Abbau von Polyethylenterephthalat mit PET …€¦ · II Bibliographische Beschreibung Autor Billig, Susan Thema Abbau von Polyethylenterephthalat mit PET-Hydrolasen aus Thermobifida

Abbau von Polyethylenterephthalat mit PET-Hydrolasen aus

Thermobifida fusca KW3

Von der Fakultät für Maschinenbau der Technischen Universität Chemnitz

Genehmigte

Dissertation

zu Erlangung des akademischen Grades

Doktor-Ingenieur

Dr.-Ing.

vorgelegt

von Dipl.-Ing. Susan Billig

geboren am 12.01.1978 in Marienberg

eingereicht am 06.09.2011

Gutachter:

Prof. Dr. Wolfgang Zimmermann

Prof. Dr.-Ing. habil. Bernd Platzer

Dr. Vincent A. Nierstrasz

Chemnitz, den 06.09.2011

II

Bibliographische Beschreibung

Autor Billig, Susan

Thema Abbau von Polyethylenterephthalat mit PET-Hydrolasen aus Thermobifida fusca KW3

Dissertation an der Fakultät für Maschinenbau der Technischen Universität Chemnitz, Institut für

Technische Thermodynamik, Chemnitz, 06.09.2011

Seitenzahl: 200, Anzahl der Abbildungen: 91, Anzahl der Tabellen: 37, Anzahl der Literaturzitate: 203

Referat

Der Actinomycet T. fusca KW3, isoliert aus Kompost, bildete während der Kultivierung im

Mineralsalz-Spurenelement-Vitamin-Minimalmedium nach Zusatz von PET-Fasern eine 52 kDa

Carboxylesterase (TfCa), welche effizient zyklische PET Trimere (CTR) hydrolysiert. Die TfCa besitzt

einen pI von 4,8, eine Substratspezifität gegenüber kurzkettigen p-Nitrophenyl-Estern und wird durch

Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Tosyl-L-Phenylalanin-Chloromethylketon (TPCK) in der

Aktivität gehemmt. Die Carboxylesterase hydrolysiert kein Cutin oder Poly-ε-caprolacton (PCL). CTR

hingegen wurden durch die TfCa mit einem Km von 0,5 mM und einer Vmax von 9,3 µmol/min/mg bei

optimalen Bedingungen (60°C, pH 6) hydrolysiert. Das aktive Zentrum der Carboxylesterase besteht

aus den Aminosäuren Ser185, Glu319 und His415, wobei das Serin in das katalytische Motiv G-E-S-A-

G eingebettet ist.

Während der Reaktion setzte die TfCa auch Hydrolyseprodukte aus PET-Fasern und -Filmen frei. Der

Nachweis der Hydrolyse erfolgte durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

der Abbauprodukte und bei den PET-Filmen zusätzlich mittels Rasterelektronenmikroskopie. Dabei

zeigte die Carboxylesterase verglichen mit anderen PET-Hydrolasen eine geringere Effizienz, was

durch die Lage des aktiven Zentrums in einer Bindungstasche und der daraus folgenden schlechten

Zugänglichkeit für polymere Substrate begründet werden kann. Bei der Hydrolyse der viel kleineren

CTR war die TfCa deutlich effektiver, was auf eine höhere Spezifität gegenüber kurzkettigen PET

Substraten hinweist.

Schlagworte

Polyethylenterephthalat, Thermobifida fusca, Carboxylesterase, PET-Hydrolase, Hydrolyse,

Actinomycet, enzymatische PET-Modifikation, enzymatischer PET-Abbau

III

Ich weiß, dass ich nichts weiß.

Sokrates (469-399 v. Chr.)

Was wir wissen, ist ein Tropfen; was wir nicht wissen, ein Ozean.

Wenn ich fähig war, weiter zu sehen als andere,

dann deshalb, weil ich auf den Schultern von Riesen stand.

Isaac Newton (1643-1727)

Eigentlich weiß man nur, wenn man wenig weiß;

Mit dem Wissen wächst der Zweifel.

Johann Wolfgang von Goethe (1749-1832)

O glücklich, wer noch hoffen kann,

aus diesem Meere des Irrtums aufzutauchen!

Was man nicht weiß, das eben braucht man,

und was man weiß, kann man nicht brauchen.

Johann Wolfgang von Goethe (1749-1832)

Der Zweifel ist der Beginn der Wissenschaft. Wer nichts anzweifelt, prüft nichts.

Wer nichts prüft, entdeckt nichts. Wer nichts entdeckt, ist blind und bleibt blind.

Teilhard de Chardin (1881-1955)

IV

Danksagung

Hiermit möchte ich allen Personen für Ihre Unterstützung, sowohl körperlich als auch mental,

danken, die damit zur Fertigstellung der vorliegenden Dissertation beigetragen haben.

Als allererstes gilt mein Dank Herrn Prof. Dr. W. Zimmermann, AG Mikrobiologie und

Bioverfahrenstechnik der Universität Leipzig, für die Unterstützung bei der Themenerstellung und bei

der Durchführung der Studien sowie seinem beständigen Interesse an der Entwicklung der Arbeit.

Die Erstellung der Dissertation fand im Rahmen eines Promotionsstipendiums der Deutschen

Bundesstiftung Umwelt (AZ 20004/730) statt, der ich hiermit für diese Finanzierung danken möchte.

Herrn Prof. Dr.-Ing. habil. B. Platzer, Professur Technische Thermodynamik an der Technischen

Universität Chemnitz, danke ich für die Übernahme der Zweitbegutachtung.

Frau Dr. Claudia Birkemeyer, AG Massenspekrometrie, danke ich sehr für die Unterstützung bei den

MS-Messungen, für die vielen interessanten Diskussionen und Gespräche sowie für Ihre

selbstverständliche Hilfsbereitschaft bei der Lösung verschiedenster Fragen oder Probleme.

Weiterhin danke ich Frau R. Oehme, AG Massenspekrometrie, Frau Dr. I. Neuendorf und Herrn Dr. J.

Stichel, AG Biochemie und Bioorganische Chemie, für die Unterstützung bei den durchgeführten

GC/MS, Sequenzierungs- und MALDI Tof/Tof Analysen. Ebenfalls bedanke ich mich bei Frau PD Dr. M.

Grunow, AG Biochemie und Molekularbiologie, für die Unterstützung bei der biochemischen

Datenauswertung.

Für die Durchführung eines wissenschaftlichen Auslandsaufenthalts in den Niederlanden möchte ich

mich bei der COST 868 Action für die finanzielle Unterstützung bedanken. Des Weiteren gilt mein

Dank Herrn Dr. V.A. Nierstrasz, Herrn Dr. Pramod B. Agrawal und Herrn Prof. Dr. M.M.C.G.

Warmoeskerken für die Hilfe bei der Realisierung meiner Studien. Ein besonderer Dank geht

ebenfalls an die gesamte Arbeitsgruppe „Engineering of Fibrous Smart Materials“ der Universität

Twente, die dazu beigetragen haben, dass ich mich auch weit weg wie zu Hause gefühlt habe.

Ein herzlicher Dank geht an meine Kolleginnen und Kollegen der AG Mikrobiologie und

Bioverfahrenstechnik: Fr. Blesz, Christina, Karen, Mohd, Nicole, Ren, René, Sandra, Simone, Susanne

und Thorsten, für das beflügelnde Arbeitsklima und die ständige Unterstützung. Besonders in

Erinnerung bleiben werden die gemeinsamen Feiern, Ausflüge und geselligen Beisammen sein.

Besonders herzlich bedanken möchte ich mich bei Nicole, meiner Mitdoktorandin, Tischnachbarin

und meinem „Fels im stürmischen Laboralltag“. Sie hatte immer ein offenes Ohr für alle Probleme

und Fragen und stets einen hilfreichen Tipp. Ich danke Ihr für die tolle Zusammenarbeit, die vielen

Gespräche mit oder ohne Kaffee, die gemeinsamen Tagungsbesuche und die hoffentlich noch lange

weiter bestehende Freundschaft.

Abschließend danke ich meiner Familie und meinen Freunden für ihre Unterstützung und Geduld mit

mir und meiner, für sie meist unverständlichen, Arbeit.

V

Inhaltsverzeichnis

1 Einführung 1

1.1 Actinomyceten 1

1.1.1 Klassifizierung 1

1.1.2 Thermobifida (Thermomonospora) fusca 2

1.2 Biopolyester Cutin und Suberin 4

1.2.1 Bestandteile des Cutins 4

1.2.2 Bestandteile des Suberins 5

1.2.3 Struktur der Biopolymere 7

1.3 Hydrolasen 12

1.3.1 Struktur und katalytischer Mechanismus 12

1.3.2 Carboxylesterasen 16

1.3.3 Lipasen 19

1.3.4 Cutinasen 22

1.4 Polyethylenterephthalat 23

1.4.1 Konventionelle PET-Faserbehandlung 24

1.4.2 Charakterisierung von PET 26

1.4.3 Biofunktionalisierung von PET 30

1.4.4 PET-Hydrolasen 38

1.5 Zielsetzung 49

2 Material und Methoden 50

2.1 Materialien 50

2.1.1 Verwendete Mikroorganismen 50

2.1.2 Verwendete Enzyme 50

2.1.3 Größenstandards 51

2.1.3.1 Low Molecular Weight Marker (GE Healthcare) 51

2.1.3.2 Roti®-Mark Standard (Fa. Carl Roth GmbH) 51

2.1.3.3 SpectraTM

Multicolor Broad range Protein Ladder (Fermentas) 51

2.1.3.4 PageRulerTM

plus prestained protein ladder (Fermentas) 51

2.1.3.5 Kalibrierungskit für pI Bestimmung (pH 3-10, GE Healthcare) 52

2.1.3.6 Kalibrierungskit für die Größenausschlusschromatographie (LMW, GE Healthcare) 52

2.1.4 Chemikalien 53

2.1.5 Geräte und Materialien 55

VI

2.1.6 Software 58

2.1.7 Nährmedien 58

2.1.8 Suberin- und Cutin-Präparationen 60

2.1.9 PET-Substrate für die Abbauuntersuchungen 60

2.1.10 Puffer und Lösungen 60

2.2 Mikrobiologische Methoden 65

2.2.1 Stammhaltung und Kultivierung 65

2.2.2 Mikroskopische Untersuchungen 65

2.2.3 Trockengewichtsbestimmung 65

2.3 Proteinchemische Methoden 66

2.3.1 Proteinaufreinigung der Wildtyp TfCa 66

2.3.2 Proteinaufreinigung der rekombinanten TfCa, TfCut1 und TfCut2 67

2.4 Analytische Methoden 67

2.4.1 Esterase-Aktivitätsbestimmung 67

2.4.1.1 Bestimmung mittels Spektrophotometer 68

2.4.1.2 Bestimmung mittels Plattenleser 68

2.4.2 Cutinase-Aktivitätsbestimmung 68

2.4.3 PCL-Abbauuntersuchung 69

2.4.3.1 Bestimmung mittels Hofbildung 69

2.4.3.2 Bestimmung mittels Plattenleser 69

2.4.4 Quantitative Protein-Bestimmung nach Bradford (1976) 69

2.4.5 SDS Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 70

2.4.5.1 Esteraseaktivitäts-Färbung 70

2.4.5.2 Coomassie-Färbung 71

2.4.5.3 Silberfärbung der Proteine 71

2.4.6 Bestimmung des pI 71

2.4.7 Bestimmung der Molaren Masse 72

2.4.8 Bestimmung der Temperatur und pH-Wert Stabilität 72

2.4.9 Bestimmung der Stabilität gegenüber Inhibitoren 72

2.4.10 Bestimmung der kinetischen Konstanten für die Hydrolyse von p-NP Ester 72

2.4.11 Bestimmung der kinetische Konstanten für die Hydrolyse von CTR 73

2.4.12 Bestimmung optimaler Temperatur und pH-Wert für die Hydrolyse von CTR 73

2.4.13 N-terminale Sequenzierung 73

2.4.14 MALDI-TOF Sequenzierung 74

2.4.15 Abbaustudien 74

VII

2.4.16 Analytik der PET Abbauprodukte 75

2.4.17 Konzentrationabhängige CTR-Abbaustudien 75

2.5 Homologie-Modelling der TfCa und weitere PET-Hydrolasen 76

3 Ergebnisse und Diskussion 77

3.1 Screening nach PET-Hydrolasen aus T. fusca 77

3.1.1 Wachstum von T. fusca KW3 im Czapek-Medium 77

3.1.2 Wachstum von T. fusca KW3 im MSV-Medium 78

3.1.2.1 Esterasebildung mit verschiedenen synthetischen und natürlichen Polyestern 78

3.1.2.2 Esterasebildung mit einer Suberinpräparation 81

3.1.2.3 Esterasebildung mit PET-Fasern 83

3.1.3 Esterasebildung bei T. fusca KW3 DSM 6013, T. fusca DSM 43792 und DSM 43793 mit

PET-Fasern und Diethylterephthalat 85

3.2 Charakterisierung der PET-Hydrolasen aus T. fusca KW3 95

3.2.1 Aufreinigung 95

3.2.1.1 Aufreinigung der TfCa 95

3.2.1.2 Aufreinigung der rekombinanten PET-Hydrolasen 105

3.2.2 pI der TfCa 113

3.2.3 Molare Masse der TfCa 113

3.2.4 Temperatur- und pH-Stabilität der TfCa 114

3.2.5 Wirkung von Inhibitoren auf die TfCa 117

3.2.6 Kinetik der Hydrolyse von verschiedenen Esterasesubstraten durch die TfCa 118

3.2.7 Optimale Temperatur und optimaler pH-Wert der CTR-Hydrolyse durch die TfCa 119

3.2.8 Cutinaseaktivität der TfCa 120

3.2.9 PCL-Abbau durch die TfCa 121

3.2.10 N-terminale Sequenz der TfCa 122

3.2.11 MALDI-TOF Sequenzierung der TfCa 123

3.2.12 Homologie-Modeling der TfCa und Vergleich der Struktur mit anderen Hydrolasen 126

3.2.13 Vergleich der TfCa mit bekannten PET-Hydrolasen 128

3.3 Hydrolyse von PET Substraten durch prokaryotische und eukaryotische Hydrolasen 138

3.3.1 Partielle Hydrolyse von APET-Filmen durch die PET-Hydrolasen 140

3.3.2 Partielle Hydrolyse von PET-Fasern durch die PET-Hydrolasen 148

3.3.3 Hydrolyse von PET-Trimeren durch die PET-Hydrolasen 151

4 Zusammenfassung 165

VIII

5 Literaturverzeichnis 166

6 Publikationen 181

7 Poster und Vorträge 182

8 Lebenslauf 183

IX

Abbildungsverzeichnis Seite

Abbildung 1: Phylogenetischer Stammbaum des Lebens auf Grundlage der 16S rDNA Untersuchungen. Die Gruppe der Actinobakterien ist im linken oberen Bereich angeordnet (www.lisci.kitasato-u.ac.jp/me/images/phylogenetic.jpg). 1

Abbildung 2: T. fusca KW3 mit 1000facher Vergrößerung (links, Färbung mit Safranin) und Makroskopisches Aussehen nach Wachstum auf Czapek-Medium (rechts). 3

Abbildung 3: Schematische Darstellung der Einlagerung von Cutin in einem Blatt. Die Stärke, Struktur und Zusammen-setzung der einzelnen Schichten der Cuticula können stark variieren abhängig von Spezies, Organen und Entwicklungs-phase. Die epicuticulären Wachse (EW) bedecken die Cuticula (C) komplett, die aus Cutin und darin eingelagerten intracuticulären Wachsen besteht. Die cuticulären Schichten (CL) bestehen höchstwahrscheinlich aus Cutin und Polysacchariden der Zellwand, könnten aber vielleicht auch intracuticuläre Wachse enthalten. (PW: primäre Zellwand, Cy: Cytoplasma, V: Vakuole) (Pollard et al. 2008). 5

Abbildung 4: Schematische Darstellung der Einlagerung von Suberin in der Endodermis einer Wurzel. Abgebildet sind zwei angrenzende Zellen mit Mittellamelle (ML) und Pektinschicht zwischen ihren primären Zellwänden (PW). Die Suberinlamellen befinden (SL) sich auf der Innenseite der primären Zellwand. (SW: sekundäre Zellwand, PM: Plasmamembran, Cy: Cytoplasma, V: Vakuole) (Pollard et al. 2008). 6

Abbildung 5: Modell der möglichen Bindungsstrukturen im Biopolyester Cutin (Kolattukudy 2002). 7 Abbildung 6: Modell der hypotetischen Struktur der Suberinschicht der Kartoffel. P: phenolisches Monomer, C:

Kohlenhydrat, S: Suberin (aromatisch oder aliphatisch) (Bernards 2002). 9 Abbildung 7: Darstellung der möglichen Verbindungen der Monomere der Biopolyester Cutin und Suberin. a) Hauptsächlich

treten dabei primäre Esterbindungen auf (roter Pfeil), wodurch lange Ketten gebildet werden. Die sekundären Esterbindungen (blauer Pfeil) stellen zusätzliche Verzweigungspunkte dar. b) Anordnung der Fettsäure- und ω-Hydroxyfettsäure-Monomere unter Bildung eines Dendrimers. c) Anordnung der α,ω-Dicarbonsäure- (DCS) und Glycerin-Monomere unter Bildung einer Dendrimer Struktur, angeordnet um freie OH Gruppen um eine Bindung an einige Glycerin Monomere zu ermöglichen. d) Anordnung der DCS- und Glycerin-Monomere unter Bildung einer quervernetzten Domäne. (Pollard et al. 2008). 11

Abbildung 8: α/β Hydrolase-Faltungsmotiv der Hydrolasen ist eine „doubly wound α/β superfold“ bestehend aus 8 zentral parallel angeordneten β-Faltblättern (rot) und 6 umgebenden stabilisierenden α-Helices (blau). Im Speziellen kann die Anzahl der Elemente variieren, das allgemeine Gerüst ist aber hochkonserviert. Das aktive Zentrum bilden 3 Aminosäuren (grün), das Nucleophil befindet sich im hoch konservierten Bereich zwischen der αC-Helix und dem β5-Faltblatt, dem „nucleophilic elbow“ (Ollis et al. 1992). 13

Abbildung 9: Der katalytische Reaktionsmechanismus der Hydrolasen am Beispiel der Spaltung eines Esters in die dazugehörige Säure und Alkohol. Die Reaktion erfolgt ohne Verwendung eines Cofaktors und ist somit sehr einfach und effizient. Die Bildung des Acylenzyms ist ein schneller Reaktionsschritt, die Freisetzung der Säure und des Enzyms ist der geschwindigkeitsbestimmende Reaktionsschritt. (Holmquist 2000). 14

Abbildung 10: Übersicht über die katalysierten hydrolytischen Spaltungen der Enzymgruppen der Carboxylesterase, Triacylglycerol Hydrolasen und der Cutin Hydrolasen im wässrigen Milieu. 15

Abbildung 11: Reaktionskinetik der Carboxylesterasen (links) nach Michaelis-Menten und der sigmoide Kurvenverlauf der Reaktionskinetik der Lipasen (rechts) (Pütz 2006). 16

Abbildung 12: Struktur der offenen und geschlossenen Lipase von Burkholderia cepacia BcL. Die offene Kristallstruktur ist blau dargestellt und das geschlossene Homologie-Modell grün, die gelbe Kugel stellt ein Ca

2+-Ion dar. Die katalytische

Triade besteht aus Serin, Histidin und Asparaginsäure (Trodler et al. 2009). 20 Abbildung 13: Polykondensationsreaktion von Terephthalsäure und Ethylenglycol zu Polyethylenterephthalat. 23 Abbildung 14: Struktur eines zyklischen PET-Trimers. 24 Abbildung 15: Schematische Darstellung des Schmelzspinnverfahrens von PET-Fibrillen (links) und Darstellung einer

beheizten Schmelzspinndüse (Jahreiß 2005). 26 Abbildung 16: Anordnung der PET-Ketten vor (links) und nach (rechts) dem Verstrecken unter Ausbildung von geordneten

kristallinen Bereichen (Jahreiß 2005). 27 Abbildung 17: Darstellung der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den durch Verstrecken entstandenen geordneten

PET-Ketten (grün). 27 Abbildung 18: Darstellung möglicher Faserquerschnitte und Oberflächen (links) und die PET-Fasern vor und nach dem

Texturieren (rechts) (Jahreiß 2005). 28 Abbildung 19: DSC-Kurve einer PET-Folie (http://web.utk.edu/~mse/Textiles/Polymer%20Crystallinity.htm). 29 Abbildung 20: Darstellung der chemischen Struktur der Polyethylenterephthalat Polymerkette, der zyklischen Trimere und

der enzymatisch freigesetzten Hydrolyseprodukte (Zimmermann und Billig 2011). 31 Abbildung 21: Darstellung der chemischen Struktur der Polytrimethylenterephthalat Polymerkette, der zyklischen Dimere

und der enzymatisch freigesetzten Hydrolyseprodukte (Zimmermann und Billig 2011). 32 Abbildung 22: Darstellung der chemischen Struktur der angewandten Polyethylenterephthalat Modellsubstrate

(Zimmermann und Billig 2011). 32 Abbildung 23: Kalibrierungskit für die pI Bestimmung, Breiter pI Bereich (pH 3-10, rechte Spur, GE Healthcare). 52 Abbildung 24: Elutionsprofil des Kalibrierungskit für die Größenausschlusschromatographie eluiert von einer XK 26/60

Säule, Superdex 200 prep grade, 320 ml SV, 50 mM Tris HCl pH7,2 150 mM NaCl, 2,5 ml/min, 280 nm und dazugehörige Kalibrierkurve (kleine Abbildung). 53

X

Abbildung 25: Wachstumskurve von T. fusca KW3 im Czapek-Medium bei 50°C und 150 rpm. 77 Abbildung 26: SDS-PAGE und Aktivitätsfärbung mit den Esterasen in den zellfreien Überständen des MSV-Mediums nach 10

tägiger Inkubation bei 50°C mit PET-Fasern (Spur 1), recyceltes PET-Granulat (Spur 2), einer PET-Oligomerpräparation (Spur 3), einer zyklischen PET-Oligomerpräparation (Spur 4), BHET (Spur 5), PBT-Fasern (Spur 6), einer Suberinpräparation (Spur 7) und einer Cutinpräparation (Spur 8). 79

Abbildung 27: Esteraseproduktion durch T. fusca KW3 mit recyceltem PET-Granulat, PET-Oligomerpräparation, zyklische PET-Oligomerpräparation, BHET, PBT und PET-Fasern über einen Zeitraum von 10 Tagen im MSV-Medium. 80

Abbildung 28: Bestimmung der Esteraseaktivitäten (◊) und der spezifischen Esteraseaktivitäten () während des Wachstums im MSV-Medium unter Zugabe von Suberin. 82

Abbildung 29: SDS-PAGE der zellfreien Überstände nach Inkubation mit Suberin im MSV-Medium, links Coomassie-gefärbtes Gel; rechts Gel mit Aktivitätsfärbung mit Fast Red. Spur 1, 7: Roti

®-Mark SDS Proteinstandard; Spur 2:

Nullwert; Spur 3, 8: zellfreier Überstand nach 2 Tagen Kultivierung; Spur 4: zellfreier Überstand nach 4 Tagen Kultivierung; Spur 5: zellfreier Überstand nach 7 Tagen Kultivierung; Spur 6: zellfreier Überstand nach 10 Tagen Kultivierung. 82

Abbildung 30: Biotrockenmasseproduktion () und Esteraseaktivität (◊) von T. fusca KW3 im MSV-Medium. 83 Abbildung 31: Graphische Darstellung der Esteraseaktivität (◊) und der spezifischen Esteraseaktivität () gebildet während

der 10-tägigen Kultivierung im MSV-Medium mit PET-Fasern. 84 Abbildung 32: SDS-PAGE der zellfreien Überstände nach Inkubation mit PET-Fasern im MSV-Medium, links Coomassie-

gefärbtes Gel; rechts Gel mit Aktivitätsfärbung mit Fast Red. Spur 1 und 7: Roti®-Mark SDS Proteinstandard; Spur 2:

Nullwert; Spur 3: zellfreier Überstand nach 2 Tagen Kultivierung; Spur 4: zellfreier Überstand nach 4 Tagen Kultivierung; Spur 5: zellfreier Überstand nach 8 Tagen Kultivierung; Spur 6, 8: zellfreier Überstand nach 10 Tagen Kultivierung. 84

Abbildung 33: SDS-PAGE der Rohenzymlösungen nach Kultivierung mit unbehandelten PET-Fasern bzw. DET im MSV-Medium, Gel gefärbt mit Coomassie- und mit Aktivitätsfärbung. Spur 1, 8: Low Molecular Weight Längenstandard; Spur 2: T. fusca DSM 43792 mit PET-Fasern kultiviert; Spur 3: T. fusca DSM 43792 mit DET kultiviert; Spur 4: T. fusca DSM 43793 mit PET-Fasern kultiviert; Spur 5: T. fusca DSM 43793 mit DET kultiviert; Spur 6: T. fusca KW3 DSM 6013 mit PET-Fasern kultiviert; Spur 7: T. fusca KW3 DSM 6013 mit DET kultiviert. 86

Abbildung 34: Esteraseproduktion durch T. fusca KW3 mit DET (◊) und PET-Fasern () über einen Zeitraum von 13 Tagen im MSV-Medium. 87

Abbildung 35: Elutionsprofil der Enzymlösung während des zweiten Aufreinigungsschritts (Phenylsepharose, Säulenvolumen 25 ml, Puffer A: 20 mM Phosphatpuffer pH 8, Puffer B: 30% Isopropanol in 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die Esteraseaktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). 96

Abbildung 36: Elutionsprofil der Enzymlösung während des dritten Aufreinigungsschritts (DEAE-Sepharose, Säulenvolumen 54 ml, Puffer A: 20 mM Phosphatpuffer pH 8, Puffer B: 1 M NaCl in 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die Esteraseaktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). 96

Abbildung 37: Elutionsprofil der Enzymlösung während des vierten Aufreinigungsschritts (Octyl-Sepharose, Säulenvolumen 1 ml, Puffer A: 20 mM Phosphatpuffer pH 8, Puffer B: 30% Isopropanol in 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die Esteraseaktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). 97

Abbildung 38: Elutionsprofil der Enzymlösung während des fünften Aufreinigungsschritts (Sephadex 200, Säulenvolumen 110 ml, Puffer: 0,15 M NaCl in 20 mM Tris/HCl pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau) und die Esteraseaktivität (schwarz). 97

Abbildung 39: SDS-PAGE der Aufreinigung der TfCa aus T. fusca KW3. Spur 1: Enzymlösung nach der Dialyse; Spur 2: Enzymlösung nach der HIC 1; Spur 3: Enzymlösung nach der AIEX; Spur 4: Enzymlösung nach der HIC 2; Spur 5: Enzymlösung nach der SEC; Spur 6: Low Molecular Weight Längenstandard (Billig et al. 2010). 98

Abbildung 40: Elutionsprofil der TfCa während des ersten Aufreinigungsschritts (HisTrap, Säulenvolumen 10 ml, Puffer A: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl; pH 8,0, Puffer B: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250mM Imidazol, pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-NPB Aktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). 106

Abbildung 41: Elutionsprofil der TfCa während des zweiten Aufreinigungsschritts (Sephadex 200 prep grade, Säulenvolumen 320 ml, Puffer: 0,15 M NaCl, 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-NPB Aktivität (schwarz). 106

Abbildung 42: Elutionsprofil der TfCut2 während des ersten Aufreinigungsschritts (HisTrap, Säulenvolumen 10 ml, Puffer A: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl; pH 8,0, Puffer B: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-NPB Aktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). 107

Abbildung 43: Elutionsprofil der TfCut2 während des zweiten Aufreinigungsschritts (Sephadex 200 prep grade, Säulenvolumen 320 ml, Puffer: 0,15 M NaCl, 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-NPB Aktivität (schwarz). 107

Abbildung 44: SDS-PAGE der Aufreinigung der rekombinant produzierten TfCa in E. coli (A) und der rekombinant produzierten TfCut2 in E. coli (B). Spur M: Low Molecular Weight Längenstandard; Spur 1, 4: Rohenzymlösung nach Zellaufschluss; Spur 2, 5: Enzymlösung nach Ni-Affinitätschromatographie; Spur 3, 6: Enzymlösung nach SEC. 108

Abbildung 45: PhastGel der Bestimmung des isoelektrischen Punktes der TfCa. (linkes Gel PhastGel IEF 3-9, rechtes Gel PhastGel IEF 4-6,5) Spur 1: 26,7 ng TfCa; Spur 2: 66,7 ng TfCa; Spur 3: 133 ng TfCa; Spur 4: 26,7 ng TfCa; Spur 5: 53,4 ng TfCa; Spur 6: Kalibrierungskit für die pI Bestimmung, Breiter pI Bereich (pH 3-10, GE Healthcare). 113

Abbildung 46: Laufstrecken der Proteine des Roti®-Mark SDS Proteinstandards (Fa. Carl Roth GmbH) aufgetragen gegen den

Logarithmus ihres Molekulargewichtes. 114

XI

Abbildung 47: Esteraseaktivitäten der TfCa über einen Zeitraum von 7 Tagen bei Inkubation in unterschiedlichen pH-Werten von 4 bis 11 bestimmt mit p-NPB als Substrat. 115

Abbildung 48: Esteraseaktivitäten der TfCa nach 24 Stunden Inkubation in verschiedenen pH-Werten von 3 bis 11 bestimmt mit p-NPB als Substrat. 115

Abbildung 49: Esteraseaktivitäten der TfCa über einen Zeitraum von 7 Tagen bei Inkubation bei 40°C, 50°C und 55°C bestimmt mit p-NPB als Substrat (Billig et al. 2010). 116

Abbildung 50: Esteraseaktivitäten der TfCa nach 24 Stunden Inkubation bei 30°C, 40°C, 50°C und 55°C bestimmt mit p-NPB als Substrat. 116

Abbildung 51: Lineweaver-Burk Darstellung für die enzymkatalysierte Hydrolyse der CTR durch die TfCa. Mit Hilfe der doppeltreziproken graphischen Darstellung konnten die Geschwindigkeitskonstanten Vmax und Km bestimmt werden. 119

Abbildung 52: pH und Temperaturoptimum der TfCa beim Abbau von zyklischen PET-Trimeren, bestimmt per RP HPLC (Billig et al. 2010). 119

Abbildung 53: Gaschromatographische Analyse des Blindwerts (ohne Enzym) der Cutinhydrolyse. 120 Abbildung 54: Gaschromatographische Analyse des Ansatzes mit 1 U TfCa der Cutinhydrolyse. 120 Abbildung 55: Gaschromatographische Analyse des Ansatzes mit 2 U TfCa der Cutinhydrolyse. 121 Abbildung 56: Gaschromatographische Analyse des Ansatzes mit 4 U TfCa der Cutinhydrolyse. 121 Abbildung 57: PCL-Agarplatten nach 24 stündiger Inkubation mit TfCa (linkes Photo), mit dem Kulturüberstand des Suberin-

MSV-Mediums (mittleres Photo) und mit Kulturüberstand des Cutin-MSV-Mediums (rechtes Photo). 122 Abbildung 58: Lokalisation des Tfu_2427 Gens im Genom von T. fusca YX (Quelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 122 Abbildung 59: Proteinsequenz von Tfu_2427 aus T. fusca YX, die Aminosäuren des aktiven Zentrums und das GXSXG Motiv

sind gelb markiert. Die ersten 10 Aminosäuren am N-Terminus, anhand derer die Identifikation erfolgte, sind unterstrichen (Billig et al. 2010). 123

Abbildung 60: Proteinsequenz der TfCa aus T. fusca KW3, die Aminosäuren des aktiven Zentrums und das GXSXG Motiv sind gelb markiert, die identifizierten Unterschiede zu Tfu_2427 aus T. fusca YX sind rot markiert (Billig et al. 2010). 124

Abbildung 61: Alignment der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 (tfu), der Carboxylesterase Arth_3983 aus Arthrobacter FB24 (art), der Carboxylesterase SCO6127 aus Streptomyces coelicolor (sco), der putativen Carboxylesterase FRAAL0556 aus Frankia alni (fal) und der putativen p-Nitrobenzylesterase SACE_2933 aus Saccharopolyspora erythraea (sen) (Billig et al. 2010). 125

Abbildung 62: Tertiärstruktur der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3. Rot sind die α-Helices gekennzeichnet und gelb die β-Faltblattstrukturen. Die grünen Bereiche sind Sequenzen ohne eine spezielle Sekundärstruktur. Die drei blau gekennzeichneten Aminosäuren sind die katalytische Triade (Billig et al. 2010). 126

Abbildung 63: Ausschnitt aus der Tertiärstruktur der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3. Rot sind die α-Helices gekennzeichnet und gelb die β-Faltblattstrukturen. Die grünen Bereiche sind Sequenzen ohne eine spezielle Sekundärstruktur. Die drei blau gekennzeichneten Aminosäuren sind die katalytische Triade. 126

Abbildung 64: Homologie-Modelle der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 (a) verglichen mit verschiedenen PET-Cutinasen. Die Strukturen der Cutinasen aus H. insolens (b), F. solani sp. pisi (c), der Cutinasen Tfu_0882 (d) und Tfu_0883 (e) aus T. fusca KW3 und der Cutinase aus P. mendocina (f) sind dargestellt (Billig et al. 2010). 127

Abbildung 65: SDS-PAGE der für die Abbauuntersuchungen eingesetzten Hydrolasen, linkes Gel mit Aktivitätsfärbung, rechtes Gel Aktivitäts- und Coomassie-Färbung. Spur 1: Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3; Spur 2: rekombinante Cutinase 1 von T. fusca WSH03-11 (Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008); Spur 3: rekombinante Cutinase 2 von T. fusca WSH03-11 (Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008); Spur 4: rekombinante Cutinase von F. solani pisi (Chen et al. 2010); Spur 5: Cutinase aus Fusarium solani sp. pisi (Vertommen et al. 2005); Spur 6: Cutinase von Novozymes. Zum Vergleich die Kulturüberstände verschiedener MSV-Medien, Spur 7: Cutin-induzierte Hydrolase aus T. fusca KW3; Spur 8: Suberin-induzierte Hydrolase aus T. fusca KW3; St

1: Spectra™ Multicolor Broad Range Protein Ladder (Fermentas); St

2:

PageRulerTM

Plus Prestained Protein Ladder (Fermentas). 138 Abbildung 66: PCL Abbautest der für die Abbauuntersuchungen eingesetzten Hydrolasen (obere Reihe: Carboxylesterase

TfCa aus T. fusca KW3 (links), rekombinante Cutinase 1 von T. fusca WSH03-11 (Mitte, Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008), rekombinante Cutinase 2 von T. fusca WSH03-11 (rechts, Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008); mittlere Reihe: rekombinante Cutinase von F. solani pisi (links, Chen et al 2010), Cutinase aus F. solani sp. pisi (Mitte, Vertommen et al. 2005), Cutinase von Novozymes (rechts); untere Reihe : rekombinant produzierten Hydrolasen aus T. fusca KW3: Carboxylesterase TfCa (links), Cutinase TfCut1 (Mitte), Cutinase TfCut2 (rechts). 139

Abbildung 67: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit TfCa aus T. fusca KW3. 140 Abbildung 68: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11

von Chen et al. 2010 und Chen J et al. 2008. 140 Abbildung 69: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinase aus F. solani pisi von

Vertommen et al. 2005. 141 Abbildung 70: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinase aus F. solani pisi von Chen

et al. 2010. 141 Abbildung 71: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinasepräparation von

Novozymes. 142 Abbildung 72: Rasterelektronenmikroskopische Analyse der enzymatisch behandelten APET-Film Oberflächen:

Unbehandelte Kontrolle (A), Inkubation mit TfCa bei 50°C 74 h (B) und Inkubation mit Cutinase FsC bei 30°C 74 h (C). 144

Abbildung 73: Chromatogramm der HPLC Analyse des enzymatischen APET Abbaus durch die TfCa. 146

XII

Abbildung 74: MS-Spektren der Hydrolyseprodukte: TPA (m/z: 121,0; 164,9; 352,9), MHET (m/z: 120,9; 208,8; 440,9), BHET (m/z: 120,9; 252,9), EBT (m/z: 357,0) und EMT (m/z: 401,0). 147

Abbildung 75: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit TfCa aus T. fusca KW3. 148 Abbildung 76: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit der Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11

von Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008. 148 Abbildung 77: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit der Cutinase aus F. solani pisi von

Vertommen et al. 2005. 149 Abbildung 78: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit der Cutinase aus F. solani pisi von Chen

et al. 2010. 149 Abbildung 79: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit der Cutinasepräparation von Novozymes.

150 Abbildung 80: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit TfCa aus T. fusca KW3. 152 Abbildung 81: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase 1 aus T. fusca

WSH03-11 von Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008. 152 Abbildung 82: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase 2 aus T. fusca

WSH03-11 von Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008. 153 Abbildung 83: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit rekombinanter TfCut1. 153 Abbildung 84: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit rekombinanter TfCut2. 154 Abbildung 85: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase aus

F. solani pisi von Vertommen et al. 2005. 154 Abbildung 86: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase aus

F. solani pisi von Chen et al. 2010. 155 Abbildung 87: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase-Präparation

von Novozymes. 155 Abbildung 88: Effekt der rTfCa Konzentration auf die Hydrolyse von PET-Trimeren (Reaktionszeit 4 Stunden). 159 Abbildung 89: Effekt der rTfCut2 Konzentration auf die Hydrolyse von PET-Trimeren (Reaktionszeit 4 Stunden). 160 Abbildung 90: Effekt der Reaktionszeit auf die Hydrolyse von PET-Trimeren mit rTfCa. 161 Abbildung 91: Effekt der Reaktionszeit auf die Hydrolyse von PET-Trimeren mit rTfCut2. 161

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Vertreter der Actinomyceten-Gruppe (Madigan et al. 2009). 2 Tabelle 2: Hauptmonomere des Cutins: C16: Hexadecansäure, 16-Hydroxyhexadecansäure, Dihydroxyhexadecansäure; 5 C18: Octadeca-9-ensäure, 18-Hydroxyoctadeca-9-ensäure, 18-Hydroxy-cis-9,10-epoxyoctadecansäure, 9,10,18-

Trihydroxyoctadecansäure. (*Δ12 ungesättigte Analoga können auftreten; y = 8,7,6,oder 5; x+y = 13) (Kolattukudy 2002). 5

Tabelle 3: Struktur der Monomere Suberins: Aliphatische Monomere: 1-Alkanole; Alkansäuren; ω-Hydroxyalkansäuren; α,ω-Dialkansäuren; 9(10),ω-Dihydroxyalkansäure; 9,10-Dihydroxyalkansäure; 9,10,18-Trihydroxyalkansäure; 9,10-Dihydroxy-α,ω-Dialkansäure; 9,10-Epoxy-ω-Hydroxyalkansäure; 9,10-Epoxy-α,ω-Dialkansäure; Ferulasäure-Ester (mit 1-Alkanole); Glycerin. Aromatische Monomere: a) R1=R2=H, p-Cumarsäure; R1=OH, R2=H, Kaffeesäure; R1=OCH3, R2=H, Ferulasäure; R1=R2=OCH3, Sinapinsäure. b) R1=R2=H, p-Cumarylalkohol; R1=OCH3, R2=H, Coniferylalkohol; R1=R2=OCH3, Sinapylalkohol. c) R1=H, p-Cumaroyltyramin; R1=OCH3, Feruloyltyramin. (Bernards 2002). 6

Tabelle 4: Gegenüberstellung der prozentualen Anteile der typischen Cutin- und Suberin-Monomere. (Pollard et al. 2008). 10

Tabelle 5: Übersicht lipolytische Enzyme I, Esterasen (Gruppe II-VIII) mit ausgewählten Beispielen (Hausmann und Jaeger 2010). 18

Tabelle 6: Übersicht lipolytische Enzyme II, Lipasen (Grup. I.1-I.8) mit ausgewählten Beispielen (Hausmann und Jaeger 2010). 21

Tabelle 7: PET Biofunktionalisierung und analysierte Effekte (Zimmermann und Billig 2011). 33 Tabelle 8: Vergleich der PET-Hydrolasen von F. solani (Carvalho et al. 1998, Carvalho et al. 1999, Ronkvist et al. 2009),

T. insolens (Sandal et al. 1996, Ronkvist et al. 2009), P. mendocina (Bott et al. 2003, Ronkvist et al. 2009) und T. fusca (Kleeberg et al. 2005, Chen S et al. 2008). 39

Tabelle 9: Das Kalibrierungskit für die Größenausschlusschromatographie. 52 Tabelle 10: Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels. 70 Tabelle 11: Zeitlicher Ablauf der Silberfärbung. 71 Tabelle 12: Esteraseproduktion durch T. fusca KW3 im MSV-Medium mit verschiedenen Additiven über einen Zeitraum von

10 Tagen. 80 Tabelle 13: Bildung von PET-Hydrolasen bei Bakterien. 93 Tabelle 14: Bildung von PET-Hydrolasen bei Pilzen. 94 Tabelle 15: Aufreinigungstabelle der TfCa aus T. fusca KW3 (Billig et al. 2010). 98 Tabelle 16: Aufreinigungstabelle der TfH aus T. fusca DSM 43793 (Kleeberg et al. 2005). 99

XIII

Tabelle 17: Aufreinigungstabelle der Cutin-induzierten p-NPB Hydrolase aus T. fusca (Chen S et al. 2008). 100 Tabelle 18: Aufreinigungstabelle der Cutinase aus P. mendocina ATCC 55613 (Sebastian et al. 1988). 100 Tabelle 19: Aufreinigungstabelle der Cutinasen und p-NPP Hydrolase aus F. solani f. pisi (Purdy und Kolattukudy 1975a). 102 Tabelle 20: Aufreinigungstabelle der extrazellulären Cutinasen (Lin und Kolattukudy 1980a). 103 Tabelle 21: Aufreinigungstabelle der PET-Hydrolase aus P. citrinum (Liebminger et al. 2007). 104 Tabelle 22: Aufreinigungstabelle der rekombinanten TfCa. 108 Tabelle 23: Aufreinigungstabelle der rekombinanten TfCut2. 108 Tabelle 24: Aufreinigungstabelle der rekombinanten periplasmatischen (pp-rTfH) und zytoplasmatischen (zp-rTfH) TfH

(Dresler et al. 2006). 109 Tabelle 25: Expression der rekombinanten TfH in E. coli und B. megaterium (Yang et al. 2007). 109 Tabelle 26: Übersicht zur Affinitätsaufreinigung der His6-Tag rTfH produziert durch B. megaterium WH323-pYYBm9

gewachsen in einer LB-Batch Kultivierung und Hochzelldichten-Kultivierung (HZDK) mit A5 Medium. I:ohne Vorhbehandlung; II: 50°C für 10 min; III: 18 Stunden Dialyse bei 4°C (Yang et al. 2007). 110

Tabelle 27: Übersicht über die verbleibenden Esteraseaktivitäten nach der Inkubation der TfCa mit verschiedenen Inhibitoren. 117

Tabelle 28: Kinetische Parameter der Hydrolyse von p-NP-Estern und PET-Trimeren durch die TfCa aus T. fusca KW3. 118 Tabelle 29: Identifizierte N-terminale Sequenz der TfCa aus T. fusca KW3. 122 Tabelle 30: Vergleich der Eigenschaften der TfCa mit Cutinasen aus T. fusca. 128 Tabelle 31: Vergleich der PET-Hydrolasen aus F. solani FsC (Carvalho et al. 1998, Carvalho et al. 1999, Ronkvist et al. 2009),

T. insolens HiC (Sandal et al. 1996, Ronkvist et al. 2009), P. mendocina PmC (Bott et al. 2003, Ronkvist et al. 2009), T. fusca TfH/Cutinase 2 (Kleeberg et al. 2005, Chen S et al. 2008, Chen J et al. 2008) und TfCa (Zimmermann und Billig 2011). 133

Tabelle 32: Kinetische Parameter Km und Vmax bestimmt für verschiedene p-NP Ester für die Hydrolasen TfCa, TfH 1/2 (Chen et al. 2010), PmC

a (Sebastian et al. 1988), PmC

b (Gray et al. 1995), FsC (Purdy und Kolattukudy 1973), FsC 1, FsC 2 und

FsE (Purdy und Kolattukudy 1975b). Die geringsten Km Werte je Enzym sind hervorgehoben, ebenso die höchsten Vmax Werte. 137

Tabelle 33: Vergleich der freigesetzten Abbauprodukte der PET-Hydrolasen mit APET-Film. 142 Tabelle 34: Vergleich der freigesetzten Abbauprodukte der PET-Hydrolasen mit PET-Fasern. 150 Tabelle 35: Vergleich der freigesetzten Abbauprodukte der PET-Hydrolasen mit PET-Trimeren. 156 Tabelle 36: Vergleich der Abbauprodukte der PET Hydrolasen mit den drei PET Substraten. Die beiden Hauptprodukte des

Enzyms sind blau unterlegt. 158 Tabelle 37: Proteinkonzentration der eingesetzten Enzyme und die dazugehörigen p-NPB-Aktivitäten in den Ansätzen des

Abbauversuchs. 159

XIV

Einheiten

% Prozent

°C Grad Celsius

µg Mikrogramm

µm Mikrometer

bp Basenpaar

cm Zentimeter

cm2 Quadratzentimeter

d Tag

g/L Gramm / Liter

g/ml Gramm / Milliliter

kDa Kilodalton

LU/ml Lipase Units / Milliliter

m/min Meter / Minute

mg Milligramm

mg/ml Milligramm / Milliliter

mm Millimeter

mM Millimolar

nm Nanometer

S Svendberg

U/ml Units / Milliliter

Abkürzungen

Abkürzungen, die dem allgemeinen deutschen Sprachgebrauch entsprechen, werden nicht

aufgeführt.

