreiem THF unter Inertgasatmosphäre gelöst und auf –78 °C gekühlt. Diisopropylazodi-

carboxylat (3.33 g, 15.7 mmol) wird innerhalb von fünf Minuten zugetropft und die entstandene hellgelbe

Lösung für weitere fünf Minuten gerührt. Anschließend läßt man eine Lösung des Oligo(ethylenglykols)

(31.4 mmol) in 20 mL THF innerhalb von fünf Minuten zutropfen. Nach weiteren fünf Minuten wird Maleinimid

(1.52 g, 15.7 mmol) als pulverisierter Feststoff zugegeben und noch fünf Minuten bei –78 °C gerührt.

Anschließend entfernt man das Kältebad und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Das Lösungsmittel wird im

Vakuum entfernt und der ölige Rückstand entsprechend der Einzelvorschriften aufgearbeitet.

____________________________________________________________

NO

H

O

O 4 ________________________________________

11-Maleinimido-3,6,9-trioxa-1-undecanol (1) (aus der Umsetzung mit Tetraethylenglykol)

Nach säulenchromatographischer Reinigung (Kieselgel, Ethylacetat) erhält man 1.03 g (24 % d. Theorie) 1 als

farbloses Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 2.77 (bs, 1H, OH), 3.55–3.79 (m, 16H, NCH2CH2O, OCH2CH2O), 6.71 (s, 2H, CH=CH)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 37.12 (NCH2), 61.70 (HOCH2), 67.85, 70.01, 70.33, 70.50, 70.64, 72.53 (OCH2), 134.16 (CH=CH), 170.72

(C=O)

Organisch-chemische Synthesen 123

NO

H

O

O 6 ________________________________________

17-Maleinimido-3,6,9,12,15-pentoxa-1-heptadecanol (2) (aus der Umsetzung mit Hexaethylenglykol)

Nach säulenchromatographischer Reinigung (Kieselgel, Chloroform/Methanol 25:1) erhält man 2.61 g (46 % d.

Theorie) 2 als farbloses Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 2.94 (bs, 1H, OH), 3.55–3.75 (m, 24H, NCH2CH2O, OCH2CH2O), 6.72 (s, 2H, CH=CH)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 37.11 (NCH2), 61.67 (HOCH2), 67.78, 70.02, 70.32, 70.52, 70.59, 72.55 (OCH2), 134.18 (CH=CH), 170.67

(C=O)

____________________________________________________________

HOO

OO

OEt

OEt ________________________________________

11-Hydroxy-3,6,9-trioxaundecanaldiethylacetal (3)

Zu einer Lösung von Triethylenglykol (65.9 g, 0.44 mol) in 120 mL wasserfreiem Dioxan wird unter

Inertgasatmosphäre bei 10 °C portionsweise Natriumhydrid (60 % in Mineralöl) (5.27 g, 0.132 mol) gegeben

und noch 30 min gerührt, wobei man auf Raumtemperatur erwärmen läßt. Anschließend wird

Bromacetaldehyddiethylacetal (17.34 g, 88 mmol) zugegeben und 16 h unter Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlung

wird die Reaktionsmischung mit 1N HCl neutralisiert und im Vakuum auf 100 mL eingeengt. Der Rückstand

wird in 200 mL NaCl-Lösung (ges.) aufgenommen und dreimal mit jeweils 100 mL Dichlormethan extrahiert.

Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im

Vakuum entfernt. Nach säulenchromatographischer Reinigung (Kieselgel, Chloroform/Methanol 25:1) erhält

man 16.44 g (70 % d. Theorie) 3 als farbloses Öl.

1H-NMR (DMSO-d6):

δ = 1.11 (t, J = 7.0 Hz, 6H, CH3), 3.30–3.66 (m, 19H, OCH2, OH), 4.56 (t, J = 5.3 Hz, 1H, CH(OEt)2)

13C-NMR (DMSO-d6):

δ = 15.23 (CH3), 60.20 (HOCH2), 61.41 (CH3CH2O), 69.76, 69.81, 70.08, 71.14, 72.32 (OCH2CH2O), 101.50

(CH(OEt)2)

124 Experimentelles

NO

OO

OEt

O

O

OEt

________________________________________

11-Maleinimido-3,6,9-trioxaundecanaldiethylacetal (4)


in 100 mL wasserfreiem THF unter Inertgasatmosphäre gelöst und auf –78 °C gekühlt. Diisopropylazodi-

carboxylat (3.86 g, 19.1 mmol) wird innerhalb von fünf Minuten zugetropft und die entstandene hellgelbe

Lösung für weitere fünf Minuten gerührt. Anschließend läßt man eine Lösung von 3 (5.09 g, 19.1 mmol) in

20 mL THF innerhalb von fünf Minuten zutropfen. Nach weiteren fünf Minuten werden Neopentylalkohol

(0.84 g, 9.6 mmol) gelöst in 10 mL THF und Maleinimid (1.85 g, 19.1 mmol) als pulverisierter Feststoff

nacheinander zugegeben. Die Reaktionsmischung wird noch fünf Minuten bei –78 °C gerührt. Anschließend

entfernt man das Kältebad und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Das Lösungsmittel wird im Vakuum

entfernt und der ölige Rückstand durch Säulenchromatographie (Kieselgel, Isohexan/Ethylacetat 3:2) gereinigt.

Man erhält 4.37 g (66 % d. Theorie) 4 als farbloses Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 1.22 (t, J = 7.0 Hz, 3H, CH3), 3.50–3.76 (m, 18H, NCH2, CH2O), 4.63 (t, J = 5.3 Hz, 1H, CH(OEt)2), 6.71 (s,

2H, CH=CH)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 15.37 (CH3), 37.14 (NCH2), 62.31 (CH3CH2O), 67.83, 70.08, 70.57, 70.60, 70.89, 71.91 (OCH2CH2O),

101.20 (CH(OEt)2), 134.17 (CH=CH), 170.66 (C=O)


NO

OO CH

O

O

O

________________________________________

11-Maleinimido-3,6,9-trioxaundecanal (5)

Eine Lösung von 4 (1.133 g, 3.28 mmol) in 100 mL Aceton wird mit 0.3 mL H2SO4 (50 %) versetzt und zwei

Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend neutralisiert man mit festem Calciumhydroxid (pH 7) und

trocknet über Magnesiumsulfat. Die Feststoffe werden abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.

Nach säulenchromatographischer Reinigung (Kieselgel, Ethylacetat) erhält man 669 mg (75 % d. Theorie) 5 als

farbloses Öl, das im konzentrierten Zustand zu Autopolymerisation neigt und daher bei –18 °C als 10 %ige

Lösung in THF aufbewahrt wird.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 3.58–3.76 (m, 12H, CH2N, CH2O), 4.16 (d, J = 0.7 Hz, 2H, CH2CHO), 6.71 (s, 2H, CH=CH), 9.73 (t,

J = 0.7 Hz, 1H, CHO)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 37.15 (NCH2), 67.89, 70.04, 70.63, 70.81, 71.21 (OCH2), 76.86 (CH2CHO), 134.18 (CH=CH), 170.67

(C(O)CH=CHCO), 200.99 (CHO)

126 Experimentelles

NO

OO

N

O

O

HN

O

________________________________________

11-Maleinimido-3,6,9-trioxaundecanal-benzoylhydrazon (6)

Eine 10 %ige Lösung von 5 in THF (2.71 mL, 1.00 mmol) wird mit Benzoylhydrazid (204 mg, 1.50 mmol)

versetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend kühlt man auf –18 °C, wobei 6 als farbloser

Feststoff ausfällt, der abfiltriert, mit wenig Diethylether gewaschen und im Vakuum getrocknet wird. Man erhält

187 mg (48 % d. Theorie) 6 als farblosen Feststoff.

1H-NMR (DMSO-d6):

δ = 3.38–3.64 (m, 12H, NCH2, OCH2), 4.13 (d, J = 5.2 Hz, 2H, CH2CH=N), 7.03 (s, 2H, CH=CH), 7.42–7.63

(m, 3H, Ar-H), 7.77 (t, J = 5.2 Hz, 1H, CH=N), 7.86 (d, J = 7.2 Hz, 2H, Ar-H), 11.65 (s, 1H, NH)

13C-NMR (DMSO-d6):

δ = 36.71 (NCH2), 66.85, 69.32, 69.45, 69.55, 69.61 (OCH2), 127.48, 128.37, 131.67, 133.21 (Ar), 134.46

(CH=CH), 148.03 (CH=N), 163.10 (Ar-C=O), 170.82 (C(O)CH=CHCO)

C19H23N3O6 [389.41]

Elementaranalyse: berechnet: C: 58.60 % H: 5.95 % N: 10.79 %

gefunden: C: 58.74 % H: 6.24 % N: 10.80 %


HOO

OO

O

O ________________________________________

Ethyl-11-hydroxy-3,6,9-trioxaundecanoat (7)

Eine Lösung von Triethylenglykol (50.1 g, 0.33 mol) in 250 mL wasserfreiem Dichlormethan wird bei 0 °C

unter Inertgasatmosphäre nacheinander mit Diazoethylacetat (7.61 g, 66.7 mmol) und Bortrifluorid-Etherat

(100 µL) versetzt. Anschließend läßt man auf Raumtemperatur erwärmen und 24 h rühren. Man wäscht dreimal

mit jeweils 50 mL Natriumhydrogencarbonatlösung (ges.) und extrahiert die wäßrigen Phasen dreimal mit

jeweils 50 mL Dichlormethan zurück. Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat

getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach säulenchromatographischer Reinigung (Kieselgel,

Ethylacetat) des Rohprodukts erhält man 7.23 g (50 % d. Theorie) 7 als gelbliches Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 1.29 (t, J = 7.2 Hz, 3H,CH3), 3.19 (bs, 1H, OH), 3.59–3.77 (m, 12H, OCH2), 4.15 (s, 2H, CH2C(O)OEt),

4.22 (q, J = 7.2 Hz, 2H, CH3CH2O)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 14.20 (CH3), 60.88 (C(O)OCH2), 61.75 (HOCH2), 68.71, 70.34, 70.62, 70.86, 72.55 (OCH2), 170.49 (C=O)

____________________________________________________________

HOO

OO

O

NH

NH2

________________________________________

11-Hydroxy-3,6,9-trioxaundecansäurehydrazid (8)

