Dissertation.22.11.11 - elib.tiho-hannover.de · induzierte reproduzierbar eine Bronchopneumonie, die innerhalb des Untersuchungszeitraums von fünf Wochen abheilte (LAMBERTZ 2011)

Tierärztliche Hochschule Hannover

__________________________________________________

Wirts-Erreger-Interaktionen im Respirationstrakt von Kälbern nach

experimenteller aerogener Infektion mit Chlamydia psittaci

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae –

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Katja Möhle

aus Berlin

Hannover 2011

Wissenschaftliche Betreuung: Apl.-Prof. Dr. E. Liebler-Tenorio

Institut für Molekulare Pathogenese

Friedrich-Loeffler-Institut

1. Gutachterin: Apl.-Prof. Dr. E. Liebler-Tenorio

2. Gutachter: Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein

Tag der mündlichen Prüfung: 22.11.2011

Meiner Familie und Valerie

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG............................................................................................. 13

2 LITERATURÜBERSICHT ....................................................................... 15

2.1 Chlamydien ................................................................................................................... 15

2.1.1 Taxonomische Einordnung .................................................................................. 15

2.1.2 Erkrankungen als Folge von Chlamydieninfektionen .......................................... 17

2.1.3 Chlamydialer Entwicklungszyklus ....................................................................... 18

2.1.4 Morphologie der Entwicklungsstadien ................................................................. 20

2.1.5 Zellwand der Chlamydien .................................................................................... 21

2.1.6 Parasitophore Vakuole ......................................................................................... 23

2.1.7 Besonderheiten von Chlamydia psittaci ............................................................... 24

2.1.8 Immunpathogenese von Chlamydieninfektionen ................................................. 25

2.2 Respirationstrakt des Rindes ......................................................................................... 27

2.2.1 Anatomischer und histologischer Aufbau von Trachea und Lunge ..................... 27

2.2.1.1 Ultrastruktur der Alveolen ........................................................................... 30

2.2.2 Histologischer und zellulärer Aufbau der Tonsille .............................................. 31

2.2.3 Histologischer und zellulärer Aufbau des Lymphknotens ................................... 32

2.3 Lymphgewebe und Immunzellen im Respirationstrakt des Rindes .............................. 33

2.3.1 Verteilung von Schleimhaut-assoziiertem Lymphgewebe (MALT) .................... 33

2.3.2 Verteilung, Morphologie und Charakteristika von BALT ................................... 34

2.3.3 Verteilung von Immunzellen in der Lunge des Rindes (außer BALT) ................ 36

2.3.4 Morphologie, Funktion und für die immunhistologische Darstellung gewählte

Epitope der Immunzellen in der Lunge des Rindes ............................................. 37

2.3.4.1 Makrophagen ................................................................................................ 37

2.3.4.2 Neutrophile Granulozyten ............................................................................ 39

2.3.4.3 Dendritische Zellen ...................................................................................... 40

2.3.4.4 T-Lymphozyten ............................................................................................ 42

2.3.4.5 B-Lymphozyten, Plasmazellen und Immunglobulin .................................... 44

2.3.4.6 Interleukin-2 Rezeptor+ Zellen .................................................................... 46

INHALTSVERZEICHNIS

3 MATERIAL UND METHODEN ............................................................. 47

3.1 Versuchsdesign ............................................................................................................. 47

3.2 Eigene Untersuchungen ................................................................................................ 48

3.2.1 Selektion der Versuchstiere .................................................................................. 48

3.2.2 Asservieren des Untersuchungsmaterials ............................................................. 49

3.2.3 Selektion des Untersuchungsmaterials ................................................................. 50

3.2.3.1 Histologische und immunhistologische Untersuchung der Kontrolltiere .... 50

3.2.3.2 Histologische und immunhistologische Untersuchung bei den mit C. psittaci

inokulierten Kälbern .................................................................................... 51

3.2.3.3 Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung ............................. 52

3.2.4 Immunhistologische Untersuchung ...................................................................... 54

3.2.4.1 Allgemeines .................................................................................................. 54

3.2.4.2 Herstellung der Gefrierschnitte .................................................................... 55

3.2.4.3 H.E. - Übersichtsfärbung .............................................................................. 55

3.2.4.4 Primärantikörper ........................................................................................... 56

3.2.4.5 Durchführung der immunhistologischen Markierung .................................. 57

3.2.4.6 Durchführung der immunhistologischen Doppelmarkierung ...................... 59

3.2.4.7 Auswertung und Dokumentation ................................................................. 60

3.2.5 Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung ..................................... 63

3.2.5.1 Vorbehandlung paraffineingebetteter Gewebe ............................................. 63

3.2.5.2 Einbettung in Araldite CY212 ...................................................................... 64

3.2.5.3 Anfertigung von Semidünnschnitten ............................................................ 65

3.2.5.4 Anfertigung von Ultradünnschnitten ............................................................ 65

3.2.5.5 Nachkontrastierung mit Uranylazetat und Bleizitrat .................................... 66

3.2.5.6 Einbettung in LR-White ............................................................................... 66

3.2.5.7 Indirekte Immunogoldmarkierung an Ultradünnschnitten ........................... 67

3.2.5.8 Auswertung und Dokumentation ................................................................. 68

4 ERGEBNISSE............................................................................................. 69

4.1 Immunhistologische Untersuchung .............................................................................. 69

4.1.1 Kontrollkälber ...................................................................................................... 70

4.1.1.1 Verteilung und Menge der Leukozytensubtypen in der Lunge .................... 70

INHALTSVERZEICHNIS

4.1.1.2 Quantitative Auswertung von CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten ....... 81

4.1.1.3 BALT ........................................................................................................... 82

4.1.1.4 Trachea ......................................................................................................... 88

4.1.1.5 Tonsilla pharyngea ....................................................................................... 88

4.1.1.6 Nl. mediastinalis ........................................................................................... 90

4.1.2 Kälber inokuliert mit C. psittaci ........................................................................... 92

4.1.2.1 Semiquantitative Auswertung von C. psittaci .............................................. 92

4.1.2.2 Verteilung und Menge der Leukozytensubtypen und Chlamydien in der

Lunge am Tag 2 pi ....................................................................................... 95

4.1.2.3 Verteilung und Menge der Leukozytensubtypen und von Chlamydien in der

Lunge am Tag 3 und 4 pi ........................................................................... 104


Lunge am Tag 7 und 10 pi ......................................................................... 112


Lunge am Tag 14 pi ................................................................................... 122


Lunge am Tag 35/37 dpi ............................................................................ 128

4.1.2.7 BALT ......................................................................................................... 133

4.1.2.8 Quantitative Auswertung von CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten in der

Lunge ......................................................................................................... 135

4.1.2.9 Nl. mediastinalis ......................................................................................... 139

4.1.2.10 Tonsilla pharyngea ..................................................................................... 142

4.2 Ultrastrukturelle Ergebnisse ........................................................................................ 144

4.2.1 Kontrollkälber .................................................................................................... 144

4.2.2 Kälber inokuliert mit C. psittaci ......................................................................... 148

4.2.2.1 Lungenveränderungen nach der Inokulation mit C. psittaci an den Tagen 2,

3, 4, 7 und 10 pi ......................................................................................... 148

4.2.2.2 Morphologie von C. psittaci in der Lunge ................................................. 152

5 DISKUSSION ........................................................................................... 164

6 ZUSAMMENFASSUNG .......................................................................... 180

7 SUMMARY ............................................................................................... 182

INHALTSVERZEICHNIS

8 LITERATURVERZEICHNIS ................................................................ 184

9 ANHANG .................................................................................................. 215

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS


A Alveole

Abb. Abbildung

AEC Alveolarepithelzelle

AG Aktiengesellschaft

AP Alkalische Phosphatase

APC professionelle antigenpräsentierende Zelle

Aqua dest. destilliertes Wasser

B Bronchus

BALT Bronchus-assoziiertes lymphatisches Gewebe

BAL bronchoalveoläre Lavage

BALF bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit

BCR B-Zellrezeptor

BGM Buffalo green monkey

bidest. bidestillatus

BM Basalmembran

Br Bronchiolus

BSA Bovines Serum Albumin

bzw. beziehungsweise

C. Chlamydia

CAP ambulant erworbene Pneumonie (community acquired pneumonia)

CD Cluster of differentiation

cm Zentimeter

Cp. Chlamydophila

Da Dalton

DAB Diaminobenzidintetrachloriddihydrat

DC dendritische Zelle

DNA Desoxyribonukleinsäure

DPBS Dulbecco´s Phosphat gepufferte Salzlösung

dpi Tage nach der Inokulation

EBE Einschluss-bildende Einheit


E.coli Escherichia coli

EK Elementarkörperchen

Env. Hülle

ER endoplasmatisches Retikulum

Fa. Firma

FAE Follikel-assoziiertes Epithel

FDC follikulär dendritische Zelle

G Blutgefäß

GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung

h Stunde

HE Hämatoxilin-Eosin

HEV hochendotheliale Venole

HF Holstein Friesian

HRP Meerrettichperoxidase

HSP Hitze Schock Protein

I Interstitium

Inc. Einschluss

IAS Interalveolarseptum

IEM Immunelektronenmikroskopie

IFZ Interfollikularzone

Ig Immunglobulin

IL Interleukin

i.v. intra venös

IK Intermediarkörperchen

Kap. Kapitel

kDa Kilodalton

KDO 2-Keto-3-Desoxyoctonat

kg Kilogramm

l Liter

LGV Lymphogranuloma venereum

LMM Lamina muscularis mucosae

Lp Lamina propria mucosae

LPS Lipopolysaccharid


m männlich

M. Mycoplasma

mAb monoklonaler Antikörper

MALT Schleimhaut-assoziiertes Lymphgewebe

Max Maximum

Mbp Megabasenpaare

mg Milligramm

MHC Haupthistokompatibilitätskomplex

min Minute

Min Minimum

ml Milliliter

mm Millimeter

Mol Stoffmenge

MOMP hauptsächliches äußeres Membranprotein

Nl./Nll. Nodulus lymphaticus/ Noduli lymphatici

Nr. Nummer

Omp äußere Membranproteine

pi nach der Inokulation (lat. post inoculationem)

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung

PIM intravaskulärer Makrophage

PMN polymorphkerniger neutrophiler Granulozyt

pIgR polymerer Immunglobulinrezeptor

RB rotbunt

rER raues Endoplasmatisches Retikulum

RK Retikularkörperchen

RT Raumtemperatur

ROI Messfeld (region of interest)

ROS reaktive Sauerstoffspezies

SB schwarzbunt

S-P Surfactantprotein

SM Submukosa

sp. Spezies

SPGA Sucrose-Phosphat-Glutamat-Albumin


spp. Spezies

SRCR Scavangerrezeptor

Tab. Tabelle

TCR T-Zellrezeptor

TGF transformierender Wachstumsfaktor

TEM Transmissionselektronenmikroskopie

Th T-Helferzelle

TLLS Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz

TM Tunica muscularis mucosae

TNF Tumornekrosefaktor

TS Teilstrich

SM Submukosa

u. und

u. a. unter anderem

unv. unverdünnt

WC Workshop Cluster

VCAM vaskuläres Zelladhäsionsmolekül

verd. verdünnt

°C Grad Celsius

µ mikro

µl Mikroliter

µm Mikrometer

nm Nanometer

% Prozent

§ Paragraf

13 EINLEITUNG

1 EINLEITUNG

Natürliche Infektionen mit Chlamydien treten weltweit bei Mensch und Tier auf

(LONGBOTTOM u. COULTER 2003). Sie verlaufen oft subklinisch, was dazu führt, dass

die Bedeutung des Erregers vielfach unterschätzt wird (HARKINEZHAD et al. 2007;

ROHDE et al. 2010). Chlamydia (C.) psittaci ist ein gram-negatives, obligat intrazelluläres

Bakterium, das sich biphasisch vermehrt und der Ordnung Chlamydiales angehört (KUO et al.

2011). Die Ordnung umfasst Erreger, die pathogen für Mensch und Tier sind

(LONGBOTTOM u. COULTER 2003). Als Reservoir für C. psittaci gelten Zier- und

Wildvögel (KALETA u. TADAY 2003). C. psittaci ist ein Zoonoseerreger, der beim

Menschen neben subklinischen Infektionen schwerwiegende Erkrankungen, wie Endokarditis,

Hepatitis und Enzephalitis verursachen kann (CARR-LOCKE u. MAIR 1976; SHEE 1988;

NEWMAN et al. 1992; VANROMPAY et al. 1995; BEECKMAN u. VANROMPAY 2009;

FRAEYMAN et al. 2010). Das Rind ist neben anderen Chlamydienspezies (C. pecorum,

C. abortus und C. suis), auch empfänglich für C. psittaci (JEE et al. 2004; REINHOLD u.

SACHSE 2004; PANTCHEV et al. 2010). Die Infektion mit C. psittaci verursacht beim Rind

Erkrankungen des Respirationstrakts und des Intestinaltrakts, wobei auch hier häufig von

inapparenten Verläufen berichtet wird (RONSHOLT 1978; REGGIARDO et al. 1989;

WITTENBRINK et al. 1993; JEE et al. 2004; TWOMEY et al. 2006).

Da bislang unklar ist, ob eine Übertragung des Zoonoseerregers C. psittaci vom Rind auf den

Menschen möglich ist, wurde ein Infektionsmodell an Kälbern zur Charakterisierung der

respiratorischen Erkrankungen und der Erregerausscheidung etabliert. Es wurden 21 Kälber

mit C. psittaci (DC15) intrabronchial inokuliert (OSTERMANN et al. 2010). Der Erreger

induzierte reproduzierbar eine Bronchopneumonie, die innerhalb des Untersuchungszeitraums

von fünf Wochen abheilte (LAMBERTZ 2011). Als Vergleich dienten 21 Kontrollkälber, die

ein steriles Inokulum erhielten. In der vorliegenden Arbeit stand Organmaterial dieser Tiere

für die Untersuchungen zur Verfügung. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die am

Immungeschehen beteiligten Zelltypen während des Infektionsverlaufs mit C. psittaci zu

charakterisieren. Da sich C. psittaci intrazellulär in einer membranumhüllten Vakuole

vermehrt, ist anzunehmen, dass die zellulär vermittelte Immunantwort, insbesondere in Form

von zytotoxischen T-Lymphozyten, entscheidend an der Elimination des Erregers beteiligt ist.

In der Untersuchung wurden neutrophile Granulozyten, CD1b+ dendritische Zellen,

EINLEITUNG 14

Makrophagen, MHC II+ Zellen sowie CD4+, CD8+ und γδ+ T- Lymphozyten aber auch

IgG1+, IgM+ und IgA+ B-Lymphozyten und Plasmazellen in Lunge, Nl. mediastinalis und

Tonsilla pharyngea an konsekutiven Zeitpunkten (Tag 2, 3, 4, 7, 10, 14 und 35/37 nach der

Inokulation) einbezogen. Da von gesunden Kälbern nur wenige Studien zur Verteilung von

Leukozytenpopulationen in der Lunge vorliegen, wurde die Verteilung der oben genannten

Leukozytensubpopulationen in Lunge, Trachea, Tonsilla pharyngea und Nl. mediastinalis von

klinisch gesunden Kälbern untersucht (ALLAN et al. 1979; ANDERSON et al. 1986a, b;

THOMASMEYER 2006).

Ultrastrukturell lassen sich verschiedene Entwicklungsstadien der Chlamydien unterscheiden.

Zudem kann mit dieser Methode die Bildung aberranter Chlamydienstadien nachgewiesen

werden, von denen angenommen wird, dass sie über lange Zeit im Körper verbleiben

(HAMMERSCHLAG et al. 1992; BEATTY et al. 1994; HOGAN et al. 2004; GOELLNER et

al. 2006). Der Nachweis dieser Stadien in vivo ist jedoch selten (POSPISCHIL et al. 2009). In

der vorliegenden Arbeit sollte ergänzend zu den immunhistologischen Methoden die

transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung Aufschluss über die Wirts-Erreger-

Interaktionen geben. Neben der Morphologie von C. psittaci waren seine Zielzellen und

subzelluläre Reaktionen nach der Infektion von Interesse.

15 LITERATURÜBERSICHT


In der vorliegenden Arbeit wurden die pathogenetischen Abläufe nach intrapulmonaler

Infektion von Kälbern mit C. psittaci untersucht. Daher werden in der Literaturübersicht

zunächst Chlamydien, insbesondere C. psittaci und durch sie verursachte Erkrankungen

vorgestellt. Danach wird die Anatomie, Histologie und Ultrastruktur des Respirationstrakts

des Rindes beschrieben. Schließlich wird die Morphologie und Funktion der Zellen

dargestellt, die an einer natürlichen und adaptiven Immunabwehr beteiligt sind.

2.1 Chlamydien

2.1.1 Taxonomische Einordnung

Die Bakterien der Familie Chlamydiaceae (gr. Chlamys-Mantel) sind obligat intrazellulär

lebend, gram-negativ und unbeweglich. Sie zeigen einen einzigartigen Vermehrungszyklus

und werden deshalb einer separaten Ordnung, den Chlamydiales, zugeordnet (STORZ u.

PAGE 1971). Zunächst umfasste die Ordnung eine Familie Chlamydiaceae, mit einem Genus

Chlamydia und zwei Spezies C. trachomatis und C. psittaci (TAMURA et al. 1971).

C. trachomatis wurde lediglich beim Menschen isoliert, wies Glykogenansammlungen im

Einschluss auf und unterschied sich aufgrund seiner Folatsynthese von C. psittaci. Die

Etablierung DNA-basierter Klassifizierungsmethoden nach 1980 ermöglichte die Zuordnung

weiterer Stämme. Zugefügt wurden C. pneumoniae, C. pecorum und Chlamydia trachomatis-

ähnliche Chlamydien, die beim Schwein entdeckt wurden (GRAYSTON et al. 1989;

FUKUSHI u. HIRAI 1992; KALTENBOECK et al. 1993).

Erkenntnisse aus Genomanalysen führten 1999 zu einer Wende in der Taxonomie der

Chlamydiales (Tab. 1). Aufgrund von Übereinstimmungen im 16S und 23S rRNA Gen

wurden weitere Bakterienfamilien Parachlamydiaceae, Simkaniaceae und Waddliaceae

zugefügt (EVERETT et al. 1999). Die Erreger dieser Bakterienfamilien vermehren sich

chlamydienspezifisch, zeigen jedoch Unterschiede in Genom und Färbeverhalten. Dies erklärt

die Einordnung in verschiedene Familien. Bakterien der Familie Chlamydiaceae sind

gekennzeichnet durch die einzigartige Sequenz ihres LPS-Trisaccharids αKdo- (2�8) αKdo-

(2�4) αKdo (KOSMA 1999). Neben dem Genus Chlamydia, das die Spezies C. trachomatis,

C. suis und C. muridarum enthielt, wurde das Genus Chlamydophila (Cp.) etabliert, das die

Spezies umfasste, die sich von C. trachomatis unterschieden. Diese synthetisierten kein

LITERATURÜBERSICHT 16

Glykogen, variierten in Morphologie und Sulfadiazinresistenz und wiesen mit 1,2 Mbp ein

geringfügig größeres Genom auf. Die Spezies Cp. psittaci wurde enger gefasst und auf die

aviären Stämme beschränkt. Die ihnen im Vorfeld zugeordneten Abort-, Katzen- und

Meerschweinchenstämme erhielten eigenständige Speziesbezeichnungen, sodass im Genus

Chlamydophila folgende Spezies unterschieden wurden Cp. abortus, Cp. psittaci, Cp. felis,

Cp. caviae, Cp. pneumoniae und Cp. pecorum (EVERETT et al. 1999).

Da die Neuordnung biologische Zusammengehörigkeiten außer Acht ließ, folgte eine

abermalige taxonomische Neuordnung (SCHACHTER et al. 2001; STEPHENS et al. 2009).

Aktuell sind acht Familien in der Ordnung Chlamydiales enthalten: Chlamydiaceae,

Clavichlamydiaceae, Criblamydiaceae, Parachlamydiaceae, Piscichlamydiaceae,

Rhabdochlamydiaceae, Simkaniaceae und Waddliaceae (KUO et al. 2011). Die seit 2011

gültige Taxonomie sieht keine Trennung in zwei Chlamydiengenera vor, sodass lediglich das

Genus Chlamydia bestehen blieb. Ihm wurden alle neun Chlamydia sp. untergeordnet.

Tab. 1: Taxonomie der Chlaymdiaceae im zeitlichen Verlauf und Wirtsspektrum der

Chlamydienspezies

Taxonomie 1980-1999

Taxonomie nach EVERETT et al.

(1999)

Taxonomie nach KUO et al. (2011)

Wirtsspektrum nach

KERR et al. (2005)

C. trachomatis C. trachomatis C. trachomatis Mensch

C. suis C. suis Schwein C. muridarum C. muridarum Maus, Hamster

C. psittaci Cp. abortus C. abortus Wiederkäuer,

Schwein Cp. psittaci C. psittaci Vogel, Geflügel Cp. felis C. felis Katze Cp. caviae C. caviae Meerschweinchen

C. pneumoniae Cp. pneumoniae C. pneumoniae Mensch

C. pecorum Cp. pecorum C. pecorum Wiederkäuer,

Schwein


2.1.2 Erkrankungen als Folge von Chlamydieninfektionen

Chlamydien verursachen vielfältige Krankheitsbilder bei Mensch und Tier, beinhalten

Zoonoseerreger und werden deshalb als bedeutende Infektionserreger angesehen

(LONGBOTTOM u. COULTER 2003).

Die Spezies C. trachomatis verursacht Erkrankungen beim Menschen und lässt sich aufgrund

von Gewebetropismus, Pathogenität und biologischem Verhalten in der Zellkultur in das

okuläre, genitale und Lymphogranuloma venereum (LGV) Biovar unterteilen (MOULDER et

al. 1984). Entsprechend der ompA-Sequenzierung sind 18 Serovare zu unterscheiden. Neben

dem Trachom, das durch die Serovare A bis C verursacht wird, kommt es durch die Serovare

D bis K zu den weltweit verbreiteten sexuell übertragbare Krankheiten. Die WHO schätzte

die Prävalenz von venerisch übertragenen C. trachomatis auf 90 Millionen Neuinfektionen

pro Jahr und machte damit auf ihre globale Bedeutung aufmerksam (WHO 1996). Die Erreger

des LGV Biovars verursachen systemische Erkrankungen.

C. pneumoniae umfasst das humane, Koala und equine Biovar. C. pneumoniae ist primär ein

respiratorisches Pathogen des Menschen und wird bei 5-20% der humanen ambulant

erworbenen Pneumonien (community aquired pneumonia (CAP)) als Ursache vermutet

(HAMMERSCHLAG 2000). Der Erreger wird mit persistenten Infektionen in Verbindung

gebracht, wobei ein Zusammenhang zur Atherosklerose und koronaren Herzerkrankung

diskutiert wird (STRATTON u. SRIRAM 2003).

C. psittaci infiziert primär den Vogel und verursacht meist systemische Infektionen, bei denen

viele Organsysteme insbesondere der Intestinaltrakt und Respirationstrakt mit

unterschiedlicher klinischer Ausprägung betroffen sind. Die Stämme von C. psittaci besitzen

zoonotisches Potential und können beim Menschen milde bis schwerwiegende atypische

Pneumonien verursachen.

C. pecorum wurde beim Wiederkäuer, Koala und Schwein isoliert. Die Spezies induziert

verschiedene Krankheitsbilder in unterschiedlicher Ausprägung, darunter Reproduktions-

störungen, Enteritiden und Pneumonien (CARR-LOCKE u. MAIR 1976; MAIR et al. 1988;

SHEE 1988; VANROMPAY et al. 1995; FRAEYMAN et al. 2010).

Der Stamm C. abortus ist bei Wiederkäuern endemisch verbreitet, verursacht vor allem bei

kleinen Wiederkäuern häufig Aborte und kommt vereinzelt als Aborterreger bei schwangeren

Frauen in Frage.


C. suis ist ein weit verbreiteter Erreger in Schweinebeständen, der sich vermehrt resistent

gegenüber Tetrazyklinen, dem Antibiotikum erster Wahl bei der Behandlung der

Chlamydiose, zeigt (LENART et al. 2001). C. suis verursacht beim Schwein Enteritiden,

Pneumonien, Konjunktivitiden, Perikarditiden und Reproduktionsstörungen und wird mit

Frühsterblichkeit von Ferkeln in Verbindung gebracht (LONGBOTTOM 2004).

Epidemiologische Studien sind nur begrenzt vorhanden. Mitunter wird von Mischinfektionen

berichtet (HOELZLE et al. 2000; POSPISCHIL et al. 2009).

C. muridarum umfasst zwei Stämme (MoPn; SFPD), die aus Maus und Hamster isoliert

wurden. SFPD verursacht keine Erkrankung (FOX et al. 1993). MoPn verläuft

asymptomatisch oder verursacht Lungenentzündungen bei der Maus. C. muridarum wird

häufig im Mausmodell verwendet, um chlamydiale Genitalinfektionen zu simulieren und gibt

Aufschluss über die Abläufe akuter und chronischer Genitalinfektionen.

C. caviae lässt sich beim Meerschweinchen isolieren. Primär wird die Konjunktiva infiziert.

Die experimentelle Infektion des Genitaltrakts verläuft ähnlich der humanen Genitalinfektion

mit C. trachomatis (LONGBOTTOM 2004).

C. felis wird regelmäßig aus der Konjunktiva infizierter Hauskatzen isoliert, die erst eine

unilaterale und dann bilaterale Konjunktivitis zeigen. Aus der Literatur ist bekannt, dass

C. felis auf den Menschen übertragbar ist (SCHACHTER et al. 1969; HARTLEY et al. 2001;

LONGBOTTOM u. COULTER 2003).

2.1.3 Chlamydialer Entwicklungszyklus

Die Chlamydien zeigen einen komplexen Entwicklungszyklus, der vorwiegend in

Epithelzellen der Konjunktiva, des Respirationstrakts, des Urogenitaltrakts und des

Gastrointestinaltrakts stattfindet (Abb. 1). Den Eintritt der infektiösen Elementarkörperchen

(EK) in die Wirtszelle vermitteln Adhäsine, darunter HSP-70, Env-B oder MOMP (SU et al.

1990b; RAULSTON et al. 1993; STEPHENS u. LAMMEL 2001). Elementarkörperchen

werden endozytotisch in Clathrin-ummantelte Vesikel aufgenommen oder

mikrofilamentabhängig phagozytiert und von der Plasmamembran der Wirtszelle umgeben

(HODINKA et al. 1988; FINLAY u. COSSART 1997). Es folgt die chlamydiale Migration

von der Zellperipherie zur perinukleären Region, wo eine als parasitophore Vakuole benannte,

membranumhüllte Struktur entsteht (MAJEED u. KIHLSTROM 1991). In ihr erfolgt die


Replikation des Erregers (ROCKEY et al. 1996; HACKSTADT et al. 1997;

ABDELRAHMAN u. BELLAND 2005). Der Einschluss blockiert die Fusion mit

wirtseigenen Lysosomen und sichert so das Überleben der Chlamydien (WARD 1983;

MOULDER 1991).

Abb. 1: Chlamydialer Entwicklungszyklus schematisch dargestellt, EK–

Elementarkörperchen, RK–Retikularkörperchen, h–Stunden; modifiziert nach

LONGBOTTOM u. COULTER (2003)

Die Expansion der parasitophoren Vakuole erfolgt synchron zur logarithmischen Vermehrung

des Erregers. Neben der Zellwand ändert sich während der Replikation auch die

Nukleoidstruktur der Chlamydien. Etwa 24 Stunden nach der Infektion mit einem EK enthält

der Einschluss lediglich Retikularkörperchen (RK), die sich ohne offensichtliche

Septenbildung vermehren (KUO et al. 2011). Spät im Replikationszyklus entwickeln sich

RKs asynchron über Intermediärkörperchen (IK) zurück zu EKs (KUO et al. 2011). Bevor die


Zelle neue infektiöse Stadien entlässt, sind im Einschluss alle drei Entwicklungsformen

sichtbar. Die Inklusion enthält ein Maximum an infektiösen Stadien, wobei ihre Anzahl nicht

allein speziesabhängig ist. In vitro wurde zum einen die intrazelluläre Auflösung des

Einschlusses mit anschließender Zellkern- und Zellwandlysis der Wirtszelle beschrieben, zum

anderen konnte mit Hilfe des konfokalen Laser Scanning Mikroskops die Extrusion des

Einschlusses ohne Zersetzung der infizierten Zelle nachgewiesen werden (HYBISKE u.

STEPHENS 2007). Der Entwicklungszyklus dauert in vitro speziesabhängig 48-72 Stunden

(ROCKEY et al. 1996). Die Immunabwehr des Wirts, der Entzug von Nährstoffen oder die

antibiotische Behandlung können die Entwicklung der Chlamydien beeinflussen und abnorm

geformte Retikularkörperchen hervorrufen (HAMMERSCHLAG 2002). Es handelt sich um

abberante Stadien, die lebensfähig, aber nicht anzuzüchten sind. Unter günstigen

Umgebungsbedingungen können sich die aberranten Dauerstadien schnell in normal

replizierende Chlamydien zurück verwandeln (GOELLNER et al. 2006).

2.1.4 Morphologie der Entwicklungsstadien

Während der Replikation der Chlamydien lassen sich verschiedene Entwicklungsstadien

beobachten. Elementarkörperchen sind 0,2-0,4 µm groß und werden von einer trilaminaren

Wand umgeben (KUO et al. 2011). Aufgrund ihrer geringen Oberfläche und ihrer osmotisch

stabilen und wenig permeablen Hülle sind sie als einziges Stadium extrazellulär

überlebensfähig. Die elektronenmikroskopische Untersuchung zeigt typischerweise

rundgeformte Elementarkörperchen. Nur die Elementarkörperchen des humanen Biovars von

C. pneumoniae sind birnenförmig (MIYASHITA et al. 1993). Das Kernmaterial ist

elektronendicht und liegt kondensiert mit Proteinen und wenigen Ribosomen vor. Die

Kondensation des Kernmaterials kommt durch bakterielle DNA-bindende Proteine (HctA,

HctB) zustande, die dem Histon ähnlich sind (BRICKMAN et al. 1993). Das Nukleoid

formiert sich exzentrisch und lässt eine Assoziation mit der inneren Membran der Zellwand

vermuten (ABDELRAHMAN u. BELLAND 2005). Im Zuge der Reifung lösen sich die

Histon-DNA-Verbindungen und es entstehen pleomorphe, mit 0,6-1,5 µm deutlich größere

Retikularkörperchen (RK), die DNA, RNA und Proteine synthetisieren (KUO et al. 2011).

Ihre trilaminare Zellwand ist dünner und flexibler. Im Gesamten erscheinen sie

ultrastrukturell weniger elektronendicht. Sie besitzen mehr Ribosomen und weisen eine

fibrilläre, aufgelockerte DNA auf, die sich gleichmäßig im Zytoplasma verteilt.


Rasterelektronen- und transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen zeigen

Knopf-ähnliche Strukturen (spike-like projections) auf der äußeren Oberfläche beider

Entwicklungsstadien, die als Komponenten des Typ-III-Sekretionssystems identifiziert

wurden. Sie dienen dazu virulente Proteine ins Zytoplasma der Wirtszelle zu schleusen

(MATSUMOTO 1982; BAVOIL u. HSIA 1998). Die Spikes auf der Oberfläche von RKs

reichen im Gegensatz zu denen der EKs bis in die Einschlussmembran (MATSUMOTO u.

MANIRE 1970). Während des Entwicklungszyklus lassen sich weiterhin IKs abgrenzen. Ihr

Kernmaterial liegt zentral im Zytoplasma vor, wodurch sie einer Zielscheibe gleichen (KUO

et al. 2011). Aberrante Chlamydienstadien sind deutlich größer und pleomorph. Unter

Einwirkung von Penicillin formt beispielsweise C. psittaci aberrante Stadien, die

elektronenmikroskopisch als pleomorphe, deutlich vergrößerte Retikularkörperchen mit

elektronendichten äußeren Membranen charakterisiert wurden (GOELLNER et al. 2006).

2.1.5 Zellwand der Chlamydien

Aufgrund ihrer geringen Größe wurden Chlamydien ursprünglich für Viren gehalten. Sie

besitzen jedoch eine Zellwand (Abb. 2), die der anderer gram-negativer Bakterien ähnlich ist

(EVERETT u. HATCH 1995). Neben dem typischen Aufbau aus äußerer Doppelmembran,

die Lipopolysaccharide (LPS) und Proteine enthält, einem periplasmatischen Spalt und einer

inneren zytoplasmatischen Membran, fehlt im Gegensatz zu anderen Eubakterien eine in allen

Stadien detektierbare Peptidoglykanschicht (BARBOUR et al. 1982).

Abb. 2: Schemazeichnung des Zellwandaufbaus von Elementarkörperchen von C. psittaci.

Die äußere Membran der Chlamydien enthält MOMP–major outer membrane proteine,

b-LPS, c-Env-A und d-Env-B; modifiziert nach EVERETT u. HATCH (1995)

Äußere Membran

P-Schicht

Innere Membran


Paradoxerweise reagieren chlamydiale Elementarkörperchen dennoch sensibel auf

Antibiotika, die die Peptidoglykansynthese hemmen (EVERETT et al. 1999; GHUYSEN u.

GOFFIN 1999).

Das hitzestabile LPS der Chlamydien (10 kDa) ist bei allen Chlamydienspezies vorhanden

und bildet eine wichtige antigene Struktur der äußeren Chlamydienwand. Es exprimiert ein

gruppenspezifisches Epitop. Im Vergleich zum LPS anderer gram-negativer Bakterien ist das

LPS der Chlamydien verkürzt und besitzt eine nur geringe endotoxische Aktivität

(KOSMA 1999). Neben dem Lipid A ist eine immunogene Kernregion aus 2-Keto-3-

desoxyoctonsäure (KDO) vorhanden (KOSMA 1999). Ein weiteres genusspezifisches

Antigen ist als GLXA bekannt (KOSMA 1999). Es handelt sich um ein Glykolipid-

Exoantigen, das die Invasion des Erregers vermittelt und auf der Oberfläche von

Elementarkörperchen von C. trachomatis, C. pneumoniae und C. psittaci gefunden wurde.

Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen wiesen GLXA ebenfalls auf der

Einschlussmembran von C. trachomatis und C. psittaci nach (WEBLEY et al. 2004). Seine

chemische Zusammensetzung und antigene Struktur ist weitgehend unbekannt. In der

Zellkultur konnte die Blockierung des GLXA durch spezifische Antikörper die Infektiosität

von C. trachomatis, C. pneumoniae und C. psittaci senken (VORA u. STUART 2003).

In der äußeren Membran von Elementarkörperchen sind speziesübergreifend MOMP, Env-A

und Env-B enthalten. MOMP wird durch das Omp-A-Gen verschlüsselt und stellt

möglicherweise das wichtigste Antigen der Chlamydien dar (DANILITION et al. 1990;

ALLEN u. STEPHENS 1993). Es handelt sich um ein mannosereiches Glykoprotein, das in

der Zellwand der Elementarkörperchen rund 60% der Proteinmasse ausmacht und sich bei den

verschiedenen Chlamydienspezies in Struktur und Molekularmasse (~40 kDa) gleicht

(CALDWELL et al. 1981; KOSMA 1999; STEPHENS u. LAMMEL 2001). MOMP dient als

Diffusionsporin und exprimiert variable Epitope, die eine Klassifizierung in Spezies,

Subspezies und Serovare ermöglichen (JONES et al. 2000). Bei den Spezies C. trachomatis

und C. psittaci gilt MOMP als immundominant (HATCH et al. 1984; SU et al. 1990a). Die

osmotisch stabilen EKs besitzen im Gegensatz zu RKs cysteinreiche Hüllenproteine (Env-A,

Env-B), die über Disulfidbrücken mit MOMP kreuzverlinkt und unlöslich in denaturierendem

Natriumdodecylsulfat sind (MATSUMOTO u. MANIRE 1970; HATCH et al. 1984).

Möglicherweise stellt der Komplex aus diesen Proteinen das funktionelle Äquivalent zum


Peptidoglykan dar (HATCH 1996). Entsprechend ihrer Größe unterscheiden sich das kleine

Env-A (12 kDa) und das große Env-B (60 kDa). Das Env-B ordnet sich regelmäßig an der

inneren Oberfläche der äußeren Membran an und bildet die periplasmatische Schicht (P-

Schicht, HATCH 1996). Die Zusammensetzung der Zellwand ist abhängig vom

Entwicklungszyklus. So erklärt sich die osmotische Fragilität der RK. Neben Disulfidbrücken

fehlt ihnen ebenfalls eine P-Schicht (MATSUMOTO u. MANIRE 1970).

Genomsequenzierungen detektierten ein weiteres oberflächenexponiertes Protein, das

Porin B, das nur wenig Variation zwischen den Isolaten einer Spezies zeigt und im Gegensatz

zu MOMP nur in geringer Menge vorhanden ist (KUBO u. STEPHENS 2001).

Proteine einer multigenen Familie von Antigenen komplettieren den äußeren chlamydialen

Proteinkomplex. Sie sind zum Teil oberflächenexponiert, wobei ihr Vorkommen zwischen

den Spezies variiert (STEPHENS et al. 1998; KALMAN et al. 1999).

Die Proteine HSP-70 und HSP-60 sind nicht Teil des chlamydialen Proteinkomplexes, werden

aber mitunter auf der Oberfläche von Chlamydien exprimiert und gelten als immundominant

(RAULSTON et al. 1998). Funktionell dient HSP-70 als Adhäsin (DANILITION et al. 1990).

Es wurde in der äußeren Membran ebenso wie im Zytoplasma von EK und RK von C.

trachomatis detektiert. HSP-60 ist dem Gro-EL Protein ähnlich und wird von allen

Chlamydien verschlüsselt. Es wird mit der Seroreaktivität infizierter Individuen in

Verbindung gebracht (BAVOIL et al. 1990).

2.1.6 Parasitophore Vakuole

Elementarkörperchen infizieren die Wirtszelle und werden vorerst umgeben von einem

Phagosom, dessen Membran von der Plasmamembran gebildet wird. Das Phagosom

entwickelt sich weiter zu einer Vakuole mit einer spezifischen Wand, die den Chlamydien

eine Nische bietet, in der die Replikation erfolgt. Die Wand der Vakuole ist impermeabel für

Makromoleküle, die größer als >520 Da sind und beteiligt sich an der Modulation der

Wirtszelle (BETTS et al. 2009). Schon früh im Replikationszyklus sichern sich alle

Chlamydienspezies den Zugang zu wirtseigenem Sphingomyelin und Cholesterol, indem sie

auf exozytotische Vesikel des Golgiapparats zugreifen und mit ihnen fusionieren

(HACKSTADT et al. 1997). Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen zeigen

in mit C. trachomatis infizierten Zellen sogar die weitreichende Manipulation des

Golgiapparats, der im Zuge der Infektion in Golgistapel zerlegt wird und die


Lipidbeschaffung steigern soll (HEUER et al. 2009). Der Nährstoffbezug ermöglicht die

chlamydiale Reifung, die unter anderem einher geht mit der Modifizierung der

Einschlussmembran durch den Einbau von integralen Inklusionsmembranproteinen (Inc-

Proteine; BANNANTINE et al. 2000). Inc-Proteine werden in hoher Vielfalt von allen

Chlamydia spp. exprimiert (BETTS et al. 2009). Ihnen gemein ist eine hydrophobe Domäne

aus mindestens 40 Aminosäureresten (BANNANTINE et al. 1998). Sie sind dem Zytoplasma

der Wirtszelle zugekehrt und erfüllen vermutlich eher eine strukturerhaltende als eine

interagierende Funktion (FIELDS u. HACKSTADT 2002). Wahrscheinlich ist, dass sie vom

Typ-III-Sekretionssystem synthetisiert werden (FIELDS et al. 2003). Das Typ-III-

Sekretionssystem ist ein Kennzeichen für pathogene, gram-negative Bakterien und wurde bei

allen Chlamydienspezies nachgewiesen (STEPHENS et al. 1998; READ et al. 2000). Es

schleust Effektorenzyme in das Zytoplasma der Wirtszelle aus. So wird der Umbau des

Zytoskeletts, der Zelltod oder die Antigenprozessierung der Wirtszelle beeinflusst (ZHONG

et al. 1999; ZHONG et al. 2000; FIELDS u. HACKSTADT 2002). Weitere Proteine ohne

charakteristische hydrophobe Domäne sind in der Einschlussmembran verankert. Darunter

Cap1, ein 31 kDa schweres Protein von C. trachomatis, von dem nachgewiesen wurde, dass

es von CD8+ T-Lymphozyten erkannt wird (FLING et al. 2001).

2.1.7 Besonderheiten von Chlamydia psittaci

Erstmals 1879 wurden Vögel mit einer Grippe-ähnlichen Krankheit des Menschen in

Verbindung gebracht. Diese wurde im Folgenden nach dem lateinischen Wort für Papagei

(psittacus), als Papageienkrankheit bezeichnet (MORANGE 1895). Beim Vogel, dem

Primärwirt von C. psittaci, führt die Infektion mit unterschiedlicher klinischer Ausprägung zu

Erkrankungen des Intestinaltrakts und Respirationstrakts. C. psittaci verursacht beim

Menschen neben subklinischen Infektionen schwerwiegende Erkrankungen (NEWMAN et al.

1992; BEECKMAN u. VANROMPAY 2009; DICKX u. VANROMPAY 2011). Berichtet

wird von Endokarditiden, Hepatitiden und Enzephalitiden (CARR-LOCKE u. MAIR 1976;

SHEE 1988; VANROMPAY et al. 1995; BEECKMAN u. VANROMPAY 2009;

FRAEYMAN et al. 2010).

Durch die Anwendung monoklonaler Antikörper, die an serovarspezifische Epitope des

MOMPs binden, und durch die PCR-basierte Analyse des Omp-A-Gens wurden neun

Serovare von C. psittaci (A bis F, E/B, WC1, M56) entdeckt (ANDERSEN 1991; SAYADA


et al. 1995; VANROMPAY et al. 1997; SACHSE u. GROSSMANN 2002; SACHSE et al.

2008). Weitere Genomanalysen zeigen die Heterogenität von C. psittaci durch die Einteilung

in 15 Genotypen (SACHSE et al. 2008). Die Serovare von C. psittaci variieren in

Wirtsspektrum, Virulenz und Genomsequenz. Am häufigsten werden Stämme isoliert, die

dem Genotyp A angehören und hochvirulent für Mensch und Vogel sind (HEDDEMA et al.

2006). Der Genotyp A ist bei Psittaciden, Genotyp B bei Tauben, Genotyp C bei Enten und

Gänsen, Genotyp D bei Puten und Genotyp F bei Psittaciden und Puten verbreitet. Der

Genotyp E ist mit diversen natürlichen Wirten assoziiert und wurde bei Tauben, Laufvögeln,

Enten und Puten nachgewiesen. Genotyp E/B ließ sich aus Tauben, Enten und Puten,

Papageien und dem Menschen isolieren (GEENS et al. 2005). Zwei Genotypen wurden bei

Säugern, dem Rind (WC) und Labornagern (M56), entdeckt.