2D-Elektrophorese 2-Dimensionale Elektrophorese

3PET Bis(Benzoyloxyethyl)terephthalat

AFM Atomkraftmikroskopie

AIEX Anionenaustauschchromatographie

APET amorphes Polyethylenterephthalat

AS Aminosäure

BEB Ethylenglycol-dibenzylester

XV

BETEB Bis(Benzoyloxyethyl)terephthalat

BHET Bis(2-Hydroxyethylterephthalat)

BHPT Bis(3-Hydroxypropylterephthalat)

BTA Copolyester aus 1,4-Butanediol, Dimethylterephthalat und

Adipinsäure

C. antarctica Candida antarctica

C. cladosporioides Cladosporium cladosporioides

CIEX Kationenaustauschchromatographie

CTR Cyclo-tris-Ethylenterephthalat

DEPA N,N-Diethyl-2-Phenylacetamid

DET Diethylterephthalat

DMSO Dimethylsulfoxid

DMT Dimethylterephthalat

DNA Deoxyribonukleinsäure

DP Diethyl-p-phthalat

DSC Differentialrasterkalorimetrie

DTT Dithiothreitol

EBT 1,2-Ethylen-bis-Terephthalat

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EMT 1,2-Ethylen-mono-Terephthalat-mono(2-Hydroxyethylterephthalat)

ESCA Elektronenspektroskopie für chemische Analyse

ESEM Umgebungsrasterelektronenmikroskopie

et al. und andere (lat.)

ETE Diethylterephthalat

F. solani Fusarium solani

FsC Fusarium solani Cutinase

FTIR Fourier-Transformations-Infrarotspektrometrie

GC Gaschromatographie

GC-Gehalt Guanin-Cytosin-Gehalt

GC-MS Gaschromatographie-Massenspektrometrie

GPET Polyethylenterephthalat Granulat

gram (-) gram negativ

gram (+) gram positiv

G. stearothermophilus Geobacillus stearothermophilus

HIC Hydrophobe Interaktionschromatographie

XVI

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

HTA Hydroxyterephthalat

K/S Verhältnis Farbintensitätsverhältnis, bestimmt mit der Kubelka-Munk Gleichung

LB-Medium Lysogenie Lösung (lysogeny broth)

LC-MS Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie

LC-MS/MS Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie/

Massenspektrometrie

MG Molekulargewicht

MHET Mono(2-Hydroxyethyl)Terephthalat

MHPT Mono(3-Hydroxypropyl)Terephthalat

mRNA Boten-Ribonukleinsäure

MSTFA N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoracetamid

MSV-Medium Mineralsalz-Spurenelemente-Vitamin Medium

NaOH Natriumhydroxid

OPET höher kristallines biaxial orientiertes Polyethylenterephthalat

P. mendocina Pseudomonas mendocina

PBT 1,2-Propylen-bis-Terephthalat

PCL Poly-ε-caprolacton

PET Dimer Bis-(p-Methylbenzoesäure)Ethylenglycolester

PET Trimer Bis-(Benzoyloxyethyl)Terephthalat

PET Polyethylenterephthalat

PET-B Polyethylenterephthalat-Pellets

p-NPA para-Nitrophenylacetat

p-NPB para-Nitrophenylbutyrat

p-NPC para-Nitrophenylcaprylat

p-NPP para-Nitrophenylpalmitat

PmC Pseudomonas mendocina Cutinase

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

PTT Dimer Cyclo-Di-Trimethylenterephthalat

PTT Polytrimethylenterephthalat

PVDF Polyvinylidenfluorid

rDNA ribosomale Deoxyribonukleinsäure

RP-HPLC Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Rt Retentionszeit

SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Elektrophorese

XVII

SEC Größenausschlusschromatographie

SeL Streptomyces exfoliates Lipase

SEM Rasterelektronenmikroskopie

T Referenzstamm

T. fusca Thermobifida fusca

T. insolens Thermomyces insolens

T. lanuginosus Thermomyces lanuginosus

Td Denaturierungstemperatur

TDOC Natrium-Taurodeoxycholat

TFA Tetrahyrofuran

TfCa Thermobifida fusca Carboxylesterase

TfCut Thermobifida fusca Cutinase

TfH Thermobifida fusca Hydrolase

Tfu Thermobifida fusca

Tg Glasübergangstemperatur

TiC Thermomyces insolens Cutinase

Tm Schmelztemperatur

TPA Terephthalsäure

TPCK Tosyl-L-Phenylalanin-Chloromethylketon

UV Ultraviolett

XPS Röntgenphotoelektronenspektroskopie

Aminosäuren:

A Ala Alanin I Ile Isoleucin R Arg Arginin

C Cys Cystein K Lys Lysin S Ser Serin

D Asp Asparaginsäure L Leu Leucin T Thr Threonin

E Glu Glutaminsäure M Met Methionin V Val Valin

F Phe Phenylalanin N Asn Asparagin W Trp Trytophan

G Gly Glycin P Pro Prolin Y Tyr Tyrosin

H His Histidin Q Gln Glutamin

1 Einführung

1 Einführung

1.1 Actinomyceten

1.1.1 Klassifizierung

Actinomyceten sind filamentöse, Sporen bildende gram (+) Bodenbakterien. Die Angehörigen dieser

Gruppe weisen einen hohen GC-Gehalt von 63-78% auf. Actinomyceten gehören zur Klasse der

Actinobakterien, zu denen auch die Corynebakterien, Arthrobacter, Brevibakterien,

Propionibakterien, Eubakterien, Bifidobakterien, Acetobakterien und Thermoanaerobacter zählen.

Die Actinomyceten werden aufgrund ihrer Eigenschaften in 8 Gruppen unterteilt (Tabelle 1).

Abbildung 1: Phylogenetischer Stammbaum des Lebens auf Grundlage der 16S rDNA Untersuchungen. Die Gruppe der Actinobakterien ist im linken oberen Bereich angeordnet (www.lisci.kitasato-u.ac.jp/me/images/phylogenetic.jpg).

Actinobacteria

http://www.lisci.kitasato-u.ac.jp/me/images/phylogenetic.jpg

2 Einführung

Tabelle 1: Vertreter der Actinomyceten-Gruppe (Madigan et al. 2009).

Bezeichnung, Eigenschaften und Beispiele GC-Gehalt

(DNA)

Actinomyceten: nicht säurefest, fakultativ aerob, keine Myzelbildung, verzweigt;

Actinomyces (anaerob bis fakultativ aerob, filamentöse Mikrokolonien, Filamente jedoch

transitorisch, fragmentieren zu coryneformen Zellen, können human-/tierpathogen sein,

kommen in Mundhöhle vor),

Arachnia, Bacterionema, Rothia, Agromyces

57-69

Mycobakterien: säurefest, übergangsweise Filamente;

Mycobacterium (pathogene Saprophyten, obligat aerob, wächst langsam, Lipidgehalt der

Zellen und Zellwände hoch, enthält Wachse und Mycolsäure; verursacht Tuberkulose,

Lepra, Granulome, Vogeltuberkulose, auch Bodenmikroben)

62-70

Stickstofffixierende Actinomyceten: Symbionten von Pflanzen, bilden echte Mycelien;

Frankia (bilden Knöllchen an Pflanzenwurzeln, wahrscheinlich mikroaerophil, wächst

langsam, fixiert Stickstoff)

67-72

Actinoplanes: bilden echte Mycelien, bildet Sporen, die in Sporangien liegen

Actinoplanes, Streptosporangium

69-71

Dermatophilus-Gruppe: bilden große Mengen beweglicher, kokkoider Elemente,

Luftmycel fehlt, gelegentlich verantwortlich für Infektionen der Oberhaut (Epidermis)

Dermatophilus, Geodermatophilus

56-75

Nocardien: Mycelfäden brechen häufig unter Bildung kokkoider oder länglicher

Elemente auseinander, gelegentlich Bildung von Luftsporen, manchmal säurefest,

Lipidgehalt der Zellen und Zellwände sehr hoch

Nocardia: verbreiteter Bodenorganismus, obligat aerob, viele

Kohlenwasserstoffverwerter

Rhodococcus: Bodensaprophyten, verbreitet im Darm verschiedener Insekten, verwerten

Kohlenwasserstoffe

61-72

59-69

Streptomyceten: Mycel bleibt intakt, üppiges Luftmycel und lange Sporenketten

Streptomyces: fast 500 gültig beschriebene Arten, viele bilden Antibiotika

Andere Gattungen (morphologisch unterschieden): Streptoverticillium, Sporichthya,

Kitasatoa, Chainia

69-75

67-73

Micromonospora-Gruppe: Mycel intakt, Sporen werden einzeln, in Paaren oder kurzen

Ketten gebildet, einige thermophil, Saprophyten des Erdbodens und verrottender

Pflanzenmasse, eine Art bildet Endosporen

Micromonospora, Microbispora, Thermobispora, Thermoactinomyces,

Thermomonospora

54-79

1.1.2 Thermobifida (Thermomonospora) fusca

Die Kolonien von T. fusca sind farblos, das gebildete Luftmycel hingegen weiß und scharf umgrenzt.

Die Lufthyphen sind geradlinig oder gewunden, einfach oder verzweigt und bilden einzelne

akropetale Luftsporen. T. fusca ist nicht säurefest, eurythermal thermophil und fakultativ anaerob

3 Einführung

(Hensen 1957). Das Temperaturoptimum für das Wachstum liegt bei 45-50°C und der optimale pH

von 7,5 bis 11. T. fusca ist Katalase stark positiv, Oxidase negativ, die Säureproduktion aus D-Glucose

ist schwach positiv und die Nitratreduktion negativ. Der Mikroorganismus kann Casein, Gelatine,

Kreatin und Elastin proteolytisch hydrolysieren. Es erfolgt ebenfalls eine Hydrolyse von Stärke, Agar,

Pektin, Cellulose, Xylan, Arbutin und Aesculin, hingegen keine von Chitin, Xanthin, Hypoxanthin,

Guanin und Tyrosin. T. fusca kann die Kohlenhydrate D-Galaktose und Laktose verwerten, D-Ribose

und D-Xylose hingegen nicht (McCarthy et al. 1984).

Phylogenetische Untersuchungen auf Grundlage der 16S rRNA zeigten keine enge

verwandtschaftliche Verbindung zu den anderen Gruppen des Actionmyceten-Klusters (Embley et al.

1994).

Abbildung 2: T. fusca KW3 mit 1000facher Vergrößerung (links, Färbung mit Safranin) und Makroskopisches Aussehen nach Wachstum auf Czapek-Medium (rechts).

Aufgrund der vielfältigen hydrolytischen Aktivität von T. fusca wurden in der Vergangenheit bereits

verschiedenste Untersuchungen zur Identifikation und Aufreinigung von hydrolytischen Enzymen

durchgeführt. Dabei erfolgte unter anderem eine Charakterisierung der Polygalakturonat-Lyase (EC

4.2.2.2) (Stutzenberger 1987), des Xylan-abbauenden Systems (Endoxylanase, α-

Arabinofuranosidase, β-Xylosidase) (Bachmann et al. 1991), einer Maltotriose produzierende α-

Amylase (Busch et al. 1997), einer Acetylxylanesterase (Yang et al. 2008) und von Cutinasen

(Kleeberg et al. 2005, Cheng et al. 2008).

Durch die lückenlose Sequenzierung der genomischen DNA von T. fusca (Lykidis et al. 2007) können

nun mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden weitere interessante Proteine identifiziert und

charakterisiert werden. Die Proteom- und Transkriptom-Analyse der extrazellulären Proteine und des

mRNA Levels mittels 2D-Elektrophorese und LC-MS/MS erfolgte ebenfalls für einen T. fusca Stamm

nach Wachstum auf Cellubiose- und Glucose-haltigem Medium (Chen et al. 2007).

4 Einführung

T. fusca KW3 (DSM 6013) wurde aus Kompost isoliert und es erfolgten bereits Studien zur

thermophilen Xylanase-Produktion mit diesem Stamm (Röthlisberger et al. 1992, Casimir-Schenkel

1992). Das Neuisolat unterscheidet sich durch eine Resistenz gegenüber Kristallviolett, einer oberen

Wachstumsgrenze bei 60°C und einer Alkalitoleranz bis pH 11.

Ein besonderes Interesse bei der Suche nach technisch anwendbaren Enzymen gilt dem Abbau der

Biopolymere Cutin und Suberin, von Pflanzen gebildete natürliche Polyester aus aliphatischen und

aromatischen Regionen. Cutin ist ein Bestandteil der Cuticula, welche die Barriere zwischen der

Pflanze und ihrer Umwelt bildet. Die Cuticula verhindert das Austrocknen der Pflanze, reguliert den

Gasaustausch und schützt vor mechanischen und Strahlungsschäden ebenso wie vor

Pflanzenfressern und pathogenen mikrobiellen Attacken. Suberin hingegen, befindlich unter

Anderem in Korkzellen und im Periderm (äußere Barriere der Rinde und der unterirdischen

Pflanzenteile wie Wurzeln und Knollen), dient als Diffusionsbarriere (Nawrath 2002, Kolattukudy

2002).

T. fusca produziert ebenfalls diese interessanten hydrolytischen Enzyme, auf deren Aktivität und

Bedeutung in den folgenden Kapiteln näher eingegangen wird (Fett et al. 1999, Kleeberg et al. 2005,

Cheng et al. 2008).

1.2 Biopolyester Cutin und Suberin

1.2.1 Bestandteile des Cutins

Die Bezeichnung Cutin wurde von Cutose abgeleitet, was die ursprüngliche Bezeichnung für eine

Gewebsschicht der Epidermis von Blättern war, welche eine Resistenz gegenüber starken Säuren

vorwies. Cutin wurde sowohl in den Blättern von Land-, als auch von Wasserpflanzen gefunden, aber

ebenfalls in Stengeln, Blattstielen, Blütenteilen, Früchten, einige Samenschalen und im Inneren von

Zitronen. Die Stärke der Cutinschicht variiert je nach Spezies und Pflanzenteil. In den Blättern von

höheren Pflanzen beträgt die Dicke der Cutinschicht zwischen 0,5 und 14 µm mit < 20 bis 600 µg

Cutin pro cm2 Oberfläche. In manchen Früchten mit hochentwickelter Cuticula beträgt der

Cutingehalt bis zu 1,5 mg pro cm2. Bei niederen Pflanzen ist die Cutinschicht sehr dünn (~0,1 µm)

(Kolattukudy 2002).

5 Einführung

Abbildung 3: Schematische Darstellung der Einlagerung von Cutin in einem Blatt. Die Stärke, Struktur und Zusammen-setzung der einzelnen Schichten der Cuticula können stark variieren abhängig von Spezies, Organen und Entwicklungs-phase. Die epicuticulären Wachse (EW) bedecken die Cuticula (C) komplett, die aus Cutin und darin eingelagerten intracuticulären Wachsen besteht. Die cuticulären Schichten (CL) bestehen höchstwahrscheinlich aus Cutin und Polysacchariden der Zellwand, könnten aber vielleicht auch intracuticuläre Wachse enthalten. (PW: primäre Zellwand, Cy: Cytoplasma, V: Vakuole) (Pollard et al. 2008).

Typische Monomere des Cutins sind C16 und C18 Fettsäuren, welche auch ein- oder mehrfach

hydroxyliert, ungesättigt oder epoxyliert sein können (Kolattukudy 2002).

Tabelle 2: Hauptmonomere des Cutins: C16: Hexadecansäure, 16-Hydroxyhexadecansäure, Dihydroxyhexadecansäure; C18: Octadeca-9-ensäure, 18-Hydroxyoctadeca-9-ensäure, 18-Hydroxy-cis-9,10-epoxyoctadecansäure, 9,10,18-

Trihydroxyoctadecansäure. (*Δ12 ungesättigte Analoga können auftreten; y = 8,7,6,oder 5; x+y = 13) (Kolattukudy 2002).

C16-Familie C18-Familie *

COOH

OH COOH

COOHOH

OH

x

y

COOH

OH COOH

COOHOOH

OH COOH

OH

OH

1.2.2 Bestandteile des Suberins

Suberin ist abgleitet von dem lateinischen Wort suber, was Kork bedeutet. Der Begriff Suberin wurde

bereits vor 200 Jahren von Michel Eugène Chevreul (1786-1889) verwendet, um den im Kork

enthaltenen wasserunlöslichen Bestandteil zu beschreiben. Dieses mehrteilige Material besteht aus

verschiedenen polymeren Domänen, die kovalent an die hoch komplexe Zellwand gebunden sind.

6 Einführung

Abbildung 4: Schematische Darstellung der Einlagerung von Suberin in der Endodermis einer Wurzel. Abgebildet sind zwei angrenzende Zellen mit Mittellamelle (ML) und Pektinschicht zwischen ihren primären Zellwänden (PW). Die Suberinlamellen befinden (SL) sich auf der Innenseite der primären Zellwand. (SW: sekundäre Zellwand, PM: Plasmamembran, Cy: Cytoplasma, V: Vakuole) (Pollard et al. 2008).

Tabelle 3: Struktur der Monomere Suberins: Aliphatische Monomere: 1-Alkanole; Alkansäuren; ω-Hydroxyalkansäuren; α,ω-Dialkansäuren; 9(10),ω-Dihydroxyalkansäure; 9,10-Dihydroxyalkansäure; 9,10,18-Trihydroxyalkansäure; 9,10-

Dihydroxy-α,ω-Dialkansäure; 9,10-Epoxy-ω-Hydroxyalkansäure; 9,10-Epoxy-α,ω-Dialkansäure; Ferulasäure-Ester (mit 1-Alkanole); Glycerin. Aromatische Monomere: a) R1=R2=H, p-Cumarsäure; R1=OH, R2=H, Kaffeesäure; R1=OCH3, R2=H,

Ferulasäure; R1=R2=OCH3, Sinapinsäure. b) R1=R2=H, p-Cumarylalkohol; R1=OCH3, R2=H, Coniferylalkohol; R1=R2=OCH3, Sinapylalkohol. c) R1=H, p-Cumaroyltyramin; R1=OCH3, Feruloyltyramin. (Bernards 2002).

Aliphatische Monomere Aromatische Monomere OH

COOH

COOHOH

COOHHOOC

COOHOH

OH

COOH

OH

OH

COOH

OH

OH

HOOC

COOH

OOH

COOHO

HOOC

OO

OH

OMe

OHOH

OH

a)

OHO

OH

R1R2

b)

CH2OH

OH

R1R2

c) OH

R1R2

O N

OH

H

7 Einführung

Suberin besteht aus polyaliphatischen Bereichen mit langkettigen Hydroxyfettsäuren und

Dicarboxylsäuren und geringeren Mengen an sehr langen Fettsäuren und Fettalkoholen. Desweiteren

gibt es noch polyaromatische Domänen mit verschiedenen aromatischen Carbonsäuren und

Alkoholen, deren genaue Struktur bisher noch nicht eindeutig bekannt ist. Diese Domänen können

auch aufgrund ihres Aussehens unterschieden werden. Die aromatischen Domänen zeigen eine

dunklere Färbung gegenüber den aliphatischen Domänen. (Bernards 2002, Kolattukudy 2002).

1.2.3 Struktur der Biopolymere

Bisher wurden die verschiedensten Modelle zur möglichen Struktur von Cutin und Suberin

veröffentlicht, allerdings gibt es bisher keine genaue Strukturaufklärung. Die nachfolgenden

Ausführungen verdeutlichen die Probleme der Strukturidentifikation aufgrund der Vielzahl an

Monomeren und möglichen Bindungsstellen.

Abbildung 5: Modell der möglichen Bindungsstrukturen im Biopolyester Cutin (Kolattukudy 2002).

Da Cutin ein unlösliches und kompaktes Polymer ist, gibt es nur wenige Möglichkeiten für eine

Strukturanalyse. Bei einer Transmissions-Fourier-Transformations-Infrarot-Spektrum Analyse (FTIR)

konnten Absorptionen in Bereichen für Hydroxylgruppen (-OH), für aliphatische C-H Bindungen, für

Carbonylester-Bindungen (C=O) und C-O Ester identifiziert werden. Des Weiteren wurden

verschiedene Analysen zur Identifikation von freien funktionellen Gruppen im Polymer durchgeführt.

8 Einführung

Als Schlussfolgerung aus den durchgeführten Untersuchungen liegen die primären Alkoholgruppen

im Cutin als Esterbindungen vor, das bedeutet dass das Polymer, ein Polyester, aus hauptsächlich

primären Alkoholesterverbindungen besteht. Etwa die Hälfte der sekundären Alkohol-Gruppen ist

ebenfalls verestert, was bedeutet, dass Verzweigungen und/oder Quervernetzungen vorliegen.

Basierend auf diesem Wissen wurde eine Modelstruktur des Cutins erstellt (Abbildung 5).

Weitere Analysen ergaben, dass Cutin ein moderat bewegliches Geflecht darstellt mit

Bewegungseinschränkungen wahrscheinlich auf Grund der quervernetzten Seitenketten. Cutin

besteht größtenteils aus mittelständigen sekundären Hydroxylgruppen, die dadurch eine große

Bedeutung bei der Quervernetzung des Polymers spielen. Für weitere Untersuchungen der Struktur

des Cutins wurden auch enzymatisch freigesetzte Cutin-Oligomere analysiert. Dabei erfolgte der

Nachweis der vorausgesagten sekundären Alkoholester der mittelständigen 10-Hydroxy-Gruppe der

Hauptkomponente des Cutins, der 10,16-Dihydroxyhexadacansäure (Kolattukudy 2002).

Bisher ist nicht bekannt, ob Cutin als eigenständiges Polymer-Molekül mit unbekanntem

Molekulargewicht existiert, verankert an die Zellwand an verschiedenen Stellen oder ob Cutin nur ein

hoch verzweigter Bestandteil ist (Pollard et al. 2008).

Eine Besonderheit in der Cutinstruktur stellt ein nichtabbaubarer Kern, der nach hydrolytischen

Behandlungen zurück bleibt, dar. Er besteht aus einem dreidimensionalen Netzwerk aus Polyethylen-

Molekülen mit Doppelbindungen und freien Carboxyl-Gruppen, und enthält zusätzliche

Etherbindungen (Kolattukudy 2002). Diese Struktur, bestehend aus aliphatischen Bestandteilen, wird

als Cutan bezeichnet und gewonnen durch Delipidation und Depolymerisation der Esterbindungen

der Cuticula. Cutan kann aber auch Zellwand-Kohlenhydrate und Aromaten enthalten. Dieses

Polymer besteht aus C-O- und C-C- verbundenen aliphatischen Ketten. Die Linolensäure scheint im

Vergleich zu Palmitin- oder Ölsäure das bevorzugte Substrat für die Biosynthese des Cutans zu sein.

Für das allgemeine Verständnis des Cutins ist es wichtig, auch die Struktur und Besonderheiten des

Cutans zu verstehen. Ist dieses Polymer mit Cutin verbunden oder ist es ein Bestandteil davon

(Pollard et al. 2008)?

Bei dem Biopolyester Suberin ist aufgrund der beiden vorherrschenden Domänen eine Struktur-

identifikation noch schwieriger. Eine besondere Rolle im Suberin hat das Glycerin: zum Einen dient es

als Verbindungsstruktur zwischen den Acyl-Monomeren und bewahrt somit ihre lineare Anordnung

und zum anderen ist es auch die Vernetzungsstruktur der beiden Domänen.

Die polyaromatische Schicht ist kovalent mit Kohlenhydraten der primären Zellwand verbunden

(Abbildung 6). Diese Bindung erfolgt nicht ausschließlich über Esterbindungen. Das Glycerin dient

hier ebenfalls als Verbindungsstruktur zwischen den beiden Schichten des Suberins. Die Darstellung

zeigt einen Ausschnitt einer suberinisierten Kartoffelzelle bestehend aus 2 aliphatischen Domänen

(heller Bereich) und einer aromatischen Domäne (dunkler Bereich), welche kovalent an die primäre

9 Einführung

Zellwand gebunden sind. Die hervorgehobenen aromatischen Monomere konnten mittels

verschiedener analytischer Methoden nachgewiesen werden. Die eingelagerten Wachse und extrem

langkettigen Fettsäuren in der Suberinschicht sind in der Abbildung nicht berücksichtigt (Bernards

2002).

Primäre Zellwand Suberin-Lamellen

Abbildung 6: Modell der hypotetischen Struktur der Suberinschicht der Kartoffel. P: phenolisches Monomer, C:

Kohlenhydrat, S: Suberin (aromatisch oder aliphatisch) (Bernards 2002).

Ein bedeutender Unterschied zwischen Suberin und Cutin ist, dass Suberin sich auf der inneren Seite

der primären Zellwände befindet.

Das aliphatische Monomerenprofil von Suberin ist ähnlich dem von Cutin, es gibt aber auch

Unterschiede im prozentualen Anteil und der Kettenlänge der Monomere (Tabelle 4). Abgesehen von

den Fettsäuren, ω-Hydroxy-Fettsäuren und Glycerin, besteht Suberin zusätzlich auch aus hohen

Mengen von α,ω-Dicarbonsäuren, Hydroxyzimtsäuren (besonders Ferulasäure) und Fettalkoholen.

Unterschiedlich ist auch, dass in Suberin eine große Menge an gesättigten Aliphaten gefunden

wurden mit einer Kettenlänge >C20. Es wurden ebenfalls Esterbindungen zwischen ω-Hydroxy-

Fettsäuren und zwischen ω-Hydroxy-Fettsäuren und α,ω-Dicarbonsäuren oder Ferulasäure

nachgewiesen (Pollard et al. 2008).

10 Einführung

Tabelle 4: Gegenüberstellung der prozentualen Anteile der typischen Cutin- und Suberin-Monomere. (Pollard et al. 2008).

Monomertyp Cutin Suberin Unsubstituierte Fettsäure

COOH

1-12% C16:0, C18:0, C18:1, C18:2

1-10% C18:0 bis C24:0

ω-Hydroxyfettsäuren COOHOH

1-32% C16:0, C18:1, C18:2

11-43% C18:1, C16:0 bis C26:0

α,ω-Dicarbonsäuren

COOHHOOC

Normal <5% aber >50% in Arabidopsis C16;0, C18:0, C18:1, C18:2

24-45% C18:1, C18:2, C16:0 bis C26:0

Mittelständige funktionelle Gruppen Epoxy-Fettsäuren

COOHO

Polyhydroxy-Fettsäuren

COOHOH

OH

Polyhydroxy-α,ω-Dicarbonsäuren

COOH

OH

OH

HOOC

0-34% C18:0 (9,10-epoxy), C18:1 (9,10-epoxy) 16-92% C16:0 (10,16-dihydroxy), C18:0 (9,10,18-trihydroxy) Spuren

0-30% C18:1 (9,10-epoxy-18-hydroxy), C18:0 (9,10-epoxy-1,18-disäure) 0-2% C18:0 (9,10,18-trihydroxy) 0-8% C18:0 (9,10-dihydroxy)

Fettalkohole 1-Alkanole und 1-Alkenole

OH

α,ω-Alkandiole und α,ω-Alkendiole OHOH

0-8% C16:0, C18:1 0-5% C18:1

1-6% C18:0 bis C22:0 0-3% C22:0

Glycerin

OHOH

OH

1-14%

14-26%

Phenole OHO

OH

OMe

0-1% Ferulasäure

0-10% Ferulasäure, geringere Mengen von Cumarsäure, Sinapinsäure und Kaffeesäure

Bei ersten Untersuchungen zur Aufklärung der Bindungen in Suberinpolymeren wurden lineare

Dimere der ω-Hydroxy-Fettsäuren verestert mit α,ω-Dicarbonsäuren und quervernetzt mit ω-

Hydroxy-Fettsäuren nachgewiesen. Glycerin konnte in verschiedenen Bindungsstrukturen detektiert

werden: verestert mit ω-Hydroxy-Fettsäuren oder α,ω-Dicarbonsäuren, verestert in beiden

Positionen mit α,ω-Dicarbonsäuren oder als Verbinder zwischen zwei α,ω-Dicarbonsäuren. Ebenfalls

11 Einführung

identifiziert wurde ein trimerer Diester des Glycerins verbunden mit einer ω-Hydroxy-Fettsäure und

Ferulasäure. Damit wurde nachgewiesen, dass die Ferulasäure kovalent an die aliphatische Suberin-

Domäne gebunden ist.

Schlussfolgerungen der Studien sind, dass Suberin langkettige α,ω-Dicarbonsäuren, an beiden Enden

mit Glycerin verestert, als Hauptbestandteil des Polymers enthält. Vom Glycerin aus sind 2- und 3-

dimensionale Esterbindungen zu α,ω-Dicarbonsäuren und ω-Hydroxy-Fettsäuren ausgebildet. Am

Rand des Glycerin-basierenden Polymers ist die Ferulasäure an die aliphatische Domäne als

polyaromatische Domäne gebunden und diese ist wiederum gebunden an die

Zellwandkohlenhydrate (Franke et al. 2007).

Mit 2-dimensionalen Kugel-Stab-Modellen werden mögliche Monomerverbindungen lokaler

Polyesterdomänenstrukturen dargestellt (Abbildung 7 b-d). Nur mittig stehende Hydroxyl-Gruppen

wurden in die Betrachtung einbezogen und andere mittelständige funktionelle Gruppen wurden

nicht berücksichtigt, ebenso wie mögliche Nicht-Ester-Verbindungen und Veresterungen mit den

Zellwänden. Es ist bisher nicht bekannt, ob solche klar definierten Domänen aus Hydroxyfettsäure-,

α,ω-Dicarbonsäure- und Glycerin-Monomeren gebildet werden oder ob die Strukturen vermischt

vorliegen (Pollard et al. 2008).

Abbildung 7: Darstellung der möglichen Verbindungen der Monomere der Biopolyester Cutin und Suberin. a) Hauptsächlich treten dabei primäre Esterbindungen auf (roter Pfeil), wodurch lange Ketten gebildet werden. Die sekundären Esterbindungen (blauer Pfeil) stellen zusätzliche Verzweigungspunkte dar. b) Anordnung der Fettsäure- und ω-Hydroxyfettsäure-Monomere unter Bildung eines Dendrimers. c) Anordnung der α,ω-Dicarbonsäure- (DCS) und Glycerin-Monomere unter Bildung einer Dendrimer Struktur, angeordnet um freie OH Gruppen um eine Bindung an einige Glycerin Monomere zu ermöglichen. d) Anordnung der DCS- und Glycerin-Monomere unter Bildung einer quervernetzten Domäne. (Pollard et al. 2008).

d)

c)

a)

b)

Fettsäure

ω-Hydroxyfettsäure

Substituierte ω-Hydroxyfettsäure

Dicarboxylsäure

-OH

Glycerin

-COOH

Ester

12 Einführung

In den letzten Jahren wurden ebenfalls Studien zur synthetischen Herstellung von Cutin durchgeführt

und die erhaltenen Polymere mit dem natürlichen Biopolyester verglichen. Die gebildeten Strukturen

der Hauptkomponenten stimmten sehr gut überein (Benίtez et al. 2004). Mittlerweile werden auch

die Enzyme des Cutin und Suberin Biosyntheseweges als interessante Biokatalysatoren für die

Produktion von Chemikalien und Polymeren studiert (Li et al. 2009).

1.3 Hydrolasen

1.3.1 Struktur und katalytischer Mechanismus

Die Enzymklasse der Hydrolasen ist eine große Gruppe an strukturell ähnlichen Enzymen mit

verschiedensten katalytischen Funktionen. Diese Enzyme katalysieren unter Einbau eines

Wassermoleküls die reversible Spaltung von Biomolekülen (Hydrolyse), aber auch unter Abspaltung

eines Wassermoleküls die Synthese dieser Strukturen. Die Gemeinsamkeit dieser Klasse ist die α/β

Hydrolase Faltungsstruktur, die aus 8 meist parallel angeordneten β-Faltblättern (β1-β8) und auf

beiden Seiten umgebende stabilisierende α-Helices (αA-αF) aufgebaut ist. Eine gewisse Variabilität in

der Anzahl der Strukturen ist bei den verschiedenen hydrolytischen Enzymen identifiziert worden,

allerdings ist die zentrale Anordnung und Form des aktiven Zentrums als definierte Bindungstasche

bei allen Enzymen gleich. Diese dreidimensionale Struktur der Hydrolasen bildet das Gerüst für die

enzymatische Funktion und Substratspezifität der Enzyme. Die hydrolytischen Katalysatoren sind ein

Beispiel für die divergierende Evolution von Enzymen, die aus einer Struktur durch den Austausch

von Aminosäuren oder durch die Insertion/Deletion von Schleifen über einen zeitlichen Abstand

entstehen und unterschiedliche katalytische Aufgaben erfüllen. Die Enzyme besitzen dadurch zwar

geringe Sequenzhomologien aber eine vergleichbare Raumstruktur und eine identische Anordnung

am katalytischen Zentrum. Die Aminosäuren des aktiven Zentrums sind ein Histidin, eine Säure

(Asparaginsäure oder Glutaminsäure) und ein Nucleophil (Serin, Asparagin oder Cystein) in einer

konservierten Region, welche sich über Wasserstoffbrückenbindungen untereinander stabilisieren

(Abbildung 8) (Ollis et al. 1992).

13 Einführung

Abbildung 8: α/β Hydrolase-Faltungsmotiv der Hydrolasen ist eine „doubly wound α/β superfold“ bestehend aus 8 zentral parallel angeordneten β-Faltblättern (rot) und 6 umgebenden stabilisierenden α-Helices (blau). Im Speziellen kann die Anzahl der Elemente variieren, das allgemeine Gerüst ist aber hochkonserviert. Das aktive Zentrum bilden 3 Aminosäuren (grün), das Nucleophil befindet sich im hoch konservierten Bereich zwischen der αC-Helix und dem β5-Faltblatt, dem „nucleophilic elbow“ (Ollis et al. 1992).

Die katalytische Hydrolyse am aktiven Zentrum erfolgt in mehreren Schritten. Im Grundzustand

stabilisieren sich die Aminosäuren der katalytischen Triade untereinander durch Wasserstoff-

Brückenbindungen (Abbildung 9). Bei Anwesenheit eines Esters im katalytischen Zentrum greift das

Nucleophil, in diesem Fall das Serin, den Ester unter Ausbildung eines tetraedrischen

Zwischenprodukts nucleophil an. Das frei werdende Proton des Nucleophils übernimmt der

Imidazolring des Histidin und dieser wird unterstützt durch das Carboxylatanion der Säure, in diesem

Fall der Asparaginsäure. Das gebildete, negativ geladene Intermediat wird durch mehrere

Aminosäure-Reste, welche sich in der Region des aktiven Zentrums befinden, stabilisiert. Diese

Struktur wird als Oxyanionen-Loch bezeichnet. Im nächsten Schritt erfolgt die Abspaltung des

Alkohols und die Bildung eines Enzym-Substrat Komplexes, dem Acylenzym. Durch den Eintritt eines

Wassermoleküls in das aktive Zentrum und dessen nucleophilen Angriff am Acylenzym bildet sich

wiederum ein tetraetrisches Intermediat, welches durch Wasserstoff-Brückenbindungen im

Oxyanionen-Loch stabilisiert wird. Durch die Abspaltung der Säure und ihrer Freigabe erfolgt die

Rückführung des aktiven Zentrums in seinen Ausgangszustand und steht somit direkt für die Bindung

eines weiteren Esters bereit.

NH2

β8

β7

β6

β5

β4

β3

β2

β1

αA

αB

αC

αD

αE

αF

His

Säure

Nuc

COOH

14 Einführung

Abbildung 9: Der katalytische Reaktionsmechanismus der Hydrolasen am Beispiel der Spaltung eines Esters in die dazugehörige Säure und Alkohol. Die Reaktion erfolgt ohne Verwendung eines Cofaktors und ist somit sehr einfach und effizient. Die Bildung des Acylenzyms ist ein schneller Reaktionsschritt, die Freisetzung der Säure und des Enzyms ist der geschwindigkeitsbestimmende Reaktionsschritt. (Holmquist 2000).

Eine weitere Besonderheit der Hydrolasen ist das hochkonservierte Pentapeptid G-X-S-X-G, in das das

katalytische Serin eingebettet ist. Bei den beiden flankierenden Aminosäuren handelt es sich um

Glycin, für X können verschiedene Aminosäuren stehen.

Die Enzymklasse der Hydrolasen beinhaltet unter Anderem die Carboxylesterasen (EC 3.1.1.1,

Esterase), die Triacylglycerol Lipasen (EC 3.1.1.3, Lipase) und die Cutin Hydrolasen (EC 3.1.1.74,

Cutinase). Sie hydrolysieren alle Ester-Verbindungen, variieren aber bezüglich ihres

Substratspektrums. Die Carboxylesterase, auch unspezifische Esterase, spaltet unter Einbau eine

Wassermoleküls Carboxylester in seine Bestandteile Alkohol und Carboxylsäure. Die Lipasen finden

Anwendung bei dem hydrolytischen Abbau von Fetten (Triacylglyceride) in Glycerol und Fettsäuren.

Die Cutinasen zeichnen sich durch die Besonderheit der katalytischen Spaltung des Biopolymers

Cutin in dessen Monomere (u.a. Fettsäuren, Hydroxyfettsäuren, aliphatische Alkohole, aromatische

Säuren) aus. Alle dargestellten Reaktionen laufen im wässrigen Milieu ab.

Säure O

O

NHN

His Ser

OH

Säure O

OH

NNH

His Ser

O

N

H

O

N

H

O

RO

O

R´

Säure O

OH

NNH

His Ser

O

N

H

O

N

H

O

R

O

R´ O

Säure O

OH

NNH

His Ser

O

O

R

N

H

O

N

H

O

Säure O

OH

NNH

His Ser

O

N

H

O

N

H

O

R

O

H O

RO

O

R´

ROH

O

Freies Enzym

RÓH

OH2

tetrahedraler Übergangszustand I

tetrahedraler Übergangszustand II

Acyl-Enzym-Komplex

15 Einführung

Abbildung 10: Übersicht über die katalysierten hydrolytischen Spaltungen der Enzymgruppen der Carboxylesterase, Triacylglycerol Hydrolasen und der Cutin Hydrolasen im wässrigen Milieu.

Die Carboxylesterase zeichnet sich durch die Hydrolyse von kurz- und mittelkettigen, wasserlöslichen

Estern aus und ihre Reaktionskinetik kann durch die Michaelis-Menten-Gleichung beschrieben

werden (Abbildung 11). Im Gegensatz dazu hydrolysieren die Lipasen bevorzugt langkettige

Triglyceride, welche meist wasserunlöslich sind. Die Reaktionskinetik der Lipasen zeichnet sich durch

einen sigmoiden Verlauf aus, da diese Enzyme eine „Grenzflächenaktivierung“ aufweisen

(Abbildung 11). Das bedeutet, dass bei geringen Substratkonzentrationen die Lipase inaktiv bleibt

bzw. nur geringe Aktivitäten detektiert werden. Sobald aber die Substratkonzentration die

spezifische Konzentration (kritische micellare Konzentration) erreicht, ab der eine Agglomeration des

Substrats erfolgt, bildet sich eine Grenzfläche zwischen den hydrophoben Substratmicellen und der

hydrophilen Wasserphase mit der Lipase aus. Ab dieser Substratmenge steigt die hydrolytische

Aktivität der Lipasen rapide an.

OR2

O

R1 OH

O

R1

O

O

O

O

O

O

R3

R2

R1 OH

OH

OH+ H2O

+ R1COOH

+ R2COOH

+ R3COOH

+ H2O + R2OH

+ (H2O)n

COOH

OH COOH

COOHOH

OH

x

y

COOH

OH COOH

COOHOOH

OH COOH

OH

OH

Carboxylesterase

Triacylglycerol Hydrolase

Cutin Hydrolase

n

16 Einführung

Abbildung 11: Reaktionskinetik der Carboxylesterasen (links) nach Michaelis-Menten und der sigmoide Kurvenverlauf der Reaktionskinetik der Lipasen (rechts) (Pütz 2006).

Der Grund für dieses Verhalten lässt sich anhand der Struktur der Lipasen erklären. Das aktive

Zentrum des Enzyms wird durch eine bewegliche Proteinschlaufe, eine α-Helix, abgedeckt. Dieser

Deckel (engl.: lid) ist der Grund für die geringen Enzymaktivitäten unterhalb der kritischen mizellaren

Konzentration. Sobald diese Proteinschlaufe mit der Grenzfläche der Substratmizelle in Berührung

kommt, erfolgt eine Konformationsänderung und der Deckel gibt das aktive Zentrum frei (Abbildung

12). Gleichzeitig wird dadurch die hydrophobe Oberfläche, die das aktive Zentrum umgibt, frei

zugänglich und unterstützt die Interaktion zwischen dem Enzym und dem hydrophoben Substrat.

In neueren Studien wurden weitere Lipasen identifiziert und biochemisch charakterisiert, die keine

Grenzflächenaktivierung zeigten. Die Lipase LipA aus B. subtilis besitzt zum Beispiel keinen Deckel

und die Lipase aus P. aeruginosa LipA besitzt zwar einen Deckel, zeigt allerdings keine

Grenzflächenaktivierung. Somit ist die Anwesenheit oder Abwesenheit des Deckels kein struktureller

Hinweis zur Unterscheidung zwischen den Carboxylesterasen und Lipasen (Hausmann und Jaeger

2010).

