Aus dem Zentralinstitut fur Ernahrung in Potsdam-Rehbriicke (Direktor : Prof. Dr. H. HAENEL), Forschungszentrum fur Molekularbiologie und Medizin, Akademie der Wissenschaften der DDR

Metabolismus des Lindan. Abbau von Lindan durch Schimmelpilzkulturen.

Unkonjugierte Metabolite

R. ENGST, R. M. MACHOLZ und M. KUJAWA~

Eine nicbinaher definierte lindanabbauende Schimmelpilzkultur wurde isoliert, weitergeziich- tet und fiir Untersuchungen zur Aufklarung des Lindanmetabolismus verwendet. Die Identi- fizierung der Abbauprodukte erfolgte gaschromatographisch unter Venvendung verschiedener Saulenfiillungen und Temperaturen. Der kurzlebige Hauptmetabolit y-Pentachlorcyclohexen konnte zusatzlich diinnschichtchromatographisch nachgewiesen werden. Des weiteren wurden in groBeren Konzentrationen gebildet : Pentachlorbenzol, 2,3,4.6-Tetrachlorphenol, 1,2,3,4- Tetrachlorbenzol, r,z,3-Trichlorbenzol, 1,~,4-Trichlorbenzol, 2,4,6-Trichlorphenol und 1,z-Di- chlorbenzol. In geringen Mengen fanden sich : I, 3, 5 -Trichlorbenzol, I, 2,4,5-Tetrachlorbenzol, 2,3,4-Trichlorphenol, z,3,4,5-Tetrachlorphenol und Pentachlorphenol. Hexachlorbenzol und 1,4-Dichlorbenzol wurden zum ersten Ma1 als Lindanabbauprodukte identifiziert. Die Untersuchungen werden weitergefiihrt.

Bei der stufenweisen Reduzierung der DDT-Anwendung gewinnt Lindan (y-Hexa- chlorcyclohexan) weiter an Bedeutung. Inwieweit es jedoch DDT ersetzen kann, hangt neben dem Ruckstandsverhalten auch von den heim Abbau entstehenden Metaboliten ab. Es ist bekannt, daL3 nach Lindanaufnahme der Gehalt in Organismen schnell ab- sinkt. Dies darf nicht daruber hinwegtauschen, daB zahlreiche Abbauprodukte ent- stehen, von denen eine Anzahl bereits nachgewiesen wurde und weitere noch vermutet werden mussen (,,potentielle" Lindanmetabolite). Einige dieser Metabolite haben eine ausgepragte toxische Wirkung, so daB die Metabolitenbildung nicht als unbe- denklich gelten kann. Diese Abbauprodukte mussen daher ebenfalls in die Riick- standsproblematik einbezogen werden.

In dieser Arbeit werden folgende Abkurzungen venvendet :

DCB - Dichlorbenzol PCP - Pentachlorphenol DCP - Dichlorphenol TCB - Trichlorbenzol HCB - Hexachlorbenzol TCP - Trichlorphenol HCH - I, z,3,4,5,6-Hexachlorcyclohexan TeCB - Tetrachlorbenzol PCB - Pentachlorbenzol TeCP - Tetrachlorphenol PCCH - 2,~,~,~,6-Pentachlorcyclohexen

Herrn Prof. Dr. Dr. h. c. H.-K. GRAFE anlaBlich der Vollendung des 70. Lebensjahres zugeeignet. a Wir danken Herrn Diplomchemiker R. KNOLL fur die Unterstiitzung bei den gas-chromato-

graphischen Untersuchungen, Frau LANGNER fur die technische Assistenz.

738 ENGST/MACHOLZ/KUJAWA

Tabel le I

Ubersicht iiber alle bisher beschriebenen, frei auftretenden Metabolite, die nach Lindanapplikation in Mikroben, Pflanzen, Kaltbliitern und Warmblutern aufgefunden wurden (Untersuchungen zum

Abbau potentieller Metabolite werden nicht beriicksichtigt) ~~ ~ -

Bezeichnung des Metaboliten

isomeres Hexachlorcyclohexan U-HCH y-HCH -____ y-Pentachlorcyclohexan y-PCCH

isomeres PCCH y-~,3,4.5,6-Pentachlorcyclo- hexen- ( 2 ) -01- (I) PCB PCP

y-3,4,5,6-Tetrachlorcyclohexen Tetrachlorcyclohexan T e C B

1,2,3,4-TeCB

1,2.4,5-TeCB

2,3,4,5-TeCP 2 , ?,4,6-TeCP

1,z,3s3-TeCB

TeCP

Chlorbenzol

Kohlendioxid ._

* Kuhbutter

Mikroben Pflanze

[S-111

-.