Die Übertragung auf den Menschen ist durch das Einatmen von mit C. psittaci

kontaminiertem Staub möglich. Dabei kommen wilde und domestizierte Vögel als

Chlamydienreservoir in Frage (VERBIN et al. 1969; HARKINEZHAD et al. 2007; VAN

DROOGENBROECK et al. 2009). Im Vergleich zu anderen Chlamydienspezies bildet

C. psittaci multiple, pleomorphe parasitophore Vakuolen pro Wirtszelle, die sich im gesamten

Zytoplasma ausbreiten (WYRICK et al. 1993). Genomanalysen belegen, dass die meisten der

ursprünglich für Energieparasiten gehaltenen Chlamydien selbständig ATP bilden

(MOULDER 1974). Im Unterschied dazu soll C. psittaci nur begrenzt fähig sein ATP zu

synthetisieren (HARKINEZHAD et al. 2007). Utrastrukturelle Untersuchungen zeigen die

direkte Interaktion zwischen den parasitophoren Vakuolen von C. psittaci und den

Mitochondrien der Wirtszelle (MATSUMOTO et al. 1991; HARKINEZHAD et al. 2007).

RKs von C. psittaci machen sich Wirtszell-ATP zu Nutze, das mit Hilfe einer speziellen ATP-

ADP-Translokase verwertbar wird (HATCH et al. 1982). Der Entwicklungszyklus von

C. psittaci ist innerhalb von 48 Stunden abgeschlossen (ROCKEY et al. 1996).

2.1.8 Immunpathogenese von Chlamydieninfektionen

Verschiedene Pathogenesestudien zur Chlamydieninfektion wurden im Tiermodell

durchgeführt. Vorwiegend stehen Ergebnisse zur Verfügung, die unter Verwendung des

humanpathogenen Stammes C. trachomatis oder C. muridarum am Labortier gewonnen

wurden und von in vitro-Studien ergänzt werden. Grundlage des immunologischen


Paradigmas zur Pathogenese von Chlamydieninfektionen von STEPHENS (2003) bildet die

initiale Infektion von Epithelzellen (Abb. 3).

Abb. 3: Modell über die zellulären Reaktionen auf die Infektion mit Chlamydien; modifiziert

nach STEPHENS (2003)

Epithelzellen sezernieren als Folge der Infektion und Erregerreplikation ein breites

Zytokinspektrum und modulieren so die Immunreaktion (RASMUSSEN et al. 1997; WISSEL

et al. 2005). Sezerniert wurde unter anderem IL-8, das chemotaktisch für neutrophile

Granulozyten (PMN) wirkt (BARTENEVA et al. 1996; MOAZED et al. 1996). Die

experimentelle Depletion von PMN im Tiermodell bei trächtigen Mäusen mit C. abortus

beeinflusste dabei vor allem die Dynamik von CD8+ T-Zellen und führte zu einer

Verminderung der CD8+ T-Zellen in den Entzündungsherden (DE OCA et al. 2000). Die

Elimination der PMNs hatte hingegen keinen Einfluss auf die Elimination von C. pecorum


(BUENDIA et al. 1999). Durch die Chlamydieninfektion wurden zeitlich verzögert

antigenspezifische T- und B- Lymphozyten zum Ort der Infektion rekrutiert. IFN-γ, das die

Reifung von T-Helferzellen induziert, wird durch IL-12 aktiviert (RUSCONI u. GREUB

2011). Die Bedeutung beider Zytokine wird in Experimenten mit C. muridarum an knock out

Mäusen deutlich. Die Depletion von IL-12 führte dazu, dass die Tiere stärkere

Lungenveränderungen zeigten (LU et al. 2000). IFN-γ-produzierende CD4+ und CD8+ T-

Lymphozyten trugen im Mausmodell zur Beseitigung einer primären Chlamydieninfektionen

bei (RAMSEY u. RANK 1991). IFN-γ limitierte dabei unter anderem durch den Entzug von

Tryptophan das Wachstum der Chlamydien (ROTTENBERG et al. 2002). Die humorale

Immunantwort nimmt Einfluss auf chlamydiale Entwicklungsstadien, die sich im

extrazellulären Raum befinden. Dabei wurde im Mausmodell die sekundäre nicht jedoch die

primäre Chlamydieninfektion durch B-Zellen beeinflusst (MOORE et al. 2003; RANK u.

WHITTUM-HUDSON 2010). Im Besonderen konnte MOMP-spezifisches IgA die

Infektiosität von C. trachomatis während der experimentellen Genitalinfektion vermindern

und die Ausbreitung des Erregers verhindern (RANK u. BATTEIGER 1989).

2.2 Respirationstrakt des Rindes

2.2.1 Anatomischer und histologischer Aufbau von Trachea und Lunge

Die Verzweigung der Bronchien bedingt die tierartspezifische, makroskopisch sichtbare

Lungenlappung (NICKEL et. al. 1979). Beim Wiederkäuer unterteilt sich die linke Lunge in

den Lobus cranialis sinister und in den Lobus caudalis sinister. Der kraniale Lungenlappen ist

zweigeteilt und besteht aus einer pars cranialis und einer pars caudalis. Die rechte Lunge

besteht aus vier Lungenlappen Lobus cranialis, Lobus medius, Lobus caudalis und Lobus

accessorius. Entsprechend der linken Lungenseite unterteilt sich auch der Lobus cranialis

dexter in eine pars cranialis und pars caudalis. Die pars cranialis wird vom trachealen

Bronchus belüftet, der vor der Hauptbifurkation aus der Trachea entspringt und den Lobus

anfällig gegenüber inhaliertem Fremdmaterial macht (CASWELL u. WILLIAMS 2007). Von

der Lungenkapsel (Pleura pulmonalis), die die linke und rechte Lunge umhüllt, ziehen Fasern

ins Innere des Organs und bilden interlobuläres, intralobuläres, peribronchiales und

perivaskuläres Interstitium. In ihnen sind Blutgefäße, Lymphgefäße, Nerven und Bronchien

enthalten. Dieses lockere Bindegewebe führt insbesondere beim Rind zu einer prominenten


Unterteilung des Lungenparenchyms in Lappen und Läppchen. Die Wand großer Blutgefäße

setzt sich zusammen aus einer inneren Tunica interna (Intima), aus einer mittleren Tunica

media und aus einer Tunica externa (Adventitia; NICKEL et al. 1979; LIEBICH 1998).

Der Respirationstrakt umfasst alle Organe, die die Aufnahme von Sauerstoff und die Abgabe

von Kohlenstoffdioxid sichern. Funktionell und strukturell lassen sich die Kompartimente der

Luftleitung von denen des Luftaustausches unterscheiden. Die Atemwege mit Nasenhöhle

(Cavum nasi), Schlund (Nasopharynx) und Kehlkopf (Larynx), die sich mit der Luftröhre

(Trachea) in die Lunge fortsetzt, sichern die Luftleitung.

Die Trachea ist, wie der Großteil des luftleitenden Systems, mit einem respiratorischen

Epithel ausgekleidet. Es besteht aus einem mehrreihigen, hochprismatischen Epithel. Die

Mehrzahl der Epithelzellen trägt Kinozilien. Zwischen ihnen sind schleimproduzierende

Becherzellen verteilt. Unter der Lamina epithelialis liegt die Lamina propria mucosae (Tunica

elastica mucosae), die feine Kollagenfasern, Gefäße und Nerven einschließt und durch längs

angeordnete elastische Fasern begrenzt wird (NICKEL et al. 1979; LIEBICH 1998). Die

Schleimhaut der Trachea wird zirkulär von hyalinen Knorpelspangen umfasst. Diese sind

dorsal geöffnet und werden durch einen Paries membranaceus bindegewebig verbunden. Der

Bindegewebsmembran liegen innen glatte Muskelfasern des Musculus trachealis an. Eine

Tunica adventitia (Tunica fibroelastica) verbindet die Trachea mit dem anliegenden Gewebe.

An der Bifurcatio tracheae trennt sich die Luftröhre in zwei Hauptbronchien (Bronchi

principales) auf, die intrapulmonal in Lappenbronchien (Bronchi lobares), Bronchi

segmentales und subsegmentales übergehen (Abb. 4; NICKEL et al. 1979; LIEBICH 1998).


Abb. 4: Bronchus segmentalis mit seinen Verzweigungen und zugehörigen Gefäßen und

Nerven; modifiziert nach NICKEL et al. (1979)

Das respiratorische Epithel, ebenso wie die knorpelige Stütze aus der Trachea setzen sich

zunächst fort, gehen jedoch mit zunehmender Verzweigung verloren, sodass Bronchiolen und

Alveolen ausschließlich durch elastische Faserhäute vor dem Kollabieren geschützt sind. Der

Übergang von luftleitendem System in das luftaustauschende macht den Umbau von Epithel

und Schleimhaut notwendig (Abb. 5), sodass das ursprünglich mehrreihige Epithel

einschichtig wird und seine Zilien und Becherzellen verliert (NICKEL et al. 1979; CRYSTAL

et al. 2008).


Das luftaustauschende System setzt sich beim Rind aus Alveolargängen (Ductus alveolares),

aus den Alveolarsäckchen (Sacculi alveolares) und aus gasaustauschenden Alveolen

zusammen.

1 2 3 4 1 2 5 4 6 7

Abb. 5: Hauptzelltypen des Lungenepithels, 1–kinozilientragende Epithelzelle,

2-undifferenzierte zylindrische Epithelzelle, 3–sekretorische Epithelzelle (Becherzelle),

4-Basalzelle, 5–Clarazelle, 6-Alveolarepithelzelle Typ II (AEC II), 7–Alveolarepithelzelle

Typ I (AEC I); modifiziert nach CRYSTAL et al. (2008)

2.2.1.1 Ultrastruktur der Alveolen

Verschiedene Zelltypen sind in der Alveole zu finden. Die membranösen

Alveolarepithelzellen (AEC I) sind große, flache Zellen, die die Alveolen zu 90-97%

tapetenartig auskleiden (SUTHERLAND et al. 2001; FEREOL et al. 2008). Sie liegen einer

dünnen Basalmembran auf und sind von einem Netz aus Blutgefäßen umgeben. Lateral sind

AEC I über tight junctions miteinander verbunden. AEC I weisen einen flachen Zellkern auf.

Alveolarepithelzellen Typ I sind ausdifferenzierte Zellen. Sie enthalten keine Antioxidantien

und sind besonders anfällig gegenüber Sauerstoffmangel. Morphologisch und funktionell

lassen sich Alveolarepithelzellen Typ II (AEC II) unterscheiden. Sie treten nur sporadisch in

Nischen der Alveolarwände auf, die durch lumenwärtige Einbuchtung der Kapillare entstehen

(NICKEL et al. 2004b). Den lateralen Kontakt zu AEC I stellen ebenfalls tight junctions her

(RYBICKA et al. 1974; ALLAN 1978). Die Zellen weisen apikale Mikrovilli auf und

enthalten zahlreiche intrazytoplasmatische Organellen, darunter elektronendichte osmiophile,

lamelläre Inklusionen, die das Surfactant mehrlagig speichern. Der Zellkern ist groß und

große Luftwege kleine Luftwege Alveole


kuboidal. Primär fungieren AEC II als Surfactantlieferanten. In ihnen wird Surfactant nicht

nur synthetisiert, sondern auch recycelt. Die oberflächenaktive Substanz besteht zu 80% aus

Phospolipiden, zu 10% aus neutralen Lipiden und zu 10% aus den Surfactantproteinen (S-P)

A, B, C und D. Sie breiten sich über der alveolären Oberfläche aus und verhindern ihren

Kollaps während der Exspiration. AEC II dienen als Vorläuferzelle des Alveolarepithels

(CASWELL u. WILLIAMS 2007).

Die maximal 100 nm dicke Basalmembran (BM) trennt Epithel und Endothel (CHEVILLE

2009). Die BM wird von Endothelzellen, Epithelzellen oder Myoepithelzellen synthetisiert,

ist fibrillär strukturiert und dem Kollagen ähnlich, wobei Mukopolysaccharide enthalten sind.

Die Epithelzellen sind fest mit der Basalmembran verbunden. Neben der Wirkung als Filter

dient sie als Leitschiene für die Regeneration von Alveolarepithel.

Das kapillare Endothel komplettiert die Blut-Luft-Schranke. Endothelzellen liegen der

Basalmembran eng an und halten damit den Diffusionsweg gering. Die Endothelzellen

werden durch Zellverbindungen mit Macula occludens zusammengehalten und bilden eine

kontinuierliche Barriere (CHEVILLE 2009). Eine feste Verbindung besteht vor allem

luminal. Die interzellulären Verbindungen enthalten Mukopolyssaccharide und repräsentieren

die fusionierten Lagen der äußeren Zytoplasmamembranen benachbarter Endothelzellen. In

plasmalemmalen Vesikeln (Caveolae) werden Makromoleküle aktiv von luminal nach basal

und entgegengesetzt transportiert. Die Zellkerne der Endothelzellen sind verglichen mit denen

des Alveolarepithels kleiner und länglich geformt (SOROKIN 1966). Im Bindegewebe

zwischen Epithel und Endothel sind mitunter Fibroblasten, Lymphozyten und glatte

Muskelfasern zu finden. Fibroblasten bilden eine heterogene Zellpopulation, die

ungleichmäßig mit extrazellulären Matrixproteinen, wie Elastin und Kollagen, assoziiert ist.

Nur dort, wo kein dichtes Bindegewebsnetzwerk vorliegt, kann der Gasaustausch erfolgen

(CHEVILLE 2009).

2.2.2 Histologischer und zellulärer Aufbau der Tonsille

Die Mandeln (Tonsillen) gehören dem Waldeyerschen Rachenring an und bilden eine

lymphoepitheliale Struktur. Sie sind beim Rind an definierten Lokalisationen angelegt und

stehen permanent in Kontakt zu inhalierten und oral aufgenommenen Antigenen (LIEBLER-

TENORIO u. PABST 2006). Den maßgeblichen Bestandteil des Waldeyerschen Rachenrings

bilden dabei Tonsilla pharyngea und Tonsilla palatina (NICKEL et al. 1979). Beide


unterscheiden sich aufgrund ihrer Lage. Die Tonsilla palatina liegt im Oropharynx. Die

Tonsilla pharyngea liegt im Nasopharynx und gilt deshalb als Wächter des Luftwegs. Beide

entwickeln sich nach der Geburt durch antigene Stimulation (SCHUH u. OLIPHANT 1992;

MANESSE et al. 1998). Dabei sind Kälber bis zur vollen Entwicklung der Tonsillen

besonders anfällig gegenüber Infektionen (SCHUH u. OLIPHANT 1992). Die Tonsillen

bestehen aus zahlreichen Einzellymphknoten (Noduli lymphatici), die im Gesamten

bindegewebig umhüllt und von Drüsen umlagert werden. Tonsillen besitzen im Unterschied

zu anderen lymphatischen Organen keine afferenten Lymphgefäße. Zudem unterscheidet sich

die Morphologie der sekundären Knötchen. Diese weisen eine epithelseitig gerichtete

Lymphozytenkappe und ein exzentrisches Reaktionszentrum auf. In der Tonsille dominiert

die Expression von IgM auf Zentrozyten, im Kryptepithel hingegen verteilen sich vermehrt

solche Zellen, die IgG oder IgA exprimieren (MACLENNAN 1994).

2.2.3 Histologischer und zellulärer Aufbau des Lymphknotens

Lymphknoten sind konstitutiv angelegt und stellen organisiertes lymphatisches Gewebe dar

(DELLMANN 1987). Aus ihrer bindegewebigen Kapsel entspringen kurze Septen, die als

Trabekel ins Organinnere reichen. Ihnen folgen afferente Lymphgefäße, die in das

Sinussystem des Lymphknotens übergehen. Das Sinussystem umfasst den subkapsulären

Marginalsinus, die Intermediärsinusoide und die Marksinusoide. Die Sinusoide werden von

endothelähnlichen modifizierten Retikulumzellen ausgekleidet, die zum Teil fenestriert sind

und den Austausch mit dem lymphoretikulären Gewebe möglich machen. Die Hohlräume der

Sinusoide enthalten neben einem Netzwerk aus Stromazellen Makrophagen. Am Hilus wird

die Lymphe über efferente Lymphgefäße abtransportiert. Das Innere des Lymphknotens

besteht aus einem dreidimensionalen Maschenwerk aus Retikulumzellen und Fasern.

Zwischen ihnen ordnen sich Immunzellen an, deren Verteilung die Kompartimente des

Lymphknotens bestimmt (Abb. 6). Subkapsulär liegt der B-zellhaltige Cortex, der vom T-zell-

abhängigen Paracortex umgeben ist. B-Lymphozyten sind in einem Primär- oder

Sekundärfollikel organisiert. Sekundärfollikel enthalten Keimzentren und weisen auf den

Kontakt mit Antigenen hin. Sie beinhalten eine dunkle Zone mit großen Zentroblasten, die die

kleineren Zentrozyten der hellen Zone produzieren. Die helle Zone enthält zusätzlich ein

dichtes Netzwerk aus follikulär dendritischen Zellen (FDC). Sie speichern langfristig

Antigene und präsentieren sie den B-Lymphozyten (MACLENNAN 1994). Der


Immunglobulin (Ig) -Isotyp, der von Plasmablasten exprimiert wird, ist variabel.

Lymphknotenfollikel exprimieren vorwiegend den IgG-Isotyp und weniger IgA und IgM

(MACLENNAN 1994). Die Lymphfollikel werden von einem Paracortex umgeben, der vor

allem Thymus-abhängige T-Zellen enthält und infolge dessen als T-Zellzone benannt ist. Im

bovinen Lymphknoten konzentrieren sich wenige γδ+ T-Lymphozyten entlang der Trabekel

(MACKAY u. HEIN 1989). Neben T-Lymphozyten sind Makrophagen, dendritische Zellen

und B-Lymphozyten im Paracortex enthalten. Im Zentrum des Organs befinden sich

Markstränge, die als Lymphknotenmark (Medulla) zusammengefasst werden. Die

Markstränge sind je nach Immunlage mit Plasmazellen gefüllt. Auch hier befinden sich

Makrophagen, B-Lymphozyten und dendritische Zellen (TIZARD 2004e).

Abb. 6: Schemazeichnung eines Lymphknotens; modifiziert nach DELLMANN (1987)

2.3 Lymphgewebe und Immunzellen im Respirationstrakt des Rindes

2.3.1 Verteilung von Schleimhaut-assoziiertem Lymphgewebe (MALT)

Alle Schleimhäute weisen lymphatische Einrichtungen auf, die der Antigenaufnahme dienen

und über die eine Immunantwort ausgelöst werden kann (LIEBLER-TENORIO u. PABST

2006). Diese Strukturen sind als Schleimhaut-assoziiertes Lymphgewebe (MALT) bekannt

und variieren von Spezies zu Spezies hinsichtlich Verteilung, Vorkommen, Morphologie und


Evolution. Allen MALT zugehörigen Strukturen sind morphologische Charakteristika

gemein. Sie liegen der Schleimhautoberfläche eng an und lassen sich in Kompartimente

unterteilen. Neben Follikeln aus B-Lymphozyten, follikulär dendritischen Zellen (FDC) und

Makrophagen weisen sie interfollikuläre T-Zellzonen (IFZ) auf, die hauptsächlich CD4+ und

CD8+ T-Lymphozyten beinhalten. In ihnen liegen high endothelial venules (HEV), die

spezielle Rezeptoren exprimieren und den Lymphozytenzustrom steuern. Das angrenzende

Epithel ist mit Lymphozyten infiltriert und weist häufig spezialisierte M-Zellen auf, die

ebenso wie intraepithelial lokalisierte dendritische Zellen der Antigenaufnahme dienen. Beim

Rind wurden folgende MALT-Strukturen beschrieben:

- CALT (CHODOSH et al. 1998)

- Waldeyerscher Rachenring (SCHUH u. OLIPHANT 1992)

- LTALT (NICKEL et al. 1979)

- BALT (ANDERSON et al. 1986a)

- GALT (DOUGHRI et al. 1972).

2.3.2 Verteilung, Morphologie und Charakteristika von BAL T

Organisiertes lymphatisches Gewebe in der Schleimhaut der Lunge wird als BALT

bezeichnet (BIENENSTOCK u. PEREY 1973). Nach seiner erstmaligen Beschreibung vor

etwa 100 Jahren wurde das BALT mittlerweile in der Lunge vieler Haussäuger und in der des

Menschen beschrieben (PABST u. GEHRKE 1990; BIENENSTOCK u. MCDERMOTT

2005). Mit Ausnahme von Maus, Ratte und Kaninchen ist das BALT nicht konstitutiv

angelegt (PLESCH et al. 1983; PABST u. GEHRKE 1990; HOLT 1993; TSCHERNIG u.

PABST 2000; LIEBLER-TENORIO u. PABST 2006).

Die Grundstruktur des BALT (Abb. 7) ist eingehend am Labortier beschrieben, wobei das

ausdifferenzierte BALT sämtliche morphologischen Charakteristika des MALT umfasst

(siehe Kap. 2.3.1; PLESCH et al. 1983; VAN DER BRUGGE-GAMELKOORN u. SMINIA

1985; SMINIA et al. 1989). Die B-Zellen der Follikel von Ratte und Kaninchen exprimieren

vorwiegend IgA und IgM (PLESCH et al. 1983). Parafollikulär verteilen sich viele CD4+ und

weniger CD8+ T-Lymphozyten in einem Verhältnis von 2,6:1 (BIENENSTOCK u.

MCDERMOTT 2005).


Abb. 7: Grundstruktur des BALT und Verteilung der am BALT beteiligten Zelltypen;

modifiziert nach TSCHERNIG u. PABST (2000)

Parafollikulär liegen HEVs, die den Adhäsionsfaktor VCAM-1 exprimieren und so den

selektiven Lymphozytenzustrom aus dem Blut ermöglichen (RANDALL 2010). Auch

efferente lymphatische Gefäße, die zu regionären Lymphknoten führen, liegen parafollikulär.

Ein Domebereich mit interdigitierenden Zellen grenzt an das Epithel. Letztes abgrenzbares

Kompartiment ist das spezialisierte Lymphepithel, das für das Kaninchen als zilienlos mit

infiltrierenden Lymphozyten beschrieben ist (RACZ et al. 1977). Im Gegensatz zu den

Peyerschen Platten im Darm lässt sich die Struktur des BALT nicht auf alle Spezies

übertragen. Zumindest in der Lunge von Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen und Hühnern

ist eine beträchtliche Menge an organisiertem BALT zu beobachten (BIENENSTOCK 1985;

SMINIA et al. 1989). Die genaue Bedeutung des BALT am Immungeschehen ist bislang

unklar (TSCHERNIG u. PABST 2009).

Das BALT des Rindes ist verglichen mit dem von Kaninchen und Ratten nur geringgradig

ausgeprägt. So zeigten Untersuchungen an Lungen gesunder Kälber und Rinder variable

Mengen an BALT (ANDERSON et al. 1986a). Bei neugeborenen Kälbern ließ sich kein

BALT nachweisen. Bei älteren Kälbern (4, 8, 18 Monate) nahm die Menge an Lymphgewebe

zu und sank bei adulten, 3 Jahre alten Rinder auf das Mengenniveau der 4 Monate alten

Kälber. Das lymphatische Gewebe ließ sich mit einer Präferenz zu den kranialen


Lungenlappen in allen Regionen der gesunden Lunge nachweisen. BALT verteilte sich

entlang der luftführenden Wege. Morphologisch waren sekundäre Lymphfollikel durch ein

Keimzentrum mit Mitosefiguren, Makrophagen, dendritischen Zellen und Lymphozyten

gekennzeichnet. In der Interfollikularzone wurden die Lymphfollikel von Lymphozyten,

Plasmazellen und Makrophagen umgeben. Peripher der Lymphfollikel waren vorwiegend

CD4+ T-Lymphozyten und nur wenige CD8+ und γδ+ T-Zellen verteilt (MATHY et al.

1997). Die ultrastrukturelle Untersuchung zeigte parafollikuläre HEVs mit emigrierenden

Lymphozyten (ANDERSON et al. 1986a). Dabei ließ sich transmissionselektronen-

mikroskopisch kein spezielles Lymphepithel nachweisen.

Das BALT von Kälbern mit Enzootischer Pneumonie wich in Morphologie und Menge im

Vergleich zu gesunden 4 Monate alten Tieren ab. Im kranialen Läppchen zeigte sich ein

Anstieg an Lymphgewebe. Das BALT umgab häufig manschettenartig Bronchiolen. Bei den

kranken Kälbern konnte ein zilienloses Lymphepithel nachgewiesen werden (ANDERSON et

al. 1986a).

2.3.3 Verteilung von Immunzellen in der Lunge des Rindes (außer BALT)

In der Lunge lassen sich verschiedene interagierende Kompartimente abgrenzen, die relevant

für die Immunantwort sind (BIENENSTOCK 1984; TSCHERNIG u. PABST 2009).

Ein Kompartiment bilden die Luftwege, wobei Epithel und Lamina propria zu unterscheiden

sind. BIENENSTOCK (1984) vermutet, dass das Epithel der Luftwege ähnlich dem

Darmepithel durch intraepitheliale zytotoxische T-Zellen vor invasiven Pathogenen geschützt

ist (BIENENSTOCK 1984). Das Bronchialepithel von gesunden Kälbern zeigte in der

Untersuchung durch ALLAN und Mitarbeiter (1979) eine Markierung für IgA und IgM.

Darüber hinaus gibt es bislang keine publizierten Untersuchungsergebnisse über

intraepitheliale Zellen des Bronchialepithels des Rindes.

In der Lamina propria der Luftwege waren von der Trachea bis zu den terminalen

Bronchiolen hauptsächlich IgA+ Plasmazellen nachweisbar (ALLAN et al. 1979;

ANDERSON et al. 1986b). Diese verteilten sich überwiegend entlang der Basalmembran

(ANDERSON et al. 1986b). In abnehmender Zahl waren IgG1+, IgG2+ und IgM+

Plasmazellen vorhanden. Die Anzahl der gefundenen Plasmazellen war altersabhängig. So

konnten bei neugeborenen Kälbern keine Plasmazellen nachgewiesen werden. Bei 18 Monate

alten Kälbern waren im Vergleich zu vier und acht Monate alten Kälbern und zu drei Jahre


alten Rindern die meisten Plasmazellen zu sehen. Die Anzahl der Plasmazellen nahm mit

Verkleinerung der Luftwege ab (ANDERSON et al. 1986b). In Untersuchungen von

THOMASMEYER (2006) konnte gezeigt werden, dass beim Rind zahlreiche MHC II+

dendritische Zellen unterhalb der Basalmembran in der Lamina propria mucosae vorliegen,

die mit zunehmendem Alter der Tiere ein Netzwerk bilden.

Ein weiteres Kompartiment umfasst das alveoläre Parenchym mit Interalveolarsepten und

Alveolarlumen, wobei über die Verteilung der Leukozyten in den Interalveolarsepten beim

Rind nur wenig bekannt ist. In immunhistologischen Untersuchungen an Kälberlungen durch

ANDERSON et al. (1986b) waren im alveolären Parenchym nur selten Plasmazellen

nachweisbar. Zellen, die sich im bronchoalveolären Raum verteilen, werden durch

bronchoalveoläre Lavage (BAL) gewonnen und sind dadurch diagnostisch zugänglich.

Untersuchungen der BAL zeigten Alveolarmakrophagen, die mit 87% den Hauptanteil

bildeten. Etwa 10% der Zellen wurden als Lymphozyten und nur etwa 2% als neutrophile

Ganulozyten identifiziert (LIGGITT 1985). Bei den gewonnenen Lymphozyten handelte es

sich überwiegend um CD8+ T-Lymphozyten, die den Aktivierungsmarker CD25 exprimierten

(MCBRIDE et al. 1997).

BALT (siehe Kap. 2.3.2), intravaskulär zirkulierende Leukozyten und das periarteriale

Interstitium vervollständigen die Lungenkompartimente (PABST u. TSCHERNIG 1995;

TSCHERNIG u. PABST 2009). Im Unterschied zu Labornagern und dem Menschen ließen

sich beim Rind ultrastrukturell durch RYBICKA u. DALY (1974) in den Gefäßen der Lunge

intravaskuläre Makrophagen (PIM) nachweisen.

2.3.4 Morphologie, Funktion und für die immunhistologische Darstellung gewählte

Epitope der Immunzellen in der Lunge des Rindes

2.3.4.1 Makrophagen

Die verschiedenen Makrophagenpopulationen in der Lunge sind maßgeblich für den Erhalt

der Homeostase und die Sterilität der tiefen Atemwege verantwortlich. Makrophagen

stammen von myeloiden Vorläuferzellen ab und zirkulieren als Monozyten im Blut.

Makrophagen sind Teil des mononukleären Phagozytosesystems und finden sich in drei

Kompartimenten der Lunge wieder (Abb. 8; LOHMANN-MATTHES et al. 1994). Unter

homeostatischen Bedingungen und während einer Entzündung werden sie durch Monozyten


erneuert. Aufgrund unterschiedlicher Funktion, Lokalisation (in Alveolen, Interstitium und

Kapillaren) und Morphologie bilden Makrophagen eine heterogene Zellpopulation.

Alveolarmakrophagen und intravaskuläre Makrophagen (PIM) phagozytieren partikuläres

Material und Mikroorganismen. Aufgenommenes Antigen wird intrazellulär in Membran-

gebundenen Phagolysosomen enzymatisch verdaut und gebunden an MHC I oder MHC II auf

der Oberfläche präsentiert. Während der Entzündung sezernieren Alveolarmakrophagen und

PIMs mikrobizide Mediatoren (ROS) und proinflammatorische Zytokine (TNF-α, IL-1β, IL-

8, TGF-β und TGF-α), die Gewebeschäden hervorrufen (CASWELL u. WILLIAMS 2007).

AEC I

AEC II

1

2

3

Monozyten

Endothel

Monozyt

AEC IAEC I

AEC II

1

2

3

Monozyten

Endothel

Monozyt

AEC I

Abb. 8: Mononukleäres Phagozytosesystem in der Lunge von Kälbern,

1-Alveolarmakrophage, 2–interstitieller Makrophage, 3–intravaskulärer Makrophage;

modifiziert nach STAUB (1994)

Unter homeostatischen Bedingungen setzen Alveolarmakrophagen nur geringe

Zytokinmengen frei, sind schwach antigenpräsentierend und supprimieren die Immunantwort

gegenüber unbedeutendem Antigen (HOLT et al. 1993; LAMBRECHT 2006; CASWELL u.

WILLIAMS 2007).

Interstitielle Makrophagen befinden sich zwischen Endothel und Alveolarepithel. Im

Vergleich zu Alveolarmakrophagen sind sie verstärkt an der Induktion und dem Erhalt einer

Immunantwort beteiligt. Sie sind durch eine vermehrte Expression von MHC II

gekennzeichnet und sezernieren IL-1 und IL-6 (STEINMULLER et al. 2000; CASWELL u.

WILLIAMS 2007). Wahrscheinlich begrenzen sie die Entzündung, beteiligen sich an der

Antigenpräsentation und verursachen Fibrose (WARNER u. BRAIN 1990; LOHMANN-


MATTHES et al. 1994; TSCHERNIG u. PABST 2009). Morphologische Unterschiede der

Makrophagen in der Lunge lassen sich ultrastrukturell beobachten. Kennzeichen der

Alveolarmakrophagen sind Pseudopodien (LIGGITT 1985). Alveolarmakrophagen besitzen

im naiven Zustand einen großen Zellkern, der von ausgedehntem Zytoplasma umgeben ist. Im

Zytoplasma befinden sich hoch entwickelte Golgikomplexe und kleine primäre Lysosomen,

die saure Hydrolasen und Lysozyme enthalten. PIMs wurden erstmals beim Kalb identifiziert,

existieren aber ebenso bei Schwein, Pferd und Ziege (RYBICKA u. DALY 1974;

SCHNEBERGER et al. 2011). PIMs entsprechen morphologisch reifen großen Makrophagen,

die mit angrenzenden Endothelzellen Adhäsionskomplexe bilden und in der Kapillare

residieren. Das elektronendurchlässige Zytoplasma beherbergt zahlreiche Organellen, die

weiter entwickelt sind, als die der Monozyten (LONGWORTH 1997). Für die

immunhistologische Darstellung von bovinen Alveolarmakrophagen wurde der monoklonale

Antikörper EBM11 verwendet (BIELEFELDT-OHMANN et al. 1988). Der Antikörper

markiert ein Glycoprotein mit einer Masse von 110 kDa, das als CD68 Molekül bezeichnet

wird. CD68 ist assoziiert mit zytoplasmatischen Granula von Makrophagen, myeloiden Zellen

und bestimmten neoplastischen, mononukleären Zellen (ACKERMANN et al. 1994).

2.3.4.2 Neutrophile Granulozyten

Neutrophile Granulozyten (PMN) stammen von denselben Vorläuferzellen ab wie

Monozyten. Dies macht die Zuordnung in das mononukleäre Phagozytosesystem möglich und

erklärt die Kooperation beider Zellpopulationen gegenüber invasiven Pathogenen

(SILVA 2011). PMNs zirkulieren als ausgereifte Zellen für 6 bis 12 Stunden im Blut. Dabei

sind PMNs, die in das Gewebe rekrutiert wurden, phagozytotisch aktiver als im Blut

zirkulierende PMNs (SILVA 2011). Sie sind Teil der natürlichen Immunabwehr und werden

in Folge stimulatorisch wirksamer Zytokine, wie IL-8, schnell rekrutiert (BAGGIOLINI et al.

1989). Im Gewebe sezernieren stimulierte PMNs TNF-α und IL-1 und entlassen mikrobizide

Sauerstoffradikale, die intrazellulär in Phagolysosomen oder im Extrazellularraum wirken

(TIZARD 2004c). Der Prozess wird als respiratory burst bezeichnet und durch das NADPH

Multiproteinsystem katalysiert (TIZARD 2004c). Die mikrobiziden Sauerstoffradikale sind an

der Elimination von invasiven Pathogenen beteiligt, rufen aber ebenso Schäden an

körpereigenen Zellen hervor.


PMNs sind durch charakteristische intrazytoplasmatische Granula gekennzeichnet, wobei je

nach Inhalt zwischen azurophilen und spezifischen Granula unterschieden wird (CHEVILLE

1983). Enthalten sind unter anderem Laktoferrine, die Eisen binden und damit unzugänglich

für den bakteriellen Stoffwechsel machen und proteolytische Enzyme, die dem Abbau von

Kollagen und Elastin dienen. Die proteolytischen Enzyme wirken zudem gewebeschädigend

(BORREGAARD 2010). Als Besonderheit fehlt den bovinen neutrophilen Granulozyten das

Lysozym, das die glykosidische Bindung von bakteriellem Peptidoglykan zerstört (RAUSCH

u. MOORE 1975; ELLISON u. GIEHL 1991). Zudem existiert beim Rind ein zusätzlicher

tertiärer Granulatyp, der sauerstoffunabhängige bakterizide Substanzen enthält (GENNARO

et al. 1983). Der Inhalt der peroxidasepositiven und peroxidasenegativen Granula wird in den

Extrazellularraum oder in das Phagolysosom abgegeben (SORENSEN et al. 2001). PMN und

Alveolarmakrophagen ergänzen einander in der Abwehr von Pathogenen. In vivo

Untersuchungen zeigten die Phagozytose von freien intrazellulären Erregern, die wiederum in

Alveolarmakrophagen gelangten (LASKAY et al. 2008). Durch die Sekretion von TNF-α,

IFN-γ und IL-8 beeinflussen sie Makrophagen, Lymphozyten und sich selbst.

2.3.4.3 Dendritische Zellen

Dendritische Zellen (DC, gr. dendron–Baum) bilden eine heterogene Zellpopulation und

gehören dem mononukleären Phagozytosesystem an. Dendritische Zellen sind professionelle

antigenpräsentierende Zellen, die eine spezifische Immunantwort initiieren. Im Vergleich zu

B-Lymphozyten und Makrophagen sind sie die potentesten Immunstimulatoren. Dabei genügt

eine DC um bis zu 1000 T-Zellen zu stimulieren (VAN VOORHIS et al. 1983; REDDY et al.

1997; BANCHEREAU u. STEINMAN 1998; GUERMONPREZ et al. 2002). Naive

dendritische Zellen finden sich im Respirationstrakt an Orten, wo die Antigenbelastung erhöht

ist und präsentieren sich dort als Wächterzellen. Sie bilden ein dichtes Netzwerk im Epithel

der Luftwege und in den Alveolen (TIZARD 2004e). Naive DC kennzeichnen sich durch eine

hohe Phagozytosefähigkeit, die im Zuge der Reifung verloren geht. DC nehmen Antigene

phagozytotisch, makropinozytotisch und pinozytotisch auf (FLORES-ROMO 2001). Neben

Mikroben und geschädigtem Gewebe veranlassen auch inflammatorische Stimuli, wie TNFα

oder IL-1, die Reifung DC (VINEY 2001).

Reife DC präsentieren viele MHC II Moleküle auf ihrer Oberfläche (FLORES-ROMO 2001;

BAROIS et al. 2002). MHC II Moleküle, sind heterodimere integrale Membranproteine, die


der Antigenpräsentation von extrazellulären Peptiden dienen. Sie werden auf der Oberfläche

von professionell antigenpräsentierenden Zellen (APC) exprimiert und von CD4+ T-

Lymphozyten erkannt (GROMME u. NEEFJES 2002). Zur Darstellung MHC II+ Zellen in

der vorliegenden Untersuchung erfolgte die Anwendung des monoklonalen Antikörpers

IL-A21, der mit einer monomorphen Determinante des bovinen MHC II Moleküls reagiert

(DELVERDIER et al. 1996). Dieses Molekül ist auf einer Vielzahl der Körperzellen

vorhanden, sodass sIg+ B-Lymphozyten, Monozyten, aktivierte bovine CD4+, CD8+ und γδ+

T-Lymphozyten detektiert werden können (TAYLOR et al. 1993).

Als Besonderheit können DC ebenso wie Makrophagen exogenes Antigen über MHC I

Moleküle präsentieren und aktivieren so zytotoxische T-Zellen (GUERMONPREZ et al.

2002; BRODE u. MACARY 2004). Diese Kreuzpräsentation ist wichtig für die Elimination

von Erregern, die die DC nicht infizieren. Das MHC I Molekül ist dabei dem MHC II

Molekül ähnlich und sichert die Antigenprozessierung von antigenen Peptiden, die sich im

Zytoplasma der Wirtszelle befinden (ALBERT et al. 1998). Es wird auf der Zelloberfläche

aller kernhaltigen Zellen exprimiert und von zytotoxischen CD8+ T-Lymphozyten erkannt

(GROMME u. NEEFJES 2002).

Als weiteres Epitop sind CD1 Moleküle auf DC zu finden. CD1 Moleküle sind funktionell

den MHC Molekülen ähnlich, wobei sie im Unterschied zu MHC nicht Proteine sondern

Lipide präsentieren (GELIN et al. 2009). Zur Darstellung von CD1b+ DC wurde in der

vorliegenden Arbeit der monoklonale Antikörperklon CC20 verwendet. Dieser reagiert mit

dem bovinen Zelloberflächenantigen CD1w2. Hierbei handelt es sich um ein Glycoprotein,

das auf Thymozyten und einer Subpopulation von Zellen mit dendritischer Morphologie

exprimiert wird (HOWARD et al. 1993).

Reife DC verlassen die Lungen und migrieren über afferente lymphatische Gefäße in den

Paracortex der regionären Lymphknoten, wo sie mit naiven T-Zellen interagieren und eine

antigenspezifische T-Zellantwort hervorrufen können (NICOD u. COCHAND 2001). Sie

polarisieren über Zytokine und über die Expression von costimulatorischen Rezeptoren die

spezifische Immunantwort in Richtung T1-Helferzellen (Th1) oder T2-Helferzellen (Th2)

(MALDONADO-LOPEZ u. MOSER 2001; GOGOLAK et al. 2003).


2.3.4.4 T-Lymphozyten

Zwei spezialisierte Zellpopulationen (T- und B-Lymphozyten) schützen den Organismus vor

intra- und extrazellulären Pathogenen (GROMME u. NEEFJES 2002). Beide

Zellpopulationen stammen aus dem Knochenmark, wobei T-Lymphozyten zusätzlich im

Thymus reifen. Lymphozyten sind morphologisch uniform, besitzen einen großen Zellkern

und einen dünnen Zytoplasmasaum. Kennzeichnend für T-Lymphozyten ist der T-

Zellrezeptor (TCR) mit Hilfe dessen Antigene erkannt werden. Nach der Antigenerkennung

folgt die klonale Expansion der angesprochenen Zellen zu kurzlebigen Effektorzellen und

langlebigen Gedächtniszellen. Die T-Lymphozyten lassen sich aufgrund des Aufbaus des

TCR in αβ+ und in γδ+ T-Lymphozyten unterteilen.

αβ+ T-Lymphozyten

Konventionelle αβ+ T-Lymphozyten exprimieren zusätzlich einen CD4+ oder CD8+

Corezeptor. Diese steigern die Signaltransduktion des TCR um das 100fache (TIZARD

2004a). CD4+ T-Lymphozyten werden als T-Helferzellen bezeichnet. Sie sezernieren

verschiedene Zytokine. Th1-Zellen sezernieren IL-2, IL-4, IL-10 und IFNγ und vermitteln

eine zelluläre Immunantwort. Neben den kurzlebigen Effektorzellen, die Makrophagen

aktivieren und eine Resistenz gegenüber intrazellulären Bakterien generieren, entstehen

langlebige Gedächtniszellen. Th2-Zellen sezernieren IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13 und

vermitteln eine humorale Immunantwort (TIZARD 2004a). Der in der Untersuchung

verwendete monoklonale Antikörper IL-A11 stellt CD 4+ T-Helferzellen dar. Mit dem

Antikörper werden Oberflächendeterminanten mit einer Masse von 52 und 55 kDa des

bovinen CD4 detektiert, wobei das Molekül in seiner Verteilung, Molekularmasse und

Funktion dem humanen CD4 entspricht (BALDWIN et al. 1986; TEALE et al. 1986). Beim

Rind wird CD4 nicht auf Makrophagen coexprimiert (TIZARD 2004a).

Neben T-Helferzellen, die CD4 exprimieren, existieren zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten.

Diese sind wirksam gegenüber intrazellulären Erregern und werden typischerweise durch

Antigene stimuliert, die über MHC I präsentiert werden (ALBERT et al. 1998). Unabhängig

davon können CD8+ T-Lymphozyten ebenfalls durch extrazelluläre Pathogene stimuliert

werden (OYKHMAN u. MODY 2010). Beispielsweise werden CD8+ T-Zellen über T-

Zellwachstumsfaktoren aktiviert und gegen extrazelluläre Candida albicans wirksam (BENO


et al. 1995). Durch die Stimulation entstehen CD8+ Effektorzellen, die über IFN-γ, den

Fas/FasL-Pathway oder die granuläre Exozytose von Granulysin oder Perforin zytotoxisch

wirksam sind (TIZARD 2004b). Granulysin beispielsweise erhöht die Membranpermeabilität

der Zelle, sodass Flüssigkeit in das Zytoplasma einfließt und die Zelle zerstört (SHI et al.

2005; OYKHMAN u. MODY 2010). Perforin zerstört gleichfalls die Wirtszellmembran und

bewirkt den Einstrom von schädigendem Calcium (KEEFE et al. 2005). Das IFN-γ der CD8+

T-Zellen nimmt zumeist indirekt Einfluss auf den Stoffwechsel des Erregers. Es katalysiert

die Produktion von Stickstoffmonoxid (NO), verstärkt die Wirkung von professionellen

antigenpräsentierenden Zellen oder entzieht dem Erreger essentielles L-Tryptophan

(ROTTENBERG et al. 2002).

In der vorliegenden Untersuchung wurde der monoklonale Antikörper CC63 verwendet, um

CD8+ T-Lymphozyten darzustellen. Dabei markiert der Antikörper die homodimere (68 kDa)

und heterodimere (64 kDa) Form des bovinen CD8-Moleküls (MACHUGH u. SOPP 1991).