1.3.2 Carboxylesterasen

Die Carboxylesterasen werden aufgrund ihrer primären Struktur und der biochemischen

Eigenschaften in 7 Gruppen (II-VIII) unterteilt (Hausmann und Jaeger 2010). Die meisten Esterasen

gehören zu der α/β-Hydrolase-Faltung Superfamilie. Ausnahmen enthält die Gruppe VIII, die

Esterasen mit einem β-Lactamase Faltungsmotiv beinhaltet. Im Jahre 2009 waren 696 bakterielle

Esterasen in der Enzymdatenbank BRENDA (Schomburg et al. 2004) enthalten und viele von ihnen

zeigen keine signifikante Übereinstimmung mit einer der bisher bekannten Esterasefamilien. Einige

Vertreter der einzelnen Gruppen sowie einige ihrer Merkmale sind in Tabelle 5 gegenübergestellt.

17 Einführung

Bakterielle Esterasen können im Cytoplasma (Droege et al. 2005), im Periplasma (Weadge et al.

2005) oder in der Membran vorhanden sein (von Tigerstrom und Stelmaschuk 1989, Wilhelm et al.

1999) oder sekretiert werden (von Tigerstrom und Stelmaschuk 1989, Xiang et al. 2006). Eine

spezifische Funktion der Esterase ist bisher nicht bekannt, sie sind unter normalen Standard-

Laborbedingungen nicht überlebenswichtig für die Bakterien (Berger et al. 1998). Sie sind involviert

in Prozessen, die eine C-Quelle zugänglich machen, wie die pathogene Infektion, der

Pflanzenzellwandabbau oder die Entgiftung (Khalameyzer et al. 1999). Es kommt zum Beispiel zur

Esteraseproduktion beim probiotischen Lactobacillus reuteri bei Anwesenheit von Gallensaft und es

wird vermutet, dass die Esterase bei der Erkennung von Zellmembranen beteiligt ist (Wall et al. 2007,

Whitehead et al. 2008). Andere Esterasen werden durch die Anwesenheit von Wasserstoffperoxid

gebildet und helfen dem Bakterium bei der Bewältigung von oxidativem Stress (Baatout et al. 2006).

Esterasen sind ebenfalls eingebunden in die Regulation der Kommunikation und Interaktion zwischen

den Spezies, sie bauen Signalmoleküle ab (Shinohara et al. 2007, Khalameyzer et al. 1999) oder

hydrolysieren Triacylglyceride als Ausgangsstoffe für die Antibiotika-Synthese (Olukoshi und Packter

1994).

Esterasen sind aufgrund ihrer Fähigkeit, Esterbindungen zwischen der Hydroxyzimtsäure und Zuckern

zu hydrolysieren, wichtige Enzyme beim Pflanzenzellwandabbau durch Clostridium und Lactobacillus

(Fonaghy et al. 2000, Prates et al. 2001, Wang et al. 2004, Garcia-Conesa et al. 1999). Die einzige

identifizierte Esterase im humanpathogenen Helicobacter pylori (Ruiz et al. 2007) ist direkt beteiligt

an der Bildung von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren und Magenkrebs (Kuster et al. 2006)

durch den Abbau der Fette des Magenschleims (Slomiany et al. 1989). Das oft in Krankenhäusern

übertragene pathogene Corynebacterium jeikeium besitzt keine eigene Fettsäure-Synthase und

spaltet deshalb mit einer Cholesterin-Esterase das Cholesterin im Blut und an extrazellulären

Matrixproteinen (Hansmeier et al. 2007, Tauch et al. 2005). Es ist Verursacher von Blutvergiftungen

und Herzinnenhautentzündungen. Die LipF aus dem pathogenen Mycobacterium tuberculosis,

gehörend zur Gruppe IV der Esterasen, ist ebenfalls ein wichtiger Faktor bei der Infektion des

Menschen durch das Bakterium. Als Autotransporter ist die Esterase EstA aus

Pseudomonas aeruginosa ebenfalls an der Infektion beteiligt (Camacho et al. 1999, Zhang et al.

2005).

18 Einführung

Tabelle 5: Übersicht lipolytische Enzyme I, Esterasen (Gruppe II-VIII) mit ausgewählten Beispielen (Hausmann und Jaeger 2010).

Gruppe Herkunft der Esterase (Proteinnr.) Merkmale

II

(GDSL)

Aeromonas hydrophila (P10480)

Pseudomonas aeruginosa

(O33407)

Bacillus cereus (Q81AY4)

Xanthomonas vesicatoria

(Q7X4K7)

Enthält die GDSL/SGNH-Esterasen, besitzen kein

GXSXG-Motiv am aktiven Zentrum, dafür ein GDS(L)-

Tetrapeptid im N-terminalen Bereich; Esterasen

enthalten fünf konservierte Sequenzbereiche, GDS(L)

mit Ser Block I, Gly in Block II, Asp in Block III und His in

Block V

III Streptomyces exfoliatus (Q56008)

Kineococcus radiotolerans

(A6WEQ4)

Clavibacter michiganensis

(B0RCM8, B0RFW0)

Thermobifida fusca (Q47RJ6,

Q47RJ7)

Extrazelluläre Enzyme, molekulare Masse von 32-35

kDa, besitzen Ähnlichkeit mit dem menschlichen

Blutblättchen-Aktivierungsfaktor Acetylhydrolase

(PAF-AH)

In dieser Gruppe sind Lipasen (definitionsgemäß) ohne

Deckel enthalten z.B. Tfu_0882 und Tfu_0883 aus T.

fusca

IV

(HSL)

Alicyclobacillus acidocaldarius

(Q7SIG1)

Burkholderia sp. 383 (u.a.

Q39FH4)

Pseudomonas sp. B11-1 (O52270)

Bacillus subtilis (O68884)

Ähnlich zur Gruppe der Hormonsensitiven

Säugetierlipasen, besitzen 3 konservierte

Sequenzblöcke, Bock II und III mit den katalytischen

AS, Block I mit HGGG Consensus-Sequenz, bevorzugen

kurzkettige Substrate und zeigen Esterase-

Enzymkinetik, besitzen am aktiven Zentrum eine „cap“

aus 2 separaten helikalen Regionen, spezifische

Inhibition

V Moraxella sp. (P24640)

Salmonella typhimurium (Q8ZNL5)

Serratia proteamaculans (A8GC20)

Rhodobacter sphaeroides

(A4WX93, A3PMP7)

Enzyme zeigen auch Homologie zu anderen

Enzymgruppen mit dem typischen α/β-Faltungsmotiv

(Epoxidhydrolase, Dehalogenase, Haloperoxidase),

besitzen 3 konservierte Sequenzblöcke, katalytisches

Ser in Bock II, Asp und His in Block III, Esterase-Kinetik,

kurzkettige Substrate bevorzugt

VI Spirulina platensis (Q53415)

Anabaena variabilis (Q3M6G8)

Shewanella amazonensis (A1S771)

Rhodoferax ferrireducens

(Q21XU9)

Kleine Enzyme mit 23-26 kDa, bisher nur eine mit 31,6

kDa, 40% Sequenzähnlichkeit zu eukaryotischen

Lysophospholipasen, 3 konservierte Sequenzblöcke

analog zu Gruppe IV und V, bevorzugt kurzkettige

Substrate

19 Einführung

Fortführung Tabelle 5


VII Arthrobacter oxydans (Q01470)

Streptomyces coelicolor (Q9Z545)

Burkholderia sp. 383 (Q398P3)

Bacillus pumilus (Q66M67)

Molekulare Masse von ca. 55 kDa, hohe Ähnlichkeit zu

Acetylcholinesterase und Darm/Leber

Carboxylesterase, 4 konservierte Sequenzblöcke,

hydrolysieren kurzkettige p-NP Ester und Triglyceride,

aber auch biotechnologisch interessante Substrate

VIII Arthrobacter aurescens (A1RB78)

Saccharopolyspora erythraea

(A4F8E6)

Pseudomonas gingeri (B0M0H4)

Streptomyces anulatus (O87861)

Unterscheiden sich in der Struktur deutlich von den

anderen Gruppen, zeigen Ähnlichkeiten zu β-

Lactamasen und DD-Peptidasen, Größe ca. 42 kDa,

Multimerbildung kann auftreten, hohe

Lösungsmitteltoleranz, katalytisch aktives Serin

befindet sich in SXXK Motiv, Ser und Lys im N-

terminalen Block und Tyr bilden aktives Zentrum,

zusätzlich wurde eine GXSXG Sequenz am C-Terminus

identifiziert

1.3.3 Lipasen

Überraschenderweise ist die genaue Funktion der Lipase bei Bakterien noch nicht bekannt, da ihre

Produktion einer komplexen Regulation unterliegt und sie somit wahrscheinlich nicht nur für die

Hydrolyse von Fetten als Energiequelle verantwortlich sind (Hausmann und Jaeger 2010). Die Art der

Regulation lässt die Schlussfolgerung zu, dass die Lipasen auch als Virulenzfaktoren auftreten

(Degrassi et al. 2008, Devescovi et al 2007, Heurlier et al. 2004, Lewenza et al. 1999, Ulrich et al.

2004) oder ähnlich den Xylan-Esterasen durch die Hydrolyse von Xylan die Schutzbarriere der

Wirtszelle zerstören (Khalameyzer et al. 1999).

Der die Atemwege infizierende, opportunistisch pathogene Pseudomonas aeruginosa produziert eine

Lipase, welche zusammen mit der Phospholipase C Substanzen abbaut, die zur Reduktion der

Oberflächenspannung an den Lungenbläschenmembranen und somit zur Unterstützung der Atmung

wichtig sind (Beatty et al. 2005, Schmidt et al. 2007). Isolierte Stämme von P. aeruginosa und

Salmonella zeigten untypische Zusammensetzungen der Lipid A Schicht, was sie für die mikrobiellen

Abwehrmechanismen des Menschen nicht erkennbar machten und es somit zu häufigeren

Erkrankungen kam (Ernst et al. 1999, Guo et al. 1998, Tanamoto und Azumi 2000). Die normale Lipid

20 Einführung

A Schicht besteht aus Capron-, Laurin-, Myristin-, Palmitin- und Stearinsäuren, bei den Isolaten wurde

allerdings eine Palmitinsäure-Konzentration von bis zu 33% gefunden (Ernst et al. 1999).

Ebenso können freie Fettsäuren die normalen Abläufe, wie die Hinderung der Lymphozyten-

Proliferation und die Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten, im menschlichen Organismus

stören (Buttke 1984, Buttke und Cuchens 1984, Hawley und Gordon 1976, Jaeger et al. 1991,

Nordstrom et al. 1991, Pourbohloul et al. 1985).

Die Anwesenheit einer Lipase bei Propionibacterium acnes unterstützt die Ansiedlung des

Organismus in den Talgdrüsenfollikeln der Haut. Durch die Hydrolyse von Glyceriden aus dem Serum

werden Fettsäuren freigesetzt, die die Ansiedlung des Bakteriums unterstützen (Burkhart und

Burkhart 2003, Gribbon et al. 1993).

Eine weitere wichtige Funktion der Lipasen ist der Abbau von lipolytischen Substraten zur

Verstoffwechselung. P. aeruginosa YS-7 kann mit Ölgemischen mit einem Wassergehalt von nur 1%

zum Wachsen gebracht werden (Shabtai et al. 1991). Microthrix parvicella kann Lipide und

Fettsäuren in hohen Konzentrationen in Abwässern abbauen, sowohl aerob als auch anaerob

(Nielsen et al. 2002).

Die Produktion von Lipasen kann durch die Anwesenheit von Alkanen angeregt werden, allerdings ist

der Abbau dieser Substrate noch nicht vollständig aufgeklärt. Selbst wenn die Lipase durch die Alkane

induziert wurde, kann sie nicht immer ohne weitere enzymatische Mithilfe die Alkane abbauen

(Breuil et al. 1978). Nur sehr wenige Stämme können diese Energiequelle verwerten, Hefestämme

noch eher als Bakterienstämme (Margesin et al. 2003).

Abbildung 12: Struktur der offenen und geschlossenen Lipase von Burkholderia cepacia BcL. Die offene Kristallstruktur ist blau dargestellt und das geschlossene Homologie-Modell grün, die gelbe Kugel stellt ein Ca

2+-Ion dar. Die katalytische

Triade besteht aus Serin, Histidin und Asparaginsäure (Trodler et al. 2009).

21 Einführung

Tabelle 6: Übersicht lipolytische Enzyme II, Lipasen (Grup. I.1-I.8) mit ausgewählten Beispielen (Hausmann und Jaeger 2010).


I.1 Pseudomonas mendocina

(Q8RKT7)

Rhodoferax ferrireducens

(Q21T36)

Vibrio cholerae (u.a. P15493)

Chromobacterium violaceum

(Q7NUI4)

Starke Ähnlichkeit zu P. aeruginosa Lipase, molekulare

Masse 30-32 kDa, Typ II Sekretionsweg, werden ATP-

abhängig ins Periplasma transportiert, in die aktive

Konformation umgefaltet und in den extrazellulären

Raum sekretiert, einige benötigen Faltungsproteine, 2

Asp binden ein Ca2+-Ion, das für die katalytisch aktive

Struktur benötigt wird, katalytisches His

I.2 Burkholderia glumae (Q05489)

Pseudomonas KWI-56 (P25275)

Burkholderia cepacia (u.a. P22088)

Pseudomonas luteola (O68551)

Starke Ähnlichkeit zu B. glumae Lipase, eine etwas

größere molekulare Masse als I.1 aufgrund 2 zusätzlicher

β-Faltblätter, Typ II Sekretionsweg, werden ATP-abhängig

ins Periplasma transportiert, in die aktive Konformation

umgefaltet und in den extrazellulären Raum sekretiert,

einige benötigen Faltungsproteine, 2 Asp binden ein Ca2+-

Ion, das für die katalytisch aktive Struktur benötigt wird,

katalytisches His

I.3 Pseudomonas fluorescens PfO1

(Q3KCS9)

Pseudomonas sp. 7323 (Q2KTB3)

Serratia marcescens (u.a. Q09KJ5)

Uncultered bacterium (A7J993)

Molekulare Masse 50-65 kDa, Typ I Sekretionsweg, Ca2+-

Ion enthalten für katalytische Funktion, näher verwandt

mit eukaryotischen Enzymen als mit bakteriellen, das C-

terminale Sekretionssignal mit Glycin-reichen Wieder-

holungen (GGXGXDX(U)X)n kann an das Ca2+-Ion binden,

welches als Chaperon bei hohen Kalzium-

Konzentrationen agiert

I.4 Bacillus subtilis (P37957)

Bacillus sp. NK13 (B0LW76)

Bacillus megaterium (Q8RJP5)

Bacillus clausii (Q5WDN0)

Molekulare Masse 20 kDa, kleinste Lipasen, häufig aus

Bacillus sp., enthalten konserviertes AXSXG Pentapeptid,

maximale Enzymaktivität bei pH 10,0-11,5, Lipase ist

Kalzium-unabhängig und enthält kein Cystein, weisen

eine kompakte minimale Hydrolasefaltung auf ohne

Deckel und Ca2+-Ionen

I.5 Geobacillus zalihae (Q842J9)

Bacillus sp. L2 (Q51413)

Geobacillus sp. SF1 (Q1L776)

Bacillus stearothermophilus

(u.a. A0MTM1)

Bacillus Lipasen zeigen nur 15% Ähnlichkeit mit Gruppe

I.4, pH Optimum variiert (7,5-9,5), Molekulargewichte ca.

46 kDa, wahrscheinlich aufgrund von Insertionen, die

eine Zink-Bindungsstelle enthalten, weisen deshalb

höhere thermale Stabilität auf

22 Einführung

Fortführung Tabelle 6


I.6 Staphylococcus hyicus (P04635)

Staphylococcus xylosus (Q2TPV1)

Staphylococcus warneri (Q5DWE2)

Staphylococcus aureus (u.a.

P10335)

Ca. 75 kDa großes Präproprotein mit ca. 200 AS am N-

terminalen Ende für die effiziente Translokation und

mit möglicher Funktion als intramolekulare Chaperone,

aktives Enzym ca. 46 kDa groß mit breiter

Substratspezifität, pH Stabilität von pH 4 bis 9, einige

Lipasen zeigen Aktivitätssteigerung mit Ca2+-Ionen und

Hemmung durch EDTA, können Polymere bilden,

können als Virulenzfaktoren agieren

I.7 Streptomyces cinnamoneus

(O33969)

Propionibacterium acnes

(u.a. Q59644)

Corynebacterium glutamicum

(u.a. Q8NU60)

Zeigen Ähnlichkeit zu Lipasen der Gruppe I.2 in der

Region von AS 50-150, Lipase S. cinnamoneus 29,2 kDa

und P. acnes 36,4 kDa, Lipase aus P. acnes besitzt

weites Substratspektrum Triacylglyceride und p-NP

Ester C2-C16

I.8 Pseudoalteromonas haloplanktis

(Q3IF07)

Hahella chejuensis (Q2SGZ8)

Colwellia psychrerythraea

(Q48AN1)

Pseudoalteromonas tunicata

(A4CF12)

Neue Gruppe, identifiziert und charakterisiert anhand

Lip1 aus P. haloplanktis, 51 kDa, gebunden an äußere

Bakterienmembran, höhere Aktivität mit langkettigen

Estern, Sequenz zeigt keine nähere Übereinstimmung

mit anderen lipolytischen Enzymen, eher zu marinen

psychrophilen Stämmen, kein Deckel, keine Ca2+-Ionen

Bindungsstelle, neues Motiv LGG(F/L/Y)STG mit Ser

anstatt GXSXG

1.3.4 Cutinasen

Cutinasen sind die einzigen Enzyme, die das Biopolyester Cutin und das Modellsubstrat Poly-ε-

caprolacton abbauen können. Sie zeigen einige Eigenschaften von Lipasen (Hydrolyse unlöslicher

Substrate) und Esterasen (Hydrolyse von löslichen Substraten). Diese Enzyme werden hauptsächlich

von pflanzenpathogenen Pilzen gebildet, es sind aber auch bereits einige Bakterien mit

Cutinaseaktivität identifiziert worden. Sie sind die kleinsten Hydrolasen in der α/β-Hydrolase Familie

(Dutta et al. 2009). Die Enzymklasse der Cutinasen ist eine bisher noch umstrittene Gruppe bei den

Hydrolasen. Es gibt einige bekannte und charakterisierte Cutinasen, z.B. die Cutinase aus

23 Einführung

Fusarium solani, Thermomyces insolens, Pseudomonas mendocina, Aspergillus oryzae und

Thermobifida fusca. Bei der Einteilung der lipolytischen Enzyme wurden die Cutinasen nicht als

selbstständige Gruppe deklariert, sondern es erfolgte z. B. aufgrund der Sequenz die Zuordnung der

Cutinasen aus T. fusca zur Gruppe III der Esterasen (Hausmann und Jaeger 2010). Bei einem

Sequenzalignment zeigten diese Cutinasen Ähnlichkeiten zu Triacylglycerol Lipasen aus

Streptomyces albus G und Streptomyces sp. M1 (Kleeberg et al. 2005). Es sollten weitere

Untersuchungen erfolgen, um die Zuordnung der Cutinasen bei den lipolytischen Enzymen noch

genauer zu versehen.

1.4 Polyethylenterephthalat

Synthetische Polymere und die daraus hergestellten Produkte sind aus unserem heutigen Leben nicht

mehr wegzudenken. Auch in der Textilindustrie haben die künstlichen Fasern eine große Bedeutung.

Speziell Polyesterfasern erlangten in den letzten Jahrzehnten immer mehr Einfluss. Die Produktion

dieser Fasern ist in den vergangenen 50 Jahren konstant angestiegen. Im Jahr 2007 waren bereits

76% aller synthetischen Fasern Polyesterfasern. Bei einer jährlichen Produktion von 30,7 Millionen

Tonnen waren davon 12,4 Millionen Tonnen Stapelfasern und 18,3 Millionen Tonnen Filamentgarn

(Saurer Management AG 2008). Für 2011 wird eine weltweite Produktion von 36 Millionen Tonnen

prognostiziert (Chemical Market Associates Inc. 2010). Die PET-Fasern werden weit verbreitet

genutzt, sowohl einzeln als auch in Mischungen mit anderen Fasern. Einige ihrer vielen Vorteile, die

sie für die Textilindustrie so unverzichtbar machen, sind ihre starke Reißfestigkeit, ihre Beständigkeit

und die Widerstandsfähigkeit gegenüber einer Vielzahl von Chemikalien. Doch besitzen

Polyesterfasern auch einige ungünstige Eigenschaften, wie zum Beispiel ihre starke Hydrophobie,

eine daraus resultierende geringe Wasseradsorption und sie neigen zum Pilling.

Polyethylenterephthalatfasern (PET), die bedeutendsten Polyesterfasern, werden durch

Polykondensation aus Terephthalsäure und Ethylenglycol hergestellt (Abbildung 13).

Abbildung 13: Polykondensationsreaktion von Terephthalsäure und Ethylenglycol zu Polyethylenterephthalat.

COOH

COOH

Terephthalsäure

+

OH

OH

Ethylenglycol

C

O

OR

C

O

O

R

PET

n

24 Einführung

Doch dabei entstehen ebenfalls einige unerwünschte Nebenprodukte, die die negativen

Eigenschaften der Polyesterfasern noch verstärken. Dabei handelt es sich um lineare und zyklische

Oligomere der Ausgangsstoffe. Besonders die Anreicherung von zyklischen Trimeren (Cyclo-tris-

Ethylenterephthalat, CTR), welche extrem wasserunlöslich sind, hat die Bildung von Agglomeraten

auf den Fasern und eine daraus resultierende Störung bei der Weiterverarbeitung (u.a. beim Färben)

zur Folge. Ebenfalls zeigen diese zyklischen Trimere eine Tendenz, sich an metallischen Oberflächen

anzulagern und haben somit auch negative Auswirkungen auf die Färbe- und

Veredelungsmaschinerie. Bisher angewandte Methoden zur Entfernung der zyklischen Trimere, wie

zum Beispiel der Abbau unter hohen Temperaturen, mit NaOH und mittels kationischer Tenside,

haben ebenfalls sehr viele negative Auswirkungen auf die Fasern und die Maschinen. Zum Einen

vermindert die aggressive Behandlung die Qualität der Polyesterfasern und zum anderen wird ein

hoher Gewichtsverlust beobachtet. Weiterhin kommt es neben dem hohen Energieeinsatz durch die

Anwendung der Chemikalien zu einer Anhäufung umweltschädigender Abfälle und zu Störungen an

den Maschinen (Valk et al. 1970; Senner 1973; Hempel 1979; Grosse et al. 1994; Höhn 2003).

Abbildung 14: Struktur eines zyklischen PET-Trimers.

1.4.1 Konventionelle PET-Faserbehandlung

Die bei der Polykondensation entstehenden niedermolekularen Nebenprodukte sind vielfältig und

können sowohl zyklische als auch lineare Verbindungen mit einem Polymerisationsgrad von 2 bis 10

Einheiten sein, wobei nicht alle die weitere Bearbeitung der Textilfaser im gleichen Maße

beeinflussen. Die wichtigsten Problemverursacher sind die zyklischen Trimere und im geringen

Ausmaß die Tetramere, Pentamere und Hexamere (Valk et al. 1970, Senner 1973, Hempel 1979,

Grosse et al. 1994, Höhn 2003). Zyklische und lineare Oligomere mit höheren Polymerisationsgraden

entstehen nur in kleinen Mengen. In Abhängigkeit vom Faserherstellungsprozess beträgt die Menge

O

O

O

O

O

O

O O

O

O O

O

Zyklischer PET-Trimer

25 Einführung

an an der Faser lokalisierten Oligomer zwischen 1 bis 3% des Fasergewichtes. Während des Prozesses

der Hochtemperatur-Färbung erfolgt ein Austritt von bis zu 70% der PET-Oligomer aus der Faser.

Durch weitere Färbe- und Abkühlungsprozesse bilden sich Oligomerablagerungen auf den

Färbemaschinen, welche mit jeder Färbung zunehmen. Die überwiegende Menge der als

Ablagerungen vorliegenden Oligomere (ca. 50-80%) bilden eine grobdisperse Aufschwemmung, die

von den PET-Produkten mittels Filtration abgetrennt werden kann. Diese so gewonnenen Oligomere

werden auch als Oberflächenoligomere bezeichnet und bestehen zu 97 bis 99% aus zyklischen

Trimeren. Sie verursachen eine Vielzahl von negativen Beeinträchtigungen bei der

Weiterverarbeitung der PET-Ware, eine Verringerung der Qualität des Produktes als auch technische

Probleme, wie unter anderem eine Leistungsverringerung der Maschinen, einen höheren

Energieverbrauch und längere Stillstandzeiten. Um diese Probleme auf ein Minimum zu reduzieren,

wurden in der Vergangenheit bereits einige Verfahren entwickelt (Dugal et al. 1973, Kusch 1974,

Baker 1974, Werkes 1975, Keller et al. 1981, Yang und Li 2000, Höhn 2003).

alkalische Vorbehandlung bei hohen Temperaturen

Die Nachteile dabei sind erhöhte Kosten durch den zeit- und energieaufwendigen

Arbeitsschritt, ein Einsatz von umweltschädlichen Chemikalien ebenso wie eine Beschädigung

der Textilfasern.

Vorbehandlung zur PET-Oligomerentfernung mit chlorierten (Methylenchlorid,

Perchlorethylen) oder chlorfreiem Lösungsmittel (Dioxan)

Dies bietet sich aus umwelttoxikologischen und sicherheitstechnischen Gründen nicht als

Alternative an.

Einsatz von Dispergatoren (Tenside) zur Verhinderung der Ablagerung von austretenden

Oligomer

Diese Methode führt zu einem höheren Gehalt an organischen Verbindungen im Abwasser.

alkalisches Färben

Positiv ist dabei eine gleichzeitige Verseifung der Oligomere, diese Methode eignet sich aber

nicht für alle Textilfärbungen.

Nachwäsche als Lösemittelwäsche mit Tetrachlorethen oder Dispergatorwäsche

Auch dieses Verfahren führt zu einem höheren Gehalt an organischen Verbindungen in den

Abwässern.

Nachreinigung als alkalische Verseifung mit Tetraalkylammoniumverbindungen als

Katalysator

Auch hier treffen die bereits oben genannten Nachteile zu.

26 Einführung

Diese Verfahren und auch alle nach dem Oligomermobilisierenden Färbeprozess angewandten und

beschriebenen Methoden gegen die PET-Oligomerdeposition weisen ähnliche wirtschaftliche,

technische und ökologische Nachteile, wie ein hoher zusätzlicher Energieeinsatz, die Verwendung

von produkt-, umwelt- und personenschädigenden Chemikalien und besonders deren Entsorgung,

auf.

Sowohl aus diesen Gründen, aber auch aufgrund des drastischen Gewichtsverlusts der PET-Fasern

und der Verschlechterung ihrer Qualität während der Bearbeitung (Zeronian und Collins 1989, Shukla

et al. 1997), wurde in den letzten Jahren zunehmend nach einem biotechnologischen Prozess zur

Oligomerbearbeitung und -entfernung geforscht, um die traditionellen Faserverarbeitungs-

methoden mit ihren Nachteilen zu ersetzen (Gübitz und Cavaco-Paulo 2001).

1.4.2 Charakterisierung von PET

Bei der PET-Herstellung erfolgen anschließend verschiedenste Modifikationsschritte, welche sich auf

die Eigenschaften des PET-Textiles oder Films auswirken. Während des Schmelzspinnverfahrens

(Abbildung 14) wird die Spinnmasse geschmolzen und anschließend durch eine beheizte Spinndüse

mit einer Geschwindigkeit von 4000 m/min gepresst. Diese Spinndüsen weisen eine Größe zwischen

1-10 cm auf und bestehen aus bis zu 60000 Spinndüsenlöchern mit einem Durchmesser zwischen

0,05 und 1 mm (Abbildung 15). Durch die anschließende Luftkühlung erstarren die Fibrillen und es

erfolgt das Verstrecken, was eine Neuanordnung der PET-Ketten in der Fibrille zur Folge hat.

Abbildung 15: Schematische Darstellung des Schmelzspinnverfahrens von PET-Fibrillen (links) und Darstellung einer

beheizten Schmelzspinndüse (Jahreiß 2005).

27 Einführung

Das Verstrecken erfolgt entweder unter sehr hohen Geschwindigkeiten beim Abziehen von der

Schmelzspinndüse oder indem das gesponnene Filament vor dem Aufrollen über mehrere

verschieden große Rollen geführt wird. Beim Verstrecken werden die zuvor wirr durcheinander

liegenden PET-Ketten in Faserrichtung und auch zueinander ausgerichtet (Abbildung 16). Dadurch

bilden sich auch Wechselwirkungen zwischen den Ketten aus, wie die Wasserstoffbrückenbindungen

(Abbildung 17), und es entstehen teilkristalline Bereiche, welche die Festigkeit der Fasern deutlich

erhöhen. Diese Bindungen sind zu diesem Zeitpunkt noch nicht stabil und würden beim Waschen

zerstört werden, deshalb erfolgt anschließend eine Hitzefixierung.

Abbildung 16: Anordnung der PET-Ketten vor (links) und nach (rechts) dem Verstrecken unter Ausbildung von geordneten kristallinen Bereichen (Jahreiß 2005).

Abbildung 17: Darstellung der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den durch Verstrecken entstandenen geordneten PET-Ketten (grün).

Verstrecken

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H

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HH

H

H

HH

28 Einführung

Die Eigenschaften von PET-Fasern, wie Glanz, Transparenz, Farbeindruck (dunkler/heller),

Schmutzsichtbarkeit, Griff (weicher/härter), eine Volumenerhöhung und Wärmeisolierung, werden

ebenfalls durch ihren Faserquerschnitt bzw. der Faseroberfläche beeinflusst (Abbildung 18). Eine

weitere Modifikation zur Optimierung der Volumenzunahme, der elastischen Dehnung, besserer

Wärmeisolierung (durch Lufteinschlüsse), des flauschigen Griffs und zur besseren

Feuchtigkeitsaufnahme für die Herstellung von elastischen Bekleidungswaren ist die Texturierung.

Dabei werden die zuvor glatten Synthesefasern mechanisch gekräuselt und somit liegen nun

Faserschlingen zwischen der Haut und dem Kleidungsstück, was zur Verbesserung der

Trageeigenschaften führt (Abbildung 18). Weiterhin hat die Modifikation eine höheren

Feuchtigkeitsaufnahme und einen erhöhten Lufteinschluss zur Folge, hingegen wird Glanz und Pilling

vermindert (Jahreiß 2005).

Abbildung 18: Darstellung möglicher Faserquerschnitte und Oberflächen (links) und die PET-Fasern vor und nach dem Texturieren (rechts) (Jahreiß 2005).

Die Textilveredelung, ein Hauptgebiet der Textilchemie, umfasst sämtliche Arbeitsprozesse, die die

äußeren Eigenschaften der Textilien verschönern, wie Färben, Bleichen, Bedrucken, sowie

Maßnahmen, die ihren Gebrauchswert steigern (Pflegeleichtausrüstung, Knitterfestmachen), sowie

Imprägnierung und Silikonisieren (weicher und geschmeidiger, durch Minimierung der Reibung der

Fasern untereinander). Diese Maßnahmen werden im unversponnenen Zustand der Textilfaser („in

der Flocke“) durchgeführt. Dazu zählt ebenfalls das Finish oder auch Ausrüstung genannt, die letzte

Bearbeitung von Textilien. Es dient zur Verschönerung, Hervorhebung oder Unterdrückung

bestimmter Eigenschaften. Dazu zählen unter anderem Waschen, Bleichen, Färben, Bedrucken,

Prägen, Imprägnieren und Hydrophobieren (d.h. wasserabweisend machen, z.B. durch

Aluminiumsalze oder Paraffinprodukte), knitterfest machen, Mattieren (z.B. durch Einschlüsse von

Titandioxid in die Faser), antimikrobiell machen (durch Zusätze von z.B. Bisphenolen oder

29 Einführung

Hexachlorophen; wodurch es zu weniger Hautpilzen und Körpergeruch kommt) und

schwerentflammbar machen (z.B. durch Borax oder Titankomplexe) (Jahreiß 2005).

PET besteht aus kristallinen und amorphen Bereichen und weist somit sowohl eine

Glasübergangstemperatur (für die amorphen Bereiche) als auch eine Schmelztemperatur (für die

kristallinen Bereiche) auf. Die Glasübergangstemperatur (Tg) ist die Temperatur, bei der ganz oder

teilweise amorphe Polymere vom glasigen oder hartelastischen, spröden Zustand in den

gummielastischen, flexiblen Zustand übergehen. Tg wird daher auch "Erweichungstemperatur"

genannt und ist für jeden Kunststoff spezifisch (Abbildung 19). Da Wärme nichts anderes als

kinetische Energie ist, bewegen sich unterhalb der Glasübergangstemperatur die Molekülketten

kaum. Bei der Erwärmung des Kunststoffes bewegen sie sich immer mehr, halten aber noch

zusammen, bis schließlich mit dem Erreichen der Glasübergangstemperatur sich längere Abschnitte

der Molekülketten frei bewegen können. Die bei Temperaturen oberhalb der

Glasumwandlungstemperatur (ca. 80°C) beweglichen Molekülketten kristallisieren bei ca. 160°C aus

(Abbildung 19, Kristallisationspeak), bevor bei ca. 255°C der endotherm ablaufende Schmelzvorgang

beginnt (Abbildung 19, Schmelzpeak).

PET kann mit Hilfe der Differentialrasterkalorimetrie (DSC) bezüglich der

Glasumwandlungstemperatur, dem Schmelzverhalten, der Kristallinität und des

Kristallisationsverhaltens charakterisiert werden (Abbildung 19). Dabei erfolgt mit der Probe eine

lineare Erhitzung und anhand der Enthalpieänderungen bezüglich einer Referenz kann ein wie in

Abbildung 19 dargestelltes Diagramm erstellt werden. Durch die Integration des Schmelzpeaks kann

die Kristallinität der vorliegenden PET Probe berechnet werden.

Abbildung 19: DSC-Kurve einer PET-Folie (http://web.utk.edu/~mse/Textiles/Polymer%20Crystallinity.htm).

T g Kristallistionspeak

Schmelzpeak

http://web.utk.edu/~mse/Textiles/Polymer%20Crystallinity.htm

30 Einführung

Die Glasübergangstemperatur hängt im Wesentlichen von der Struktur der Polymere ab. Die

Flexibilität der Hauptkette ist einer der wichtigsten Faktoren. Ein Kunststoff hat eine niedrige

Glasübergangstemperatur, wenn sich die Molekülketten bei geringen Temperaturen schon von sich

aus gut bewegen können. Das bedeutet, dass Polymere, die aus aliphatischen Bausteinen aufgebaut

sind, eine geringere Glasübergangstemperatur besitzen als Polymere, welche aus aromatischen

Monomeren, wie der Terephthalsäure, zusammengesetzt sind. Bei PET handelt es sich um ein

Polymer, das sowohl aliphatische als auch aromatische Bestandteile besitzt und eine

Glasübergangstemperatur von ca. 80°C.

1.4.3 Biofunktionalisierung von PET

In den letzten Jahrzehnten erfolgten verschiedenste Studien über die Biofunktionalisierung von

Polyethylenterephthalat, eine Übersicht darüber gibt Zimmermann und Billig (2011). Zunächst wurde

noch angenommen, dass aromatische Polyester, also auch PET, resistent gegenüber einem

hydrolytischen Abbau sind (Kint und Munoz-Guerra 1999, Müller et al. 2001). Ferner erfolgten

Veröffentlichungen von verschiedenen Autoren, die keine enzymatischen Effekte auf den PET-Fasern

nachweisen konnten (Tokiwa und Suzuki 1977, Levefre et al. 1999). Weitere Untersuchungen

hingegen dokumentieren die Möglichkeit der biokatalytischen Modifikation der PET-Fasern.

Veränderungen in den physikalischen Eigenschaften wie Reißfestigkeit, Viskosität und

Dehnungsverhalten von PET-Film und Fasern wurde nach der Inkubation mit einer Enzym-

Präparation aus Cladosporium cladosporioides festgestellt (Sato 1983). Ferner wurde von Oda et al.

(1999) beschrieben, dass die Inkubation mit Arthrobacter und Trichosporon Spezies ebenfalls

Modifikationen der PET-Fasern zur Folge hat. Ebenfalls konnte eine Verbesserung der

Wasserbenetzbarkeit und der Absorptionseigenschaften sowie eine Verbesserung der Anfärbbarkeit

von PET-Textilien und Fasern nach einer enzymatischen Hydrolyse mit bakteriellen Cutinasen aus

Pseudomonas mendocina (Hsieh und Cram 1998, Hsieh et al. 2003, Bott et al. 2003, Kellis et al. 2001,

Yoon et al. 2002, Dyson et al. 2005), aus Thermobifida fusca (Alisch et al. 2004, Alisch-Mark et al.

2006, Heumann et al. 2006, Feuerhack et al. 2008, Eberl et al. 2008, Eberl et al. 2009, Brueckner

et al. 2008) und mit eukaryotischen Cutinasen aus Fusarium solani (OŃeill und Cavaco-Paulo 2004,

Silva et al. 2005, Alisch-Mark et al. 2006, Heumann et al. 2006, Araujo et al. 2007, OŃeill et al. 2007,

Nimchua et al. 2007, Nimchua et al. 2008) und Thermomyces insolens (Abo et al. 2004, Svendsen

et al. 2005, McCloskey und Jump 2005, Liu et al. 2008) nachgewiesen werden (Tabelle 7). Die Enzyme

bewirken dabei durch die partielle Hydrolyse von Esterbindungen und die dadurch entstehenden

Hydroxyl- und Carboxylgruppen eine Zunahme der hydrophilen Eigenschaften auf der Oberfläche der

PET-Fasern. Mit Hilfe einer solchen Behandlung erhält man bei Polyestertextilien verbesserte

31 Einführung

Eigenschaften, wie zum Beispiel größere Bindung von kationischen Farbstoffen, einen Depilling

Effekt, die Entfernung von Polyesterschlichte und eine bessere Entfernbarkeit von Ölflecken. In

weiteren Untersuchungen wurden Textilien und Fasern mit eukaryotischen Lipasen aus

Aspergillus sp. (Fischer-Colbrie et al. 2004, Heumann et al. 2006, Wang et al. 2008), aus

Thermomyces lanuginosus (Almansa et al. 2008, Brueckner et al. 2008, Eberl et al. 2008, Eberl et al.

2009), aus Candida antarctica (Anderson et al. 1999, Khoddami et al. 2001, Lee und Song 2010, Kim

und Song 2006), mit der bakteriellen Lipase aus Burkholderia cepacia (Heumann et al. 2006, Kim und

Song 2006) und einer tierischen Lipase (Kim und Song 2006, Kim und Song 2008, Hsieh und Cram

1998) behandelt und dabei eine Erhöhung der Hydrophilie erzielt. Weiterhin konnte eine

Verbesserung der Eigenschaften der PET-Fasern durch die Inkubation mit Esterasen und Proteasen

bewiesen werden (Kontkanen et al. 2006, Zhang et al. 2004, Zhang et al. 2006, Liebminger et al.

2007, Kim und Song 2010).

Abbildung 20: Darstellung der chemischen Struktur der Polyethylenterephthalat Polymerkette, der zyklischen Trimere und der enzymatisch freigesetzten Hydrolyseprodukte (Zimmermann und Billig 2011).

Neben den PET-Textilien wurden in den letzten Jahren auch Studien zur Modifikation und zum

Bioabbau von PET-Folien, welche unter anderem in der Verpackungsindustrie Anwendung finden,

durchgeführt. Dabei erfolgte mit den bereits benannten Cutinasen aus F. solani (Vertommen et al.

2005, Ronkvist et al. 2009), P. mendocina (Ronkvist et al. 2009), T. fusca (Müller et al. 2005, Eberl

et al. 2008, Eberl et al. 2009) und T. insolens (Abo et al. 2004, Ronkvist et al. 2009) die partielle

Hydrolyse der Folien unter verschiedenen Bedingungen (Tabelle 5). Ebenfalls waren die Lipase aus

T. lanuginosus (Almansa et al. 2008, Brueckner et al. 2008, Eberl et al. 2008, Eberl et al. 2009) und die

Esterase aus C. cladosporioides (Sato 1983) in der Lage, den PET-Film zu modifizieren. Diese

hydrophilen PET-Filme werden ferner für medizinische Anwendung genutzt.

32 Einführung

Abbildung 21: Darstellung der chemischen Struktur der Polytrimethylenterephthalat Polymerkette, der zyklischen Dimere und der enzymatisch freigesetzten Hydrolyseprodukte (Zimmermann und Billig 2011).

Der direkte Abbau von zyklischen PET-Trimeren erfolgte bereits mit den Cutinasen aus T. fusca (Chen

et al. 2010) und T. insolens (Andersen et al. 1999, Riegels et al. 2001, Hooker et al. 2003, Abo et al.

2004, Jump und McCloskey 2004, Svendsen et al. 2005, Figueroa et al. 2006). Für Screening-Studien,

die Optimierung der Hydrolysebedingungen und kinetische Studien wurden in den letzten Jahren

ebenfalls diverse kurzkettige Modellsubstrate eingesetzt (Abbildung 20-22) (Andersen et al. 1999,

Kellis et al. 2001, Riegels et al. 2001, Hooker et al. 2003, Jump et al. 2004, Abo et al. 2004, Zhang

et al. 2004, Dyson et al. 2005, Svendsen et al. 2005, Figueroa et al. 2006, Heumann et al. 2006,

Michels et al. 2006, Pütz 2006, Zhang et al. 2006, Liebminger et al. 2007, Eberl et al. 2008, Wang

et al. 2008, Eberl et al. 2009, Chen et al. 2010).

Nach der Behandlung der PET-Textilien oder -Filme kommen verschiedenste analytische Methoden

zur Charakterisierung der modifizierten Oberfläche zur Anwendung. Dabei wird zwischen der

direkten und der indirekten Oberflächenanalytik unterschieden.

Abbildung 22: Darstellung der chemischen Struktur der angewandten Polyethylenterephthalat Modellsubstrate (Zimmermann und Billig 2011).

33 Einführung

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36 Einführung

Zur direkten Oberflächenanalytik zählen unter anderem XPS (Röntgenphotoelektronen-

spektroskopie), bekannt auch als ESCA (Elektronenspektroskopie für chemische Analyse), FTIR

(Fourier-Transformations-Infrarotspektrometrie), SEM (Rasterelektronenmikroskopie) bzw. ESEM

(Umgebungsrasterelektronenmikroskopie) und AFM (Atomkraftmikroskopie). Während der XPS

Analyse wird die elementare Zusammensetzung der PET Oberfläche in einem Bereich von 10 nm

detektiert und die spezifischen funktionellen Gruppen nachgewiesen. Enzymatische Modifikationen

durch Hydrolasen wurden bereits mehrfach bestätigt (Vertommen et al. 2005, Feuerhack et al. 2008,

Brueckner et al. 2008, Eberl et al. 2009), allerdings ist eine vorherige Reinigung der PET-Filme

notwendig, um verfälschende Proteinverunreinigungen zunächst zu entfernen (Vertommen et al.