Literatur

Kaltbliiter

[16-18, 20,

211 [20 - 221

[ZO, 211

Warmbliiter (Sauger)

[I1 *

In Tab. I sind bisher beschriebene, (aus den verschiedensten Organismen) frei aus- geschiedene Metabolite aufgefiihrt. Ihre Konjugate mit Glutathion, mit Schwefel- bzw. Glucuronsaure sollen in einer spateren Arbeit diskutiert werden.

Trotz der Fiille an Einzelergebnissen war es bisher nicht moglich, den Abbau auch nur teilweise bzw. hypothetisch in einem Schema festzulegen.

Metabolismus des Lindan 739

BRADBURY u. a. [13, 16-18], GROVER u. a. [IO, 301 haben Ende der 50er, Anfang der doer Jahre eine Reihe von Metaboliten identifiziert. Sie konnten noch nicht auf die Gaschromatographie zu- ruckgreifen. Anfang der 70er Jahre arbeiteten die verschiedenen Arbeitsgruppen an der gaschro- matographischen Identifizierung [zo, 24, 261. GROVER u. a. [30] schlugen als erste ein Abbauschema fur Lindan vor, konnten jedoch nicht alle Abbauschritte belegen. Die vermutete Bildung von y- PCCH aus y-HCH konnte von ihnen nicht nachgewiesen werden. Dies deutet anf die Richtigkeit der Annahme anderer Autoren [32] hin, daIj y-PCCH entweder sehr kurzlebig ist, nicht zur Ausschei- dung gelangt oder aber im Organismus der Warmbliiter iiberhaupt nicht als Intermediarprodukt ent- steht.

y-PCCH wurde eindeutig nur in Insekten, Pflanzen bzw. in Kulturmedien von Mikroorganismen nachgewiesen. Die Vielfalt der bisher aufgefundenen, in den chemischen Eigenschaften sehr ahn- lichen Abbauprodukte dcs y-HCH mit 5 oder 4 Chloratomen durfte die ohnehin unklaren Vorstellun- gen iiber eine Reihenfolge des Abbaus noch unubersichtlicher machen. Einheitlichkeit in der Auf- fassung der verschiedenen Autoren besteht nur bei den vermutlichen Endprodukten des Stoffwechsels, den Chlorphenolen.

FREAL u. a. [24] geben eine recht umfassende Ubersicht iiber mogliche Abbauwege. Ihre Ergeb- nisse stimmen rnit denen von KARAPALLY u. a. [26, 321 und denen von REED u. a. [zo, 211 nicht fur alle Abbaustufen iiberein. Sie begriinden die feststellbaren Differenzen mit Unterschieden im Stoff- wechsel der Versuchstiere (Ratten, Kaninchen, Insekten) .

Neben den Arbeiten, die direkt den Abbau von Lindan verfolgen und daraus mehr oder weniger experimentell belegte SchluBfolgerungen hinsichtlich des Abbauweges ziehen, werden Untersuchun- gen beschrieben, bei denen potentielle Metabolite verfiittert und die im Stoffwechsel auftretenden Abbauprodukte nachgewiesen wurden [30,33 - 391.

Id allen relevanten Arbeiten wird iiber die Hydroxylierung von Chlorbenzolen zu Chlorphenolen bzw. Diphenolen und iiber die Bildung der zugehorigen Chlorthiophenole und Glutathionderivate berichtet. Auch zum Abbau von PCP liegen Untersuchungen vor 1401.

Die vorstehend beschriebenen Erkenntnisse gestatten aber noch keine Festlegung des Abbauweges des Lindans. Besonders die ersten Schritte der angegebenen Abbau- wege bleiben hypothetisch, solange nicht eindeutig die direkte Bildung der primaren Metabolite aus Lindan nachgewiesen worden ist.

Exfierimenteller Teil Materialien

Ziichtung der Pilzkultur. Geriebene Mohren wurden rnit 10 ppm Lindan versetzt. Nach zwei Wo- chen wurden aus dem angesiedelten Schimmelrasen 4 Kulturen isoliert. Fur die weiteren Versuche wurde die am intensivsten abbauende Kultur verwendet. Sie wurde auf lindanhaltigem Kultur- medium (10 mg, 100 mg sowie 300 mg Lindan in gesattigter Losung von absolutem Athano1 pro I 1) bei 35 "C weiter geziichtet.