γδ+ T-Lymphozyten

T-Lymphozyten mit γδ+ TCR unterliegen einer spezies- und altersabhängigen Diversität.

Kälber weisen erhöhte Zellzahlen auf, wobei der Anteil der γδ+ T-Lymphozyten an

mononukleären Zellen des peripheren Bluts bei drei Monate alten Kälbern bei 30% liegt

(MACKAY u. HEIN 1989; CLEVERS et al. 1990; WILSON et al. 1996). Phänotypisch

lassen sich γδ+ T-Lymphozyten über das Workshop Cluster (WC) 1 Molekül differenzieren,

das einzigartig bei Rind und Schwein verbreitet ist. Es handelt sich um ein transmembranes

Glykoprotein, das der scavanger receptor cysteine rich (SRCR) Familie angehört

(FREEMAN et al. 1990). Da die Phosphorylierung des WC1 Moleküls notwendig ist, um die

Proliferation von WC1+ γδ+ T-Zellen auszulösen, fungiert es möglicherweise als

Costimulator ähnlich dem CD4 oder CD8 (WANG et al. 2009). WC1+ γδ+ T-Zellen sind

regulatorisch aktiv (RHODES et al. 2001). Das WC1 Molekül kommt in zwei Isoformen vor,

sodass WC1.1 und WC1.2 unterschieden werden. Vorwiegend WC1.1+ Zellen bilden IFN-γ

und stimulieren die Th1-Antwort (ROGERS et al. 2005; PRICE et al. 2007).

Im Unterschied zu konventionellen T-Zellen mit αβ+ T-Zellrezeptor sind γδ+ T-Zellen nicht

MHC-restringiert, sodass Zytokine, Protozoen und Bakterien ihre Proliferation direkt

stimulieren (WELSH et al. 2002; LAHMERS et al. 2005; PRICE et al. 2007). γδ+ T-

Lymphozyten sind entsprechend den zytotoxischen CD8+ T-Zellen über Perforin oder


Granulysin zytolytisch wirksam und stellen durch die Sekretion von IFN-γ den Link zur

adaptiven Immunabwehr her (CICCONE et al. 1988; PRICE et al. 2007). Die von ihnen

sezernierten Zytokine aktivieren Makrophagen, neutrophile Granulozyten und Lymphozyten

(BLUMERMAN et al. 2007; JUTILA et al. 2008). Zur immunhistologischen Darstellung γδ+

T-Lymphozyten wurde in der vorliegenden Unteruchung der monoklonale Antikörper IL-A29

verwendet. Dieser markiert Oberflächenstrukturen boviner Zellen mit einer Molekülmasse

von 215/300 kDa, das als WC1 Molekül definiert ist. Durch den Antikörper wird ein T-

Zellsubtyp mit γδ+ TCR und CD3+ Corezeptor markiert. Bovine γδ+ T-Lymphozyten sind

meist negativ für CD4 und CD8 (CLEVERS et al. 1990).

2.3.4.5 B-Lymphozyten, Plasmazellen und Immunglobulin

B-Lymphozyten sind spezialisierte Zellen, die vielseitig die Immunantwort beeinflussen.

Kennzeichnend für B-Lymphozyten ist die Expression des B-Zellrezeptors (BCR) mit Hilfe

dessen Antigene erkannt werden (Abb. 9). Zudem können B-Lymphozyten Antigene über

MHC II präsentieren (LANZAVECCHIA u. BOVE 1985; LANZAVECCHIA 2007). Nach

der Antigenerkennung folgt die klonale Expansion der angesprochenen Zellen in kurzlebige

Effektorzellen und langlebige Gedächtniszellen. Während der Reifung von B-Lymphozyten

zu Plasmazellen wird der BCR in ein sekretorisches Immunglobulin umgewandelt

(MCDERMOTT et al. 1982).

Abb. 9: Schematische Darstellung der B-Zellreifung und B-Zellaktivierung; modifiziert nach

TEDDER et al. (1984); Ig-Immunglobulin

Eine Plasmazelle ist ultrastrukturell durch Chromatinaggregate gekennzeichnet, die entlang

der Zellkernmembran aufgereiht sind. Ihr Zytoplasma ist mit rauem endoplasmatischen

Retikulum (rER) und immunglobulinhaltigen Zisternen gefüllt (SACCO 2009). Ihr Isotyp

Stammzelle Prä-B-Zelle unreife reife aktivierte Plasmazelle B-Zelle B-Zelle B-Zelle


wird über Zytokine umliegender CD4+ T-Zellen bestimmt. Nach ihrer Aktivierung

sezernieren Plasmazellen einen der fünf Immunglobulinisotypen. IgA stellt dabei die primäre

Barriere der Schleimhaut dar. Es wird als Dimer von Plasmazellen abgegeben und mit Hilfe

des polymeren Immunglobulinrezeptors (pIgR) durch das Epithel transportiert (LAMM 1997;

TIZARD 2004). Im Lumen verhindert es durch die Bildung von Immunkomplexen, die

Adhärenz des Erregers an das Epithel (immune exclusion; MCDERMOTT et al. 1982;

BRANDTZAEG 2009). IgM wird initial, während der Stimulation des Immunsystems

gebildet. Verglichen mit dem IgA binden große pentamere IgM-Moleküle nur instabil an den

pIgR (BRANDTZAEG 1975). IgG ist unterdessen proinflammatorisch wirksam, indem es

Leukozyten und Komplement aktiviert (LAMM 1997). IgG dominiert im Serum und wird nur

von einer kleinen Population der in der Schleimhaut lokalisierten Plasmazellen gebildet. Ein

selektiver Transport durch das Epithel fehlt und es verteilt sich durch Diffusion. IgG

dominiert in den peripheren Luftwegen und vermittelt die Phagozytose von Bakterien.

In der vorliegenden Untersuchung wurden mit Hilfe folgender Antikörper B-Lymphozyten,

Plasmazellen und Antikörper detektiert. Der monoklonale Antikörper IL-A71 richtet sich

spezifisch gegen bovines IgA. Der Antikörper reagiert mit einem Protein (61-63 kDa) auf der

schweren alpha-Kette des Immunglobulins und auf der sekretorischen Komponente des

Isotyps. Der monoklonale Antikörper IL-A30 bindet spezifisch an ein Epitop der zellulären

Oberfläche boviner IgM+ Lymphozyten. Der monoklonale Antikörper IL-A60 (Maus anti-

bovines IgG1) detektiert Proteine mit der Masse von 55-59 kDa und richtet sich gegen

bovines IgG1. Der Nachweis der spezifischen Bindung aller drei Antikörper wurde mittels

ELISA überprüft (NAESSENS et al. 1988; WILLIAMS et al. 1990).

Mit dem monoklonalen Antikörper CC56 werden B-Lymphozyten in den Lymphfollikeln

dargestellt. Der Antikörper detektiert ein Epitop mit demselben Molekulargewicht (180 kDa),

wie das WC3 Molekül (MUKWEDEYA et al. 1993). MUKWEDEYA (1993) vermutet einen

Bezug zum bovinen WC 3 Molekül, das auf Ig+ B-Lymphozyten präsent ist. Die Verteilung

und die Größe des WC 3 Antigens ähnelt dem humanen CD21, dem Komplementrezeptor 2,

der auf reifen und aktivierten B-Zellen exprimiert wird (NAESSENS u. HOWARD 1991;

MUKWEDEYA et al. 1993). Mit dem Antikörper werden B-Zellareale von Lymphknoten

und Tonsille markiert. Zusätzlich reagieren Zellen mit dendritischer Morphologie. Durch den


Antikörper werden keine boCD2+ T-Zellen, boWC1+ T-Zellen, Makrophagen, Monozyten

oder Granulozyten markiert.

2.3.4.6 Interleukin-2 Rezeptor+ Zellen

Der IL-2 Rezeptor ist ein Multimer aus CD25 (IL-Rα), CD122 (IL-2Rβ) und CD132 (IL-

2Rγ). Wichtig für die Affinitätsbindung des IL-2 an den Rezeptor ist der heterodimere

Komplex aus α und β Kette (NAESSENS et al. 1988; NAESSENS et al. 1992). IL-2 wirkt

unter anderem autokrin und wird hauptsächlich von CD4+ T-Helferzellen produziert.

Bei Mensch und Maus wird CD25 im Unterschied zu unreifen Thymozyten nur von wenigen

ruhenden CD4+ und CD8+ T-Zellen mit Gedächtnisphänotyp exprimiert (TAGA et al. 1991).

Der Rezeptor wird weiterhin von NK-Zellen, B-Zellen und Makrophagen exprimiert

(GAFFEN 2001). Murine CD25+ B-Lymphozyten gelten als aktiviert, funktionell ausgereift

und migratorisch aktiv (AMU et al. 2010). Die Stimulation des TCR oder BCR auf der

Oberfläche reifer Lymphozyten bewirkt eine temporär gesteigerte Expression des IL-2

Rezeptors (NELSON u. WILLERFORD 1998). Der Aktivierung des IL-2 Rezeptors folgt

eine Kaskade an Signalen, die die Immunfunktionen modulieren. Es fördert das T-

Zellwachstum und sichert das Überleben der Zelle. Die Bedeutung des IL-2 für die

Elimination des Pathogens ist abhängig davon, wie wirkungsvoll das Antigen die angeborene

Immunabwehr angeregt hat (BACHMANN u. OXENIUS 2007). Das Interleukin-2 Signal

beeinflusst besonders die CD8+ T-Zelldynamik und polarisiert entweder in Richtung

kurzlebige Effektorzellen oder langlebige Gedächtniszellen (COX et al. 2011). Auch wenn

das Interleukin-2 entbehrlich für die Initiation der frühen Immunantwort ist, so fördert es das

Überleben, die Differenzierung und die Bildung von Gedächtniszellen (BACHMANN u.

OXENIUS 2007).

In der vorliegenden Untersuchung wurde der monoklonale Antikörper CACT116A verwendet

um IL-2 Rezeptor+ Zellen zu markieren. Der Antikörper reagiert mit der alpha Untereinheit

des Interleukin-2 Rezeptors, der dem CD25 entspricht. Dabei ist das Vorkommen des IL-2

Rezeptors nicht auf die T-Zelllinie beschränkt, sondern erstreckt sich auf stimulierte T-

Lymphozyten, B-Lymphozyten und Monozyten (WAHL et al. 1987).

47 MATERIAL UND METHODEN


3.1 Versuchsdesign

Versuchstiere

Am Friedrich-Loeffler Institut am Standort Jena wurde ein respiratorisches Infektionsmodell

zur Untersuchung der Infektion mit Chlamydia (C.) psittaci in der Lunge von Kälbern

etabliert. Der Tierversuch wurde vom Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und

Verbraucherschutz (TLLV) unter der Registrierungsnummer: 04-002/07 und dem Thema:

„Infektionsversuch mit Chlamydophila (Cp.) psittaci beim Rind“ genehmigt. In den Versuch

wurden 42 männliche Holstein-Friesian Kälber aus konventioneller Haltung einbezogen, in

deren Herkunftsbetrieb keine Krankheiten aufgetreten waren, die mit Chlamydien zu

assoziieren sind. Die Tiere wurden in Gruppen aufgeteilt. Im Alter von fünf bis neun Wochen

erhielten 21 Kälber ein Inokulum, das C. psittaci enthielt und 21 Kälber ein steriles Inokulum.

Das Inokulum wurde einmalig an acht definierten Lokalisationen des Bronchialbaums

(Abb. 10) per Bronchoskop abgesetzt (OSTERMANN et al. 2010). Nach der Inokulation

wurden die Versuchstiere unter Einhaltung des Arbeitsschutzes täglich untersucht. Neben der

allgemeinen klinischen Untersuchung, erfolgte die Untersuchung des Herz-Kreislaufsystems

und des Respirationstrakts.

Inokulum

1,5 ml

1 ml

0,5 ml

Abb. 10: Inokulationsstellen in der

Lunge und Inokulationsmengen,

modifiziert nach OSTERMANN et al.

(2010), Lunge des Rindes

Dorsalansicht; modifiziert nach

NICKEL et al. (1979)

MATERIAL UND METHODEN 48

Die 42 Kälber des Tierversuchs erhielten ein Inokulum mit unterschiedlicher

Zusammensetzung:

- 21 Kälber erhielten 6 ml SPGA1-Nährmedium und BGM-Zellen, das lebende

C. psittaci mit einem Titer von 108 Einschluss-bildenden Einheiten (EBE) enthielt.

Der verwendete Stamm DC15 wurde aus einem abortierten Rinderfetus isoliert.

- 21 Kälber dienten als Negativkontrollen. Ihnen wurde ein steriles Inokulum aus

SPGA-Nährmedium und BGM-Zellen eingegeben.

Sektion

Jeweils drei Kälber, die das sterile und drei Kälber, die das erregerhaltige Inokulum erhalten

hatten, wurden im Anschluss an die Inokulation (pi) an den Tagen 2, 3, 4, 7, 10, 14 und 35/37

seziert. Vor der Sektion wurden die Kälber in tiefe Narkose2 gelegt und so eröffnet, dass

Trachea und Oesophagus abgeklemmt werden konnten. Dies verhinderte die Kontamination

der Lunge durch Aspiration. Die Tiere wurden anschließend unter Blutentzug getötet und

seziert. Befunde an der Lunge und am Tierkörper wurden dokumentiert (LAMBERTZ 2011).

Probenentnahme

Zahlreiche Proben wurden aus der Lunge und aus anderen Organsystemen entnommen und

für die histologische, immunhistologische, elektronenmikroskopische, mikrobiologische und

molekularbiologische Untersuchung vorbereitet (LAMBERTZ 2011).

3.2 Eigene Untersuchungen

3.2.1 Selektion der Versuchstiere

Von den 21 Kontrollkälbern wurden sechs Kälber für die eigenen Untersuchungen

ausgewählt. Berücksichtigt wurden hierbei je ein Kalb für alle Zeitpunkte nach Inokulation

mit Ausnahme von Tag 10 pi. Ein zusätzliches Kalb (Tier Nr. 7) wurde verwendet, da eine

Lungenprobe nicht zu bearbeiten war. Alle 21 mit C. psittaci inokulierten Kälber wurden in

die Untersuchung einbezogen. Die laufenden Tiernummern, Rasse, Geschlecht, Alter bei

Inokulation, Alter bei Sektion, Zeitpunkt der Sektion und der Versuchszeitraum sind in Tab. 2

zusammengefasst. 1 eigene Herstellung, siehe Anhang 2 i.v. 90mg/kg Pentobarbital Release®, WDT, Garbsen, Deutschland


Tab. 2: Liste der Kontrollkälber und der mit C. psittaci inokulierten Kälber von denen das

Untersuchungsmaterial stammte

Tier- nummer

Rasse Geschl. Alter bei

Inokulation (d)

Sektion dpi

Alter bei Sektion

(d)

Versuchs-zeitraum

Kon

trol

lkäl

ber

1 HF SB m. 43 2 45 04 - 05.2010 2 HF SB m. 42 3 45 01 - 02.2010 3 HF SB m. 52 4 56 04 - 05.2010 4 HF SB m. 49 7 56 01 - 03.2010 5 HF SB m. 54 14 68 01 - 03.2010 6 HF SB m. 57 35 92 01 - 03.2010 7 HF SB m. 47 7 55 04 - 05.2010

mit

C. p

sitta

ci in

okul

iert

e K

älbe

r

8 HF SB m. 42 2 44 08 - 10.2009 9 HF SB m. 50 2 52 08 - 10.2009 10 HF SB m. 46 2 48 02 - 04.2009 11 HF SB m. 53 3 56 08 - 10.2009 12 HF SB m. 50 3 53 08 - 10.2009 13 HF SB m. 44 3 47 02 - 04.2009 14 HF SB m. 39 4 53 08 - 10.2009 15 HF SB m. 52 4 56 08 - 10.2009 16 HF SB m. 47 4 51 02 - 04.2009 17 HF SB m. 54 7 61 08 - 10.2009 18 HF SB m. 45 7 52 08 - 10.2009 19 HF SB m. 52 7 59 02 - 04.2009 20 HF SB m. 49 10 59 08 - 10.2009 21 HF SB m. 48 10 58 08 - 10.2009 22 HF SB m. 47 10 57 02 - 04.2009 23 HF SB m. 50 14 64 08 - 10.2009 24 HF SB m. 53 14 67 02 - 04.2009 25 HF SB m. 54 14 68 02 - 04.2009 26 HF SB m. 51 35 86 08 - 10.2009 27 HF SB m. 50 37 87 08 - 10.2009 28 HF SB m. 51 37 88 08 - 10.2009

Geschl.-Geschlecht, HF–Holstein Friesian, SB–Schwarz-Bunte, m–männlich; d–Tage; dpi–Tage nach der Inokulation,

3.2.2 Asservieren des Untersuchungsmaterials

Die Proben, die für die histologische und immunhistologische Untersuchung bestimmt waren,

wurden während der Sektion schockgefroren. Dazu wurde ein Gefäß mit 2-Methylbutan3 zur

Hälfte gefüllt und mit flüssigem Stickstoff auf -70°C gekühlt. Die Proben wurden unmittelbar

3 Fa. Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz


nach der Entnahme für etwa 60 Sekunden mit einer Pinzette in das kalte Isopentan

eingetaucht. Die gefrorenen Proben wurden in Aluminiumfolie verpackt und bis zur weiteren

Behandlung bei -80°C gelagert. Gewebeproben, die für die elektronenmikroskopische

Präparation bestimmt waren, wurden auf eine Größe von 1-2 mm³ zugeschnitten und in

2,5%igem Glutaraldehyd in 0,1 Mol Kakodylatpuffer4 asserviert. Diese Proben wurden bei

4°C gelagert.

3.2.3 Selektion des Untersuchungsmaterials

3.2.3.1 Histologische und immunhistologische Untersuchung der Kontrolltiere

Aus der Lunge jedes Kontrolltieres wurden zehn Lungenproben (Abb. 11) in die

Untersuchung einbezogen. Die Lungenprobe a eines Kalbes (Tier Nr. 4) ließ sich am

Gefriermikrotom nicht bearbeiten, als Ersatz diente die entsprechende Probe eines anderen

Kalbes (Tier Nr. 7). Neben den Lungenproben wurden die Tonsilla pharyngea, der Nl.

mediastinalis und die Trachea für die Untersuchung ausgewählt.

Abb. 11: Probenentnahmeschema der Kontrollkälber, Lunge Rind Dorsalansicht; modifiziert

nach NICKEL et al. (1979)

4 eigene Herstellung, siehe Anhang

a – Lobus cranialis sinister, pars cranialis

b – Lobus cranialis sinister, pars caudalis

c1 – Lobus caudalis sinister, caudal

c2 – Lobus caudalis sinister, cranial

d – Lobus cranialis dexter, pars cranialis

e – Lobus cranialis dexter, pars caudalis

f – Lobus medius

g1 – Lobus caudalis dexter, caudal

g2 – Lobus caudalis dexter, cranial


3.2.3.2 Histologische und immunhistologische Untersuchung bei den mit C. psittaci

inokulierten Kälbern

Anhand der makroskopischen Befunde wurden drei Lungenlokalisationen für die

Untersuchung ausgewählt (Abb. 12). Die Proben stammten aus Lungenlappen, die im akuten

Stadium der Entzündung hochgradig verändert waren. Die Proben wurden aus der pars

caudalis des linken (b) oder rechten (e) Lobus cranialis, aus dem linken (c1) oder rechten (g1)

Lobus caudalis und dem Lobus accessorius (h) entnommen. Dabei wurde die Lungenseite

berücksichtigt, die stärkere Veränderungen zeigte (Tab. 3). War makroskopisch kein

Unterschied zwischen beiden Seiten erkennbar, wurde die Probe der linken Lunge gewählt.

Zusätzlich wurden Tonsilla pharyngea und Nl. mediastinalis untersucht.

Abb. 12: links: Verteilung der Lungenläsionen (durch gestrichelte Linien dargestellt,

beispielhaft bei Tier Nr. 9 am Tag 2 pi); modifiziert nach LAMBERTZ (2011); rechts:

Probenentnahmeschema der Lunge für die mit C. psittaci inokulierten Kälber; modifiziert

nach NICKEL et al. (1979)

b – Lobus cranialis

sinister, pars caudalis

c1 – Lobus caudalis

sinister, caudal

e – Lobus cranialis

dexter pars caudalis

g1 – Lobus caudalis

dexter, caudal

h – Lobus accessorius


Tab. 3: Entnahmestellen der Lungenproben für die immunhistologische Untersuchung bei den

mit C. psittaci inokulierten Kälbern

Tiernr.

Entnahmestellen Lobus cranialis

sinister, pars caudalis

Lobus cranialis dexter,

pars caudalis

Lobus caudalis sinister, caudal

Lobus caudalis dexter, caudal

Lobus accessorius

8 x x x 9 x x x 10 x x x 11 x x x 12 x x x 13 x x x 14 x x x 15 x x x 16 x x x 17 x x x 18 x x x 19 x x x 20 x x x 21 x x x 22 x x x 23 x x x 24 x x x 25 x x x 26 x x x 27 x x x 28 x x x

3.2.3.3 Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung

Von jedem mit C. psittaci inokulierten Tier der Tage 2-10 pi wurde eine Lungenlokalisation

für die Einbettung in Kunstharz ausgewählt (Tab. 4). Von den in Glutaraldehyd fixierten

Proben wurden jeweils 4 bis 5 Gewebeblöckchen je Lungenprobe eingebettet. Weiterhin

wurde Gewebe aus Paraffinblöcken von zwei Kälbern der Tage 2 und 3 pi und je einem Kalb

der Tage 4 und 7 pi entnommen, in denen immunhistologisch Chlamydiaceae-LPS

nachgewiesen worden war (LAMBERTZ 2011). Diese sind nicht optimal fixiert, können aber

für die ultrastrukturelle Untersuchung verwendet werden. Für die Entnahme des

Paraffinmaterials wurden die Paraffinschnitte, in denen der Chlamydiennachweis

immunhistologisch erfolgte, lichtmikroskopisch auf Erregergehalt kontrolliert und

erregerhaltige Areale auf dem Schnitt gekennzeichnet. Anschließend wurden aus dem


entsprechenden Bereich des Paraffinblocks mit Hilfe einer Biopsie-Einmalstanze5

Stanzproben mit einem Durchmesser von 1 mm entnommen. Um zusätzlich den

ultrastrukturellen Nachweis von Chlamydien mit Goldmarkierung durchführen zu können,

war die Einbettung des Gewebes in ein hydrophiles Kunstharz notwendig. Berücksichtigt

wurden solche Lokalisationen, die in der bereits erfolgten ultrastrukturellen Untersuchung

Hinweise auf Erregerstrukturen lieferten (Tab. 4). Dazu wurden weitere 3 bis 4

Gewebeblöckchen je Lokalisation von den in Glutaraldehydlösung fixierten Geweben in

LR-White6 eingebettet.

Tab. 4: Übersicht über die Gewebe, die transmissionselektronenmikroskopisch untersucht

wurden unter Angabe der Präparationstechnik

Tiernr. Lungen-lokalisation

Konventionelle TEM

Umbettung von Paraffin in Araldite

Immun-elektronen-mikroskopie

Kontrollen

1 e x 2 b x 3 b x 4 b x 5 b x 6 b x

2 dpi 8 b x x 9 b x x 10 b x x x

3 dpi

11 b x x 12 e x 13 h x x x 13 b x x

4 dpi 14 e x 15 e x 16 e x x x

7 dpi 18 b x x 19 b x x

10 dpi 20 b x 21 e x 22 e x

5 Einmalhautstanze, Fa. Mercateo AG, Köthen, Deutschland 6 Fa. London Resin Company Ltd., Berkshire, England

b – Lobus cranialis sinister, pars caudalis; c1 – Lobus caudalis sinister, caudal; e – Lobus cranialis dexter pars caudalis; g1 – Lobus caudalis dexter, caudal; h – Lobus accessorius


3.2.4 Immunhistologische Untersuchung

3.2.4.1 Allgemeines

Alle immunhistolologischen Untersuchungen wurden an Gefrierschnitten durchgeführt. Durch

Schockgefrieren des Gewebes ohne das Anwenden eines Fixierungsmittels werden Antigene

im Gewebeschnitt besser erhalten und zugänglich für immunhistologische Untersuchungen.

Im Vergleich zu formalinfixierten und paraffineingebetteten Proben lässt sich ein verbesserter

Antigenerhalt im Gewebe erzielen. Nachteil dieser Methodik ist jedoch ein mäßiger

Strukturerhalt. Angewendet wurde die indirekte Immunmarkierung, bei der neben einem

Primärantikörper ein enzymkonjugierter Sekundärantikörper eingesetzt wird (Abb. 13). Der

primäre Antikörper bindet zuerst an das zu lokalisierende Antigen und wird im sich

anschließenden Reaktionsschritt durch einen sekundären Antikörper gebunden. Ein Substrat

wird zugesetzt und während der Reaktion durch das Enzym reduziert. Die frei werdenden

Protonen bewirken die Umsetzung eines eingesetzten farblosen Chromogens in ein

unlösliches farbiges Präzipitat, das die gelungene Immunmarkierung sichtbar macht.

Abb. 13: Schema der indirekten Immunmarkierung, G–Epitope im Gewebe, A–Antigen,

B-Primärantikörper, C-markierter Sekundärantikörper; modifiziert nach ROMEIS (2010)


3.2.4.2 Herstellung der Gefrierschnitte

Die Bearbeitung der Proben, die von den Kälbern stammten, die C. psittaci erhalten hatten,

erfolgte unter einer Atemschutzmaske mit Filter7. Die in Aluminiumfolie verpackten Proben

wurden mit gekühlter Pinzette und Skalpell auf Trockeneis oder im Kryostaten8 auf 1x1x1 cm

große Gewebeblöcke getrimmt und mittels Gefriermedium9 auf den Objekthalter des

Mikrotomschlittens aufgefroren. Von den Proben wurden mindestens 15 konsekutive

Kryostatschnitte der Lungen mit einer Schnittdicke von 7 µm und der Tonsilla, Trachea und

Lymphknoten mit einer Schnittdicke von 5 µm angefertigt und auf mit Chromalaungelatine10

beschichtete Objektträger11 aufgezogen. Die Gefrierschnitte der Gewebe, die von den mit

C. psittaci inokulierten Kälbern stammten, wurden für etwa fünf Sekunden in Azeton12

vorfixiert. Die Objektträger trockneten bei Raumtemperatur über Nacht und wurden bis zur

sich anschließenden Färbung oder immunhistologischen Markierung bei -20°C aufbewahrt.

3.2.4.3 H.E. - Übersichtsfärbung

Die Hämalaun-Eosin Färbung wird als Übersichtsfärbung routinemäßig eingesetzt. Dabei

sorgt das Hämalaun als positiv geladener Farbstoff für eine selektive Blaufärbung des

Zellkerns. Eosinlösungen färben das Zytoplasma, Kollagene, Keratine und Erythrozyten rot.

Die Gefrierschnitte wurden für 5 Minuten in einer Hämalaun-Lösung nach P. Mayer13 gefärbt.

Anschließend wurde durch eine 15-minütige Spülung unter Leitungswasser die Bläuung des

Farbstoffs erreicht und ungebundener Farbstoff ausgewaschen. Es schloss sich eine

dreiminütige Gegenfärbung in 1%igem Eosin14 an. In der aufsteigenden Alkoholreihe wurden

die Schnitte entwässert. Dazu wurden sie zweimal kurz in 70%igen vergällten Alkohol und

zweimal in 80%igen vergällten Alkohol eingetaucht und verblieben je nach

Differenzierungsgrad zweimal bis zu 2 Minuten in 96%igem Alkohol. Die Schnitte wurden

im Anschluss für 3 min in Karbolxylol15 inkubiert und schließlich noch weitere zwei Mal für

7 Dräger X-plore 7500, Dräger Safety AG & Co. KGaA, Lübeck, Deutschland 8 Figocut 2800E, Fa. Leica Instruments GmbH, Wetzlar, Deutschland 9 Neg-50, Fa. Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreieich, Deutschland 10 eigene Herstellung; siehe Anhang 11 Star Frost, Fa. Engelbrecht GmbH, Edermünde, Deutschland 12 Fa. Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe, Deutschland 13 eigene Herstellung; siehe Anhang 14 eigene Herstellung; siehe Anhang 15 eigene Herstellung; siehe Anhang


2 min in Xylol gestellt. Die gefärbten Gefrierschnitte wurden luftdicht mit Kanadabalsam16

eingedeckt.

3.2.4.4 Primärantikörper

In den Lungen, der Tonsille, dem Lymphknoten und der Trachea wurden folgende Antigene

dargestellt: CD4, CD8, CD25, boWC1, MHC II, CD68, CD1b, IgA, IgM, IgG1 und boWC3.

Zudem wurde in der Lunge Panzytokeratin dargestellt. Der dazu gewählte monoklonale

Antikörperklon MNF11617 (Maus anti-humanes Zytokeratin) reagiert mit einem auf

Epithelzellen weit verbreiteten Epitop und markiert das Zytoplasma von Zellen epithelialen

Ursprungs.

An den Geweben, die von den mit C. psittaci inokulierten Kälbern stammten, wurde

immunhistologisch das Chlamydiaceae-LPS dargestellt. Der gewählte monoklonale

Antikörper ACI-P50018 (Maus anti-Chlamydia) reagiert dabei mit einem genusspezifischen

Epitop des Chlamydien-LPS. Der Antikörper markiert intrazelluläre Einschlüsse,

extrazelluläre Elementarkörperchen und freies zellassoziiertes Antigen u.a. von C. psittaci.

Die optimale Verdünnung der Primärantikörper wurde durch eine Titrationsreihe am

Lungengewebe und Lymphknoten ermittelt. In Tab. 5 sind Spezifität des Klons, Isotyp, die

dargestellten Zelltypen, die angewendete Verdünnung und die Referenzen aufgelistet.

16 Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Seelze-Hannover, Deutschland 17 Dako Denmark A/S, Glostrup, Dänemark 18 Progen Biotechnik GmbH, Heidelberg, Deutschland


Tab. 5: Übersicht über die verwendeten Primärantikörper

Klon Spezifität Isotyp markierte Zelltypen Verd. Referenz

IL-A1119 CD4 IgG2 T-Helferzellen unv. (BALDWIN et al.

1986)

CC6319 CD8 IgG2a zytotoxische T-Lymphozyten unv. (MACHUGH et al.

1991)

CACT116A20 boCD25 IgG1 aktivierte Lymphozyten,

Monozyten 1:100

(NAESSENS et al. 1992)

IL-A2919 boWC1 IgG1 γδ+ T-Lymphozyten 1:800 (CLEVERS et al.

1990)

IL-A2119 MHC II IgG2a Lymphozyten, Monozyten,

Epithel-, Endothelzellen 1:100

(TAYLOR et al. 1993)

EBM1121 CD68 IgG1, kappa

Makrophagen, myeloide Zellen, neoplastische Zellen

1:800 (ACKERMANN et al.

1994)

CC2019 CD1b IgG2a Subpopulation dendritischer

Zellen, Thymozyten 1:10

(HOWARD et al. 1993)

IL-A7119 IgA IgG2a IgA+ Zellen 1:10 (WILLIAMS et al.

1990)

IL-A3019 IgM IgG1 IgM+ Zellen 1:100 (NAESSENS et al.

1988)

IL-A6019 IgG1 IgG1 IgG1+ Zellen 1:100 (WILLIAMS et al.

1990)

CC5619 boWC3 IgG2a Immunglobulin+ B-Zellen 1:2 (NAESSENS u.

HOWARD 1991)

MNF116 Zytokeratin IgG1, kappa

Epithelzellen 1:100 Dako Denmark A/S, Glostrup, Dänemark

ACI-P500 Chlamydiaceae-LPS IgG3 Chlamydien 1:200 (NAHER et al. 1988)

Verd.–Verdünnung; unv.–unverdünnt

3.2.4.5 Durchführung der immunhistologischen Markierung

Die Gefrierschnitte wurden aus dem Gefrierschrank entnommen und trockneten für 60

Minuten bei Raumtemperatur (RT). Es folgte bei unterschiedlicher Temperatur eine 10-

minütige Fixierung in Azeton (Tab. 6).

Tab. 6: Temperatur der zur Fixierung eingesetzten Azetonlösung bei den verwendeten mAbs

IL-A11 CC63

CACT 116A

IL-A29

IL-A21

EBM 11 CC20

IL-A71

IL-A30

IL-A60 CC56

MNF 116

ACI-P500

RT - - - + + + + + + + + + +

-20°C + + + - - - - - - - - - -

RT–Raumtemperatur

19 European Collection of Cell Cultures, Salisbury, England 20 Fa. VMRD, Pullman, USA, vertrieben durch Labor Diagnostik Leipzig, Leipzig, Deutschland 21 Fa. Dako Denmark A/S, Glostrup, Dänemark


Die Gefrierschnitte wurden mit einem Fettstift22 umrandet und zweimal für 5 Minuten in

DPBS23 gespült. Die Gefrierschnitte wurden abhängig von ihrer Größe generell mit 60-100 µl

Medium oder Antikörper bedeckt. Um unerwünschte Hintergrundmarkierungen zu

vermeiden, die entstehen, wenn der sekundäre Antikörper mit endogenen Epitopen der Probe

kreuzreagiert, wurden sie mit verdünntem Normalserum vom Schaf in einer Konzentration

von 1:10 in BSA/DPBS24 in feuchten Kammern25 inkubiert. Nach 20-minütiger Einwirkzeit

wurde das Serum dekantiert und der Primärantikörper aufgetragen. Die Negativkontrolle

wurde mit BSA/DPBS anstelle des Primärantikörpers inkubiert. Die Schnitte wurden für 60

Minuten in feuchte Kammern eingesetzt. Im Anschluss wurde der Antikörper abgespült und

die Schnitte dreimal für 5 Minuten in DPBS gespült. Um die im Gewebe enthaltene endogene

Peroxidase zu blockieren, wurden die Gefrierschnitte für 40 Minuten bei 37°C in warmer

0,06%iger Phenylhydrazinlösung26 im Wasserbad27 inkubiert. Die Objektträger wurden erneut

dreimal für 5 Minuten in DPBS gespült. Anschließend folgte die Inkubation mit dem

sekundären Antikörper in der feuchten Kammer. Der Sekundärantikörper NA931V28 (Schaf

anti-Maus IgG) wurde 1:50 verdünnt in BSA/DPBS angewendet. Im Anschluss an die

einstündige Inkubationszeit wurden die Schnitte mit DPBS abgespült und weitere drei Mal in

DPBS gespült. Die Schnitte wurden für 7 Minuten bei Raumtemperatur in frisch angesetzte

und filtrierte Diaminobenzidin-Lösung29 unter Zusatz von 3%igem Wasserstoffperoxid30

verbracht. Durch das Spülen mit Aqua dest. kam es zum Abbruch der Reaktion. Das

kurzzeitige Auftropfen von 0,01%iger Osmiumlösung31 verstärkte die Braunfärbung. Es

folgte die 10-minütige Gegenfärbung der immunmarkierten Gefrierschnitte mit 2%iger

Methylengrünlösung32. Diese wurden in Aqua dest. solange gespült bis sich keine Farbwolken

mehr lösten. Die Schnitte wurden abschließend mit Glyceringelatine33 luftdicht eingedeckt.

22 PAP-Pen/Dako Pen, Fa. Dako, Hamburg, Deutschland 23 eigene Herstellung, siehe Anhang 24 eigene Herstellung, siehe Anhang 25 Fa. Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe, Deutschland 26 eigene Herstellung, siehe Anhang

27 Mikrobiologischer Brutschrank B6200, Fa. Kendro Laboratory Products GmbH, Langenselbold, Deutschland

28 GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Deutschland


30 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland


32 eigene Herstellung, siehe Anhang 33 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland


3.2.4.6 Durchführung der immunhistologischen Doppelmarkierung

Die Doppelmarkierung von CD1b+ dendritischen Zellen und Epithelstrukturen sollte an

ausgewählten Lungenschnitten der mit C. psittaci inokulierten Kälber die Verteilung

dendritischer Zellen in Bezug zu hyperplastischen Epithelien darstellen. Abweichend vom

zuvor beschriebenen Protokoll (siehe Kap. 3.2.4.5), folgte nun die Anwendung zweier

Primärantikörper und zweier Sekundärantikörper. Die Schnitte wurden aus dem

Gefrierschrank entnommen und bei Raumtemperatur für eine Stunde getrocknet. Es schloss

sich eine 10minütige Fixierung in Azeton bei Raumtemperatur an. Die Gefrierschnitte wurden

mit einem Fettstift umrandet und in DPBS gespült. Im Anschluss wurde Normalserum34 aus

der Ziege in einer Verdünnung von 1:10 in BSA/DPBS aufgetragen und für 20 Minuten in

feuchten Kammern belassen. Die Inkubation der aufgetragenen Substanzen wurde unter

mehrmaliger Spülung in DPBS beendet (siehe Kap. 3.2.4.5). Es folgte die 60-minütige

Inkubation der Schnitte mit dem Primärantikörper CC20. Eine 40-minütige Inkubation mit

0,06%igem Phenylhydrazin, dem das 60-minütige Auftragen mit einem Sekundärantikörper

(Ziege anti-Maus IgG235) in einer Konzentration von 1:50 in BSA/DPBS folgte. Der

sekundäre Antikörper war mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert. Die erste Reaktion

wurde mittels DAB entwickelt unter einer Einwirkzeit von 7 Minuten. Anschließend wurden

die Schnitte mit einem zweiten Primärantikörper MNF116 für 60 Minuten inkubiert. Es folgte

die Antigen-Antikörper-Bindung mit einem Sekundärantikörper (Ziege anti-Maus IgG136),

der mit Alkalischer Phosphatase (AP) konjugiert war und in einer Verdünnung von 1:50 in

BSA/DPBS angewendet wurde. Die Antigen-Antikörper-Bindung wurde mit Levamisol37

versetztem Vector Blue38 entwickelt. Für die Gegenfärbung wurde Kernechtrot39 verwendet.

Die markierten Gewebeschnitte wurden mit Glyceringelatine eingedeckt.

34 Tierhaus Friedrich-Loeffler Institut, Jena, Deutschland 35 Fa. SouthernBiotech, Birmingham, USA

36 Fa. SouthernBiotech, Birmingham, USA

37 Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

38 Fa. Biozol Diagnostica Vertrieb GmbH, Eiching, Deutschland



3.2.4.7 Auswertung und Dokumentation

Semiquantitative Auswertung der immunhistologischen Markierung und der HE-Färbung

Die Gefrierschnitte der Organe wurden mit Hilfe eines Lichtmikroskops40 ausgewertet. Für

die HE gefärbten und immunhistologisch CD4, CD8, CD25, γδ, MHC II, CD68, CD1b, IgA,

IgM und IgG1 markierten Gewebe wurden die Zellzahlen semiquantitativ anhand eines

Bewertungsscores erhoben (Tab. 7). Der Bewertungscore wurde auch auf die histologisch

identifizierten neutrophilen Granulozyten (PMN) angewendet. Die Auswertung

berücksichtigte die Kompartimente der Trachea mit respiratorischem Epithel und Lamina

propria; der Tonsille mit respiratorischem Epithel, Interfollikularzone, Lymphfollikel und

subepithelialem Bereich und dem Lymphknoten mit Cortex, Paracortex und Medulla. Die

Zellen wurden in vier Gesichtsfeldern in der 400fachen Vergrößerung ausgezählt.

In der Lunge wurden folgende Kompartimente unterschieden: luftleitendes System mit

Bronchus und Bronchiolus, luftaustauschendes System mit Alveolen und Interalveolarsepten,

interlobuläres Interstitium und Blutgefäße. Die Zellzahlen in Bronchus und Bronchiolus und

in den Blutgefäßen wurden für das gesamte Kompartiment bestimmt. Die Datenerhebung für

den Alveolarraum und das interlobuläre Interstitium erfolgte in vier Gesichtsfeldern in der

400fachen Vergrößerung.

Tab. 7: Tabellarische Darstellung der Bewertungskriterien für die semiquantitative

Auswertung nach immunhistologischer Markierung der Leukozytensubtypen

Semiquantitative Auswertung

Zellzahlen/Blickfeld bzw. /Bronchus, /Bronchiolus,

/Blutgefäß Interpretation

- 0 keine DAB+ Zelle (+) 1-5 Zellen einzelne DAB+ Zellen + 6-10 Zellen wenige DAB+ Zellen

++ 11-20 Zellen viele DAB+ Zellen +++ 21-50 Zellen sehr viele DAB+ Zellen

++++ >50 Zellen massenhaft DAB+ Zellen

40 Firma Olympus, Hamburg, Deutschland


Semiquantitative Auswertung von C. psittaci in der Lunge

In den Gefrierschnitten der mit C. psittaci inokulierten Kälber wurde der immunhistologische

Nachweis des Erregerantigens durchgeführt. Als Erregerantigen wurden braune, granuläre

Reaktionsprodukte, deren Morphologie variierte, innerhalb des Zytoplasmas einer Zielzelle

angesprochen. Zu unterscheiden waren kleine, kugelige Granula (1 bis 3 µm), große, runde

Einschlüsse (5 bis 10 µm) und spindelförmige Markierungen (bis 20 µm). Die Proben der

Kontrolltiere waren negativ (LAMBERTZ 2011). Die Auswertung der immunhistologisch mit

dem mAb ACI-P500 markierten Schnitte, erfolgte in der 100fachen Vergrößerung unter

Berücksichtigung semiquantitativer Kriterien, die beispielhaft in Abb. 24 dargestellt sind. Es

erfolgte eine Einteilung in: keine Erregerstadien nachweisbar, wenige Erregerstadien

nachweisbar (Abb. 24A), viele Erregerstadien nachweisbar (Abb. 24B) und sehr viele

Chlamydien-Einschlüsse nachweisbar (Abb. 24C).

Quantitative Auswertung des BALT

Die Lungenlokalisationen beider Versuchsgruppen wurden hinsichtlich lymphatischer

Aggregate untersucht. BALT wird definiert als organisiertes lymphatisches Gewebe, das an

Bronchien und Bronchiolen liegt. In der vorliegenden Untersuchung wurde die Anzahl und

Lage von nodulär organisierten, lymphatischen Aggregaten ermittelt, die sich durch den mAb

CC56 netzwerkartig schwach bis intensiv markierten. Weiterhin wurde die Menge an

unorganisierten lymphatischen Infiltraten aus CD4+ T-Lymphozyten ermittelt. Gezählt

wurden Anhäufungen, die aus mindestens zehn Zellen bestanden, deren Zellmembranen sich

berührten oder die locker nebeneinander lagen.

Quantitative Auswertung von CD4+, CD8+, γδ+ T-Lymphozyten

Zusätzlich zur semiquantitativen Auswertung der CD4+, CD8+ und γδ+ Zellen in den

Gefrierschnitten wurden die Zellzahlen quantitativ in ausgewählten Lungenproben ermittelt.