2005, Feuerhack et al. 2008). Mit der FTIR Analyse werden ebenfalls chemische Veränderungen auf

der PET-Oberfläche nachgewiesen. Mit Hilfe infraroter Strahlung werden die Moleküle in ein

energetisch höheres Niveau versetzt und die bei der Rückkehr in den nicht angeregten Zustand

freiwerdende Strahlung wird analysiert und gibt Rückschlüsse über die Zusammensetzung der Probe

(Goddard und Hotchkiss 2007). Änderungen in der chemischen Struktur von PET-Filmen nach einer

enzymatischen Behandlung wurden mittels FTIR bereits von Donelli et al. 2009 nachgewiesen. Das

SEM nutzt einen Elektronenstrahl, um die Oberfläche abzutasten und somit ein dreidimensionales

Abbild zu erschaffen. Damit können Veränderungen wie Ablagerungen oder Löcher nachgewiesen

werden. Fasermodifikationen wurden bereits bestätigt durch eine Schweineleber Esterase (Zhang

et al. 2004, Zhang et al. 2006), Lipasen von C. antarctica und aus Schweineleber (Lee und Song 2010,

Kim und Song 2006) und Cutinasen aus P. mendocina und T. insolens (Kellis et al. 2001, Yoon et al.

2004). Die Cutinase aus T. insolens bildete während der Enzymbehandlung von PET-Filmen viele

Löcher und somit eine rauere Oberfläche (Ronkvist et al. 2009). Nach der Inkubation von PTT-

(Polytrimethylenterephthalat) Fasern mit der Cutinase aus T. fusca zeigte sich hingegen keine

Oberflächenveränderung per ESEM (Eberl et al. 2008, Brueckner et al. 2008). Die Abtastung der

Oberfläche beim AFM erfolgt mit einer dünnen Nadel, welche einen Laserstrahl aussendet. Der von

der Oberfläche reflektierte Laserstrahl wird von einem Photodetektor aufgenommen und in eine

Oberflächenaufnahme umgewandelt. Bisher wurde per AFM die Oberflächenveränderung von PET-

Fasern nach der Behandlung mit der Cutinase aus T. fusca nachgewiesen (Feuerhack et al. 2008).

Bei der indirekten Oberflächenanalyse wird die Modifikation mit Hilfe weiterer Agenzien detektiert.

Die gesteigerte Hydrophilie der Textilien wird mittels Kontaktwinkelmessung, Steighöhen-

bestimmung, Tropfentest, Flüssigkeitsaufnahmekapazität, Feuchtigkeitsaufnahme und Färbetests mit

anschließender Farbintensitätsmessung nachgewiesen. Für diese Analysemethoden ist es ebenfalls

wichtig, dass das noch verbliebene Enzym an der Oberfläche vor dem Nachweis entfernt wird, da

sonst verfälsche Ergebnisse auftreten (Vertommen et al. 2005, Brueckner et al. 2008, Donelli et al.

2009). Bei der Kontaktwinkelmessung wird der auftretende Winkel eines Wassertropfens auf einer

37 Einführung

festen Oberfläche bestimmt. Je kleiner der Winkel ist, desto hydrophiler ist die Oberfläche (ca. 0-

90°), ab 90° gilt der Feststoff als hydrophob und ab ca. 160° als superhydrophob, was auch als

Lotuseffekt bekannt ist. Enzymatisch behandelte PET-Oberflächen wurden unter anderem von Hsieh

und Yu 1992, Hsieh 1995, Yoon et al. 2002, Heumann et al. 2006, Donelli et al. 2009 und Lee und

Song 2010 mit dieser Methode analysiert. Bei der Steighöhenbestimmung wird die Wasseraufnahme

eines Textilstreifens, der mit einem Ende in eine Flüssigkeit getaucht ist, nach definierten

Zeitabständen in Zentimetern bestimmt. Eine hohe Steighöhe geht einher mit einer hydrophilen

Oberfläche des PET-Textils (Fischer-Colbrie et al. 2004, Alisch-Mark et al. 2006, Müller 2006). Eine

ähnliche Methode zum Nachweis der Hydrophilie ist der Tropfentest, bei dem der Zeitabstand von

der Aufbringung eines definierten Tropfens Flüssigkeit auf ein PET-Textil bis zur vollständigen

Aufnahme des Tropfen in das Textil gemessen wird (Heumann et al. 2006, Brueckner et al. 2008, Liu

et al. 2008). Das Verhältnis an Flüssigkeit, das ein trockenes PET-Textil maximal aufnehmen kann,

zum Textil wird als Flüssigkeitsaufnahmekapazität bezeichnet. Die Flüssigkeitsaufnahme hingegen ist

die Menge an Wasser, welche eine trockene Faser oder Textil aus der Luft mit definierter

Feuchtigkeit absorbiert kann. Beide Methoden verdeutlichen Veränderungen in den

Absorptionseigenschaften von modifizierten PET-Textilien (Hsieh et al. 1996, Hsieh und Cram 1998,

Kim und Song 2006, Lee und Song 2010). Aufgrund der eingefügten hydrophilen funktionellen

Gruppen werden die Textilien verstärkt durch kationische oder reaktive Farbstoffe angefärbt. Die

Brillianz der Farbe kann durch eine Farbintensitätsmessung bestimmt werden und somit indirekt die

Hydrophilie nachweisen (Yoon et al. 2001, Alisch et al. 2004, OŃeill und Cavaco-Paulo 2004,

Brueckner et al. 2008, Eberl et al. 2009).

Die enzymatische Hydrolyse kann nicht nur durch die Modifikationen auf der Oberfläche

nachgewiesen werden, sondern auch freigesetzte Hydrolyseprodukte können mit verschiedensten

Methoden analysiert werden. Da diese wasserlöslichen Produkte Derivate der Terephthalsäure bzw.

Terephthalsäure direkt sind, können sie einfach im ultravioletten Wellenlängenbereich von 240-

255 nm spektrophotometrisch detektiert werden (Kellis et al. 2001, Alisch et al. 2004, OŃeill und

Cavaco-Paulo 2004). Da enthaltene Proteine die UV Messung beeinflussen, dient dieser Nachweis nur

zum Screening nach PET Aktivität. Terephthalsäure kann ebenfalls mittels Dünnschich-

chromatographie nachgewiesen werden (Fischer-Colbrie et al. 2004, Pütz 2006, Liebminger et al.

2007). Die Bestimmung der Konzentrationen der verschiedenen Hydrolyseprodukte; u. a. TPA, MHET

und BHET; freigesetzt aus PET-Textilien, Filmen, zyklischen PET-Trimeren und weiteren

Modellsubstraten kann per RP-HPLC (Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)

erfolgen (Riegels et al. 2001, Hooker et al. 2003, Fischer-Colbrie et al. 2004, Vertommen et al. 2005,

Figueroa et al. 2006, Heumann et al. 2006, Eberl et al. 2008, Eberl et al. 2009, Ronkvist et al. 2009,

Chen et al. 2010). Terephthalsäure einzeln kann auch mittels Fluoreszenz-Spektroskopie detektiert

38 Einführung

werden, dazu erfolgt zunächst die Bildung von Hydroxyterephthalsäure (HTA), welche bei 329 nm

angeregt und bei 425 nm die freigesetzte Emissionsstrahlung gemessen wird (OŃeill und Cavaco-

Paulo 2004, Nimchua et al. 2007). Die freigesetzte TPA kann ebenfalls mittels Titration mit NaOH

nach der enzymatischen Hydrolyse nachgewiesen werden (Kim und Song 2008, Kim und Song 2010).

Für kinetische Studien zur Charakterisierung verschiedener PET-Hydrolasen erfolgte auch schon die

Anwendung eines pH-Staten um die Säurefreisetzung über einen längeren Zeitraum zu detektieren

(Ronkvist et al. 2009).

Bei den Untersuchungen mit den verschiedenen PET-Hydrolasen wurde eine Korrelation der

enzymatischen Abbaurate mit dem Temperaturunterschied zwischen der Glasübergangstemperatur

Tg (amorphe Bereiche) bzw. der Schmelztemperatur Tm (kristalline Bereiche) und der

Hydrolysetemperatur identifiziert. Da die Polymerketten in der Nähe dieser charakteristischen

Temperaturen deutlich mobiler sind, können sie schneller erreicht und hydrolysiert werden durch die

PET-Hydrolasen. Deshalb sollten die PET Hydrolysen nahe der Tg von amorphen PET erfolgen (Witt

et al. 1997, Marten et al. 2003, Marten et al. 2005).

1.4.4 PET-Hydrolasen

In den letzten Jahren wurden verschiedene Enzymgruppen für eine enzymatische Hydrolyse von PET

Substraten eingesetzt, mit unterschiedlichen Abbauraten als Folge. Die am häufigsten verwendeten

Enzyme gehören zur Gruppe der Cutin Hydrolasen (EC 3.1.1.74.), bekannt auch als Cutinasen

(Tabelle 5).

Die am häufigsten eingesetzten und somit am besten charakterisierten PET-Cutinasen sind die

rekombinant produzierten Wildformen oder bereits optimierten Mutanten isoliert aus den

Bakterienstämmen Pseudomonas mendocina (zuvor Pseudomonas putita), Thermobifida fusca und

den eukaryotischen Stämmen Fusarium solani und Thermomyces insolens. Bei den drei zuerst

genannten Enzymen handelt es sich definitiv um Cutinasen, da diese Enzyme nachgewiesene

hydrolytische Aktivität gegenüber dem Biopolyester Cutin zeigten (Sebastian et al. 1987, Kleeberg

et al. 2005, Purdy und Kolattukudy 1973, Purdy und Kolattukudy 1975). Die Cutinase aus T. insolens

wird von der ersten literarischen Erwähnung an als Cutinase bezeichnet, einen eindeutigen Nachweis

anhand von Daten sind die Autoren aber bisher schuldig geblieben (Sandal et al.1995, Andersen et al.

1999, Riegels et al. 2001, Hooker et al. 2003, Abo et al. 2004, Svendsen et al. 2005, Figueroa et al.

2006, Ronkvist et al. 2009). Trotz dieses fehlenden Nachweises wird für die nachfolgende Darstellung

in Übereinstimmung mit der Literatur weiterhin die Hydrolase als Cutinase bezeichnet.

39 Einführung

Tabelle 8: Vergleich der PET-Hydrolasen von F. solani (Carvalho et al. 1998, Carvalho et al. 1999, Ronkvist et al. 2009), T. insolens (Sandal et al. 1996, Ronkvist et al. 2009), P. mendocina (Bott et al. 2003, Ronkvist et al. 2009) und T. fusca (Kleeberg et al. 2005, Chen S et al. 2008).

F. solani T. insolens P. mendocina T. fusca

Anzahl der Aminosäuren 197 194 272 261

Molekulargewicht 22 kDa 20-21 kDa 30 kDa 28 kDa

Isoelektrischer Punkt 7,2 8 nb 6,43

pH Optimum 6,5-8,5 8,5-9,5 9,0-9,5 6,5-8,0

Temperatur Optimum 50°C 75-80°C 50°C 60-70°C

Katalytische Triade Ser120

Asp175

His188

Ser140

Asp195

His208

Ser126

Asp176

His206

Ser132

Asp176

His210

GXSXG Motiv G-Y-S-Q-G G-Y-S-Q-G G-H-S-Q-G G-H-S-M-G

α-Helices / β-Faltblätter 5 / 5 Nb 7 / 9 Nb

nb: nicht bestimmt

Die wichtigsten Informationen über die vier Cutinasen sind in Tabelle 8 zusammengefasst. Es ist

deutlich ersichtlich, dass alle Enzyme eine ähnlich kleine Größe zwischen 20 und 30 kDa aufweisen,

ein neutrales bis leicht alkalischen pH Optimum und ein thermophiles Temperatur Optimum

besitzen. Die katalytische Triade besteht bei allen vier Cutinasen aus den Aminosäuren (AS) Serin,

Asparaginsäure und Histidin, natürlich an verschiedenen Positionen im Protein, aber dennoch in

einem Abstand von maximal 20-22 AS. Das spezifische Hydrolase-Motiv ist bei den beiden

eukaryotischen Cutinasen identisch, bei den bakteriellen Cutinasen unterscheidet es sich nur in einer

flankierenden Aminosäure.

Die Cutinase aus F. solani ist das am besten untersuchte Enzym für den PET-Abbau. Es wurden bereits

mehrere Reviews veröffentlicht, die eine Übersicht über die wichtigsten katalytischen und

strukturellen Eigenschaften der Cutinase beinhalten. Die angewandten Methoden für die

Cutinaseinduktion, die rekombinante Produktion und Aufreinigung wurden in dem Übersichtsartikel

von Carvalho et al. 1999 beschrieben. Die F. solani Cutinase ist aufgebaut aus 197 Aminosäuren,

besitzt ein Molekulargewicht von 22 kDa und vier nichtvariable Cysteine bilden zwei Disulfidbrücken.

Die Cutinase gehört zur Klasse der Serin-Esterasen und zeigt die typische α/β-Hydrolase Faltung. Die

katalytische Triade ist zusammengesetzt aus Ser120, Asp175 und His188. Mit einer ortsspezifischen

Mutagenese wurden Studien über die funktionellen Interaktionen mit verschiedenen Substraten und

zur Identifikation der Struktur und Bindungen am aktiven Zentrum durchgeführt. Es sind viele Daten

über die thermale Stabilität der Cutinase in eingekapselten Präparationen und in kovalent

40 Einführung

gebundenen oder absorbierten Strukturen beschrieben worden. Hingegen gibt es bisher keine

Informationen über die thermale Stabilität des frei gelösten Enzyms (Carvalho et al. 1999).

Eine Cutinase Präparation von Genencore International, Inc. (GCI 2002/1410) wurde zum ersten Mal

für die Hydrolyse von Polyester eingesetzt. Freigesetzte Hydrolyseprodukte von PET-Textilien wurden

durch die Fluoreszenzdetektion von Hydroxyterephthalat nachgewiesen, ebenso die Steigerung der

Hydrophilie durch die Anfärbung und Farbintensitätsbestimmung (Andre und Charmoille 1999,

OŃeill und Cavaco-Paulo 2004). 2005 wurde eine granulierte Cutinase von Unilever Research and

Development Laboratory, Vlaardingen, gelöst in Puffer, eingesetzt und war in der Lage aromatische

Hydrolyseprodukte vom einem amorphen PET-Film (APET; 4,1% Kristallinität) und von PET Granulat

(GPET; 13,7% Kristallinität) während einer 5-tägigen Inkubation bei 30°C freizusetzen, detektiert

durch RP-HPLC. Die Cutinase setzte mehr Hydrolyseprodukte vom geringer kristallinen APET und nur

Spuren an Produkten vom höher kristallinen biaxial orientierten PET (OPET; 48,2% Kristallinität) frei.

Die Hydrolyseprodukte wurden identifiziert als TPA (Rt: 11,0 min), MHET (Rt: 12,3 min) und BHET (Rt:

12,9 min). Das Haupthydrolyseprodukt war MHET, aber das Verhältnis von MHET zu TPA war

abhängig vom Verhältnis von Enzym zum Substrat. Zusätzlich wurden höher molekulare

Hydrolyseprodukte während der Inkubation freigesetzt, allerding konnten die Produkte zu diesem

Zeitpunkt nicht strukturell identifiziert werden. Veränderungen auf der Polyesteroberfläche wurde

detektiert mittels einer ESCA-Analyse und zeigten Modifikationen auf dem PET-Film (Vertommen

et al. 2005).

Aus der Kultivierung eines neuen Fusarium sp. wurde eine Rohenzymlösung gewonnen, die

hydrolytische Aktivität gegenüber PET-Fasern bei 30°C besaß und freigesetzte aromatische Produkte

wurden mittels Fluoreszenz-und UV-Absorbtionsmessung nachgewiesen (Nimchua et al. 2007,

Nimchua et al. 2008).

Die genetisch modifizierte F. solani Cutinase, erhalten durch die Substitutionen L81A und L182A,

zeigte eine gesteigerte Polyesteraktivität gegenüber PET-Textilien. Die mit Hilfe von ortsspezifischen

Mutationen eingeführten Strukturen am aktiven Zentrum unterstützten die Stabilisierung des

Enzyms und erlauben eine bessere Einbettung des Substrates (Araújo et al. 2007). Mit der L182A

Substitutionsmutante und dem Wildtyp Enzym erfolgten mehrere Studien über den Einfluss der

Durchmischung auf die hydrolytische Effizienz. Die Inkubation der PET-Textilien erfolgte bei 37°C und

die Hydrolyseprodukte wurden mittels Fluoreszenzdetektion nachgewiesen. Die Detektion der

Modifikationen an den Textilien erfolgte durch eine Anfärbung mit Reaktivfarbstoffen und der

Bestimmung der Farbintensität. In der Studie wurde gezeigt, dass eine geringere Durchmischung

höhere Funktionalisierungsraten zu Folge hatte (OŃeill et al. 2007).

Intensivere Studien zur enzymatischen Oberflächenmodifikation und Funktionalisierung wurden mit

TEXAZYM EM durchgeführt (InoTEX Ltd., Tschechische Republik). Die Enzympräparation zeigte eine

41 Einführung

intensive Proteinbande in der SDS-PAGE bei etwa 22 kDa, womit es sich bei dem hydrolytischen

Enzym um eine Cutinase von F. solani handelt. Die Analyse der PET-Filme, erfolgt per FTIR, brachte

Informationen über die chemischen und strukturellen Eigenschaften sowie über den enzymatischen

Effekt auf der Oberfläche des Films. Abschließende Untersuchungen zeigten, dass der enzymatisch

behandelte Film effizient mit einem fluorszierenden Alkylbromid (2-Bromomethylnaphthalen (BrNP))

verestert werden konnten, was eines der neuen Anwendungsgebiete des biofunktionalisierten PET

ist (Donelli et al. 2009).

Bis zum jetzigen Zeitpunkt sind keine Informationen über eine Steigerung der Thermostabilität der

löslichen Cutinase von F. solani veröffentlicht. Das Enzym ist instabil oberhalb von 45°C und verliert

mehr als 80% seiner Aktivität über einen Zeitraum von 60 Minuten bei 60°C (Dutta et al. 2009).

In neuesten Studien wurde die hydrolytische Aktivität der eukaryotischen Cutinase aus F. solani

(40°C) und der bakteriellen Cutinase aus T. fusca (60°C) verglichen. Dabei wurde gezeigt, dass die

eukaryotische Cutinase mehr Hydrolyseprodukte in Abhängigkeit zu der eingesetzten Menge an

Protein (mg) freisetzte im Vergleich zur bakteriellen Cutinase (Chen et al. 2010).

Die Cutinase aus F. solani ist eine höchst aktive Hydrolase für PET-Modifikationen und von Interesse

für verschiedene Hydrolysestudien. In den nächsten Jahren sollte die Steigerung der Thermostabilität

durch eine Substitutionsmutagenese stärker untersucht werden, um das Interesse an dieser Cutinase

für die Anwendung zur PET Modifikation noch zu steigern.

Thermomyces (Humicola) insolens ist ein thermophiler Pilz. Ein lipolytische Enzym wurde in einer

E. coli Klonbibliothek, hergestellt aus der genomischen DNA aus H. insolens DSM 1800, identifiziert.

Die Cutinase wurde rekombinant produziert, chromatographisch aufgereinigt und charakterisiert. Die

Bestimmung des Molekulargewichts ergab 20-21 kDa, der isoelektrische Punkt des Enzyms betrug 8.

Das pH Optimum lag bei pH 8, aber auch mit einer hohen Aktivität bis pH 10. Das aktive Zentrum der

eukaryotischen Cutinase besteht aus den Aminosäuren Ser140, Asp195 und His208. Bei der

Untersuchung der lipolytischen Aktivität während eines Waschganges zeigte sich, dass das Enzym

eine hervorragende Fettentfernung bei den Textilien erzielte und eine hohe Affinität gegenüber

Olivenöl zeigte (Sandal et al. 1996).

Die Cutinase wurde eingesetzt für den Abbau von ETE und BEB, für die Bestimmung ihres Depilling

Effekts und die Farbauffrischungsfähigkeit bei Polyestertextilien bei 50°C und zeigte bei allen

Untersuchungen ausgezeichnete Ergebnisse (Andersen et al. 1999).

Die hydrolytische Aktivität der Cutinase gegenüber zyklischen PET-Trimeren (CTR) wurde ebenfalls

untersucht. Während der Inkubation von 16 Stunden bei 30°C wurden durch das Enzym 56% der

zyklischen Oligomere hydrolysiert. Das Haupthydrolyseprodukt war MHET und nur geringe Mengen

an TPA und BHET konnten detektiert werden (Riegels et al. 2001).

42 Einführung

Durch eine lokale zufällige Mutagenese konnten neue Varianten der Cutinase hergestellt werden und

die positiven Klone wurden durch die Inkubation bei 60°C selektiert. Drei positive Varianten wurden

isoliert und durch eine Sequenzierung erfolgte die Identifizierung der Modifikationen A14P + E47K,

E47K und E179Q verglichen zur Wildtyp Cutinase. Durch eine ortsspezifische Mutation wurden

zusätzliche Modifikationen eingefügt. Für sieben Mutanten erfolgte die Bestimmung der

Thermostabilität mittels DSC. Die Wildtyp Cutinase besaß eine Td (thermale Denaturierungs-

temperatur) von 61°C bei pH 4,5. Fünf der Varianten besaßen eine Td von 64-66°C, was eine

Erhöhung von 3-5°C bedeutete. Eine Variante (E6Q, E10Q, A14P, E47K, R51P, E179Q) wies eine

erhöhte Thermostabilität während der CTR Hydrolyse auf und eine optimale Oligomerentfernung bei

pH 9 und 75°C. Das Temperaturoptimum dieser Mutante lag bei 65°C (Abo et al. 2004).

Weitere Mutanten wurden durch eine ortsspezifische Mutagenese mit dotierten Oligonukleotiden

erzeugt. Die erstellten Bibliotheken wurden nach Varianten mit einer höheren Thermostabilität

mittels Hofbildung auf BETEB Agarplatten bei 68°C durchsucht. Alle erzeugten Mutanten bildeten

Höfe bei 68°C, der Wildtyp jedoch nicht, seine bevorzugte Wachstumstemperatur lag bei 60°C. Einige

Varianten waren auch noch aktiv während der Inkubation bei 76°C. Bei der DSC

Thermostabilitätsbestimmung bei pH 10 zeigte der Wildtyp eine Td von 68°C, hingegen zeigten drei

Varianten eine Td von 71-72°C. Somit konnte eine deutliche Steigerung der Thermostabilität erzielt

werden. Mit einer dieser Varianten wurden zusätzliche Textilienbehandlungen durchgeführt

(Waschgänge, Behandlung der Polyestertextilien und Gewichtsverlustberechnungen,

Reinigungseffekt gegenüber Fettflecken, Depillingeffekt und Effekt auf die Wasserabsorption), die

meisten Behandlungen erfolgten bei 75°C und die Mutante zeigte exzellente Resultate (Svendsen

et al. 2005).

2003 veröffentlichten Hooker et al. Abbauergebnisse unter Anwendung einer Cutinase von Novozym

North Amerika, Inc. (Franklinton, NC). Die Cutinase wurde für die Hydrolyse von CTR bei 60°C mit

verschiedenen CTR- und Enzymkonzentrationen, unter Zugabe von Lösungsmitteln und für eine

Langzeitinkubation eingesetzt. Durch die Variation der Reaktionsparameter konnte eine annähernd

komplette Hydrolyse der CTR erreicht werden. Die nachgewiesenen Abbauprodukte waren nur TPA,

MHET und BHET, es konnten keine linearen Dimere oder Trimere per RP-HPLC detektiert werden. Das

bedeutet, dass nach der Ringöffnung eine schnelle Hydrolyse der CTR erfolgte und somit fast alle

Esterbindungen gespalten wurden. Die Durchmischung konnte als ein wichtiger Faktor für die

Hydrolyserate identifiziert werden. Eine höhere Durchmischung resultierte in einer höheren

prozentualen Hydrolyse. Zusätzlich zeigten höhere Enzymkonzentrationen eine komplettere

Hydrolyse der Esterbindungen und das Hauptprodukt verschob sich von MHET zu TPA (Hooker et al.

2003).

43 Einführung

Weitere Studien mit der entwickelten Cutinase wurden 2006 von der gleichen Arbeitsgruppe

durchgeführt. Der Einfluss der Partikelgröße der CTR auf die Enzymkinetik wurde bei 60°C

untersucht. Grob dispergierte CTR zeigten eine größere Partikelgröße als aus einer Dioxanlösung

ausgefällte CTR. Als Konsequenz für die größere Partikelgröße wurde eine heterogene Kinetik 0.

Ordnung detektiert, hingegen zeigten die kleineren Partikel eine homogene Kinetik 1. Ordnung.

Deshalb wurde geschlussfolgert, dass weitere Studien für einen optimaleren Abbau mit Trimeren der

kleineren Partikelgröße durchgeführt werden sollten (Figueroa et al. 2006).

Zwei Mutanten aus dem Patent von Svendsen et al. (2005) wurden ausgewählt für die

Charakterisierung der neuen Varianten. Die Variante A hatte folgende Substitutionen: E6Q, G8D,

A14P, N15D, T29M, E47K, S48E, R51P, A88H, N91H, A130V, T166I, L167P, E179Q, R189V und die

Variante B: E6Q, G8D, A14P, N15D, E47K, S48E, R51P, A88H, N91H, A130V, E179Q, R189V. Die

entwickelten Enzyme wurden angewandt für die Bestimmung ihrer Depilling Eigenschaften bei 70°C

mit und ohne der Zugabe von Triton X-100 als Lösungsvermittler und ihrer Fähigkeit zum Biopolishing

von 100% Polyester und 50%/50% Polyester/Baumwolle Mischgarn bei 70°C. Die Mutante B zeigte

eine höhere hydrolytische Aktivität während der Polyesterbehandlung und exzellente Ergebnisse bei

der Anwendungstemperatur von 70°C (Jump und McCloskey 2004).

Novozym China veröffentlichte 2008 Ergebnisse von enzymatischen Hydrolysestudien von PET-

Textilien zur Steigerung der Hydrophilizität unter Anwendung der Cutinasevariante B von T. insolens.

Der optimale pH Bereich für die Enzympräparation lag bei pH 7-9 und der optimalen Temperatur

Bereich von 65 bis 80°C. In Verbindung mit Triton X-100 konnte bereits bei einer

Cutinasekonzentration von 5 LU/ml eine Durchfeuchtungszeit von 5 Sekunden erreicht werden,

hingegen ohne Lösungsvermittler und mit 200 LU/ml Cutinase wurde eine Durchfeuchtungszeit von

180 Sekunden plus x bestimmt. Die Hydrophilizität und Feuchtigkeitseigenschaften wurden analysiert

durch den Tropfentest (Liu et al. 2008).

Zusätzliche Abbauergebnisse zur PET-Behandlung mit der T. insolens Cutinase wurden 2009

veröffentlicht. Es erfolgte ein Vergleich zwischen der T. insolens Cutinase und zwei weiteren

Cutinasen, einer bakteriellen und einer weiteren eukaryotischen. Die PET-Film Hydrolyse erfolgte bei

70 bis 80°C mit der Cutinase aus T. insolens. Der PET-Film mit der geringen Kristallinität wies eine Tg

von 75°C auf, das bedeutet, dass die Abbaustudien sowohl 5°C unterhalb als auch oberhalb der

Glasübergangstemperatur des PET-Films erfolgten und somit unter optimalen Bedingungen. Mit

dieser Gewissheit war es nicht verwunderlich, dass die entwickelte Cutinase die besten

Abbauergebnisse erzielte mit 100% Gewichtsverlust nach 96 Stunden Inkubation bei 70°C. Ein

adäquates Kinetik-Modell für den Filmabbau wurde ebenfalls bestimmt und mittels RP-HPLC wurde

TPA als Haupthydrolyseprodukt identifiziert (Ronkvist et al. 2009).

44 Einführung

Zu diesem Zeitpunkt ist die entwickelte Cutinase aus T. insolens, erhalten durch ortsspezifische

Mutagenese, das wohl beste PET-hydrolysierende Enzym.

Die Cutinase aus dem gram (-) Pseudomonas putita (später umbenannt in Pseudomonas mendocina)

wurde 1987 aus einer Bakterienkultur aus einer Phyllosphäre identifiziert und zeigte die höchste

cutinolytische Aktivität zwischen pH 9 und 11. Die Wachstumstemperatur war für diesen Stamm mit

41°C relativ hoch und bei der Temperaturstabilitätbestimmung zeigte die Cutinase im extrazellulären

Überstand nach 1 Stunde Inkubation bei 60°C 100% Restaktivität und bei 70°C 85% Restaktivität

(Sebastian et al. 1987). Nach der Aufreinigung der Cutinase wurde das Molekulargewicht mittels SDS-

PAGE und Größenausschlusschromatographie auf 30 kDa bestimmt und eine monomerische Struktur

wurde geschlussfolgert. Das pH Optimum für die Cutinhydrolyse des aufgereinigten Enzyms lag

zwischen pH 8,5 und 10,5 (Sebastian et al. 1988).

Die Cutinase zeigte keine Grenzflächenaktivierung, aber die typische α/β-Hydrolase Faltungsstruktur

und ein aktives Zentrum mit Ser126, Asp176 und His206. Es erfolgte ein positionsspezifischer

Aminosäurenaustausch, um die Cutinase für die Fetthydrolyse und die Detergenzienanwendung zu

verbessern. Die Cutinase aus P. mendocina wurde aufgrund der Triglyceridhydrolyse im alkalischen

Bereich ausgewählt. Der Austausch an Position Y202L/R203L steigerte die Acylkettenbindung der

Triglyceride und damit die Aktivität gegenüber längeren Triglyceriden mit C18 Acylseitenketten

(Boston et al. 1997).

Die ersten enzymatischen Behandlungen von PET-Textilien wurden 1988 mit der Cutinase aus

P. mendocina, zur Verfügung gestellt von Genencore International, durchgeführt. Die Cutinase

steigerte die Durchfeuchtungs- und Absorbtionseigenschaften von Dacron 54 (PET-Homopolymer),

Dacron 64 (sulfoniertes PET, SPET) und MicromattiqueR (Mikrodenier PET). Die optimalen

Reaktionsbedingungen lagen mit 0,12 g/L Cutinase bei 35°C für 10 Minuten. Im Vergleich zur

alkalischen Hydrolyse zeigte die Cutinasebehandlung den Vorteil, dass sie eine stärkere Steigerung

der Durchfeuchtung bei einer geringeren Temperatur (Hsieh und Cram 1998, Hsieh et al. 2003)

erzielte. In weiteren Studien wurde die Cutinase eingesetzt, um die Farbstoffaufnahme und

Absorption von kationischen Farbstoffen bei Dacron 54 und Dacron 64 nach einer Behandlung für 24

Stunden bei 40°C zu untersuchen. Vor der Färbung wurden die Textilien mit einer Protease und

Triton X-100 behandelt und gründlich gewaschen, um die anheftenden Proteinverunreinigungen zu

entfernen. In einer anderen Untersuchung wurde nachgewiesen, dass die Cutinasebehandlung eine

Steigerung des Depillingeffekts zur Folge hatte, zusätzlich wurde ein Gewichtsverlust im Vergleich zur

Kontrolle detektiert und die Oberflächenmodifikationen der PET-Fasern per SEM beobachtet. Die

Cutinase modifizierte ebenso PTT Fasern, ebenfalls nachgewiesen durch die Farbstoffaufnahme. Die

während der enzymatischen Inkubation freigesetzten Hydrolyseprodukte wurden mittels UV

45 Einführung

Absorbtionsmessung und RP-HPLC nachgewiesen. Das detektierte Produkt nach der

Natronlaugebehandlung war nur TPA, hingegen bei der Cutinasebehandlung wurde ein unbekanntes

Produkt analysiert. Mit der Cutinase aus P. mendocina wurde zum ersten Mal gezeigt, dass nur

Textilien mit einer geringen Orientierung/Kristallinität effektiv hydrolysiert werden im Gegensatz zu

hoch orientierten/kristallinen Textilien (Yoon et al. 2002, Dyson et al. 2005).

Eine ortsspezifische gesättigte Mutagenese erfolgte mit der Cutinase aus P. mendocina, um die

hydrolytische Aktivität gegenüber Polyethylenterephthalat Textilien und/oder die Enzymstabilität zu

steigern. Die Mutanten wurden bezüglich ihre Freisetzung von löslichen TPA-enthaltenden Derivaten

während der enzymatischen Hydrolyse von PET mittels UV Absorptionsmessung im Plattenleser

getestet. Die Stabilitätsuntersuchungen wurden ebenfalls im Plattenleser anhand der Spaltung von p-

NPB ermittelt. Die ortsspezifische abgesättigte Mutagenese an den Positionen 63-65, 178-182, 205,

209 und 211 hatte Varianten zur Folge, von denen mehr als 2% eine höhere Aktivität besaßen als die

Kontrolle. Mutationen an den Positionen 59, 64, 150, 177, 180 und 182 brachten Varianten hervor,

von denen mehr als 2% der Klone eine größere Stabilität aufwiesen gegenüber der Kontrolle.

Varianten die sowohl eine erhöhte Aktivität und Stabilität zeigten, wiesen Substitutionen an den

Positionen 64, 180, 182 und 211 auf. Zusätzliche Mutationen wurden durchgeführt und der

Austausch des Serins an den Stellen 20 und 85 kreierten neue Bibliotheken mit neuen Positionen.

Mutanten mit einer Substitution von Phenylalanin an der Position 180 durch Isoleucin, Leucin,

Asparagin oder Prolin brachten Varianten hervor mit einer erhöhten Stabilität gegenüber dem

Wildtyp. Ebenso zeigte ein Austausch des Glycins an der Position 59 mit Phenylalanin, Lysin, Leucin

oder Valin eine Erhöhung der Stabilität im Vergleich zum Wildtyp. Die Kombination der

Substitutionen von Phenylalanin an der Position 180 und Serin an der Position 205 ergaben Varianten

mit einer signifikanten Steigerung der relativen Stabilität. Zusätzliche Austausche an einer bis drei

Positionen hatten Mutanten zur Folge mit gesteigerter PET-Hydrolaseaktivität (Bott et al. 2003).

Nicht überraschend zeigte die Cutinase von P. mendocina in den Untersuchungen von Ronkvist et al

(2009) ein Temperaturoptimum von 50°C. Verglichen zu den Cutinasen von T. insolens und F. solani

zeigte die Cutinase von P. mendocina die stärkste Affinität gegenüber PET. Während einer 96

stündigen Abbaustudie bei 50°C setzte die Cutinase nur TPA und Ethylenglycol als lösliche Produkte

vom gering kristallinen PET-Film (7% Kristallinität) frei, detektiert durch die RP-HPLC. Der

Gewichtsverlust des Films war nur 5% aufgrund der Temperaturdifferenz von etwa 25°C zwischen der

Inkubationstemperatur und der Glasübergangstemperatur des PET (Ronkvist et al. 2009).

Zusammenfassend ist aufgrund der Tatsache, dass PET besser abbaubar ist bei Temperaturen um 75

bis 80°C, die Temperaturstabilität und die optimale Reaktionstemperatur für eine industrielle

Anwendung immer noch zu gering.

46 Einführung

Thermobifida (zuvor Thermomonospora) fusca ist ein gram (+), thermophiler, aerober,

sporenbildender Actinomycet mit einem Temperaturoptimum zwischen 50 und 55°C. Sein

natürliches Habitat sind Dung, Kompost und überhitztes Heu (McCarthy 1989).

Vier verschiedene Stämme von T. fusca sind bisher bekannt und untersucht, T. fusca DSM 43792

(ATCC 27730) und seine Mutanten, T. fusca DSM 43793, T. fusca YX und T. fusca KW3.

Der erste untersuchte Stamm war der Referenzstamm T. fusca DSM 43792, welcher auf die Bildung

von cutinolytischer Aktivität getestet wurde. Die Rohenzymlösung zeigte eine optimale Temperatur

von 50 bis 70°C und einen optimalen pH von 11. Die Enzympräparation besaß eine Halbwertszeit bei

70°C von 60 Minuten (Fett et al 1999).

Weiterführend wurde eine Mutante des Referenzstamms mittels DES und UV-Licht Behandlung

erzeugt. Diese Mutante, WSH04, zeigte eine höhere Cutinaseproduktion gegenüber dem Wildtyp.

Mit diesem Bakterienstamm erfolgte die Optimierung der Cutinaseproduktion durch eine zwei-

stufige pH Kontrolle und eine maximale Cutinaseaktivität von 19,8 U/ml konnte erreicht werden nach

50 Stunden Inkubation (Du et al. 2007).

Eine Enzympräparation von T. fusca KW3 mit Esteraseaktivität, induziert während des Wachstums

mit Suberin, zeigte nach der Inkubation mit PET-Fasern, PBT-Fasern und recyceltem PET-Granulat

eine Freisetzung von aromatischen Bestandteilen bei 50°C und 70°C. Mit der höheren Temperatur

konnten mehr Hydrolyseprodukte nachgewiesen werden. Die Effekte der Fasermodifikation wurden

nach der Färbung mit Reaktivfarbstoffen durch die Bestimmung der Farbintensität nachgewiesen,

ebenso wie mit der Steighöhenbestimmung und Flüssigkeitsaufnahmekapazitätsmessung (Alisch

et al. 2004, Alisch-Mark et al. 2006, Feuerhack et al. 2008).

Ein weiteres Enzym mit cutinolytischer Aktivität wurde 2005 aus T. fusca DSM 43793 isoliert: BTA1

(TfH). Dieses Enzym wurde induziert durch den aliphatisch-aromatischen Copolyester (BTA40:60) und

dessen Oligomere, aber nicht mit dem Monomer TPA oder mit Poly-ε-caprolacton (PCL) produziert.

Die molekulare Masse des Enzyms war 28,2 kDa, der pI lag bei 6,43. TfH ist eine aus 261

Aminosäuren bestehende Serin-Hydrolase. Die katalytische Triade besteht aus den Aminosäuren

Ser132, Asp176 und His210. Das Enzym konnte Cutin aus Apfelschalen abbauen und das aktive

Zentrum ist frei zugänglich, das heißt, dass kein schließender Deckel das aktive Zentrum bedeckt

(Kleeberg et al. 2005). Zusätzlich baute die TfH käufliche PET-Flaschen und PET-B Pellets bei 55°C ab

(Müller et al. 2006). In weiteren Arbeiten wurde die Cutinase rekombinant in E. coli und nach einer

Codonoptimierung in B. megaterium mit einem N-terminalen Signalpeptid für die B. megaterium

Lipase A und einem C-terminalen His6-Anhang unter der Kontrolle eines Xylose-induzierten

Promotors produziert (Dresler et al. 2006, Yang et al. 2007). Alle diese Studien über die Cutinase TfH

aus T. fusca DSM 43793 basieren auf einem Patent von Deckwer et al. aus dem Jahr 2000, in dem die

Lokalisation der Gene der BTA Hydrolasen BTA1 und BTA2 beschrieben wurde. Beide Enzyme liegen

47 Einführung

nacheinander im Genom vor und nach ihrer Transkription und Prozessierung besitzen sie fast das

gleiche Molekulargewicht (beide bestehen aus 261 Aminosäuren, BTA1 mit 28,2 kDa und BTA2 mit

28,4 kDa). Bei einem Sequenzvergleich wurde festgestellt, dass 20 der 261 Aminosäuren sich in den

beiden Cutinasen unterscheiden, woraus sich eine 92% Übereinstimmung der beiden Cutinasen

ableiten lässt (Deckwer et al. 2000). Bisher wurden nur Studien über eine PET-hydrolysierende

Aktivität mit BTA1 (TfH) durchgeführt, da die hydrolytische Aktivität der BTA2 geringer war. Die

rekombinante TfH baute das PET Modellsubstrat BETEB ab und steigerte die Hydrophilität von PET-

Textilien während der enzymatischen Behandlung (die Inkubationstemperatur wurde nicht genannt).

Der Nachweis der Modifikation erfolgte mittels Steighöhenbestimmung und Tropfentest (Heumann

et al. 2006). Die Hydrolyse von BHPT, der bis(3-Hydroxypropyl)Ester der Terephthalsäure, erfolgte bei

60°C über einen Zeitraum von 24 Stunden. Die TfH hydrolysierte zunächst das BHPT zu MHPT und

später den Monoester komplett zu Terephthalsäure. Hingegen wurde beim Abbau von zyklischen

PPT-Dimeren bei 60°C durch die TfH kein BHPT nachgewiesen. Zu Beginn der Hydrolyse war das

Hauptprodukt MHPT (bis etwa 48 Stunden Inkubation), aber nach 96 Stunden wurde TPA in höheren

Konzentrationen detektiert. Die PTT-Film-Modifikationen durch die TfH bei 60°C wurden

nachgewiesen durch die Erniedrigung des Kontaktwinkels nach der Behandlung und durch den

fehlenden Kristallisationspeak bei 72°C, analysiert per DSC. Dabei betrug der Temperaturunterschied

zwischen der Inkubationstemperatur und der Glasübergangstemperatur (Tg) 12°C. Die Behandlung

von PTT-Textilien mit der Cutinase aus T. fusca bei 60°C zeigte ebenfalls eine hydrolytische Aktivität

durch die Freisetzung von MHPT und TPA, den bestimmten Gewichtsverlust und eines deutlichen

Anstiegs des K/S Verhältnisses (Eberl et al. 2008). Weiterhin wurde die enzymatische Behandlung von

PET-Textilien mit der TfH bei 60°C untersucht. Die Modifikationen wurden nachgewiesen durch die

Detektion der Hydrolyseprodukte per HPLC, von den amorphen Textilien wurden TPA, MHET und

BHET freigesetzt und von den semi-kristallinen Textilien TPA und MHET. Veränderungen in der

elementaren Zusammensetzung der Textilien nach der enzymatischen Behandlung wurden durch

eine XPS-Analyse nachgewiesen. Zusätzlich erfolgte der Nachweis der Oberflächenmodifikationen

durch einen Tropfentest, durch die Bestimmung der Durchfeuchtungszeit und eine K/S-

Verhältnisbestimmung (Brueckner et al. 2008). Überraschenderweise ergab die Zugabe von Triton X-

100 zum BETEB (3PET)-Abbau keine Steigerung der hydrolytischen Aktivität der Cutinase während

der Inkubation bei 60°C. Hingegen zeigte die Addition von N,N-Diethyl-2-Phenylacetamid (DEPA),

einem Weichmacher, eine Steigerung der Abbaurate bei den semi-kristallinen PET-Filmen und

Textilien. Daraus wurde geschlussfolgert, dass für die Cutinase aus T. fusca die Zugabe eines

Weichmachers für eine Steigerung der Hydrolyserate angewandt werden sollte (Eberl et al. 2009).

Basierend auf der vollständigen Sequenzierung des Genoms von T. fusca YX im Jahre 2008 (Lykidis

et al. 2008) wurden zwei ähnliche Cutinasen aus T. fusca WSH03-11 identifiziert (Chen S et al. 2008,

48 Einführung

Chen J et al. 2008). Beide Enzyme, kloniert und produziert in E. coli, wiesen ähnliche enzymatische

Eigenschaften auf und beide hydrolysierten Apfelcutin unter Freisetzung von Cutinmonomeren. Die

optimale Temperatur für die Hydrolyse von Triolein und p-NPB lag bei beiden Enzymen bei 60°C und

der optimale pH Wert lag bei 8. Eine verbleibende Restaktivität von 80% nach 160 Stunden

Inkubation bei 40°C und eine Restaktivität von 50% nach 40 Stunden Inkubation bei 60°C wurde

nachgewiesen (Chen S et al. 2008). Die identifizierten Cutinasen zeigten eine 93% Übereinstimmung

ihrer Proteinsequenz. Interessanterweise konnte während der Inkubation der Enzyme mit zyklischen

PET-Trimeren (CTR) bei 60°C nur eine Cutinase lösliche Hydrolyseprodukte freisetzen. Die löslichen

Hydrolyseprodukte wurden mittels RP-HPLC analysiert und per LC-MS verifiziert (Chen et al. 2010).