Eine Lösung von 7 (7.50 g, 31.7 mmol) in 100 mL Methanol wird mit Hydrazinhydrat (3.86 mL, 79.4 mmol)

versetzt und zwei Stunden unter Rückfluß erhitzt. Anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt

und der Rückstand säulenchromatographisch gereinigt (Kieselgel, Chloroform/Methanol 20:1). Man erhält

6.02 g (85 % d. Theorie) 8 als farbloses Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 3.58–3.77 (m, 13H, OCH2, OH), 4.06–4.12 (m, 2H, CH2CONH), 4.93 (bs, 3H, NHNH2)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 61.45 (HOCH2), 69.86, 70.08, 70.21, 70.55, 71.13, 73.15 (OCH2), 170.17 (C=O)

128 Experimentelles

HOO

OO

O

NH

HN O

O ________________________________________

N-(tert.-Butoxycarbonyl)-N'-(11-hydroxy-3,6,9-trioxaundecanoyl)hydrazin (9)

Eine Lösung von 8 (5.62 g, 25.3 mmol) in 25 mL wasserfreiem Dichlormethan wird mit Di-tert.-butyldicarbonat

(13.53 mL, 63.3 mmol) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen des

Lösungsmittels im Vakuum wird das Produkt säulenchromatographisch gereinigt (Kieselgel, Chloro-

form/Methanol 25:1 → 10:1). Man erhält 8.27 g (100 % d. Theorie) 9 als farblosen Sirup.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 1.49 (s, 9H, C(CH3)3), 3.08 (bs, 1H, OH), 3.58–3.78 (m, 12H, OCH2), 4.16 (s, 2H, CH2C(O)NH), 6.83 (bs,

1H, NH), 9.12 (bs, 1H, NH)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 28.18 (C(CH3)3), 61.64 (HOCH2), 70.13, 70.21, 70.34, 70.52, 71.07, 72.63 (OCH2), 81.48 (C(CH3)3), 155.40

(NH-C(O)O), 169.72 (CH2C(O)NH)


HN

NO

OO

O

NH

O

OO

O

________________________________________

N-(tert.-Butoxycarbonyl)-N'-(11-maleinimido-3,6,9-trioxaundecanoyl)hydrazin (10)

In einem Dreihalskolben mit Innenthermometer und Tropftrichter wird Triphenylphosphin (814 mg, 3.10 mmol)

in 60 mL wasserfreiem THF unter Inertgasatmosphäre gelöst und auf –78 °C gekühlt.

Diisopropylazodicarboxylat (627 mg, 3.10 mmol) wird innerhalb von zwei Minuten zugetropft und die

entstandene hellgelbe Lösung für weitere zwei Minuten gerührt. Anschließend läßt man eine Lösung von 9

(1.000 g, 31.0 mmol) in 5 mL THF innerhalb von fünf Minuten zutropfen. Nach weiteren fünf Minuten werden

Neopentylalkohol (137 mg, 15.5 mmol) gelöst in 5 mL THF und Maleinimid (301 mg, 31.0 mmol) als

pulverisierter Feststoff nacheinander zugegeben. Die Reaktionsmischung wird noch zehn Minuten bei –78 °C

gerührt. Anschließend entfernt man das Kältebad und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Das Lösungsmittel

wird im Vakuum entfernt und der ölige Rückstand durch Säulenchromatographie (Kieselgel,

Chloroform/Ethylacetat 1:1) gereinigt. Man erhält 413 mg (33 % d. Theorie) 10 als farbloses Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 1.48 (s, 9H, C(CH3)3), 3.57–3.78 (m, 12H, OCH2, NCH2), 4.12 (s, 2H, CH2C(O)NH), 6.71 (bs, 1H, NH),

6.73 (s, 2H, CH=CH), 8.85 (bs, 1H, NH)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 28.16 (C(CH3)3), 37.15 (NCH2), 67.84, 70.01, 70.12, 70.43, 71.25 (OCH2), 81.48 (C(CH3)3), 134.20

(CH=CH), 155.21 (NH-C(O)O), 169.70 (CH2C(O)NH), 170.77 (C(O)CH=CHCO)

130 Experimentelles

HOO

O

O3 ________________________________________

tert.-Butyl-11-hydroxy-3,6,9-trioxaundecanoat (14)

Eine Lösung von Triethylenglykol (51.1 g, 0.34 mol) in 100 mL wasserfreiem THF wird unter

Inertgasatmosphäre bei 0 °C portionsweise mit Natriumhydrid (60 % in Mineralöl) (2.72 g, 68.0 mmol) versetzt.

Man läßt noch eine halbe Stunde rühren, tropft anschließend tert.-Butylbromacetat (13.26 g, 68.0 mmol)

innerhalb zehn Minuten bei 0 °C zu und läßt über Nacht bei Raumtemperatur rühren. Das Lösungsmittel wird im

Vakuum entfernt, der Rückstand in 100 mL Natriumchloridlösung (ges.) aufgenommen und dreimal mit jeweils

100 mL Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet

und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach säulenchromatographischer Reinigung (Kieselgel,

Ethylacetat) erhält man 5.25 g (29 % d. Theorie) 14 als farbloses Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 1.48 (s, 9H, C(CH3)3), 2.93 (bs, 1H, OH), 3.58–3.75 (m, 12H, OCH2), 4.03 (s, 2H, CH2C(O)OtBu)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 28.11 (C(CH3)3), 61.74 (HOCH2), 69.03, 70.35, 70.58, 70.64, 70.70, 72.55 (OCH2), 81.63 (C(CH3)3), 169.68

(CH2C(O)OtBu)


HOO

O

O6 ________________________________________

tert.-Butyl-20-hydroxy-3,6,9,12,15,18-hexoxaeicosanoat (15)

Zu einer Suspension von Kaliumhydrid (35 % in Mineralöl) (5.17 g, 45.1 mmol) in 500 mL wasserfreiem THF

wird unter Inertgasatmosphäre bei 0 °C Hexaethylenglykol (25.44 g, 90.1 mmol) innerhalb fünf Minuten

getropft. Man läßt noch eine Stunde bei Raumtemperatur rühren, gibt anschließend tert.-Butylbromacetat (8.7 g,

45.1 mmol) zu und erhitzt über Nacht unter Rückfluß. Anschließend wird das entstandene Kaliumbromid über

Celite abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach säulenchromatographischer Reinigung

(Kieselgel, Dichlormethan/Methanol 100:1 → 40:1) erhält man 12.16 g (68 % d. Theorie) 15 als farbloses Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 1.48 (s, 9H, C(CH3)3), 2.75 (bs, 1H, OH), 3.57–3.75 (m, 24H, OCH2), 4.02 (s, 2H, CH2C(O)OtBu)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 28.12 (C(CH3)3), 61.75 (HOCH2), 69.06, 70.36, 70.60, 70.74, 72.55 (OCH2), 81.52 (C(CH3)3), 169.69

(CH2C(O)OtBu)

132 Experimentelles

Allgemeine Vorschrift zur Monoalkylierung von Oligo(ethylenglykolen) mit tert.-Butylacrylat (zur

Darstellung von 16–18)

Zu einer Lösung des Oligo(ethylenglykols) (0.30 mol) und einer katalytischen Menge Kalium-tert.-butoxid

(100 mg) in 150 mL wasserfreiem THF wird unter Inertgasatmosphäre tert.-Butylacrylat (13.49 g, 105 mmol) in

150 mL THF getropft. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, mit 1N HCl

neutralisiert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Anschließend wird der Rückstand in 150 mL

Natriumchloridlösung (ges.) aufgenommen. Man extrahiert dreimal mit jeweils 75 mL Ethylacetat, wäscht die

vereinigten organischen Phasen mit 90 mL Natriumchloridlösung (ges.) und trocknet über Magnesiumsulfat.

Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum erfolgt die weitere Aufreinigung entsprechend der

Einzelvorschriften.

____________________________________________________________

HOO O

O

3 ________________________________________

tert.-Butyl-12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoat (16) (aus der Umsetzung mit Triethylenglykol)

Nach säulenchromatographischer Reinigung des Rohprodukts (Kieselgel, Ethylacetat) erhält man 21.33 g (73 %

d. Theorie) 16 als farbloses Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 1.45 (s, 9H, C(CH3)3), 2.51 (t, J = 6.6 Hz, 2H, CH2C(O)OtBu), 2.72 (bs, 1H, OH), 3.58–3.75 (m, 14H,

OCH2)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 28.10 (C(CH3)3), 36.24 (CH2C(O)OtBu), 61.74 (HOCH2), 66.92, 70.36, 70.39, 70.51, 70.64, 72.52 (OCH2),

80.53 (C(CH3)3), 170.93 (CH2C(O)OtBu)


HOO O

O

4 ________________________________________

tert.-Butyl-15-hydroxy-4,7,10,13-tetroxapentadecanoat (17) (aus der Umsetzung mit Tetraethylenglykol)

Nach säulenchromatographischer Reinigung des Rohprodukts (Kieselgel, Ethylacetat/Methanol 10:1 → 3:1)

erhält man 21.66 g (64 % d. Theorie) 17 als farbloses Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 1.45 (s, 9H, C(CH3)3), 2.50 (t, J = 6.4 Hz, 2H, CH2C(O)OtBu), 2.72 (bs, 1H, OH), 3.58–3.75 (m, 18H,

OCH2)

13C-NMR (CDCl3):


80.50 (C(CH3)3), 170.92 (CH2C(O)OtBu)

____________________________________________________________

HOO O

O

6 ________________________________________

tert.-Butyl-21-hydroxy-4,7,10,13,16,19-hexoxauncosanoat (18) (aus der Umsetzung mit Hexaethylenglykol)

Nach säulenchromatographischer Reinigung des Rohprodukts (Kieselgel, Ethylacetat/Methanol 5:1) erhält man

34.48 g (80 % d. Theorie) 18 als farbloses Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 1.45 (s, 9H, C(CH3)3), 2.50 (t, J = 6.6 Hz, 2H, CH2C(O)OtBu), 2.91 (s, 1H, OH), 3.58–3.74 (m, 26H, OCH2)

13C-NMR (CDCl3):


80.46 (C(CH3)3), 170.89 (CH2C(O)OtBu)

134 Experimentelles

NO

O

O

O

O 3 ________________________________________

tert.-Butyl-11-maleinimido-3,6,9-trioxaundecanoat (19)



Diisopropylazodicarboxylat (6.27 g, 31.0 mmol) wird innerhalb von zwei Minuten zugetropft und die