Kulturmedium : KH,PO, I , O g CaCl, 0,I g KNO, 2,o g Saccharose I O O , ~ g MgSO, * 7 H,O

In Abwandlung der Literaturangabe [19] wurden die Nahrstoffe in I 1 Phosphatpuffer nach Soren- sen (pH 6,o) gelost. Sterilisiert wurde wie iiblich.

Testsubstanzen. Die verwendeten Testsubstanzen sind in Tab. 2 aufgefiihrt.

0,5 g

.'Methoden ZUY Bestimmung der Abbauprodukte Extvnktion. 50 ml des Kulturmediums wurden rnit dreimal50ml n-Hexan intensiv ausgeschY!tCelt.

Da der pH-Wert der Pilzansatze stets unter pH'3 abgesunken war, eriibrigte sich ein Ansauern zur Extrsktion der Phenole. Die rnit wasserfreiem Natriumsulfat getrockneten Extrakte wurden im trockenen Luftstrom bis zur Entfernung der letzten Hexanreste eingeengt. Extrakte und alle Testsubstanzen wurden wie folgt behandelt :

740

Tabel le 2

Testsubstanzen

Hersteller

Ferak Berlin(West) dto. dto. dto. dto. dto. dto.

Fluka Schweiz dto. dto. dto.

--

VEB Fettschemie Karl-Marx-Stadt dto. dto. dto. dto.

VEB Fahlberg-List, Magdeburg dto. dto.

Schuchardt Munchen dto.

Arco-Chemie Berlin(West)

VEB Chemiekombinat Bitterfeld dto.

VEB Laborchemie Apolda dto.

Testsubstanz und Hersteller- hinweise

P-HCH V-PCCH

I,P-DCB, rein

I.~-DCB, rein

Reinigung

Fp. 135-136 "C (2 x Benzol)

Fp. 189 OC (2 x Benzol, sublimiert) Fp. 34-40 "C (ohne Reinigung)

Fp. 113 'C (3 x absoluter Alkohol)

Fp. 34-40 OC (ohne Reinigung)

Fp. 63-67 "C (3 x Wasser) Fp. 42-43 "C (3 x Wasser)

Fp 67-68 "C (2 x Wasser)

Fp. 63-67 "C (2 x Wasser)

Kp. 212-213 "C (destilliert)

-

~ _ _ _ _ ~ _ _ -

Kp. 178-179 "C (destilliert)

Fp. 53 OC (sublimiert)

n-Hexan wurde in jedem Falle vor der Verwendung iiber eine 40 mm-Kolonne destilliert. Nitrosomethylharnstoff und daraus Diazomethan (als Methylierungsreagenz) wurden nach [41] selbst dargestellt.

Die Proben wurden in 10 ml einer gesattigten Losung von Diazomethan in n-Hexan aufgenommen. Nach 24 h wurde der DiazomethanuberschuB im Luftstrom entfernt (Losungsmittelverlust < 5 %) und I ~1 der methylierten Extrakte direkt in einen Gaschromatographen eingespritzt. Bei zu geringer Konzentration der Metabolite ist vor dem Einspritzen ein groBerer Anteil der Lasung im kalten Luftstrom einzuengen. Wenn notwendig, wurde mit n-Hexan verdunnt. n-Hexan wurde in Abwandlung einer veroffentlichten Vorschrift anstelle von Ather als Losungs- mittel [41] fur Diazomethan venvendet, da dunnschichtchromatographisch nachgewiesen werden konnte, daB besonders die Bildung der Dichloranisole nicht in Ather, sondern nur in n-Hexan quan- titativ war. Bei Verwendung von Ather ware zudem ein vollstandiges Entfernen des Losungsmittels notwendig, was zwangslaufig zu erhohten Verlusten bei den methylierten Phenolen gefuhrt hatte.

Diinnschichtchromutogru~h~e. Die Untersuchung erfolgte auf Kieselgel G Merck mit einem Gemisch von Cyclohexan und Chloroform (80/20) als Laufmittel und ammoniakalischer Sibernitratlosung als Sprtihreagenz.

Metabolismus des Lindan 74 1

Gawhvomatographie. Gas-Chromatograph : Varian Aerograph Model1 1860- 4 rnit Elektronen-Ein- fang-Detektoren.