Zusammenfassend ist bekannt, dass der thermophile Actinomycet T. fusca zwei Isoenzyme mit mehr

als 90% Übereinstimmung produziert, welche sich in ihrer Hydrolyserate gegenüber PET deutlich

unterscheiden. Nur mit einer der Cutinasen konnten PET-Textilien effektiv modifizieren werden. Die

Untersuchung der Unterschiede der beiden Enzyme durch die Bestimmung der Kristallstrukturen,

durch Sequenzvergleiche und Mutationsanalysen und die Bestimmung ihres Einflusses auf die

katalytische Aktivität gibt einen interessanten Einblick in die PET-Hydrolysereaktion. Zusätzlich sollte

auch für diese Enzyme eine Steigerung der Thermostabilität und Aktivität durch eine ortsspezifische

Mutagenese oder einen Austausch von Aminosäuren im Hinblick auf eine industrielle Anwendung

erfolgen.

49 Einführung

1.5 Zielsetzung

Besonders thermophile Actinomyceten sind außerordentlich leistungsfähig beim Abbau von

Kunststoffen sind (Kleeberg et al. 1998). Ferner spielen Actinomyceten, darunter auch

Thermomonospora spp., eine wichtige Rolle beim Abbau von Pflanzenpolymermaterial und sind

ebenfalls in der Lage, eine große Vielfalt an hydrolytischen extrazellulären Enzymen zu bilden (Wilson

1988; Zimmermann 1989; Röthlisberger et al. 1992; Hilge et al. 1998). Bei Untersuchungen mit

Streptomyces spp. (Lin und Kolattukudy 1980; Fett et al. 1992) und Thermomonospora fusca (Fett

et al. 1999) konnte eine Cutinaseaktivität nachgewiesen werden, welche die Hydrolyse des

aliphatischen Pflanzenpolyesters Cutin verursachte. Von Zimmermann et al. (1985) und Bernards

et al. (1995) ist bekannt, dass auch der pflanzliche Polyester Suberin sowohl aliphatische als auch

aromatische Regionen enthält und aufgrund seiner Struktur zur Induktion von Polyester

hydrolysierenden Enzymen in Actinomycetenisolaten eingesetzt werden könnte.

Diese hydrolytischen Enzyme können mit ihren günstigen Eigenschaften, wie zum Beispiel

Temperaturstabilität oder Substratspezifität, bei der Entwicklung eines biotechnologischen

Verfahrens zum Abbau von PET-Oligomer eingesetzt werden.

Dadurch eröffnet sich die Chance, durch den Einsatz von spezifischen Biokatalysatoren zur

Elimination von synthetischen PET-Oligomer ein alternatives umweltfreundliches biotechnologisches

Verfahren zur Textilveredelung von Chemiefasern zu erhalten.

Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung eines biokatalytischen Abbaus von PET-Oligomeren,

welcher umweltfreundlich und faserschonend zugleich ist und somit eine optimale Alternative zur

problembehafteten industriellen Textilveredelung darstellt.

Mit dem aus Kompost gewonnenen Actinomyceten Thermobifida fusca KW3 wurde ein Enzym (TfCa)

produziert, welches in der Lage war, die PET-Oligomere auf der Faseroberfläche abzubauen, ohne die

Faser zu beschädigen. Nach der Optimierung der Induktion der Hydrolase erfolgte die Produktion des

Enzyms in größeren Mengen und es wurde eine Methode zur Aufreinigung entwickelt. Anschließend

wurde die TfCa biochemisch charakterisiert und verglichen mit bereits bekannten PET-Hydrolasen.

Desweiteren erfolgte die Aufreinigung der beiden rekombinant produzierten Cutinasen TfCut1 und

TfCut2 aus T.°fusca KW3 parallel zu rekombinant produzierten Carboxylesterase TfCa, welche alle

drei in der Lage waren, PET mit unterschiedlicher Effektivität zu modifizieren.

Mit den aufgereinigten Enzymen und weiteren bekannten PET-Hydrolasen aus

Fusarium solani sp. pisi, T. fusca sp. und einer eukaryotischen Cutinasepräparation von Novozymes

erfolgten anschließend Abbauversuche, um den Abbaumechanismus auch im Vergleich zueinander

zu untersuchen. Dabei kamen verschiedene PET-Substrate in Form von PET-Trimeren, PET-Fasern

und PET-Film zum Einsatz.

Material und Methoden 50

2 Material und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Verwendete Mikroorganismen

Thermobifida fusca KW3 (Thermomonospora), ein Isolat aus Komposterde, ist ein gram positives

aerobes thermophiles und alkalophiles Bakterium, das den Actinomyceten zugeordnet wurde.

Hinterlegt ist der Stamm unter der Stammbezeichnung DSM 6013 bei der Deutschen

Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (Braunschweig, Deutschland). Die optimalen

Wachstumsbedingungen für T. fusca KW3 sind 50-55°C und pH 7,3 (Casimir-Schenkel 1992). Die

Kultivierung von T. fusca KW3 erfolgte auf Czapek-Medium.

Des Weiteren wurden T. fusca DSM 43792 und T. fusca DSM 43793, bezogen von der Deutschen

Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (Braunschweig, Deutschland), in die

Arbeiten einbezogen. Die Kultivierung von T. fusca DSM 43792 erfolgte ebenfalls mit Czapek-

Medium, die Kultivierung von T. fusca DSM 43793 mit einem modifizierten Czapek-Medium, welches

6,1 g/L Casein Hydrolysat anstatt 5 g /L Pepton enthielt.

2.1.2 Verwendete Enzyme

Die aufgereinigte Carboxylesterase (EC 3.1.1.1) TfCa aus T. fusca KW3 wurde mit einer spezifischen

Aktivität von 11,6 U/mg bei den Abbauuntersuchungen eingesetzt, dazu wurde die erhaltene

vereinigte Enzymlösung gefriergetrocknet und bei –20°C gelagert.

Für die Abbauuntersuchungen wurde ebenfalls eine eukaryotische Cutinase (EC 3.1.1.74) aus

Fusarium solani pisi, erhalten von Unilever Research and Development Laboratory in Vlaardingen,

eingesetzt. Die Cutinase lag in immobilisierter Form vor und wurde, wie von Vertommen et al. (2005)

beschrieben, vorbereitet. Weiterhin wurde eine Cutinase, vorliegend als flüssiges Konzentrat von

Novozymes (NS-29061, LN05012), für die Abbauuntersuchungen verwendet.

Die Cutinasen 1 und 2 aus dem Isolat T. fusca WSH03-11 wurden rekombinant produziert von Chen S

et al. (2008) erhalten und lagen lyophilisiert vor (Chen J et al. 2008).

Die rekombinant produzierten Cutinasen TfCu1 und TfCu2 und die Carboxylesterase TfCa aus T. fusca

KW3, bereitgestellt von Herrn Ren Wei und Herrn Thorsten Oeser, lagen aufgereinigt mit einer

spezifischen Aktivität von 230 U/mg, 155 U/mg und 204 U/mg in Lösung vor.


2.1.3 Größenstandards

2.1.3.1 Low Molecular Weight Marker (GE Healthcare)

Der Proteinstandard diente zum Abschätzen der molekularen Größe der Proteine im SDS Gel. Die

enthaltenen Proteine besaßen eine Größe von 97 000 g/mol, 66 000 g/mol, 45 000 g/mol,

30 000 g/mol, 20 100 g/mol und 14 400 g/mol.

2.1.3.2 Roti®-Mark Standard (Fa. Carl Roth GmbH)

Der Roti®-Mark SDS Proteinstandard wurde für die Berechnung des Molekulargewichtes der Esterase

verwendet. Die enthaltenen Proteine besaßen eine Größe von 200 000 g/mol, 119 000 g/mol,

66 000 g/mol, 43 000 g/mol, 29 000 g/mol, 20 000 g/mol und 14 500 g/mol.

2.1.3.3 SpectraTM Multicolor Broad range Protein Ladder (Fermentas)


enhaltenen Proteine besaßen eine Größe von 260 000 g/mol, 135 000 g/mol, 95 000 g/mol,

72 000 g/mol, 52 000 g/mol, 42 000 g/mol, 34 000 g/mol, 26 000 g/mol, 17 000 g/mol und

10 000 g/mol.

2.1.3.4 PageRulerTM plus prestained protein ladder (Fermentas)


enhaltenen Proteine besaßen eine Größe von 250 000 g/mol, 130 000 g/mol, 95 000 g/mol,

72 000 g/mol, 55 000 g/mol, 36 000 g/mol, 28 000 g/mol, 17 000 g/mol und 11 000 g/mol.


2.1.3.5 Kalibrierungskit für pI Bestimmung (pH 3-10, GE Healthcare)

Das Kalibrierungskit für die pI Bestimmung wurde für die Berechnung des pI der Esterase mittels

Isoelektrischer Fokusierung verwendet.

Abbildung 23: Kalibrierungskit für die pI Bestimmung, Breiter pI Bereich (pH 3-10, rechte Spur, GE Healthcare).

2.1.3.6 Kalibrierungskit für die Größenausschlusschromatographie (LMW, GE Healthcare)

Das Kalibrierungskit für die Größenausschlusschromatographie wurde für die Kalibrierung der

Größenausschlusschromatographiesäule verwendet.

Tabelle 9: Das Kalibrierungskit für die Größenausschlusschromatographie.

Protein Molekulargewicht (g/mol) Herkunft Position

Blue dextran 2000 2 000 000

Conalbumin 75 000 Hühnerei a

Ovalbumin 43 000 Hühnerei b

Carboanhydrase 29 000 Schweineerythrozyten c

Ribonuclease A 13 700 Schweinepankreas d

Aprotinin 6 500 Schweinelunge e


0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 50 100 150 200 250 300 350 400

UV

(m

AU

)

Elutionsvolumen (ml)

y = -0.03x + 17.239R² = 0.9891

0

5

10

15

200 250 300ln M

ole

kula

rge

wic

ht


Abbildung 24: Elutionsprofil des Kalibrierungskit für die Größenausschlusschromatographie eluiert von einer XK 26/60

Säule, Superdex 200 prep grade, 320 ml SV, 50 mM Tris HCl pH7,2 150 mM NaCl, 2,5 ml/min, 280 nm und dazugehörige Kalibrierkurve (kleine Abbildung).

2.1.4 Chemikalien

Die Chemikalien wurden, wenn nicht weiter erwähnt, mit der Reinheit p.a. eingesetzt.

Acros Organics (Geel, Belgium) Diethylterephthalat (DET), 2-Naphtylacetat,

Phenylmethyl-sulfonylfluorid (PMSF),

Thiamindichlorid

Aldrich Chemical Company (St. Louis, UAS) p-Aminobenzoat, (NH4)6Mo7O24 x 4 H2O,

Terephthalsäure (TPA)

Fluka Chemie (Buchs, Schweiz) Coomassie Brilliant Blue R250, Jodacetamid, N,N´-

Methylenbisacrylamid, Poly(ε-caprolacton) (PCL)

Grüssing GmbH (Filsum, Deutschland) Essigsäure, KH2PO4, NaH2PO4 x 2 H2O, Na2HPO4,

(NH4)2SO4, NH4OH

Macherey-Nagel GmbH & Co. KG (Düren, N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoracetamid (MSTFA)

Deutschland)

a

b

c

d

e


Merck (Darmstadt, Deutschland) Acrylamid, AgNO3, Biotin, CuCl2 x 2 H2O, Eisessig,

Ethanol absolut, FeCl3 x 6 H2O, FeSO4 x 7 H2O,

Glycerin, konz. HCl, Hefeextrakt, Hexansäure

(Caproinsäure), Isopropanol, KCl, K2HPO4, MgSO4 x 7

H2O, MnCl2 x 4 H2O, NaNO3, Natriumsulfit, NH4Cl,

Niacinamid, Triton-X-100, Vitamin B12, ZnCl2

Riedel de Haën AG (Seelze, Deutschland) n-Caprylsäure, Malachitgrün-Oxalat, Safranin T

Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Deutschland) Acetonitril HPLC rein, Agar, Buttersäure, CHAPS,

Glycin, β-Mercaptoethanol, Methanol HPLC rein,

NaCl, NaOH, NH4HCO3, Pepton, Roti-Quant,

Saccharose, SDS, Tributyrin, Tricaprylin,

Trifluoressigsäure (TFA), TRIS

Scharlau Chemie S.A. (Barcelona, Spanien) 1,4-Dioxan

Serva Feinbiochemika GmbH Bromphenolblau, BSA, EDTA

(Heidelberg, Deutschland)

Sigma Chemical Company (St. Louis, UAS) Ammoniumpersulfat, bis (2-hydroxyethyl)

Terephthalat (BHET), Chymotrypsin, D,L-6,8-

Dithiooctansäure, Dithiothreitol (DTT), Ethylenglycol,

Fast Red TR Salt, Folsäure, Formaldehyd, Gum

arabicum, Methyloleat, Na2B4O7 x 10 H2O, para-

Nitrophenylacetat (p-NPA), para-Nitrophenylbutyrat

(p-NPB), para-Nitrophenylcaprylat (p-NPC), para-

Nitrophenylpalmitat (p-NPP), D-Panthotensäure,

Pyridoxalhydrochlorid, Riboflavin, N,N,N´,N´-

Tetramethylethyldiamin, Tosyl-L-phenylalanine-

chloromethylketon (TPCK), Tricaproin, Trypsin,

Zitronensäure

VEB Laborchemie Apolda (Deutschland) Ammoniumoxalat, CaCO3, Oxalsäure


2.1.5 Geräte und Materialien

Chromatographie-Säulen XK 16/20 (GE Healthcare, München, Deutschland)

XK 16/40 (GE Healthcare, München, Deutschland)

XK 16/100 (GE Healthcare, München, Deutschland)

Octyl Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare,

München, Deutschland)

Dialyse Spectra/Por® Membrane, MWCO 6-8.000 (Spectrum

Laboratories Inc., Rancho Dominguez, USA)

Elektrophorese Typ P8DS, Owl Separation Systems Inc. (Portsmouth,

USA)

Protean®II xi Cell (Bio-Rad Laboratories, Hercules,

USA)

PhastSystemTM (GE Healthcare, Schweden)

ESCA PHI Quantera XPS (Physical Electronics Inc.,

Chanhassen, USA)

0,45 µm Filter Zapcap-CR (Schleicher & Schuell MicroScience

GmbH, Dassel, Deutschland)

GC CP-3380 (Varian Inc., Palo Alto, USA)

GC Säule Roti Cap-5-0,25 µm, 30 m x 0,25 mm ID (Carl Roth

GmbH, Karlsruhe, Deutschland)

GC-MS Finnigan Trace GC ultra, Finnigan MAT 95XP (Thermo

Electron, Waltham, USA)

GC-MS Säule Thermo TR-5MS, 30 m x 0,25 mm ID 0,25 µm, C12

(Thermo Electron, Waltham, USA)


HPLC Äkta Basic 10 (Pumpe P-903, Detektor UV-900,

Fraktionssammler Frac-900, Motor Valve PV-908,

Injektionsventil Inv-907, Mischkammer M-925 0.6ml)

(GE Healthcare, München, Deutschland)

Elite LaChrom (Pump L-2130, Diode Array Detector L-

2455, Autosampler L-2200, Column oven L-2350)

(VWR Hitachi, Darmstadt, Deutschland)

Inkubationsschüttler Innova 4400 (New Brunswick Scientific Co., Edison,

USA)

Heraeus T12 (Kendro Laboratory Products GmbH,

Wien, Österreich) Schüttler Typ 3006 (GFL -

Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel,

Deutschland)

Isoelektrische Fokusierung PhastSystemTM, PhastGel® IEF 3-9 und PhastGel® IEF 4-

6,5 (GE Healthcare, München, Deutschland)

LC-MS HP 1100 Serie HPLC Technologie (Agilent

Technologies, Santa Clara, USA), UV Detektor

(Cohesive Technologies, Thermo Fisher Scientific Inc.,

Franklin, USA), Massenspektrometer Esquire 3000

plus mit Elektrospray-Ionisation und Ionenfalle

(Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Deutschland)

LC-MS Säule Gemini Säule 150 x 2,00 mm 5 µ C18 110A

(Phenomenex, Aschaffenburg, Deutschland)

MALDI Tof/Tof Bruker

Photometer Cary 50 Bio UV-Visible Spectrophotometer (Varian

Inc., Palo Alto, USA)

Plattenleser PowerWave XS (Bio-Tek®, Instruments, Bad

Friedrichshall, Deutschland)


Power supply Typ E844 (Consort nv, Turnhout, Belgium)

Rundfilter Durchmesser 90mm (Schleicher & Schuell

MicroScience GmbH, Dassel, Deutschland)

Säulenmaterial Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (low sub) (GE

Healthcare, München, Deutschland)

Toyopearl DEAE-650M (Tosoh Bioscience GmbH,

Stuttgart, Germany)

Superdex 200 prep grade (GE Healthcare, München,

Deutschland)

Säule RP Chromsep HPLC Colum SS 250 x 4,6 mm Microsorb

300-5 C18 (Varian Inc., Palo Alto, USA)

Schüttler HTM 130L (HLC Biotech, Bovenden, Deutschland)

Sequenzer Procise® cLC Sequencing System, Model 492cLC

(Applied Biosystems, Foster City, USA)

Thermoblock für Derivatisierung Typ BBA2 (Grant-Boekel, Grant Instruments,

Cambridge, UK)

Zentrifuge Rotina 46R (Hettich Zentrifugen, Tuttlingen,

Deutschland)

Micro R22 (Hettich Zentrifugen, Tuttlingen,

Deutschland)


2.1.6 Software

Folgende Software wurde für Analysen oder die Auswertung von Analysen oder Datensätzen

verwendet:

Cary WinUV Kinetics (Varian Inc., Palo Alto, USA)

Unicorn 3.21 (GE Healthcare, Uppsala, Schweden)

PyMOL (DeLano Scientific, San Carlos, USA)

Varian Star 5.5 (Varian Inc., Palo Alto, USA)

EZChrom Elite 3.3.1 (VWR, Darmstadt, Deutschland)

Xcalibur 1.4 (Thermo Electron, Waltham, USA)

KC4 v3.3 (Bio-Tek®, Instruments, Bad Friedrichshall, Deutschland)

2.1.7 Nährmedien

Die Medien wurden 20 min bei 121°C und 1 bar Überdruck autoklaviert. Temperaturlabile Lösungen

wurden sterilfiltriert und nach dem Autoklavieren und Abkühlen steril dem Medium zugeführt.

Soweit nicht anders angegeben wurden die Medienbestandteile in deionisiertem Wasser gelöst. Für

die Herstellung von festen Medienplatten wurden der Kulturlösung vor dem Autoklavieren 15 g/L

Agar zugesetzt.

Czapek-Medium (Vollmedium) Saccharose 30 g/L

NaNO3 3,0 g/L

K2HPO4 1,0 g/L

MgSO4 x 7 H2O 0,5 g/L

KCl 0,5 g/L

FeSO4 x 7 H2O 0,001 g/L

Hefeextrakt 2,0 g/L

Pepton 5,0 g/L

pH-Wert 7,3

MSV-Medium (Mineralsalz-Spurenelement-Vitamin-Medium) (Produktionsmedium)

Pepton 5 g/L

Mineralsalzlösung1 12,5 mL/L

Spurenelementlösung2 1 mL/L


Additiv 2 g/L

Gelöst in 50 mM Phosphatpuffer pH 8

Nach dem Autoklavieren steril zugeben

Vitaminlösung3 1 mL/L

Zusammensetzung der Lösungen:

1 Mineralsalzlösung: 0,4 g/L CaCO3; 6 g/L KH2PO4; 1 g/L MgSO4 x 7 H2O; 1 g/L NaCl; 10 g/L

NH4Cl; 3 g/L (NH4)2SO4

2 Spurenelementlösung: 0,01 g/L CuCl2 x 2 H2O; 0,2 g/L FeCl3 x 6 H2O; 0,01 g/L MnCl2 x 4 H2O;

0,01 g/L Na2B4O7 x 10 H2O; 0,01 g/L (NH4)6Mo7O24 x 4 H2O; 0,04 g/L

ZnCl2

3 Vitaminlösung: 20 mg/L p-Aminobenzoat, 6 mg/L Biotin, 50 mg/L D,L-6,8-Dithiooctansäure,

20 mg/L Folsäure, 20 mg/L Niacinamid, 10 mg/L D-Panthotensäure, 100 mg/L

Pyridoxalhydrochlorid, 50 mg/L Riboflavin, 10 mg/L Thiamindichlorid,

50 mg/L Vitamin B12, Sterilfiltrieren und nach dem Autoklavieren Medium

zusetzen

Als Additive im MSV Medium wurde Polyethylenterephthalat und Polyethylenbutyrat in folgender

Form eingesetzt:

unbehandeltes, vorgewaschenes Polyethylenterephthalat-Garn (Dr. Th. Böhme KG,

Geretsried, Deutschland);

zyklische PET-Oligomerpräparation (~90%, 9/03, Dr. Th. Böhme KG, Geretsried,

Deutschland);

lineare und zyklische PET-Oligomerpräparation (Prof. Andreaus, FURB Universität in

Blumenau, Brasilien);

PET-Granulat (TEXPET A P800, particle size 4-8 mm, Texplast GmbH Wolfen,

Deutschland);

Polybutylenterephthalat-Garn (AMTEX Ltd., 78/34-1 CS, Barcelona, Spanien).


2.1.8 Suberin- und Cutin-Präparationen

Die Suberinpräparation wurde durch die Behandlung von Kartoffelschalen mit einem

Ammoniumoxalat-Oxalsäure-Puffer bei 100°C und 24 Stunden Inkubation unter Rühren hergestellt.

Die Schalen wurden mit dest. Wasser gespült, getrocknet und zerkleinert (Fernando et al. 1984).

Die Cutinpräparation wurde wie oben beschrieben aus Apfelschalen gewonnen. Nach dem Waschen

der Schalen mit Wasser erfolgte die Behandlung mit Cellulase (Sigma, 5 g/L), Amylase (Sigma, 1 g/L)

und Pektinase (Aspergilus niger, Fluka, 1 g/L) in Natriumacetat Lösung (pH 5, 50 mM) für 30°C und 16

Stunden. Die Reste wurden getrocknet und im Soxhlet mit Chloroform für 24-48 Stunden extrahiert.

Die Enzymbehandlung und Extraktion wurde noch zweimal wiederholt und die Reste wurden

getrocknet und zerkleinert (Fernando et al. 1984).

2.1.9 PET-Substrate für die Abbauuntersuchungen

Die Abbauuntersuchungen erfolgten an drei verschiedenen PET Substraten, welche im gleichen

Gewichtsverhältnis zum Einsatz kamen. Zu den Substraten gehörte eine APET Folie (Vertommen et al.

2005), welche 3% (w/w) Isophthalat enthielt, um amorphe Regionen in der Folie zu erzeugen. Diese

wurde bereitgestellt von Herrn Dr. V.A. Nierstrasz, Universität Gent. Das zweite Substrat waren

unbehandelte PET-Fasern, erhalten von der Firma Dr. Th. Böhme KG Geretsried, welche für die

Inkubation in etwa 1 cm große Stücke geschnitten wurden. Als drittes Substrat wurde eine zyklische

PET Trimerpräparation eingesetzt, welche mittels Soxlett-Extraktion mit Dichlormethan und 1,4-

Dioxan aus PET Stoffen gewonnen wurden. Die PET Stoffe wurden ebenfalls von der Firma Dr. Th.

Böhme KG Geretsried bezogen.

2.1.10 Puffer und Lösungen

Soweit nicht anders angegeben wurden die Substanzen in deionisiertem Wasser gelöst.

50% Acetonitril Acetonitril 500 ml/L

47.5%iges Acetonitril / 5%ige TFA Lösung Acetonitril 475 ml/L

TFA 50 ml/L

Acrylamidstammlösung Acrylamid 292 g/L

N,N´-Methylenbisacrylamid 8 g/L


Aktivitätsfärbelösung Lösung 1: 2-Naphthyl Acetat 20 mg

(SDS-PAGE) Aceton 5 ml

100 mM Tris/HCl pH 7,5 50 ml

Lösung 2: Fast Red TR Salt 50 mg


Die Lösungen vor der Färbung frisch herstellen und im

Verhältnis 1:1 mischen.

Chloroform/Methanol Gemisch Chloroform 85 ml

(Extraktion) Methanol 15 ml

100 mM Citrat-Phosphat-Puffer Lösung 1: 100 mM Citronensäure x H2O 21,01 g/L

Lösung 2: 100 mM Na2HPO4 x 2 H2O 35,6 g/L

Lösung 1 wurde mit Lösung 2 auf pH 3, 4, 5, 6 und 7

eingestellt.

Coomassie-Färbelösung Coomassie Brilliant Blue R250 0,02 g/L

Methanol 450 ml/L

Eisessig 90 ml/L

Coomassie-Entfärbelösung Methanol 100 ml/L

Essigsäure (96%) 75 ml/L

100 mM DTT Stammlösung Dithiothreitol 15,42 g/L

(Inhibitoruntersuchungen) (gelöst in 25 mM Phosphatpuffer pH 8)

10 mM DTT Lösung Dithiothreitol 1,54 g/L

100 mM EDTA Stammlösung EDTA 37,23 g/L

(gelöst in 25 mM Phosphatpuffer pH 8)

Elektrodenpuffer Tris 3 g/L

Glycin 14,4 g/L

SDS 1 g/L


100 mM Glycin-NaOH Puffer Lösung 1: 100 mM Glycin 7,51 g/L

100 mM NaCl 5,84 g/L

Lösung 2: 0,1 M NaOH

Lösung 1 wurde mit Lösung 2 auf pH 9, 10 und 11 eingestellt.

50 mM Jodacetamidlösung Jodacetamid 9,25 g/L

50 mM Natriumacetat Natriumacetat 4,1 g/L

Mit konzentrierter HCl wurde pH 5 eingestellt.

100 mM NH4HCO3 NH4HCO3 7,9 g/L

10 mM p-NP Acetat (gelöst in Ethanol absolut) p-NPA 1,811 g/L

(Lagerung bei –20°C)

10 mM p-NP Butyrat (gelöst in Ethanol absolut) p-NPB 2,09 g/L


10 mM p-NP Caprylat (gelöst in Ethanol absolut) p-NPC 2,65 g/L


10 mM p-NP Palmitat (gelöst in Ethanol absolut) p-NPP 3,78 g/L


100 mM Phosphatpuffer Lösung 1: NaH2PO4 x 2 H2O 15,6 g/L

Lösung 2: Na2HPO4 14,2 g/L

Lösung 2 mit Lösung 1 auf pH 8 eingestellt.

Andere Konzentrationen des Puffers wurden durch

Verdünnen der Stammlösung hergestellt.

20 mM Phosphatpuffer 1 M NaCl NaCl 58,44 g/L

20 mM Phosphatpuffer, 30% Isopropanol Isopropanol 300 ml/L

100 mM PMSF Stammlösung Phenylmethylsulfonylfluorid 17,42 g/L

(Lagerung bei 4°C) (gelöst in Isopropanol)


Proteinbestimmung Roti®-Quant, 5fach Konzentrat zur Proteinbestimmung

Puffer für die Kartoffelschalenbehandlung Ammoniumoxalat 16 g/L

Oxalsäure 4 g/L

Puffer für p-NPC und p-NPP Gum arabicum 1 g/L

Deoxycholat 2 g/L

(gelöst in 100 mM Phosphatpuffer pH 7,5)

Renaturierungslösung Triton X-100 0,5 ml


Sammelgelpuffer Tris 60,46 g/L

SDS 4 g/L

HCl pH 6,8

Silberfärbelösungen Lösung 1: Ethanol 400 ml/L


Lösung 2: Ethanol 400 ml/L


Formaldehyd 10 ml/L

Lösung 3: Silbernitrat-Färbelösung (frisch ansetzen)

NH4OH 2 ml

0,1 N NaOH 28 ml

AgNO3 (20%) 5 ml

(tropfenweise unter ständigem Rühren

zugeben, die Lösung muss klar bleiben)

dest. Wasser 115 ml

Lösung 4: Entwickler-Lösung (frisch ansetzen)

Formaldehyd 1 ml/L

Zitronensäure 0,25 g/L

Mit NaOH den pH-Wert 7,3 einstellen.

Lösung 5: Essigsäure (96%) 50 ml/L

Lösung 6: Essigsäure (96%) 10 ml/L


SDS-Probenpuffer (50 ml, 5-fach) SDS 1,25 g

EDTA 18,6 mg

Bromphenolblau 2 mg

β-Mercaptoethanol 2,5 ml

Glycerin 20 ml


Sporenfärbung nach Wirtz Lösung 1: Malachitgrün-Oxalat 50 g/L

Lösung 2: Safranin 5 g/L

100 mM TPCK Stammlösung Tosyl-L-phenylalanine- 35,18 g/L

(gelöst in Ethanol absolut, Lagerung bei 4°C) chloromethylketon

Trenngelpuffer Tris 181,5 g/L

SDS 4 g/L

HCl pH 6,8

0,1% Trifluoressigsäure TFA 1 ml/L

100 mM Tris/HCl Tris 12,1 g/L

Mit konzentrierter HCl wurde der gewünschte pH-Wert

eingestellt. Andere Konzentrationen des Puffers wurden

durch Verdünnen der Stammlösung hergestellt.

20 mM Tris/HCl pH 8; 0,15 M NaCl NaCl 8,77 g/L

Trypsinlösung bzw. Chymotrypsinlösung 0,5 µg/µl Protein in 1 mM HCl 2 µl

50 mM NH4HCO3 18 µl


2.2 Mikrobiologische Methoden

2.2.1 Stammhaltung und Kultivierung

Die Kultivierung von T. fusca KW3 erfolgte in einem 300 ml Schüttelkolben mit 50 ml Czapek-Medium

für 2 Tage bei 50°C und 100 rpm. Zur mittelfristigen Aufbewahrung bzw. Vereinzelung wurde die

Kultur auf Czapek-Agarplatten ausplattiert und ebenfalls 2 Tage bei 50°C inkubiert.

2.2.2 Mikroskopische Untersuchungen

Zellen von T. fusca wurden auf einem Objektträger in physiologischer Kochsalzlösung ausgestrichen.

Nach dem Lufttrocknen erfolgte eine Färbung der Zellen mit Malachitgrün für 10 Minuten. Nach

Entfernung der Färbelösung wurden die Objektträger einmal hitzefixiert und dann gründlich mit

demineralisiertem Wasser gespült. Die Gegenfärbung erfolgte mit Safraninlösung 15 Sekunden lang.

Nach dem Spülen mit demineralisiertem Wasser und Lufttrocknen des Objektträgers konnten die

Zellen bei einer 1000fachen Vergrößerung mit Immersionsöl mikroskopisch betrachten werden.

2.2.3 Trockengewichtsbestimmung

Für die Trockengewichtsbestimmung wurden Rundfilter verwendet, die zunächst bis zur

Gewichtskonstanz 24 Stunden im Trockenschrank bei 105°C getrocknet, im Exsikkator abgekühlt und

bis zum weiteren Gebrauch dort aufbewahrt wurden. Das Ausgangsgewicht der Filter wurde dann an

einer Feinwaage bestimmt.

3 x 250 ml Czapek-Medium wurden mit T. fusca KW3 angeimpft und 7 Tage in einem Schüttler bei

50°C und 150 rpm kultiviert. Täglich wurden 10 ml Probe entnommen. Die Zellen wurden über eine

Filternutsche und einen Rundfilter durch Anlegen eines Vakuums von der Nährlösung getrennt. Der

Rundfilter wurde anschließend mit 10 ml demineralisiertem Wasser gespült, um Reste der

Nährlösung zu entfernen. Nachdem die Flüssigkeit vollständig abgesaugt wurde, erfolgte die

Trocknung des Filters im Trockenschrank bei 105°C über Nacht. Nach dem Abkühlen im Exsikkator

wurde das Gewicht des Filters bestimmt.

Die Trockenmasse wurde aus der Differenz der Filtergewichte und dem Volumen der Probe

berechnet.


2.3 Proteinchemische Methoden

T. fusca KW3 wurde in 500 ml MSV-Medium mit unbehandelten PET-Fasern bei 50°C und 150 rpm

kultiviert, um eine maximale Ausbeute an Esterase zu erhalten. Aller 24 h wurden 200 µl Proben für

die Esteraseaktivitätsbestimmung entnommen (siehe 2.4.1). Die Proben wurden abzentrifugiert

(10 min, 10 000 rpm, RT) und die Überstände für den Nachweis eingesetzt. Nach 10 Tagen Inkubation

wurden die Zellen durch Zentrifugation (4000 rpm, 20 min, 4°C) entfernt. 200 µl Überstand wurden

erneut für die Esteraseaktivitätsbestimmung (siehe 2.4.1) entnommen. Der zellfreie Überstand

wurde im Gefriertrockner aufkonzentriert und bei –21°C bis zur weiteren Aufreinigung gelagert. Die

Aufreinigung erfolgte bei Raumtemperatur.

2.3.1 Proteinaufreinigung der Wildtyp TfCa

Der gefriergetrocknete Überstand wurde in einem Aliquot demineralisiertem Wasser gelöst und

gegen demineralisiertes Wasser für 5-6 Stunden dialysiert. Die Enzymlösung wurde anschließend

zentrifugiert (15 min bei 11 000 x g, 22°C) und der klare Überstand mit 100 mM Phosphatpuffer (pH

8) auf 20 mM eingestellt.

Die chromatographische Aufreinigung erfolgte mit einem Äkta Basic 10 HPLC-System. Alle

verwendeten Puffer wurden vor Benutzung filtriert und entgast, die Chromatographiesäulen wurden

zunächst mit dem Startpuffer equilibriert. Die Enzymlösung wurde auf eine Phenylsepharose 6 Fast

Flow (high sub) XK 16/20 Säule (Säulenvolumen 25 ml), equilibriert mit 20 mM Phosphatpuffer pH 8,

aufgetragen. Die Elution erfolgte mit einem Gradienten von 0 bis 100% des Elutionspuffers, 30%

Isopropanol in 20 mM Phosphatpuffer pH 8. Die aufgefangenen Fraktionen mit Esteraseaktivität

wurden vereinigt und das Isopropanol wurde durch Evaporation entfernt.

Die vereinigten Fraktionen wurden auf eine DEAE-650M XK 16/40 Säule (Säulenvolumen 54 ml),

equilibriert mit 20 mM Phosphatpuffer pH 8, aufgetragen und eluiert mit 1 M NaCl in 20 mM

Phosphatpuffer pH 8. Die Fraktionen wurden auf Esteraseaktivität getestet. Fraktionen mit

Esteraseaktivität wurden vereinigt und dialysiert gegen 20 mM Phosphatpuffer pH 8.

Die vereinigten Fraktionen wurden auf eine HiTrap™ Octyl Fast Flow Säule (Säulenvolumen 1 ml)

aufgetragen und eluiert mit 30% Isopropanol in 20 mM Phosphatpuffer pH 8. Die Fraktionen mit

Esteraseaktivität wurden vereinigt und das Isopropanol wurde durch Evaporation entfernt.

Die vereinigten Fraktionen wurden auf eine Superdex 200 prep grade XK 16/70 Säule

(Säulenvolumen 110 ml) equilibriert mit 0,15 M NaCl in 20 mM Phosphatpuffer pH 8 aufgetragen und

eluiert. Die Fraktionen wurden auf Esteraseaktivität getestet.


Nach jedem Reinigungsschritt wurde ein Aliquot der vereinigten Fraktionen entnommen und für die

SDS-PAGE Analyse aufbereitet.

2.3.2 Proteinaufreinigung der rekombinanten TfCa, TfCut1 und TfCut2

Von 3 PET-Hydrolasen aus T. fusca KW3 wurde das jeweilige Gen isoliert, in den Vektor pET21B(+)

eingeschleust und in E. coli BL21(DE3) transformiert. Die Proteine besaßen ein His6-Tag für die

spätere Aufreinigung. Die Produktion der rekombinanten Cutinase TfCut1 und TfCut2 und der

Carboxylesterase TfCa erfolgte bei 18°C im LB-Medium sowohl im Schüttelkolben als auch im 5 L

Fermenter. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen mit Ultraschall aufgeschlossen und

der partikelfreie Überstand für die chromatographische Aufreinigung verwendet. Alle beschriebenen

Vorarbeiten wurden von Herrn Thorsten Oeser und Herrn Ren Wei im Rahmen ihrer Dissertationen

entwickelt und beschrieben (Oeser et al. 2010, Chen S et al. 2008).

Die Aufreinigung der rekombinanten Hydrolasen erfolgte mittels eines Äkta Basic 10 HPLC-System.

Die HisTrap™ FF Crude Säule (Säulenvolumen 2 x 5 ml) wurde zunächst mit einem 50 mM

Phosphatpuffer mit 300 mM NaCl pH 8 equilibriert und anschließend der partikelfreie Überstand

aufgetragen. Es erfolgte eine Gradientenelution (10 Säulenvolumen) bis 100% 50 mM

Phosphatpuffer mit 300 mM NaCl und 250 mM Imidazol pH 8. Die Fraktionen wurden auf

Esteraseaktivität getestet. Fraktionen mit Esteraseaktivität wurden vereinigt und auf eine Superdex

200 prep grade XK 26/60 Säule (Säulenvolumen 320 ml) equilibriert mit 0,15 M NaCl in 20 mM

Phosphatpuffer pH 8 aufgetragen und eluiert. Die Fraktionen wurden auf Esteraseaktivität getestet.

Nach jedem Reinigungsschritt wurde ein Aliquot der vereinigten Fraktionen entnommen und für die

SDS-PAGE Analyse aufbereitet.

2.4 Analytische Methoden

2.4.1 Esterase-Aktivitätsbestimmung

Bei diesem Nachweis wird das nach enzymatisch katalysierter Spaltung von chromogenen para-

Nitrophenyl-Acylestern freigesetzte gelbe para-Nitrophenol bei 410 nm spektrophotometrisch

bestimmt (Purdy und Kolattukudy 1973). Ein Unit (U) ist definiert als die Menge an Enzym, die 1 µmol

p-NPB pro Minute freisetzt.


2.4.1.1 Bestimmung mittels Spektrophotometer

Zu 940 µl 100 mM Phosphatpuffer pH 7,5 erfolgte die Zugabe von 10 µl 10 mM p-Nitrophenylbutyrat

als Substrat. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µl Enzymlösung gestartet, wobei die Messung

30 Sekunden danach im Cary 50 Bio UV-Visible Spektrophotometer bei 410 nm für eine Minute

erfolgte. Die Enzymaktivität wurde in U/ml angegeben.

2.4.1.2 Bestimmung mittels Plattenleser

Zu 80 µl 100 mM Phosphatpuffer pH 7,5 erfolgte die Zugabe von 10 µl 5 mM p-Nitrophenylbutyrat als

Substrat. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 µl Enzymlösung gestartet, wobei die Messung 10

Sekunden danach im Plattenleser PowerWave XS bei 410 nm für fünf Minuten erfolgte. Die

Enzymaktivität wurde in U/ml angegeben. Die Messung des Blindwerts erfolgte mit 10 µl Puffer

anstatt der Enzymlösung.

2.4.2 Cutinase-Aktivitätsbestimmung

Bei diesem Nachweis werden die durch die enzymatisch katalysierte Spaltung des Biopolyesters Cutin

entstehenden Monomere, meist C16 und C18 Hydroxyfettsäuren, durch eine

Gaschromatographische Analyse nachgewiesen (Chen S et al. 2008). Das Enzym wurde mit 10 mg

Cutinpräparation in 500 µl Phosphatpuffer (25 mM, pH 8) bei 50°C 72 Stunden inkubiert. 500 µl

Eisessig wurden dem Reaktionsgemisch zugesetzt und die freigesetzten Cutinmonomere mit 3 ml

Chloroform nach kräftigem Schütteln und Zentrifugation (2000 rpm, 10 min, RT) extrahiert und unter

Stickstoffbegasung eingedampft. Die Abbauprodukte wurden in 1 ml Chloroform/Methanol-Gemisch

(85:15) aufgenommen, in GC Vials überführt und unter Stickstoff erneut getrocknet. Die Produkte

wurden mit MSTFA syliliert und analysiert per GC-MS. Zum Vergleich wurde eine Negativkontrolle

der Reaktion ohne Enzymzugabe mit inkubiert und detektiert.

Als zusätzlicher Vergleich wurde Cutin chemisch hydrolysiert und die entstandenen Monomere

ebenfalls wie oben beschrieben aufgenommen, derivatisiert und per GC-MS analysiert. Die

chemische Hydrolyse erfolgte zum einen von 50 mg Cutin in 30 ml Tetrahydrofuran mit 2,5-fachem

Gewichtsüberschuss von LiAlH4. Die Lösung wurde für 72 Stunden bei Raumtemperatur schüttelnd

inkubiert und anschließend mit 100 ml dest. Wasser versetzt. Die erhaltene Lösung wurde mit 4 ml

HCl angesäuert und mit Di-Ethylether die entstandenen Monomere extrahiert (5 x 150 ml). Die

organische Phase wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat von verbleibenden Wasserresten befreit

und unter Vakuum vollständig getrocknet (Walton und Kolattukudy 1972). Eine weitere Hydrolyse


von 50 mg Cutin erfolgte in 30 ml 95% Ethanol alkalisch mit 3 g Kaliumhydroxid. Die Lösung wurde

unter Stickstoffatmosphäre 72 Stunden bei Raumtemperatur schüttelnd inkubiert. Das

Reaktionsgemisch wurde mit 4 ml HCl angesäuert und die entstandenen Cutinmonomere mit Di-

Ethylether extrahiert (5 x 100 ml). Die organische Phase wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat von

verbleibenden Wasserresten befreit und unter Vakuum vollständig getrocknet (Gerard et al. 1992).

2.4.3 PCL-Abbauuntersuchung

Poly(ε-caprolacton) gilt als Modellsubstrat für Cutinasen und wurde zur genaueren Spezifikation der

untersuchten Enzyme eingesetzt. Die Untersuchung des PCL Abbaus erfolgte als Screening Methode

auf Agarplatten und zur Bestimmung von Abbauraten mittels Plattenleser.

2.4.3.1 Bestimmung mittels Hofbildung

Zunächst wurden in die Agarplatten (18 g/L Agar in 25 mM Phosphatpuffer pH 8, nach dem

Autoklavieren wurden 50 ml/L 1%ige PCL Stammlösung in Aceton zugegeben und die Platten

gegossen) ein Loch gestanzt, in das die Enzymlösung gegeben wurde. Die Platten wurden bei

optimaler Temperatur 24 Stunden inkubiert und die Hofbildung anschließend ausgewertet.

2.4.3.2 Bestimmung mittels Plattenleser

Zunächst wurden 0,5 ml PCL Stammlösung (0,27 g PCL in 50 ml Aceton) in 9,5 ml 100 mM

Phosphatpuffer pH 7,5 frisch durch mehrfaches Durchmischen suspendiert. Die Reaktion wurde

durch Zugabe von 10 µl Enzymlösung gestartet, wobei die Messung der Klärung 10 Sekunden danach

im Plattenleser PowerWave XS bei 600 nm für 10 Minuten erfolgte. Die Enzymaktivität wurde als

Abbaurate in mg min-1 ml-1 angegeben. Die Messung des Blindwerts erfolgte mit 10 µl Puffer anstatt

der Enzymlösung.

2.4.4 Quantitative Protein-Bestimmung nach Bradford (1976)

Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte mit einer Roti-Quant® Lösung. 200 µl der Roti-

Quant® Lösung wurden auf 800 µl der zu bestimmenden Proteinlösung pipettiert, gevortext und fünf

Minuten inkubiert. Die Analyse erfolgte spektrophotometrisch bei 595 nm und die Konzentration mit

einer zuvor erstellten Kalibrierkurve mit BSA als Protein berechnet.