Neopentylalkohol (1.37 g, 15.5 mmol) gelöst in 10 mL THF und Maleinimid (3.01 g, 31.0 mmol) als




Diethylether/Isohexan/Ethylacetat 2:1:1) gereinigt. Man erhält 3.96 g (37 % d. Theorie) 19 als farbloses Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 1.48 (s, 9H, C(CH3)3), 3.59–3.76 (m, 12H, NCH2, OCH2), 4.02 (s, 2H, CH2C(O)OtBu), 6.71 (s, 2H,

CH=CH)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 28.12 (C(CH3)3), 37.13 (NCH2), 67.83, 69.05, 70.04, 70.58, 70.64, 70.71 (OCH2), 81.52 (C(CH3)3), 134.17

(CH=CH), 169.69 (CH2C(O)OtBu), 170.67 (C(O)CH=CHCO)


NO

O

O

O

O 6 ________________________________________

tert.-Butyl-20-maleinimido-3,6,9,12,15,18-hexoxaeicosanoat (20)

Eine Suspension von 15 (4.00 g, 10.1 mmol), Neopentylalkohol (404 mg, 4.59 mmol) und polymergeträgertem

Triphenylphosphin (≅ 3 mmol Ph3P pro g Polymer) (3.36 g, 10.1 mmol) in 100 mL wasserfreiem THF wird bei

0 °C nacheinander mit Maleinimid (890 mg, 9.17 mmol) und DIAD (1.854 g, 9.17 mmol) versetzt. Man läßt

noch 5 min bei 0 °C rühren, entfernt das Kältebad und rührt drei Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend

wird der Feststoff über Celite abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach

säulenchromatographischer Reinigung (Kieselgel, 1. Diethylether/Ethanol 15:1, 2. Chloroform/Methanol 50:1)

des öligen Rückstands erhält man 1.367 g (31 % d. Theorie) 20 als farbloses Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 1.47 (s, 9H, C(CH3)3), 3.58–3.74 (m, 24H, NCH2, OCH2), 4.02 (s, 2H, CH2C(O)OtBu), 6.70 (s, 2H,

CH=CH)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 28.13 (C(CH3)3), 37.15 (NCH2), 67.83, 69.06, 70.08, 70.60, 70.74 (OCH2), 81.52 (C(CH3)3), 134.17

(CH=CH), 169.69 (CH2C(O)OtBu), 170.66 (C(O)CH=CHCO)

136 Experimentelles

NO O

OO

O 3 ________________________________________

tert.-Butyl-12-maleinimido-4,7,10-trioxadodecanoat (21)



Diisopropylazodicarboxylat (6.54 g, 32.3 mmol) wird innerhalb von zwei Minuten zugetropft und die



Neopentylalkohol (1.43 g, 16.2 mmol) gelöst in 10 mL THF und Maleinimid (3.14 g, 32.3 mmol) als




Diethylether/Isohexan 3:1) gereinigt. Man erhält 6.73 g (58 % d. Theorie) 21 als farbloses Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 1.45 (s, 9H, C(CH3)3), 2.50 (t, J = 6.6 Hz, 2H, CH2C(O)OtBu), 3.57–3.76 (m, 14H, NCH2, OCH2), 6.71 (s,

2H, CH=CH)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 28.10 (C(CH3)3), 36.26 (CH2C(O)OtBu), 37.12 (NCH2), 66.89, 67.81, 70.05, 70.35, 70.54, 70.56 (OCH2),

80.48 (C(CH3)3), 134.16 (CH=CH), 170.64 (C(O)CH=CHCO), 170.91 (CH2C(O)OtBu)


NO O

OO

O 4 ________________________________________

tert.-Butyl-15-maleinimido-4,7,10,13-tetroxapentadecanoat (22)

Zu einer Lösung von Triphenylphosphin (2.70 g, 10.3 mmol), 17 (3.65 g, 11.3 mmol) und Neopentylalkohol

(454 mg, 5.2 mmol) in 70 mL wasserfreiem THF wird unter Inertgasatmosphäre Diisopropylazodicarboxylat

(2.08 g, 10.3 mmol) innerhalb von zwei Minuten getropft und die entstandene hellgelbe Lösung für weitere zwei

Minuten gerührt. Anschließend wird Maleinimid (1.000 g, 10.3 mmol) als pulverisierter Feststoff zugegeben und

über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der ölige Rückstand

durch Säulenchromatographie (Kieselgel, Diethylether) gereinigt. Man erhält 2.79 g (68 % d. Theorie) 22 als

farbloses Öl.

1H-NMR (CDCl3):


2H, CH=CH)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 28.11 (C(CH3)3), 36.30 (CH2C(O)OtBu), 37.15 (NCH2), 66.91, 67.81, 70.08, 70.39, 70.52, 70.57, 70.60,

70.65 (OCH2), 80.48 (C(CH3)3), 134.17 (CH=CH), 170.64 (C(O)CH=CHCO), 170.90 (CH2C(O)OtBu)

138 Experimentelles

NO O

OO

O 6 ________________________________________

tert.-Butyl-21-maleinimido-4,7,10,13,16,19-hexoxauncosanoat (23)

Eine Suspension von 18 (3.80 g, 9.27 mmol), Neopentylalkohol (371 mg, 4.21 mmol) und polymergeträgertem

Triphenylphosphin (≅ 3 mmol Ph3P pro g Polymer) (3.09 g, 9.27 mmol) in 100 mL wasserfreiem THF wird bei

0 °C nacheinander mit Maleinimid (818 mg, 8.43 mmol) und DIAD (1.70 g, 8.43 mmol) versetzt. Man läßt noch

5 min bei 0 °C rühren, entfernt das Kältebad und rührt drei Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird der

Feststoff über Celite abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach säulenchromatographischer

Reinigung (Kieselgel, 1. Diethylether/Ethanol 15:1, 2. Chloroform/Methanol 50:1) des öligen Rückstands erhält

man 1.014 g (25 % d. Theorie) 23 als farbloses Öl.

1H-NMR (CDCl3):


2H, CH=CH)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 28.11 (C(CH3)3), 36.29 (CH2C(O)OtBu), 37.15 (NCH2), 66.91, 67.81, 70.08, 70.38, 70.52, 70.59 (OCH2),

80.48 (C(CH3)3), 134.17 ( H=CH), 170.65 (C(O)CH=CHCO), 170.90 (CH2C(O)OtBu) C


Allgemeine Vorschrift zur Abspaltung der tert.-Butyl-Schutzgruppen (zur Darstellung von 24–28)

Eine Lösung von 3 mmol des tert.-Butylesters in 5 mL wasserfreiem Dichlormethan wird unter

Inertgasatmosphäre mit 5 mL Trifluoressigsäure versetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt.

Anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in 30 mL Dichlormethan

aufgenommen und 4 g Amberlyst A-21 zugegeben. Man läßt eine Stunde bei Raumtemperatur rühren, filtriert

den Feststoff ab und entfernt das Lösungsmittel im Vakuum. Die Carbonsäuren 24–28 werden dabei in

quantitativer Ausbeute erhalten.

____________________________________________________________

NO COOH

O

O 3 ________________________________________

11-Maleinimido-3,6,9-trioxaundecansäure (24) 1H-NMR (CDCl3):

δ = 3.58–3.80 (m, 12H, NCH2, OCH2), 4.18 (s, 2H, CH2COOH), 6.72 (s, 2H, CH=CH), 7.21 (bs, 1H, COOH)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 37.19 (NCH2), 68.02, 69.87, 70.27, 70.56, 71.28 (OCH2), 134.21 (CH=CH), 170.67 (C(O)CH=CHCO),

172.84 (COOH)

____________________________________________________________

NO COOH

O

O 6 ________________________________________

20-Maleinimido-3,6,9,12,15,18-hexoxaeicosansäure (25) 1H-NMR (CDCl3):

δ = 3.35–3.88 (m, 24H, NCH2, OCH2), 4.16 (s, 2H, CH2COOH), 5.92 (bs, 1H, COOH), 6.71 (s, 2H, CH=CH)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 37.16 (NCH2), 67.82, 69.14, 70.02, 70.26, 70.35, 70.39, 70.48, 70.58, 71.11 (OCH2), 134.19 (CH=CH),

170.74 (C(O)CH=CHCO), 171.97 (COOH)

140 Experimentelles

NO

COOH

O

O 3 ________________________________________

12-Maleinimido-4,7,10-trioxadodecansäure (26) 1H-NMR (CDCl3):

δ = 2.64 (t, J = 6.2 Hz, 2H, CH2COOH), 3.58–3.81 (m, 14H, NCH2, OCH2), 6.72 (s, 2H, CH=CH), 9.76 (bs, 1H,

COOH)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 34.78 (CH2COOH), 37.14 (NCH2), 66.32, 67.86, 70.00, 70.37, 70.38, 70.52 (OCH2), 134.20 (CH=CH),

170.79 (C(O)CH=CHCO), 176.32 (COOH)

____________________________________________________________

NO

COOH

O

O 4 ________________________________________

15-Maleinimido-4,7,10,13-tetroxapentadecansäure (27) 1H-NMR (CDCl3):


COOH)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 34.86 (CH2COOH), 37.11 (NCH2), 66.40, 67.79, 70.03, 70.32, 70.44, 70.47, 70.56, 70.60 (OCH2), 134.18

(CH=CH), 170.75 (C(O)CH=CHCO), 175.65 (COOH)

____________________________________________________________

NO

COOH

O

O 6 ________________________________________

21-Maleinimido-4,7,10,13,16,19-hexoxauncosansäure (28) 1H-NMR (CDCl3):


COOH)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 34.93 (CH2COOH), 37.16 (NCH2), 66.50, 67.81, 70.04, 70.32, 70.49, 70.58, 70.65 (OCH2), 134.19

(CH=CH), 170.72 (C(O)CH=CHCO), 174.87 (COOH)


4.2.2 Albuminbindende Camptothecin-Prodrugs

Allgemeine Vorschrift für die Umsetzung von Camptothecin-20-O-glycinat-Trifluoracetat (30) mit den

Carbonsäuren 24–28 (zur Darstellung von 31–35)

Zu einer Suspension von 30 (318 mg, 0.613 mmol), 0.919 mmol der Carbonsäure und Triethylamin (256 µL,

1.838 mmol) in 5 mL wasserfreiem Dichlormethan wird 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid (Mukaiyama-

Reagenz) (235 mg, 0.919 mmol) unter Inertgasatmosphäre als Feststoff gegeben und die entstandene Suspension

drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei eine klare Lösung entsteht. Anschließend wird mit 50 mL

Dichlormethan verdünnt, zweimal mit 20 mL 1N HCl und zweimal mit 20 mL Wasser gewaschen, die

organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand

wird entsprechend der Einzelvorschriften aufgearbeitet.