Berücksichtigt wurde der Lobus cranialis sinister, pars caudalis (b), der Lobus caudalis

sinister (c1) und der Lobus accessorius (h) der Kontrollkälber und die Lungenproben, der mit

C. psittaci inokulierten Tiere. Die Datenerhebung erfolgte an den immunhistologisch

markierten Gefrierschnitten und wurde mit Hilfe eines computergestützten halb-


automatischen Bildanalysesystems41 durchgeführt. Das Bild des auszuwertenden

Lungenschnittes wurde lichtmikroskopisch erfasst und über eine Kamera42 auf einen

Computerbildschirm übertragen. In der 400fachen Vergrößerung wurde ein Standbild

aufgenommen und die verwendete Objektivgröße in das Computerprogramm eingegeben. Die

Fläche des angezeigten Messfeldes (ROI), in der die Zellzählung erfolgte, betrug stets 0,16

mm². Um für die Auswertung berücksichtigt zu werden, mussten im Messfeld zumindest 50%

an Gewebe vorhanden sein. War die Voraussetzung nicht erfüllt, musste der Schnitt in

derselben Richtung, in der das Präparat gerade verschoben wurde, weiter bewegt werden. Bei

der Zählung wurden Zellen berücksichtigt, deren Zellkern sichtbar war und deren

Zellmembran zu 50% braun markiert war. Zellen die Kontakt zur rechten oder unteren

Begrenzungslinie des Messfeldes hatten, blieben unbeachtet. Pro Lungenschnitt wurden fünf

ROIs in der 400fachen Vergrößerung ausgezählt (Abb. 14).

Abb. 14: Zellzählung am Gefrierschnitt der Lunge schematisch dargestellt – links: bei den

Kontrollkälbern; rechts: bei den mit C. psittaci inokulierten Kälbern; TS-Teilstrich; ROI-

Messfeld

Um eine repräsentative Auswahl der Messfelder zu erhalten, wurde als Ausgangspunkt die

Mitte des Lungenschnittes bzw. bei den mit C. psittaci inokulierten Kälbern das Zentrum der

Läsion unter Verwendung der Lupenvergrößerung anvisiert. Hier wurde das erste Messfeld

(ROI 1) gesetzt. Um die folgenden Messfelder zu erreichen, wurde der Schnitt, um die

Übersicht zu behalten, in der 200fachen Vergrößerung wie folgt verschoben:

41 Cell* imaging Software, Fa: Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster, Deutschland 42 DP71, Fa: Olympus, Hamburg, Deutschland


- ausgehend vom ersten ROI um einen Teilstrich (TS) nach unten und um zwei TS nach

rechts (ROI 2)

- um vier TS nach links (ROI 3)

- um zwei TS nach oben (ROI 4)

- um vier TS nach rechts (ROI 5).

Bei den Lungenlokalisationen der mit C. psittaci infizierten Kälber wurde, um sicher zu

stellen, dass sich die fünf Messfelder innerhalb der Läsion befanden, der Radius peripher des

ersten ROIs vermindert und die Teilstriche zwischen den Messfeldern halbiert.

Die ausgezählten Zellen wurden auf eine Fläche von 1 mm² umgerechnet.

Statistik

Die Messwerte aus der Auszählung des lymphatischen Gewebes und der T-Zellsubtypen/mm²

wurden statistisch ausgewertet. Verwendet wurde das Programm SPSS43 unter Anwendung

des Kolmogorov-Smirnov-Test für den Test auf Normalverteilung und der Mann-Whitney-U-

Test zur Prüfung der Signifikanz der Übereinstimmung zweier unabhängiger Verteilungen

unter der Annahme eines Signifikanzniveaus von p ≤ 0,05. Repräsentative Gewebeschnitte

wurden mit Hilfe eines computergestützten Bildanalysesystems fotografisch dokumentiert.

3.2.5 Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung

3.2.5.1 Vorbehandlung paraffineingebetteter Gewebe

Die aus Paraffinblöcken ausgestanzten Gewebeproben wurden zunächst in Xylol für 15

Minuten entparaffiniert. Die Proben wurden auf einer Rotationsscheibe44 langsam bewegt und

währenddessen zwei Mal für 15 Minuten in 90%igem vergälltem Alkohol inkubiert. Es folgte

die Inkubation in 70%igem vergälltem Alkohol zwei Mal für je 15 Minuten und einmalig für

15 Minuten in 50%igem vergälltem Alkohol. Anschließend wurden die Proben für 15

Minuten in Aqua dest. gestellt. Hiernach wurde entsprechend der üblichen Präparation für die

ultrastrukturelle Untersuchung verfahren (siehe Kap. 3.2.5.2).

43 SPSS Statistics 19, IBM, Deutschland 44 Culture tube Rotator SC1, Fa. Stuart Scientific, Stone Staffordshire, England


3.2.5.2 Einbettung in Araldite CY212

Von den in 2,5%iger kakodylatgepufferter Glutaraldehydlösung fixierten Gewebeproben

wurden 10–12 Gewebeblöckchen pro Lokalisation in Epoxidharz45 eingebettet. Hierzu wurde

nach einer Einwirkzeit von mindestens 24 Stunden das Glutaraldehyd mit Hilfe von

Kakodylatpuffer ausgewaschen. Die Proben wurden langsam auf einer Rotationsscheibe

bewegt und fünf- bis sechsmal jeweils für 30 Minuten mit dem Puffer gespült. Es schloss sich

eine zweistündige Nachfixierung mit 2%igem Osmiumtetroxid46 an, das den Kontrast des

Gewebes erhöhte. Das Osmiumtetroxid wurde wiederum mit Kakodylatpuffer ausgewaschen.

Am Folgetag wurden die Proben in steigender Azetonkonzentration schrittweise entwässert:

- für 15 Minuten in 30%igem Azeton,



- für weitere 60 Minuten in 90%igem Azeton.

Anschließend wurden die Proben in wasserfreies Azeton verbracht und zweimal für 30

Minuten inkubiert. Die Infiltration mit dem Einbettmedium erfolgte stufenweise. Zunächst

wurde wasserfreies Azeton und Araldite I47 im Verhältnis 3:1 gemischt und eine Stunde auf

die Proben verbracht. Es folgte für eine Stunde die Infiltration mit einem Verhältnis von

Azeton zu Araldite I von 1:1. Über Nacht wurden die Proben dann in einem Teil wasserfreiem

Azeton mit drei Teilen Araldite I eingelegt. Am nächsten Tag folgte die Inkubation der

Proben mit frisch angesetzter Araldite I für zweimal 1 bis 2 Stunden bei 50°C. Die Proben

wurden schließlich in reines Araldite II48 überführt. In Araldite II verblieben sie für weitere

zwei Stunden bei 50°C. Die Proben wurden schließlich in Silikonkautschukformen49

überführt, die mit Araldite II aufgefüllt wurden. Die Proben wurden mindestens 48 Stunden

bei einer Temperatur von 50-70°C ausgehärtet.

45 Araldite CY212, Fa. Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland 46 eigene Herstellung, siehe Anhang 47 eigene Herstellung, siehe Anhang 48 eigene Herstellung, siehe Anhang 49 Fa. Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland


3.2.5.3 Anfertigung von Semidünnschnitten

Von drei der pro Lokalisation eingebetteten Gewebeblöckchen wurden Semidünnschnitte mit

einer Schnittdicke von 300 nm angefertigt. Anhand derer konnte die Fixierung und

Einbettung überprüft werden. Weiterhin dienten Semidünnschnitte der Orientierung im

Gewebe für die Auswahl der Ultradünnschnitte. Vor der Herstellung der Semidünnschnitte

wurde die eingebettete Probe mit einer Fräse50 von überschüssigem Harz befreit und konisch

getrimmt. Das getrimmte Kunstharzblöckchen wurde in das Ultramikrotom51 eingespannt, ein

Diamantmesser52 wurde eingesetzt und an der Anschnittsfläche ausgerichtet. Vor dem

Schneiden wurde der Messertrog des Mikrotoms mit sterilem Ampuwa-Wasser53 gefüllt,

sodass die Messerschneide feucht blieb aber kein Wasser das Kunstharzblöckchen benetzte.

Die Semidünnschnitte wurden am Ultramikrotom geschnitten und mit einem Glasstab aus

dem Wassertrog abgefangen und ummittelbar flotierend mit Toluidinblau54 gefärbt.

Anschließend wurde der Schnitt auf einen Tropfen aus A. dest auf einen Objektträger

übertragen und zum Trocknen auf eine 60°C heiße Heizplatte55 gelegt. Trockene

Semidünnschnitte wurden mit Entellan56 eingedeckt und bei 4°C gelagert.

3.2.5.4 Anfertigung von Ultradünnschnitten

Die Semidünnschnitte wurden lichtmikroskopisch untersucht und Bereiche, die von Interesse

waren, wurden in eine Schemazeichnung eingezeichnet. Die in Kunstharz eingebetteten

Gewebe wurden in den Päparatehalter eingespannt und unter mikroskopischer Kontrolle

erfolgte das Zuschneiden der Probe mit einer Rasierklinge, sodass die ausgewählten Bereiche

erhalten blieben. Der Block wurde in Form eines Trapezes getrimmt und hatte eine

Oberfläche von maximal 0,1-0,3 mm2. Im Folgenden wurde das Diamantmesser57 in den

Messerhalter eingesetzt und der Wassertrog mit sterilem Ampuwa-Wasser aufgefüllt. Die

80 nm dicken Ultradünnschnitte glitten als Schnittbänder in einen wassergefüllten Trog. Aus

50 Leica EM Trim, Fa. Leica, Bensheim, Deutschland

51 Ultracut UCT-GA-DE 1/00, Fa. Leica, Bensheim, Deutschland

52 Histo Hi 7447, Fa. DiATOME, Hatfield, USA 53 Ampuwa Wasser für Injektionszwecke, Nord Apotheke, Jena, Deutschland

54 Eigene Herstellung, siehe Anhang 55 Leica EM MP, Fa. Leica, Bensheim, Deutschland 56 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

57 Ultra 45°, DiS-Galetzka Ultramikrotomie Messerservice, Weinheim, Deutschland


diesem wurden die ultradünnen Schnitte mit einem Kupfernetz58 aufgenommen und auf

Filterpapier getrocknet.

3.2.5.5 Nachkontrastierung mit Uranylazetat und Bleizitrat

Um einen höheren Kontrast zu erreichen, wurden die Ultradünnschnitte mit Uranylazetat und

Bleizitrat kontrastiert (VENABLE u. COGGESHALL 1965). Das Uranylazetat reagiert mit

Nukleinsäuren und das Bleizitrat mit Membranen, Proteinen, Nukleinsäuren und Glykogen.

Für die Kontrastierung wurden die Netzchen für 15 Minuten auf einen Tropfen aus

Uranylazetatlösung59, der sich auf einer Zahnwachsplatte60 befand, gelegt. Im Folgenden

wurde die Lösung mit Ampuwa-Wasser abgespült und das Trägernetz getrocknet. Ein Teil der

Zahnwachsplatte wurde in eine Petrischale eingesetzt, an deren Rand Natriumhydroxid-

Plätzchen61 ausgelegt waren, um das Kohlenstoffdioxid zu binden. Im Anschluss wurde das

Trägernetz für 25 Minuten auf einen Tropfen aus Bleizitrat-Lösung62 gelegt. Die Lösung

wurde ebenfalls mit sterilem Ampuwa-Wasser gründlich abgespült und die Netze getrocknet.

3.2.5.6 Einbettung in LR-White

Auch für die LR-White Einbettung wurden Gewebeproben, die in 2,5% Glutaraldehyd fixiert

worden waren mit 4°C kaltem Kakodylatpuffer aus den Gewebeblöckchen ausgewaschen.

Der Puffer wurde fünf Mal in 30-minütigen Abständen gewechselt. Die Proben wurden

während der Bearbeitung bei 4°C aufbewahrt. Sie wurden in aufsteigenden Konzentrationen

von Ethanol: zunächst 30%, dann 50% und schließlich 70%, für jeweils 30 Minuten

entwässert. Anschließend wurden sie für jeweils 30 Minuten in eine aufsteigende Mischung

aus absolutem Ethanol und LR-White verbracht. Dabei erhöhte sich mit jedem Schritt der

Anteil des hydrophilen Acrylharzes. Begonnen wurde mit einem Verhältnis von 2:1, es

folgten gleiche Teile von absolutem Ethanol und LR-White und schließlich ein Verhältnis von

1:2 mit einem überwiegenden Anteil des Harzes. Die Proben verblieben über Nacht in LR-

White und wurden im Anschluss unter Luftabschluss in Gelatinekapseln63 eingebettet. Die

58 Typ 200 square mesh, ppar 3,05 mm, Fa. Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland 59 eigene Herstellung, siehe Anhang

60 Dental-Wachs, Fa. Plano, GmbH, Wetzlar, Deutschland 61 Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland

62 eigene Herstellung, siehe Anhang 63 Gelatinekapseln Größe 3, Fa. Plano, Wetzlar, Deutschland


Kapseln härteten für 24 Stunden bei 50°C aus. Im Anschluss wurden 300 nm dicke

Semidünnschnitte und 80 nm dicke Ultradünnschnitte angefertigt (siehe Kap. 3.2.5.3; Kap

3.2.5.4), die abweichend auf 200 mesh Goldnetzchen64 aufgezogen wurden.

3.2.5.7 Indirekte Immunogoldmarkierung an Ultradünnschnitte n

Die mit Gewebe beladenen Netzchen wurden für 30 Minuten auf einen Tropfen 0,2%iger

BSA-c65 Lösung in DPBS aufgelegt (Tab. 8). Daran schloss sich die 10-minütige Inkubation

auf einem Tropfen aus 0,02 Mol Glycin66 in Aqua. bidest und die 1-stündige Inkubation mit

dem mAb ACI-P500. Dieser wurde 1:250 in DPBS mit Zusatz von Ziegennormalserum und

BSA-c67 verdünnt. Die Negativkontrolle wurde mit einem für das BVD-Virus spezifischen

Primärantikörper68 in derselben Konzentration inkubiert. Anschließend folgte eine 5-malige

Spülung mit der Dauer von jeweils 2 Minuten unter Verwendung des bereits verwendeten

DPBS mit 0,2% BSA-c Gemisches. Der mit 18 nm Gold-konjugierte zweite polyklonale

Antikörper69 wurde mit DPBS und BSA-c70 1:10 verdünnt und für 60 Minuten auf dem

Schnitt belassen. Anschließend wiederholte sich das Waschen der Netzchen. Die Reaktion

wurde unter mehrmaliger Spülung in Ampuwa-Wasser beendet. Es folgte die Kontrastierung

in Uranylazetat und Bleizitrat (siehe Kap. 3.2.5.5).

Tab. 8: Schritte der indirekten Immunogoldmarkierung am Ultradünnschnitt

1.

Schritt 2.

Schritt 3. Schritt

4. Schritt

5. Schritt 6. Schritt 7.

Schritt

Medium

DPBS mit

0,2% BSA-c

0,02 M Glycin

mAb ACIP500 bzw. C16

verd. in DPBS mit 0,2%

Ziegennormalserum u. 0,2% BSA-c

DPBS mit

0,2% BSA-c

Ziege anti-Maus IgG markiert mit Gold in DPBS mit 0,2% BSA-c 1:10

DPBS mit 0,2% BSA-

c Ampuwa

Einwirkzeit 30

Minuten 10

Minuten 1 Stunde

5 x je 2 Minuten

1 Stunde 5 x je 2 Minuten

5 x je 5 Minuten

64 Fa. Baltic Präparation, Weinheim, Deutschland 65 eigene Herstellung, siehe Anhang 66 eigene Herstellung, siehe Anhang 67 eigene Herstellung, siehe Anhang 68 mAb C16, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Moennig, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover,

Deutschland 69 Ziege anti-Maus IgG 18nm Gold, DIANOVA GmbH, Hamburg, Deutschland 70 eigene Herstellung, siehe Anhang


3.2.5.8 Auswertung und Dokumentation

Die Auswertung der ultradünnen Schnitte wurde mit Hilfe eines Transmissionselektronen-

mikroskops71 durchgeführt. Charakteristische und repräsentative Befunde wurden durch

analoge Aufnahmen auf Planfilm72 dokumentiert. Neben den Abzügen auf Fotopapier73

erfolgte die Digitalisierung der Aufnahmen und die Bearbeitung mit Photoshop74.

71 Tecnai 12, Fa. Philips, Hamburg, Deutschland 72 Kodak SO163, Fa. Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland 73 Ilford Multigrad IV, Fa. Ilford Imaging GmbH, Dreieich, Deutschland 74 Adobe Photoshop CS5, Fa. Adobe Systems GmbH, München, Deutschland

69 ERGEBNISSE

4 ERGEBNISSE

4.1 Immunhistologische Untersuchung

Die in der Untersuchung verwendeten Organe stammten aus einem Infektionsversuch an

Kälbern, bei dem ein respiratorisches Tiermodell zur Untersuchung der C. psittaci-Infektion

etabliert werden sollte. Bei diesem Infektionsversuch wurde C. psittaci intrapulmonal

verabreicht und induzierte bei allen inokulierten Tieren eine Bronchopneumonie

(OSTERMANN et al. 2010). Die Verteilung der Lungenveränderungen entsprach den

Applikationsstellen. Somit waren besonders häufig Veränderungen im linken kaudalen

Spitzenlappen, dem Mittellappen, den Basislappen und dem akzessorischen Lungenlappen zu

finden (LAMBERTZ 2011). Der Mittellappen konnte histologisch nicht ausgewertet werden,

da er durch die Gewinnung von BALF hochgradige Artefakte aufwies. Für die vorliegende

Untersuchung wurde gezielt verändertes Lungengewebe aus dem linken kaudalen

Spitzenlappen, den Basislappen und dem akzessorischen Lungenlappen sowie die regionären

Lymphknoten und repräsentativ für den oberen Respirationstrakt die Tonsille ausgewählt.

Von den mit C. psittaci inokulierten Kälbern, die am Ende des Beobachtungszeitraums keine

Lungenveränderungen aufwiesen und den Kontrollkälbern, von denen keines während des

gesamten Beobachtungszeitraums entzündliche Lungenveränderungen zeigte, wurden

Lungenproben aus denselben anatomischen Lokalisationen untersucht. Bei den

Kontrollkälbern wurden zusätzlich die Trachea und weitere Lungenproben aus den übrigen

Lungenlappen in die Untersuchung einbezogen, sodass bei diesen Tieren insgesamt 10

Lokalisationen aus der Lunge berücksichtigt wurden.

Die Anwendung verschiedener Antikörper ermöglichte die differenzierte Darstellung der

Leukozyten im Gewebeschnitt.

° Durch die Anwendung der Antikörper IL-A11, CC63 und IL-A29 wurde die

Zelloberfläche von CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten markiert. T-Lymphozyten

waren durch einen großen Zellkern und einen schmalen Zytoplasmasaum

gekennzeichnet. In der Lunge von gesunden Kälbern erschwerte eine unspezifische

Hintergrundmarkierung die Abgrenzung einzelner CD8+ T-Zellen.

ERGEBNISSE 70

° Der Antikörper CACT116A markierte CD25, einen Aktivierungsmarker, der von

Lymphozyten und Makrophagen exprimiert wird.

° Mit den Antikörpern IL-A71, IL-A30 und IL-A60 wurden IgA+, IgM+ und IgG1+ B-

Lymphozyten und Plasmazellen dargestellt. Plasmazellen waren durch ein breites

Zytoplasma von B-Lymphozyten zu unterscheiden.

° Eine Subpopulation dendritischer Zellen ließ sich durch den Antikörper CC20, der

CD1b+ in der Zellwand markiert, darstellen.

° Der Antikörper EBM11 markierte das Zytoplasma von CD68+ Makrophagen.

° MHC II ließ sich auf Zellen mit heterogener Morphologie darstellen. Markiert wurden

Makrophagen, dendritische Zellen, Lymphozyten, Epithel- und Endothelzellen. Die

untersuchten Kompartimente wurden diffus markiert. Ohne Markierung blieben

neutrophile Granulozyten, Muskelzellen und Knorpel.

° Neutrophile Granulozyten wurden in der HE-Färbung anhand ihres segmentierten

Zellkerns identifiziert.

Da die oben aufgeführten Leukozytensubpopulationen nicht gleichmäßig in den untersuchten

Organen verteilt waren, wurden bei der Auswertung verschiedene funktionelle Kom-

partimente unterschieden. Bei den Kontrollkälbern wurden beispielsweise luftleitendes und

luftaustauschendes Gewebe, Blutgefäße, Lymphfollikel und Paracortex bzw.

Interfollikularzone getrennt beurteilt. Bei den mit C. psittaci-inokulierten Kälbern erfolgte

zusätzlich die Unterscheidung von Nekrose und Regenerationszone.

4.1.1 Kontrollkälber

In den Organen, die in die Untersuchung einbezogen wurden, waren immunhistologisch keine

Chlamydien nachweisbar (LAMBERTZ 2011).

4.1.1.1 Verteilung und Menge der Leukozytensubtypen in der Lunge

Die Lunge lässt sich funktionell und morphologisch in luftleitendes System (Bronchien,

Bronchiolen) und luftaustauschendes System (Alveolen, Interalveolarsepten), in Blutgefäße

und Interstitium unterteilen (Abb. 15). Befunde, die das BALT betreffen, sind separat in

Kap. 4.1.1.3 dokumentiert.

71 ERGEBNISSE

Abb. 15: Kompartimente der Lunge: A-Alveolen, IAS–Interalveolarsepten, B–Bronchus, Br –

Bronchiolus, G–Blutgefäß, I–interlobuläres Interstitium

Bronchien und Bronchiolen

CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten lagen vereinzelt zwischen den Zellen des respiratorischen

Epithels (Abb. 16BC). Sie waren häufiger im Epithel der Bronchien als in den Bronchiolen zu

finden. In der Lamina propria mucosae (Lp) waren überwiegend sehr viele CD4+, CD8+ und

weniger γδ+ T-Lymphozyten vorhanden (16A,B,C).In der Mehrzahl befanden sie sich

gleichmäßig über den Querschnitt verteilt. CD4+ und CD8+ T-Zellen bildeten zusätzlich

fokal bis multifokal lockere Ansammlungen. Bei einem Kalb lagen CD4+ T-Zellen in

mehreren Lagen vor (Tier Nr. 6). Die Bronchiolen wiesen meist weniger CD8+ T-

Lymphozyten in der Lp auf als CD4+ T-Zellen. Lediglich im accessorischen Lungenlappen

eines Tieres (Tier Nr. 1) waren wenige aktivierte CD25+ Zellen zu sehen. Markiert wurden

kleine, runde Zellen, die sich in der Lp der Bronchien und im peribronchiolären Interstitium

verteilten (Abb. 16D). Das apikale oder das gesamte Zytoplasma des Bronchial- und

Bronchiolarepithels zeigte bei allen Kälbern eine Markierung für IgA mit unterschiedlicher

Intensität (Abb. 16E). Ausnahme bildete der Lobus caudalis eines Tieres (Tier Nr. 1), bei dem

das Epithel eines Bronchus keine Markierung für IgA aufwies, wobei sich periphere

Bronchiolarepithelien schwach für IgA markierten. In einem Teil der Lungenlokalisationen

bei vier der Kälber war zudem eine schwächere IgM+ Markierung zu sehen (Tiere Nr. 1, 2,

4, 5). IgG1 markierte diffus die Kompartimente der luftführenden Wege mit Ausnahme des

Epithels und des Knorpels (Abb. 16F).

ERGEBNISSE 72

Abb. 16: Darstellung der immunhistologischen Befunde von CD4+, CD8+, γδ+ T-Zellen,

CD25+ Zellen, IgA+ und IgG1+ Plasmazellen im luftführenden System der Kontrollkälber.

A-C, E indirekte Immunperoxidase an konsekutiven Kryostatschnitten von Tier Nr. 5,

Lobus caudalis sinister; Eichstrich = 200 µm

A: Sehr viele CD4+ T-Lymphozyten (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich diffus oder in

Ansammlungen in der Lamina propria (Lp) und im peribronchialen Interstitium (I).

B: Sehr viele CD8+ T-Lymphozyten (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich gleichmäßig in der

Lp (Lp) und im peribronchialen Interstitium (I). Einzelne CD8+ T-Zellen liegen

intraepithelial (Pfeilspitze, exemplarisch).

C: In der Lp (Lp) und im peribronchialen Interstitium (I) befinden sich wenige γδ+ T-Zellen

(Pfeile, exemplarisch). Einzelne γδ+ T-Zellen liegen intraepithelial (Pfeilspitze,

exemplarisch).

D: Wenige aktivierte CD25+ Zellen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich diffus und in einer

Ansammlung in der Lp (Lp) und im peribronchialen Interstitium (I) eines Bronchus.

Indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt von Tier Nr. 1, Lobus accessorius; Eichstrich

= 200 µm

E: Das apikale Bronchiolarepithel markiert sich für IgA. Zudem liegen wenige IgA+

Plasmazellen (Pfeile, exemplarisch) in der Lp (*) und im peribronchiolären Interstitium (I).

F: In der diffus für IgG1 markierten Lp (Lp) und in dem diffus für IgG1 markierten

peribronchialen Interstitium (I) liegen einzelne IgG1+ Plasmazellen (Pfeile, exemplarisch).

Das Bronchialepithel ist von der diffusen Markierung für IgG1+ ausgenommen.

Indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt von Tier Nr. 6, Lobus medius; Eichstrich =

500 µm

73 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 74

Im luftführenden Kompartiment waren nur Plasmazellen und keine B-Lymphozyten zu

beobachten. In der Mehrzahl der untersuchten Lungenlokalisationen waren in der Lp der

Bronchien viele bis sehr viele IgA+ und weniger IgM+ Plasmazellen und IgG1+ Plasmazellen

vorhanden (Abb. 16E,F). In den Spitzenlappen von Tier Nr. 5 waren zum Teil viele IgG1+

Plasmazellen vorhanden. IgA+ und IgM+ Plasmazellen lagen zum Teil eng aneinander gereiht

und basal des Bronchialepithels angeordnet. Die Bronchialwand, dessen Epithel negativ für

IgA war, enthielt keine IgA+ Plasmazellen (Tier Nr. 1). Im selben Schnitt waren in der Lp

von Bronchiolen wenige IgA+ Plasmazellen enthalten. Im Vergleich zu den Bronchien wiesen

die Bronchiolen weniger IgA+, IgM+, IgG1+ Plasmazellen auf, wobei sich IgA+ und IgM+

Plasmazellen überwiegend in der Submukosa (SM) verteilten. Regelmäßig waren wenige

IgG1+ Plasmazellen in der Lp oder peribronchiolär verteilt.

Das Luftwegsepithel mit Flimmerepithelzellen und Becherzellen zeigte in mehr als 50% der

untersuchten Luftwege eine apikale, granuläre oder eine diffuse Markierung für MHC II. In

der Lp und im peribronchialen bzw. peribronchiolären Bindegewebe waren sehr viele in

Zytoplasmaausläufer positiv für MHC II und umgaben regelmäßig den Luftweg. Weniger

häufig lagen polygonale und runde MHC II+ Zellen vor.

CD1b+ dendritische Zellen waren vereinzelt zwischen den Epithelzellen und vermehrt in der

Lp, meist basal des Epithels der Bronchien und Bronchiolen zu sehen (Abb. 17A). Häufig

waren zudem fokale Ansammlungen aus CD1b+ dendritischen Zellen (DC) ober- oder

unterhalb der Lamina muscularis mucosae (LMM) bzw. der Tunica muscularis (TM) im

peribronchialen oder peribronchiolären Bindegewebe lokalisiert. Mitunter waren keine

CD1b+ dendritischen Zellen in den Bronchiolen vorhanden. Multifokal ließen sich einzelne

CD1b+ dendritische Zellen mit schaumigem Zytoplasma im Lumen der Luftwege nachweisen

(Tier Nr. 1). CD1b+ dendritische Zellen stimmten mit der Lage MHC II+ Zellen überein,

wobei weniger Zellen markiert waren. Makrophagen waren selten im Lumen der Bronchien

und häufiger im Lumen von Bronchiolen zu beobachten. Im rechten kaudalen Spitzenlappen

eines Tieres sammelten sich fokal viele Makrophagen im Lumen eines Bronchiolus (Tier

Nr. 3). In der Lp und im peribronchialen und peribronchiolären Bindegewebe waren wenige

Makrophagen darstellbar, die sich diffus verteilten (Abb. 17B).

Neutrophile Granulozyten waren nur vereinzelt in der Lp nachweisbar.

75 ERGEBNISSE

Abb. 17: Darstellung der immunhistologischen Befunde von CD1b+ dendritischen Zellen und

CD68+ Makrophagen im luftführenden System der Kontrollkälber.

A, B indirekte Immunperoxidase an konsekutiven Kryostatschnitten von Tier Nr. 5,

Lobus medius; Eichstrich = 200 µm

A: Wenige CD1b+ dendritische Zellen (Pfeile, exemplarisch) befinden sich in der Lp (Lp)

eines Bronchus.

B: Wenige schlanke Makrophagen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich in der Lp (Lp) eines

Bronchus.

ERGEBNISSE 76

Alveolen und Interalveolarsepten

Sehr viele CD4+ und CD8+ Zellen verteilten sich diffus und seltener in kleinen

Ansammlungen in den Interalveolarsepten (Abb. 18A,B). Weniger häufig waren γδ+ T-Zellen

zu sehen, die sich überwiegend diffus in den Interalveolarsepten verteilten (Abb. 18C). Bei

zwei Kälbern lagen erhöhte CD4+ Zellzahlen vor (Tiere Nr. 5, 6). Vereinzelt waren CD8+ T-

Zellen im Alveolarlumen zu sehen. Aktivierte CD25+ Zellen waren lediglich im

accessorischen Lungenlappen eines Tieres vorhanden (Tier Nr. 2). Sie waren unregelmäßig in

den Interalveolarsepten verteilt. In einem Teil der untersuchten Lungenlokalisationen waren

einzelne Plasmazellen in den Interalveolarsepten zu erkennen, die IgA+ (Abb. 18D) und

weniger häufig IgM+ waren. Zudem markierten sich in einem Teil der Schnitte zahlreiche

Zellausläufer und Interalveolarsepten diffus oder granulär intensiv für IgA und für IgM. Die

Verteilung entsprach dabei der von interstitiellen und intravaskulären Makrophagen. Diese

Markierung trat sporadisch bei allen Tieren auf. IgG1+ granuläre Präzipitate waren diffus in

den Interalveolarsepten zu sehen (Abb. 18E). Einzelne CD1b+ dendritische Zellen und zum

Teil Ansammlungen aus CD1b+ dendritischen Zellen waren in den Interalveolarsepten

verteilt (Abb. 18F). Bei einem Tier waren multifokal CD1b+ Zellen in den Alveolarlumina

vorhanden (Tier Nr. 3). Bei einem Kalb lagen in der Mehrzahl der Lungenlokalisationen

erhöhte Mengen an CD1b+ dendritischen Zellen in den Interalveolarsepten (Tier Nr. 5). Zum

Teil waren unterschiedlich intensive Markierungen der Zellen vorhanden. CD68+

Alveolarmakrophagen konnten aufgrund ihres granulär markierten breiten Zytoplasmas von

schlanken interstitiellen und intravaskulären Makrophagen unterschieden werden (Abb. 19B).

In den Interalveolarsepten waren massenhaft interstitielle und krophagen gleichmäßig verteilt

(Abb. 19A,B). In den Lumina der Alveolen waren nur wenige Alveolarmakrophagen zu sehen

(Abb. 19B). Die Mehrzahl der Zellen in den Interalveolarsepten war schwach für MHC II

markiert. Markiert wurden kleine, runde Zellen und schlanke Zellen. Multifokal waren

intensiv markierte Zytoplasmaausläufer zu erkennen, die aufgrund ihrer Morphologie als

dendritische Zellen identifiziert wurden. In den Interalveolarsepten reagierten einzelne Zellen

negativ für MHC II. In den Alveolarlumina lagen regelmäßig einzelne MHC II+ große runde

Zellen, die mit der Verteilung von Alveolarmakrophagen übereinstimmten.

77 ERGEBNISSE

Blutgefäße

Einzelne CD4+, CD8+ und γδ+ T-Zellen waren in der Gefäßadventitia verteilt. In den

Lungenlokalisationen einzelner Tiere waren kleine Gefäße regelmäßig von CD4+ Zellen

umgeben (Tiere Nr. 4, 5, 6). Zum Teil waren einzelne γδ+ und CD8+ Zellen auf dem

Gefäßendothel lokalisiert. Nur bei wenigen Tieren waren einzelne IgA+ und IgM+

Plasmazellen in den Gefäßwänden vorhanden. Die Gefäßwände markierten sich mit

Ausnahme der Tunica media diffus für IgG1.

CD1b+ dendritische Zellen verteilten sich in variabler Anzahl in den Gefäßwänden. Ein

Großteil kleiner Gefäße wurde von einem Netzwerk aus CD1b+ Zellen umgeben. CD68+

Makrophagen waren nur selten in den Gefäßwänden zu sehen. Die Markierung der

Gefäßwände für MHC II variierte stark. Im selben Schnittpräparat waren sowohl Gefäßwände

mit zahlreichen MHC II+ Zellen als auch solche ohne jegliche Markierung zu finden. In der

Mehrzahl waren viele Zytoplasmaausläufer gleichmäßig in den Gefäßwänden und vermehrt

im perivaskulären Bindegewebe verteilt. Die Endothelzellen waren in der Mehrzahl positiv

für MHC II.

Interstitium

In der Mehrzahl der untersuchten Lungenlokalisationen waren wenige CD4+ T-Zellen

unregelmäßig in den interlobulären Interstitien angeordnet. Bei zwei Kälbern waren CD4+

T-Zellen in erhöhter Anzahl vorhanden und diffus im interlobulären Bindegewebe verteilt

(Tiere Nr. 5, 6). Einzelne CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten und seltener einzelne IgM+ und

IgG1+ Plasmazellen ließen sich im interlobulären Interstitium nachweisen (Tiere Nr. 2, 5, 6).

Wenige CD1b+ Zellausläufer waren multifokal locker aneinander gereiht oder lagen einzeln

vor. Bei einem der Kälber waren CD1b+ dendritische Zellen vermehrt vorhanden und

bildeten multifokale Ansammlungen (Tier Nr. 1). Selten waren einzelne Makrophagen im

interlobulären Bindegewebe zu sehen. Wenige MHC II+ Zellen ließen sich als kleine und

runde Zellen, polygonale Zellen und Zytoplasmaausläufer darstellen. Sie waren regelmäßig in

den Interstitien enthalten. Multifokal waren Infiltrate aus MHC II+ Zellen zu sehen.

ERGEBNISSE 78

Abb. 18: Darstellung der immunhistologischen Befunde von CD4+, CD8+, γδ+ T-Zellen,

IgA+ und IgG1+ Plasmazellen und CD1b+ dendritischen Zellen im luftaustauschenden

System der Kontrollkälber.

Indirekte Immunperoxidase an Kryostatschnitten; Eichstrich = 200 µm

A-C konsekutive Kryostatschnitte von Tier Nr. 5, Lobus caudalis sinister;

A: Sehr viele CD4+ T-Lymphozyten (Pfeile, exemplarisch) liegen in den Interalveolarsepten

(IAS).

B: Sehr viele CD8+ T-Lymphozyten (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich in den

Interalveolarsepten (IAS). Zudem liegt eine unspezifische Hintergrundmarkierung in den IAS

vor (Pfeilspitze, exemplarisch).

C: Viele γδ+ T-Lymphozyten (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich in den Interalveolarsepten

(IAS).

D: In den Interalveolarsepten (IAS) liegen IgA+ Ablagerungen und einzelne IgA+

Plasmazellen (Pfeile, exemplarisch).

Tier Nr. 6, Lobus medius;

E: Die Interalveolarsepten (IAS) markieren sich diffus für IgG1. Dabei zeigt sich eine

besonders intensive Markierung in der Wand einer Arteriole (G).

Tier Nr. 6, Lobus accessorius;

F: CD1b+ dendritische Zellen liegen einzeln (Pfeilspitze, exemplarisch) oder als

Ansammlung (Pfeil, exemplarisch) in den Interalveolarsepten (IAS).

Tier Nr. 5, Lobus medius;

79 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 80

Abb. 19: Darstellung der immunhistologischen Befunde von CD68+ Makrophagen im

luftaustauschenden System bei einem Kontrolltier.

Indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt;

A: CD68+ Makrophagen liegen massenhaft in den Interalveolarsepten (IAS).

Tier Nr. 5, Lobus caudalis sinister; Eichstrich = 200 µm

B: Die höhere Vergrößerung von A erlaubt die Unterscheidung von Alveolarmakrophagen

mit breit markiertem Zytoplasma (Pfeilspitzen, exemplarisch) und schlanken interstitiellen

bzw. intravaskulären Makrophagen (Pfeile, exemplarisch).

Tier Nr. 6, Lobus accessorius; Eichstrich = 100 µm

81 ERGEBNISSE

4.1.1.2 Quantitative Auswertung von CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten

Die Anzahl der CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten wurde quantitativ in den linken

kaudalen Spitzenlappen, den linken Basislappen und den accessorischen Lungenlappen

ermittelt. Hierbei wurden keine Kompartimente unterschieden. Lediglich BALT blieb bei der

Untersuchung unberücksichtigt. Zwischen den drei untersuchten Lungenlokalisationen lagen

keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Anzahl an CD4+, CD8+ und γδ+

T-Lymphozyten vor. Fasst man die Daten der drei Lungenlokalisationen zusammen, so waren

78 ± 26 CD4+ T-Zellen/mm² Lungengewebe, 65 ± 23 CD8+ T-Zellen/mm² Lungengewebe

und 30 ± 18 γδ+ T-Zellen/mm² Lungengewebe zu finden (Abb. 20). Das bedeutet, dass CD4+

und CD8+ T-Lymphozyten in etwa doppelt so häufig im Vergleich zu γδ+ T-Lymphozyten im

Lungenparenchym zu finden sind. Die Anzahl der CD4+ T-Lymphozyten ist geringgradig

höher als die der CD8+ T-Lymphozyten. Die tierindividuelle Schwankung der T-Zellzahlen

findet in den teils recht großen Standardabweichungen Ausdruck.

0

20

40

60

80

100

120

CD4

CD8

γ δ

Abb. 20: Arithmetische Mittelwerte und Standardabweichungen der Zellzahlen/mm² der

CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten im Lobus cranialis, Lobus caudalis und Lobus

accessorius der Kontrollkälber

Lobus cranialis Lobus caudalis Lobus accessorius

Zel

lzah

l/mm

²

Quantitative Auswertung der T-Zellsubtypen

ERGEBNISSE 82

Vergleicht man das Verhältnis von CD4+:CD8+ T-Lymphozyten zwischen den einzelnen

Tieren, so lässt sich bestätigen, dass bei der Mehrzahl der untersuchten Kontrollkälber und in

der Mehrzahl der Lungenlappen mehr CD4+ als CD8+ T-Lymphozyten im Lungengewebe zu

finden waren (Abb. 21). Dies spiegelte sich im durchschnittlichen Verhältnis von 1,2:1

wieder. Nur bei einem Kalb dominierten in allen untersuchten Lungenlokalisationen CD8+ T-

Lymphozyten (Tier Nr. 2). Bei zwei Tieren waren in einem der drei Lungenlappen

überwiegend CD8+ T-Lymphozyten vorhanden (Tiere Nr. 3, 5).

Abb. 21: Verhältnis zwischen CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten in den verschiedenen

Lungenlokalisationen bei den Kontrollkälbern

4.1.1.3 BALT

Das Vorkommen und die Organisation des lymphatischen Gewebes in der Lunge der

Kontrollkälber unterlag großen tierindividuellen Schwankungen und variierte zwischen den

Lungenlokalisationen. Die Menge an BALT und an lymphatischen Aggregaten unterschied

sich jedoch nicht signifikant zwischen den Spitzenlappen, Basislappen und accessorischen

Lungenlappen. In den Lungen der sechs Kontrollkälber war in unterschiedlicher Menge

organisiertes lymphatisches Gewebe (BALT) vorhanden. Signifikant häufiger lagen

Ansammlungen aus vorwiegend CD4+ T-Lymphozyten ohne Organisation vor, die als

Lobus cranialis

Lobus caudalis

Lobus accessorius

Ver

häl

tnis

CD

4:C

D8

Tiernummern der Kontrollkälber

83 ERGEBNISSE

lymphatische Aggregate zusammengefasst wurden. Der Median des BALT lag im gesunden

Lungengewebe bei 0,7 Anschnitte/cm².

BALT trat nahe der Bronchien und Bronchiolen auf. Das BALT war in der Mehrzahl, bei

62 %, mit Bronchien assoziiert (Abb. 22). Das Bronchus-assoziierte Lymphgewebe verteilte

sich überwiegend in der Lamina propria. Es durchbrach zum Teil die glatte Muskulatur und

dehnte sich bis in die Submukosa aus. Weiterhin lag es isoliert in der Submukosa vor. Nur

vereinzelt war BALT in unmittelbarer Nähe von Gefäßen lokalisiert. Bronchiolus-assoziiertes

Lymphgewebe lag isoliert in der Lamina propria, dehnte sich bis in die Submukosa aus,

grenzte an Gefäße oder verteilte sich in der Submukosa mit Kontakt zu angrenzenden

Gefäßen. Seltener lag es isoliert in der Submukosa.

Die lymphatischen Aggregate waren assoziiert mit Luftwegen, Interalveolarsepten und

Blutgefäßen oder grenzten an die interlobulären Interstitien (Abb. 23E,F). In der Wand der

Luftwege setzten sie sich aus CD4+ T-Lymphozyten und randständigen dendritischen Zellen

zusammen. Lymphatische Aggregate, die an das Interstitium und an die Blutgefäße grenzten

oder in den Interalveolarsepten vorlagen, bestanden hingegen ausschließlich aus CD4+ T-

Lymphozyten. Der Median der lymphatischen Aggregate lag im gesunden Lungengewebe bei

3,53 Anschnitte/cm². Im BALT war folgende Zellzusammensetzung zu finden: Die Follikel

waren homogen für MHC II (Abb. 22B) markiert. Dabei zeigte das Follikelzentrum eine

intensive retikuläre oder homogene diffuse Markierung für CC56 (Abb. 22A). Das

Follikelzentrum war zudem positiv für IgM und IgG1 (Abb. 22C,D). Weniger häufig war der

Lymphfollikel für IgA (Abb. 22E) markiert. Viele Makrophagen, einzelne IgM+

Plasmazellen, IgG1+ Plasmazellen und CD4+ T-Lymphozyten waren im Follikelzentrum

lokalisiert, wobei Plasmazellen gehäuft am Follikelrand zu beobachten waren (Abb. 22C,D,F;

Abb. 23A). Aktivierte CD25+ Zellen lagen in der epithelseitigen Hälfte des Follikels, die sich

mit schwacher Intensität netzwerkartig für CD25 markierte. Der parafollikuläre Bereich

bestand hauptsächlich aus CD4+ T-Lymphozyten (Abb. 23A), aus wenigen CD8+, γδ+ T-

Lymphozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen (Abb. 22A,B,C,D). CD1b+

dendritische Zellen waren vorwiegend subepithelial angeordnet. Einzelne CD8+ und γδ+ T-

Lymphozyten und zum Teil intraepitheliale IgM+ Präzipitate waren im FAE vorhanden (Abb.

22C). Bei zwei Kälbern waren zum Teil viele IgG1+ Plasmazellen im Domebereich des

BALT zu finden (Tiere Nr. 5, 6).

ERGEBNISSE 84

Abb. 22: Darstellung der immunhistologischen Befunde von CC56, MHC II, IgM+, IgG1+

und IgA+ Plasmazellen und CD68+ Makrophagen im BALT bei den Kontrollkälbern.

Indirekte Immunperoxidase;

A, E konsekutive Kryostatschnitte von Tier Nr. 6, Lobus medius;

Eichstrich = 200 µm

B-D, F konsekutive Kryostatschnitte von Tier Nr. 5, Lobus medius;


A: In den Lymphfollikeln (F) zeigt sich eine diffuse Markierung für CC56. CC56+

Einzelzellen (Pfeil, exemplarisch) sind in der Lp (Sterne) und im peribronchialen Interstitium

(I) zu sehen.