2.4.5 SDS Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die PAGE wurde nach Laemmli (1970) mit SDS durchgeführt. Als molekularer Standard (MW range

14.000 – 94.000 Da) wurde der LMW-Marker von der Firma GE Healthcare verwendet.

Die gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine erfolgte in einem 12,5%igen Trenngel und einem

4%igen Sammelgel. In Tabelle 10 sind die Mengenangaben der Lösungen zur Herstellung des

SDS Gels zusammengefasst.

Tabelle 10: Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels.

Lösungen Trenngel (12,5%) Sammelgel (4%)

Trenngelpuffer 2,6 ml ---

Sammelgelpuffer --- 0,78 ml

Acrylamidstammlösung 4,36 ml 0,47 ml

Wasser, reinst 3,44 ml 1,88 ml

Natriumsulfit 3-5 Kristalle pro Gel

Ammoniumpersulfat (40%) 10 µl 1,1 µl

TEMED 5 µl 2,2 µl

Die Glasplatten wurden mit Ethanol entfettet. Zunächst wurde das Trenngel bis zu 2/3 in die

Gelkammer gegossen, mit Isopropanol überschichtet und für eine Stunde auspolymerisiert. Nach

Entfernen des Isopropanols wurde das Sammelgel gegossen, der Gelkamm eingesetzt und für eine

weitere Stunde auspolymerisiert

20 µl Proteinlösung und 5 µl SDS-Probenpuffer (5-fach) wurden gemischt, für 5 min bei 100°C

inkubiert und nach dem Abkühlen in die Taschen eingefüllt. Die Proteinauftrennung erfolgte bei

100 V und 4°C.

2.4.5.1 Esteraseaktivitäts-Färbung

Bei dieser Färbung wird das nach enzymatisch katalysierter Spaltung von 2-Naphthylacetat

freigesetzte 2-Naphthol, welches mit Fast Red einen farbigen Komplex eingeht, visuell bestimmt.

Dazu wurde das Gel zunächst in 100 ml 100 mM Tris/HCl pH 7,5 und 0,5% Triton X-100 für 30 min

renaturiert und anschließend mit den frisch hergestellten Färbelösungen (Lösung 1 und Lösung 2)

gefärbt bis rote Banden sichtbar wurden. Anschließend erfolgte eine Entfärbung des Gels bei Bedarf

mit einer Entfärbelösung.


2.4.5.2 Coomassie-Färbung

Proteine im Gel wurden mit Coomassie Brilliant Blau R-250 gefärbt (Weber und Osborn 1969) und die

Entfärbung erfolgte mit einer frisch hergestellten Entfärbelösung.

2.4.5.3 Silberfärbung der Proteine

Die Silberfärbung der Proteine wurde nach Kleber, Schlee und Schöpp (1997) durchgeführt. Der

Zeitliche Ablauf der Färbung ist in Tabelle 11 dargestellt.

Tabelle 11: Zeitlicher Ablauf der Silberfärbung.

Schritt Färbezeit

Gel mit Lösung 1 schwenken 2 x 1 Stunde

Gel mit Lösung 2 schwenken 1 Stunde

Gel mit demineralisiertem Wasser schwenken 3 x 40 Minuten

Gel mit Lösung 3 schwenken 15 Minuten

Gel mit demineralisiertem Wasser schwenken 3 x 10 Minuten

Entwicklung in Lösung 4 bis zur Bildung

von braunen Flecken auf klarem Grund

Abstoppen mit Lösung 5

Lagerung in Lösung 6

2.4.6 Bestimmung des pI

Die Bestimmung des isoelektrischen Punktes der gereinigten Carboxylesterase erfolgte mit dem

PhastSystemTM Gelelektrophorese-System mit einem PhastGel® IEF 3-9 Gel und IEF 4-6,5 und dem

Kalibrierkit für pI Bestimmung durch Isoelektrische Fokusierung, Broad range pI (pH 3-10).

Das Protein wurde in verschiedenen Konzentrationen auf das Gel aufgetragen und fokusiert (IEF 3-9:

2000 V; 2,5 A; 3,5 W; 15°C; 410 Vh; IEF 4-6,5: 2000 V; 5,0 mA; 3,5 W; 15°C; 410 Vh; PhastSystemTM).

Nach der Ausrichtung des Proteins wurden die Gele mittels Silberfärbung angefärbt. Die Standard-

Proteine zur Berechnung des pI waren Amyloglucosidase (pI 3,5), Trypsininhibitor (pI 4,55), β-

Lactoglobulin A (pI 5,20), Bovine carbonic anhydrase B (pI 5,85), Human carbonic anhydrase B (pI

6,55), Myoglobin-acid band (pI 6,85), Myoglobin-base band (pI 7,35), Lentil lectinacidic band (pI

8,15), Lentil lectin-middle band (pI 8,45), Lentil lectin-basic band (pI 8,65) und Trypsinogen (pI 9,3).


2.4.7 Bestimmung der Molaren Masse

Für die Bestimmung des Molekulargewichtes der extrazellularen Esterase wurden die Enzymlösung

und der SDS Elektrophorese Standard Roti®-Mark mit einer SDS-PAGE aufgetrennt und mit dem Gel

erfolgte eine Aktivitäts- und Coomassie-Färbung. Die Laufstrecken der Proteine des Standards und

der Esterase wurden bestimmt. Die bestimmten Laufstrecken der Standards wurden gegen den

Logarithmus des Molekulargewichts der Proteine aufgetragen und somit eine Formel zur Berechnung

des Molekulargewichts erhalten. Damit konnte das Molekulargewicht der Esterase berechnet

werden.

2.4.8 Bestimmung der Temperatur und pH-Wert Stabilität

Zur Bestimmung der pH Stabilität erfolgte die Inkubation der Esterase bei 23°C für 7 Tage in Puffern

von pH 3 bis 11. Citrat-Phosphat-Puffer wurde für pH 3 bis 7 verwendet, Phosphatpuffer für pH 8 und

Glycin-NaOH Puffer für pH 9 bis 11. Die Esteraseaktivität wurde mit dem Esteraseaktivitätsmessung

bestimmt. Die Bestimmung der Temperaturstabilität der Esterase erfolgte bei Temperaturen von 30

bis 55°C in einem 25 mM Phosphatpuffer für 7 Tage. Die Esteraseaktivität wurde mit dem

Esteraseaktivitätsmessung bestimmt.

2.4.9 Bestimmung der Stabilität gegenüber Inhibitoren

Die Esterase wurde mit den Inhibitoren EDTA, Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), Tosyl-L-

phenylalanine-chloromethylketon (TPCK) und Dithiothreitol (DTT) bei 30°C für 15 min inkubiert. EDTA

wurden in den Konzentrationen 1 mM und 10 mM und DTT mit 0,1 mM; 1 mM und 10 mM in 25 mM

Phosphatpuffer pH 8 eingesetzt. PMSF wurde, in Methanol gelöst, mit einer Endkonzentration von

0,1 mM; 1 mM und 10 mM eingesetzt. TPCK, gelöst in Isopropanol, wurde mit den

Endkonzentrationen 0,1 mM; 1 mM und 10 mM verwendet. Die Esteraseaktivität wurde mit dem

Esteraseaktivitätsnachweis mit p-NPB als Substrat bei 410 nm spektrophotometrisch bestimmt.

2.4.10 Bestimmung der kinetischen Konstanten für die Hydrolyse von p-NP Ester

Die Substratspezifität gegenüber p-NP Estern und Triacylglyceride mit verschiedener Kettenlänge

wurde bestimmt. Die Aktivität gegenüber den p-NP Estern wurde spektrophotometrisch bei 410 nm

mittels Esteraseaktivitäts-Assay determiniert.


2.4.11 Bestimmung der kinetische Konstanten für die Hydrolyse von CTR

Die kinetischen Konstanten für den Abbau von zyklischen PET-Trimeren wurden bestimmt. Die

Trimere, gelöst in 1,4-Dioxan, wurden in 25 mM Phosphatpuffer pH 8 gelöst und es erfolgte eine

Inkubation mit der Esterase bei 50°C für einer Stunde. Die entstandenen Abbauprodukte wurden

mittels Reversed Phase HPLC aufgetrennt und bei 241 nm spektrometrisch detektiert.

2.4.12 Bestimmung optimaler Temperatur und pH-Wert für die Hydrolyse von CTR

Der optimale pH-Wert wurde bestimmt mit einem Reaktionsgemisch gelöst in Citrat-Phosphat-Puffer

für pH 3 bis 7, Phosphatpuffer für pH 8 oder Glycin-NaOH Puffer für pH 9 bis 11. Alle Puffer besaßen

eine Ionenstärke von 100 mM und der Abbau erfolgte bei 50°C. Der Puffer wurde vortemperiert bei

50°C, das Substrat, zyklische PET Trimere gelöst in 1,4-Dioxan, wurde vor Beginn der Reaktion in den

Puffer gegeben und gemischt. Die Reaktion wurde durch Zugabe der Esterase gestartet. Die

Inkubation erfolgte für eine Stunde und die gebildeten Produkte wurden per Reversed Phase HPLC

aufgetrennt und bei 241 nm detektiert.

Die optimale Temperatur wurde bestimmt mit zyklischen Trimeren, gelöst in 1,4-Dioxan, als Substrat

und dem optimalen pH-Wert, welcher zuvor bestimmt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde in

25 mM Phosphatpuffer pH 8 suspendiert und der Abbau erfolgte bei 30 bis 55°C. Der Puffer wurde

vortemperiert, das Substrat zugegeben und gemischt. Durch die Zugabe der Esterase erfolgte der

Start des Abbaus, welcher eine Stunde inkubiert wurde. Die gebildeten Produkte wurden per

Reversed Phase HPLC aufgetrennt und bei 241 nm detektiert.

2.4.13 N-terminale Sequenzierung

Die N-terminale Sequenzierung der Esterase erfolgte durch die Arbeitsgruppe Biochemie und

Bioorganische Chemie am Institut für Biochemie, Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und

Psychologie der Universität Leipzig.

Dafür wurde die Esterase in einem 12,5% SDS Gel aufgetrennt, auf eine PVDF Membran geblottet

und mit Coomassie Brilliant Blue angefärbt. Die entsprechende Bande wurde ausgeschnitten, halbiert

und in den Sequenzer gegeben. Es wurden die ersten 10 Aminosäuren des Proteins sequenziert.


2.4.14 MALDI-TOF Sequenzierung

Die Esterase wurde im 12,5%igen SDS-Gel aufgetrennt und mit Coomassie Brilliant Blue angefärbt.

Die entsprechende Proteinbande wurde aus dem Gel ausgeschnitten, im 1 mm große Stücke geteilt

und mit 100 µl Aqua bidest. 10 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Entfernen des Wassers

wurde 100 µl 50% Acetonitril zugegeben und der Ansatz nochmals 10 min bei Raumtemperatur

geschüttelt. Dieser Schritt wurde einmal wiederholt. Der Überstand wurde abgenommen und es

erfolgte eine Inkubation der Gelstücke in 80 µl 100% Acetonitril bei Raumtemperatur für 5 min unter

Schütteln. Danach erfolgte die Zugabe von 80 µl 100 mM NH4HCO3. Nach 10 min Schütteln bei

Raumtemperatur wurde der Überstand komplett entfernt und die Gelstücke im einem

Vakuumkonzentrator getrocknet. Die getrockneten Gelstücke wurden zur Reduktion und Alkylierung

in 80 µl frisch hergestellter 10 mM DTT Lösung für 45 min bei 56°C inkubiert. Nach dem Abkühlen

wurde der Überstand abgenommen und sofort 80 µl 50 mM Jodacetamidlösung zugeben (Inkubation

im Dunkeln für 30 min). Der Überstand wurde abgenommen, 80 µl 100 mM NH4HCO3 Lösung

zugegeben und 5 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurden 80 µl 100%iges

Acetonitril zugegeben und 10 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Überstand wurde entfernt

und die Gelstücke im Vakuumkonzentrator komplett getrocknet. Zu den Gelbanden wurde 6,6 µl

Trypsinlösung bzw. Chymotrypsinlösung gegeben und anschließend mit 50 mM NH4HCO3 Lösung

überschichtet. Der enzymatische Verdau erfolgte bei 37°C über Nacht. Um die verdauten

Proteinbruchstücke aus dem Gel zu eluieren, wurde 50 µl 47,5%iges Acetonitril / 5%ige TFA Lösung

zugegeben (Schütteln bei RT für 10 min). Der erhaltene Überstand wurde aufgehoben und der Schritt

noch zweimal wiederholt. Die erhaltenen Überstände wurden vereinigt, eingefroren und mit dem

Vakuumkonzentrator auf etwa 5 bis 10 µl aufkonzentriert. Die Lösung wurde anschließend entsalzt

und für die Auftrennung der Bruchstücke auf eine Reversed Phase HPLC mit Nanopumpe

aufgetragen. Die Auftrennung und die anschließende MALDI-TOF Analyse erfolgte in der

Arbeitsgruppe Biochemie und Bioorganische Chemie am Institut für Biochemie, Fakultät für

Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie der Universität Leipzig.

Die durch die LC aufgetrennten Proteinfragmente wurden auf Trägerplatten gespottet und jeder

einzelne per MALDI-TOF analysiert und anschließend elektronisch ausgewertet.

2.4.15 Abbaustudien

Für die Abbauuntersuchungen wurden die gleichen Mengen an APET Folie, unbehandelten PET-

Fasern und zyklischen PET-Trimeren in 10 ml Phosphatpuffer suspendiert und je 40 U der PET-

Hydrolasen bzw. 25 mg der rekombinanten PET-Hydrolasen aus T. fusca KW3 zugegeben. Die


Enzymaktivität wurde mit p-NPB als Substrat spektrophotometrisch bestimmt. Die Kolben wurden

verschlossen um einer Evaporation der Flüssigkeit vorzubeugen und die Inkubation erfolgte bei 30°C

für die Cutinasen aus F. solani pisi (Vertommen et al. 2005, Chen et al. 2010); 50°C für die TfCa,

rekombinante TfCa, Cutinase 1 aus T. fusca WSH03-11, Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11 und die

Cutinase-Präparation von Novozymes; 60°C für die rekombinanten TfCut1 und TfCut2 für 74 Stunden

(150 rpm). Es wurden zu verschiedenen Zeiten Proben genommen und per Umkehrphasen HPLC

analysiert. Nur die Proben vom Trimer-Abbau wurden nach der Probennahme zentrifugiert

(9000 rpm, 15 min) und anschließend wurden bei allen Proben der pH-Wert mit 1 M HCl auf 5 bis 6

eingestellt.

Die APET-Folie wurde nach der Inkubation mit der TfCa und der Cutinase aus F. solani pisi

(Vertommen et al. 2005) aus der Pufferlösung entnommen, mit demineralisiertem Wasser

gewaschen, mit einer 1%igen CHAPS-Lösung in Phosphatpuffer zur Entfernung der verbliebenen

Proteinreste von den Oberflächen der Substrate bei 50°C und 150 rpm für 2 Stunden inkubiert und

mit demineralisiertem Wasser gewaschen. Die Modifikationen der Oberflächen der Substrate durch

die Inkubation mit den Enzymen wurden mit SEM analysiert.

2.4.16 Analytik der PET Abbauprodukte

Die Analyse der Proben der Abbauuntersuchungen erfolgte wie bei Vertommen et al. (2005)

beschrieben, jedoch mit folgenden Änderungen: Die Eluenten der polaren mobile Phase waren 0,1%

TFA in Wasser (A) und Acetonitril (B) und das Injektionsvolumen der Proben war bei dem

Trimerabbau 10 µl und bei den anderen Abbauexperimenten 30 µl.

Es wurden Kalibrierkurven für die Standards Terephthalsäure und Bis(2-hydroxyethyl)terephthalat

(BHET) angefertigt.

Die detektierten Produktpeaks wurden ebenfalls per LC-MS analysiert. Diese Messungen wurden von

der AG Massenspektrometrie am Institut für Analytische Chemie, Universität Leipzig durchgeführt.

2.4.17 Konzentrationabhängige CTR-Abbaustudien

Die Enzyme wurden mit den verschiedenen Konzentrationen für jeweils 4 und 8 Stunden mit der

gleichen Menge an CTR (15 mg/0,5 ml CTR; entspricht einer Konzentration von 30 mg/ml) bei 50°C

(rTfCa) und 60°C (rTfCut) bei 150 rpm inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben wie bereits

beschrieben für die RP-HPLC Analyse vorbereitet und analysiert (Billig et al. 2010, Vertommen et al.

2005).


Bei den eingesetzten Enzymlösungen wurde zusätzlich die Esterase-Aktivität mit p-NPB als Substrat

bestimmt.

2.5 Homologie-Modelling der TfCa und weitere PET-Hydrolasen

Die Erstellung des Homologie-Modells der TfCa erfolgte mit dem Programm PHYRE unter der

Verwendung der thermostabilen Carboxylesterase aus G. stearothermophilus (PDB code 2OGS resp.

2OGT) als Vorlage (Bennett-Lovsey et al. 2008, Liu et al. 2007). Eine Plausibilitätsprüfung des

endgültigen Modells durchgeführt mit dem Programm VERIFY3D zeigte bei 83% der Aminosäuren

einen Messwert über 0,2, was die Übereinstimmung des Modells bestätigte (Eisenberg et al. 1997).

Die modellierte Struktur der Cutinase Tfu_0882 aus T. fusca YX basierte auf der

Streptomyces exfoliates Lipase (SeL) und wurde mittels dem SWISS-Model homology modeling web

server erstellt (Chen S et al. 2008, Schwede et al. 2003). Das Modell der Tfu_0883 Cutinase aus

T. fusca YX wurde mittels PHYRE erstellt mit der SeL als Vorlage (Bennett-Lovsey et al. 2008, Chen S

et al. 2008, Liu et al. 2007).

Die Strukturen der Cutinasen aus F. solani sp. pisi und P. mendocina wurden aus der NCBI

Proteindatenbank entnommen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov, Longhi et al. 1997, Bott et al. 2003).

Die Modellierung der Cutinase aus H. insolens erfolgte mit dem WURST protein threading server

(Sandal et al. 1996, Torda et al. 2004).

Die dargestellten Abbildungen der Proteinstrukturen wurden mittels PyMOL erstellt (DeLano 2002).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Ergebnisse und Diskussion 77

3 Ergebnisse und Diskussion

3.1 Screening nach PET-Hydrolasen aus T. fusca

3.1.1 Wachstum von T. fusca KW3 im Czapek-Medium

Für den Einsatz von T. fusca KW3 zur Esteraseproduktion mussten zunächst Zellen in einem

Vollmedium, dem Czapek-Medium, angezogen werden, welche dann anschließend im

Enzymproduktionsmedium, dem Mineralsalzmedium (MSV-Medium), das gewünschte Enzym in

größeren Mengen synthetisierten. Damit die Zellen sich in der exponentiellen Phase beim

Überimpfen befanden, erfolgte die Aufnahme einer Wachstumskinetik des Actinomyceten

T. fusca KW3 im Komplexmedium. Dafür wurden drei 250 ml Czapek-Medien mit dem Actinomyceten

angeimpft und für 7 Tage bei 50°C und 150 rpm kultiviert. Täglich wurden 10 ml Probe genommen,

die Zellen von der Nährlösung abgetrennt, gewaschen und bei 105°C über Nacht getrocknet. Nach

dem Abkühlen der Filter im Exsikkator wurde ihr Gewicht bestimmt und die Trockenmasse aus der

Differenz der Filtergewichte und dem Volumen der Probe berechnet.

Abbildung 25: Wachstumskurve von T. fusca KW3 im Czapek-Medium bei 50°C und 150 rpm.

Die Wachstumskurve von T. fusca KW3 im Czapek-Medium wurde als Biotrockenmasse (mg/ml) über

die Zeit (Tage) dargestellt (Abbildung 25). In den ersten beiden Tagen erfolgte maximales

Zellwachstum in der exponentiellen Phase. Vom zweiten bis vierten Tag folgte die statische Phase,

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 1 2 3 4 5 6 7

Bio

tro

ck

en

ma

ss

e (

mg

/ml)

Kultivierungsdauer (d)


bei der die Neubildungsrate gleich der Absterberate aufgrund von gebildeten toxischen

Nebenprodukten und mangelnden Nährstoffen ist. In dieser Phase werden Sekundärprodukte, wie

unter anderem Antibiotika, gebildet. Als letzte Phase schloss sich die Absterbephase an, bei der

durch Zelllyse eine deutliche Abnahme der Biomasse erfolgt. Bei T. fusca KW3 im Czapek-Medium

konnte hingegen nur ein leichter Abfall der Biotrockenmasse registriert werden. Die Kultivierung der

Vorkultur für die spätere Enzymproduktion erfolgte, abgeleitet aus der oben dargestellten

Wachstumskurve, in 2 Tagen.

Für die Enzymproduktion im Minimalmedium ist es wichtig, möglichst wenig Saccharose aus dem

Czapek-Medium mit dem Inoculum in das Produktionsmedium einzutragen, da Glucose ein Hemmer

der Esteraseproduktion ist. Deshalb wurden die Zellen nach der sterilen Ernte und erfolgter

Zentrifugation in sterilem 25 mM Phosphatpuffer (pH 8) des gleichen Volumens aufgenommen.

3.1.2 Wachstum von T. fusca KW3 im MSV-Medium

3.1.2.1 Esterasebildung mit verschiedenen synthetischen und natürlichen Polyestern

Als Mediumzusatz für eine Esteraseproduktion wurden folgende Polyester-Oligomere und Polymere

im MSV-Medium eingesetzt (je 2 g/L): recyceltes PET-Granulat, eine PET-Oligomerpräparation, eine

zyklische PET-Oligomerpräparation, BHET, PBT-Fasern und Präparationen der natürlichen

Biopolyester Cutin und Suberin. Dazu wurden die MSV-Medien mit den im Czapek-Medium 2 Tage

vorkultivierten Zellen angeimpft. Die Kultivierung erfolgte über einen Zeitraum von 10 Tagen.

Anschließend wurden die Kulturüberstände gewonnen und Proben davon auf ein SDS Gel

aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Darüber hinaus wurde eine Aktivitätsfärbung mit

Fast Red und 2-Naphtylacetat durchgeführt.

Sowohl unter Einsatz von PET-Fasern, recyceltem PET-Granulat, der PET-Oligomerpräparation und

PBT-Fasern konnte die Bildung einer ca. 52 kDa großen Esterase gelelektrophoretisch nachgewiesen

werden (Abbildung 26, Spur 1, 2, 3 und 6). Die zellfreien Überstände unter Verwendung der

zyklischen PET Oligomerpräparation bzw. BHET zeigten nur eine schwache bzw. keine Bande im SDS-

PAGE (Abbildung 26, Spur 4 und 5). Mit diesen Substraten wurde nur wenig bzw. keine Esterase

produziert. Hingegen konnte mit Cutin und Suberin als Substrat keine 52 kDa Esterase identifiziert

werden, aber dafür eine kleinere, ca. 29 kDa große Esterase, allerdings in verhältnismäßig großen

Mengen (Abbildung 26, Spur 7,8).


Abbildung 26: SDS-PAGE und Aktivitätsfärbung mit den Esterasen in den zellfreien Überständen des MSV-Mediums nach 10 tägiger Inkubation bei 50°C mit PET-Fasern (Spur 1), recyceltes PET-Granulat (Spur 2), einer PET-Oligomerpräparation (Spur 3), einer zyklischen PET-Oligomerpräparation (Spur 4), BHET (Spur 5), PBT-Fasern (Spur 6), einer Suberinpräparation (Spur 7) und einer Cutinpräparation (Spur 8).

Ausgehend von der Zielstellung der Arbeit, eine PET-Trimere abbauende Esterase zu identifizieren,

aufzureinigen und zu charakterisieren, stand die durch Kultivierung unter Verwendung der Substrate

PET-Fasern, recyceltes PET-Granulat und PET-Oligomerpräparation identifizierte 52 kDa große

Esterase zunächst im Mittelpunkt der nachfolgenden Untersuchung. Inwieweit die durch Induktion

mit der Suberin bzw. Cutinpräparation identifizierte 29 kDa große Esterase auch PET abbauen kann,

wird zu einem späteren Zeitpunkt untersucht.

Im nächsten Schritt wurden die gebildeten Esteraseaktivitäten mittels p-NPB Aktivitätsbestimmung

während 10-tägiger Kultivierung im MSV-Medium mit PBT-Fasern, PET-Fasern, recyceltem PET-

Granulat, einer PET-Oligomerpräparation, einer zyklischer PET-Oligomerpräparation bzw. BHET

untersucht. Die Entwicklung der bestimmten Aktivitäten ist in Abbildung 27 graphisch dargestellt und

die maximal produzierten Aktivitäten sind in Tabelle 12 zusammengefasst. Die höchste

Esteraseaktivität von 24 mU/ml wurde mit PET-Fasern als Additiv erreicht, wobei während der

10 Tage Kultivierung die Enzymaktivität stetig zunahm. Unter Einsatz von recyceltem PET-Granulat,

PBT-Fasern, einer PET-Oligomerpräparation, einer zyklischer PET-Oligomerpräparation und BHET

konnten ebenfalls Esteraseaktivitäten gemessen werden, aber diese waren im Vergleich zur

Enzymaktivität aus dem MSV-Medium mit PET-Fasern deutlich geringer.

Obwohl beim Einsatz von BHET als Mediumzusatz in der SDS-PAGE (Abbildung 26) keine 52 kDa

große Bande im zellfreien Überstand nachzuweisen war, wurde auch hier nach 3 Tagen Kultivierung

eine Esteraseaktivität gemessen, die mit 21 mU/ml nur etwas geringer war als bei Verwendung von

PET-Fasern als Induktor (24 mU/ml). Eine Erklärung, warum die Bande in der SDS-PAGE nach

10 Tagen Kultivierung mit BHET nicht nachzuweisen war, ist, dass zu diesem Zeitpunkt bereits keine

52 kDa Esterase

29 kDa Esterase

1 2 3 4 5 6 7 8


detektierbare Esterasemenge mehr vorlag. Wahrscheinlich erfolgte mit BHET nur eine Produktion bis

zum 3. Tag der Kultivierung und anschließend wurde das Enzym inaktiviert oder abgebaut, was auch

mit dem Kurvenverlauf in Abbildung 27 übereinstimmen würde.

Abbildung 27: Esteraseproduktion durch T. fusca KW3 mit recyceltem PET-Granulat, PET-Oligomerpräparation, zyklische PET-Oligomerpräparation, BHET, PBT und PET-Fasern über einen Zeitraum von 10 Tagen im MSV-Medium.

Tabelle 12: Esteraseproduktion durch T. fusca KW3 im MSV-Medium mit verschiedenen Additiven über einen Zeitraum von 10 Tagen.

Substrat

(2 g/L)

Kultivierungstag

mit der höchsten

Enzymaktivität

Enzymaktivität

(U/ml)

Proteinkonzentration

(mg/ml)

Spezifische

Enzymaktivität

(U/mg)

BHET 3 0,021 0,25 0,084

PET-Oligomer-

präparation

3 0,007 0,14 0,047

zyklische PET-

Oligomer-

präparation

3 0,003 0,18 0,018

PET-Fasern 10 0,024 0,17 0,142

PBT-Fasern 10 0,014 0,06 0,240

Für die Proteinaufreinigung ist ebenfalls die gebildete Gesamtproteinmenge im Vergleich zur

Esterasemenge von Interesse, um einen optimalen Zeitpunkt für die Ernte der Rohenzymlösung

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0 1 2 3 4 5 6 7

En

zym

ak

tivit

ät

(U/m

l)


PET Oligomerpräparation zyklische PET Oligomerpräparation BHET

PBT Fasern PET Fasern recyceltes PET Granulat


festzulegen. Um diese Entwicklung genauer zu untersuchen, erfolgte während der Kultivierung von

T. fusca KW3 im MSV-Medium mit PET-Fasern zu verschiedenen Zeitpunkten eine Probenahme.

Diese Proben wurden anschließend per SDS-PAGE gelelektrophoretisch aufgetrennt und unspezifisch

mit Coomassie angefärbt. Zum Vergleich wurde diese Untersuchung ebenfalls mit einer Suberin-

präparation im MSV-Medium durchgeführt, um nochmals die Unterschiede zwischen den beiden

verwendeten Additiven und der daraus folgenden Enzymproduktion zu verdeutlichen.

3.1.2.2 Esterasebildung mit einer Suberinpräparation

T. fusca KW3 wurde in 5 Kolben mit 250 ml MSV-Medium mit Suberin als Additiv über einen Zeitraum

von 10 Tagen bei 50°C kultiviert. Der zellfreie Überstand von je einem Kolben wurde nach 0, 2, 4, 7

und 10 Tagen Kultivierung durch Zentrifugation gewonnen, die Esteraseaktivität und der

Proteingehalt mit den Standardbestimmungen gemessen und der Überstand gefriergetrocknet. In

Abbildung 28 sind die Esteraseaktivitäten (U/ml) und die maximalen spezifischen Esteraseaktivitäten

(U/mg) der zellfreien Kulturüberstände während des Zeitraums der Kultivierung graphisch

dargestellt.

Die maximale Esteraseaktivität (8,1 U/ml) und spezifische Esteraseaktivität (50,8 U/mg) wurden nach

48 Stunden Kultivierung gemessen, danach erfolgte eine Aktivitätsabnahme. Bis zum 7. Tag blieb die

Esteraseaktivität konstant auf einem Stand von 30 U/mg Protein, danach sank die Aktivität auf

0,03 U/ml und 0,289 U/mg ab.

Darüber hinaus wurden Proben der zellfeien Überstände mittels SDS-PAGE gelelektrophoretisch

aufgetrennt (Abbildung 29). Dafür wurden die Proben mit gleichen Volumenmengen auf das Gel

aufgetragen. Anhand des Gelphotos wird sichtbar, dass während der Kultivierung ein Protein mit ca.

29 kDa Größe gebildet wurde, dessen Konzentration bis zum 2. Tag anstieg und anschließend

während der weiteren Kultivierung stetig sank.


Abbildung 28: Bestimmung der Esteraseaktivitäten (◊) und der spezifischen Esteraseaktivitäten () während des

Wachstums im MSV-Medium unter Zugabe von Suberin.

Abbildung 29: SDS-PAGE der zellfreien Überstände nach Inkubation mit Suberin im MSV-Medium, links Coomassie-gefärbtes Gel; rechts Gel mit Aktivitätsfärbung mit Fast Red. Spur 1, 7: Roti


Nullwert; Spur 3, 8: zellfreier Überstand nach 2 Tagen Kultivierung; Spur 4: zellfreier Überstand nach 4 Tagen Kultivierung; Spur 5: zellfreier Überstand nach 7 Tagen Kultivierung; Spur 6: zellfreier Überstand nach 10 Tagen Kultivierung.

Zusätzlich erfolgte die Kultivierung von T. fusca KW3 für die Bestimmung der Biotrockenmasse-

bildung im MSV-Medium mit Suberin in 2 L Erlenmeyerkolben mit 750 ml Medium. Die Kultivierung

wurde gestartet durch die Zugabe von 42 ml Inoculum und erfolgte bei 50°C mit 150 rpm im

Schüttelinkubator mit täglicher Probenahme von je 35 ml und anschließender Filtration. Das Filtrat

0

20

40

60

80

0

2

4

6

8

10

0 2 4 6 8 10

Sp

ezif

isch

e E

nzym

akti

vit

ät

(U/m

g)

En

zym

akti

vit

ät

(U/m

l)


66 kDa

43 kDa

29 kDa

20 kDa

14.5 kDa

200 kDa

119 kDa

1 2 3 4 5 6 7 8


wurde für die Esteraseaktivitätsbestimmung eingesetzt und der Filter mit demineralisiertem Wasser

gewaschen, über Nacht getrocknet und nach dem Abkühlen im Exikkator mit der Feinwaage

ausgewogen. Die von T. fusca KW3 gebildete Biotrockenmasse in mg/ml und die Esteraseaktivität in

U/ml wurden gegeneinander aufgetragen (Abbildung 30). Da das MSV-Medium mit den Zellen aus

der Vorkultur angeimpft wurde, lag zum Zeitpunkt 0 ein Trockengewicht an Zellen von 0,7 mg/ml vor.

Bis zum vierten Tag gab es eine Zunahme sowohl der Biomasse als auch der Esteraseaktivität. Ab

dem vierten bis zum neunten Tag nahm die Biotrockenmasse nicht weiter zu. Nach dem neunten Tag

war dann eine Abnahme der Biotrockenmasse zu verzeichnen. Bezüglich der Esteraseaktivität konnte

festgestellt werden, dass die Aktivität vom ersten bis vierten Tag stark anstieg und danach auf ein

Drittel der maximalen Aktivität abfiel. Vom fünften bis achten Tag blieb die Esteraseaktivität konstant

und sank bis zum elften Tag auf 1,3 U/ml ab.

Die Unterschiede im Verlauf der Enzymaktivitäten in Abbildung 28 und 30 sind zum Einen auf die

verschiedenen Größen der Kultivierungsansätze (250 und 750 ml) und zum Anderen auf die

natürlichen Unterschiede der Suberinpräparation zurückzuführen.

Abbildung 30: Biotrockenmasseproduktion () und Esteraseaktivität (◊) von T. fusca KW3 im MSV-Medium.

3.1.2.3 Esterasebildung mit PET-Fasern

Um den optimalen Zeitpunkt für die Gewinnung der 52 kDa Esterase Rohenzymlösung in Form des

zellfreien Überstandes zu ermitteln, wurde T. fusca KW3 in 5 Erlenmeyerkolben mit je 250 mL MSV-

Medium mit PET-Fasern bei 50°C kultiviert. Eine Kontrolle wurde sofort nach der Inokulation

abfiltriert und abzentrifugiert, um den zellfreien Überstand zu gewinnen. Diese Probe diente als

0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

2,1

0

1

2

3

4

5

6

7

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Bio

tro

ck

en

ma

ss

e (

mg

/ml)

En

zym

ak

tivit

ät

(U/m

l)



Nullwert. Nach 2, 4, 8 und 10 Tagen wurden die zellfreien Überstände von je einem weiteren Kolben

geerntet und die Esteraseaktivität und der Proteingehalt bestimmt. Die Esteraseaktivität (mU/ml)

wurde gegen die Kultivierungsdauer (Tage) aufgetragen (Abbildung 31). Ab der Kultivierungsdauer

von 2 Tagen stieg die Esteraseaktivität bis zum 10. Tag auf 35 mU/ml bzw. die spezifische Aktivität

auf 673 mU/mg an.

Abbildung 31: Graphische Darstellung der Esteraseaktivität (◊) und der spezifischen Esteraseaktivität () gebildet während

der 10-tägigen Kultivierung im MSV-Medium mit PET-Fasern.

Darüber hinaus wurden Proben der zellfeien Überstände mittels SDS-PAGE gelelektrophoretisch

aufgetrennt (Abbildung 32).

Abbildung 32: SDS-PAGE der zellfreien Überstände nach Inkubation mit PET-Fasern im MSV-Medium, links Coomassie-gefärbtes Gel; rechts Gel mit Aktivitätsfärbung mit Fast Red. Spur 1 und 7: Roti


Nullwert; Spur 3: zellfreier Überstand nach 2 Tagen Kultivierung; Spur 4: zellfreier Überstand nach 4 Tagen Kultivierung; Spur 5: zellfreier Überstand nach 8 Tagen Kultivierung; Spur 6, 8: zellfreier Überstand nach 10 Tagen Kultivierung.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 2 4 6 8 10

Sp

ezif

isc

he

En

zym

ak

tivit

ät

(mU

/mg

)

En

zym

ak

tivit

ät

(mU

/ml)


1 2 3 4 5 6 7 8

200 kDa

119 kDa

66 kDa

43 kDa

29 kDa

20 kDa

14.5 kDa


Dafür wurden die Proben mit gleichen Volumenmengen auf das Gel aufgetragen. Anhand des

Gelphotos wurde sichtbar, dass bereits nach 2 Tagen Kultivierung ein Protein mit ca. 52 kDa Größe

gebildet wurde, dessen Konzentration bis zum 10. Tag stetig anstieg.

Der optimale Zeitpunkt für die Gewinnung des zellfreien Überstandes für die Aufreinigung der 52 kDa

PET-Esterase war demnach nach einer 10-tägigen Kultivierung im MSV-Medium mit PET-Fasern.

Die Biotrockenmassebestimmung zur Untersuchung der Wachstumskurve von T. fusca KW3 mit PET-

Fasern konnte nicht durchgeführt werden, da ein Teil der Biomasse an der Faseroberfläche anhaftete

und somit mit den Fasern bei der Filtration von den restlichen Zellen abgetrennt wurde. Somit

konnte keine Gesamtbiotrockenmasse bestimmt werden.

Anhand der bisherigen Versuche konnte folgendes festgestellt werden: Bei der Kultivierung von

T. fusca KW3 im MSV-Medium mit PET-Fasern wurde die Bildung einer 52 kDa großen Esterase

induziert (Abbildung 32). Erfolgte stattdessen die Kultivierung in Gegenwart von Suberin, wurde eine

29 kDa Esterase produziert (Abbildung 29).

Da die 52 kDa Esterase unter Zusatz von synthetischen Polyestern produziert wurde, war sie von

größerem Interesse für die weiteren Untersuchungen. Aus diesem Grund erfolgten alle

nachfolgenden Arbeiten mit der 52 kDa große Esterase, die mit den PET-Fasern als Substrat gebildet

wurde. Allerdings ergab sich daraus das Problem, dass die Produktion der Esterase mit den PET-

Fasern einen hohen Zeitaufwand für die Kultivierung beanspruchte, um genügend Rohenzymlösung

für eine Aufreinigung des Enzyms bereitzustellen. Aus diesem Grund wurde im Anschluss ein

weiteres Terephthalat-enthaltendes Substrat als möglicher Zusatz für die Produktion der gesuchten

Esterase getestet. Ebenfalls wurden zwei weitere Spezies der Gattung Thermobifida fusca in das

Esterase-Screening mit einbezogen, um zu testen, ob sich die Esteraseproduktion deutlich

unterscheidet von der von T. fusca KW3.

3.1.3 Esterasebildung bei T. fusca KW3 DSM 6013, T. fusca DSM 43792 und DSM 43793 mit PET-Fasern und Diethylterephthalat

Das Ziel dieser Untersuchung war es, einen Stamm und einen Zusatzstoff zu finden, mit dem eine

maximale Ausbeute an PET abbauender Esterase in der Rohenzymlösung erhalten wird. Neben PET-

Fasern wurde als weiteres Additiv Diethylterephthalat (DET), ebenfalls wie BHET ein Derivat der

Terephthalsäure, eingesetzt. Diese Substanz wurde dem MSV-Medium wie alle anderen bereits

getesteten Additive in einer Konzentration von 2 g/L zugesetzt. Neben T. fusca KW3 wurden zwei

weitere, vom DSMZ bezogene Stämme unter den gleichen Bedingungen kultiviert (T. fusca DSM

43792 und T. fusca DSM 43793). Bei der Kultivierung sollte die Esterasebildung von T. fusca KW3 mit


PET-Fasern und DET im MSV-Medium verglichen werden mit der Esterasebildung von

T. fusca DSM 43792 und DSM 43793 unter gleichen Bedingungen.

Für T. fusca KW3 erfolgte während der Kultivierung eine Probenahme zur Bestimmung der

Esteraseaktivitäten im Überstand (Abbildung 34). Darüber hinaus wurden Proben für die SDS-PAGE

und die Aktivitätsfärbung entnommen (Abbildung 33). Es ist ersichtlich, dass nach der Kultivierung

mit PET-Fasern sowohl bei Stamm T. fusca KW3 als auch bei den Stämmen T. fusca DSM 43792 und

DSM 43793 eine 52 kDa große Esterase gebildet wurde, die über die Aktivitätsfärbung mit Fast Red

genau auf dem Gel identifiziert werden konnte (rote Banden Spuren 2, 4, 6). Desweiteren konnte

gezeigt werden, dass nach Kultivierung mit DET bei allen drei untersuchten Stämmen eine 29 kDa

große Esterase produziert wurde, die ebenfalls über Aktivitätsfärbung mit Fast Red genau

identifiziert werden konnte (rote Banden Spuren 3, 5, 7). Damit konnte festgestellt werden, dass die

beiden Additive die Produktion zweier unterschiedlicher Esterasen induzieren: die PET-Fasern eine

52 kDa Esterase und DET eine 29 kDa Esterase. Somit waren die Stämme bei Anwesendheit von DET,

ebenso wie von Suberin und Cutin, nicht in der Lage, die 52 kDa Esterase zu synthetisieren.

Da sich die produzierten Mengen der 52 kDa Esterase bei allen drei Stämmen nicht unterscheiden,

wurde bei den weiteren Untersuchungen das Isolat aus der Stammsammlung, T. fusca KW3,

verwendet.

Abbildung 33: SDS-PAGE der Rohenzymlösungen nach Kultivierung mit unbehandelten PET-Fasern bzw. DET im MSV-

Medium, Gel gefärbt mit Coomassie- und mit Aktivitätsfärbung. Spur 1, 8: Low Molecular Weight Längenstandard; Spur 2: T. fusca DSM 43792 mit PET-Fasern kultiviert; Spur 3: T. fusca DSM 43792 mit DET kultiviert; Spur 4: T. fusca DSM 43793 mit PET-Fasern kultiviert; Spur 5: T. fusca DSM 43793 mit DET kultiviert; Spur 6: T. fusca KW3 DSM 6013 mit PET-Fasern kultiviert; Spur 7: T. fusca KW3 DSM 6013 mit DET kultiviert.

97 kDa 66 kDa 45 kDa 30 kDa 20.1 kDa 14.4 kDa

52 kDa

29 kDa

1 2 3 4 5 6 7 8


Abbildung 34: Esteraseproduktion durch T. fusca KW3 mit DET (◊) und PET-Fasern () über einen Zeitraum von 13 Tagen im MSV-Medium.

Beim Screening nach PET-Hydrolasen aus T. fusca zeigte sich, dass zunächst die Vorkultur im Czapek-

Medium nach zwei Tagen Wachstum die maximale Zelldichte mit noch exponentiellem Wachstum

vorwies. Die Zellen wurden steril zentrifugiert, in Puffer resuspendiert, um alle Reste an Glucose zu

entfernen, und damit das MSV-Medium angeimpft. Die Kultur im MSV-Medium wurde mit

verschiedenen Zusätzen kultiviert, um hydrolytische Enzyme zu produzieren. Während des

Wachstums war zu beobachten, dass mit Cutin, Suberin und DET die Produktion eines anderen

Enzyms erfolgte, als mit den synthetischen PET- und PBT-Fasern, PET-Granulat und der PET-

Oligomerpräparation. Mit den Monomeren TPA und Ethylenglycol erfolgte keine Enzymproduktion.

Die mit den Biopolyestern und erstaunlicherweise auch mit DET induzierte Hydrolase besaß p-NPB

Aktivität und wies im SDS-PAGE Gel eine molekulare Größe von 29 kDa auf. Desweiteren war die

maximale Produktion des Enzyms bei 50°C nach 2 Tagen mit Suberin erreicht und betrug 8,1 U/ml

und eine spezifische Aktivität von 50,8 U/mg. Mit den synthetischen Additiven bildete T. fusca KW3

hingegen eine andere, größere Hydrolase von ca. 52 kDa und mit p-NPB Aktivität. Für dieses Enzym

wurde die maximale Produktionsrate nach mindestens 10 Tagen Kultivierung mit 35 mU/ml bzw. die

spezifische Aktivität auf 673 mU/mg erreicht. Die Produktion erfolgte ebenfalls bei 50°C, jedoch

wurden deutlich geringere Mengen Enzym produziert im Vergleich zur 29 kDa Hydrolase (Verhältnis

1:230) mit einem 5fach höheren Zeitaufwand.