____________________________________________________________

N

N O

O

OO

NH

O

O

OO

N

O

O2 3

56

78

9

10

11

1213

1415

1616a17

1819

2021

2

________________________________________

Camptothecin-20-O-[(11-maleinimido-3,6,9-trioxaundecanoyl)glycinat] (31) (aus der Umsetzung mit 24)

Nach Umkristallisation des Rückstands aus Methanol erhält man 223 mg (54 % d. Theorie) 31 als blaßgelbes

Pulver.

1H-NMR (DMSO-d6):

δ = 0.94 (t, J = 7.4 Hz, 3H, C18-H), 2.17 (q, J = 7.4 Hz, 2H, C19-H), 3.38–3.58 (m, 12H, NCH2CH2O,

OCH2CH2O), 3.93 ('s', 2H, CH2C(O)NH), 4.08/4.22 (dd, JAB = 17.3 Hz, JAX = 6.2 Hz, 2H, NHCH2CO), 5.22

(s, 2H, C5-H), 5.50 (s, 2H, C17-H), 6.97 (s, 2H, C(O)CH=CHCO), 7.16 (s, 1H, C14-H), 7.69 ('t', J = 8.1 Hz,

1H, C10-H), 7.85 ('t', J = 7.2 Hz, 1H, C11-H), 8.08 (d, J = 7.5 Hz, 1H, C9-H), 8.15 (d, J = 8.3 Hz, 1H,

C12-H), 8.22 (t, J = 6.2 Hz, 1H, NH), 8.64 (s, 1H, C7-H)

13C-NMR (DMSO-d6):

δ = 7.41 (C18), 30.35 (C19), 36.64 (NCH2CH2O), 50.04 (C5), 66.22 (C17), 66.78, 69.24, 69.37, 69.48, 69.67,

70.15 (OCH2, CH2NH), 76.19 (C20), 95.10, 118.86, 127.57, 127.81, 128.38, 128.78, 129.56, 130.31, 131.43,

134.38 (C(O)CH=CHCO), 144.94, 145.82, 147.74, 152.18, 156.37 (C2,3,6–16,16a), 166.91, 168.79, 169.86,

170.76 (C21, C(O)CH=CHCO, C(O)OC20, C(O)NH)

ESI-MS (4.4 kV, MeOH): m/z (%) 697.1 ([M+Na]+, 100)

142 Experimentelles

N

N O

O

OO

NH

O

O

OO

N

O

O2 3

56

78

9

10

11

1213

1415

1616a17

1819

2021

5

________________________________________

Camptothecin-20-O-[(20-maleinimido-3,6,9,12,15,18-hexoxaeicosanoyl)glycinat] (32) (aus der Umsetzung

von 30 mit 25)

Nach säulenchromatographischer Reinigung des Rückstands (Chloroform/Methanol 30:1) erhält man 322 mg

(79 % d. Theorie) 32 als blaßgelben wachsartigen Feststoff.

1H-NMR (DMSO-d6):

δ = 0.92 (t, J = 7.3 Hz, 3H, C18-H), 2.16 (q, J = 7.3 Hz, 2H, C19-H), 3.35–3.61 (m, 24H, NCH2CH2O,

OCH2CH2O), 3.93 ('s', 2H, CH2C(O)NH), 4.08/4.22 (dd, JAB = 17.9 Hz, JAX = 6.0 Hz, 2H, NHCH2CO), 5.28

(s, 2H, C5-H), 5.50 (s, 2H, C17-H), 7.00 (s, 2H, C(O)CH=CHCO), 7.17 (s, 1H, C14-H), 7.71 ('t', J = 7.5 Hz,

1H, C10-H), 7.87 ('t', J = 7.2 Hz, 1H, C11-H), 8.12 (d, J = 7.7 Hz, 1H, C9-H), 8.17 (d, J = 8.6 Hz, 1H,

C12-H), 8.21 (t, J = 6.0 Hz, 1H, NH), 8.68 (s, 1H, C7-H)

13C-NMR (DMSO-d6):

δ = 7.39 (C18), 30.36 (C19), 36.70 (NCH2CH2O), 50.08 (C5), 66.23 (C17), 66.82, 69.31, 69.53, 69.62, 70.20

(OCH2, CH2NH), 76.15 (C20), 95.11, 118.89, 127.61, 127.87, 128.43, 128.82, 129.65, 130.33, 131.46,

134.43 (C(O)CH=CHCO), 144.93, 145.85, 147.80, 152.26, 156.40 (C2,3,6–16,16a), 166.88, 168.78, 169.86,

170.79 (C21, C(O)CH=CHCO, C(O)OC20, C(O)NH)



O

N

N O

O

OO

NH

O

N

O

O

O

O 2

2120

1918

1716a 16

1514

1312

11

10

98

76

5

32

________________________________________

Camptothecin-20-O-[(12-maleinimido-4,7,10-trioxadodecanoyl)glycinat] (33) (aus der Umsetzung von 30

mit 26)

Nach Umkristallisation des Rückstands aus Ethanol erhält man 279 mg (66 % d. Theorie) 26 als blaßgelbes

Pulver.

1H-NMR (DMSO-d6):

δ = 0.93 (t, J = 7.4 Hz, 3H, C18-H), 2.17 (q, J = 7.4 Hz, 2H, C19-H), 2.38 ('t', J = 6.4 Hz, 2H, CH2C(O)NH),

3.36–3.68 (m, 14H, NCH2CH2O, OCH2CH2O), 4.02/4.21 (dd, JAB = 17.4 Hz, JAX = 5.9 Hz, 2H, NHCH2CO),

5.24 (s, 2H, C5-H), 5.50 (s, 2H, C17-H), 6.99 (s, 2H, C(O)CH=CHCO), 7.16 (s, 1H, C14-H), 7.70 ('t',

J = 7.5 Hz, 1H, C10-H), 7.86 ('t', J = 7.7 Hz, 1H, C11-H), 8.10 (d, J = 7.5 Hz, 1H, C9-H), 8.16 (d,

J = 8.7 Hz, 1H, C12-H), 8.43 (t, J = 5.9 Hz, 1H, NH), 8.65 (s, 1H, C7-H)

13C-NMR (DMSO-d6):

δ = 7.42 (C18), 30.29 (C19), 35.61 (CH2C(O)NH), 36.65 (NCH2CH2O), 50.05 (C5), 66.20 (C17), 66.42, 66.78,

69.36, 69.47, 69.50, (OCH2, CH2NH), 76.10 (C20), 95.15, 118.83, 127.58, 127.82, 128.39, 128.80, 129.58,

130.31, 131.42, 134.41 (C(O)CH=CHCO), 144.98, 145.82, 147.75, 152.20, 156.37 (C2,3,6–16,16a), 166.98,

169.02, 170.58, 170.78 (C21, C(O)CH=CHCO, C(O)OC20, C(O)NH)


144 Experimentelles

O

N

N O

O

OO

NH

O

N

O

O

O

O 3

2120

1918

1716a 16

1514

1312

11

10

98

76

5

32

________________________________________

Camptothecin-20-O-[(15-maleinimido-4,7,10,13-tetroxapentadecanoyl)glycinat] (34) (aus der Umsetzung

von 30 mit 27)


Pulver.

1H-NMR (DMSO-d6):






13C-NMR (DMSO-d6):


69.26, 69.38, 69.48, 69.58, 69.63 (OCH2, CH2NH), 76.09 (C20), 95.15, 118.82, 127.55, 127.80, 128.37,

128.79, 129.55, 130.30, 131.41, 134.41 (C(O)CH=CHCO), 144.98, 145.80, 147.74, 152.17, 156.36

(C2,3,6−16,16a), 166.96, 169.00, 170.57, 170.78 (C21, C(O)CH=CHCO, C(O)OC20, C(O)NH)



O

N

N O

O

OO

NH

N

O

O

O

O

O

5

2120

1918

1716a 16

1514

1312

11

10

98

76

5

32

________________________________________

Camptothecin-20-O-[(21-maleinimido-4,7,10,13,16,19-hexoxauncosanoyl)glycinat] (35) (aus der Umsetzung

von 30 mit 28)

Nach säulenchromatographischer Reinigung des Rückstands (Chloroform/Methanol 30:1) erhält man 322 mg

(89 % d. Theorie) 35 als blaßgelben wachsartigen Feststoff.

1H-NMR (DMSO-d6):






13C-NMR (DMSO-d6):


69.30, 69.40, 69.53, 69.63 (OCH2, CH2NH), 76.10 (C20), 95.14, 118.85, 127.58, 127.84, 128.41, 128.82,

129.59, 130.31, 131.43, 134.44 (C(O)CH=CHCO), 144.98, 145.84, 147.78, 152.22, 156.38 (C2,3,6–16,16a),

166.96, 169.00, 170.57, 170.80 (C21, C(O)CH=CHCO, C(O)OC20, C(O)NH)


146 Experimentelles

4.2.3 Synthese einer nicht-albuminbindenden CPT-Modellverbindung

OO

OOH

________________________________________

Triethylenglykolmonobenzylether (36)

Zu Triethylenglykol (80.96 g, 0.54 mol) wird unter Inertgasatmosphäre bei Raumtemperatur kleingeschnittenes

Natrium (1.86 g, 80.9 mmol) gegeben. Man erhitzt, bis sich das Natrium vollständig gelöst hat. Nach Abkühlen

der Reaktionsmischung auf Raumtemperatur wird Benzylbromid (6.40 mL, 53.9 mmol) innerhalb zehn Minuten

zugetropft und die Mischung eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird mit 50 mL Wasser

verdünnt, mit 1N HCl neutralisiert und dreimal mit jeweils 100 mL Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten

organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach

säulenchromatographischer Reinigung (Kieselgel, Ethylacetat) erhält man 10.06 g (78 % d. Theorie) 36 als

farbloses Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 2.84 (bs, 1H, OH), 3.56–3.74 (m, 12H, OCH2CH2O), 4.56 (s, 2H, CH2Ar), 7.23–7.34 (m, 5H, Ar-H)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 61.71 (HOCH2), 69.38, 70.37, 70.61, 70.66, 72.53, 73.25 (OCH2), 127.63 (Ar), 127.77 (Ar), 128.37 (Ar),