B: Das BALT ist homogen für MHC II markiert (Stern). Das Epithel des Bronchus zeigt eine

apikale MHC II+ Markierung. Zudem liegen viele MHC II+ Zellen in der Lp (Sterne) und im

peribronchialen Interstitium (I).

C: Im Lymphfollikel (F) ist eine netzwerkartige Markierung für IgM vorhanden. Im darüber

liegenden Epithel verteilen sich multifokal IgM+ Ablagerungen (Pfeilspitze, exemplarisch).

Viele IgM+ Plasmazellen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich in der Lp (Sterne) des

Bronchus.

D: Im Lymphfollikel (F) ist eine netzwerkartige Markierung für IgG1 vorhanden. Zusätzlich

liegen viele IgG1+ Plasmazellen im Domebereich (Pfeile, exemplarisch). Wenige IgG1+

Plasmazellen verteilen sich weiterhin in der Lp (Sterne) des Bronchus (Pfeilspitzen,

exemplarisch).

E: Im Lymphfollikel (F) ist eine netzwerkartige Markierung für IgA vorhanden. Das

Bronchialepithel ist positiv für IgA. Wenige IgA+ Plasmazellen (Pfeilspitzen weiß,

exemplarisch) befinden sich in der Lp (Sterne) und im peribronchialen Interstitium (I).

F: Im Lymphfollikel (F) verteilen sich gleichmäßig sehr viele Makrophagen. Viele

Makrophagen (Pfeile, exemplarisch) liegen in der Lp (Sterne) des Bronchus.

85 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 86

Abb. 23: Darstellung der immunhistologischen Befunde von CD4+, CD8+ und γδ+ T-Zellen

und CD1b+ dendritischen Zellen im BALT und Darstellung immunhistologischer Befunde

von nicht organisierten lymphatischen Aggregaten (E-F) bei den Kontrollkälbern.

Indirekte Immunperoxidase an Kryostatschnitten;

A, B konsekutive Kryostatschnitte von Tier Nr. 6, Lobus medius;


C, D konsekutive Kryostatschnitte von Tier Nr. 5, Lobus medius;


A: Sehr viele CD4+ T-Zellen sind in der Peripherie des Lymphfollikels (F) angeordnet

(Pfeile, exemplarisch). In der Lp (Sterne) befinden sich viele CD4+ T-Zellen (Pfeilspitze,

exemplarisch).

B: Wenige CD8+ T-Zellen liegen im parafollikulären Bereich des BALT (Pfeile,

exemplarisch). In der Lp (Sterne) und vermehrt im peribronchiolären Interstitium (I) befinden

sich CD8+ T-Zellen.

C: Wenige γδ+ T-Zellen sind parafollikulär angeordnet (Pfeile, exemplarisch). Viele γδ+ T-

Zellen sind in der Lp (Sterne) des Bronchus verteilt (Pfeilspitze, exemplarisch).

D: Wenige CD1b+ dendritische Zellen sind parafollikulär angeordnet (Pfeile, exemplarisch).

Zudem sind viele CD1b+ dendritische Zellen in der Lp (Sterne) des Bronchus verteilt

(Pfeilspitze, exemplarisch).

E: CD4+ T-Zellen liegen als Ansammlung (Stern) fokal in der Wand (Lp) eines Bronchus.

Ein Teil des Aggregates liegt im peribronchialen Interstitium (Sterne, exemplarisch).

Indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt von Tier Nr. 4, Lobus cranialis sinister, pars

caudalis; Eichstrich = 200 µm

F: CD4+ T-Zellen liegen fokal als Ansammlung (Stern) im Interalveolarseptum (IAS). Sehr

viele CD4+ T-Zellen verteilen sich im umliegenden Lungengewebe.

Indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt von Tier Nr. 5, Lobus cranialis sinister pars

cranialis; Eichstrich = 200 µm

87 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 88

4.1.1.4 Trachea

Die untersuchten Zelltypen waren vorwiegend im respiratorischen Epithel und in der Lamina

propria mucosae zu finden- Sie lagen hauptsächlich entlang der Basalmembran.

Respiratorisches Epithel

Das apikale Zytoplasma und der Ziliarsaum des respiratorischen Epithels war schwach positiv

für MHC II und unterschiedlich intensiv für IgA markiert. Bei Tier Nr. 2 war das apikale

Zytoplasma zudem schwach für IgM markiert. Einzelne CD8+ und γδ+ T-Zellen verteilten

sich zwischen den Epithelzellen. Bei Tier Nr. (1) lagen CD8+ T-Zellen vermehrt und

teilweise als kleine Ansammlungen im Epithel. Einzelne intraepitheliale CD1b+ dendritische

Zellausläufer waren zu beobachten.

Lamina propria

Wenige IgA+ Plasmazellen waren entlang der Basalmembran ungleichmäßig angeordnet.

Zum Teil waren einzelne IgM+ B-Lymphozyten zu sehen (Tiere Nr. 2, 3). Die Lp markierte

sich ungleichmäßig diffus für IgG1 und war basal des Epithels besonders intensiv gefärbt.

IgG1+ Plasmazellen wurden nicht gefunden. Viele MHC II+ Zellausläufer und runde Zellen

ordneten sich kontinuierlich basal des Epithels an. Einzelne Makrophagen waren multifokal

und wenige CD1b+ dendritische Zellen gleichmäßig basal des Epithels angeordnet. In der

Mehrzahl waren unterschiedlich dichte Ansammlungen aus CD1b+ dendritischen Zellen fokal

oder multifokal zu sehen. Wenige CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten waren überwiegend

gleichmäßig entlang der Basalmembran vorhanden. Bei einem Kalb lagen einzelne aktivierte

CD25+ Zellen basal des Epithels (Tier Nr. 5). Einzelne neutrophile Granulozyten lagen

mitunter subepithelial oder im Lumen kleiner Gefäße. Das apikale Zytoplasma des

Trachealdrüsenepithels färbte sich homogen für IgA und schwach für MHC II. Zusätzlich

waren einzelne MHC II+ Zellen und CD8+ T-Zellen um die Trachealdrüsen verteilt.

4.1.1.5 Tonsilla pharyngea

Die Tonsille enthielt zahlreiche Lymphfollikel, die von einer breiten Interfollikularzone

umgeben waren. Der Bereich zwischen Lymphfollikel und Epithel der Tonsillarkrypte wird

als subepithelialer Bereich bezeichnet. Im Epithel ließen sich Abschnitte mit Follikel-

assoziiertem Epithel (FAE) unterscheiden.

89 ERGEBNISSE

Lymphfollikel

Die Läppchen der Tonsilla pharyngea wiesen bei allen Kontrollkälbern kleine, runde und

große ovale Follikel auf. Diese markierten sich homogen braun für MHC II und ließen sich

gut von der Interfollikularzone abgrenzen. Die Lymphfollikel markierten sich netzwerkartig

für IgM, IgG1 und schwach für IgA. In den Follikeln wurden bei drei Kälbern (Tiere Nr. 2, 4,

5) einzelne IgM+, bei drei Kälbern (Tiere Nr. 3, 5, 6) einzelne IgG1+ und bei einem Kalb

(Tier Nr. 3) einzelne IgA+ Plasmazellen gefunden. Viele CD4+ und wenige CD8+ und γδ+ T-

Zellen waren in den Follikeln verteilt. Der Follikel markierte sich schwach netzwerkartig für

CD25. Die Follikel waren gleichmäßig von vielen Makrophagen durchsetzt.

Interfollikularzone (IFZ)

In der IFZ waren sehr viele runde, polygonale und MHC II+ Zytoplasmaausläufer verteilt, die

sich überwiegend granulär markierten. Die IFZ bestand aus massenhaft CD4+ und CD8+ T-

Zellen, die eng nebeneinander lagen. Weniger γδ+ T-Zellen waren ungleichmäßig verteilt. Bei

Tier Nr. (6) ließen sich multifokale Ansammlungen aus γδ+ T-Zellen beobachten. Die

Markierung der Lymphfollikel für CD25 dehnte sich mitunter auf den interfollikulären

Bereich aus. Mit Ausnahme zweier Tiere, die viele aktivierte CD25+ Zellen aufwiesen (Tiere

Nr. 2, 5), waren wenige CD25+ runde Einzelzellen unregelmäßig um die Follikel verteilt.

Multifokal waren viele kleine Makrophagen in der IFZ nachweisbar. Viele CD1b+

dendritische Zellen waren peripher der Follikel meist gleichmäßig und nur selten in

Zellgruppen angeordnet. Mitunter säumten CD1b+ dendritische Zellen die Lymphfollikel

(Tiere Nr. 3, 6). Zwischen den Follikeln waren ungleichmäßig viele IgM+ B-Lymphozyten

verteilt. Nur vereinzelt lagen Plasmazellen und neutrophile Granulozyten im interfollikulären

Bereich.

Subepithelialer Bereich

Die Mehrzahl der Zellen im subepithelialen Bereich war MHC II+. Dabei handelte es sich um

runde oder polygonale Zellen und um Zytoplasmaausläufer. Multifokal waren MHC II+

Zellaggregate vorhanden. Viele IgM+ und IgG1+ B-Lymphozyten und Plasmazellen und

viele γδ+ T-Lymphozyten waren in der epithelnahen Interfollikularzone überwiegend

gleichmäßig verteilt. γδ+ T-Lymphozyten waren in einer oder in mehreren Lagen aufgereiht.

Bei zwei der sechs Kontrollkälber waren weniger γδ+ T-Zellen nachweisbar (Tiere Nr. 1, 6).

ERGEBNISSE 90

Wenige CD1b+ dendritische Zellen und wenige kleine Makrophagen waren unregelmäßig

subepithelial verteilt. Im Vergleich zum angrenzenden interfollikulären Bereich war die

Anzahl der CD4+ T-Zellen und CD8+ T-Zellen im subepithelialen Bereich geringer. In der

Mehrzahl der Kontrollkälber waren wenige IgA+ Plasmazellen subepithelial verteilt. Bei Tier

Nr. (3) waren viele IgA+ Plasmazellen vorhanden.

Epithel

Das apikale Zytoplasma des Tonsillarepithels war positiv für MHC II und IgA und schwach

positiv für IgM. Regelmäßig waren IgM+ Präzipitate im Zytoplasma der Epithelzellen zu

sehen. Einzelne IgG1+ Plasmazellen lagen bei einem Kalb zwischen den Epithelzellen

(Tier Nr. 5). Im Tonsillarepithel waren einzelne kleine, runde MHC II+ Zellen oder MHC II+

Zytoplasmaausläufer zu sehen. Im Epithel waren wenige CD8+ T-Zellen, einzelne γδ+ T-

Lymphozyten und CD1b+ dendritische Zellen zwischen den Epithelzellen nachweisbar. Das

FAE ließ sich durch die Ansammlung von MHC II+ Zellen vom restlichen Tonsillarepithel

abgrenzen. Im FAE waren im Vergleich zum übrigen Tonsillarepithel vermehrt CD4+ und

CD8+ T-Zellen zu sehen.

4.1.1.6 Nl. mediastinalis

Der Lymphknoten lässt sich morphologisch in Cortex, Paracortex und Medulla unterteilen.

Cortex

Der Cortex des Lymphknotens enthielt zahlreiche Lymphfollikel, die sich homogen für

MHC II markierten und dadurch gut abzugrenzen waren. Die Lymphfollikel bestanden aus

IgM+ B-Lymphozyten und markierten sich am Übergang zum Keimzentrum netzwerkartig

für IgM. Bei Tier Nr. 5 war das Keimzentrum lediglich schwach für IgM markiert. Die

Follikel zeigten, mit einer Ausnahme (Tier Nr. 5) in der Mehrzahl eine retikuläre Markierung

für IgA und IgG1. Die Lymphfollikel wurden von wenigen Makrophagen durchzogen.

Überwiegend waren wenige CD4+ T-Zellen und einzelne CD8+ T-Zellen innerhalb der

Lymphfollikel nachweisbar. Die Follikel waren bei Tier Nr. 5 randständig für CD25 markiert.

Paracortex

Der Paracortex wies eine netzwerkartige Markierung für MHC II auf. Sehr viele bis

massenhaft CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten verteilten sich überwiegend dicht gedrängt im

91 ERGEBNISSE

Paracortex. Zwischen Follikel und Kapsel lagen sie weniger zahlreich vor. Viele

γδ+ T-Lymphozyten waren überwiegend gleichmäßig entlang der Intermediärsinusoide

vorhanden. Der Paracortex wies eine schwache netzwerkartige Markierung für CD25 auf und

enthielt in der Mehrzahl einzelne CD25+ Zellen. Bei zwei Kälbern (Tiere Nr. 5, 6) waren

wenige CD25+ Zellen diffus verteilt, oder multifokal gehäuft. Wenige bis viele IgM+

Plasmazellen und einzelne IgA+ und IgG1+ Plasmazellen ließen sich im Paracortex

nachweisen. Viele CD1b+ dendritische Zellen waren gleichmäßig um die Follikel lokalisiert

und dominierten entlang der Sinusoide. Ansammlungen aus CD1b+ DC waren als

netzförmige Markierung sichtbar. Im parafollikulären Bereich waren einzelne Makrophagen

sichtbar.

Medulla

Entlang der Markstränge waren sehr viele MHC II+ Zellen verteilt, darunter polygonale

Zellen und Zellen mit Zytoplasmaausläufern, die unregelmäßig dicht beieinander lagen.

Wenige CD1b+ dendritische Zellen und viele bis sehr viele Makrophagen waren in den

Marksträngen zu finden. Weiterhin lagen viele CD4+ und CD8+ T-Zellen vor, die sich im

Vergleich zum Paracortex weniger dicht aneinander reihten. Bei zwei Tieren waren

multifokale Zellansammlungen aus CD4+ und CD8+ T-Zellen zu beobachten (Tiere Nr. 2, 5).

Die Anzahl der γδ+ T-Lymphozyten variierte zwischen den Kontrollkälbern von wenigen

(Tiere Nr. 1, 2) bis sehr vielen Zellen (Tier Nr. 5). Wenige Zellen mit Aktivierungsmarker

CD25 waren bei einem Tier zu beobachten (Tier Nr. 5). Die Markstränge waren diffus oder

granulär für IgA und schwach für IgM markiert. Viele bis sehr viele IgM+ Plasmazellen

verteilten sich diffus oder häuften sich multifokal. Wenige IgG1+ und einzelne IgA+

Plasmazellen waren zu sehen.

ERGEBNISSE 92

4.1.2 Kälber inokuliert mit C. psittaci

Im Folgenden werden Befunde an Lunge, regionärem Lymphknoten und Tonsille an den

Tagen 2, 3, 4, 7, 10, 14 und 35/37 pi dargestellt. Hierbei wird schwerpunktmäßig auf Befunde

eingegangen, die sich von denen der Kontrolltiere unterscheiden. Neben den

Leukozytensubpopulationen wird, um den Bezug zwischen Pathogen (C. psittaci) und

Wirtsantwort (Leukozytensubpopulationen) darstellen zu können, die Verteilung von

C. psittaci beschrieben. Befunde, die das BALT betreffen, sind separat in Kap. 4.1.2.7

dokumentiert.

4.1.2.1 Semiquantitative Auswertung von C. psittaci

Bei den Kälbern der Infektionsgruppe waren während des gesamten Versuchszeitraums

Chlamydieneinschlüsse in den Lungen darstellbar, wobei je nach Untersuchungszeitpunkt und

je nach Lungenlokalisation die Menge an Chlamydien variierte. Bei der Auswertung wurde

das Lungenläppchen des Gefrierschnittes berücksichtigt, in dem die meisten Chlamydien

nachweisbar waren. Die Beurteilung der Erregermenge erfolgte semiquantitativ in keine,

wenige, viele und sehr viele Chlamydieneinschlüsse (Abb. 24).

Die Auswertung des semiquantitativen Nachweises von C. psittaci ist vergleichend für die

drei untersuchten Lungenlokalisationen in Abb. 25 dargestellt. Bereits am Tag 2 pi konnten

sehr viele Chlamydien im Spitzenlappen und Basislappen nachgewiesen werden. Bis Tag

10 pi waren in den veränderten Bereichen von Spitzenlappen, Basislappen und

accessorischem Lungenlappen viele bis sehr viele Chlamydien vorhanden. Am Tag 14 pi

waren überwiegend nur noch viele Chlamydien verteilt. Am Tag 35/37 pi hingegen konnten

nur noch wenige Chlamydieneinschlüsse im Basislappen eines Kalbes nachgewiesen werden

(Tier Nr. 26). Im Spitzenlappen und im accessorischen Lungenlappen wurden keine

Chlamydien gefunden. Zwischen den untersuchten Lungenlokalisationen lagen je nach

Zeitpunkt keine deutlichen Unterschiede in der Menge an Chlamydien vor.

93 ERGEBNISSE

Abb. 24: Unterschiedliche Menge von Chlamydien im Lungengewebe

Indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt; Eichstrich = 200 µm

A: Wenige Chlamydieneinschlüsse am Tag

2 pi.

Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister pars

caudalis;

B: Viele Chlamydieneinschlüsse am Tag 7 pi.

Tier Nr. 19, Lobus accessorius;

C: Sehr viele Chlamydieneinschlüsse am Tag

4 pi.

Tier Nr. 15, Lobus cranialis dexter pars

caudalis;

ERGEBNISSE 94

Abb. 25: Verteilung der semiquantitativ erhobenen Menge an Chlamydien in den

verschiedenen Lungenlappen nach der Inokulation mit C. psittaci: Score 0 – keine / Score 1 –

wenige / Score 2 - viele und Score 3 – sehr viele Chlamydieneinschlüsse nachweisbar.

Boxplots zeigen Median, 25. und 75. Perzentil (Box)

95 ERGEBNISSE

4.1.2.2 Verteilung und Menge der Leukozytensubtypen und Chlamydien in der Lunge

am Tag 2 pi

Lungenveränderungen und Verteilung von C. psittaci

Am Tag 2 pi zeigten die Lungenlokalisationen in der Mehrzahl herdförmige bis diffuse eitrig-

fibrinöse Bronchopneumonien (Abb. 26A). Der accessorische Lungenlappen eines Kalbes

war histologisch unverändert (Tier Nr. 8). Die Gefrierschnitte enthielten mitunter

unveränderte Läppchen (Tiere Nr. 9, 10). Multifokal war proteinreiches Exsudat peripher von

kleinen Blutgefäßen und in den Interalveolarsepten und Alveolarlumina zu beobachten. Die

Adventitia der Gefäße war verbreitert, enthielt eine eosinophile, aufgelockerte Masse und

unterschiedliche Mengen an Entzündungszellen. Im veränderten Spitzenlappen und im

veränderten Basislappen von Tier Nr. 8 waren zudem multifokal kleine strukturlose Herde zu

beobachten, die sich verstärkt eosinophil anfärbten. Bei zwei Kälbern waren viele

Chlamydieneinschlüsse und bei einem Kalb wenige Chlamydien (Abb. 24A) nachweisbar. In

der unveränderten Lokalisation waren keine Chlamydieneinschlüsse nachgewiesen werden.

Sie verteilten sich überwiegend multifokal im Läppchen. Mehrfach wurden im Exsudat von

Bronchiolen und fokal im Exsudat eines Bronchus (Tier Nr. 10) Chlamydieneinschlüsse

gefunden, die nicht epithelassoziiert waren. Die Morphologie der Chlamydieneinschlüsse

variierte. Am Tag 2 pi waren meist granuläre Erregerstrukturen sichtbar, die mit neutrophilen

Granulozyten und Alveolarmakrophagen assoziiert waren. Im Spitzenlappen und Basislappen

von Tier Nr. 8, im Basislappen von Tier Nr. 9 und im Spitzenlappen von Tier Nr. 10 waren

vereinzelt spindelförmige Markierungen in Alveolarepithelzellen zu sehen (Abb. 26B).


In den Alveolen waren massenhaft neutrophile Granulozyten (Abb. 26A), wenige MHC II+

Alveolarmakrophagen, wenige CD4+, CD8+, γδ+ T-Zellen und einzelne aktivierte CD25+

Zellen verteilt. Die Alveolen waren inhomogen zellulär infiltriert, sodass sich multifokale

Bereiche diffus für MHC II markierten. In den weniger zelldichten Bereichen waren MHC II+

polygonale Zellen mit breitem Zytoplasma von MHC II- neutrophilen Granulozyten

abgrenzbar. Fokal lagen sie in Zellgruppen in der Umgebung eines kleinen Gefäßes vor

(Tier Nr. 8A). Einzelne CD1b+ Zellen wiesen ein schaumiges Zytoplasma auf.

ERGEBNISSE 96

Die verbreiterten Interalveolarsepten markierten sich für MHC II und enthielten weniger

interstitielle und intravaskuläre Makrophagen als bei den Kontrollkälbern (Abb. 26C), aber

viele neutrophile Granulozyten. Im Vergleich zu den Kontrollkälbern waren im veränderten

Lungengewebe weniger CD4+ (Abb. 26E), CD8+, γδ+ T-Lymphozyten vorhanden. Die T-

Zellen waren ungleichmäßig verteilt. Abweichend von den Kontrolltieren waren einzelne

aktivierte CD25+ Zellen zu beobachten (Abb. 26F). Eine Hintergrundfärbung durch den

monoklonalen Antikörper CC63 lag in den veränderten Bereichen nicht vor. CD1b+

dendritische Zellen waren in ihrer Anzahl stark vermindert und markierten sich nur vereinzelt

in den Alveolarsepten (Abb. 26D). Einzelne IgA+ Plasmazellen waren entsprechend der

Kontrollen verteilt. Die Interalveolarsepten waren weiterhin diffus für IgG1 markiert.


Die Bronchial- und Bronchiolarlumina waren mit variablen Mengen an neutrophilen

Granulozyten gefüllt (Abb. 27A) und enthielten nur vereinzelt polygonale MHC II+ Zellen

(Abb. 27B). Zum Teil war das Exsudat granulär für IgA (Abb. 27E) markiert. Das

Zytoplasma des Epithels vorwiegend großer Bronchiolen markierte sich diffus für MHC II.

Vor allem abgeflachte Bronchiolarepithelzellen waren zudem diffus für IgA markiert, wobei

dem geschädigten Epithel eine durchgehende IgA+ Markierung fehlte. Einzelne neutrophile

Granulozyten waren regelmäßig im Bronchial- und Bronchiolarepithel zu sehen (Abb. 27A).

Im Gegensatz zu den Kontrollen waren in der Lp von Bronchien und Bronchiolen weniger

CD1b+ dendritische Zellen und Makrophagen verteilt. MHC II+ Zellen und CD4+ (Abb.

27C), CD8+ und γδ+ T-Zellen verteilten sich in der Lp entsprechend der Kontrollen und

waren vermehrt peribronchial bzw. peribronchiolär unterhalb der LMM bzw. TM zu

beobachten. Zudem umrandeten viele IgA+ Plasmazellen die Bronchien und zum Teil die

Bronchiolen. Wenige bis viele aktivierte CD25+ Einzelzellen waren in der Lp und vermehrt

peribronchiolär locker aneinander gereiht (Abb. 27D). Stark geschädigte Bronchiolen wiesen

weniger oder keine T-Lymphozyten oder Plasmazellen (Abb. 27F) auf.

97 ERGEBNISSE

Blutgefäße

Am Gefäßendothel hafteten wenige überwiegend runde MHC II+ Zellen. Zum Teil waren

wenige IgA+ und einzelne IgM+ Plasmazellen in den Gefäßwänden verteilt (Tiere Nr. 8, 9).

Im Unterschied zu den Kontrollen waren viele bis sehr viele MHC II+ polygonale Zellen und

Zellen mit Zytoplasmaausläufern in den Wänden großer Gefäße sichtbar. Ein Teil der MHC

II+ Zellen ließ sich als Makrophagen identifizieren. Die MHC II+ Zellen waren überwiegend

negativ für CD1b. Arteriolen in den Lungenveränderungen waren teilweise von vielen CD4+,

CD8+, γδ+ T-Zellen und CD25+ Zellen umgeben (Abb. 28C). Wenige IgA+ Plasmazellen

umgaben in den Lungenveränderungen größere Gefäße (Abb. 28D). Perivaskuläres Exsudat

war fibrindurchtränkt und diffus für IgG1 markiert (Abb. 28A,B).

Interlobuläre Interstitien

Die interlobulären Interstitien waren durch ein proteinreiches IgG1+ Exsudat verbreitert und

enthielten multifokal Ansammlungen aus Entzündungszellen. Sehr viele überwiegend

polygonale MHC II+ Zellen verteilten sich gleichmäßig in den interlobulären Interstitien. Nur

vereinzelt waren CD68+ Makrophagen oder CD1b+ dendritische Zellen nachweisbar. In den

Fibrinansammlungen lagen multifokale Ansammlungen aus CD4+, CD8+ und γδ+ T-

Lymphozyten. Bei allen drei Kälbern lagen wenige und fokal bis multifokal viele kleine runde

CD25+ Zellen vor.

ERGEBNISSE 98

Abb. 26: Darstellung der histologischen Befunde und immunhistologischen Befunde von

Chlamydiaceae-LPS, Makrophagen, CD1b+ dendritischen Zellen, CD4+ T-Zellen und

CD25+ Zellen im luftaustauschenden System des veränderten Lungengewebes am Tag 2 pi.

A HE-Färbung am Kryostatschnitt;

B-F indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt;

A: In den Alveolen (A) befinden sich massenhaft neutrophile Granulozyten.

Tier Nr. 10, Lobus cranialis pars caudalis; Eichstrich = 200 µm

B: Chlamydiale Einschlüsse sind in Alveolarepithelzellen (Pfeilspitze, exemplarisch) und im

alveolären Exsudat (Pfeile, exemplarisch) zu sehen.

Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister pars caudalis; Eichstrich = 100 µm

C: Die Anzahl an interstitiellen und intravaskulären Makrophagen (Pfeile, exemplarisch) ist

in der pneumonisch veränderten Lunge herabgesetzt. Einzelne Alveolarmakrophagen

(Pfeilspitzen, exemplarisch) sind in den Alveolen (A) zu unterscheiden.


D: In den Interalveolarsepten ist lediglich eine einzelne CD1b+ dendritische Zelle

(Pfeilspitze) zu sehen.


E: Die Anzahl an CD4+ T-Lymphozyten ist in den Interalveolarsepten der pneumonisch

veränderten Lunge vermindert (Pfeile, exemplarisch).


F: Viele CD25+ Zellen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich diffus in der veränderten Lunge.


99 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 100

Abb. 27: Darstellung der histologischen Befunde und der immunhistologischen Befunde von

MHC II+, CD4+ T-Zellen, CD25+ Zellen und IgA+ Plasmazellen im luftleitenden System des

veränderten Lungengewebes am Tag 2 pi.


B-F indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt;

A: Zahlreiche neutrophile Granulozyten (Sterne, exemplarisch) liegen im Lumen und Epithel

(Pfeile, exemplarisch) eines Bronchus (B).


B: Sehr viele MHC II+ Zellen verteilen sich in der Lp (Lp) und im peribronchialen

Interstitium (I). Das Exsudat im Lumen des Bronchus besteht aus MHC II+ Zellen und

neutrophilen Granulozyten (Stern).


C: Sehr viele CD4+ T-Zellen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich gleichmäßig im

peribronchiolären Interstitium (I). Wenige sind weiterhin diffus in der Lp (Stern) verteilt.


D: Viele aktivierte CD25+ T-Zellen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich gleichmäßig im

peribronchiolären Interstitium (I). Wenige CD25+ Zellen verteilen sich gleichmäßig in der Lp

(Stern).


E: Das Epithel eines Bronchiolus (Br) markiert sich diffus für IgA. Viele IgA+ Plasmazellen

(Pfeile, exemplarisch) sind im umliegenden Interstitium (I) verteilt.


F: Die Schädigung des Epithels eines Bronchiolus (Br) bedingt den Verlust der IgA+

Markierung (schmale Pfeile, exemplarisch). Abgeflachte Epithelzellen markieren sich diffus

für IgA (Pfeilspitzen, exemplarisch). Vereinzelt sind IgA+ Plasmazellen sichtbar (dicke

Pfeile, exemplarisch).


101 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 102

Abb. 28: Darstellung der histologischen Befunde und der immunhistologischen Befunde von

IgG1+, CD25+ Zellen und IgA+ Plasmazellen an den Blutgefäßen des veränderten

Lungengewebes am Tag 2 pi.


B-D indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt;

A: Das perivaskuläre Bindegewebe und die Interalveolarsepten sind mit Fibrin durchsetzt.

Neutrophile Granulozyten befinden sich im Gefäßlumen (Stern) und in den

Interalveolarsepten (Sterne).


B: Das perivaskuläre Bindegewebe markiert sich intensiv für IgG1 (Stern).

Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister pars cranialis; Eichstrich = 200 µm

C: Viele CD25+ Zellen (Pfeilspitzen, exemplarisch) umgeben eine Arteriole (G). Einzelne

aktivierte Zellen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich in den umliegenden Alveolen (A).


D: IgA+ Plasmazellen (Pfeil, exemplarisch) liegen in den Gefäßwänden und verteilen sich

vereinzelt (Pfeilspitze, exemplarisch) in umliegenden Alveolen (A).


103 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 104


Lunge am Tag 3 und 4 pi


An den Tagen 3 und 4 pi zeigte sich in der Mehrzahl der Lungenschnitte eine hochgradige

akute fibrinös-eitrige Bronchopneumonie mit Nekroseherden. Aufgrund der

übereinstimmenden histopathologischen Veränderungen wurden die Befunde beider

Zeitpunkte zusammengefasst. Die veränderten Lungen wiesen zum Teil herdförmige

strukturlose Areale auf, die sich verstärkt eosinophil anfärbten und in denen nur vereinzelt

Zytokeratinfilamente und desquamierte Alveolarepithelzellen nachweisbar waren (Abb. 29A).

Diese Areale traten multifokal auf und wurden als Nekrosen angesprochen. Betroffen waren

Interalveolarsepten, Bronchiolen und kleine Gefäße. Multifokal waren die Lumina kleiner

Gefäße bindegewebig verschlossen. Sämtliche umliegende Alveolen, Bronchiolen und

Bronchien enthielten viele Entzündungszellen und Ödemflüssigkeit. Die interlobulären

Interstitien waren hochgradig verbreitert und enthielten dilatierte Lymphgefäße mit

Fibrinthromben. In einzelnen Lungenlokalisationen waren keine Nekrosen enthalten (Tiere

Nr. 12, 15). Zu diesem Zeitpunkt konnten Chlamydien in allen Lungenlokalisationen

nachgewiesen werden (Abb. 25). In solchen Läppchen, in denen der Erreger massenhaft

nachgewiesen wurde, verteilten sich die Chlamydieneinschlüsse diffus im luftaustauschenden

Parenchym und begrenzt vom interlobulären Bindegewebe (Abb. 24C). Betroffen waren die

Spitzenlappen aller Tiere und zum Teil die Basislappen (Tiere Nr. 14, 16) und accessorischen

Lungenlappen (Abb. 29B; Tiere Nr. 11, 12, 13, 16). Wurden geringere Mengen an

Chlamydieneinschlüssen beobachtet, waren sie entsprechend Tag 2 pi multifokal im

Läppchen verteilt. Regelmäßig waren mit Chlamydien infizierte Zellen im Exsudat von

untergehenden Bronchiolen verteilt. Bei zwei Tieren wurden einzelne mit Chlamydien

infizierte Zellen im Blutgefäß beobachtet (Tiere Nr. 11, 12). Die Zellen hafteten am

Gefäßendothel und enthielten einen großen, runden Einschluss. Die Chlamydieneinschlüsse

waren entsprechend Tag 2 pi mit neutrophilen Granulozyten, Alveolarmakrophagen und

untergehendem Gewebe assoziiert. In einem Teil der Lungenschnitte konnten einzelne

spindelförmige Chlamydieneinschlüsse in Alveolarepithelzellen nachgewiesen werden (Tiere

Nr. 11, 13, 15). Neben granulären Strukturen waren vermehrt größere, runde Markierungen

(> 3µm) vorhanden, die das Zytoplasma der infizierten Zellen ausfüllten.

105 ERGEBNISSE


Die Alveolen peripher der Nekrosen waren heterogen zellulär infiltriert. Das Exsudat bestand

zunehmend aus MHC II+ Alveolarmakrophagen (Abb. 29E). Besonders die Alveolen, die an

das Interstitium oder an Blutgefäße grenzten, waren vollständig von Makrophagen infiltriert

und diffus für MHC II markiert (Tier Nr. 11). Einzeln liegende Alveolarmakrophagen waren

intensiv für MHC II markiert. Zum Teil waren entsprechend 2 dpi wenige überwiegend

kleine, runde CD25+ Zellen diffus im Alveolarlumen verteilt (Abb. 29C). Fokal war eine

Vielzahl an aktivierten CD25+ Zellen zu beobachten (Abb. 29D, Tier Nr. 16). Multifokal

waren homogene IgA+, IgM+ und IgG1+ Reaktionsprodukte und nur wenige IgA+ und

einzelne IgM+ Plasmazellen zu sehen. Wenige CD1b+ dendritische Zellen waren teilweise in

eitrig-fibrinösem Exsudat ungleichmäßig peripher von Nekrosen verteilt (Tier Nr. 14). In den

verbreiterten Interalveolarsepten waren weiterhin weniger interstitielle und intravaskuläre

Makrophagen und CD1b+ dendritische Zellen als bei den Kontrollen zu beobachten. Wenige

CD4+, CD8+ und γδ+ Zellen waren nachweisbar, darunter einzelne aktivierte CD25+ Zellen.

Die Nekrosebereiche enthielten untergehende neutrophile Granulozyten. Zudem waren sie

diffus für MHC II markiert. CD4+, CD8+ und γδ+ Zellen, darunter aktivierte CD25+ Zellen

lagen nur vereinzelt vor. In den Nekrosen waren keine CD1b+ dendritischen Zellen enthalten.

ERGEBNISSE 106

Abb. 29: Darstellung immunhistologischer Befunde von Zytokeratin, Chlamydiaceae-LPS,

CD25+ Zellen und Makrophagen im luftaustauschenden System des veränderten

Lungengewebes an den Tagen 3 und 4 pi.

Indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt;

A: Die Schädigung an Bronchiolarepithelzellen (Pfeilspitzen, exemplarisch) und

Alveolarepithelzellen (Pfeile, exemplarisch) wird durch die Zytokeratinmarkierung deutlich.

Dabei lösen sich kuboidale Epithelzellen aus dem Verband.


B: Im Exsudat der Alveolen (A) verteilen sich zunehmend Chlamydieneinschlüsse in

unterschiedlicher Morphologie.


C: Wenige aktivierte CD25+ Zellen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich diffus im

veränderten Lungengewebe.

Indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt, Tier Nr. 11, Lobus cranialis sinister, pars


D: Bei einem Tier sind sehr viele aktivierte CD25+ Zellen (Pfeile, exemplarisch) in den

Alveolen vorhanden.

Tier Nr. 16, Lobus accessorius; Eichstrich = 200 µm

E: Alveolarmakrophagen (Pfeilspitzen, exemplarisch) liegen in zunehmender Anzahl in den

Alveolen (A).


107 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 108


Das Lumen von Bronchien und häufiger von Bronchiolen war multifokal verlegt. Das

Exsudat bestand aus neutrophilen Granulozyten und aus variablen Mengen an MHC II+

Zellen (Abb. 30A). Fokal waren überwiegend MHC II+ Makrophagen enthalten (Tier Nr. 11).

Waren wenige MHC II+ Makrophagen im Exsudat enthalten, verteilten sie sich meist

randständig im Exsudat. Dabei bildeten Alveolarmakrophagen einen großen Anteil (Abb.

30B). Zum Teil wurde das Exsudat von einzelnen CD1b+ dendritischen Zellen umhüllt (Abb.

30C). Das Exsudat markierte sich zum Teil diffus für IgA oder enthielt IgA+ Präzipitate

(Abb. 30D). Zum Teil waren im Lumen von defekten Bronchiolen abgeschilferte

Epithelzellen zu sehen, deren Zytoplasma weiterhin apikal für IgA markiert war. Im

Zytoplasma untergehender Bronchiolen war granuläres MHC II+ Reaktionsprodukt

vorhanden. Peribronchioläre IgA+, IgM+ und IgG1+ Plasmazellen waren in ihrer Anzahl

reduziert und nur vereinzelt nachweisbar. In der Lamina propria und im Interstitium der

Bronchien waren weiterhin viele IgA+ und IgM+ Plasmazellen zu beobachten. CD4+, CD8+

und γδ+ T-Zellen waren in der Lp und vermehrt, zum Teil in mehreren Lagen, im Interstitium

von Bronchien verteilt aber kaum zu untergehenden Bronchiolen assoziiert (Abb. 30E,F). In

entsprechender Lage fanden sich aktivierte CD25+ Zellen wieder. Vereinzelt waren CD1b+

dendritische Zellen im peribronchialen Interstitium verteilt. In der Lp der Bronchien waren

entsprechend Tag 2 pi nur einzelne Makrophagen vorhanden und nur vereinzelt CD1b+

dendritische Zellen darstellbar.

Blutgefäße

Regelmäßig hafteten einzelne IgM+ Plasmazellen am Gefäßendothel. In den Gefäßwänden

waren wenige CD4+, CD8+ und γδ+ T-Zellen sowie einzelne aktivierte CD25+ Zellen

vorhanden. Perivaskuläre CD25+ Zellen waren rund oder besaßen Zellausläufer. In der

Adventitia von großen Blutgefäßen waren unterschiedlich viele MHC II+ Zellen vorhanden.

Darunter polygonale Alveolarmakrophagen und wenige MHC II+ Zellen mit

Zytoplasmaausläufern. Dabei waren keine CD1b+ dendritischen Zellen nachweisbar. Mitunter

waren einzelne IgA+ und IgM+ Plasmazellen in den Wänden der Blutgefäße vorhanden. Die

Markierung mit IgG1 entsprach an beiden Tagen der Markierung von Tag 2 pi.

109 ERGEBNISSE

Interlobuläre Interstitien

In den Fibrinthromben waren wenige segmentkernige Granulozyten und viele, überwiegend

diffus verteilte MHC II+ Zellen enthalten. Ein Teil der MHC II+ Zellen stimmten in Lage und

Morphologie mit Makrophagen überein. In der Mehrzahl der Lungenlokalisationen waren

zudem viele CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten zu beobachten, die sich multifokal häuften

oder gleichmäßig verteilten. Im Vergleich zu CD4+ und CD8+ waren weniger γδ+ T-Zellen

zu beobachten. Vereinzelt lagen aktivierte CD25+ Zellen vor.

ERGEBNISSE 110

Abb. 30: Darstellung immunhistologischer Befunde von MHC II, Makrophagen,

CD1b+ dendritischen Zellen, IgA+ Plasmazellen, CD8+ und γδ+ T-Zellen im luftleitenden

System des veränderten Lungengewebes am Tag 3 pi an konsekutiven Gefrierschnitten eines

Bronchus.

A-F indirekte Immunperoxidase an Kryostatschnitten von Tier Nr. 11, Lobus


A: Zahlreiche MHC II+ Zellen verteilen sich in der Lp (Lp) und im peribronchialen und

perivaskulären Bindegewebe (I). Das Exsudat im Lumen von Bronchus (B) und Alveolen (A)

besteht größtenteils aus MHC II+ Zellen.

B: Zahlreiche Makrophagen bilden einen Großteil des bronchialen und alveolären Exsudats

(E). Wenige Makrophagen (Pfeilspitze, exemplarisch) sind in der Lp (Lp) und im

peribronchialen Bindegewebe (I) vorhanden.

C: Einzelne CD1b+ dendritische Zelle (Pfeilspitzen, exemplarisch) liegen im Lumen (B) und

in der Lp (Lp) eines Bronchus.

D: Das Exsudat (E) weist granuläres Präzipitat und eine diffuse Markierung für IgA auf

(Stern weiß). In der Lp (Lp) und peribronchial (I) verteilen sich viele IgA+ Plasmazellen

(Pfeile, exemplarisch).

E: Sehr viele CD8+ T-Lymphozyten (Pfeile, exemplarisch) sind gleichmäßig im

peribronchialen Bindegewebe (I) angeordnet.

F: Sehr viele γδ+ T-Lymphozyten (Pfeile, exemplarisch) liegen im peribronchialen

Bindegewebe (I).

111 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 112


Lunge am Tag 7 und 10 pi


Aufgrund weitestgehender Übereinstimmung der histopathologischen Veränderungen wurden

die Befunde für Tag 7 und 10 pi zusammengefasst. Als Lungenveränderungen waren

subakute fibrinöse Bronchopneumonien zu finden. Weiterhin waren Nekrosen vorhanden, die

sich überwiegend lobulär ausdehnten. Im Spitzenlappen von Tier Nr. 19, im accessorischen

Lungenlappen zweier Kälber (Tiere Nr. 17, 20) und im Basislappen zweier Kälber (Tiere Nr.

20, 22) waren die Nekrosen auf multiple Herde beschränkt. In den Nekrosen waren einzelne

kuboidale Epithelzellen oder Zytokeratinfilamente verteilt. Die Nekrosen wurden zunehmend

von einer Regenerationszone aus hyperplastischen Alveolarepithelzellen Typ II (AEC II)

begrenzt. Der Regeneration folgte eine zelluläre Infiltration. An die Läsionen grenzten

vermehrt unveränderte Läppchen (Tiere Nr. 20, 21). Der Spitzenlappen von Tier Nr. 17 und

der accessorische Lungenlappen von Tier Nr. 21 wiesen eine fibrinöse Bronchopneumonie

auf. Einzelne abgeschilferte Zellen verteilten sich im Lumen von Bronchiolen. In der

Mehrzahl waren sie frei von Exsudat. Multifokal fielen im Spitzenlappen und im

accessorischen Lungenlappen von Tier Nr. 17 Bronchien mit mehrreihigem Epithel auf. Die

Interalveolarsepten, die Gefäßadventitia und das peribronchiale und interlobuläre Interstitium

waren weiterhin verbreitert und enthielten proteinreiches Exsudat.

An beiden Tagen unterschieden sich die Erregermengen nicht signifikant. In der Mehrzahl

waren sehr viele Chlamydieneinschlüsse vorhanden. Ausnahmen bildeten die histologisch

unveränderten Lungenlokalisationen der Tiere Nr. 17 und 21, in denen nur wenige

Chlamydieneinschlüsse in Einzelzellen vorhanden waren bzw. keine Erregerstrukturen

nachgewiesen werden konnten. Chlamydien verteilten sich im Zentrum (Abb. 24B) oder am

Rand der Nekrosen (Abb. 31B, Abb. 32B). Zudem waren im Basislappen von Tier Nr. 17 und

im accessorischen Lungenlappen von Tier Nr. 18 Erregerstrukturen multifokal in der

Regenerationszone verteilt. Die Chlamydieneinschlüsse waren als große, runde

intrazytoplasmatische Markierung und weiterhin als granuläre Strukturen sichtbar.

113 ERGEBNISSE

Nekrosen

Die Nekrosen enthielten Fibrin und Zelldetritus (Abb. 31A, Abb. 32A). In ihnen waren

wenige intensiv markierte runde oder schlanke MHC II+ Zellen verteilt. Ebenfalls ließen sich

wenige CD1b+ dendritische Zellen (Abb. 31D) aber keine Makrophagen darstellen. Zum Teil

waren einzelne CD8+, γδ+, CD4+ Zellen und aktivierte CD25+ Zellen in der Nekrose

enthalten (Tiere Nr. 19, 21, 22). Peripher der Nekrosen waren sehr viele Makrophagen

(Abb. 31C). viele CD25+ T-Zellen und CD4+ T-Zellen (Tiere Nr. 17, 18) und weniger CD8+

T-Zellen zu beobachten (Abb. 31E,F).