Diese Produktion zweier verschiedener Esterasen wurde nicht nur bei T. fusca KW3 festgestellt,

sondern auch mit den Stämmen aus der Stammsammlung des DSMZ, T. fusca DSM 43792 (ATCC

27730) und DSM 43793.

Fett et al. testeten bereits 1999 verschiedene Actinomyceten auf ihre Produktion von Cutin-

depolymerisierenden Enzymen (Fett et al. 1999). Von Thermomonospora alba NRRL B-16963T

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 2 4 6 8 10 12 14

Es

tera

se

ak

tivit

ät

(mU

/ml)



(NCIMB 10169); T. chromogena ATCC 43196T; T. curvata ATCC 19995T; T. formosensis ATCC 49059T;

T. fusca ATCC 27730T (DSM 43792), NRRL B-11456 und YX-5p; T. mesophila ATCC 27303T;

T. mesouviformis ATCC 27644T und T. sp. NRRL B-16962 produzierte nur der Referenzstamm

T. fusca ATCC 27730 im Trypton-Hefeextrakt-Medium Cutinase-Aktivität. Ebenso produzierte der

verwendete Stamm T. fusca KW3 im MSV-Medium mit Pepton bei Anwesenheit einer Suberin- oder

Cutin-Präparation Esteraseaktivität.

Mit verschiedenen Substanzen und cutin- bzw. lipidhaltigen Naturprodukten (1-Hexadecanol, ein

Cutinhydrolysat, Palmitinsäure, Hexadecan-1-ol, Rizinolsäure, Maisfasern (unbehandelt), Maiskleie,

Rizinusöl, Maiskeimöl und Olivenöl) zeigte der Referenzstamm T. fusca ATCC 27730 keine Anregung

der Cutinaseproduktion und bei höheren Konzentrationen sogar eine Hemmung des

Bakterienwachstums (Fett et al. 1999). T. fusca KW3 produzierte mit den Monomeren

Terephthalsäure und Ethylenglycol ebenfalls keine Esteraseaktivität.

Hingegen konnte bei T. fusca ATCC 27730 mit Apfelcutin, Apfeltrester, Tomatenschalen, Kork und

Suberin aus Kartoffeln Cutinase-Aktivitäten nachgewiesen werden, welche mit den Tomatenschalen

am höchsten waren. T. fusca KW3 produzierte mit Apfelcutin und Suberin die höchsten

Esteraseaktivitäten, wobei die Aktivitäten mit Apfelcutin am Höchsten waren (Daten nicht

dargestellt). Geringere Esteraseaktivitäten wurden mit synthetischen PET- und PBT-Fasern, PET-

Granulat, der PET-Oligomerpräparation und DET bestimmt. Bei Untersuchungen zum biologischen

Abbau von aromatisch-aliphatischen Copolyestern mit den neu isolierten T. fusca K13g und K7a-3

erfolgten die Induktion und das Screening nach hydrolytischer Esteraseaktivität mit Polymerfilmen

aus 1,4-Butandiol, Terephthalsäure und Adipinsäure (Kleeberg et al. 1998). T. fusca K13g und K7a-3

zeigten bei 16S rDNA Sequenzvergleichen die höchsten Übereinstimmungen mit T. fusca DSM 43792T

(99,8% und 100%). Nachfolgend wurden weitere Studien zur Produktion dieser Copolyester-

abbauenden Hydrolase aus T. fusca DSM 43793 mit Ecoflex™-Pulver (BTA Copolyester, Partikelgröße

< 0,8 mm) als Induktor durchgeführt (Gouda et al. 2002). Die höchsten Aktivitäten der Hydrolase

wurden aufgrund des Austauschs von 5 g/L Pepton im MSV-Medium durch 1,87 g/L NH4Cl und 5 g/L

Pektin erzielt (von 1,5 UPCL-Film/mg und 0,8 U/mgProtein auf 1,8 UPCL-Film/mg und 6,0 U/mgProtein). Die

Actinomycetenisolate M5, M9 und Thermobifida fusca KW3b (jetzt KW3), alle isoliert aus Kompost,

wurden in einem Minimalmedium mit PET-Garn, DET oder einer Suberinpräparation aus

Kartoffelschalen (je 2 g/L) zur Enzymproduktion 8 Tage bei 45°C kultiviert (Alisch et al. 2004). Die

produzierte Enzymaktivität, bestimmt mit p-NPB, lag für alle Isolate mit PET-Fasern und DET als

Induktor während der 8 Tage bei maximal 40 mU/ml, ebenso für M5 und M9 mit der

Suberinpräparation. Die einzige Ausnahme war T. fusca KW3b, der nach 8 Tagen mit der

Suberinpräparation 120 mU/ml aufweisen konnte (Alisch et al. 2004).


Weiterhin konnte festgestellt werden, dass die Zugabe von Glucose zum Produktionsmedium bei

T. fusca ATCC 27730 und T. fusca KW3 eine stark hemmende Auswirkung auf die Enzymproduktion

besaß (Fett et al. 1999). Auch bei Gouda et al. 2002 erfolgte beim Einsatz von Glucose, Saccharose

oder Stärke anstatt Pektin keine Produktion der Hydrolase.

Weiterhin konnte kein signifikanter Einfluss des eingesetzten Inokulationsvolumens (1 bis 15 ml auf

80 ml Medium) auf die maximal produzierte Enzymaktivität (1,3 bis 1,7 UPCL-Film/mL) identifiziert

werden (Gouda et al. 2002). Bei der Untersuchung des Einflusses der freigesetzten BTA-Monomere

auf die Esteraseproduktion wurden die Natriumsalze der Adipinsäure und der Terephthalsäure und

1,4-Butandiol dem Kulturmedium vor der Inokulation beigesetzt. Bei einer Konzentration von

50,1 mg 1,4-Butandiol oder 68,0 mg Adipinsäure oder 50,4 mg Terephthalsäure zusätzlich zu 250 mg

BTA-Pulver wurden keine hydrolytischen Aktivitäten im Medium detektiert. Das bedeutet, dass diese

Konzentrationen sich auf eine weitere Enzymproduktion hemmend auswirken, nicht aber auf bereits

produziertes Enzym, welches die Monomere während eines Abbaus freisetzt. Beim Vergleich von

BTA-Filmen, -Pulver und -Nanopartikeln als Induktor zeigte sich, dass die Polymeroberfläche keinen

bedeutenden Einfluss auf die Enzymproduktion nach 48 Stunden hatte. Hingegen zeigte die Variation

der BTA-Pulver Konzentration im Produktionsmedium einen interessanten Einfluss auf die

produzierte Menge an hydrolytischem Enzym. Beim Scale-up der Produktion vom Schüttelkolben

zum 100 L Fermenter wurden stets Enzymaktivitäten um die 1,5 UPCL-Film/mL und spezifische

Aktivitäten von 4 bis 6 U/mgProtein nach 48 Stunden Inkubation erreicht. Die untersuchte Hydrolase

aus T. fusca DSM 43793 besaß ein Molekulargewicht von ca. 30 kDa (Gouda et al. 2002).

Weiterführend zu Fett et al. (1999) erfolgte die Erzeugung von Mutanten des Referenzstamms

T. fusca ATCC 27730 (T. fusca WSH04) mit einer höheren Cutinaseproduktion mittels Behandlung mit

Diethylsulfat (Du et al. 2007). Weiterhin wurde der Einfluss von Glucose, Saccharose, löslicher Stärke,

Ethanol und Natriumacetat auf die Cutinaseproduktion untersucht und es zeigte sich, dass mit dem

Zusatz von Ethanol und Natriumacetat ähnliche Zelltrockengewichte und Cutinaseaktivitäten erreicht

werden konnten, die spezifische Cutinaseaktivität aber höher beim Einsatz von Natriumacetat war.

Bei der Untersuchung des Einflusses der Natriumacetatkonzentration auf die gebildete Zellmasse und

Cutinaseaktivität zeigte sich, dass mit einer Konzentration von 7,5 g/L die höchsten Ergebnisse erzielt

wurden. Das beste Zellwachstum wurde mit pH 7,3 und die höchste Cutinaseproduktion mit pH 7,6

erreicht. Deshalb entwickelten Du et al. (2007) eine 2-Phasen pH-kontrollierte Kultivierung mit 20

Stunden bei pH 7,3 für eine maximale Biomasseproduktion und anschließend bei pH 7,6 nach 50

Stunden Kultivierung für eine maximale Cutinaseproduktion (Du et al. 2007).

Hu et al. (2010) isolierten von kompostierten Polyesterfilmen zwei Gruppen von Mikroorganismen,

Actinomyceten (vier Gattungen) und Bacillen (drei Gattungen). Von diesen Isolaten war nur

Thermobifida alba AHK119 in der Lage, den aliphatisch-aromatischen Copolyesterfilm (Apexa®, zuvor


Biomax® 4026 und 4027, ein Polyethylenterephthalat Copolymer aus Terephthalsäure, Ethylenglycol

und einer ungenannten Komponente) abzubauen, ebenso die Partikelgröße von Polymeren (PCL,

Bionolle™ EM-301 (Polybutylensuccinat-co-adipat (PBSA)), Ecoflex™) zu verringern und dabei

Terephthalsäure freizusetzen. Verantwortlich für den Abbau war eine Hydrolase von ca. 30 kDa

Größe (Hu et al. 2010). Bisher wurden allerdings nicht nur aus Thermobifida cutinolytische oder PET-

abbauende Enzyme identifiziert, sondern ebenfalls aus anderen Bakterienstämmen und auch Pilzen.

Aus einer phyllospherischen Bakterienkultur wurde 1987 von Sebastian et al. ein fluoreszierender

Pseudomonas putita ATCC 55613 (wurde umbenannt zu P. mendocina) Stamm isoliert. Das Isolat

produzierte eine extrazelluläre Cutinase während des Wachstums mit Cutin, aber nicht mit Cutin

Hydrolysaten im Vergleich zur eukaryotischen Produktion von Fusarium solani sp. pisi. Die während

der Hydrolyse freigesetzten Cutinmonomere wurden mittels Dünnschichtchromatographie

nachgewiesen (Sebastian et al. 1987). Bei der SDS-PAGE und der Gelfiltration zeigte das Enzym ein

Molekulargewicht von 30 kDa und eine monomere Form (Sebastian et al. 1988).

El-Bendary et al. haben 2010 die Oberflächenhydrolyse von PET-Textilien durch Lipasen aus den

Bacillus Isolaten 5W und 6C untersucht. Die Lipase aus dem Bacillus 5W Isolat wurde in größeren

Mengen als PET-oberflächenmodifizierendes Enzym mit 6% Baumwollsamenmehl und pH 7,5

produziert (90U/ml). Die beste Ausbeute wurde mit 25 ml Medium, 25 x 106 CFU/ml Inoculum und

24 Inkubation erzielt. Die Zugabe von Pepton zum Medium steigerte die Lipaseproduktion um 22,5%

(130,7 U/ml) (El-Bendary et al. 2010).

F. solani f. pisi produzierte während des Wachstums mit Cutin extrazelluläre Cutin-

depolymerisierende Enzyme, welche alle Gruppen von Cutinmonomeren freisetzten (Purdy und

Kolattukudy 1973). Aus dem extrazellulären Überstand wurden zwei Isoenzyme, eine Cutinase und

eine unspezifische Esterase (p-Nitrophenylpalmitat Hydrolase) mit einem Molekulargewicht von

22 kDa bzw. 52 kDa isoliert (Purdy und Kolattukudy 1975a).

Cutinhydrolysate im Medium hatten eine Produktion einer extrazellulären Cutinase bei einem in

Glucose-Medium gewachsenen F. solani f. sp. pisi zur Folge (Lin und Kolattukudy 1978). Die

Produktionsrate war abhängig von der Menge des Cutinhydrolysates, welches bis zu einer

Konzentration von 80 µg/ml zugegeben wurde, und bei dieser Konzentration erfolgte kein weiterer

Anstieg der Produktion. Bei Anwesenheit von Glucose erfolgte keine Cutinaseproduktion. Die

Induktion der Cutinase durch Cutinhydrolysate wurde nicht durch Actinomycin D (zytotoxisches

Antibiotika) inhibiert und durch Cordycepin (Antitumor, antifungales und antivirales Reagenz) sogar

noch erhöht. Durch die Zugabe von Cycloheximid mit dem Induktor oder bis zu 12 Stunden nach der

Zugabe des Induktors resultierte ein fast sofortiger Stillstand der Cutinaseproduktion. Ebenso

unterdrückte Deoxyglucose, ein Hemmer der Proteinglykosylierung, die Produktion der Cutinase mit

Cutinhydrolysaten. Die ω-Hydroxyfettsäuren waren deutlich effizienter bei der Induktion der


Cutinase als alle anderen noch polareren Säuren des Cutins. Experimente mit Derivaten und Analogas

der ω-Hydroxy-C16-Fettsäuren zeigten, dass eine freie Hydroxylgruppe an der ω-Position als ein

wichtiger Faktor für die Cutinaseinduzierende Aktivität zu sehen ist. Ebenfalls erfolgte mit n-

aliphatischen primären Alkoholen (C14 oder mehr) die Produktion der Cutinase, wobei n-C16 am

effizientesten induzierte. Das bedeutet, dass die Monomere als das chemische Signal agieren,

welches die extrazelluläre Hydrolase induziert (Lin und Kolattukudy 1978).

Ebenfalls wurden Cutinasen aus fünf verschiedenen phytopathogenen Pilzen und Bakterien,

F. roseum culmorum, F. roseum sambucinum, Ulocladium consortiale, Streptomyces scabies und

Helminthosporium sativum, mit einem Molekulargewicht von ca. 25 kDa isoliert. Eine Suspension mit

Sporen oder Mycelien einer 14 Tage alten Kultur wurde dafür in 100 ml eines Mineralmediums mit

pH 7,2 und 0,5 g Cutin gegeben (Lin und Kolattukudy 1980a).

Das F. solani pisi Isolat T-8 war in der Lage, mit Suberin aus Kartoffelschalen als einzige

Kohlenstoffquelle zu wachsen. Der extrazelluläre Überstand dieser Kulturen hydrolysierte p-

Nitrophenylbutyrat und radioaktiv markiertes Apfelcutin. Der Großteil der Esterase war an die

Suberin enthaltende Mycelmatte gebunden und konnte mit einer 0,4% Triton X-100 Lösung

ausgewaschen werden. Die Enzymlösung enthielt zwei Isoenzyme mit einem Molekulargewicht von

23 kDa. Desweiteren wurde festgestellt, dass F. solani pisi sehr ähnliche oder gleiche Polyesterasen

bildet für den Abbau von Cutin und Suberin, wenn diese als einzige Kohlenstoffquellen im Medium

vorhanden sind (Fernando et al. 1984).

Nimchua et al. (2007) verwendete für die Isolation von Mikroorganismen mit PET-hydrolysierenden

Enzymen sowohl Pflanzenproben, wie Blätter, Blüten, unterirdische Speicherorgane und Früchte, als

auch Bodenproben gesammelt an verschiedenen Stellen in Nord-Thailand. Die PCL abbauenden

Isolate und der F. solani f. sp. pisi wurden anschließend mit Mineralmedium kultiviert (Nimchua et al.

2007). Verschiedene Microfungi wurden von Pflanzenoberflächen und Bodenproben mittels PCL-

Mineralmedium-Platten isoliert. 22 der 115 Isolate zeigten Hofbildung, was auf eine Cutinaseaktivität

schließen ließ. Die Produktion der Cutinase im Mineralmedium mit Suberin aus Kartoffeln oder PET-

Fasern wurde mittels p-NPB Aktivitätsbestimmung nachgewiesen, wobei alle Isolate p-NPB Aktivität

zeigten. Das Isolat PBURU-B5 besaß die höchste p-NPB Aktivität mit PET-Fasern und wurde

identifiziert als F. solani (Nimchua et al. 2008).

Wang et al. (2008) untersuchten die Optimierung der Kulturbedingungen der Lipaseproduktion und

die Bereitstellung einer spezifischen Lipase für die PET-Hydrolyse aus Aspergillus oryzae CCUG. Die

unter Zusatz von Olivenöl produzierte Lipase konnte die Eigenschaften der PET-Textilien nicht

deutlich ändern, deshalb wurden Diethyl-p-phthalat (DP), BHET und PET-Fasern als Zusätze

verwendet. Mit BHET wurden die besten Produktionsraten erreicht und die extrazelluläre Lipase

hydrolysierte das PET Modellsubstrat DP (Wang et al. 2008).


Zur Identifikation neuer PET-modifizierender Mikroorganismen erfolgte ein Screening mit

Bodenproben von verschiedenen Mülldeponien und von einer Abwasserkompostierungsanlage als

Inoculum. Die gesuchten Mikroorganismen sollten mit PET als alleinige C-Quelle wachsen können.

Die Kultivierung erfolgte in einem Mineralsalzmedium mit Spurenelementen bei pH 7 (für Bakterien)

und pH 5 (für Pilze). Das Medium mit PET-Pulver (10 g/L) wurde mit einer Bodenprobe kultiviert.

Nach drei Wochen wurden die Kulturen auf Vollmedium ausgestrichen und Reinkulturen auf ihre

PET-Hydrolyse hin getestet. Es konnten 4 verschiedene bakterielle und 5 verschiedene eukaryotische

Isolate identifiziert werden. Da das Wachstum mit PET sehr langsam erfolgte, wurde zusätzlich Cutin

als Induktor getestet. Alle Pilze und 2 Bakterienisolate wuchsen mit Cutin als einzige C-Quelle und

produzierten eine Esteraseaktivität, hingegen zeigten mit Adipinsäure-bishexylamid als Induktor alle

bakteriellen Isolate extrazelluläre PET-Hydrolyseaktivität. Im Vollmedium mit Pepton, Hefeextrakt

und Glucose besaßen alle Isolate nur eine schwache p-NPA Aktivität (Fischer-Colbrie et al. 2004).

Mit 3PET (BETEB, 1 g/L) als Modellsubstrat isolierten Liebminger et al. (2007) Mikroorganismen, die

PET-abbauende Enzyme produzieren. Dabei wurde ein Penicillium citrinum Isolat identifiziert,

welches eine Polyesterase von 14.1 kDa zum PET Abbau produziert. Die höchsten Enzymausbeuten

konnten unter Zusatz von Cutin (1.2 g/L) erreicht werden (Liebminger et al. 2007).

Der Abbau von BHET/DET (in der Literatur wurde unter Zusatz von Diethylenglycolterephthalat

angegeben, was eine andere Beschreibung für BHET ist; in den Abbildungen ist allerdings DET

dargestellt, was sich durch die beiden endständigen Alkoholgruppen vom BHET unterscheidet; somit

ist keine eindeutige Zuordnung möglich) und PET-Fasern durch Mikroorganismen und Lipasen wurde

von Zhang et al. 2004 untersucht. Die isolierten Mikroorganismen aus Belebtschlamm wurden auf

ihre Fähigkeit hin, PET-Fasern oder BHET/DET zu hydrolysieren, getestet (Zhang et al. 2004, Zhang

et al. 2006).

Zusammenfassend ist aus den Tabellen 13 und 14 ersichtlich, dass bei den Bakterien und Pilzen je

maximal zwei verschiedene Polyesterspaltende Enzyme produziert wurden und diese in einem

Größenbereich von 14 bis 52 kDa lagen. Bei den Bakterien wurden meist hochpolymere natürliche

oder synthetische Verbindungen aus Zusatzstoffe eingesetzt, wohingegen deren Monomere oder

Hydrolysate ebenso wie Glucose oder andere Zucker eher eine hemmende Wirkung auf die

Enzymproduktion zeigten. Zusätzlich zu den Induktoren wurden noch weitere komplexe C-Quellen

für die Bildung der Biokatalysatoren benötigt und die Kultivierungsdauer lag zwischen 1 bis 10 Tagen

bis zum Erreichen der maximalen Enzymaktivität.


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Die verwendeten Induktoren bei den Pilzkultivierungen waren zum Teil Biopolyester, aber auch

Monomere oder Hydrolysate. Einige Pilze konnten sogar nur mit diesen Induktoren als einzige C-

Quelle wachsen. Dieser Unterschied macht deutlich sichtbar, dass die Bakterien nicht nur die Energie

in Form einer C-Quelle benötigen, sondern auch weitere wichtige Bausteine, wie z. B. Vitamine, die

sie selbst nicht synthetisieren können, Pilze hingegen sind dazu in der Lage. Die Hemmung der

Enzymproduktion bei den Bakterien durch die Abbauprodukte der enzymatischen Katalyse stellt

einen wichtigen Regulationsschritt im Stoffwechselweg dar und verhindert die Verschwendung von

Energiereserven. Die Kultivierungsdauer bei den Pilzkulturen war mit 4 bis 21 Tagen deutlich höher

als bei den Bakterien und begründet sich durch das langsamere Wachstum. Ein Vergleich der

gebildeten Aktivitäten ist nicht sehr sinnvoll, da für die Aktivitätsbestimmungen verschiedene

Substrate eingesetzt wurden. Interessanterweise bildete nicht nur T. fusca KW3 zusätzlich zu zwei

isomeren Cutinasen eine 52 kDa große Esterase, dieses Verhalten konnte ebenfalls bei F. solani f. pisi

identifiziert werden. Leider erfolgte keine weitere Studie dieser gebildeten Esterase zu dem

damaligen Zeitpunkt (Purdy und Kolattukudy 1975a, b).

3.2 Charakterisierung der PET-Hydrolasen aus T. fusca KW3

3.2.1 Aufreinigung

3.2.1.1 Aufreinigung der TfCa

Im Vergleich zu intrazellulären Enzymen, die durch Aufschluss mittels Ultraschall oder French Press in

großen Mengen gewonnen werden können und daraus Enzyme von Interesse über verschiedene

chromatographische Verfahren aufgereinigt werden, ist die Aufreinigung extrazellulärer Enzyme

komplizierter.

Die Enzymaufreinigung erfolgte bei Raumtemperatur. Nach Dialyse und Zentrifugation wurde die

Enzympräparation mit 100 mM Phosphatpuffer pH 8 auf 20 mM eingestellt. Dann erfolgte der

Auftrag der Enzymlösung auf eine selbstgepackte equilibrierte Phenylsepharose Säule. Unter den

gewählten Bedingungen band die TfCa an die Säulenmatrix. Durch die Erhöhung der Isopropanol

Konzentration von 0 auf 30% durch den in Abbildung 35 verzeichneten Stufengradienten erfolgte die

Elution des gebundenen aktiven Proteins bei 15 bis 25% Elutionspuffer B (Aufreinigungsschritt 2).

Aktive Fraktionen (p-NPB Aktivität) wurden vereinigt. Das enthaltene Isopropanol in der

Enzympräparation wurde mittels Rotationsverdampfers abgetrennt.


Abbildung 35: Elutionsprofil der Enzymlösung während des zweiten Aufreinigungsschritts (Phenylsepharose,

Säulenvolumen 25 ml, Puffer A: 20 mM Phosphatpuffer pH 8, Puffer B: 30% Isopropanol in 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die Esteraseaktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt).

Weitere Fremdproteine wurden durch eine Anionenaustauschchromatographie mit DEAE Sepharose

abgetrennt (Aufreinigungsschritt 3). Die TfCa band an die Matrix und eluierte nach dem Anlegen des

NaCl-Gradienten im Bereich von 20 bis 25% Puffer B (Abbildung 36). Aktive Fraktionen wurden

gesammelt (DEAE-Sepharose Pool) und gegen 20 mM Phosphatpuffer pH 8 dialysiert. Dann erfolgte

der Auftrag der Enzympräparation auf eine equilibrierte Octyl-Sepharose Säule (Aufreinigungsschritt

4). Die gebundene TfCa eluierte nach Anlegen eines linearen Isopropanol-Gradienten bis 30% in

20 mM Phosphatpuffer (Abbildung 37). Die aktiven Fraktionen von 10 bis 50% Puffer B wurden

vereinigt und das enthaltene Isopropanol durch Abdampfen entfernt.

Abbildung 36: Elutionsprofil der Enzymlösung während des dritten Aufreinigungsschritts (DEAE-Sepharose, Säulenvolumen

54 ml, Puffer A: 20 mM Phosphatpuffer pH 8, Puffer B: 1 M NaCl in 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die Esteraseaktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt).

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-50

50

150

250

350

450

0 200 400 600 800

Es

tera

se

ak

tivit

ät

(U)

UV

(2

80

nm

)


15%

50%

100%


Abbildung 37: Elutionsprofil der Enzymlösung während des vierten Aufreinigungsschritts (Octyl-Sepharose, Säulenvolumen

1 ml, Puffer A: 20 mM Phosphatpuffer pH 8, Puffer B: 30% Isopropanol in 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die Esteraseaktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt).

Als letzter chromatographischer Reinigungsschritt erfolgte der Auftrag auf eine selbstgepackte

Sephadex 200 (Größenausschlusschromatographie) und die Elution der Proteine nach ihrer Größe

mit einem 0,15 M NaCl in 20 mM Tris/HCl pH 8 Elutionspuffer (Abbildung 38). Die aktiven Fraktionen

wurden im Bereich von 60-80 ml identifiziert und vereinigt. Die Aufreinigung wurde mit einer SDS-

PAGE mit Coomassie Färbung dokumentiert (Abbildung 39).

Abbildung 38: Elutionsprofil der Enzymlösung während des fünften Aufreinigungsschritts (Sephadex 200, Säulenvolumen

110 ml, Puffer: 0,15 M NaCl in 20 mM Tris/HCl pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau) und die Esteraseaktivität (schwarz).

0

5

10

15

20

25

0

50

100

150

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Es

tera

se

ak

tivit

ät

(U)

UV

(2

80

nm

)


100%

0

10

20

30

40

50

0

5

10

15

20

25

30

35

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Es

tera

se

ak

tivit

ät

(U)

UV

(2

80

nm

)



97 kDa 66 kDa 45 kDa 30 kDa 20.1 kDa 14.4 kDa

1 2 3 4 5 6

Abbildung 39: SDS-PAGE der Aufreinigung der TfCa aus T. fusca KW3. Spur 1: Enzymlösung nach der Dialyse; Spur 2: Enzymlösung nach der HIC 1; Spur 3: Enzymlösung nach der AIEX; Spur 4: Enzymlösung nach der HIC 2; Spur 5: Enzymlösung nach der SEC; Spur 6: Low Molecular Weight Längenstandard (Billig et al. 2010).

Wie aus der Abbildung 39 ersichtlich ist, konnte mit den fünf Reinigungsschritten die TfCa bis zur

elektrophoretischen Reinheit isoliert werden. Es erfolgte eine 7625 fache Aufreinigung der Esterase

mit einer Ausbeute von 7% der Ausgangsenzymlösung mit einer Aktivität von 36,6 U und einer

Proteinkonzentration von 0,012 mg (Tabelle 15). Die spezifische Aktivität konnte von 0,4 U/mg auf

3050 U/mg erhöht werden.

Tabelle 15: Aufreinigungstabelle der TfCa aus T. fusca KW3 (Billig et al. 2010).

Schritt Volumen

(ml)

Aktivität

(U)

Protein

(mg)

Spezifische Aktivität

(U/mg)

Ausbeute

(%)

Kulturüberstand 33 600 526 1212,7 0,4 100

Dialyse 7 655 325,7 808,7 0,4 61,9

HIC 1 844 258 22,2 11,6 49

AIEX 46 187,6 0,24 781,7 35,7

HIC 2 4,4 83,2 0,045 1848,9 15,8

SEC 3,6 36,6 0,012 3050 7

Aufreinigungsprotokolle für einige PET-Hydrolasen wurden bereits in den letzten Jahren

veröffentlicht. Die bereits erwähnte 29 kDa Cutinase (BTA Hydrolase 1, TfH) aus T. fusca DSM 43793

konnte durch Gouda et al. 2002 und Kleeberg et al. 2005 aufgereinigt werden. Zunächst erfolgte die

Konzentrierung und Aufreinigung mittels Ultrafiltration mit einer regenerierten

Zellulosetriacetatmembran (Ausschlussgröße 10 kDa). Dabei stieg die spezifische Aktivität 2,4 fach

mit einer Ausbeute von 60,8%. Die Verwendung einer Membran mit der Ausschlussgröße von 20 kDa


führte zu einem starken Verlust bei der Ausbeute. Bei der Verwendung einer Polysulfonmembran

(Ausschlussgröße 10 kDa) lag die Rückgewinnung des Proteins bei 99%, allerdings nur mit 34,5%

Ausbeute und somit konnte nur eine geringe Aufreinigung (Faktor 1,2) erzielt werden. Es wurde

spekuliert, dass das Enzym eine starke Hydrophobizität besitzt und somit an die Membran absorbiert

hat (Gouda et al. 2002).

Tabelle 16: Aufreinigungstabelle der TfH aus T. fusca DSM 43793 (Kleeberg et al. 2005).

Schritt Volumen

(ml)

Aktivität

(U)*

Protein

(mg)


(U/mg)

Ausbeute

(%)

Kulturüberstand 1600 18133 5520 3.3 100

(NH4)2SO4 Fällung 107 6777 70 97 37

KIEX 42 4584 21 218 25

HIC 9,5 2521 7 360 14

*Bestimmt mit Tributyrin als Substrat, 1 Unit entspricht der Aktivität, die 1 µmol Ester in einer Minute spaltet.

Kleeberg et al. (2005) testeten weitere Konzentrierungsschritte. Mit einer 50%

Ammoniumsulfatfällung konnte die gesamte Menge an BTA-Hydrolase ausgefällt werden, allerdings

nur ein Bruchteil davon konnte durch Waschen mit 20 mM Citratpuffer (pH 4,4) oder 20 mM Tris/HCl

Puffer (pH 9,1) wieder resuspendiert werden. Anschließend wurde die Enzymlösung auf eine S-

Sepharose Säule (Uno, Kationenaustauschchromatographie, pH 4) aufgetragen und mit einem

Salzgradienten von 0 bis 1 M NaCl eluiert. Die noch vorhandenen Verunreinigungen wurden mit einer

Hydrophoben Interaktionschromatographie entfernt. Dazu wurde der aktive Enzympool auf eine

Phenylsepharose Säule, equilibriert mit 0,5 M Ammoniumsulfat, aufgetragen und mit einem

Gradienten von 0,5 auf 0 M Ammoniumsulfat und 0 auf 30% Isopropanol eluiert. Mit dieser 3-Schritt

Aufreinigung konnte eine Steigerung der spezifischen Aktivität um den Faktor 110 mit einer Ausbeute

von 14% der Ausgangsaktivität erreicht werden (Tabelle 16, Kleeberg et al. 2005).

Bei Chen S et al. (2008) erfolgte ebenfalls die Aufreinigung einer mit Cutin induzierten p-NPB

Hydrolase aus T. fusca. Nach der Kultivierung wurden die Zellen entfernt und mit 70% (w/v)

Ammoniumsulfat die Proteine aus der Lösung ausgefällt. Das Präzipitat, gewonnen durch

Zentrifugation, wurde in Puffer gelöst und über Nacht bei 4°C dialysiert. Anschließend erfolgte eine

erneute Ausfällung mit 20% (w/v) Ammoniumsulfat. Der Überstand wurde filtriert (0.22 µm) und auf

eine Phenyl Sepharose Säule geladen. Durch die lineare Erniedrigung der

Ammoniumsulfatkonzentration erfolgte die Elution der Proteine mit p-NBP Aktivität. Nach einer

erneuten Dialyse erfolgte der Auftrag auf eine DEAE-Sepharose Säule, die Elution mit einem linearen

Natriumchlorid Gradienten (0 bis 1 M) und eine weitere Dialyse. Die letztliche Enzympräparation

wurde nochmals konzentriert (Tabelle 17, Chen S et al. 2008).


Tabelle 17: Aufreinigungstabelle der Cutin-induzierten p-NPB Hydrolase aus T. fusca (Chen S et al. 2008).

Schritt Protein

(mg)

Aktivität

(U)


(U/mg)

Aufreinigung

(fach)

Ausbeute

(%)

Kulturüberstand 234,9 12294,0 52,3 1,0 100

(NH4)2SO4 Fällung 46,4 5205,2 112,2 2,1 42,3

HIC 4,7 1521,2 320,3 6,1 12,4

AIEX 2,9 1140,9 398,6 7,6 9,3

Die Aufreinigung der Cutinase aus P. mendocina ATCC 55613 erfolgte zuerst mittels einer

fraktionellen Acetonfällung (75%), um die hochviskosen Verfärbungen vom Enzym abzutrennen. Die

Rückgewinnung des Enzyms lag bei 80%, welche auf eine DEAE Säule aufgetragen wurden. Die

Cutinase band bei diesem Reinigungsschritt nicht an die Säulenmatrix, die Verunreinigung hingegen

schon. Als weiterer Aufreinigungsschritt folgte eine weitere Anionenaustauschchromatographie mit

einer QAE-Sephadex Säule. Dabei konnte ein starker Verlust an hydrolytischer Aktivität während des

Reinigungsschritts verzeichnet werden, eventuell durch die Abtrennung einer weiteren enthaltenen

p-NPB Hydrolase (von 50% Ausbeute auf 9% Ausbeute, Tabelle 17). Die Cutinase zeichnete sich

weiterhin durch nicht vorhandene Bindungseigenschaften an SP-Sephadex, CM-Cellulose, Phenyl-

Sepharose und Octyl-Sepharose aus, womit keine HIC oder Kationische Ionenaustausch-

chromatographie durchgeführt werden konnte. Die letzten Verunreinigungen konnten mittels

Größenausschlusschromatographie abgetrennt werden (Sepharose 6B und Sephadex G-100). Durch

diese 5-Schritt Aufreinigung erfolgte eine 200 fache Aufreinigung der Cutinase mit einer Ausbeute

von 3% verbleibender Enzymaktivität (Tabelle 18, Sebastian et al. 1988)

Tabelle 18: Aufreinigungstabelle der Cutinase aus P. mendocina ATCC 55613 (Sebastian et al. 1988).

Schritt Aktivität

(U)

Protein

(mg)


(U/mg)

Ausbeute

(%)

Kulturüberstand 249 450 7360 44 100

Aceton Fällung 182 000 2090 87 78

AIEX 1 121 200 460 262 50

AIEX 2 22 000 11 2650 9

SEC 1 14 500 4 3360 6

SEC 2 4 430 1,1 7030 3

In einem Patent der Firma Genencore (Gray et al. 1995) wurde die Aufreinigung zweier 30 kDa großer

mit Cutin induzierter Hydrolasen beschrieben, produziert durch den Stamm P. mendocina ATCC

53552. Beide Hydrolasen unterschieden sich aufgrund ihrer Fähigkeiten zur Hydrolyse von


verschiedenen p-NP-Estern. Nach der Kultivierung mit 0,3% Apfelcutin für 12-15 Stunden erfolgte die

Filtration des Überstandes (0,22 µm). Verbleibende Enzymaktivitäten auf den Cutinresten wurden

mittels Zentrifugation gewonnen und es ergab sich eine Ausbeute von 90%. Anschließend erfolgten

die Konzentrierung der Lösung mittels Ultrafiltration und eine Dialyse, wobei eine 80%ige Ausbeute

erreicht wurde. Es erfolgte der Auftrag der Lösung auf eine Octyl-Sepharose Säule und eine

Waschung mit einem Harnstoff enthaltenden Puffer. Die Elution erfolgte mit einem linearen

Gradienten mit 50% Isopropanol und zwei aktive Fraktionen mit unterschiedlichen p-NPB/p-NPC

Verhältnissen wurden identifiziert. In Fraktion 32 besaß die Lipase 1 (mit Cutinase Aktivität) ein p-

NPB/p-NPC Verhältnis von 4,6 und in Fraktion 51 die Lipase 2 (mit Cutinase Aktivität) ein p-NPB/p-

NPC Verhältnis von 1,4. Für eine Sequenzierung erfolgte eine weitere Aufreinigung der getrennten

Hydrolasen mittels Umkehrphasen Chromatographie, wobei Lipase 1 bei 35% des Elutionspuffers

eluierte und Lipase 2 bei 39% (Gray et al. 1995).

Die erste Aufreinigung von Polyesterasen aus Pilzen erfolgte 1975 durch die Gruppe von Purdy et al.

(Purdy und Kolattukudy 1975a). Dabei wurde das extrazelluläre Protein einer 12 Tage alten Kultur

von F. solani f. pisi, gewachsen mit Apfelcutin aus Golden Delicious als einzige C-Quelle, mit 40-50%

Ammoniumsulfat ausgefällt. Im Gegensatz dazu erfolgte 1973 bereits eine Kultivierung von F. solani

f. pisi mit Cutin, isoliert aus Red Delicious Äpfeln, als einzige C-Quelle und nach 12 Tagen erfolgte die

Fällung der aktiven Proteine mit 30% Ammoniumsulfat (Purdy und Kolattukudy 1973). Das

unterschiedliche Fällungsverhalten wurde mit den enthaltenen Phenol-Verunreinigungen beim Cutin

aus dem Golden Delicious begründet, welche mit dem aktiven Protein interagierten. Dabei hatten die

extrazellulären Überstände die gleiche Proteinzusammensetzung bei beiden Kultivierungen. Es

erfolgte eine Größenausschlusschromatographie mit Sephadex G-100, wobei die p-NPP Aktivität bei

einem MG Bereich von 50-60 kDa eluierte. In diesem Bereich war auch eine Cutinaseaktivität

vorhanden, die mit der p-NPP Aktivität überlappte. Da die Aktivitäten zu diesem Zeitpunkt nicht

sauber getrennt werden konnten, wurden sie vereinigt und auf eine QAE-Sephadex Säule

aufgetragen. Bei dem pH Wert von 9 banden Fremdproteine und auch das p-NPP aktive Enzym, die

Cutinase konnte damit von den anderen abgetrennt werden. Die Elution der Fremdproteine erfolgte

bei pH 8,3 und der p-NPP Aktivität bei pH 7. Die 2. SEC mit Sephadex G-100 zeigte für den

Cutinasepeak von der QAE-Sephadex ebenfalls nur einen Proteinpeak mit Cutinaseaktivität und eine

Verschiebung des Molekulargewichts um 40-60 kDa zu 22 kDa aufgrund der Abtrennung der

phenolischen Verunreinigungen. Bei der 2. SEC des Proteinpeaks mit p-NPP Aktiviät zeigten sich ein

Hauptpeak mit Aktivität und zwei kleine Peaks ohne Aktivität. Das MG der p-NPP Hydrolase war das

gleiche, wie bereits bei der ersten SEC, was bedeutet, dass die Phenole keinen Einfluss auf die Elution

der Hydrolase hatten. Bei der anschließenden Kontrolle der Reinheit der Proteine konnten bei der


Cutinase zwei sehr eng liegende, aber trennbare Banden identifiziert werden, welche nach dem

Ausschneiden beide Cutinaseaktivität besaßen. Somit handelte es sich bei der Cutinase um zwei sehr

ähnliche Isoenzyme, welche mittels Ionenaustauschchromatographie mit einer SE-Sephadex Säule

und einem linearen NaCl Gradienten getrennt werden konnten (Cutinase I und Cutinase II).

Die p-NPP Hydrolase hatte während der 34fachen Aufreinigung die meiste Aktivität bei dem QAE-

Sephadex Schritt verloren. Lediglich eine 6,5 fache Aufreinigung vom Überstand hatte die

Homogenität der Cutinasen zur Folge, da sie die direkte Antwort auf das Wachstum des Pilzes mit

Cutin als einzige C-Quelle in hoher Konzentration waren. Das Ausgangsmedium enthielt 33 g Cutin

und produziert wurden 48 mg Cutinase I und 20 mg Cutinase II nach der Aufreinigung (Purdy und

Kolattukudy 1975a).

Analog dazu wurden aus F. roseum culmorum mit derselben Kultivierung und Aufreinigung eine

Cutinase (MG 24,3 kDa) und eine p-NPP Hydrolase isoliert. Diese Cutinase ähnelte aufgrund ihrer

Aminosäurezusammensetzung eher der Cutinase I aus F. solani f. pisi (Soliday und Kolattukudy 1976).

Bei der Kultivierung der fünf Pilz- bzw. Bakterienkulturen F. roseum culmorum,

F. roseum sambucinum, Ulocladium consortiale, S. scabies und Helminthosporium sativum war die

spezifische Aktivität von F. roseum sambucinum 50fach höher im extrazellulären Überstand

gegenüber den anderen Kulturen. Die zuvor von Purdy und Kolattukudy 1975 entwickelte

Aufreinigungsmethode wurde erfolgreich auch für diese extrazellulären Enzyme angewandt. Nach

der Ammoniumsulfat-Fällung und der SEC mit Sephadex G-100 konnten auch zwei Peaks identifiziert

werden, wovon der vordere cutinolytische Aktivität besaß und der hintere p-NPP Aktivität. Diese

Beobachtungen wurden auch von Purdy und Kollatukudy 1975 und von Soliday und Kolattukudy 1976

gemacht.

Tabelle 19: Aufreinigungstabelle der Cutinasen und p-NPP Hydrolase aus F. solani f. pisi (Purdy und Kolattukudy 1975a).

Schritt Aktivität (%)

Cutinase

Aktivität (%)

p-NPP Hydrolase


(104 dpm/µg)

Cutinase1


(µmol/mg)

p-NPP Hydrolase2

Kulturüberstand 100 100 1.2 11

(NH4)2SO4 Fällung 67 40 2.0 12

SEC 1 61 26 4,1 17

AIEX 1 36 5 7,6 123

SEC 2 5 340

AIEX 2 30(I)

13(II)

7,8

1 Bestimmt mit Cutin als Substrat.

2 Bestimmt mit p-NPP als Substrat.


Die Mikroorganismen produzierten alle nur eine Cutinase mit einem Molekulargewicht von 24,3-

26,3 kDa im Vergleich zu F. solani f. pisi. Für die fünf Cutinasen ergab sich eine 6-16 fache

Aufreinigung mit 16-28% Ausbeute (Tabelle 20, Lin und Kolattukudy 1980a).

Tabelle 20: Aufreinigungstabelle der extrazellulären Cutinasen (Lin und Kolattukudy 1980a).

F. roseum sambucinum U. consortiale H. sativum S. scabies

Schritt Protein

(mg)

Spez. Aktivität

(103dpm/µg)

Protein

(mg)

Spez. Aktivität

(103dpm/µg)

Protein

(mg)

Spez. Aktivität

(103dpm/µg)

Protein

(mg)

Spez. Aktivität

(103dpm/µg)

Kulturüberstand 660 5 410 0,11 210 0,11 310 0,1

(NH4)2SO4 Fällung 449 6 148 0,18 69 0,13 102 0,13

SEC 1 233 7 77 0,3 46 0,4 60 0,35

AIEX 1 25 28 10 1,7 4 1 6 1,2

AIEX 2 20 31 7 1,8 3 1,2 4 1,2

Die spezifische Aktivität wurde mit Cutin als Substrat bestimmt.