138.16 (Ar)


OO

OO O

O

________________________________________

tert.-Butyl-12-benzyloxy-4,7,10-trioxadodecanoat (37)

Zu einer Lösung von 36 (11.33 g, 47.15 mmol) und einer katalytischen Menge Kalium-tert.-butoxid (100 mg) in

150 mL wasserfreiem THF wird unter Inertgasatmosphäre tert.-Butylacrylat (9.06 g, 70.7 mmol) in 100 mL THF

innerhalb 20 min getropft. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, mit 1N HCl

neutralisiert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach säulenchromatographischer Reinigung des

Rohprodukts (Kieselgel, Ethylacetat/Isohexan 1:2) erhält man 9.95 g (57 % d. Theorie) 37 als farbloses Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 1.44 (s, 9H, C(CH3)3), 2.50 (t, J = 6.6 Hz, 2H, CH2C(O)OtBu), 3.57–3.75 (m, 14H, OCH2), 4.57 (s, 2H,

CH2Ar), 7.23–7.37 (m, 5H, Ar-H)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 28.10 (C(CH3)3), 36.28 (CH2C(O)OtBu), 66.91, 69.44, 70.39, 70.54, 70.64, 70.67, 73.24 (OCH2), 80.49

(C(CH3)3), 127.58 (Ar), 127.75 (Ar), 128.36 (Ar), 138.30 (Ar), 170.92 (CH2C(O)OtBu)

____________________________________________________________

OO

OO

COOH

________________________________________

12-Benzyloxy-4,7,10-trioxadodecansäure (38) (aus der Umsetzung von 37 nach der allgemeinen Vorschrift auf

S. 139) 1H-NMR (CDCl3):

δ = 2.61 (t, J = 6.2 Hz, 2H, CH2C(O)OtBu), 3.59–3.71 (m, 12H, OCH2), 3.76 (t, J = 6.2 Hz, 2H,

CH2CH2C(O)OtBu), 4.58 (s, 2H, CH2Ar), 7.24–7.37 (m, 5H, Ar-H), 8.72 (bs, 1H, COOH 13C-NMR (CDCl3):

δ = 34.90 (CH2COOH), 66.39, 69.37, 70.30, 70.47, 70.53, 70.62, 73.21 (OCH2), 127.67 (Ar), 127.84 (Ar),

128.38 (Ar), 138.06 (Ar), 175.66 (COOH)

148 Experimentelles

2120

1918

1716a 16

1514

1312

11

10

98

76

5

32

OO

OO

N

N O

O

OO

NH

O

O

________________________________________

Camptothecin-20-[(12-benzyloxy-4,7,10-trioxadodecanoyl)glycinat] (39) (aus der Umsetzung von 30 mit 38

nach der allgemeinen Vorschrift auf S. 141)


Pulver.

1H-NMR (DMSO-d6):

δ = 0.93 (t, J = 7.5 Hz, 3H, C18-H), 2.16 (q, J = 7.5 Hz, 2H, C19-H), 2.34–2.43 (m, 2H, CH2C(O)NH), 3.39–

3.66 (m, 14H, NCH2CH2O, OCH2CH2O), 4.01/4.20 (dd, JAB = 17.9 Hz, JAX = 5.8 Hz, 2H, NHCH2CO), 4.45

(s, 2H, CH2Ar), 5.24 (s, 2H, C5-H), 5.50 (s, 2H, C17-H), 7.16 (s, 1H, C14-H), 7.21–7.38 (m, 6H, Ar-H,

C10-H), 7.81–7.91 (m, 1H, C11-H), 8.10 (d, J = 7.5 Hz, 1H, C9-H), 8.17 (d, J = 8.3 Hz, 1H, C12-H), 8.42 (t,

J = 5.8 Hz, 1H, NH), 8.66 (s, 1H, C7-H)

13C-NMR (DMSO-d6):

δ = 7.41 (C18), 30.30 (C19), 35.63 (CH2C(O)NH), 50.07 (C5), 66.21 (C17), 66.43, 69.00, 69.40, 69.52, 69.63,

69.68, 71.89 (OCH2, CH2NH), 76.10 (C20), 95.16, 118.84, 127.24, 127.36, 127.59, 127.84, 128.09, 128.42,

128.82, 129.61, 130.32, 131.44, 138.36, 144.98, 145.84, 147.78, 152.23, 156.38 (C2,3,6–16,16a, Ar),

166.97, 169.00, 170.56 (C21, C(O)OC20, C(O)NH)



2 3

56

78

9

10

11

1213

1415

1616a17

1819

2021

OO

OOH

N

N O

O

OO

NH

O

O

________________________________________

Camptothecin-20-[(12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoyl)glycinat] (40)

Zu einer Suspension von 39 (218 mg, 0.312 mmol) und 200 mg Palladium/Aktivkohle (10 % Pd) in 20 mL

Ethanol (abs.) gibt man unter Inertgasatmosphäre 1 mL Cyclohexen und erhitzt 16 Stunden unter Rückfluß.

Anschließend filtriert man die heiße Reaktionslösung über Celite und wäscht mit 50 mL Dichlormethan nach.

Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand aus 30 mL Ethanol umkristallisiert. Man erhält

116 mg (61 % d. Theorie) 40 als blaßgelbes Pulver.

1H-NMR (DMSO-d6):

δ = 0.94 (t, J = 7.5 Hz, 3H, C18-H), 2.17 (q, J = 7.5 Hz, 2H, C19-H), 2.32–2.45 (m, 2H, CH2C(O)NH), 3.29–

3.71 (m, 14H, NCH2CH2O, OCH2CH2O), 4.02/4.21 (dd, JAB = 18.1 Hz, JAX = 5.8 Hz, 2H, NHCH2CO), 4.56

(t, J = 5.5 Hz, 1H, OH), 5.23 (s, 2H, C5-H), 5.50 (s, 2H, C17-H), 7.15 (s, 1H, C14-H), 7.70 ('t', J = 7.0 Hz,

C10-H), 7.80–7.91 (m, 1H, C11-H), 8.09 (d, J = 7.5 Hz, 1H, C9-H), 8.16 (d, J = 8.3 Hz, 1H, C12-H), 8.43 (t,

J = 5.8 Hz, 1H, NH), 8.65 (s, 1H, C7-H)

13C-NMR (DMSO-d6):

δ = 7.43 (C18), 30.30 (C19), 35.62 (CH2C(O)NH), 50.05 (C5), 66.21 (C17), 66.43, 69.40, 69.51, 69.61, 69.66,

72.21 (OCH2, CH2NH), 76.10 (C20), 95.15, 118.84, 127.57, 127.82, 128.39, 128.80, 129.58, 130.31, 131.43,

144.98, 145.82, 147.76, 152.20, 156.37 (C2,3,6–16,16a), 166.97, 169.00, 170.58 (C21, C(O)OC20,

C(O)NH)


150 Experimentelles

4.2.4 Makromolekulare Bendamustin-Prodrugs

1a 2a

1b 2b

3

4 5

6

789

10

1112

1314N

N

CH3

N

Cl

Cl OO

N

O

O

O3

________________________________________

11-Maleinimido-3,6,9-trioxaundecyl-(1)-4-{1-Methyl-5-[bis-(2-chlorethyl)amino)]benzimidazolyl-

(2)}butanoat (41)

Eine Lösung von Bendamustin (400 mg, 1.01 mmol) in 10 mL wasserfreiem Dichlormethan wird bei 0 °C unter

Stickstoffatmosphäre mit Triethylamin (282 µL, 2.02 mmol) und DIPC (173 µl, 1.11 mmol) versetzt. Nach

10 min wird eine Lösung von 1 in 1 mL Dichlormethan (415 mg, 1.52 mmol) zugetropft und das

Reaktionsgemisch 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum

entfernt und der Rückstand durch Säulenchromatographie (Kieselgel, Chloroform/Methanol 50:1) gereinigt. Man

erhält 262 mg 41 (42 % d. Theorie) als gelbes Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 2.19 (tt, J1 = 7.5 Hz, J2 = 7.0 Hz, 2H, C12-H), 2.54 (t, J = 7.0 Hz, 2H, C13-H), 2.93 (t, J = 7.5 Hz, 2H, C11-

H), 3.56–3.76 (m, 25H, C1a,1b,2a,2b-H, NCH2CH2O, OCH2CH2O, C10-H), 4.22 (t, J = 4.7 Hz, 2H,

CH2OC=O), 6.68 (s, 2H, CH=CH), 6.78 (dd, J1 = 8.8 Hz, J2 = 2.3 Hz, 1H, C4-H), 7.08 (d, J = 2.3 Hz, 1H,

C8-H), 7.18 (d, J = 8.8 Hz, 1H, C5-H)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 22.54 (C12), 26.45 (C11), 29.77 (C10), 33.17 (C13), 37.10 (NCH2), 40.81 (C1a,1b), 54.84 (C2a,2b), 63.60

(CH2OC=O), 67.82, 69.08, 70.03, 70.53, 70.57, 70.61 (OCH2), 103.36 (C8), 109.72 (C4), 110.71 (C5),

129.61 (C6), 134.13 (C(O)CH=CHCO), 142.59 (C7), 143.59 (C3), 154.58 (C9), 170.62 (C(O)CH=CHCO),

173.14 (C14)

ESI-MS (4.0 kV, MeOH): m/z (%) 613.1 ([M+1]+, 100), 635.1 ([M+Na]+,13)


1a 2a

1b 2b

3

4 5

6

789

10

1112

1314N

NCH3

N

Cl

Cl OO

N

O

O

O5

________________________________________

17-Maleinimido-3,6,9,12,15-pentoxaheptadecyl-(1)-4-{1-Methyl-5-[bis-(2-

chlorethyl)amino)]benzimidazolyl-(2)}butanoat (42)

Zu einer Lösung von Bendamustin (421 mg, 1.07 mmol) in 10 mL wasserfreiem Dichlormethan werden

Triethylamin (149 µL, 1.07 mmol), BOP (346 mg, 0.78 mmol) und 2 (257 mg, 0.71 mmol) gegeben und die

entstandene Suspension fünf Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel im