Regenerationsbereich

Am Tag 7 pi war die Regenerationszone aus kuboidalen AEC II zunächst multifokal entlang

der interlobulären Interstitien zu beobachten. Am Tag 10 pi war die Regenerationszone

vergrößert und entlang des interlobulären Bindegewebes ausgedehnt (Abb. 32C). Das

Zytoplasma der AEC II wies eine feingranuläre Markierung für IgA auf (Abb. 32D, F). Am

Tag 7 und vermehrt am Tag 10 pi waren viele IgA+ Plasmazellen und IgM+ Plasmazellen

und IgM+ B-Lymphozyten in einer oder mehreren Lagen entlang des interlobulären

Interstitiums angeordnet. Die Regenerationszone markierte sich homogen für MHC II. Von

der diffusen Markierung ließen sich wenige intensiv für MHC II+ markierte Einzelzellen mit

runder oder schlanker Gestalt abgrenzen. Durch die Doppelmarkierung von Zytokeratin und

CD1b+ dendritischer Zellen waren regelmäßig wenige CD1b+ dendritische Zellen basal und

luminal der hyperplastischen Alveolarepithelzellen abgrenzbar (Abb. 32F). Die

hyperplastischen AEC II lagen in Zellverbänden und bildeten Hohlräume, in denen sich

zunächst IgA+ und IgM+ und im weiteren Verlauf vermehrt IgG1+ Präzipitate sammelten.

Die Hohlräume waren überwiegend von Alveolarmakrophagen infiltriert, die so die Nekrosen

begrenzten (Abb. 31C). Am Tag 10 pi waren neben Alveolarmakrophagen vermehrt

interstitielle Makrophagen (Abb. 32E) vorhanden. Dabei waren Häufungen zum einen

unmittelbar angrenzend an die Nekrose und zum anderen in der Peripherie des

Regenerationsbereiches, dicht am interlobulären Interstitium, zu finden. CD4+, CD8+ T-

Zellen und γδ+ T-Zellen nahmen in ihrer Anzahl zu und breiteten sich diffus in der

Regenerationszone aus (Abb. 33A,B,C). Wenige CD25+ Zellen waren weiterhin im

Regenerationsbereich verteilt (Abb. 33D). Multifokal entlang des interlobulären Interstitiums

ERGEBNISSE 114

waren Ansammlungen aus CD4+ und weniger aus CD8+ Zellen zu sehen (Abb. 33A). In der

Lunge eines Kalbes waren multifokale Lymphozyteninfiltrate vorhanden, die sich

netzwerkartig für CD25 markierten, mit Makrophagen durchsetzt waren und wenige IgM+ B-

Lymphozyten enthielten (Tier Nr. 20).


Der Spitzenlappen von Tier Nr. 17 war weitgehend unverändert. Lediglich verbreiterte

Interalveolarsepten waren zu sehen. Entsprechend der Kontrollen verteilten sich interstitielle

und intravaskuläre Makrophagen. Zudem waren wenige CD4+, CD8+ und einzelne γδ+ T-

Zellen unregelmäßig in den Interalveolarsepten verteilt. CD25+ Zellen waren nicht enthalten.

Zum Teil waren Bereiche vorhanden, in denen sich IgM+ Zellausläufer entsprechend der

Kontrollen markierten. Im Vergleich zu den veränderten Lungen, lagen CD1b+ dendritische

Zellen am Tag 7 pi im angrenzenden, unveränderten Gewebe in erhöhter Zahl vor.


Ein Teil der Luftwege war weiterhin mit Detritus, Fibrinansammlungen und neutrophilen

Granulozyten verlegt. Das Exsudat markierte sich diffus für MHC II und wurde häufig von

CD1b+ dendritischen Zellen infiltriert und umgeben. In der Lp von Bronchien und

Bronchiolen waren wenige neutrophile Granulozyten zu sehen. Im peribronchialen

Interstitium waren vermehrt IgM+ Plasmazellen vorhanden. Sehr viele CD4+ und CD8+ T-

Lymphozyten, wenige IgA+ Plasmazellen und γδ+ T-Zellen und einzelne aktivierte CD25+

Zellen waren peribronchial bzw. peribronchiolär verteilt. Ab Tag 10 pi waren die Lumina von

Bronchiolen multifokal durch Granulationsgewebe verlegt, das von hyperplatischen

Epithelzellen umgeben wurde. Im Granulationsgewebe befanden sich einzelne neutrophile

Granulozyten.

115 ERGEBNISSE

Blutgefäße

Viele MHC II+ Zellen und Makrophagen waren in der Gefäßadventitia zu beobachten.

CD1b+ dendritische Zellen ließen sich nicht nachweisen. Ab Tag 10 pi waren vermehrt IgM+

und IgA+ Plasmazellen gleichmäßig im Querschnitt der Gefäßwände verteilt. Weiterhin

waren sehr viele CD4+ und weniger CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten im perivaskulären

Bindegewebe zu beobachten. Zum Teil waren wenige aktivierte CD25+ Zellen zu sehen (Tier

Nr. 22).

Interlobuläres Interstitium

Im interlobulären Bindegewebe waren noch immer Fibrinthromben, viele Entzündungszellen

und Zelldetritus enthalten. Im Vergleich zu den vorherigen Zeitpunkten und im Vergleich zu

den Kontrollen lagen am Tag 10 pi vermehrt MHC II+ Zellen vor, darunter viele

Makrophagen (Abb. 32E) und zum Teil viele CD1b+ dendritische Zellen. CD1b+

dendritische Zellen bildeten vermehrt multifokale Zellansammlungen. Sehr viele CD4+ und

CD8+ T-Zellen und weniger γδ+ T-Zellen waren zu beobachten. Zum Teil bildeten CD4+ und

CD8+ T-Zellen multifokal kleine Ansammlungen.

ERGEBNISSE 116

Abb. 31: Darstellung histologischer Befunde und immunhistologischer Befunde von

Chlamydiaceae-LPS, Makrophagen, dendritischen Zellen sowie CD4+ und CD8+ T-Zellen

im veränderten Lungengewebe am Tag 7 pi.


B-F indirekte Immunperoxidase an Kryostatschnitten;

A, B, D konsekutive Kryostatschnitte von Tier Nr. 19, Lobus accessorius;

C, E, F konsekutive Kryostatschnitte von Tier Nr.17, Lobus accessorius;


A: Subakute, fibrinöse Bronchopneumonie mit herdförmiger Nekrose (N).

B: In der Nekrose (N) lassen sich sehr viele Chlamydienstadien (Pfeilspitzen, exemplarisch)

nachweisen.

C: Die Nekrose (N) ist von zahlreichen Alveolarmakrophagen umgeben (Pfeile,

exemplarisch).

D: In der Nekrose und im Randbereich verteilen sich viele CD1b+ dendritische Zellen (Pfeile,

exemplarisch).

E: Viele CD4+ T-Zellen (Pfeile, exemplarisch) sind peripher der Nekrose (N) in den

umliegenden Alveolen zu finden.

F: Wenige CD8+ T-Lymphozyten (Pfeile, exemplarisch) sind peripher der Nekrose (N) in

den umliegenden Alveolen verteilt.

117 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 118

Abb. 32: Darstellung der histologischen Befunde und immunhistologischen Befunde von

Chlamydiaceae-LPS, Zytokeratin, IgA, Makrophagen und CD1b+ dendritischen Zellen im

veränderten Lungengewebe am Tag 10 pi an konsekutiven Kryostatschnitten von Tier Nr. 21,

Lobus caudalis.


B-F indirekte Immunperoxidase

A: Der Regenerationsbereich (R) aus hyperplastischen alveolären Epithelzellen (Pfeile,

exemplarisch) grenzt an das interlobuläre Interstitium (I) und demarkiert die Nekrose (N).

Entlang des Interstitiums lassen sich zelluläre Infiltrate nachweisen (Pfeilspitze,

exemplarisch). Eichstrich = 500 µm

B: Chlamydieneinschlüsse verteilen sich überwiegend im Randbereich der Nekrose (N).

Wenige Chlamydieneinschlüsse (Pfeile, exemplarisch) sind in der Regenerationszone (R)

enthalten. Eichstrich = 500 µm

C: Die Markierung des Zytokeratins zeigt tubuläre Epithelstrukturen mit zentralen

Hohlräumen (R), die an das interlobuläre Interstitium (I) grenzen und die Nekrose (N)

demarkieren. Eichstrich = 500 µm

D: Die hyperplastischen Alveolarepithelzellen Typ II weisen eine feine granuläre Markierung

für IgA auf (Pfeilspitzen, exemplarisch) in der Regenerationszone (R). Viele IgA+

Plasmazellen (Pfeile, exemplarisch) sind entlang der interlobulären Interstitien (I) aufgereiht

und vereinzelt (schlanke Pfeile, exemplarisch) in den Randbereichen der Nekrose (N) zu

finden. Eichstrich = 500 µm

E: Makrophagen (Sterne, exemplarisch) häufen sich peripher der Nekrose (N) und im

Regenerationsbereich (R) entlang der interlobulären Interstitien (I). Eichstrich = 500 µm

F: CD1b+ dendritische Zellen verteilen sich im Regenerationsbereich (R) unmittelbar entlang

der hyperplastischen AEC II (Pfeile, exemplarisch).

Doppelmarkierung von CD1b und Zytokeratin; Eichstrich = 200 µm

119 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 120

Abb. 33: Darstellung der immunhistologischen Befunde von CD4+, CD8+, γδ+ T-

Lymphozyten und CD25+ Zellen im veränderten Lungengewebe am Tag 10 pi an

konsekutiven Gefrierschnitten.

Indirekte Immunperoxidase, Tier Nr. 21, Lobus caudalis; Eichstrich = 500 µm

A: Zahlreiche CD4+ T-Zellen (Pfeile, exemplarisch) liegen diffus im Regenerationsbereich

(R). Zusätzlich sind multifokale Ansammlungen aus CD4+ T-Zellen (Pfeilspitzen,

exemplarisch) entlang des interlobulären Interstitiums (I) zu sehen. Einzelne CD4+ T-Zellen

befinden sich in den interlobulären Interstitien und in der Nekrose (N).

B: CD8+ T-Zellen (Pfeile, exemplarisch) sind zahlreich, aber im Vergleich zu CD4+ T-

Zellen in geringerer Anzahl im Regenerationsbereich (R) verteilt. Einzelne CD8+ T-Zellen

liegen in den interlobulären Interstitien (I) und in der Nekrose (N).

C: Wenige γδ+ T-Zellen liegen im Regenerationsbereich (R). Einzelne γδ+ T-Zellen verteilen

sich in den interlobulären Interstitien (I) und in der Nekrose (N).

D: Einzelne CD25+ Zellen (Pfeile, exemplarisch) sind im Regenerationsbereich (R) verteilt.

121 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 122


Lunge am Tag 14 pi


Am Tag 14 pi war das Lungengewebe durch weitgehende Regeneration der veränderten

Bereiche gekennzeichnet. Die Regenerationszonen verdrängten zunehmend die Nekrosen

(Abb. 34A). Nur noch in einem Teil der Lungenschnitte waren Nekrosen vorhanden - in den

Spitzenlappen zweier Kälber (Tiere Nr. 23, 25), im Basislappen und im accessorischen

Lungenlappen von jeweils einem (Tiere Nr. 24, 25). Im Unterschied zu Tag 10 pi waren die

Nekrosen hochgradig zellulär infiltriert. Weiterhin ließen sich Lymphozytenansammlungen

entlang des interlobulären Interstitiums beobachten, wovon ein Großteil follikuläre Strukturen

aufwies. Das Alveolarepithel der Regenerationszone war überwiegend flach und umgab

ausgeweitete Alveolen. Angrenzende Läppchen waren in der Mehrzahl histologisch

unverändert.

Chlamydien lagen in geringer Zahl, diffus oder randständig in den Nekrosen vor (Abb. 34B).

Bei einem Tier (Nr. 25) im Spitzenlappen wurde eine herdförmige Ansammlung aus

chlamydialen Einschlüssen im interlobulären Bindegewebe beobachtet. Die lymphozytären

Infiltrate entlang des interlobulären Bindegewebes enthielten keine chlamydialen Einschlüsse.

Im angrenzenden unveränderten Lungengewebe waren wenige, einzeln gelegene mit

Chlamydien infizierte Zellen zu beobachten. Im accessorischen Lungenlappen von Tier Nr. 23

stimmte die Lage von CD1b+ dendritischen Zellen mit den markierten

Chlamydieneinschlüssen überein.


In den unveränderten Läppchen entsprachen Menge und Verteilung der untersuchten

Zelltypen denen der Kontrollkälber.

Nekrosen

Die Nekrosen markierten sich diffus für MHC II und enthielten massenhaft Makrophagen,

sehr viele CD8+ und viele CD4+ und γδ+ T-Lymphozyten (Abb. 34C,D,E,F). Wenige CD1b+

dendritische Zellen verteilten sich diffus in der Nekrose. Die T-Lymphozyten waren

gleichmäßig in der Nekrose verteilt.

123 ERGEBNISSE

Regenerationsbereich

Die Regenerationszone war schwach diffus für MHC II markiert. Das Zytoplasma der

hyperplastischen Alveolarepithelzellen wies weiterhin eine feingranuläre Markierung für IgA

auf. Wenige CD1b+ dendritische Zellen waren regelmäßig basal und luminal von

hyperplastischen Epithelzellen zu finden. Viele IgM+, IgA+ und IgG1+ Plasmazellen

verteilten sich gleichmäßig in der Regenerationszone und unmittelbar angrenzend an die

Nekrose. Zusätzlich lagen massenhaft IgM+ B-Lymphozyten in unterschiedlich ausgedehnten

Ansammlungen vor. Sehr viele CD4+, CD8+ und γδ+ T-Zellen lagen gleichmäßig verteilt in

der Regenerationszone. Ihre Anzahl war in der Regenerationszone geringer als in der

Nekrose.

Lymphozytäre Aggregate

Multifokale lymphozytären Aggregate lagen entlang des interlobulären Interstitiums

aufgereiht oder perivaskulär. Sie waren homogen für MHC II markiert. Sie bestanden

überwiegend aus CD4+ T-Lymphozyten, IgM+ B-Lymphozyten und wenigen bis vielen

CD1b+ DC (Abb. 35B,C,D). Zudem waren sie netzwerkartig für CD25 markiert. Es ließen

sich T- und B-Zellzone unterscheiden. Die B-Zellzone zeigte eine retikuläre Markierung für

CC56 (Abb. 35A) und eine netzwerkartige Markierung für IgM. Eine nur schwache

Markierung konnte für IgG1 und IgA beobachtet werden. Im Follikelzentrum lagen vereinzelt

CD4+ T-Lymphozyten und Makrophagen vor. Im parafollikulären Bereich verteilten sich

viele CD4+ T-Zellen, viele dendritische Zellen und wenige Makrophagen.

Blutgefäße

CD4+ T-Zellen bildeten perivaskuläre Infiltrate, die besonders um kleine Gefäße zu

beobachten waren (Tier Nr. 23). Weiterhin befanden sich viele MHC II+ Zellen in den

Gefäßwänden. Das perivaskuläre Bindegewebe markierte sich diffus für IgG1. IgA+ IgM+

und IgG1+ Plasmazellen ließen sich nicht nachweisen. Im perivaskulären Bindegewebe waren

regelmäßig Ansammlungen aus CD1b+ DC zu sehen.

ERGEBNISSE 124

Abb. 34: Darstellung der immunhistologischen Befunde von Zytokeratin, Chlamydiaceae-

LPS, Makrophagen, CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten im veränderten Lungengewebe

am Tag 10 pi an konsekutiven Gefrierschnitten.

Indirekte Immunperoxidase, Tier Nr. 24, Lobus caudalis; Eichstrich = 500 µm

A: Die Nekrose (N, durch gestrichelte Linie dargestellt) kennzeichnet sich durch das Fehlen

von Zytokeratin+ Alveolarepithelzellen. Ein Regenerationsbereich umgibt die Nekrose und

weist eingeengte Bronchiolarlumina auf (Bronchiolitis obliterans (B)).

B: Viele Chlamydieneinschlüssen liegen in der Nekrose (durch gestrichelte Linie dargestellt)

und zwischen regeneriertem Epithel.

C: Die Nekrose (N, durch gestrichelte Linie dargestellt) ist hochgradig mit

Alveolarmakrophagen infiltriert. Alveolarmakrophagen sind zusätzlich in umliegenden

Alveolen (A) verteilt.

D: Zahlreiche CD4+ T-Zellen verteilen sich in der Nekrose (N, durch gestrichelte Linie

dargestellt). Zudem liegt eine Ansammlung aus CD4+ Zellen (Stern) neben einem Blutgefäß

(G).

E: CD8+ T-Zellen (Pfeile, exemplarisch) infiltrieren deutlich die Nekrose (N, durch

gestrichelte Linie dargestellt).

E: Viele γδ+ T-Zellen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich in der Nekrose (N, durch

gestrichelte Linie dargestellt).

125 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 126

Abb. 35: Zelluläre Zusammensetzung der lymphatischen Aggregate in den Interstitien am Tag

14 pi an konsekutiven Gefrierschnitten.

Indirekte Immunperoxidase am Kryostatschnitt; Tier Nr. 24, Lobus caudalis; Eichstrich =

500 µm

A: Lymphozyteninfiltrate entlang der interlobulären Interstitien (I) zeigen herdförmige,

netzartige Markierung für CC56 (Sterne).

B: Lymphozyteninfiltrate entlang des interlobulären Interstitien (I) enthalten Ansammlungen

von IgM+ B-Lymphozyten (Sterne).

C: Zahlreiche CD4+ T-Lymphozyten sind parafollikulär (Sterne) in den lymphozytären

Aggregaten der interlobulären Interstitien (I) angeordnet.

D: Lymphozyteninfiltrate (Sterne) im interlobulären Interstitium (I) enthalten zahlreiche

CD1b+ dendritischen Zellen (Pfeile, exemplarisch) im parafollikulären Bereich.

127 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 128


Multifokal waren Bronchien zu beobachten, in deren Lp die untersuchten

Leukozytensubtypen in Anzahl und Verteilung entsprechend der Kontrollen verteilt waren.

Dabei war die Epithelmarkierung durch IgA nur bei einem Tier wie bei den Kontrollen (Tier

Nr. 25). Im peribronchialen und peribronchiolären Bindegewebe waren vermehrt

Ansammlungen aus CD1b+ DC zu sehen.

Interlobuläres Bindegewebe

Neben den bereits beschriebenen lymphozytären Aggregaten waren im interlobulären

Interstitium, das die Läsionen begrenzte, sehr viele MHC II+ Makrophagen und wenige

CD1b+ dendritische Zellen nachweisbar. Die T-Zellsubtypen verteilten sich in den

interlobulären Interstitien entsprechend Tag 10 pi. IgA+, IgM+ und IgG1+ Plasmazellen

wurden nicht beobachtet. Im interlobulären Bindegewebe waren regelmäßig Aggregate aus

vielen CD1b+ DC zu sehen.


Lunge am Tag 35/37 dpi


Am Tag 35/37 pi war die Mehrzahl der untersuchten Lungen histologisch unverändert. In den

unveränderten Läppchen waren die untersuchten Zelltypen in Menge und Verteilung

entsprechend der Kontrollkälber verteilt. Regelmäßig waren follikuläre Strukturen entlang der

Luftwege, des interlobulären Interstitiums und perivaskulär zu beobachten. Im Spitzenlappen

eines Tieres war vermehrt hyperplastisches BALT vorhanden (Tier Nr. 27). Peripher des

BALT, waren viele IgA+ und IgM+ Plasmazellen in der Lp der Bronchien verteilt. Zudem

waren einzelne CD25+ aktivierte Zellen in der Lp von Bronchien und Bronchiolen zu sehen.

Im Basislappen eines Kalbes (Tier Nr. 26) befanden sich zwei Herde granulomatöse

Entzündung (Abb. 36A,B). In ihnen ließen sich immunhistologisch Chlamydienstadien

nachweisen (Abb. 36C). Die Chlamydieneinschlüsse lagen als blass-braunes, homogenes

Material im Zytoplasma von Makrophagen, die sich im Inneren des Granuloms verteilten. Im

Zentrum der Veränderung waren sehr viele Makrophagen, mehrere mehrkernige Riesenzellen

129 ERGEBNISSE

(Abb. 36A,D) und sehr viele CD8+ T-Zellen verteilt (Abb. 36E). Zusätzlich ließen sich

einzelne CD1b+ dendritische Zellen, CD4+ und γδ+ T-Zellen (Abb. 36F). In der Peripherie

des Granuloms lagen sehr viele bis massenhaft CD8+ T-Zellen und weniger γδ+ T-Zellen

nachweisen (Abb. 36E,F). Peripher der Veränderungen waren vermehrt IgA+ Plasmazellen zu

sehen (Abb. 37B). CD4+ T-Lymphozyten waren in geringer Zahl vorhanden. Sie bildeten

multifokale Ansammlungen um Gefäße und entlang des Interstitiums (Abb. 37A). Die

Aggregate waren positiv für CD25 und wurden von wenigen CD8+, γδ+ T-Zellen und CD1b+

dendritischen Zellen umgeben.

ERGEBNISSE 130

Abb. 36: Darstellung histologischer und immunhistologischer Befunde von Zytokeratin,

Chlamydiaceae-LPS, Makrophagen, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten im veränderten

Lungengewebe am Tag 35/37 pi.


B-F indirekte Immunperoxidase an konsekutiven Kryostatschnitten von Tier Nr. 26,

Lobus caudalis;

A: Fokale granulomatöse Entzündung (Gr, durch gestrichelte Linie dargestellt) mit

mehrkernigen Riesenzellen (Pfeilspitze, exemplarisch). In der Peripherie des Granuloms

befindet sich ein perivaskuläres lymphozytäres Infiltrat (Stern, weiß).


B: In der Veränderung (Gr, durch gestrichelte Linie dargestellt) sind keine Zytokeratin+

Epithelstrukturen vorhanden.


C: In dem Granulom (Gr, durch gestrichelte Linie dargestellt) sind wenige

Chlamydieneinschlüsse (Pfeilspitzen, exemplarisch) in Makrophagen zu erkennen.


D: In dem Granulom (Gr, durch gestrichelte Linie dargestellt) sind Ansammlungen von

Makrophagen (Pfeile, exemplarisch) und mehrkernige Riesenzellen (Pfeilspitze,

exemplarisch) zu finden.


E: Zahlreiche CD8+ T-Zellen (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich im Granulom (Gr, durch

gestrichelte Linie dargestellt) und in der Peripherie.


F: Viele γδ+ T-Lymphozyten (Pfeile, exemplarisch) verteilen sich diffus im Granulom (Gr,

durch gestrichelte Linie dargestellt) und peripher davon.


131 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 132

Abb. 37: Darstellung immunhistologischer Befunde von CD4+ T-Lymphozyten und

IgA+ Plasmazellen im veränderten Lungengewebe am Tag 35/37 pi.

Indirekte Immunperoxidase an konsekutiven Kryostatschnitten von Tier Nr. 26, Lobus


A: CD4+ T-Zellen verteilen sich diffus in und vermehrt peripher des Granuloms (Gr). Fokal

liegt ein perivaskuläres lymphozytäres Aggregat (Pfeilspitze).

B: Viele IgA+ Plasmazellen (Pfeilspitzen, exemplarisch) sind peripher des Granuloms (Gr,

durch gestrichelte Linien dargestellt) verteilt.

133 ERGEBNISSE

4.1.2.7 BALT

Bis zum Tag 14 pi waren unregelmäßig einzelne Bronchus- oder Bronchiolus-assoziierte

Follikel in den Lungenlokalisationen verteilt. Erstmals am Tag 7 pi fiel im Spitzenlappen

eines Tieres ein geringgradig ausgeprägter CC56+ Follikel am interlobulären Bindegewebe

auf (Tier Nr. 17A). Diese ektopischen Follikel traten ab Tag 14 pi regelmäßig in den

untersuchten Lungenlokalisationen auf. Am Tag 14 pi waren, wie bei den Kontrollen, in der

Mehrzahl Bronchus-assoziierte Follikel vorhanden, die sich überwiegend isoliert in der

Submukosa und ohne Kontakt zum Epithel oder zu Gefäßen verteilten. Vereinzelt lag der

Follikel in der Lamina propria oder mit Gefäßkontakt in der Submukosa vor. Bronchiolus-

assoziierte lymphatische Follikel waren entsprechend der Kontrolltiere lokalisiert. In einem

Teil der Lungenlappen waren multifokal ektopische CC56+ Follikel entlang des

interlobulären Bindegewebes (Tiere Nr. 23, 24, 25) verteilt und/oder multiple perivaskuläre

CC56+ Follikel zu sehen (Tiere Nr. 24, 25). Diese traten in Spitzenlappen, Basislappen oder

accessorischen Lungenlappen auf. Neben netzwerkartig markierten Follikeln waren zudem

multifokal Aggregate aus CC56+ B-Lymphozyten entlang des interlobulären Bindegewebes

und perivaskulär verteilt. Am Tag 14 pi lag der Median des BALT bei 2,5 Anschnitte/cm²

Lungengewebe. Der Median für Lymphaggregate lag am Tag 14 pi bei 6,91 Anschnitte/cm²

Lungengewebe.

Am Tag 35/37 pi waren deutlich ausgeprägte BALT Follikel vorhanden, die weiterhin

überwiegend mit Bronchien assoziiert waren. Dabei lagen sie zu gleichen Teilen isoliert in der

Lamina propria oder isoliert in der Submukosa (SM) vor. Die Bronchiolus-assoziierten

Follikel waren zu gleichen Teilen in der Lp oder in der SM mit Gefäßkontakt zu finden. Fokal

in einem accessorischen Lungenlappen waren sie ausschließlich in der Submukosa lokalisiert

(Tier Nr. 27). Verglichen mit Tag 14 pi waren ektopische Follikel weniger häufig entlang des

interlobulären Bindegewebes zu sehen (Tiere Nr. 26, 27, 28). Perivaskuläre CC56+ Follikel

konnten nicht nachgewiesen werden. Am Tag 35/37 pi lag der Median des BALT bei 3,77

Anschnitte/cm² Lungengewebe. Damit war die Menge an BALT am Tag 35/37 pi im

Vergleich zu den Kontrolltieren, bei denen 0,7 Anschnitte/cm² Lungengewebe zu finden

waren, signifikant erhöht (Abb. 38). Am Tag 35/37 pi lag der Median für lymphatische

ERGEBNISSE 134

Aggregate bei bei 2,49 Anschnitte/cm² Lungengewebe. Diese Anzahl unterschied sich

signifikant von der der Kontrollkälber.

Abb. 38: Menge des BALT und der lymphatischen Aggregate bei den Kontrollkälbern sowie

am Tag 14 und 35/37 pi. Boxplots zeigen Median, 25. und 75. Perzentil (Box), MIN/MAX,

Ausreißer (o), Mann-Whitney-Test, p-Wert ≤ 0,05 zeigt signifikante Unterschiede (*)

Die Zellzusammensetzung im BALT entsprach an den Tagen 14 pi und 35/37 pi der, die im

BALT der Kontrollkälber beobachtet wurde. Die BALT Follikel ebenso sowie ein Teil der

ektopischen Follikel waren netzwerkartig positiv für IgM markiert oder bestanden aus dicht

beieinander liegenden IgM+ B-Lymphozyten. Eine schwache Markierung für IgA und IgG1

war nur zum Teil zu beobachten. Teile der Follikel markierten sich schwach netzwerkartig für

CD25. Die Darstellung von MHC II, CD68, CD1b, CD4, CD8 und γδ, entsprach der, die bei

den Kontrollkälbern zu beobachten war.

135 ERGEBNISSE

4.1.2.8 Quantitative Auswertung von CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten in der

Lunge

Entsprechend dem Vorgehen bei den Kontrollkälbern wurde die Anzahl der CD4+, CD8+ und

γδ+ T-Lymphozyten aus den drei Lungenlokalisationen der mit C. psittaci inokulierten Kälber

ermittelt. Die Zellzahlen der drei Lungenlokalisationen wurden je Zeitpunkt und Subtyp

zusammengefasst.

ERGEBNISSE 136

Im Vergleich zu den Kontrollen waren in den veränderten Lungen die CD4+ T-

Lymphozyten/mm² an den Tagen 2, 3, 4, 7 pi signifikant erniedrigt (Abb. 39). Am Tag 10 und

14 pi waren auffällige Streuungen der CD4+ Zellzahlen/mm² vorhanden. Am Tag 10 pi

unterschieden sich die CD4+ T-Zellen/mm² signifikant von den Kontrollen. Die Zellzahlen

der CD4+ T-Zellen/mm² waren am Tag 10 pi im Vergleich zu Tag 7 signifikant erhöht. Die

CD4+ T-Zellen unterschieden sich weiterhin signifikant zwischen den Tagen 10 und 14 pi.

Abb. 39: CD4+ T-Lymphozyten/mm² Lungengewebe im zeitlichen Verlauf nach der

Inokulation mit C. psittaci im Vergleich zur Kontrollgruppe. Boxplots zeigen Median, 25. und

75. Perzentil (Box), MIN/MAX und Ausreißer (o), p-Wert ≤ 0,05 zeigt signifikante

Unterschiede zur Kontrollgruppe (*) und hinsichtlich des zuvor untersuchten Zeitpunktes pi

(#)

CD

4+ T

-Lym

phoz

yten

/mm

² Lu

ngen

gew

ebe

137 ERGEBNISSE

Die CD8+ T-Lymphozyten/mm² waren im Vergleich zu den Kontrollen an den Tagen 2, 3, 4

und 7 pi signifikant vermindert. Am Tag 14 pi waren CD8+ T-Lymphozyten/mm² im

Vergleich zu den Kontrollen signifikant erhöht (Abb. 40). Vergleicht man die Zellzahlen/mm²

mit den jeweils vorhergehenden Zeitpunkten, so unterschieden sich die Zellzahlen zwischen

den Tagen 7 und 10 pi und zwischen den Tagen 10 und 14 pi signifikant voneinander. Dabei

lässt sich an den Tagen 10 und 14 pi eine deutliche Streuung der Zellzahlen beobachten.

Abb. 40: CD8+ T-Lymphozyten/mm² in der Lunge im zeitlichen Verlauf nach der Inokulation

mit C. psittaci im Vergleich zur Kontrollgruppe. Boxplots zeigen Median, 25. und 75.

Perzentil (Box), MIN/MAX und Ausreißer (o), p-Wert ≤ 0,05 zeigt signifikante Unterschiede

zur Kontrollgruppe (*) und hinsichtlich des zuvor untersuchten Zeitpunktes pi (#)

CD

8+ T

-Lym

phoz

yten

/mm

² Lu

ngen

gew

ebe

ERGEBNISSE 138

γδ+ T-Lymphozyten/mm² waren im Vergleich zu den Kontrollen an den Tagen 2, 3, 4, 7 pi

signifikant vermindert. Dabei fallen deutliche Streuungen der γδ+ T-Zellzahlen/mm² am Tag

4 pi auf. Am Tag 14 pi war die γδ+ T-Zellzahl signifikant erhöht (Abb. 41). Vergleicht man

die Zellzahlen/mm² mit den jeweils vorangehenden Zeitpunkten, so unterschieden sich die

Zellzahlen zwischen den Tagen 7 und 10 pi, 10 und 14 pi, und 14 und 35/37 pi signifikant

voneinander.

Abb. 41: γδ+ T-Lymphozyten/mm² in der Lunge im zeitlichen Verlauf nach der Inokulation

mit C. psittaci im Vergleich zur Kontrollgruppe. Boxplots zeigen Median, 25. und 75.

Perzentil (Box), MIN/MAX und Ausreißer (o), p-Wert ≤ 0,05 zeigt signifikante Unterschiede

zur Kontrollgruppe (*) und hinsichtlich des zuvor untersuchten Zeitpunktes pi (#)

γδ+

T-L

ymph

ozyt

en/m

m²

Lung

enge

web

e

139 ERGEBNISSE

4.1.2.9 Nl. mediastinalis

In den Lymphknoten zeigte sich im Verlauf der Infektion mit C. psittaci eine Reaktion

sowohl innerhalb der Follikel als auch im Paracortex und in der Medulla. Im Nl. mediastinalis

konnten immunhistologisch keine Erregerstadien nachgewiesen werden.

Subkapsulär- und Intermediärsinusoide

Die homogene MHC II Markierung der Follikel war mitunter auf subkapsuläre Bereiche und

auf die intermediären Sinusoide ausgedehnt. Die Follikel ließen sich zum Teil nicht vom

Paracortex abgrenzen (Tier Nr. 13). Bis Tag 7 pi waren die Sinusoide der Lymphknoten mit

Makrophagen ausgefüllt und wenige CD1b+ dendritische Zellen nachweisbar. Bei einem Tier

waren zusätzliche multifokale dichte Ansammlungen aus Makrophagen und wenige

dendritischen Zellen aufgereiht in den kapsulären Sinusoiden vorhanden (Tier Nr. 17). Bei

einem anderen Tier waren Makrophagen überwiegend in den Medullarsinusoiden und nicht

subkapsulär zu beobachten (Tier Nr. 16). Neben Makrophagen waren einzelne CD1b+

dendritische Zellen, CD4+ und CD8+ T-Zellen in den Sinusoiden aufgereiht (Tiere Nr. 16,

17). Wie bei den Kontrollen waren wenige bis viele γδ+ T-Lymphozyten ungleichmäßig in

den Intermediärsinusoiden enthalten. Die Sinusoide waren in einem Teil der Lymphknoten

retikulär für CD25 markiert (Tiere Nr. 8, 17).

Am Tag 4 pi wurden sehr viele IgM+ Plasmazellen und B-Lymphozyten, viele IgA+ und

wenige IgG1+ Plasmazellen in den Intermediärsinusoiden gesehen. Sie waren vorwiegend am

Übergang zwischen Paracortex und Medulla lokalisiert (Tiere Nr. 14, 15, 16). Ab Tag 7 pi

waren zum Teil viele IgG1+ Plasmazellen gleichmäßig oder in multifokalen Ansammlungen

in den Intermediärsinusoiden verteilt (Tiere Nr. 14, 17). IgA+ und IgM+ Plasmazellen waren

weiterhin in unterschiedlicher Anzahl vorhanden. Am Tag10 pi waren viele Makrophagen

multifokal (Tier Nr. 23) oder gleichmäßig (Tier Nr. 20) in den Intermediärsinusoiden

vorhanden und nur wenige in den kapsulären Sinusoiden zu sehen.

Cortex

Im Verlauf der Infektion mit C. psittaci war zunehmend eine Zonierung der Lymphfollikel zu

beobachten, die sich bereits zu Beginn der Untersuchung am Tag 2 pi in einem Teil der

Lymphfollikel zeigte. Die Lymphfollikel setzten sich wie bei den Kontrollen aus dicht

ERGEBNISSE 140

aneinander liegenden IgM+ B-Lymphozyten zusammen, die sich überwiegend netzwerkartig

für IgM markierten und einzelne IgM+ Plasmazellen aufwiesen (Tiere Nr. 13, 16). Ein Teil

der subkapsulären Follikel war im Verlauf der Infektion zudem netzwerkartig für IgA

markiert (Tiere Nr. 15, 24, 26). Einzelne Lymphfollikel wurden von IgA+ Plasmazellen

umgeben (Tiere Nr. 8, 28). Die zonierten Follikel waren zudem positiv für IgG1 und

enthielten mitunter einzelne IgG1+ Plasmazellen.

In den Follikeln waren regelmäßig wenige CD4+ T-Zellen verteilt und einzelne CD8+ T-

Zellen zu beobachten. Bei zwei Tieren waren einzelne γδ+ T-Zellen in den Follikeln verteilt

(Tiere Nr. 16, 22). Makrophagen waren wie bei den Kontrollen diffus verteilt. Die Follikel

waren mit Bereichen des umliegenden Paracortex netzwerkartig für CD25 markiert. Teilweise

waren die Lymphfollikel lediglich kapselseitig positiv für CD25 (Tiere Nr. 18, 21) oder

lediglich randständig markiert.

Am Tag 35/37 pi wiesen die Follikel mit einer Ausnahme (Tier Nr. 26) eine netzwerkartige

CD25+ retikuläre Markierung der kapselseitigen Follikelhälfte auf. Die Follikel waren zum

Teil positiv für IgM und IgG1 und enthielten bei einem Tier einzelne IgG1+ Plasmazellen

(Tier Nr. 26).

Paracortex

Im Paracortex waren im Verlauf der Infektion wie bei den Kontrollen überwiegend dicht

gedrängte CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten verteilt. Zwischen der retikulären CD25+

Markierung von Teilen des Paracortex waren wenige und zum Teil multifokal viele CD25+

aktivierte Zellen verteilt. Markiert wurden kleine und große, überwiegend runde Zellen. Im

Paracortex eines Lymphknotens waren keine aktivierten CD25+ Zellen vorhanden (Tier

Nr. 21). Abweichend zu den Kontrollen waren bei einzelnen Tieren am Übergang von

Paracortex zur Medulla vermehrt γδ+ T-Lymphozyten verteilt (Tiere Nr. 8, 13, 22). Im

übrigen Paracortex befanden sich regelmäßig einzelne γδ+ T-Zellen. Einzelne IgM+

Plasmazellen waren um die Follikel lokalisiert. Bei einem Tier waren multifokal subkapsulär

Ansammlungen aus IgM+ Plasmazellen zu sehen (Tier Nr. 16). Wenige kleine Makrophagen

waren regelmäßig multifokal im Paracortex verteilt. Bei den Tieren Nr. 13 und 22 waren viele

Makrophagen zu sehen. Weiterhin waren viele CD1b+ dendritischen Zellen zu beobachten,

die die Lymphfollikel umgaben und sich diffus im Paracortex verteilten. Im Vergleich zu den

141 ERGEBNISSE

Kontrollen waren am Tag 2 pi und 3 pi zum Teil (Tiere Nr. 10, 11, 13) vermehrt dendritische

Einzelzellen entlang der Intermediärsinusoide sichtbar. Weiterhin markierten sich

überwiegend einzelne Zellkörper. Am Tag 4 und 7 pi lagen bei zwei Tieren (Tiere Nr. 14, 17)

weniger dendritischer Zellen vor. Dabei waren nur einzelne dendritische Zellen im Paracortex

verteilt. Sie waren subkapsulär und entlang der Intermediärsinusoide angeordnet. Im weiteren

Verlauf waren meist ungleichmäßige Verteilungsmuster und Mengen zu beobachten. Bei Tier

Nr. 20 waren weniger dendritische Zellen als bei den Kontrollen vorhanden. Am Tag 10 pi

waren einzelne IgM+ Plasmazellen um die Follikel verteilt. Am Tag 35/37 pi waren im

Paracortex multifokal Ansammlungen aus IgM+ B-Lymphozyten und Plasmazellen

vorhanden. Am Tag 35/37 pi waren dendritische Zellen in unterschiedlicher Zahl

entsprechend der Kontrollen verteilt.

Medulla

Die T-Zellsubtypen, CD1b+ dendritische Zellen und Makrophagen verteilten sich in den

Marksträngen wie bei den Kontrollen. Plasmazellen unterschieden sich in der Anzahl von

Tier zu Tier und im Verlauf der Infektion. Nur zum Teil war eine diffuse granuläre

Markierung für IgA und für IgM vorhanden, zum Teil fehlte sie (Tiere Nr. 8, 13). Am Tag 2

und 3 pi waren keine IgA+ und nur wenige IgM+ Plasmazellen zu sehen (Tiere Nr. 8, 13)

oder sehr viele IgM+ Plasmazellen gleichmäßig in den Marksträngen angeordnet (Tier

Nr. 12). Zudem waren einzelne IgG1+ Plasmazellen zu sehen. Am Tag 4 pi wurden sehr viele

IgM+ Plasmazellen und B-Lymphozyten, viele IgA+ und wenige IgG1+ Plasmazellen, die

vorwiegend am Übergang zwischen Paracortex und Medulla lagen, beobachtet (Tiere Nr. 14,

15, 16). Ab Tag 7 pi waren zum Teil viele IgG1+ Plasmazellen gleichmäßig oder in

multifokalen Ansammlungen in den Medullarsinusoiden verteilt (Tiere Nr. 14, 17). IgA+ und

IgM+ Plasmazellen waren in unterschiedlicher Anzahl vorhanden. In einem Teil der

Lymphknoten waren viele IgA+ Plasmazellen verteilt (Tiere Nr. 19, 24, 26). Die Zahl an

IgM+ Plasmazellen nahm im Gegensatz zu IgG1+ Plasmazellen im Infektionsverlauf ab. Zum

Teil waren vermehrt IgM+ B-Lymphozyten vorhanden (Tiere Nr. 21, 25). IgG1+

Plasmazellen lagen am Tag 14 pi multifokal in Ansammlungen vor (Tiere Nr. 23, 24). Bei

einem Tier waren einzelne IgG1+ Plasmazellen vorhanden (Tier Nr. 25). Zusätzlich waren

IgM+ und IgA+ Ablagerungen zwischen den Zellen vorhanden (Tier Nr. 25).

ERGEBNISSE 142

Am Tag 35/37 pi waren die Markstränge diffus für IgA und schwach für IgM markiert. IgA+

und IgM+ Plasmazellen waren bei einem Tier nicht enthalten (Tier Nr. 26). Bei einem

anderen Tier waren viele IgM+ B-Lymphozyten und Plasmazellen vorhanden (Tier Nr. 27).

Viele IgG1+ Plasmazellen lagen multifokal in kleinen Ansammlungen vor (Tiere Nr. 27, 28).

4.1.2.10 Tonsilla pharyngea

Die Tonsilla pharyngea blieb im Verlauf der Infektion mit C. psittaci in ihrer Struktur

unverändert. Im Infektionsverlauf waren immunhistologisch keine Erregerstadien

nachweisbar.

Epithel

Die Anzahl und Verteilung der intraepithelialen Leukozytensubpopulationen waren nach der

Inokulation mit C. psittaci weitestgehend unverändert. Im Unterschied zu den Kontrollkälbern

waren am Tag 7 und 10 pi einzelne aktivierte CD25+ Zellen vorhanden (Tiere Nr. 17, 22).

Bei einem Kalb (Tier Nr. 21) lagen fokal vermehrt CD8+ T-Zellen vor. Teilweise waren

einzelne eosinophile Granulozyten zwischen den Epithelzellen lokalisiert (Tiere Nr. 21, 22,

27).

Subepithelialer Bereich

Ab Tag 4 pi waren multifokale Ansammlungen aus IgM+ B-Lymphozyten zu sehen (Tiere

Nr. 14, 16) und bei einem Tier (Tier Nr. 17) kleine Ansammlungen aus IgA+ Plasmazellen zu

beobachten. Wenige aktivierte CD25+ Zellen verteilten sich im Verlauf der Infektion

ungleichmäßig entlang des Tonsillarepithels. Ab Tag 7 pi lagen sie zum Teil in fokalen

Ansammlungen vor (Tiere Nr. 17, 27). Am Tag 35 pi waren erneut und entsprechend der

Kontrollen subepithelial einzelne IgG1+ Plasmazellen aufgereiht.