Saulen (Ganzglassystem) : I. Pyrex-Glas 6' x 1/4", gefiillt mit 7,5% QF-I auf 100-zoo mesh Vara- port 30; 2. Pyrex-Glas 6' x 1/4", gefiillt mit 2% SE-30 und o,z% Epicote auf IOO - zoo mesh Vara- port 30; 3. Pyrex-Glas 3' x 1/4'', gefiillt mit 3% OV-17 auf IOO - 120 mesh GaschromQ (Serva); 4. Pyrex-Glas 3' x I/:', gefiillt mit 2% OV-25 auf 100 - 120 mesh GaschromQ (Serva).

Temperaturen: Saule 40 OC, go "C, 180 OC; Injektoren 195 "C; Detektoren zoo "C; Tragergas: 30 ml N,/min; Elektrometer: Range IO-~O, Attenuation 8 und 32.

Papiergeschwindigkeit bei Saulentemperatur go OC: 10 inches/h, bei 180 "C: 80 inches/h, bei 40 OC: 20 inches/h.

Dosis: I p1 (on colum).

10

72 A I

13 15

Abb. I. n-Hexan-Extrakte des Kulturmediums an 2% SE-30 und O , Z % Epicote bei go "C

I t I,~-DCB; 2 = I,P-DCB; 3 = I , ~ , ~ - T C B ; 4 = I,z,~-TCB; 5 = z,6-DCPund I,z,~-TCB; 6 = 2,5- DCP; 7 = z,4-DCP; 8 = 1,2,4,5-TeCB und z,4,6-TCP und 2,3-DCP; g = 1,2,3,4-TeCB; 10 = y- PCCH; 11 = z,3,5-TCP und z,3,6-TCP und z,4,5-TCP und 3,4,5-TCP; 12 = PCB; 13 = z,3,4,6-

TeCP und 8-PCCH; 14 = z,3,4-TCP; 15 = z,3,4,5-TeCP; 16 = PCP A: nach 17 Tagen Pilzwachstum bei 10 mg Lindan pro I 1 Kulturmedium; B: Testgemisch; C: nach

52 Tagen Pilzwachstum bei 300 mg Lindan pro I 1 Kulturmedium

742 ENGST/MACHOLZ/KUJAWA

Ergebnisse und Diskusion

Die Zuordnung aller aufgefundenen Peaks (Abb. I) erwies sich als sehr aufwendig. Sie wurde erst bei gleichzeitiger Untersuchung an 4 verschiedenen Saulen moglich. Bei der Auswertung von Gaschromatogrammen und Dunnschichtchromatogrammen sind folgende Besonderheiten zu beobachten :

Wahrend des Lindanabbaus durch den Schimmelpilz entstehen 2,3,5-TCP, 2,3,6- TCP, 2,4,5-TCP und 3,4,5-TCP in kaum nachweisbaren Mengen. Die Tatsache, daB

?6

i

Abb. 2. Testgemische I = I ,~ -DCB; 2 = 1,z-DCB; 3 = 1,3,5-TCB; 4 = I ,z ,~-TCB; 5a = 2,G-DCP; 5b = 1,2,3-TCB; G = 2,5-DCP; 7 = 2,4-DCP; 8a = 1,2,4,5-TeCB; 8b = 2,4,6-TCP; 8c = z , ~ - D C P ; 9 = I,2,3,4- TeCB; 10 = y-PCCH; 11 = 2,3,5-TCP und z,3,6-TCP und 2,4,5-TCP und 3,4.5-TCP; 12 = PCB;

13a = 2,3,4,6-TeCP; 13b = 8-PCCH; 14 = 2,3*4-TCP; 15 = 2,3>4,5-TeCP; 16 = PCp A: 2% OV-25 bei go "C; B: 7,5% QF-I bei go "C

sie selbst an 4 Saulen nicht zu trennen sind, ist daher von geringer Bedeutung. Die Trennung von 2,5-DCP, 2,4-DCP, 2,4,6-TCP und 1,2,4,5-TeCB ist an Saulen mit 3% OV-17 moglich, nicht jedoch an Saulen mit 2% OV-25 [Abb. 2) . 2,3,4,5-TeCP, IICB, PCP, y-HCH, 6-HCH und p-HCH sind bei 180 "C, I ,~-DCB und I ,~-DCB nur bei 40 "C sicher identifizierbar.