Vakuum entfernt und der Rückstand säulenchromatographisch gereinigt (Kieselgel, Chloroform/Methanol

100:1). Man erhält 370 mg 42 (74 % der Theorie) als braunen Sirup.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 2.19 (tt, J1 = 7.7 Hz, J2 = 7.0 Hz, 2H, C12-H), 2.53 (t, J = 7.0 Hz, 2H, C13-H), 2.93 (t, J = 7.7 Hz, 2H, C11-

H), 3.55–3.78 (m, 33H, C1a,1b,2a,2b-H, NCH2CH2O, OCH2CH2O, C10-H), 4.23 (t, J = 4.7 Hz, 2H,

CH2OC=O), 6.69 (s, 2H, CH=CH), 6.79 (dd, J1 = 8.8 Hz, J2 = 1.8 Hz, 1H, C4-H), 7.08 (d, J = 1.8 Hz, 1H,

C8-H), 7.19 (d, J = 8.8 Hz, 1H, C5-H)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 22.55 (C12), 26.44 (C11), 29.80 (C10), 33.16 (C13), 37.13 (NCH2), 40.82 (C1a,1b), 54.86 (C2a,2b), 63.60

(CH2OC=O), 67.82, 69.09, 70.05, 70.54, 70.56, 70.61 (OCH2), 103.33 (C8), 109.76 (C4), 110.78 (C5),

129.56 (C6), 134.15 (C(O)CH=CHCO), 142.64 (C7), 143.48 (C3), 154.57 (C9), 170.66 (C(O)CH=CHCO),

173.15 (C14)

ESI-MS (4.0 kV, MeOH): m/z (%) 701.1 ([M+1]+, 100), 723.1 ([M+Na]+, 41), 665.1 ([M–Cl]+, 6)

152 Experimentelles

1a 2a

1b 2b

3

4 5

6

789

10

1112

1314N

NCH3

N

Cl

ClHN

NH

O

O

O

________________________________________

N-(Butoxycarbonyl)-N'-(4-{1-methyl-5-[bis-(2-chlorethyl)amino)]benzimidazolyl-(2)}butanoyl)hydrazin

(43)

Zu einer Suspension von Bendamustin (401 mg, 1.02 mmol) in 20 mL Dichlormethan wird unter

Stickstoffatmosphäre bei 0 °C Triethylamin (426 µL, 3.06 mmol), DIPC (142 mg, 3.06 mmol), DMAP (13 mg,

0.10 mmol) und Hydrazinoameisensäure-tert.-butylester (192 mg, 1.46 mmol) gegeben. Man läßt drei Stunden

bei Raumtemperatur rühren und entfernt anschließend das Lösungsmittel im Vakuum. Nach

säulenchromatographischer Reinigung des Rohprodukts (Kieselgel, Chloroform/Methanol 40:1) erhält man

336 mg 43 (70 % d. Theorie) als farblosen Feststoff.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 1.46 (s, 9H, C(CH3)3), 2.16 (tt, J1 = 7.0 Hz, J2 = 6.6 Hz, 2H, C12-H), 2.38 (t, J = 6.6 Hz, 2H, C13-H), 3.03

(t, J = 7.0 Hz, 2H, C11-H), 3.60−3.76 (m, 8H, C1a,1b,2a,2b-H), 3.68 (s, 3H, C10-H), 6.69 (bs, 1H, NH),

6.79 (dd, J1 = 8.9 Hz, J2 = 2.3 Hz, 1H, C4-H), 7.06 (d, J = 2.3 Hz, 1H, C8-H), 7.18 (d, J = 8.9 Hz, 1H, C5-

H), 9.20 (bs, 1H, NH)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 23.19 (C12), 25.45 (C11), 28.20 (C(CH3)3), 29.78 (C10), 32.45 (C13), 40.88 (C1a,1b), 54.80 (C2a,2b),

81.42 (C(CH3)3), 103.20 (C8), 109.87 (C4), 110.91 (C5), 129.42 (C6), 142.77 (C7), 143.13 (C3), 154.46

(C9), 155.59 (tBuOC=O), 172.58 (C14)

C21H31Cl2N5O3 [472.41]

Elementaranalyse: berechnet: C: 53.39 % H: 6.61 % N: 14.82 % Cl: 15.01 %

gefunden: C: 53.65 % H: 6.32 % N: 14.23 % Cl: 15.35 %

EI-MS (3.0 kV): m/z (%) 471.2 ([M–1]+, 17)


1a 2a

1b 2b

3

4 5

6

789

10

1112

1314N

NCH3

N

Cl

ClHN

NH3+

O CF3COO-

________________________________________

4-{1-Methyl-5-[bis-(2-chlorethyl)amino)]benzimidazolyl-(2)}butansäurehydrazid-Trifluoracetat (44)

Eine Lösung von 43 (400 mg, 0.85 mmol) in 5 ml Dichlormethan wird bei Raumtemperatur mit 3.5 ml

Trifluoressigsäure versetzt und zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel

im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wird ohne weitere Aufreinigung zur Umsetzung mit 5 für die Synthese

von 45 verwendet.

154 Experimentelles

1a 2a

1b 2b

3

4 5

6

789

10

1112

1314N

NCH3

N

Cl

ClHN

N

O

OO

N

O

O

2

________________________________________

11-Maleinimido-3,6,9-trioxaundecanal-4-{1-Methyl-5-[bis-(2-chlorethyl)amino)]benzimidazolyl-(2)}-

butanoylhydrazon (45)

Eine 10 %ige Lösung von 5 (1.36 ml, 0.500 mmol) in THF wird mit 44 (450 mg, 0.749 mmol) und 100 mg

aktiviertem pulverisiertem Molekularsieb (4 Å) versetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt.

Anschließend gibt man 1 g Amberlyst A-21 zu, läßt weitere 5 min rühren und filtriert über Celite. Nach

Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wird das Rohprodukt säulenchromatographisch (Kieselgel,

Chloroform/Methanol 25:1) gereinigt. Man erhält 45 mg 45 (11 % d. Theorie) als gelbes Öl.

1H-NMR (DMSO-d6):

δ = 1.94–2.09 (m, 2H, C12-H), 2.29 (t, J = 7.2 Hz, 2H, C13-H (Z)-Isomer), 2.63 (t, J = 7.2 Hz, 2H, C13-H (E)-

Isomer), 2.78–2.90 (m, 2H, C11-H), 3.40–3.61 (m, 12 H, NCH2, OCH2), 3.66 (s, 3H, C10-H), 3.71 (s, 8H,

C1a,1b,2a,2b-H), 3.98 (d, J = 5.3 Hz, 2H, CH2CH=N (E)-Isomer), 4.04 (d, J = 5.3 Hz, 2H, CH2CH=N (Z)-

Isomer), 6.78 (d, J = 8.7 Hz, 1H, C4-H), 6.92 (s, 1H, C8-H), 7.01 (s, 2H, C(O)CH=CHCO (E)-Isomer), 7.02

(s, 2H, C(O)CH=CHCO (Z)-Isomer), 7.27–7.38 (m, 2H, C5-H, CH2CH=N (E)-Isomer), 7.45 (t, J = 5.3 Hz,

1H, CH2CH=N (Z)-Isomer), 11.02 (s, 1H, NH (E)-Isomer), 11.16 (s, 1H, NH (Z)-Isomer)

13C-NMR (DMSO-d6):

δ = 21.52, 22.35 (C12 (E/Z)-Isomere), 25.72, 25.85 (C11 (E/Z)-Isomere), 29.28 (C10), 31.10, 33.06 (C13 (E/Z)-

Isomere), 36.68 (NCH2), 41.39 (C1a,1b), 53.41 (C2a,2b), 66.83, 69.27, 69.35, 69.41, 69.52, 69.57 (OCH2),

102.17 (C8), 109.72, 109.79 (C4 (E/Z)-Isomere), 109.99, 110.06 (C5 (E/Z)-Isomere), 129.25 (C6), 134.42

(C(O)CH=CHCO), 142.12, 142.79, 142.81, 143.28, 145.76 (CH2CH=N, (C7), (C3) (E/Z)-Isomere), 170.78

(C(O)CH=CHCO), 168.16, 173.70 (C14 (E/Z)-Isomere)

ESI-MS (4.0 kV, MeOH):

m/z (%) 625.1 ([M+1]+, 100), 647.1 ([M+Na]+, 46)


N

NH3C

N

Cl

Cl

O

N

NCH3

N

Cl

Cl

O

OO

n

________________________________________

Bendamustin-PEG35k-diester (46)

Eine Lösung von Bendamustin-Hydrochlorid (677 mg, 1.71 mmol), Triethylamin (238 µL, 1.71 mmol), DMAP

(104 mg, 0.86 mmol) und PEG35k (10.0 g, 0.286 mmol) in 100 mL Dichlormethan wird unter

Stickstoffatmosphäre bei 0 °C mit DIPC (265 µL, 1.71 mmol) versetzt und zunächst zwei Stunden bei 0 °C,

anschließend 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach tropft man das Reaktionsgemisch in 1000 mL

Diethylether, filtriert den Feststoff ab und kristallisiert zweimal aus jeweils 100 mL 2-Propanol um. Man erhält

9.00 g 46 (89 % d. Theorie) als farblosen Feststoff.