Lymphfollikel

Die Follikel markierten sich weiterhin homogen für MHC II, wobei sie durch die diffuse

Markierung der anderen Bereiche nur bedingt von der IFZ abzugrenzen waren. Die Follikel

bestanden aus IgM+ B-Lymphozyten und markierten sich überwiegend retikulär für IgM. Sie

waren zudem diffus oder netzwerkartig für IgG1+ markiert und wiesen regelmäßig in der

Peripherie zum Teil einzelne IgM+ und/oder IgG1+ Plasmazellen auf. Bei einzelnen

Lymphfollikeln markierte sich das Keimzentrum retikulär für IgA.

143 ERGEBNISSE

Ab Tag 2 pi waren vermehrt CD4+ T-Zellen im Follikel verteilt. Bei einem Tier waren viele

CD4+ Zellen vorhanden (Tier Nr. 21). Die Lymphfollikel waren heterogen für CD25

markiert. Die Follikel waren im Gesamten, mit der epithelseitigen Zone oder randständig

markiert. Am Tag 35/37 pi waren die Follikel nur noch schwach positiv für CD25 oder

lediglich randständig markiert.

Interfollikularzone (IFZ)

In der Interfollikularzone waren CD4+ T-Zellen im Unterschied zu den Kontrollen zusätzlich

als dichte Ansammlungen vorhanden. Einzelne γδ+ T-Zellen waren um die Follikel

lokalisiert. Die retikuläre CD25+ Markierung der Follikel fand sich zum Teil in der IFZ

wieder (Tiere Nr. 8, 16). Zudem waren wenige bis viele (Tier Nr. 13) CD25+ Einzelzellen

multifokal in kleinen Ansammlungen verteilt. Ab Tag 4 pi waren multifokal vermehrt IgM+

B-Lymphozyten zu sehen und einzelne IgM+ und IgA+ Plasmazellen vorhanden.

ERGEBNISSE 144

4.2 Ultrastrukturelle Ergebnisse

Von den Kontrollkälbern und von Kälbern, die C. psittaci erhalten hatten, wurden Proben aus

der Lunge für die transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung aufbereitet.

4.2.1 Kontrollkälber

Die Blut-Luft-Schranke wurde von dünnen Lagen aus Alveolarepithelzellen Typ I (AEC I),

Basalmembran und Endothelzellen gebildet. In den Lungen klinisch gesunder Kälber waren

die langen Ausläufer der AEC I über tight junctions verbunden. Ihre luminale Oberfläche war

meist wellig. Der ovale Zellkern wurde von einem dünnen Zytoplasmasaum umgeben und

war nur selten sichtbar (Abb. 42A). Die Ausläufer der AEC I enthielten zahlreiche kleine

Vesikel von kreisrunder oder ovaler Form, selten waren oval geformte Mitochondrien zu

sehen, die überwiegend kernnah vorlagen. Mitunter waren Alveolarepithelzellen vom Typ II

(AEC II) über tight junctions in den Zellverband eingegliedert (Abb. 42B). Im Vergleich zu

den AEC I bildeten sie nur einen kleinen Anteil der alveolären Oberfläche. An der apikalen

Seite der AEC II waren kurze und plumpe Mikrovilli zu sehen. Der Zellkern enthielt bis zu

zwei Nukleoli und war chromatinreich. AEC II besaßen einen breiten Zytoplasmasaum.

Charakteristisches Merkmal waren intrazytoplasmatische lamelläre Körperchen in

unterschiedlicher Größe. Im Zytoplasma waren Vakuolen, polymorphe Mitochondrien, raues

Endoplasmatisches Retikulum (rER) und freie Ribosomen vorhanden.

Die Endothelzellen von Arteriolen und Kapillaren waren durch zahlreiche, kleine einheitlich

große pinozytotische Vesikel im Zytoplasma gekennzeichnet. Ihre polymorphen Zellkerne

waren häufig sichtbar und ragten in das Kapillarlumen oder legten sich der Basalmembran

(BM) flach an. Die Endothelzellen waren fest über interzelluläre tight junctions miteinander

verbunden. Das Lumen von Kapillaren oder Arteriolen war häufig mit einem oder mehreren

Erythrozyten ausgefüllt; zum Teil waren Thrombozyten (Tier Nr. 1) oder große intravaskuläre

Makrophagen zu sehen (Tier Nr. 5). In dem translucenten Zytoplasma der PIMs befanden sich

viele Mitochondrien und Phagolysosomen mit heterogen elektronendichtem Inhalt.

Die Basalmembran war mäßig elektronendicht und lag dem Endothel und Epithel

gleichmäßig eng an. Die Basalmembran wurde stichprobenartig vermessen und war zwischen

30 und 90 nm dick.

145 ERGEBNISSE

Im Alveolarlumen waren selten Alveolarmakrophagen zu finden (Abb. 42C; Tiere Nr. 1, 3).

Sie lagen dem Alveolarepithel auf oder lagen frei im Alveolarlumen. Auf ihrer Zelloberfläche

zeigten sich Pseudopodien, die vereinzelt extrazelluläre Partikel umgaben (Tier Nr. 3). Im

Zytoplasma waren zahlreiche unterschiedlich große polymorphe Phagolysosomen mit

heterogenem Inhalt zu sehen. Sie enthielten häufig osmiophile Substanz oder amorphes

Material, das sich auch frei in den Alveolen wiederfand. Im Zytoplasma waren viele

vorwiegend oval geformte Mitochondrien, ER und elektronendichte Granula vorhanden. Der

runde oder ovale chromatinarme Zellkern wies einen oder mehrere Nukleoli auf.

ERGEBNISSE 146

Abb. 42: Transmissionselektronenmikroskopische Befunde des Alveolarepithels (A, B) und

eines Alveolarmakrophagen (C) bei den Kontrollkälbern.

A: Alveolarepithelzellen Typ I (AEC I) besitzen lange Zytoplasmaausläufer (Pfeilspitzen,

exemplarisch) und einen längsovalen Zellkern (Z).

Tier Nr. 1, Lobus cranialis dexter, pars caudalis; Eichstrich = 5 µm

B: Alveolarepithelzellen Typ II (AEC II) besitzen charakteristische lamelläre Körperchen

(Stern, exemplarisch) und zahlreiche Mitochondrien (Pfeilspitzen, exemplarisch). Auf ihrer

Oberfläche sind plumpe Mikrovilli sichtbar.

Tier Nr. 1, Lobus cranialis dexter, pars caudalis; Eichstrich = 3 µm

C: Alveolarmakrophage mit multiplen Phagolysosomen (Sterne weiß, exemplarisch),

Pfeilspitze zeigt, die Phagozytose von extrazellulärem Material.

Tier Nr. 3, Lobus cranialis sinister, pars caudalis; Eichstrich = 3 µm

147 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 148

4.2.2 Kälber inokuliert mit C. psittaci

4.2.2.1 Lungenveränderungen nach der Inokulation mit C. psittaci an den Tagen 2, 3, 4,

7 und 10 pi

Am Tag 2 pi infiltrierten vorwiegend neutrophile Granulozyten das Alveolarlumen

(Abb. 43A). Neutrophile Granulozyten ließen sich aufgrund des elektronendichten

segmentierten Zellkerns und der vielen elektronendichten Granula im Zytoplasma

unterscheiden. Sie grenzten mitunter eng aneinander, wobei fädige Zytoplasmaausstülpungen

den Kontakt zu angrenzenden PMNs herstellten. Die Mehrzahl der PMNs enthielt ein oder

mehrere intrazytoplasmatische Phagolysosomen mit heterogenem Inhalt und Vakuolen.

Weiterhin waren AEC II abzugrenzen, die Vesikel mit osmiophiler Substanz enthielten. Ihre

Oberfläche wurde luminal von neutrophilen Granulozyten umgeben. Die Basalmembran war

überwiegend intakt. In angrenzenden Kapillaren zeigten sich vermehrt Erythrozyten (Tier

Nr. 8). Im Alveolarlumen waren vereinzelt Alveolarmakrophagen (Abb. 43B) mit

segmentiertem Zellkern oder untergehende Zellen sichtbar. Zudem waren multifokal Bündel

aus feinen Fasern mit periodischer Querstreifung, die der Morphologie und dem Aufbau von

Fibrin entsprachen, vorhanden. Die Alveolarepithelzellen Typ I (Tiere Nr. 8, 13) waren

geschwollen, translucent und enthielten vergrößerte pinozytotische Vesikel. AEC I waren

überwiegend als intakter Zellverband organisiert, wobei sie sich multifokal von der

Basalmembran lösten. Die Endothelzellen waren ebenfalls geschwollen und translucent und

der interzelluläre Spalt war nicht mehr zu erkennen (Tier Nr. 8). Multifokal war lediglich die

Basalmembran ohne Endothel und Epithel sichtbar. Bei einem Tier war in einer Kapillare ein

PIM mit translucentem, organellenreichem Zytoplasma, der ein Phagolysosom mit

unterschiedlich großen, runden Gebilden und mit unterschiedlicher Elektronendichte enthielt,

vorhanden. Der Zellkern war dabei nicht zu sehen.

Am Tag 3 pi war zunehmende Strukturlosigkeit zu beobachten. Neutrophile Granulozyten

enthielten zahlreiche Vakuolen und zeigten geschwollene Zellkerne. Lediglich die

Basalmembran gab Hinweise auf die ursprüngliche Morphologie der Lunge. Wenige intakte

Alveolarmakrophagen konnten identifiziert werden.

Am Tag 4 pi waren viele geschwollene, nicht mehr intakte Zellen, wenige

Alveolarmakrophagen (Abb. 43C) und einzelne neutrophile Granulozyten zu sehen. Die

149 ERGEBNISSE

Zellkerne untergehender Zellen wiesen einen erweiterten perinukleären Spalt auf, das

Chromatin war in der Peripherie verklumpt und im Gesamtenerschienen die Zellkerne und

Zytoplasma translucent. Das Zytolplasma war Ihr Zytoplasma enthielt multiple große

Phagolysosomen (Abb. 43C). Diese wiesen unterschiedlich elektronendichte nicht

zuzuordnende Fragmente auf, die sich zum Teil immunelektronenmikroskopisch mit Gold

markierten (Abb. 47). Intakte PMNs waren eng assoziiert mit solchen Alveolarmakrophagen,

die intrazytoplasmatische Einschlüsse aufwiesen (Tier Nr. 16). Bei einem Tier war eine Zelle

mit langen Zytoplasmaausläufern vorhanden, die als DC identifiziert wurde. Im Zytoplasma

war zahlreiches ER und wenige Mitochondrien enthalten (Tier Nr. 15). Die Zelle wies einen

großen Zellkern auf, der gleichmäßig schwach elektronendicht war und wenig granuläres

Chromatin enthielt.

Am Tag 7 und 10 pi war überwiegend keine eindeutige Zellstruktur zu erkennen. Die

strukturlose Masse enthielt Fibrinfäden und einzelne Erythrozyten. Bei einem Tier konnte im

Alveolarraum eine weitere DC identifiziert werden (Tier Nr. 17). Häufig waren lediglich die

Kapillaren abgrenzbar. Sie waren überwiegend mit Erythrozyten ausgefüllt. Bei einem Tier

grenzte an die intakte Basalmembran eine große Zelle mit gleichmäßig elektronendichtem

Zellkern und weniger elektronendichtem Zytoplasma (Tier Nr. 22). Das Zytoplasma enthielt

ein großes Phagolysosom mit stark osmiophilen Fragmenten. Peripher war keine eindeutige

Zellstruktur zu erkennen und weiterhin Fibrin enthalten. Phagolysosomen prägten das Bild zu

diesen Zeitpunkten, diese waren überwiegen zu untergehenden Zellen assoziiert (Tier Nr. 20).

ERGEBNISSE 150

Abb. 43: Transmissionselektronenmikroskopische Befunde an den Tagen 2 und 4 pi im

veränderten Lungengewebe nach der Inokulation mit C. psittaci.

A: Neutrophile Granulozyten (Sterne, exemplarisch) sind am Tag 2 pi zahlreich im

Alveolarraum verteilt. Wenige Chlamydienstadien liegen frei im Zytoplasma oder finden sich

in Phagolysosomen wieder (Pfeilspitze, exemplarisch). Eine Zelle weist eine hochgradige

Kernwandhyperchromasie (K) auf.

Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister, pars caudalis; Eichstrich = 5,0 µm

B: Alveolarmakrophage (Sterne) ist am Tag 2 pi von neutrophilen Granulozyten (Stern)

umgeben. Im Zytoplasma liegen 0,3 µm große Chlamydienstadien (Pfeilspitzen,

exemplarisch). Zudem liegen zahlreiche Phagolysosomen mit heterogenem Inhalt vor.

Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister, pars caudalis; Eichstrich = 3,0 µm

C: Alveolarmakrophage (Sterne) enthält am Tag 4 pi multiple Phagolysosomen (P) mit

heterogenem Inhalt, wobei Chlamydienstadien nicht abzugrenzen sind.

Tier Nr. 16, Lobus cranialis dexter pars caudalis; Eichstrich = 5,0 µm

151 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 152

4.2.2.2 Morphologie von C. psittaci in der Lunge

Die Spezifität des Nachweises von C. psittaci wurde an den Tagen 2 und 4 pi durch den

immunelektronenmikroskopischen Nachweis und durch die gezielte Entnahme aus

paraffineingebettetem Gewebe erhöht. Dabei waren die in paraffineingebetteten Gewebe

aufgrund des geringen Strukturerhaltes nur begrenzt auswertbar.

Am Tag 2 pi wurden Einschlüsse mit verschiedenen Entwicklungsstadien der Chlamydien

nachgewiesen (Abb. 44). Alle Stadien waren von einer Doppelmembran umgeben. Die äußere

Membran war teilweise abgehoben und wellig. Es waren Körperchen mit einem Durchmesser

von 0,3 µm zu sehen, die als Elementarkörperchen (EK) identifiziert wurden. Ihr Zellleib war

homogen elektronendicht und von einer glatten Doppelmembran begrenzt. Zudem waren

Körperchen mit einem Durchmesser von 0,3-0,6 µm vorhanden, die als

Intermediärkörperchen (IK) identifiziert wurden. IKs waren vermehrt elektronendurchlässig

und enthielten einen meist zentralen elektronendichten Kern. Ihre Zellwand war glatt oder

gewellt. Weiterhin waren größere Körperchen mit einem Durchmesser von 0,5-0,7 µm und

mäßig elektronendichtem, granulären Zellleib vorhanden, die von einer unebenen Membran

umgeben waren. Sie wurden als Retikularkörperchen (RK) identifiziert. Bei der

immunelektronenmikroskopischen Markierung waren 18 nm Goldpartikel gehäuft in der

Zellmembran der Chlamydien nachweisbar. Im übrigen Schnitt waren nur vereinzelte

Goldpartikel nachweisbar. Dies stimmt überein mit Befunden an C. psittaci infizierten

Zellkulturzellen, die als positive Kontrolle verwendet wurde. In dieser waren alle

Erregerstadien entlang der Zellmembran mit Goldpartikeln markiert. Von jedem

Schnittpräparat wurde ein Konsekutivschnitt mit einem Antikörper desselben Isotyps gegen

BVDV anstelle des ersten Antikörpers gegen Chlamydiaceae-LPS behandelt. In diesen

Negativkontrollen waren nur einzelne Goldpartikel zu finden. In der Lungenprobe eines

Tieres waren Einschlüsse zu sehen, die zugleich EK, IK und RK enthielten (Tier Nr. 10). Die

Chlamydienstadien waren größtenteils von einer Inklusionsmembran umgeben. Der

Einschluss befand sich in einer flachen Zelle, die der Basalmembran eng auflag und aufgrund

dessen als AEC I identifiziert wurde (Abb. 44). Im selben Tier war ein ähnlicher Einschluss in

einer weiteren AEC I zu sehen (Abb. 45). Da diese Einschlüsse sehr selten waren, konnten sie

bei der immunelektronenmikroskopischen Untersuchung nicht nachgewiesen werden

153 ERGEBNISSE

Abb. 44: Chlamydieneinschluss mit verschiedenen Erregerstadien. Zu sehen sind

Elementarkörperchen (E, exemplarisch) mit einer Größe von 0,3 µm, Intermediärkörperchen

(I, exemplarisch) mit einer Größe von 0,4 µm und Retikularkörperchen (R, exemplarisch) mit

einer Größe von 0,6 µm.

Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister, pars caudalis; Eichstrich = 800 nm

ERGEBNISSE 154

Am Tag 2 pi lagen neutrophile Granulozyten zahlreich in den Alveolarlumina (Abb. 43A). In

den neutrophilen Granulozyten waren EKs und häufiger IKs frei im Zytoplasma zu finden

(Abb. 43A; Tiere Nr. 8, 10). Zusätzlich gab es kleine Vakuolen, die wenige Erregerstadien

(Abb. 46) und elektronendichtes Material enthielten. Diese wurden nicht als chlamydiale

Einschlüsse, sondern als Phagolysosomen angesprochen. Immunelektronenmikroskopisch

ließen sich Goldpartikel an der Außenmembran der EKs und IKs finden. Sowohl frei im

Zytoplasma, als auch in Phagolysosomen liegende Chlamydien wurden mit Gold markiert.

Chlamydien waren zu diesem Zeitpunkt auch in Alveolarmakrophagen darstellbar. EKs und

IKs lagen frei im Zytoplasma oder befanden sich im Phagolysosom (Abb. 47).

155 ERGEBNISSE

An den Tagen 3 und 4 pi waren EKs und IKs mit einem Durchmesser von 0,2-0,4 µm einzeln

oder in Ansammlungen in untergehenden Zellen zu finden. Häufig war lediglich unscharf

begrenztes, granuläres Zytoplasma zu sehen, ohne dass die Wirtszelle identifiziert werden

konnte (Tiere Nr. 8, 11, 13). Seltener waren pyknotische, einheitlich elektronendichte

segmentierte Zellkerne sichtbar. Die Chlamydienstadien waren zum Teil von einer Membran

umgrenzt. In den Alveolen waren Alveolarmakrophagen mit zahlreichen Phagolysosomen

und wenigen neutrophilen Granulozyten zu finden (Tier Nr. 13). Alveolarmakrophagen und

neutrophile Granulozyten enthielten Chlamydienstadien, die sich immunelektronen-

mikroskopisch mit Gold markieren ließen. Zudem waren heterogen elektronendichte

Phagolysosomen vorhanden, in denen keine eindeutigen Erregerstadien erkennbar waren

(Abb. 47). Die Alveolarmakrophagen waren am Tag 4 pi häufig von dilatiertem ER

durchzogen und enthielten im Zytoplasma multiple Einschlüsse, die aus elektronenarmen,

runden Strukturen und elektronendichten Massen bestanden. Immunelektronenmikroskopisch

ließen sich in den Phagolysosomen der Alveolarmakrophagen nicht eindeutig mit

Erregerstadien assoziierte Ansammlungen von Goldpartikeln beobachten (Tier Nr. 16). Diese

lagen in der Zellwand von Strukturen, die nicht das charakteristische Aussehen von

Chlamydien hatten, und als teilweise abgebaute Chlamydien interpretiert wurden.

ERGEBNISSE 156

Abb. 45: Transmissionselektronenmikroskopische Befunde am Tag 2 pi im veränderten

Lungengewebe.

Tier Nr. 10, Lobus cranialis sinister, pars caudalis;

A: Ein Chlamydieneinschluss in einer AEC I, die der Basalmembran (Pfeile, exemplarisch)

anliegt. Im Alveolarbereich liegt ein neutrophiler Granulozyt (Stern schwarz). Im

Kapillarlumen befinden sich Thrombozyten (T, exemplarisch) und Fibrin (Sterne weiß,

exemplarisch).

Eichstrich = 2,3 µm

B: Die höhere Vergrößerung von A zeigt den Inhalt des Chlamydieneinschlusses mit

Elementarkörperchen (E, exemplarisch) und Intermediärkörperchen (I, exemplarisch). Zudem

liegt ein großes wenig elektronendichtes Körperchen (Sterne schwarz) mit einem

Durchmesser von 1 µm vor, bei dem es sich möglicherweise um ein Retikularkörperchen

handelt.


157 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 158

Abb. 46: Darstellung der immunelelektronenmikroskopischen Befunde am Tag 2 pi.


A: Im Zytoplasma eines neutrophilen Granulozyten (Stern) liegt ein EK (Pfeilspitze) und ein

IK (Pfeil). Die Wand der Chlamydienstadien ist mit Goldpartikeln markiert. Die beiden

Erregerstadien liegen in einer membrangebundenen Vakuole (P), in der sich zusätzlich

amorphes Material befindet. Einzelne Goldpartikel sind diffus über dem Schnitt verteilt

(Pfeilspitze umrandet, exemplarisch).


B: Die höhere Vergrößerung von A zeigt 18 nm Goldpartikel (Pfeilspitzen, exemplarisch)

entlang der Außenmembran der Chlamydien (Stern) in einem Phagolysosom (P).

Eichstrich = 600 nm

159 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 160

Abb. 47: Darstellung der immunelelektronenmikroskopischen Befunde am Tag 2 pi in einem

Alveolarmakrophagen.


A: Goldpartikel markieren Chlamydienstadien (Pfeile), die frei im Zytoplasma eines

Alveolarmakrophagen (PAM) vorliegen. Zusätzlich ist ein Phagolysosom mit amorphem

Material enthalten (Pfeilspitze umrandet).


B: Die höhere Vergrößerung von B zeigt mit Gold markierte 0,4-0,6 µm große

Intermediärkörperchen (Sterne).

Eichstrich = 600 nm

161 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 162

Abb. 48: Immunelelektronenmikroskopische Befunde am Tag 4 pi in einer degenerierten

Zelle.

Tier Nr. 16, Lobus cranialis dexter, pars caudalis;

A: Die Zelle ist geschwollen und zeigt dilatiertes ER. Sie enthält mehrere Phagolysosomen

(P), in denen sich Ansammlungen von 18 nm Goldpartikeln befinden (Pfeilspitze).


B: Die höhere Vergrößerung von A zeigt 18 nm Goldpartikel, die die Außenwand eines

0,3 µm großen Körperchens (Stern) markieren, das keine typische Chlamydienmorphologie

aufweist.

Eichstrich = 500 nm

163 ERGEBNISSE

DISKUSSION 164

5 DISKUSSION

Natürliche Infektionen mit Chlamydien treten weltweit bei Mensch und Tier auf

(LONGBOTTOM u. COULTER 2003). Dabei verlaufen Infektionen mit Chlamydien oft

subklinisch oder werden aufgrund schwieriger Diagnostik fehlerhaft interpretiert. Dies führt

dazu, dass die Bedeutung des Erregers unterschätzt wird (HARKINEZHAD et al. 2007;

ROHDE et al. 2010). Im Fokus aktueller Forschung stehen in erster Linie die

humanpathogenen Spezies C. trachomatis und C. pneumoniae. Beim Menschen verursacht

C. trachomatis üblicherweise Infektionen des Urogenitaltrakts und des Auges (SCHACHTER

1999). C. pneumoniae ist primär ein respiratorisches Pathogen und wird bei 5-20 % der

humanen ambulant erworbenen Pneumonien als Ursache vermutet (HAMMERSCHLAG

2000). Es gibt Hinweise darauf, dass Infektionen mit C. pneumoniae im Zusammenhang zu

Atherosklerose, Alzheimer und Multipler Sklerose stehen (STRATTON u. SRIRAM 2003;

BOREL et al. 2008).

C. psittaci ist eine Chlamydienspezies mit breitem Wirtsspektrum, die primär Vögel infiziert.

Bisher konnte der Erreger oder dessen Antikörper in 469 verschiedenen Vogelarten

nachgewiesen werden (KALETA u. TADAY 2003). C. psittaci ist übertragbar auf den

Menschen und stellt damit einen Zoonosererreger dar (MEYER 1967; NEWMAN et al. 1992;

BEECKMAN et al. 2008). Die aviäre Chlamydiose des Menschen ist weltweit, auch in

Deutschland, verbreitet (HARKINEZHAD et al. 2007; STRAUBE 2010). C. psittaci

verursacht beim Menschen meist respiratorische Erkrankungen mit variabler Symptomatik.

Nach der initialen Vermehrung in Epithelzellen kann der Erreger mit Hilfe von Makrophagen

im Organismus verschleppt werden und Endokarditis, Hepatitis oder Enzephalitis auslösen

(CARR-LOCKE u. MAIR 1976; SHEE 1988; VANROMPAY et al. 1995; BEECKMAN u.

VANROMPAY 2009; FRAEYMAN et al. 2010). Das Rind ist natürlicher Wirt für

verschiedene Chlamydienspezies (C. pecorum, C. abortus, C. psittaci, C. suis), die

Erkrankungen des Urogenitaltrakts, der Gelenke, des Euters, des Respirationstrakts oder des

Intestinaltrakts verursachen können (RONSHOLT 1978; REGGIARDO et al. 1989;

WITTENBRINK et al. 1993; JEE et al. 2004; PANTCHEV et al. 2010). Bei Kälbern in den

USA lag die Prävalenz von Chlamydieninfektionen bei 61 % (JEE et al. 2004). Beim Rind

wird häufig von inapparenten Infektionen berichtet (RONSHOLT 1978; SHEWEN 1980).

165 DISKUSSION

In der vorliegenden Studie wurde Organmaterial verwendet, das aus einem Tierversuch zur

Etablierung eines respiratorischen Infektionsmodells für C. psittaci stammte (OSTERMANN

et al. 2010). In der Studie wurden 21 Kälber mit C. psittaci intrabronchial inokuliert. Um den

Verlauf der Infektion untersuchen zu können, folgte im Anschluss an die Inokulation, an den

Tagen 2, 3, 4, 7, 10, 14 und 35/37, die sequentielle Sektion der Kälber. Die hier vorgelegte

Untersuchung hatte zum Ziel, die Immunreaktion des Wirtes auf die Infektion mit C. psittaci

im zeitlichen Verlauf immunhistologisch in Lunge, Nl. mediastinalis und Tonsilla pharyngea

zu verfolgen. Da Informationen zur Verteilung dieser Zelltypen bei gesunden Kälbern sehr

begrenzt zur Verfügung stehen, wurde diese zunächst bei nicht infizierten Kontrollkälbern

ausführlich dokumentiert (ALLAN et al. 1979; ANDERSON et al. 1986a, b; MATHY et al.

1997; BUCHENAU 2003; THOMASMEYER 2006). Dabei erfolgte eine vergleichende

Untersuchung zwischen den verschiedenen Lungenlappen. An die immunhistologische

Untersuchung schloss sich eine ultrastrukturelle Untersuchung an. Dabei war vorwiegend von

Interesse, bis zu welchem Zeitpunkt nach der Inokulation und in welchen Zellen der Erreger

replizierte.

Im ersten Teil der durchgeführten Studie wurde die Verteilung der Leukozytensubtypen bei

1,5 bis drei Monate alten Kälbern in der Lunge, in der Trachea, im Lymphknoten und in der

Tonsilla pharyngea untersucht. In der durchgeführten Untersuchung an den Lungen der

Kontrollkälber lagen zwischen den verschiedenen Lungenlappen keine Unterschiede in

Menge und Verteilung der untersuchten Leukozytensubpopulationen vor. Makrophagen

bildeten die dominierende Zellpopulation in der Lunge der klinisch gesunden Kälber. Dabei

ließen sich aufgrund von Lage und Morphologie Alveolarmakrophagen und Makrophagen in

den Interalveolarsepten unterscheiden. In den Interalveolarsepten konnte lichtmikroskopisch

nicht zwischen den in der Literatur beschriebenen interstitiellen und intravaskulären

Makrophagen (PIMs) unterschieden werden (STAUB 1994; ACKERMANN 2009). Eine

Identifizierung von intravaskulären Makrophagen war erst durch die sich anschließende

ultrastrukturelle Untersuchung möglich. Entsprechend der Beschreibung durch RYBICKA u.

DALY (1974) stellten sich PIMs als Zellen mit translucentem Zytoplasma dar, die dem

Endothel der Kapillaren auflagen. Die Zellen enthielten teilweise Phagolysosomen. Dies

spricht für, die in der Literatur beschriebene phagozytotische Aktivität der PIMs und ihre

Beteiligung an der Clearance von intravaskulär zirkulierenden Bakterien (CASWELL u.

DISKUSSION 166

WILLIAMS 2007). Zudem ist beschrieben, dass sie proinflammatorische Zytokine entlassen,

sobald sie mit bakteriellem Endotoxin in Kontakt kommen, was dazu führt, dass

Entzündungszellen angelockt werden (SINGH et al. 2004; CASWELL u. WILLIAMS 2007).

PIMs sind nicht in der gesunden Lunge des Menschen vorhanden (STAUB 1994), weshalb

der Vergleich der Situation bei Rind und Mensch nur bedingt möglich ist.

Die in geringer Zahl in den Alveolen vorliegenden Alveolarmakrophagen sollen unter

homeostatischen Bedingungen immunsuppressiv wirksam sein und das Alveolarepithel vor

unbedeutendem Antigen schützen (HOLT 1978; HOLT et al. 1993). In vitro-Untersuchungen

von HOLT (1993) zeigen, dass Alveolarmakrophagen humoral die Antigenpräsentation

dendritischer Zellen unterdrücken. Alveolarmakrophagen prozessieren und präsentieren

Antigen und initiieren so eine Immunantwort. Während einer Entzündungsreaktion sind sie

immunregulatorisch aktiv (CASWELL u. WILLIAMS 2007). Alveolarmakrophagen werden

über den mukoziliären Transport aus der Lunge entfernt und ausgehustet oder abgeschluckt.

Im Vergleich zu Alveolarmakrophagen sind dendritische Zellen potentere

antigenpräsentierende Zellen (REDDY et al. 1997). Generell werden sie als Wächterzellen

beschrieben, die an antigenzugänglichen Orten lokalisiert sind (STEINBRINK et al. 2009). In

der vorliegenden Arbeit wurde eine Subpopulation dendritischer Zellen untersucht, die CD1b

auf ihrer Oberfläche exprimieren (HOWARD et al. 1993). CD1b ist strukturell und

funktionell dem MHC ähnlich und dient der Präsentation lipidhaltiger Antigene (GELIN et al.

2009), wie beispielsweise das LPS der Chlamydien. CD1b+ und MHC II+ DC waren in der

vorliegenden Untersuchung in der Lamina propria mucosae von Trachea, Bronchien und

Bronchiolen aber auch in Interalveolarsepten, perivaskulär und im Interstitium verteilt.

Ähnliche Verteilungsmuster werden bei MHC II+ dendritischen Zellen in der menschlichen

Lunge beschrieben (SERTL et al. 1986).

In der vorliegenden Untersuchung war die Anzahl der DC an Bronchien besonders groß,

während weniger DC in der Lamina propria mucosae der Bronchiolen und in den

Interalveolarsepten zu finden waren. Diese Ergebnisse bestätigen Befunde von

THOMASMEYER (2006), die das Vorkommen dendritischer Zellen bei lungengesunden

Kälbern in Trachea und Lunge untersuchte und hierbei neugeborene bis 4 Monate alte Kälber,

6 bis 7 Monate alte Kälber und adulte Schlachtrinder einbezog. Eine mögliche Erklärung für

167 DISKUSSION

die Verteilung könnte sein, dass die Antigenexposition im Tracheobronchialbaum intensiver

ist als in tieferen Bereichen der Lunge.

In der eigenen Untersuchung ließ sich in der gesunden Kälberlunge die Expression von

MHC II auf Makrophagen, dendritischen Zellen, B-Lymphozyten, T-Lymphozyten,

Epithelzellen und Endothelzellen nachweisen. Dies bestätigt, die in der Literatur beschriebene

Verteilung des MHC II Moleküls auf einer Vielzahl von Körperzellen (TAYLOR et al. 1993;

TIZARD 2004c). In der vorliegenden Studie war neben MHC II positivem ebenfalls MHC II

negatives Bronchialepithel und Gefäßendothel zu beobachten. Von humanen

Alveolarepithelzellen Typ II wird in der Literatur berichtet, dass sie konstitutiv MHC II auf

ihrer Oberfläche tragen (CUNNINGHAM et al. 1997). Offensichtlich beteiligen sich

Epithelzellen des Respirationstrakts an der Antigenpräsentation. Dies wurde auch durch

Untersuchungen an Bronchialepithelzellen des Menschen, die per Bronchoskopie gewonnen

wurden, bestätigt. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass Bronchialepithelzellen MHC II

Moleküle aktiv synthetisieren (ROSSI et al. 1990). In den Interalveolarsepten waren nur

einzelne Zellen von der Markierung für MHC II ausgespart. TAYLOR et al. (1993)

beschreiben eine Verteilung von MHC II auf aktivierten T-Lymphozyten. Möglicherweise

handelte es sich bei den MHC II – Zellen in den Interalveolarsepten um naive T-

Lymphozyten.

Das Epithel von Bronchien und Bronchiolen in der Lunge der Kontrollkälber war

unterschiedlich stark für IgA und IgM markiert. Aus der Literatur ist für beide

Immunglobulinisotypen der an pIgR-gebundene Transport durch das Epithel bekannt

(BRANDTZAEG 1975; LAMM 1997). Dabei bildet IgA eine wirksame Barriere, indem es

das Eindringen von inhalierten Pathogenen verhindert. Die weniger intensive Markierung

oder das Fehlen der Markierung für IgM an Bronchial- bzw. Bronchiolarepithelien erklärt

sich trotz des mit IgA-übereinstimmenden Nachweises im Epithel dadurch, dass das polymere

IgM im Gegensatz zu dimerem IgA weniger stabile Komplexe bildet und somit nicht auf der

Oberfläche der Luftwege anhaften bleibt (BRANDTZAEG 1975). In der vorliegenden

Untersuchung waren bei den Kontrollkälbern mehr IgA+ Plasmazellen in der Lamina propria

mucosae als IgM+ und IgG1+ Plasmazellen vorhanden. Im alveolären Parenchym waren

kaum Plasmazellen nachweisbar. Es lag jedoch eine diffuse intensive Markierung für IgG1

vor. Dies deutet auf die Bedeutung von IgG für das alveoläre Kompartiment hin. Bestätigt

DISKUSSION 168

werden diese Befunde von anderen Untersuchern, die im Vergleich zu IgG2, IgG1 und IgM

vermehrt IgA+ Plasmazellen in der Lamina propria mucosae des Tracheobronchialbaums und

kaum Plasmazellen im alveolären Parenchym fanden (ALLAN et al. 1979; ANDERSON et al.

1986b).

In den Lungen der klinisch gesunden Kälber waren IL-2 Rezeptor+ Zellen nur im BALT und

im Parenchym einer Lungenlokaliation bei einem Kalb vorhanden. Dies deutet darauf hin,

dass die vorhandene Antigenexposition nicht ausreichte, um die Expression des IL-2

Rezeptors zu stimulieren. Ähnlich dem MHC II Molekül wird auch der IL-2 Rezeptor als

Aktivierungsmarker beschrieben (QUADE u. ROTH 1999). Aus der Literatur ist bekannt,

dass dieser auf der Zelloberfläche von T- und B-Lymphozyten und Monozyten exprimiert

wird (WAHL et al. 1987). Eine genaue Zuordnung des Oberflächenrezeptors zu einer

Leukozytenpopulation war in der vorliegenden Untersuchung allein basierend auf der

Morphologie der Zellen im Kryostatschnitt nicht möglich und sollte in weiterführenden

Untersuchungen mit Hilfe einer Doppelmarkierung erfolgen. Hinweis auf unterschiedliche

Expressionmuster abhängig vom T-Zellsubtyp geben durchflusszytometrische

Untersuchungen an mononukleären Blutzellen, die von 12 Wochen alten Kälbern stammten

und mit M. bovis stimuliert wurden (VANDEN BUSH u. ROSENBUSCH 2003). Die

Untersuchung konnte zeigen, dass die Stimulation durch M. bovis, einem bakteriellen

extrazellulären Erreger, einen Anstieg des IL-2 Rezeptors auf CD4+, CD8+ und γδ+ T-

Lymphozyten zur Folge hat, wobei der Anstieg des IL-2 Rezeptors auf CD8+ T-Zellen

proportional kleiner war als auf CD4+ und γδ+ T-Lymphozyten.

In der eigenen Untersuchung an den Lungen der Kontrollkälber wurde die Verteilung und

Menge von CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten in den Alveolen und Bronchiolen

bestimmt. Dabei dominierten CD4+ T-Zellen gegenüber CD8+ T-Zellen in einem

durchschnittlichen Verhältnis von 1,2:1. Das Verhältnis aus beiden T-Zellpopulationen war

demnach im Vergleich mit dem Verhältnis, das im Blut von drei Monate alten Kälbern

vorliegt und bei 1,43:1 liegt, geringgradig zugunsten der CD8+ T-Lymphozyten verschoben

(WILSON et al. 1996). Im Gegensatz zu den eigenen Untersuchungen ergaben

Untersuchungen der BALF von 12 bis 18 Monate alten Kälbern und durchflusszytometrisch

untersuchtem Lungenparenchym derselben Altersgruppe überwiegend CD8+ T-Zellen

(MATHY et al. 1997). Eine Erklärung hierfür könnte sein, dass bei der Gewinnung von

169 DISKUSSION

BALF vor allem Zellen aus dem Alveolarlumen und Bronchiallumen berücksichtigt werden,

nicht aber aus den Interalveolarsepten. Dadurch werden vermehrt intraepitheliale CD8+ T-

Zellen gewonnen. Die in der vorgelegten Untersuchung durchgeführte immunhistologische

Charakterisierung lässt eine detaillierte Lagebestimmung zu und erlaubt eine differenziertere

Betrachtung als die Untersuchung von BALF und homogenisiertem Lungengewebe in der

Durchflusszytometrie.

Im Vergleich zu CD4+ oder CD8+ T-Lymphozyten konnten in den Alveolen und Bronchiolen

etwa halb so viele γδ+ T-Lymphozyten nachgewiesen werden. Von diesen Ergebnissen

weichen Befunde im Blut von Kälbern des gleichen Alters ab, in dem sich vermehrt γδ+ T-

Lymphozyten (30%) und seltener CD4+ (10%) und CD8+ T-Lymphozyten (7%) nachweisen

lassen (WILSON et al. 1996). Der relative Anteil der γδ+ T-Lymphozyten ist speziesabhängig

und altersabhängig. Mit zunehmendem Alter der Tiere ändert sich das Verhältnis zugunsten

der CD4+ T-Zellen (PARK et al. 1992). γδ+ T-Lymphozyten ließen sich unter anderem im

Epithel von Bronchien und Bronchiolen finden, von wo aus sie eine erste Abwehrlinie

gegenüber inhaliertem Antigen bilden. Aus diesem Grund werden sie funktionell der

natürlichen Immunabwehr zugeordnet, bei der keine auf MHC Moleküle beschränkte

Präsentation von Antigenen notwendig ist, um ihre Stimulation zu erreichen. In der eigenen

Untersuchung wurden selektiv γδ+ T-Lymphozyten mit WC1 Molekül markiert. Von diesen

ist aus der Literatur bekannt, dass sie im Gegensatz zu WC1- γδ+ T-Lymphozyten kein CD8

koexprimieren. Daher wurde durch die Anwendung des Antikörpers eine selektive

Markierung von γδ+ T-Lymphozyten erreicht. Die WC1+ Subpopulation umfasst γδ+ T-

Lymphozyten, die nach antigener Stimulation IFN-γ sezernierten (BLUMERMAN et al.

2006). Als Besonderheit und im Unterschied zum humanen Organismus, bei denen

CD4+/CD25+ T-Lymphozyten mit der Expression von Foxp3 regulatorisch wirksame Zellen

darstellen, sollen beim Rind γδ+ T-Lymphozyten diese Funktion übernehmen und die

Homeostase des Immunsystems erhalten (HOEK et al. 2009).

In der vorliegenden Arbeit wurde das lymphatische Gewebe (BALT) in der Lunge besonders

berücksichtigt. Aus der Literatur ist bekannt, dass BALT eine dynamische Struktur darstellt,

das sich in Abhängigkeit von der Antigenexposition entwickelt (ANDERSON et al. 1986a).

Bei den untersuchten Kontrollkälbern gab es große interindividuelle Unterschiede in Zahl und

Morphologie des BALT. Im Vergleich zu BALT wurden signifikant häufiger unorganisierte

DISKUSSION 170

Lymphaggregate aus CD4+ T-Lymphozyten gefunden. Dass nur wenig organisiertes BALT

vorhanden war, entspricht Ergebnissen anderer Untersucher und ist auf das Alter und die gute

Lungengesundheit der Kälber zurückzuführen (ANDERSON et al. 1986a). Eine bevorzugte

Verteilung von BALT in kranialen Lungenlappen, wie von ANDERSON (1986a)

beschrieben, konnte nicht bestätigt werden und erklärt sich durch die geringe Anzahl an

BALT, das in den Lungen zu finden war. Die Befunde zur Zellzusammensetzung des BALT

decken sich mit den Ergebnissen von TSCHERNIG u. PABST (2000), die am BALT des

Menschen erhoben wurden. Ähnlich zu den Follikeln in Tonsille und Lymphknoten

exprimierten auch im vorliegenden BALT B-Lymphozyten IgA, IgM und IgG1.

In der vorliegenden Untersuchung wurden die Leukozytensubpopulationen in der Tonsilla

pharyngea immunhistologisch charakterisiert. Beim gesunden Kalb entsprechen die Befunde,

denen von MANESSE und Mitarbeitern (1998), die an Kryostatschnitten der Tonsilla

pharyngea von Kälbern unterschiedlichen Alters (21 Tage, 60 Tage und 300 Tage alte Rinder)

die Verteilung von T-Lymphozyten, IgM, IgG und MHC II beschreiben.

Im zweiten Teil der durchgeführten Studie wurde die Entzündungsreaktion und

Immunantwort auf die intrabronchiale Applikation von C. psittaci bei 1,5 bis drei Monate

alten Kälbern charakterisiert. Dazu wurden Abwehrzellen des natürlichen und erworbenen

Immunsystems im entzündeten Lungengewebe und ergänzend im Nl. mediastinalis und in der

Tonsilla pharyngea untersucht. Dabei lassen die Abwehrzellen, die in das mit Chlamydien

infizierte Lungengewebe strömen, Rückschlüsse auf die Funktion des Immunsystems zu.

Durch ultrastrukturelle Untersuchungen wurde die Reaktion des Erregers auf die

Immunantwort erfasst. Hinlängliche in vivo- und in vitro-Studien zu C. trachomatis existieren

bereits und begründen die Fragestellung danach, ob die für C. trachomatis gewonnenen

Erkenntnisse auch auf andere Chlamydienstämme im Besonderen auf C. psittaci übertragbar

sind. Zwischen den beiden Chlamydienspezies bestehen sowohl Übereinstimmungen als auch

Differenzen hinsichtlich ihres Wirtsspektrums, ihrer Inklusionsmorphologie und ihrer

Ultrastruktur (KINGSBURY u. WEISS 1968; MOULDER 1991).

Die Verabreichung von C. psittaci in einer hohen Dosis in die Bronchien von Kälbern

induzierte eine hochgradig eitrig-fibrinöse Bronchopneumonie mit Nekroseherden. Dabei

waren die pathomorphologischen Veränderungen auf die Infektion und Replikation von

171 DISKUSSION

C. psittaci im Lungengewebe zurückzuführen, da die Inokulation von sterilem SPGA-

Medium und BGM-Zellen oder inaktivierten Chlamydien des gleichen Volumens bei der

Kontrollgruppe keine Lungenveränderungen hervorrief (LAMBERTZ 2011). Generell

beeinflusst die Anatomie der bovinen Lunge die Pathogenese bakterieller Infektionen. So

wird die Bronchopneumonie durch fehlende kollaterale Alveolarverbindungen und ein

ausgeprägtes interlobuläres Bindegewebe auf die Läppchen begrenzt (ROBINSON 1982;

CASWELL u. WILLIAMS 2007). Die Schädigung war besonders an den Tagen 3 und 4

hochgradig ausgeprägt und lässt sich nur zum Teil durch die direkte Wirkung der Chlamydien

erklären, die sich in den Wirtszellen vermehren. Vor allem bedingen infiltrierende

Abwehrzellen den Zelluntergang.