Metabolismus des Lindan 743

Die Anwesenheit folgender Metabolite war auf Grund ihrer Retentionszeiten an den 4 verwendeten Saulen eindeutig nachzuweisen :

I, 2-DCB 2 ,3,4-TCP z,3,4,6-TeCP

I,z,~-TCB I ,z,3,+TeCB PCB

I , ~ , ~ - T C B z,3,4,5-TeCP HCB

I,~-DCB 2,4,6-TCP y-PCCH

I , ~ , ~ - T C B 1,z,4,5-TeCB PCP

Dunnschichtchromatographisch (Abb. 3) konnte y-PCCH durch Vergleich mit der Testsubstanz nachgewiesen und so der Befund der gaschromatographischen Unter- suchungen (Abb. IA) gestutzt werden. Von y-PCCH sind dunnschichtchromato- graphisch wesentlich geringere Mengen erfal3bar als von PCB. Dies erklart, warum PCB auf der Dunnschichtplatte (Abb. 3) nicht gefunden wurde. Hingewiesen wird aber noch auf den intensiven Fleck, der von methylierten Chlorphenolen herruhrt, deren Trennung gaschromatographisch moglich war, aber diinnschichtchromato- graphisch zu aufwendig erschien.

7

Abb. 3. Diinnschichtchromatographischer Nachweis von y-HCH und y-PCCH A: n-Hexan-Extrakt des Kulturmediums (10 mg Lindan/I 1) nach 17 Tagen;

B: Testgemische (je 0,5 wg/zo pl Hexan)

Den Hauptmetaboliten beim Abbau von y-HCH durch den Pilz stellt ohne Zweifel das oben erwahnte y-PCCH (Peak 10, Abb. I) dar. Zwischen dem 17. und 52. Tag des Pilzwachstums sinkt der Gehalt an y-PCCH schnell. Gleichzeitig erhoht sich der An- teil an chlorarmeren Metaboliten. Bemerkenswert ist die schnelle Abnahme des Lin- dam. Konform mit dieser Abnahme steigen die Konzentrationen an wesentlich fliichtigeren Metaboliten. Die erhohte Temperatur bei der Pilzzucht ist sicher nicht die Ursache fur die Senkung des Lindangehaltes infolge von Verdampfungsverlusten. Der Vergleich der beiden Gaschromatogramme IA und IC weist vielmehr darauf hin, dal3 der Abbau des Lindanmolekuls schnell erfolgt.

In relativ hohen Konzentrationen weiterhin entstehende Metabolite sind : PCB, z,3,4,6-TeCP, 1,2,3,4-TeCB, I,z,~-TCB, I,z,~-TCB und z,4,6-TCB.

fjber das Auftreten von I ,~-DCB und HCB im Lindanstoffwechsel wurde in der uns zugangigen Literatur bisher nicht berichtet. Bei der grol3en Menge der identifi- zierten Metabolite sind weitergehende Aussagen uber Abbauwege noch nicht mog- lich. Sicher ist jedoch, dal3 nicht nur dehydrochlorierende und hydroxylierende En- zyme, sondern auch dehydrierende Enzyme [zo, 21, 26, 321 einen sehr wesentlichen Anteil am Metabolismus und an der Entgiftung des yHCH haben.

Die laufenden Untersuchungen zum Metabolismus sollen weiter gefiihrt werden.

744 ENGST/MACHOLZ/KU JAWA

S u m m a r y

R. ENGST, R. M. MACHOLZ and M. KUJAWA: Lindane metabolism. Degradation of lindane by mould cultures. Unconjugated metabolites

A lindane degrading mould which was not nearer defined, has been isolated, cultivated, and used for studies in lindane metabolism. The identification of the degradation products has been carried out by gas chromatography using different column packings and temperatures. Moreover the pre- sence of the short-lived main-metabolite, the y-pentachloro-cyclohexene, could be proved by TLC. Besides of this the following compounds have been found in greater amounts : pentachlorobenzene, ~,3.4,6-tetrachlorophenol, 1,2,3,4-tetrachlorobenzene, 1,~,3-trichlorobenzene, 1,~,4-trichlorobenzene, ~,4,6-trichloropheno1, and 1,z-dichlorobenzene. Smaller amounts were found of: 1,3,5-trichloroben- zene, 1,2,4,5-tetrachlorobenzene, ~,3,4-trichlorophenol, ~,3,4,5-tetrachlorophenol, and pentachloro- phenol.

Firstly hexachlorobenzene and 1,4-dichlorobenzene have been identified as lindane degradation products. The studies will be continued.

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Metabolismus des Lindan 745

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Prof. Dr. R. ENGST, Diplomlebensmittelchemiker R. M. MACHOLZ und Dr. M. KUJAWA, Zentral- institut fur Erniihrung, Bereich Fremdstoffe in Nahrung und Erniihrung, DDR-1505 Bergholz- Rehbriicke, Arthur-Scheunert-Allee 114- 116

Eingegangen 16.4.1974

50 Die Nahrung, 18. Jhg., Heft 8