GPC (Durchführung auf HPLC-Anlage 1):

Säule: semianalytische Säule 300x15 mm gefüllt mit Sephadex® LH20, Laufmittel: Methanol, Fluß: 1 mL/min

Retentionszeiten: Bendamustin: 979 s, 46: 508 s, Chromatogramm zeigt kein Vorliegen von freiem Bendamustin

156 Experimentelles

4.2.5 Albuminbindende Platin(II)-Prodrugs

Br Br

OSi

________________________________________

1,3-Dibrom-2-tert.-butyldimethylsiloxypropan (47)

Zu einer Lösung von tert.-Butyldimethylchlorsilan (41.1 g, 265 mmol) und Imidazol (33.0 g, 485 mmol) in

200 mL wasserfreiem DMF wird eine Lösung von 1,3-Dibrom-2-propanol (50.6 g, 221 mmol) in 25 mL DMF

innerhalb zehn Minuten getropft. Man läßt über Nacht bei Raumtemperatur rühren, nimmt anschließend die

Reaktionsmischung in 800 mL Wasser auf und extrahiert dreimal mit jeweils 400 mL Dichlormethan. Die

vereinigten organischen Phasen werden dreimal mit jeweils 400 mL Wasser gewaschen und über

Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wird der Rückstand

säulenchromatographisch (Kieselgel, Isohexan) gereinigt. Man erhält 73.4 g (100 % d. Theorie) 47 als farbloses

Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 0.13 (s, 6H, Si(CH3)2), 0.91 (s, 9H, C(CH3)3), 3.46 (dd, J1 = 10.6 Hz, J2 = 4.9 Hz, 2H, CH2Br), 3.49 (dd,

J1 = 10.6 Hz, J2 = 5.3 Hz, 2H, CH2Br), 4.00 ('p', J = 5.1 Hz, 1H, CHOTBS)

13C-NMR (CDCl3):

δ = –4.63 (Si(CH3)2), 18.06 (C(CH3)3), 25.68 (C(CH3)3), 35.45 (CH2Br), 71.25 (CHOTBS)

C9H20Br2OSi [332.15]

Elementaranalyse: berechnet: C: 32.55 % H: 6.07 % Br: 48.11 %

gefunden: C: 32.33 % H: 6.32 % Br: 48.55 %


O O

O O

OCH3H3CO

OSi

________________________________________

Bis(4-methoxybenzyl)-3-tert.-butyldimethylsiloxycyclobutan-1,1-dicarboxylat (48)

Zu einer Suspension von Kaliumhydrid (35 % in Mineralöl) (2.10 g, 18.29 mmol) in 20 mL wasserfreiem

Dioxan wird unter Inertgasatmosphäre Bis(4-methoxybenzyl)malonat (6.00 g, 17.4 mmol) innerhalb 30 min

zugetropft. Man läßt weitere 15 min bei Raumtemperatur rühren, versetzt mit 47 (6.08 g, 18.29 mmol) und

erhitzt über Nacht unter Rückfluß. Zu der auf Raumtemperatur abgekühlten Reaktionsmischung wird

Kaliumhydrid (35 % in Mineralöl) (2.10 g, 18.29 mmol) als Suspension in 10 mL Dioxan langsam gegeben.

Anschließend wird zwei weitere Tage unter Rückfluß gerührt. Das gebildete Kaliumbromid wird über Celite

abfiltriert, das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand säulenchromatographisch (Kieselgel,

Ethylacetat/Isohexan 1:10 → 1:3) gereinigt. Man erhält 2.28 g 48 (26 % d. Theorie) als farbloses Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 0.01 (s, 6H, Si(CH3)2), 0.85 (s, 9H, C(CH3)3), 2.41–2.51 (m, 2H, CH2CHOTBS), 2.74–2.84 (m, 2H,

CH2CHOTBS), 3.79 (s, 6H, ArOCH3), 4.32 ('p', J = 7.3 Hz, 1H, CHOTBS), 5.04/5.06 (s, 4H, CH2Ar),

6.82/6.83 (d, J = 8.7 Hz, 4H, Ar-H), 7.17 (d, J = 8.7 Hz, 4H, Ar-H)

13C-NMR (CDCl3):

δ = –4.86 (Si(CH3)2), 17.92 (C(CH3)3), 25.75 (C(CH3)3), 40.84 (CH2CHOTBS), 45.90 (C(COOPMB)2), 55.23

(ArOCH3), 62.02 (CHOTBS), 66.95/67.09 (CH2Ar), 113.85/113.88, 127.57/127.65, 129.81/129.92,

159.61/159.64 (Ar), 170.80/171.74 (C=O)

C28H38O7Si [514.69]

Elementaranalyse: berechnet: C: 65.34 % H: 7.44 %

gefunden: C: 65.31 % H: 7.17 %

158 Experimentelles

O O

O O

OCH3H3CO

OH ________________________________________

Bis(4-methoxybenzyl)-3-hydroxycyclobutan-1,1-dicarboxylat (49)

Eine Lösung von 48 (2.69 g, 5.23 mmol) in 25 mL wasserfreiem THF wird mit Tetrabutylammoniumfluorid

(2.47 g, 7.85 mmol) versetzt und 15 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel im

Vakuum entfernt und der Rückstand säulenchromatographisch (Kieselgel, Ethylacetat/Isohexan 1:1) gereinigt.

Man erhält 1.85 g 49 (88 % d. Theorie) als farbloses Öl, das langsam kristallisiert.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 2.28–2.51 (m, 3H, CH2CHOH), 2.80–2.91 (m, 2H, CH2CHOH), 3.78 (s, 6H, ArOCH3), 4.33 ('p', J = 7.4 Hz,

1H, CHOH), 5.05 (s, 4H, CH2Ar), 6.82 (d, J = 8.5 Hz, 4H, Ar-H), 7.16/7.17 (d, J = 8.5 Hz, 4H, Ar-H)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 40.27 (CH2CHOH), 46.02 (C(COOPMB)2), 55.24 (ArOCH3), 62.22 (CHOH), 67.18 (CH2Ar), 113.92,

127.50, 129.91/129.95, 159.67 (Ar), 171.18/171.42 (C=O)

C22H24O7 [400.42]

Elementaranalyse: berechnet: C: 65.99 % H: 6.04 %

gefunden: C: 66.33 % H: 6.04 %


O

O

O

O

OCH3

OCH3

O OO

OO

O

N

O

O

________________________________________

Bis(4-methoxybenzyl)-3-(15-maleinimido-4,7,10,13-tetroxapentadecanoyl)cyclobutan-1,1-dicarboxylat (50)

Eine Lösung von 49 (1.154 g, 2.881 mmol), 27 (1.49 g, 4.32 mmol) und Triethylamin (1.20 mL, 8.64 mmol) in

20 mL wasserfreiem Dichlormethan wird mit 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid (1.10 g, 4.32 mmol) versetzt und

drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man verdünnt mit 80 mL Dichlormethan, wäscht jeweils zweimal mit

50 mL Salzsäure 1N, 50 mL Wasser sowie einmal mit 50 mL Natriumchloridlösung (ges.) und trocknet über

Magnesiumsulfat. Anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand

säulenchromatographisch (Kieselgel, Ethylacetat) gereinigt. Man erhält 1.93 g 50 (92 % d. Theorie) als farbloses

Öl.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 2.55 (t, J = 6.4 Hz, 2H, CH2COO), 2.56–2.66 (m, 2H, CH2CHOR), 2.89–2.99 (m, 2H, CH2CHOR), 3.57–

3.77 (m, 18H, NCH2, OCH2), 3.80 (s, 6H, ArOCH3), 5.00–5.13 (m, 1H, CHOR), 5.06/5.07 (s, 4H, CH2Ar),

6.69 (s, 2H, C(O)CH=CHCO), 6.83 (d, J = 8.7 Hz, 4H, Ar-H), 7.18 (d, J = 8.7 Hz, 4H, Ar-H)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 34.87 (CH2COO), 37.11 (NCH2, CH2CHOR), 47.04 (C(COOPMB)2), 55.24 (ArOCH3), 63.92 (CHOR),

66.57 (OCH2), 67.20/67.34 (CH2Ar), 67.80, 70.04, 70.42, 70.46, 70.53, 70.57, 70.61 (OCH2),

113.89/113.92, 127.33/127.42, 129.97 (Ar), 134.14 (C(O)CH=CHCO), 159.68/159.70 (Ar), 170.38, 170.65,

170.75, 170.86 (C(O)CH=CHCO, C(COOPMB)2, CH2COO)

160 Experimentelles

O OO

OO

O

N

O

O

HO

HO

O

O ________________________________________

3-(15-Maleinimido-4,7,10,13-tetroxapentadecanoyl)cyclobutan-1,1-dicarbonsäure (51)

Eine Lösung von 50 (1.94 g, 2.66 mmol) und Anisol (4.35 mL, 39.9 mmol) in 50 mL wasserfreiem

Dichlormethan wird bei 0 °C mit 10 mL Trifluoressigsäure versetzt und zwei Stunden bei 0 °C gerührt.

Anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand säulenchromatographisch

(Kieselgel, Chloroform/Methanol 10:1) gereinigt. Man erhält 1.15 g 51 (89 % d. Theorie) als farblosen Sirup.

1H-NMR (DMSO-d6):

δ = 2.35–2.56 (m, 4H, CH2CHOR, CH2COO), 2.68–2.83 (m, 2H, CH2CHOR), 3.32–3.66 (m, 18H, NCH2,

OCH2), 4.92 ('p', J = 7.3 Hz, 1H, CHOR), 7.02 (s, 2H, C(O)CH=CHCO)

13C-NMR (DMSO-d6):

δ = 34.40 (CH2COO), 36.49 (CH2CHOR), 36.73 (NCH2,), 46.32 (C(COOH)2), 63.33 (CHOR), 65.80, 66.86,

69.33, 69.58, 69.68, 69.71 (OCH2), 134.46 (C(O)CH=CHCO), 170.45, 170.82, 171.79, 172.42

(C(O)CH=CHCO, C(COOH)2, CH2COO)


m/z (%) 510.2 ([M+Na]+, 100)


N

O

OO

O

O

O

OCH3

OCH3

O

O

________________________________________

Bis(4-methoxybenzyl)-3-(6-maleinimidohexanoyl)cyclobutan-1,1-dicarboxylat (52)

Eine Lösung von 49 (1.40 g, 3.48 mmol), EMC (1.10 g, 5.22 mmol) und Triethylamin (1.46 mL, 10.5 mmol) in

25 mL wasserfreiem Dichlormethan wird mit 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid (1.34 g, 5.22 mmol) versetzt und

20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man verdünnt mit 80 mL Dichlormethan, wäscht jeweils zweimal mit

50 mL Salzsäure 1N, 50 mL Wasser sowie einmal mit 50 mL Natriumchloridlösung (ges.) und trocknet über

Magnesiumsulfat. Anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand

säulenchromatographisch (Kieselgel, Chloroform) gereinigt. Man erhält 1.53 g 52 (74 % d. Theorie) als

farbloses Öl, das langsam kristallisiert.