Immunhistologisch waren Chlamydien bereits 2 Tage nach der Inokulation in

Alveolarepithelzellen Typ I zu sehen. Dies ließ sich auch in der

transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchung bestätigen, mit Hilfe derer zu diesem

Zeitpunkt intrazelluläre Einschlüsse zu beobachten waren, die alle Entwicklungsstadien

aufwiesen. Damit konnte in der vorliegenden Studie gezeigt werden, dass C. psittaci in vivo in

AEC I repliziert. Auch aus der Literatur ist bekannt, dass Chlamydien primär Nicht-

Immunzellen infizieren (RASMUSSEN et al. 1997; STEPHENS 2003). Dabei unterscheiden

sich Chlamydien in vielerlei Hinsicht gegenüber regulären gram-negativen Bakterien. So ist

das üblicherweise als Virulenzfaktor gram-negativer Bakterien beschriebene LPS bei den

Chlamydien durch das speziell aufgebaute Lipid A nur gering endotoxisch aktiv (KOSMA

1999). Zudem fehlt den Chlamydien das Proteoglykan, das in der Literatur als ein weiterer

typischer Auslöser von Entzündungen beschrieben wird (BARBOUR et al. 1982;

HEUMANN u. ROGER 2002). Aus der Literatur sind verschiedene Evasionsmechanismen

bekannt, die die Chlamydien nutzen, um ihr Überleben zu sichern. Beispielsweise konnte von

ZHONG und Mitarbeitern (1999, 2000) bei in vitro-Experimenten gezeigt werden, dass

C. trachomatis über chlamydiale Proteasen die infizierte Epithelzelle moduliert. Dies

verhindert die Antigenpräsentation über MHC und sichert das Überleben der Chlamydien in

Epithelzellen. Ob dies als Strategie von C. psittaci in der vorliegenden Untersuchung vorliegt,

ist durch die angewendete Methodik nicht nachvollziehbar.

DISKUSSION 172

Neben der direkten Schädigung der Lungenarchitektur durch die Infektion mit C. psittaci

nehmen Chlamydien auch indirekt Einfluss auf den Untergang des Alveolar- und

Bronchiolarepithels. So fanden RASMUSSEN und Mitarbeiter (1991) durch in vitro-Studien

an Kolon- und Cervixepithelzellen heraus, dass der Infektion mit C. trachomatis im

Unterschied zu anderen invasiven gram-negativen Bakterien eine langanhaltende Sekretion

von proinflammatorischen Zytokinen folgt. Beschrieben ist die Sekretion von IL-8, GROα,

GM-CSF und IL-6 (AGACE et al. 1993; MCCORMICK et al. 1993; RASMUSSEN et al.

1997; STEPHENS 2003). Diese Ergebnisse bestätigten sich auch bei in vivo-Infektionen

muriner Alveolarepithelzellen mit C. pneumoniae (RASMUSSEN et al. 1997; WISSEL et al.

2005). Von einem der sezernierten Zytokine, vom IL-8, ist aus der Literatur bekannt, dass es

deutlich die Immunantwort moduliert, indem es den Einstrom von neutrophilen Granulozyten

(PMN) aus der Blutzirkulation in das infizierte Gewebe hervorruft (BARTENEVA et al.

1996; MOAZED et al. 1996). Diese Erkenntnisse geben Grund zu der Annahme, dass das in

der vorliegenden Untersuchung beobachtete Exsudat in Alveolen, Bronchiolen und Bronchien

am Tag 2 pi eine Folge der Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen, wie IL-8, durch

die infizierten AEC I war. Die ins Gewebe eingewanderten neutrophilen Granulozyten sind

mikrobizid wirksam und ein wichtiger Teil einer erfolgreichen Wirtsantwort (SOETHOUT et

al. 2002).

In der vorliegenden Arbeit waren Chlamydienstadien immunhistologisch und transmissions-

bzw. immunelektronenmikroskopisch an den Tagen 2 und 3 pi in neutrophilen Granulozyten

nachweisbar. Es waren jedoch keine Einschlüsse mit allen Stadien des Vermehrungszyklus zu

beobachten, sondern vorwiegend Elementarkörperchen und Intermediärkörperchen. Diese

lagen einzeln frei im Zytoplasma oder in kleinen Gruppen in Vakuolen, die als

Phagolysosomen interpretiert wurden. Dies spricht dafür, dass in den neutrophilen

Granulozyten keine Vermehrung stattfindet. Die vorliegenden Ergebnisse werden durch in

vitro-Untersuchungen mit humanpathogenen C. trachomatis-Biovaren unterstützt, bei denen

transmissionselektronenmikroskopisch die Degradation der Chlamydien in peroxidasehaltigen

Phagolysosomen in humanen neutrophilen Granulozyten innerhalb kürzester Zeit erfolgte

(YONG et al. 1982; YONG et al. 1986).

173 DISKUSSION

Neben der Wirksamkeit gegenüber C. psittaci führt eine Freisetzung proteolytischer Enzyme

in der Lunge aber auch dazu, dass das Alveolarepithel geschädigt wird (BORREGAARD

2010). Der Epitheluntergang konnte in der vorliegenden Untersuchung ab Tag 2 pi durch die

fehlende Markierung der Interalveolarsepten mit Zytokeratin gezeigt werden. Zudem war die

Anzahl der potentiell antigenpräsentierenden Makrophagen und T-Lymphozyten, die im

gesunden Gewebe in den Interalveolarsepten vorhanden sind, herabgesetzt. Hierbei könnte es

sich jedoch auch um eine relative Abnahme durch die hochgradige Verbreiterung der

Interalveolarsepten und Erweiterung der Alveolarräume durch neutrophile Granulozyten und

Fibrin handeln. Von der Schädigung betroffen waren ebenfalls kleine Gefäße.

Gefäßwandschäden wurden durch perivaskuläres Exsudat, das sich intensiv für IgG1

markierte, deutlich.

In der vorliegenden Untersuchung setzte sich im Verlauf der Infektion ab Tag 3 und 4 pi das

alveoläre, bronchioläre und bronchiale Exsudat vermehrt aus Alveolarmakrophagen

zusammen. Aus der Literatur ist bekannt, dass Alveolarmakrophagen direkt durch die

Phagozytose und indirekt über ein breites Zytokinspektrum am Entzündungsgeschehen und an

Reparationsprozessen in der Lunge beteiligt sind (CASWELL u. WILLIAMS 2007). Daher

ist davon auszugehen, dass Alveolarmakrophagen als potente Phagozyten auch in der

vorliegenden Untersuchung an der zahlenmäßigen Abnahme der PMNs ab Tag 3 und 4 pi

beteiligt waren. Die phagozytotische Aktivität der Alveolarmakrophagen kann dabei günstig

für den Wirt oder für den Erreger sein. Falls Alveolarmakrophagen infizierte Zellen

phagozytieren und antigenes Peptid über MHC präsentieren, ist dies nützlich für den Wirt, da

dadurch Effektor T-Lymphozyten aktiviert werden. In der vorliegenden Untersuchung spricht

die immunhistologisch nachweisbare Expression von MHC II auf den Alveolarmakrophagen

ab Tag 3 pi für diese Wirkung. In der Literatur ist auch eine stille Infektion beschrieben

(RUPP et al. 2009). Dabei dienen neutrophile Granulozyten als Vektoren, um die länger

lebenden Makrophagen zu infizieren. Dies stellt eine Möglichkeit für die Chlamydien dar in

andere Organe disseminiert zu werden. C. psittaci konnte in der vorliegenden Verlaufsstudie

ähnlich wie in neutrophilen Granuloyzten auch in Alveolarmakrophagen ultrastrukturell

dargestellt werden. Auch in Alveolarmakrophagen ließen sich keine Einschlüsse mit allen

Vermehrungsstadien, sondern überwiegend stark abgebaute Erreger finden.

DISKUSSION 174

Dendritische Zellen gelten allgemein als Schlüsselinduktoren für die erworbene

Immunantwort. Sie können vielseitig über MHC I, II und CD1 chlamydiales Antigen

präsentieren (REY-LADINO et al. 2005; AGRAWAL et al. 2008; FIEGL 2011). Durch

MHC I und II werden antigene Peptide präsentiert. Über das untersuchte CD1b Molekül

könnte im Besonderen chlamydiales Lipid-A präsentiert werden. Eine besondere Eigenschaft

der DC ist ihre Fähigkeit zur Kreuzpräsentation (GUERMONPREZ et al. 2002). Für die

Infektion mit Chlamydien bedeutet dies, dass auch exogen vorliegende Erreger über MHC I

für CD8+ T-Zellen präsentiert werden können. In der Zellkultur können Chlamydien DC

infizieren (FIEGL 2011). Die Replikation verläuft jedoch anders ab als in Epithelzellen. Die

Erreger werden aus dem Einschluss nicht extrazellulär freigesetzt, sondern gelangen in

mikrovesikuläre Kompartimente der Zelle und damit in den Kreuzpräsentationsweg (FIEGL

2011). Durch die Kokultivierung mit Chlamydien-infizierten DCs wurden CD4+ und CD8+

T-Zellen stimuliert (SU et al. 1998; FIEGL 2011). Die Stimulation der CD8+ T-Zellen führte

hierbei zur Sekretion von INF-γ (FIEGL 2011).

Ab Tag 2 waren MHC II+ Zellen, aber kaum CD1b+ DC im entzündeten Lungengewebe

nachweisbar. Dabei liegt die Vermutung nahe, dass CD1b+ DC in regionäre Lymphknoten

abgewandert sind, um T-Lymphozyten zu stimulieren. Der Lymphknoten ist als sekundäres

lymphatisches Organ Schaltstelle der Immunantwort und wies bereits 2 Tage pi reaktive

Veränderungen auf. Dabei waren vermehrt Makrophagen und bei einigen Tieren ebenfalls

vermehrt DC in den Sinusoiden des regionären Lymphknoten zu sehen. Ab Tag 2 pi waren

die Keimzentren vergrößert. Ein anderer Erklärungsansatz für die geringe Zahl an CD1b+ DC

an den Tagen 2, 3 und 4 pi im entzündeten Lungengewebe bietet die Reifung der CD1b+ DC.

Diese geht einher mit dem Verlust an CD1b+ Molekülen auf der Oberfläche und mit der

vermehrten Expression von MHC II (GELIN et al. 2009; AQUINO et al. 2011). Am Tag 7 pi

waren fokale Anhäufungen von CD1b+ DC im Bereich der Nekrosen in den Lungen zu finden

und damit genau in den Bereichen, in denen zu diesem Zeitpunkt immunhistologisch ein

besonders deutliches Signal für Chlamydien vorlag. Dies spricht für eine anhaltende

Antigenpräsentation und für die Stimulation einer Immunantwort.

Im akuten Stadium der Bronchopneumonie waren im Unterschied zu den Kontrollen im

veränderten Lungengewebe vermehrt IL-2 Rezeptor+ Zellen vorhanden. Die Expression des

175 DISKUSSION

Rezeptors ist demzufolge mit großer Wahrscheinlichkeit mit der Auseinandersetzung mit

C. psittaci assoziiert. Dabei ist die Expression des Rezeptors kein Indiz für eine spezielle

Effektorfunktion der markierten Zellen (SANDBULTE u. ROTH 2004). Bei den im

Lungengewebe immunhistologisch markierten IL-2R+ Zellen handelte es sich aufgrund von

übereinstimmender Lage und Morphologie mit hoher Wahrscheinlichkeit um

T-Lymphozyten, die CD4+, CD8+ oder γδ+ waren. In der Literatur ist die Expression des

IL-2 Rezeptors auf T- und B-Lymphozyten und auf Monozyten beschrieben (WAHL et al.

1987). Um den T-Zellsubtyp zu identifizieren, der IL-2 Rezeptor+ ist, müsste in

weiterführenden Studien eine Doppelmarkierung erfolgen. Aufgrund übereinstimmender Lage

und Morphologie konnte zudem die Expression von MHC II auf T-Lymphozyten beobachtet

werden, was damit den Ergebnissen von HAMMERLING (1976) entspricht.

Generell ist für die Elimination eines intrazellulär replizierenden Erregers, wie von

C. psittaci, eine zelluläre Immunantwort durch chlamydienspezifische CD4+ und CD8+

Effektor-T-Zellen notwendig. Diese werden im regionären Lymphknoten durch

antigenpräsentierende Zellen, im Besonderen durch DC stimuliert und wandern danach in die

Lunge ein (REDDY et al. 1997; GUERMONPREZ et al. 2002). In der vorliegenden

Untersuchung war die Zellzahl der T-Lymphozyten bis zum Tag 7 nach der Inokulation mit

C. psittaci in den veränderten Lungenbereichen deutlich verringert. Grund hierfür ist die

exsudatbedingte Expansion der Interalveolarsepten, durch die es zu einer relativen Abnahme

der T-Lymphozyten kommt. Dieser Effekt könnte durch den Untergang von T-Lymphozyen

verstärkt werden. In vitro-Untersuchungen konnten zeigen, dass mit C. trachomatis infizierte

Makrophagen die Apoptose von kokultivierten T-Lymphozyten auslösen (JENDRO et al.

2000). Dies lässt sich als weitere Strategie der Chlamydien interpretieren das eigene

Überleben zu sichern, indem sie in die Steuerung des energieabhängigen Zelluntergangs

eingreifen. So ist eine Hemmung der Apoptose von Wirtszellen dann sinnvoll, wenn es sich

um Zielzellen handelt, in denen der Erreger repliziert, ihre Induktion ist dagegen bei Zellen

sinnvoll, die nicht infiziert sind und zur Wirtsabwehr gehören (FAN et al. 1998; OJCIUS et

al. 1998; JENDRO et al. 2000; SCHOIER et al. 2001).

Ab Tag 7 pi konnte in der vorliegenden Untersuchung die Regeneration des Alveolarepithels

in Form von hyperplastischen Alveolarepithelzellen Typ II (AEC II) beobachtet werden. Sie

DISKUSSION 176

produzieren Matrixbestandteile und ermöglichen so die Reepithelialisierung der

Basalmembran. Der Prozess folgt einem allgemeinen Schema mit schneller Mobilisation,

Proliferation und Redifferenzierung der AEC II zu AEC I. Im Verlauf der Regeneration ließ

sich eine Bronchiolitis obliterans beobachten, die gehäuft bei chronischen

Bronchopneumonien des Kalbes beschrieben werden und die als Zeichen für eine fehlerhafte

Wundheilung gilt (CASWELL u. WILLIAMS 2007). Als Ursache für die Schädigung des

Bronchiolarepithels wird unter anderem das Einwirken neutrophiler Granulozyten genannt,

wie dies auch in der vorliegenden Untersuchung zu beobachten war.

Ab Tag 10 pi setzte die zelluläre Immunantwort aus T-Lymphozyten ein, wobei primär CD4+

T-Zellen zu beobachten waren. Von ihnen ist aus der Literatur bekannt, dass sie die

erworbene Immunantwort koordinieren und Einfluss auf CD8+ T-Zellen, auf Makrophagen

oder auf Antikörper produzierende Immunzellen nehmen. Von anderen Untersuchern ist

bekannt, dass die Proteine der äußeren Membran der Chlamydien über MHC II CD4+ T-

Zellen stimulieren (BEATTY u. STEPHENS 1992). Im weiteren Verlauf am Tag 14 pi war

eine zunehmende Regeneration des Lungengewebes zu beobachten, die dazu führte, dass

multifokal lediglich kleine Nekroseherde nachweisbar waren. Lymphozyten, Plasmazellen,

DC und Makrophagen waren in der Regenerationszone am Rand zu finden. Ihre Zahl war

jedoch besonders groß innerhalb der zunehmend kleiner werdenden Nekroseherde. In den

Nekrosen waren neben Makrophagen und dendritischen Zellen, CD4+ und γδ+ T-Zellen vor

allem CD8+ T-Lymphozyten nachweisbar. Von CD8+ T-Zellen ist aus der Literatur bekannt,

dass sie gegenüber intrazellulären Bakterien zytotoxisch wirksam sind. Die Erkennung von

Chlamydien ist dabei möglich, weil chlamydiale Proteine auf der Einschlussmembran

exprimiert werden oder mit Hilfe des Typ-III-Sekretionssystems an MHC I gekoppelt und

CD8+ T-Zellen präsentiert werden (WIZEL et al. 2008). Zumindest für das Cap-1 Protein von

C. trachomatis wurde diese stimulierende Wirkung bewiesen (FLING et al. 2001).

CD8+ T-Zellen sind neben ihrer zytotoxischen Aktivität durch die Sekretion von IFN-γ

gekennzeichnet. IFN-γ entzieht dabei den Chlamydien essentielles Tryptophan und führt zur

Bildung aberranter Retikularkörperchen, die in metabolisch inaktiver Form im Gewebe

persistieren können (ROTTENBERG et al. 2002). Durch in vitro-Untersuchungen von

177 DISKUSSION

BEATTY und Mitarbeitern (1997) konnte die Effektivität von spezifischen CD8+ T-

Lymphozyten für die Elimination von Chlamydien bestätigt werden. Sie zeigt jedoch

Unterschiede zwischen den Spezies C. trachomatis und C. psittaci. Zellen, die mit C. psittaci

infiziert waren, reagierten sensibler auf die Zerstörung durch CTLs als Zellen, die mit C.

trachomatis infiziert waren (BEATTY et al. 1997). Widersprüchliche Ergebnisse zur

Wirksamkeit von CTLs ergaben sich bei der experimentellen Infektion von Mäusen mit

C. trachomatis und deuten auf weitere speziesbedingte Unterschiede hin (SU u. CALDWELL

1995). Aus der Literatur ist bekannt, dass neben CD8+ T-Zellen auch γδ+ T-Zellen

zytotoxisch wirksam werden können und infizierte Zellen zerstören. Funktionelle Studien

belegen ihre zytotoxische Aktivität durch Granulysin und Perforin und ihre Fähigkeit IFN-γ

zu sezernieren (BLUMERMAN et al. 2007). Die in den Veränderungen nachgewiesenen γδ+

T-Zellen könnten damit ähnlich wie CD8+ T-Lymphozyten einerseits dazu dienen C. psittaci

zu eliminieren. Andererseits könnten sie auch CD8+ T-Zellen regulatorisch beeinflussen. Für

die γδ+ T-Zellen der Wiederkäuer ist beschrieben, dass sie anstelle der CD4+/CD25+/Foxp3+

Zellen regulatorisch wirksam sind, um eine überschießende Immunreaktion zu verhindern

(HOEK et al. 2009). Dysbalancen zwischen zytotoxischen und IFN-γ bei den CD8+ T-Zellen

und γδ+ T-Zellen könnten dazugeführt haben, dass Chlamydien in das Persistenzstadium

übergehen und in einzelnen Herden in der Lunge überleben. Es bleibt ungelöst, ob diese

Herde im weiteren Verlauf abheilen oder Ausgangspunkt für die Erregerstreuung in andere

Organe sind.

Zusätzlich zu einer T-Zellantwort war im Verlauf der Infektion mit C. psittaci im veränderten

Lungengewebe und im Lymphknoten eine humorale Immunantwort zu beobachten, bei der

primär IgM und im weiteren Verlauf gleichfalls IgG1+ detektiert wurde. Entlang des

neugebildeten Alveolarepithels dominierten IgA+ Plasmazellen, die dabei offensichtlich

effizient verhindern, dass das neugebildete Epithel mit C. psittaci infiziert wird. Dabei ist

bislang unklar, in wie weit und über welchen Mechanismus lokales Immunglobulin wirksam

gegenüber Chlamydien ist (YANG u. BRUNHAM 1998).

Zusätzlich zum BALT an Luftwegen und Gefäßen trat im Infektionsverlauf mit C. psittaci

ektopisches BALT in den interlobulären Interstitien der Lunge auf. Dieses war vergleichbar

DISKUSSION 178

mit dem, was im Mausmodell im Verlauf einer Influenzavirusinfektion gesehen wurde und als

Induktionsbereich für eine spezifische T- und B-Zellantwort diskutiert wird (MOYRON-

QUIROZ et al. 2004). Neben ektopischem BALT war zudem hyperplastisches BALT

vorhanden, das im Vergleich zu den Kontrollkälbern signifikant an Menge am zuletzt

untersuchten Zeitpunkt, am Tag 35/37 pi, zunahm. Dies könnte ein Hinweis auf die Bildung

des bei chronisch mit Chlamydien infizierten Kälbern beobachteten hyperplastischen BALT

sein (JÄGER et al. 2007). Ähnliche Befunde ergaben auch Untersuchungen der Lungen von

Kälbern mit Enzootischer Pneumonie (ANDERSON et al. 1986a). Dies bestätigt die Theorie,

das BALT beim Rind antigeninduziert ist. Wie langlebig ektopisches oder hyperplastisches

BALT ist und ob es als Reservoir für spezifische Immunzellen dient, können nur

weiterführende Untersuchungen zeigen.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Immunantwort im Verlauf einer experimentellen

Infektion von Kälbern mit C. psittaci charakterisiert. Dies gibt einen Einblick in die

Immunpathogenese von C. psittaci in einem natürlichen Wirt. Trotz ihrer einzigartigen

intrazellulären Reproduktion, induzierte C. psittaci eine kaskadenartige Immunantwort, die

sowohl das natürliche als auch das erworbene Immunsystem ansprach und bei den meisten

Tieren innerhalb des untersuchten Zeitraums von etwa 5 Wochen C. psittaci erfolgreich

eliminierte. Dies ermöglichte eine vollständige Regeneration der Lungenveränderungen.

Nur bei einem Tier war am Ende des Beobachtungszeitraums am Tag 35 pi in der Lunge eine

herdförmige granulomatöse Entzündung mit Chlamydien in Makrophagen zu finden und

mehrkernige Riesenzellen vorhanden. Diese wiesen lichtmikroskopisch eine von der

Erregermorphologie, die an den Tagen 2 bis 14 pi gefunden wurde, abweichende Struktur auf,

sodass angenommen werden kann, dass es sich um aberrante Stadien handelte. Es sollte

abgeklärt werden, ob dies mit dem von OSTERMANN et al. (2011) berichteten protrahierten

Krankheitsverlauf in Zusammenhang steht.

Ausgehend von den vorliegenden Untersuchungsbefunden, könnten weiterführende

Untersuchungen noch genauer auf einzelne Schritte der Immunantwort fokussieren. So

könnten Untersuchungen zur Antigenspezifität der jeweiligen Abwehrzellen erfolgen. Ein

weiterer Ansatzpunkt wäre die Untersuchung von Zytokinen und Chemokinen, die bedeutend

179 DISKUSSION

Einfluss auf die Schädigung des Lungengewebes nehmen und die Clearance bzw. die

Persistenz des Erregers bedingen. Dabei könnte die Untersuchung nicht nur im Blut (VOGEL

2010) und in der BALF, sondern auch im Gewebe helfen einen unmittelbaren Zusammenhang

zu den Schäden im Lungengewebe herzustellen.

ZUSAMMENFASSUNG 180

6 ZUSAMMENFASSUNG

Katja Möhle: Wirts-Erreger-Interaktionen im Respira tionstrakt von Kälbern nach

experimenteller aerogener Infektion mit Chlamydia psittaci

Die experimentelle intrapulmonale Inokulation von Kälbern mit C. psittaci verursacht eine

akute eitrig-fibrinöse Bronchopneumonie mit Nekroseherden, die innerhalb von 5 Wochen

weitgehend abheilt. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, die zellulären Reaktionen im

Verlauf der akuten Entzündung und der Abheilung zu charakterisieren. Von Kälbern, die

intrabronchial 108 EBE C. psittaci (Stamm DC 15) erhalten hatten, wurden Lungenproben,

Nl. mediastinalis und Tonsilla pharyngea an konsekutiven Zeitpunkten 2, 3, 4, 7, 10, 14 und

35/37 Tage nach der Inokulation (dpi) entnommen. In den Organen wurde die Anzahl und

Verteilung von Immunzellen ermittelt. Untersucht wurden neutrophile Granulozyten,

Makrophagen, dendritische Zellen (DC), CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten, IgA+,

IgM+, IgG1+ Plasmazellen/B-Lymphozyten, sowie Chlamydien. Weitere sechs Kälber, die

nicht infiziertes Medium erhalten hatten, dienten als Kontrollen (Sektionszeitpunkt 2, 3, 4, 7,

14 und 35/37 dpi). Neben der immunhistologischen Untersuchung wurde zu ausgewählten

Zeitpunkten eine transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung der Lungenproben

durchgeführt, um Hinweise auf Wirtszellen, Zielzellen und die Replikation von C. psittaci zu

erhalten.

Bei den mit C. psittaci inokulierten Kälbern war die Βronchopneumonie an den Tagen 2 und

3 durch ein Exsudat aus neutrophilen Granulozyten gekennzeichnet. An den Tagen 3 und 4 pi

waren vermehrt Alveolarmakrophagen zu finden. Chlamydien ließen sich initial in

Alveolarepithelzellen und zunehmend in neutrophilen Granulozyten und

Alveolarmakrophagen, besonders in Nekrosebereichen nachweisen. Ultrastrukturell waren

chlamydiale Einschlüsse mit Elementarkörperchen, Retikularkörperchen und

Intermediärkörperchen in Alveolarepithelzellen Typ I und Intermediär- und

Elementarkörperchen frei im Zytoplasma oder in Phagolysosomen von neutrophilen

Granulozyten und Alveolarmakrophagen darstellbar. Am Tag 7 pi war eine enge Assoziation

von Chlamydien und CD1b+ DC in Nekroseherden zu beobachten. Die Nekrosen wurden

teilweise durch hyperplastische Alveolarepithelzellen Typ II und Makrophagen begrenzt. Am

181 ZUSAMMENFASSUNG

Tag 10 pi war die Regenerationszone konfluent und von CD1b+ DC, Makrophagen, CD4+,

CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten, IgA+ und IgM+ Plasmazellen/B-Lymphozyten infiltriert. Im

Vergleich zu Tag 7 pi wurden am Tag 10 pi signifikant erhöhte Zellzahlen von CD4+, CD8+

und γδ+ T-Lymphozyten ermittelt. Am Tag 14 pi waren die Nekrosen von Makrophagen, DC,

CD4+, CD8+ und γδ+ T-Lymphozyten infiltriert und die Anzahl der Chlamydien war deutlich

geringer. Ektopische Lymphfollikel aus IgM+ B-Lymphozyten, die parafollikulär von CD4+

T-Lymphozyten und CD1b+ DC umgeben waren, traten entlang der interlobulären Interstitien

auf. Am Tag 35/37 pi waren die Chlamydien weitgehend aus der Lunge eliminiert und das

Lungengewebe hatte sich regeneriert. Die Anzahl und Verteilung der nicht organisierten

Immunzellen entsprach der bei den Kontrollkälbern, aber das BALT war ausgeprägter und die

Anzahl der Anschnitte von BALT/cm² Lungengewebe war signifikant erhöht. Lediglich in

einer Lungenlokalisation eines Kalbes waren wenige Chlamydien mit atypischer Morphologie

(besonders groß und immunhistologisch schwach markiert) in Makrophagen nachweisbar.

In der vorliegenden Untersuchung führte die initiale Infektion von Alveolarepithelzellen mit

C. psittaci über die Freisetzung chemotaktischer proinflammatorischer Zytokine zu einem

Einstrom zahlreicher neutrophiler Granulozyten. Die Freisetzung der Granula und der Zerfall

der neutrophilen Granulozyten verursachte ausgedehnte Schäden des Lungengewebes mit

Nekrosen. Zahlreiche Chlamydien waren zwischen untergehenden neutrophilen Granulozyten

und Alveolarmakrophagen zu finden. Die zelluläre Wirtsantwort war initial durch

antigenpräsentierende Zellen und im weiteren Infektionsverlauf zunehmend von T- und B-

Lymphozyten bzw. Plasmazellen dominiert. Diese zelluläre Abwehreaktion bedingt eine

weitgehende Elimination von C. psittaci und ermöglicht die Regeneration des

Lungengewebes. Die wenigen am Tag 35 pi vorhandenen atypischen Chlamydien geben

möglicherweise Hinweise auf die Bildung von aberranten Retikularkörperchen und die

Entstehung von Persistenz.

SUMMARY 182

7 SUMMARY

Katja Möhle: Host-pathogen interactions in the respiratory tract of calves after

intrapulmonary infection with Chlamydia psittaci

Experimental intrapulmonary inoculation of calves with C. psittaci causes acute

fibrinopurulent bronchopneumonia with multifocal necrosis that regresses completely within

5 weeks. The objective of the present study was to characterize local cellular reactions in the

course of acute inflammation and regeneration. Samples of lung, mediastinal lymph node and

pharyngeal tonsil were collected at consecutive days (2, 3, 4, 7, 10, 14 and 35/37 days post

inoculation (dpi) from calves that had intrabronchially received 108 inclusion forming units of

C. psittaci (strain DC15). Number and distribution of neutrophils, macrophages, CD1b+

dendritic cells (DCs), CD4+, CD8+, γδ+ T-lymphocytes as well as IgM+, IgA+ and IgG1+ B-

lymphocytes/plasma cells and chlamydia were determined in these tissues by

immunohistochemistry. Six calves that had received non infected medium served as controls

(necropsy at 2, 3, 4, 7, 14 and 35 dpi). Transmission electron microscopy and immune

electron microscopy were performed on selected pulmonary samples collected at 2, 3, 4, 7

and 10 dpi to investigate the cellular tropism and replication of C. psittaci.

At days 2 and 3 pi, the pneumonic exsudate in the calves inoculated with C. psittaci consisted

predominantly of neutrophils. Increasing numbers of alveolar macrophages were seen at 3 and

4 dpi. Chlamydiae were seen initially in alveolar epithelial cells and increasingly in

neutrophils and alveolar macrophages especially in areas of necrosis. Ultrastructural

investigation revealed chlamydial inclusions with reticular bodies, intermediate bodies and

elementary bodies in alveolar epithelial cells type 1, while intermediate and elementary bodies

were seen free in the cytoplasm or in phagolysosomes of neutrophils and alveolar

macrophages. A close association between chlamydia and CD1b+ DC was seen in areas of

necrosis at 7 dpi. The areas of necrosis were partially demarcated by hyperplastic epithelial

cells of type 2 and dense infiltrates of macrophages. The zones of regeneration became

confluent at 10 dpi and were infiltrated by CD1b+ DC, macrophages, CD4+, CD8+ and γδ+

T-lymphocytes, IgM+ and IgA+ B-lymphocytes/plasma cells. Numbers of CD4+, CD8+ and

γδ+ T-lymphocytes were significantly increased at 10 dpi compared to 7 dpi. At day 14 pi, the

areas of necrosis were infiltrated by macrophages, DC, CD4+, CD8+ and γδ+ T-lymphocytes

183 SUMMARY

and the number of chlamydia was markedly reduced. Ectopic lymphoid follicles formed by

IgM+ B-lymphocytes and parafollicular CD4+ T-lymphocytes and CD1b+ DC were located

within interlobular interstitium. At days 35/37 pi, chlamydia had been eliminated from most

parts of the lungs and pulmonary tissue had regenerated. Number and distribution of

unorganized immune cells were as seen in control calves, but BALT was more pronounced

and the number of sites with BALT/cm² pulmonary tissue was significantly increased

compared to the controls. Only in one pulmonary lobe of one calf, there was an area of

granulomatous inflammation and few chlamydia with atypical morphology (large, weakly

stained by immunohistochemistry) were seen in macrophages.

In the presented investigation the initial infection of alveolar epithelial cells with C. psittaci

was followed by a rapid influx of neutrophils most likely mediated by chemotactic

inflammatory cytokines produced by the infected alveolar epithelial cells. Degranulation and

decay of neutrophils caused extensive damage of the pulmonary tissue and necrosis.

Numerous chlamydia were seen in association with disintegrating neutrophils and alveolar

macrophages. The host’s cellular reactions were initially dominated by antigen presenting

cells and later increasingly by T- and B-lymphocytes as well as plasma cells. This cellular

reaction resulted in an almost complete elimination of C. psittaci and allowed regeneration of

the pulmonary tissue. The few atypical chlamydia found at 35 dpi may be indicative for the

formation of aberrant reticular bodies and chlamydial persistence.

LITERATURVERZEICHNIS 184

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215 ANHANG

9 ANHANG

Inokulum

SPGA Stabilisator

• 74,6 g Saccharose 0,52 g KH2PO4 1,25 g K2HPO4 0,92 g L- Glutaminsäure (Na- Salz) werden in 1000 ml Aqua bidest. gelöst.

• Es folgt die Zugabe und das Lösen von 1 g bovines Albumin, Fraktion V. • Die Lösung wird steril filtriert.

Verwendete Chemikalien

Behandlung der Objektträger

Chromalaungelatine zur Beschichtung von Objektträgern für Kryostatschnitte:

• 0,625 g Gelatine75 in 250 ml Aqua dest. bei 80°C lösen • die erkaltete Lösung mit 0,063 g Chromalaun76 und 1-5 Körnchen Thymol77 versetzen.

Färbungen

Hämalaun–Eosin-Färbung

Hämalaun nach P. Mayer: • 1 g Hämatoxylin78 in 1000 ml Aqua dest. lösen • 0,2 g Natriumjodat79 und 50 g chemisch reines Kalilaun80 zugeben und unter schütteln

lösen, • besitzt die Lösung einen blau-violetten Farbton folgt die Zugabe von 50 g Chloralhydrat81

und 1 g kristallisierter Zitronensäure82: • Die rot-violette Lösung wird für den sofortigen Gebrauch filtriert. Die Farbe ist bei Erhalt

des Farbtons wiederholt zu gebrauchen.

75 Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Seelze, Deutschland 76 VEB Laborchemie, Apolda, Deutschland 77 Thüringische Universitätsapotheke, Jena, Deutschland 78 Fa. Riedel-de Haen AG, Seelze- Hannover, Deutschland 79 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland 80 Fa. VEB Laborchemie, Apolda, Deutschland (DDR) 81 Fa. Carl Roth GmbH und Co, Karlsruhe, Deutschland 82 Fa. VWR International, Darmstadt, Deutschland

ANHANG 216

1%ige Eosin-Lösung:

• 1 g Eosin83 in 50% Ethanol dest. gelöst. • Ethanol dest. erhält man aus gleichen Mengen Ethanol und Aqua bidest. • Unmittelbar vor Gebrauch wird 1 Tropfen Eisessig84 auf 100 ml der Lösung zugesetzt. • Vor Gebrauch frisch ansetzen und filtrieren.

Karbolxylol

• 10g Phenol85 wird in 100ml Xylol86 gelöst.

Methylengrünlösung

• 2 g Methylengrün87 in 100 ml Aqua. dest auflösen. Zweifach filtrieren, ist mehrfach zu gebrauchen, vor Gebrauch stets filtrieren.

Kernechtrot

• 5 g Aluminiumsulfat88 in 100 ml Aqua dest. lösen. • Die Aluminiumsulfatlösung erhitzen und 0,1 g Kernechtrot89 einrühren, bis sich Farbstoff

löst, abkühlen und filtrieren.

Tuloidinblau

2,5-%ige wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung (NaHCO3): • 2,5 g Natriumhydrogencarbonat in 100 ml Aqua bidest. lösen • mit NAOH oder HCL auf pH-Wert 11 einstellen.

1%iges Toluidinblau (Stammlösung ist über Monate haltbar):

• 1 g Toluidinblau90 in einem Messkolben mit frisch hergestellter Natriumhydrogen-carbonatlösung auf 100 ml auffüllen und lösen.

83 Fa. Roth GmbH und Co, Karlsruhe, Deutschland 84 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland 85 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland 86 Dr. K. Hollborn & Söhne GmbH & Co KG, Leipzig, Deutschland 87 Fa. Sigma Aldrich Chemie, Steinheim, Deutschland 88 VEB Laborchemie, Apolda, Deuschland 89 Fa. Fluka AG, Buchs, Schweiz 90 Fa. Arcochemie, Berlin, Deutschland

217 ANHANG

Toluidinblau-Gebrauchslösung: • 25 ml Stammlösung ad 100 ml Aqua dest. (1:4) • frisch hergestellte Lösungen verwenden und vor Gebrauch filtrieren • Lösung sollte keine metallisch-glänzende Schicht auf der Oberfläche haben

Immunhistologie

PBS- Puffer

PBS-Stammlösung (pH 6,8):

• 800 ml Aqua dest. 40 g NaCl91 10 g NaH2PO4 x 2H2O

92 150 ml Aqua dest. zugeben.

• Den pH mit 5N NaOH auf 6,8 einstellen und mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllen. PBS-Gebrauchslösung (pH 7,1): • 200 ml PBS-Stammlösung

800 ml Aqua dest.

Dulbecco’s PBS- Puffer (DPBS)

DPBS-Stammlösung:

• 40 g NaCl93 1 g KCl94 1 g KH2PO4

95

7,15 g Na2HPO4 x 2H2O96

in 1000 ml Aqua dest. lösen.

DPBS-Gebrauchslösung (pH 7,4):

• 200 ml DBPS-Stammlösung 800 ml Aqua dest

91 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland 92 Fa. VWR International, Darmstadt, Deutschland 93 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland 94 Fa. Carl Roth GmbH und Co, Karlsruhe, Deutschland 95 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland 96 Fa. VWR International, Darmstadt, Deutschland

ANHANG 218

12,5% BSA in DPBS (BSA/DPBS)

• 12,5 g Bovines Serum Albumin (BSA)97 in 100 ml DPBS-Gebrauchslösung lösen.

0,06%ige Phenylhydrazin-Lösung

• 30 µl Phenylhydrazin98 in 50 ml PBS lösen.

Diaminobenzidintetrachlorid-dihydrat-Lösung (DAB)

• 24 mg DAB99 in 40 ml PBS lösen • unter Rühren langsam 400 µl 30% H2O2

100 1:10 verdünnt in Aqua dest. zusetzen,

• filtrieren und sofort benutzen

0,01%ige Osmiumsäure

• 250 µl Osmiumtetroxid101 in 100 ml Aqua dest.

Elektronenmikroskopie

2,5%iges Glutaraldehyd

• 25% Glutaraldehyd102 1:10 mit Cacodylatpuffer pH 7,2 verd.

Kakodylatpuffer pH 7,2

• 21,4 g Natriumcacodylat103 mit Aqua bidest auf 1l lösen pH mit 1N HCL auf 7,2 einstellen

2%iges Osmiumtetroxid

• 4%iges Osmiumtetroxid104 1:1 mit Cacodylatpuffer verdünnen

97 Fa. Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland 98 Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Seelze, Deutschland 99 Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Seelze, Deutschland 100 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland 101 Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe, Deutschland 102 Fa. VWR, Merck, Dresden, Deutschland 103 Fa. Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland 104 Fa. Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

219 ANHANG

Araldite I

• 10 ml Araldite CY212105 10 ml Dodecenylbersteinsäure (Härter)106 0,1 – 0,2 ml Dibutylphthalat (Weichmacher)107

Araldite II

• ml Araldite CY212 10 ml Dodecylbernsteinsäure 0,1 – 0,2 ml Dibutylphthalat 0,3 – 0,4 ml NN-Dimethylbezylamin (Beschleuniger)108

• beide Mischungen 15–30 min langsam rühren, anschließend etwa 15 Minuten bei 50°C homogenisieren

Uranylazetat, gesättigte wässrige Lösung

• Uranylazetat (UO2Ac)109 in 100 ml Aqua bidest. lösen • Vorgang mehrfach wiederholen, bis nach 3 Stunden die Lösung gesättigt vorliegt. • Lösung über Nacht stehen lassen. • Überstand vorsichtig in ein frisches Zentrifugenröhrchen pipettieren. • Mit Tischzentrifuge bei 1300 U/min 15 min abzentrifugieren. • In einem Aliquot pH messen, pH Sollwert liegt bei 4,0. • Überstand abpipettieren und in einer dunklen Glasflasche aufbewahren.

Bleizitrat

• 0,665 g Bleizitrat (Pb(NO3)2)110 und 0,88 g Tri-Natriumzitrat-2-hydrat (Na3(C6H5O7))

111 in15 ml Aqua bidest. Lösen

• stark schütteln bis nach 30 min die Umwandlung von Bleinitrat in Bleizitrat eintritt • 4 ml 1N NaOH (carbonatfrei) zusetzen und auf 25 ml mit Aqua bidest auffüllen und

schwenken. • nach Auflösung des Bleizitrats ist die Lösung gebrauchsfertig (pH 12)

105 Fa. Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland 106 Fa. Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland 107 Fa. Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland 108 Fa. Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland 109 Fa. Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland 110 Fa. Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz 111 Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

ANHANG 220

Indirekte Immunogoldmarkierung am Ultradünnschnitt:

DPBS mit 0,2% BSA-c™

• 0,2 ml 10%iges BSA-c™112 • 9,8 ml DPBS-Gebrauchslösung

Gycin 0,2 Mol

• 0,02 g Glycin113 ad. 10 ml Ampuwa

DPBS mit BSA-c™ und Ziegennormalserum

• 4,7 ml DPBS • 0,05 ml 10%iges BSA-c™ • 0,25 ml Ziege Normalserum

DPBS mit BSA-c™

• 4,7 ml DPBS • 0,05 ml 10%iges BSA-c™

112 Fa. Aurion, Wageningen, Niederlande 113 Fa. Baltic Präparation, Weinheim, Deutschland

Danksagung

Meiner Doktormutter, Frau Apl.-Prof. Dr. E. Liebler-Tenorio gilt mein besonderer Dank für

die Überlassung des interessanten Themas, die konstruktive Zusammenarbeit und für die

jederzeit und in jeder Hinsicht gewährte Unterstützung. Insbesondere möchte ich mich für die

wertvollen Ratschläge und das ausgesprochen freundliche Arbeitsklima bedanken.

Bei Sabine Lied und Lisa Wirker bedanke ich mich ganz herzlich für die tatkräftige

Unterstützung bei der Bearbeitung der Proben und die freundliche Zusammenarbeit.

Wolfram Maginot danke ich ganz besonders für die investierte Zeit und Mühe bei der

Bearbeitung der unzähligen Fotos, die Hilfsbereitschaft und den aufmunternden Beistand.

Herrn Thalmann danke ich sehr für die technische Unterstützung.

Bei Frau Rohde bedanke ich mich sehr für die ausdauernde Hilfe bei der Literatursuche.

Herrn Dr. Diller danke ich für die Einführung in das Statistikprogramm SPSS und für die

Hilfestellung bei der statistischen Auswertung.

Bedanken möchte ich mich bei allen, die am Versuchsvorhaben beteiligt waren, insbesondere

bei Frau PD Dr. Dr. P. Reinhold für die gute Zusammenarbeit.

Jacqueline, Anneka, Christin, Katharina, Maria, Markus, Michaela und Ulrike danke ich für

das sehr freundliche Miteinander und für viele gute Gespräche. Jan Schinköthe bin ich sehr

dankbar für die Mithilfe bei der Probensortierung.

Meiner Familie, insbesondere meiner Mutter, möchte ich für die liebevolle Unterstützung, für

den Glauben an mich und vor allem für das Ermöglichen meines beruflichen Werdegangs

danken. Meinem Freund Valerie danke ich von Herzen für seine Geduld und Unterstützung.

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Dissertation.22.11.11 - elib.tiho-hannover.de · induzierte reproduzierbar eine Bronchopneumonie, die innerhalb des Untersuchungszeitraums von fünf Wochen abheilte (LAMBERTZ 2011)