1H-NMR (CDCl3):

δ = 1.22–1.36 (m, 2H, CH2), 1.52–1.74 (m, 4H, CH2), 2.24 (t, J = 7.2 Hz, CH2COO), 2.53–2.64 (m, 2H,

CH2CHOR), 2.88–2.99 (m, 2H, CH2CHOR), 3.50 (t, J = 7.4 Hz, 2H, NCH2), 3.80 (s, 6H, ArOCH3), 4.97–

5.10 (m, 5H, CHOR, CH2Ar), 6.67 (s, 2H, C(O)CH=CHCO), 6.83 (d, J = 8.3 Hz, 4H, Ar-H), 7.18 (d,

J = 8.3 Hz, 4H, Ar-H)

13C-NMR (CDCl3):

δ = 24.24 (CH2), 26.22 (CH2), 28.18 (CH2), 33.84 (CH2COO), 37.17 (CH2CHOR), 37.60 (NCH2), 47.12

(C(COOPMB)2), 55.26 (ArOCH3), 63.77 (CHOR), 67.22/67.35 (CH2Ar), 113.91/113.95, 127.37/127.47,

129.97/130.06 (Ar), 134.07 (C(O)CH=CHCO), 159.70/159.73 (Ar), 170.44, 170.82, 170.89, 172.62

(C(O)CH=CHCO, C(COOPMB)2, CH2COO)

C32H35NO10 [593.63]


gefunden: C: 64.40 % H: 5.66 % N: 2.33 %

162 Experimentelles

N

O

OO

O

HO

HO

O

O

________________________________________

3-(6-Maleinimidohexanoyl)cyclobutan-1,1-dicarbonsäure (53)

Eine Lösung von 52 (1.433 g, 2.414 mmol) und Anisol (3.92 mL, 36.2 mmol) in 50 mL wasserfreiem

Dichlormethan wird bei 0 °C mit 10 mL Trifluoressigsäure versetzt und zwei Stunden bei 0 °C gerührt.

Anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand säulenchromatographisch

(Kieselgel, Chloroform/Methanol 10:1) gereinigt. Man erhält 301 mg 53 (35 % d. Theorie) als farblosen Sirup.

1H-NMR (DMSO-d6):

δ = 1.13–1.27 (m, 2H, CH2), 1.41–1.58 (m, 4H, CH2), 2.26 (t, J = 6.8 Hz, CH2COO), 2.35–2.47 (m, 2H,

CH2CHOR), 2.70–2.83 (m, 2H, CH2CHOR), 3.38 (t, J = 7.4 Hz, 2H, NCH2), 4.90 ('p', J = 7.4 Hz, 1H,

CHOR), 7.00 (s, 2H, C(O)CH=CHCO), 12.97 (bs, 2H, COOH)

13C-NMR (DMSO-d6):

δ = 23.67 (CH2), 25.37 (CH2), 27.48 (CH2), 32.99 (CH2COO), 36.52 (CH2CHOR), 36.77 (NCH2), 46.29

(C(COOH)2), 63.18 (CHOR), 134.34 (C(O)CH=CHCO), 170.96, 171.80, 172.08, 172.42 (C(O)CH=CHCO,

C(COOH)2, CH2COO)


O OO

OO

O

N

O

O

O

O

O

OPt

H2N

NH2

________________________________________

trans-(R,R/S,S)-Cyclohexan-1,2-diaminoplatin(II)-[3-(15-maleinimido-4,7,10,13-

tetroxapentadecanoyl)cyclobutan-1,1-dicarboxylat] (54)

Zu einer auf Raumtemperatur abgekühlten wäßrigen Lösung von [Pt trans-DACH](NO3)2 (175 mg, 405 µmol),

die man durch Erhitzen (50 °C) des Platinkomplexes mit 30 mL Wasser erhält, wird eine Lösung von 51

(217 mg, 445 µmol) in 5 mL Wasser gegeben. Die Reaktionsmischung wird mit 0.1 M KOH auf pH 5.5

eingestellt und drei Stunden bei Raumtemperatur in der Dunkelheit gerührt. Anschließend engt man im Vakuum

auf ca. 5 mL ein und zentrifugiert den Niederschlag ab. Der Überstand wird durch präparative HPLC (Anlage 1,

Nucleosil® 100-7-C18-Säule (250x15 mm), Wasser/Acetonitril 80:20 + 0.05 % TFA, Fluß: 20 mL/min,

Retentionszeit: ca. 20 min) gereinigt. Nach Entfernen des Laufmittels im Vakuum und Kristallisation des Rück-

standes durch Zugabe von ca. 1 mL 2-Propanol erhält man 60 mg 54 (19 % d. Theorie) als farblosen Feststoff.

1H-NMR (D2O, geeicht auf Aceton δ ≡ 2.20 ppm):

δ = 0.98–1.35 (m, 4H, Cyclohexyl-H), 1.44–1.62 (m, 2H, Cyclohexyl-H), 1.94–2.06 (m, 2H, Cyclohexyl-H),

2.28–2.48 (m, 2H, Cyclohexyl-H), 2.66 (t, J = 6.0 Hz, CH2COO), 2.80–2.93 (m, 2H, CH2CHOR), 3.34–3.50

(m, 2H, CH2CHOR), 3.54–3.84 (m, 18H, NCH2, OCH2), 4.93 ('p', J = 7.1 Hz, 1H, CHOR), 6.85 (s, 2H,

C(O)CH=CHCO)

13C-NMR (D2O, geeicht auf Aceton):

δ = 24.30 (Cyclohexyl), 32.22 (Cyclohexyl), 34.91 (CH2COO), 37.37, 38.54, 38.72 (CH2CHOR, NCH2,

Cyclohexyl), 50.71 (C(COOH)2), 63.05 (CHOR), 65.37, 66.52, 68.02, 69.73, 69.97, 70.01 (OCH2), 134.86

(C(O)CH=CHCO), 173.39, 174.11 (C(O)CH=CHCO, CH2COO), 180.30, 180.47 (C(COOH)2)

195Pt-NMR (D2O):

δ = –311

IR (KBr):

ν = 3448 (ss, b), 2934 (w, b), 1709 (ss), 1627 (s), 1353 (m), 1094 (ss, b), 696 (w) cm–1


m/z (%) 816.9 ([M+Na]+, 100)

C27H41N3O12Pt [794.71]


gefunden: C: 39.88 % H: 5.16 % N: 5.08 %

164 Experimentelles

N

O

O

O

OO

O

O

OPt

H2N

NH2

________________________________________

trans-(R,R/S,S)-Cyclohexan-1,2-diaminoplatin(II)-[3-(6-maleinimidohexanoyl)cyclobutan-1,1-

dicarboxylat] (55)

Zu einer auf Raumtemperatur abgekühlten wäßrigen Lösung von [Pt trans-DACH](NO3)2 (263 mg, 607 µmol),

die man durch Erhitzen (50 °C) des Platinkomplexes mit 30 mL Wasser erhält, wird eine Lösung von 53

(236 mg, 668 µmol) in 5 mL 0.01 M KOH gegeben. Die Reaktionsmischung wird mit 0.1 M KOH auf pH 5.5

eingestellt und drei Stunden bei Raumtemperatur in der Dunkelheit gerührt. Anschließend kühlt man auf 0 °C

und zentrifugiert den entstandenen farblosen Niederschlag ab. Dieser wird zweimal mit jeweils 5 mL Wasser

gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 269 mg 55 (67 % d. Theorie) als farbloses Pulver.

1H-NMR (Methanol-d4):

δ = 1.11–1.41 (m, 6H, CH2, Cyclohexyl-H), 1.50–1.70 (m, 6H, CH2, Cyclohexyl-H), 1.93–2.06 (m, 2H,

Cyclohexyl-H), 2.19–2.40 (m, 4H, CH2COO, Cyclohexyl-H), 2.70–2.81 (m, 2H, CH2CHOR), 3.36–3.46 (m,

2H, CH2CHOR), 3.50 (t, J = 7.4 Hz, 2H, NCH2), 6.81 (s, 2H, C(O)CH=CHCO)

13C-NMR (Methanol-d4):

δ = 25.44, 25.55, 27.17, 29.18 (CH2, Cyclohexyl), 33.25 (Cyclohexyl), 34.78 (CH2COO), 38.34, 39.94, 40.07

(CH2CHOR, NCH2, Cyclohexyl), 51.27 (C(COOH)2), 63.86 (CHOR), 135.38 (C(O)CH=CHCO), 172.64,

174.83 (C(O)CH=CHCO, CH2COO), 180.50, 180.78 (C(COOH)2)


m/z (%) 1343.5 ([2*M+Na]+, 100), 1321.6 ([2*M]+, 22), 683.3 ([M+Na]+, 35), 661.3 ([M]+, 30)

C22H31N3O8Pt [660.58]


gefunden: C: 39.45 % H: 4.56 % N: 5.91 %

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176 Anhang

Anhang

Berechnung der Zusammensetzung von Produktgemischen aus der

unvollständigen Umsetzung homopolyfunktioneller Verbindungen anhand

des Beladungsfaktors

Erreicht man bei der Reaktion einer n-funktionellen Verbindung A (deren funktionelle

Gruppen einen genügend großen Abstand voneinander aufweisen müssen, um sich

gegenseitig in ihrer Reaktivität nicht zu beeinflussen), mit einer monofunktionellen

Komponente B keinen vollständigen Umsatz, so läßt sich die Zusammensetzung des

erhaltenen Produktgemisches (A, AB, ... , ABn) anhand des Beladungsfaktors mit Hilfe einer

einfachen statistischen Betrachtung berechnen.

Der Beladungsfaktor m des Gemisches ist definiert als die mittlere Anzahl der Moleküle

B pro Molekül der n-funktionellen Verbindung A, so daß stets gilt: m ≤ n. Der Quotient

m / n ≡ a gibt die relative Beladung wieder, d. h. den Umsatz pro funktioneller Gruppe von A.

Demzufolge beschreibt 1–a den Anteil an funktionellen Gruppen, welche nicht reagiert

haben. Wählt man aus der Gesamtheit der funktionellen Gruppen des Gemisches genau eine

Funktionalität aus, so beschreibt a die Wahrscheinlichkeit für den Fall einer erfolgten

Reaktion mit B (bzw. 1–a die Wahrscheinlichkeit für den Fall, daß keine Reaktion stattfand).

Daraus läßt sich der Anteil der Einzelkomponenten des Gemisches x(ABi) mit

berechnen:

1)AB(0

=∑=

n

iix

inii aa

in

x −−

= )1()AB(

Für den einfachen Fall eines homobifunktionellen Moleküls A (z. B. PEG) ergibt sich damit:

x(A) = (1–a)2 x(AB) = 2 a (1–a) x(AB2) = a2

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Maleinimid-funktionalisierte wasserlösliche Derivate