Fernando et al. (1984) kultivierte einen F. solani pisi Stamm im Mineralmedium mit Suberin als

einzige C-Quelle. Im Mediumüberstand konnte nur eine geringe Menge an p-NPB Aktivität detektiert

werden. Daraufhin wurde die Myzelmatte mit 0,4% Triton X-100 in 0,2 M Natriumphosphatpuffer

gewaschen und es konnte eine 13 fach höhere Aktivität nachgewiesen werden. Das bedeutet, dass

nach der Kultivierung 93% der Gesamtaktivität am Myzel oder am Suberin gebunden vorlag. Beim

Auftrag auf die QAE-Sepharose wurden die farblichen Verunreinigungen gebunden, das aktive Enzym

jedoch eluierte direkt wieder. Bei pH 4,8 band das aktive Enzym anschließend an die SP-Sephadex C-

25 Säule, die vorhandenen Verunreinigungen wanderten durch die Säule durch. Die Elution mit

einem NaCl Gradienten ergab einen Elutionspeak, der nach Auftrag auf eine SP-Sephadex Säule 2

getrennte Peaks mit p-NPB und Cutinaseaktivität hervorbrachte. Dabei handelte es sich um 2

Isoenzyme mit einem Molekulargewicht von 23 kDa. Der Vergleich der Aminosäurezusammen-

setzung der Suberin- und Cutin-induzierten Cutinasen (Purdy und Kolattukudy 1975a) zeigte, dass

diese Isoenzyme sich lediglich aufgrund eines nicht detektierten Methionins unterschieden. Somit

besteht die Möglichkeit, dass die Cutin- und Suberin-induzierten Isoenzyme die gleichen sind

(Fernando et al. 1984).

Die PET-Hydrolase aus P. citrinium wurde aufgrund ihrer Aktivität gegenüber 3PET (BETEB)

aufgereinigt. Zunächst erfolgte eine fraktionelle Ultrafiltration mit den Ausschlussgrößen von 50 und

5 kDa. Die PET-Hydrolase wurde 67,9 fach bis zur elektrophoretischen Reinheit aufgereinigt, die

Ausbeute betrug 6% nach AIEX und SEC. Die spezifische Aktivität betrug am Ende 14,8 nkat/mg und

das Molekulargewicht wurde auf 14,1 kDa bestimmt. Somit ist diese PET-Hydrolase die kleinste

bekannte PET abbauende Hydrolase (Tabelle 21, Liebminger et al. 2007).


Tabelle 21: Aufreinigungstabelle der PET-Hydrolase aus P. citrinum (Liebminger et al. 2007).

Schritt Volumen

(ml)

Aktivität

(nkat)

Protein

(mg)


(nkat/mg)

Ausbeute

(%)

Kulturüberstand 200,0 120,6 552,0 0,2 100

AIEX 40,0 22,4 19,8 1,1 18,6

Entsalzung 30,0 18,0 12,7 1,4 15,0

AIEX 9,0 9,1 2,2 4,1 7,5

SEC 2,0 7,3 0,49 14,8 6,0

Die Rohenzymlösungen mit den hydrolysierenden Enzymen von F. oxysporum LCH 1 und

F. solani f. sp. pisi wurden mittels Zentrifugation und Ausfällung gewonnen und es erfolgte mit ihnen

die Untersuchung der Hydrolyse von PET-Fasern (Nimchua et al. 2007).

Die für die Aufreinigung der PET-Hydrolasen eingesetzten Methoden variierten bei der

Aufkonzentrierung des extrazellulären Überstandes, es kamen Ultrafiltration, verschiedene Fällungen

und die Gefriertrocknung zum Einsatz. Diese Schritte waren meist mit einem höheren Verlust an

aktivem Enzym verbunden, allerdings von Nöten für die weitere Aufreinigung, da das extrazelluläre

Enzym in einer zu hohen Verdünnung vorlag (Purdy und Kolattukudy 1973, Soliday und Kolattukudy

1976, Sebastian et al. 1988, Gouda et al. 2002, Kleeberg et al. 2005). Für die TfCa wurden auch

verschiedene Aufkonzentrierungsmethoden getestet mit dem Ergebnis, dass die

Aufreinigungsverluste mit der Gefriertrocknung am geringsten waren. Bei der anschließenden

chromatographischen Aufreinigung kamen meistens eine IEX oder SEC zum Einsatz, seltener eine HIC

aufgrund der stark hydrophoben Eigenschaften der PET-Hydrolasen und der daraus resultierenden

schlechten Rückgewinnung des Enzyms vom Säulenmaterial. Die Aufreinigung der hydrolytischen

Enzyme konnte mit einer 3 bis 5 Schritt Aufreinigungsmethode bis zur elektrophoretischen Reinheit

bewerkstelligt werden. Dabei lagen die Ausbeuten bei 3-30%, im Vergleich dazu lag die Ausbeute der

TfCa bei 7% (Billig et al. 2010).

Eine interessante Besonderheit konnte bei der Aufreinigung der Cutin-induzierten Hydrolasen aus

den Pilzen F. solani f. pisi, F. roseum culmorum, F. roseum sambucinum, U. consortiale und

H. sativum, aber auch beim Actinomyceten S. scabies identifiziert werden. Parallel zur Cutinase

produzierten diese Stämme mit Cutin als einzige C-Quelle ebenfalls eine Esterase, welche p-NPB und

p-NPP spalten konnte (Purdy und Kolattukudy 1975a, Lin und Kolattukudy 1980a). Ebenfalls besaß

diese p-NPP Esterase ein MG von 52 kDa (Purdy und Kolattukudy 1975a). Der Pilz F. solani f. pisi

unterschied sich zusätzlich von den anderen Kulturen, indem er zwei Isoenzyme während des

Wachstums mit Cutin bildete (Purdy und Kolattukudy 1975a). Bei allen weiteren Aufreinigungen von

PET-Hydrolasen wurde auf die Produktion einer zusätzlichen p-NPB oder p-NPP Esterase nicht

geachtet. Bei der Aufreinigung der Cutinase aus P. mendocina konnte beim ersten


Anionenaustauschschritt ein starker Verlust der p-NPB Aktivität verzeichnet werden, was mit einer

möglichen Abtrennung einer weiteren Esterase begründet wurde (Sebastian et al. 1988). Aufgrund

der bisherigen Ergebnisse scheint diese Annahme als sehr wahrscheinlich. Die Aufreinigungen der

TfH aus T. fusca DSM 43793 und der PET-Hydrolase aus P. citrinum erfolgte mit BTA bzw. 3PET

induzierten Kulturen und deshalb könnte die Produktion einer mitinduzierten Esterase nicht

stattgefunden haben oder in zu geringen Mengen für einen direkten Nachweis erfolgt sein (Kleeberg

et al. 2005, Liebminger et al. 2007). Fernando et al. (1984) kultivierte den Pilz F. solani f. pisi mit

Suberin als Induktor. Während der anschließenden Aufreinigung der Suberin-hydrolysierenden

Enzyme wurde keine zusätzliche Esterase detektiert bzw. nicht nach ihr gesucht.

Es wäre interessant, die beiden Esterasen TfCa und die eukaryotische Esterase in ihren Sequenzen

und katalytischen Zentren zu vergleichen und herauszufinden, warum die eukaryotische Esterase

unter Zusatz von Cutin produziert wird und ob die Produktion auch unter Zusatz eines synthetischen

Polyesters nachweisbar wäre. Weiterhin ob und wie sich die beiden Esterasen hinsichtlich ihrer PET-

Hydrolyseaktivität unterscheiden würden.

Eine weitere Besonderheit war ebenfalls die beobachtete Hydrophobie der PET-Hydrolasen

begründet durch ihre Affinität zu den abzubauenden hydrophoben Substraten. Diese Eigenschaft

wurde bei der Aufreinigung der TfCa ausgenutzt.

3.2.1.2 Aufreinigung der rekombinanten PET-Hydrolasen

Die TfCa und die Cutinasen TfCut1 und TfCut2 aus T. fusca KW3 wurden bereits erfolgreich kloniert

und mit Hilfe verschiedener E. coli Stämme exprimiert (Oeser et al. 2010, Chen S et al. 2008). Die

Hydrolaseproduktion erfolgte bei einer optimalen Kultivierungstemperatur von 18°C im 5 L

Fermenter. Bei der niedrigeren Temperatur erfolgte eine geringere Bildung an Einschlusskörpern der

produzierten Enzyme und somit stand mehr aktives Protein nach der Kultivierung für die

Aufreinigung zur Verfügung. Mit den optimierten Bedingungen erfolgte die rekombinante Produktion

der TfCa mit einer 4500fach höheren Aktivität gegenüber dem Wildtyp und die spezifische Aktivität

(U/mg) stieg um mehr als das 30fache (Oeser et al. 2010). Die rekombinante TfCa, gewonnen aus

dem löslichen Zellinhalt, wurde mittels Nickel-Affinitätschromatographie (Abbildung 40) und

Größenausschlusschromatographie (Abbildung 41) aufgereinigt. Es erfolgte eine Aufreinigung um das

12fache (spezifische Aktivität 35 U/mg) (Tabelle 22, Abbildung 44A).

Unter den gleichen Kultivierungsbedingungen wurden ebenfalls die beiden Cutinasen TfCut1 und

TfCut2 aus T. fusca KW3 in E. coli produziert und mittels Affinitätschromatographie (Abbildung 42)

und Größenausschlusschromatographie (Abbildung 43) aufgereinigt. Da es sich bei den beiden

Cutinasen um Isoenzyme mit ähnlichen Eigenschaften handelte, sind hier nur die Aufreinigungdaten


für die Cutinase II exemplarisch dargestellt. Nach der 2-Schritt Aufreinigung der TfCut2 konnte eine

9fach höhere Reinheit nachgewiesen werden (spezifische Aktivität TfCut2 26 U/mg) (Tabelle 23,

Abbildung 44B).

Abbildung 40: Elutionsprofil der TfCa während des ersten Aufreinigungsschritts (HisTrap, Säulenvolumen 10 ml, Puffer A: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl; pH 8,0, Puffer B: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250mM Imidazol, pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-NPB Aktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt).

Abbildung 41: Elutionsprofil der TfCa während des zweiten Aufreinigungsschritts (Sephadex 200 prep grade, Säulenvolumen 320 ml, Puffer: 0,15 M NaCl, 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-NPB Aktivität (schwarz).


Abbildung 42: Elutionsprofil der TfCut2 während des ersten Aufreinigungsschritts (HisTrap, Säulenvolumen 10 ml, Puffer A: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl; pH 8,0, Puffer B: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-NPB Aktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt).

Abbildung 43: Elutionsprofil der TfCut2 während des zweiten Aufreinigungsschritts (Sephadex 200 prep grade, Säulenvolumen 320 ml, Puffer: 0,15 M NaCl, 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-NPB Aktivität (schwarz).


Abbildung 44: SDS-PAGE der Aufreinigung der rekombinant produzierten TfCa in E. coli (A) und der rekombinant produzierten TfCut2 in E. coli (B). Spur M: Low Molecular Weight Längenstandard; Spur 1, 4: Rohenzymlösung nach Zellaufschluss; Spur 2, 5: Enzymlösung nach Ni-Affinitätschromatographie; Spur 3, 6: Enzymlösung nach SEC.

Tabelle 22: Aufreinigungstabelle der rekombinanten TfCa.

Schritt Volumen

(ml)

Aktivität

(U)

Protein

(mg)


(U/mg)

Ausbeute

(%)

Aufreinigung

(fach)

Zellfreier

Extrakt

196 4606 1535 3 100 1

HisTrap 44 2077 112 19 45 6

SEC 75 1538 44 35 33 12

Tabelle 23: Aufreinigungstabelle der rekombinanten TfCut2.

Schritt Volumen

(ml)

Aktivität

(U)

Protein

(mg)


(U/mg)

Ausbeute

(%)

Aufreinigung

(fach)

Zellfreier

Extrakt

195 2477 1482 2 100 1

HisTrap 27 1183 54 22 26 7

SEC 50 895 35 26 19 9

Die TfH wurde durch Dresler et al. 2006 auch bereits rekombinant in E. coli TG1 mit dem Plasmid

pCYTEXP1-OmpA-bta1-His6 produziert, sekretiert und aufgereinigt. Im Vergleich mit der Wildtyp

Produktion konnte rekombinant extrazellulär eine 1,5-2fach höhere volumetrische Aktivität in den

Batch Kulturen und eine 20fach höhere in den Fed-Batch Kulturen erzielt werden (unter Glucose

Limitation). Die volumetrische Aktivität intrazellulär konnte sogar um das 50fache gesteigert werden

und somit stieg die Gesamtproduktion um mehr als das 100fache gegenüber dem Wildtyp. Aufgrund

des angehängten His6-Tags erfolgte die einfache Aufreinigung des periplasmatischen und


zytoplasmatischen (Einschlusskörper) Proteins in zwei Schritten. 57% Ausbeute konnte erzielt

werden und eine 30fache Aufreinigung mit einer spezifischen Aktivität von 445 U/mg wurde erreicht

(Tabelle 24). Zum Vergleich beim Wildtyp konnte nur 14% Ausbeute nachgewiesen werden (Dresler

et al. 2006).

Tabelle 24: Aufreinigungstabelle der rekombinanten periplasmatischen (pp-rTfH) und zytoplasmatischen (zp-rTfH) TfH (Dresler et al. 2006).

Schritt Aktivität

(103 U/L)

Protein

(mg/L)


(U/mg)

Ausbeute

(%)

Aufreinigung

(fach)

pp-rTfH Extrakt 8,57 587 15 100 1

HisTrap 6,53 15 436 71 29

SEC 4,89 11 445 57 30

zp-rTfH Extrakt 26,52 2570 10,3 100 1

Hitzebehandlung 22,52 1470 15,3 85 1,5

Ultraschall- und

Hitzebehandlung

28,89 1410 20,5 109* 2

* Rohextrakt nach Ultraschall und Zentrifugation.

In weiterführenden Studien erfolgte nach einer Codon-Optimierung die erfolgreiche rekombinante

Produktion der TfH mit B. megaterium WH323. Bei einer pH-kontrollierten Batchkultivierung konnte

eine weitere Steigerung auf 16,1 mg/L rTfH erzielt werden. Nach der Induktion durch Xylose erfolgte

ein starker Anstieg der rTfH Produktion für 4 Stunden. Beim Vergleich der produzierten Mengen an

rTfH mittels B. megaterium und E. coli (Dresler et al. 2006) konnte für die Batchkultivierung mit LB

Medium und Hochzelldichten-Kultivierung mit synthetischem Medium ähnliche Ergebnisse erzielt

werden (Tabelle 25). Beide zeigten eine 50-100fach höhere Produktion gegenüber dem Wildtyp

(Yang et al. 2007).

Tabelle 25: Expression der rekombinanten TfH in E. coli und B. megaterium (Yang et al. 2007).

Kultivierung Medium

B. megaterium WH323

U/g U/L

E. coli TG 1

U/g U/L

Batch LB 2651 7953 4000 8000

Batch Definiert 116 886 770 7300

Hochzelldichten-

Kultivierung

Definiert 187 6098 76/227* 5500/12000*

* abhängig von der Induktionsphase (Temperaturänderung)


Die Aufreinigung der rTfH erfolgte ebenfalls mittels Ni-Affinitätschromatographie. Die Protokolle

einiger Proteinaufreinigungen verschiedener Kultivierungsansätze sind in der nachfolgenden Tabelle

zusammengefasst (Yang et al. 2007).

Tabelle 26: Übersicht zur Affinitätsaufreinigung der His6-Tag rTfH produziert durch B. megaterium WH323-pYYBm9 gewachsen in einer LB-Batch Kultivierung und Hochzelldichten-Kultivierung (HZDK) mit A5 Medium. I:ohne

Vorhbehandlung; II: 50°C für 10 min; III: 18 Stunden Dialyse bei 4°C (Yang et al. 2007).

Kultivierung Aktivität

(U)

Protein

(µg)


(U/mg)

Ausbeute

(%)

Aufreinigung

(fach)

LB-I Extrakt

HisTrap

37

20

238

41

157

494

100

54

1,0

3,2

LB-II Extrakt

HisTrap

35

17

213

37

162

471

100

50

1,0

2,9

LB-III Extrakt

HisTrap

23

13

147

42

159

310

100

55

1,0

1,9

HZDK-I Extrakt

HisTrap

49

25

203

83

240

307

100

52

1,0

1,3

HZDK-II Extrakt

HisTrap

47

23

221

63

213

367

100

49

1,0

1,7

HZDK-III Extrakt

HisTrap

29

10

161

45

178

215

100

34

1,0

1,2

Die gleichen Cutinasen wurden 2008 von Chen S et al. 2008 als Cutinase 1 und Cutinase 2 aus T. fusca

WSH03-11 nach vorherigen Vermehrungs- und Modifikationsschritten in den pET20b(+) Vektor

kloniert und anschließend in E. coli Rossetta (DE3) pLysS einzeln transformiert (Chen J et al. 2008).

Das Wachstum der transformierten Klone erfolgte unter Zusatz von Ampicillin und Chloramphenicol

und bei einer Zelldichte von 1,5 (OD600) erfolgte die Induktion mit IPTG. Nach 16 Stunden Expression

erfolgte die Zellernte, Konzentrierung des Kulturüberstand, Dialyse und Ni-Affinitätschromatographie

(Chen S et al. 2008).

Die p-NPB Aktivität im Kulturüberstand der transformierten E. coli Zellen mit dem Plasmid pET20b-

Cutinase 2 lag bei 180 U/ml, und damit um das 782fache höher als bei den untransformierten Zellen

und um das 9,5fache höher als bei den Cutin-induzierten Zellen von T. fusca. Die p-NPB Aktivität im

Kulturüberstand der transformierten E. coli Zellen mit dem pET20b-Cutinase 1 Vektor lag bei

69 U/ml, und damit um das 300fache höher als bei den untransformierten Zellen und um das

3,6fache höher als in den Cutin-induzierten T. fusca Zellen. Die rekombinanten Enzyme wurden bis

zur homogenen Reinheit mit einem Schritt mittels Ni-Affinitätschromatographie aufgereinigt und


besaßen eine spezifische Aktivität von 458 U/mg (Cutinase 2) und 223 U/mg (Cutinase 1) (Chen S

et al. 2008, Chen J et al. 2008).

Sinsereekul et al. (2010) konstruierten einen transkonjuganten S. rimosus R7 mit dem Vektor pIJ-BTA,

der das Gen für eine Ecoflex® Filme-abbauende Hydrolase enthielt. Das Gen wurde aus dem Isolat

Thermobifida sp. BCC23166 gewonnen, isoliert aus einer Probe von einer Deponie. Es erfolgte die

Ligation des Gens in den pIJ8600 Vektor und der Transfer in S. rimosus R7 mittels intergenetischer

Konjugation. Dieses entwickelte Expressionssystem zeichnete sich durch die Produktion des

gesamten nativen Proteins aus dem unmodifizierten Gen ohne Codon Optimierung und Modifikation

durch Fusionsproteine aus. Allerdings war zum damaligen Zeitpunkt die anfängliche Ausbeute aus

der Expression geringer (0,058 mg/L) verglichen mit den Expressionssystemen in E. coli oder

B. megaterium. Das produzierte rekombinante Enzym (mit His6Tag) wurde anschließend bis zu einer

95% Reinheit mittels einer Ein-Schritt Aufreinigung durch eine Ni-Affinitätschromatographie

aufgereinigt. Dabei betrug das Kulturvolumen am Beginn 500 ml und die Ausbeute nach der

Reinigung 82,5% (Sinsereekul et al. 2010).

In neuesten Studien wurde eine thermoaktive Hydrolase Est119 aus Thermobifida alba AHK119

rekombinant ebenfalls in E. coli produziert. Dazu wurde das isolierte Gen der Hydrolase ohne die

Signalsequenz in den Vektor pQE80L kloniert, mit den Vektor pQE80L-est119 als Produkt. Das

rekombinante Protein mit einem N-terminalen His6Tag konnte erfolgreich mit dem E. coli Rosetta-

gami B (DE3) nach der Zugabe von IPTG produziert werden. Die rekombinante 29 kDa Cutinase

konnte um das 2,3fache mittels einer Ein-Schritt Aufreinigung mit der Ni-Affinitätschromatographie

Säule aus dem zellfreien E. coli Extrakt gewonnen werden (Spezifische Aktivität 1.37 U/mg, Hu et al.

2010).

Die Cutinasen aus P. mendocina ATCC 53552 wurden nach der Identifikation der Gene einzeln in das

Plasmid pSNtacII kloniert und rekombinant in E. coli JM101 exprimiert. 74% der Aktivität der

Hydrolase 1 lagen nach der Kultivierung extrazellulär vor, 17% Aktivität in den Zellen, 2% im

periplasmatischen Raum und 7% an der Cytoplasmamembran. Die Aufreinigung der Hydrolasen

erfolgte mittels Octyl-Sepharose analog zur bereits erläuterten Aufreinigung der Wildtyp Enzyme. Die

Cutinase 1 zeigte eine p-NPB Aktivität von 3750 U/mg Protein, bestand aus 259 Aminosäuren ohne

Signalsequenz und zeigte ein p-NPB/p-NPC Verhältnis von 7 (Cutinase 2 besaß ein Verhältnis von 1)

(Gray et al. 1995).

Für die präparative Produktion der F. solani Cutinase erfolgte die Kultivierung von E. coli WK6 Zellen,

welche das Plasmid pMa/c5-CUF enthielten. Bei einer optischen Dichte von 410 erfolgte die

Induktion mit IPTG über 6 bis 12 Stunden (Carvalho et al. 1999). Aufschlussmethoden der Cutinase

waren kombinierte Methoden wie z.B. osmotischer Schock und Präzipitation der Verunreinigungen

mit verdünnter Essigsäure. Anschließend erfolgte die Aufreinigung mittels Kationenaustauscher, wie


SP-Sephadex oder in zwei Anionenaustauschschritten, z.B. mit DEAE-Cellulose und MonoQ- oder Q-

Sepharose HP. Die endgültige Ausbeute der Aufreinigung lag bei 51% und der Aufreinigungsfaktor bei

10. Die Aufreinigung der Cutinase, produziert durch Hefezellen, verlief ähnlich wie mit den

Bakterienzellen, allerdings folgte am Schluss eine Affinitätschromatographie mit einer Con-A

Sepharose-4B Säule zur Entfernung der glykosylierten Fraktionen (Carvalho et al. 1999). Neuere

Aufreinigungsmethoden sind die Umkehrmyzellen Extraktion und das wässrige Zwei-Phasen System

als Alternative für die Säurepräzipitation, Filtration, Zentrifugation oder Dialyse (Carvalho et al.

1999). Mit der Umkehrmyzellen Extraktion konnten Ausbeuten von 5-50% erreicht werden mit

Aufreinigungsfaktoren von 1,2 bis 10,2. Bei der direkten Extraktion der Cutinase aus dem Zellextrakt

mit Zellbruchstücken der E. coli Zellen lag die Ausbeute bei optimalen Bedingungen bei 54,4%

(Carvalho et al. 1999). Beim wässrigen Zwei-Phasen System lagen die Ausbeuten immer sehr hoch,

meist über 90%. Bei einer Ein-Schritt Aufreinigung der Cutinase aus E. coli Zelltrümmern lagen die

Ausbeute bei 91% und der Aufreinigungsfaktor bei 4,1, bei einem Zeitaufwand von nur 20 min

(Carvalho et al. 1999). Die Cutinase aus F. solani pisi wurde in B. subtilis Zellen mit dem Vektor

pBSMuL3 während des Wachstums im Medium mit Kanamycin produziert. Die Proteine des

Kulturüberstands wurden mit Ammoniumsulfat ausgefällt, zentrifugiert, resuspendiert und dialysiert.

Nach einer erneuten Präzipitation der verunreinigenden Proteine mit Ammoniumsulfat erfolgte die

Filtration der Lösung und der Auftrag auf eine Phenyl HP-Sepharose Fast Flow Säule. Die Elution der

Cutinase erfolgte mit einem linearen Gradienten von 20% auf 0% Ammoniumsulfat im Elutionspuffer.

Die Fraktionen mit p-NPB Aktivität wurden anschließend auf eine CM-Sepharose Säule aufgetragen

und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1 M Natriumchlorid eluiert (Chen S et al. 2008).

Die Cutinase aus T. insolens wurde in A. niger mit dem Vektor pA2L79 rekombinant produziert. Nach

der Produktion erfolgte die Gewinnung der intrazellulären Cutinase mittels Zentrifugation und

Ultrafiltration. Mit dem Überstand erfolgte eine Ammoniumsulfatfällung. Das Präzipitat mit der

Cutinase wurde mittels Zentrifugation gewonnen, in Wasser gelöst und mit Essigsäure auf pH 6

eingestellt. Zur Entfernung der enthaltenen Proteasen passierte die Lösung eine Bacitracin-Agarose

Säule und die eluierten aktiven Fraktionen wurden auf eine Kationenaustausch SP-Sepharose HP

Säule aufgetragen. Die Cutinase wurde mit einem linearen Salzgradienten eluiert (Sandal et al. 1996).

Bisher wurden verschiedenste bekannte Systeme für die rekombinante Expression von Hydrolasen

und deren Aufreinigung zusammengefasst. Bei der Wahl des jeweiligen Expressionssystems besteht

keine Möglichkeit zur Diskussion, da die Auswahl nach dem „try and error“ Verfahren abläuft und

jedes der Systeme seine spezifischen Vor- und Nachteile aufweist. Eines ist allerdings für alle

rekombinanten Produktionen zu empfehlen, die Verwendung eines His6Tags für eine deutlich

einfachere und spezifischere Aufreinigung des rekombinanten Proteins, wie es auch für die beiden in

diesem Abschnitt beschriebenen Hydrolasen aus T. fusca KW3, produziert mittels E. coli, erfolgte.


Dadurch sind Ausbeuten von über 50% keine Seltenheit. In dieser Hinsicht sollte die Aufreinigung der

beiden rekombinanten Hydrolasen aus T. fusca KW3 noch weiter optimiert werden, damit eine

Steigerung der Ausbeute erfolgen kann.

3.2.2 pI der TfCa

Der bestimmte pI der TfCa lag bei 4,8 (theoretischer Wert 4,79).

Abbildung 45: PhastGel der Bestimmung des isoelektrischen Punktes der TfCa. (linkes Gel PhastGel IEF 3-9, rechtes Gel PhastGel IEF 4-6,5) Spur 1: 26,7 ng TfCa; Spur 2: 66,7 ng TfCa; Spur 3: 133 ng TfCa; Spur 4: 26,7 ng TfCa; Spur 5: 53,4 ng TfCa; Spur 6: Kalibrierungskit für die pI Bestimmung, Breiter pI Bereich (pH 3-10, GE Healthcare).

3.2.3 Molare Masse der TfCa

Die Molekulargewichtsbestimmung erfolgte mit einer SDS-PAGE mit der partiell aufgereinigten

Enzymlösung und des Roti®-Mark SDS Proteinstandards (Fa. Carl Roth GmbH).

St 1 2 3

9.30

8.65

8.458.15

7.35

6.85

6.55

5.85

5.20

4.55

St 4 5

6.85

6.55

5.85

5.20

4.55


Abbildung 46: Laufstrecken der Proteine des Roti®-Mark SDS Proteinstandards (Fa. Carl Roth GmbH) aufgetragen gegen den

Logarithmus ihres Molekulargewichtes.

Nach erfolgter elektrophoretischer Auftrennung wurden die Laufstrecken der Proteine des Standards

bestimmt und gegen den Logarithmus ihres Molekulargewichts aufgetragen (Abbildung 46). Für die

untersuchte TfCa ergab sich daraus ein exaktes Molekulargewicht von 52,4 kDa, was mit dem

theoretischen MG von 52,94 kDa gut übereinstimmt.

3.2.4 Temperatur- und pH-Stabilität der TfCa

Für die Bestimmung der Stabilität der TfCa bei verschiedenen pH-Werten wurde die Esterase in

100 mM Puffern mit pH-Werten von 3 bis 11 für 7 Tage inkubiert und die Esteraseaktivitäten zu

verschiedenen Zeiten mit p-NPB als Substrat spektrophotometrisch bestimmt. Ein Citrat-Phosphat-

Puffer wurde für pH 3 bis 7 verwendet, Phosphatpuffer für pH 8 und Glycin-NaOH Puffer für pH 9 bis

11. Die Inkubationen erfolgten bei Raumtemperatur.

Bei der Inkubation der TfCa bei verschiedenen pH-Werten wurde festgestellt, dass die Esterase hohe

Stabilität im alkalischen Bereich auch über einen längeren Zeitraum besitzt (Abbildung 47). Nach 7

Tagen Inkubation konnte bei pH 9 und 10 noch eine relative Aktivität von 85% nachgewiesen werden.

Aber auch bei pH 5 und 11 zeigte die TfCa nach 7 Tagen Inkubation noch eine relative Aktivität von

22% und 16%. Das bedeutet, dass die Esterase bei kürzeren Inkubationen, wie zum Beispiel nach 24

Stunden (Abbildung 48), im pH-Bereich von 5 bis 11 noch eine relative Aktivität von 40% bis 100%

besitzt und somit einen breiten Einsatzbereich vorweisen kann.

y = -0,089x + 2,037

R² = 0,993

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2 4 6 8 10

lg M

W

Laufstrecke (cm)


Abbildung 47: Esteraseaktivitäten der TfCa über einen Zeitraum von 7 Tagen bei Inkubation in unterschiedlichen pH-

Werten von 4 bis 11 bestimmt mit p-NPB als Substrat.

Abbildung 48: Esteraseaktivitäten der TfCa nach 24 Stunden Inkubation in verschiedenen pH-Werten von 3 bis 11 bestimmt

mit p-NPB als Substrat.

Für die Stabilitätsuntersuchung der TfCa bei verschiedenen Temperaturen wurde die Esterase in

100 mM Phosphatpuffer pH 8 bei den Temperaturen 40°C, 50°C und 55°C für 7 Tage inkubiert. Die

Esteraseaktivitäten wurden mit p-NPB als Substrat spektrophotometrisch bestimmt.

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7

Rela

tive A

ktiv

ität (%

)

Inkubationszeit (d)

pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10 pH 11

0

20

40

60

80

100

3 4 5 6 7 8 9 10 11

Rela

tive A

ktiv

ität (%

)

pH


Abbildung 49: Esteraseaktivitäten der TfCa über einen Zeitraum von 7 Tagen bei Inkubation bei 40°C, 50°C und 55°C bestimmt mit p-NPB als Substrat (Billig et al. 2010).

Abbildung 50: Esteraseaktivitäten der TfCa nach 24 Stunden Inkubation bei 30°C, 40°C, 50°C und 55°C bestimmt mit p-NPB als Substrat.

Die TfCa besitzt ebenfalls eine hohe Stabilität bei Temperaturen von 40 bis 50°C, (Abbildung 49).

Nach 7 Tagen Inkubation bei diesen Temperaturen war noch eine relative Aktivität zwischen 93 und

100% nachweisbar. Bei 40°C erfolgte über diesen Zeitraum keine Verminderung der Aktivität, die

Aktivität blieb über den gesamten Zeitraum konstant. Bei 55°C hingegen konnte nach 24 Stunden

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7

Rela

tive A

ktiv

ität (%

)

Inkubationszeit (d)

40°C 50°C 55°C

0

20

40

60

80

100

30 35 40 45 50 55

Rela

tive A

ktiv

ität (%

)

Temperatur (°C)


Inkubation lediglich 1% Restaktivität detektiert werden (Abbildung 50). Bei höheren Temperaturen

erfolgte die Inaktivierung der Esterase in einem noch kürzeren Zeitraum.

3.2.5 Wirkung von Inhibitoren auf die TfCa

Um eine Einordnung der TfCa in der Enzymgruppe der Hydrolasen durchzuführen, wurde die

Stabilität des Enzyms gegenüber verschiedener spezifischer und unspezifischer Inhibitoren

untersucht. Die Inhibitoren, welche eingesetzt wurden, waren EDTA, PMSF, TPCK und DTT. Sie

wurden nach Anweisung in Puffer, Isopropanol oder Ethanol gelöst. Die eingesetzten

Konzentrationen der Inhibitoren lagen bei 0,1 mM, 1 mM und 10 mM. Für die Untersuchung wurde

die TfCa in 25 mM Phosphatpuffer pH 8 mit dem Inhibitor für 15 min bei 30°C inkubiert und die

verbleibende Esteraseaktivität mit p-NPB als Substrat spektrophotometrisch gemessen (Tabelle 27).

Die Inhibitoren EDTA und DTT zeigten mit verschiedenen Konzentrationen keine Hemmung der

Esteraseaktivität. Hingegen zeigte sich mit den spezifischen Esterasehemmern PMSF und TPCK eine

deutliche Erniedrigung der Aktivität ab einer Konzentration des Inhibitors von 1 mM. Mit 10 mM

Inhibitor war die verbleibende Esteraseaktivität mit PMSF 35% und mit TPCK konnte keine

verbleibende Aktivität bestimmt werden.

Tabelle 27: Übersicht über die verbleibenden Esteraseaktivitäten nach der Inkubation der TfCa mit verschiedenen Inhibitoren.

Inhibitor Konzentration (mM) Aktivität (%)

Ethylendiamintetraacetat (EDTA) 1 100

10 100

Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) 0,1 100

1 69

10 35

Tosyl-L-Phenylalanin-Chloromethylketon (TPCK) 0,1 100

1 19

10 0

Dithiothreitol (DTT) 0,1 100

1 100

10 100


3.2.6 Kinetik der Hydrolyse von verschiedenen Esterasesubstraten durch die TfCa

Für die Bestimmung der Substratspezifität der TfCa wurden verschiedene Modellsubstrate und die

zyklischen PET-Trimere (CTR) eingesetzt, um die kinetischen Konstanten für den Umsatz der

Substrate zu bestimmen. Bei den Modelsubstraten handelte es sich um die p-Nitrophenylester der

Essigsäure, der Buttersäure, der Caprylsäure und der Palmitinsäure. Dafür wurde die TfCa in Puffer

mit den Substraten in unterschiedlichen Konzentrationen gegeben und die Umsatzgeschwindigkeit

anhand des entstandenen Produktes, p-Nitrophenol, bestimmt. Mit den Konzentrationen und den

Umsatzgeschwindigkeiten konnten dann die kinetischen Konstanten Km und Vmax für die einzelnen

Substrate per Lineweaver-Burk Darstellung berechnet werden.

Diese Untersuchung wurde abschließend auch für die zyklischen Trimere des PET durchgeführt. Dazu

wurde eine Stammlösung der Trimere in 1,4-Dioxan hergestellt. Für die Bestimmung der kinetischen

Parameter wurden die zyklischen Trimere in verschiedenen Konzentrationen zu einer Pufferlösung

mit der TfCa gegeben und bei 50°C für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurden die Proben

zentrifugiert und per Umkehrphasen-HPLC mit 0,1% TFA (Puffer A) und Acetonitril (Puffer B)

analysiert. Die entstandenen Abbauprodukte wurden bei 241 nm mit dem UV Detektor detektiert.

Die kinetischen Konstanten Km und Vmax für die CTR wurden per Lineweaver-Burk Darstellung

berechnet (Abbildung 51).

Tabelle 28: Kinetische Parameter der Hydrolyse von p-NP-Estern und PET-Trimeren durch die TfCa aus T. fusca KW3.

Substrat Acyl-Rest Km (mM) Vmax (µmol/min/mg)

p-Nitrophenylester p-Nitrophenylacetat 2:0 0,27 ± 4% 46,1 ± 1%

p-Nitrophenylbutyrat 4:0 0,16 ± 4% 88,1 ± 1%

p-Nitrophenylcaprylat 8:0 0,20 ± 4% 64,0 ± 1%

p-Nitrophenylpalmitat 16:0 k. A. k. A.

PET Trimere 0,47 ± 9% 9,3 ± 6%

k. A.: keine Aktivität


Abbildung 51: Lineweaver-Burk Darstellung für die enzymkatalysierte Hydrolyse der CTR durch die TfCa. Mit Hilfe der doppeltreziproken graphischen Darstellung konnten die Geschwindigkeitskonstanten Vmax und Km bestimmt werden.

3.2.7 Optimale Temperatur und optimaler pH-Wert der CTR-Hydrolyse durch die TfCa

Für die Anwendung der Esterase zum Abbau von zyklischen PET-Trimeren wurde die optimale

Temperatur und der optimale pH-Wert der CTR Hydrolse bestimmt. Dazu erfolgte der Ansatz

mehrerer Reaktionen mit verschiedenen pH-Werten des Puffers und die Inkubation bei

verschiedenen Temperaturen, um deren Einfluss auf die Abbaurate zu bestimmen.

Die TfCa besitzt ein Temperaturoptimum für den Abbau von zyklischen PET-Trimeren bei 60°C und

ein pH-Optimum bei pH 6 (Abbildung 52).

Abbildung 52: pH und Temperaturoptimum der TfCa beim Abbau von zyklischen PET-Trimeren, bestimmt per RP HPLC (Billig et al. 2010).


3.2.8 Cutinaseaktivität der TfCa

Um zu testen, ob die aufgereinigte TfCa auch in der Lage ist, Cutin abzubauen, wurden je 1 U, 2 U

und 4 U der TfCa mit Cutin inkubiert. Die nachfolgenden Chromatogramme zeigen die

gaschromatographischen Analysen der verschiedenen Ansätze (Abbildung 53-56).

Abbildung 53: Gaschromatographische Analyse des Blindwerts (ohne Enzym) der Cutinhydrolyse.

Abbildung 54: Gaschromatographische Analyse des Ansatzes mit 1 U TfCa der Cutinhydrolyse.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Analysezeit (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rela

tive A

bundan

z

9.73

2.81

8.19

5.27

19.84 12.25 14.08 6.37 16.05 17.63 22.93

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Analysezeit (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100 9.74

7.19 2.76

8.19

5.29 12.86 20.08 16.05 18.34 23.11 21.71

Rela

tive A

bundan

z




Die Analysechromatogramme der enzymatischen Cutinhydrolyse zeigen, dass das partiell

aufgereinigte Enzym nicht in der Lage war, das Biopolymer zu hydrolysieren. Damit gehört dieses

Enzym nicht zur Gruppe der Cutinasen.

3.2.9 PCL-Abbau durch die TfCa

Nach 24 Stunden zeigte die Platte mit der TfCa keine Hofbildung, die Platten mit den Enzymlösungen

aus dem Suberin- und Cutin MSV-Medium jedoch eine deutliche Hofbildung (Abbildung 57). Das

bedeutet, dass die TfCa keine Cutinase sondern eine Carboxylesterase ist, da sie weder Cutin noch

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Analysezeit (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rela

tive A

bundan

z

2.75

9.75

14.45

7.20 19.31

5.29 12.25 16.06 23.09 20.64

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Analysezeit (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rela

tive A

bundan

z

9.75

7.20

2.78

8.20

3.67 5.32 12.25

19.81 13.97 16.06 22.67


PCL hydrolysierte. Die mit den Cutin- und Suberinpräparationen inkubierten PCL-Platten zeigten eine

deutliche Hofbildung, was bedeutet, dass diese Enzyme wahrscheinlich Cutinasen sind.

Abbildung 57: PCL-Agarplatten nach 24 stündiger Inkubation mit TfCa (linkes Photo), mit dem Kulturüberstand des Suberin-MSV-Mediums (mittleres Photo) und mit Kulturüberstand des Cutin-MSV-Mediums (rechtes Photo).

3.2.10 N-terminale Sequenz der TfCa

Die eindeutige Identifizierung der Esterase erfolgte über die Bestimmung der Protein und DNA

Sequenz. Hilfreich dabei war die Publikation von Lykidis et al. (2007), welche die komplett

identifizierte genomische Sequenz von T. fusca XY enthält.

Es wurden die ersten 10 Aminosäure-Reste der TfCa ansequenziert. In Tabelle 29 ist die detektierte

N-terminale Sequenz dargestellt. An Position 3 und 5 können entweder Lysin oder Isoleucin stehen.

Tabelle 29: Identifizierte N-terminale Sequenz der TfCa aus T. fusca KW3.

Aminosäure-Rest 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Aminosäure M E I/K V I/K R T G S G

Das zu dieser N-terminalen Sequenz mittels Datenbank-Recherche ermittelte identische Protein ist

eine Carboxylesterase (EC 3.1.1.-) mit der Bezeichnung Tfu_2427. Es besitzt eine berechnete Größe

von 52,8 kDa und eine für Hydrolasen typische katalytische Triade aus den Aminosäuren Serin,

Glutamat und Histidin. Ebenfalls ist die Region des Serins hochkonserviert und besitzt das

Sequenzmotiv GESAG. Die Lokalisation des Gens im Genom und die Sequenz einschließlich der

katalytischen Triade sind in den Abbildungen 58 und 59 dargestellt.

Abbildung 58: Lokalisation des Tfu_2427 Gens im Genom von T. fusca YX (Quelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/


1 meivirtgsg dvrgskengi avfrgipyae ppvgahrfta prpprpwdgv rdatefsata

61 prppypeaig allierfipg ddyltlnvwt pdpnavglpv mvwihggaft ngsgsepvyd

121 gaafardgvv fvsfnyrlgi igfadlpdap snrglldqia alewvrdnia rfggdpgnvt

181 vfgesagams vctlmatpra rglfrrailq sgagnmavaa edattiaavi ahrlgvepta

241 aalahvpvaq lldvqqqvaq eiqgapdpav wgeriaggsv llpfapvidg ellsqrpaea

301 iaggaghdvd llfgtttdey rlflaptgll pfitgdyvtt hlaksgldad aakaytaegr

361 geepgdilas iitdqvfrip alriaesrvd apartfgyef awrtpqldgi lgachavelp

421 fvfrtldraa slvgtnppee laetvhnawv rfatsgdpgw pawnpetrsv mrfdhpvsem

481 vtdpypatra lwdgvpl

Abbildung 59: Proteinsequenz von Tfu_2427 aus T. fusca YX, die Aminosäuren des aktiven Zentrums und das GXSXG Motiv sind gelb markiert. Die ersten 10 Aminosäuren am N-Terminus, anhand derer die Identifikation erfolgte, sind unterstrichen (Billig et al. 2010).

3.2.11 MALDI-TOF Sequenzierung der TfCa

Die durch die N-terminale Sequenzierung erhaltene Sequenz stammt von dem Actinomyceten

T. fusca YX, einem sehr nahen Verwandten des T. fusca KW3. Da es aber auch bei Organismen der

gleichen Spezies kleine Unterschiede in einer Proteinsequenz geben kann, wurde mit der isolierten

TfCa eine MALDI-TOF Analyse durchgeführt, um die genaue Proteinsequenz zu bestimmen.

Das Ergebnis war eine 93,5% Übereinstimmung mit der bereits bekannten Sequenz und dem

aufgereinigten Protein. Bis auf zwei Bruchstücke konnte die gesamte Enzymsequenz der TfCa

identifiziert werden. Das bedeutet, dass es sich bei dem aufgereinigten Protein definitiv um eine

Carboxylesterase handelt, welche mindestens zu 93,5% mit der Sequenz des Proteins Tfu_2427 aus

T. fusca YX übereinstimmt.

Für eine vollständige Sequenzidentifikation erfolgte parallel eine Sequenzierung des TfCa Gens

mittels abgeleiteter Primer (Oeser et al. 2010). Bei dieser Sequenzierung konnte die gesamte

Sequenz des TfCa Gens identifiziert werden und somit die gesamte Proteinsequenz abgeleitet

werden. Beim Vergleich der Sequenz der TfCa mit der Tfu_2427 wurde festgestellt, dass die Proteine

bis auf 2 Aminosäuren übereinstimmen. Diese beiden unterschiedlichen Aminosäuren wurden zuvor

mit der MALDI TOF/TOF Analyse nicht identifiziert, da beide Unterschiede sich im gleichen

Proteinfragment befanden und sich somit die Differenzen der Massen ausglichen. An Position 335 bei

der TfCa steht anstelle eines Glycins ein Serin und an Position 340 steht ein Alanin anstelle eines

Threonins (Abbildung 60). Somit ergibt sich eine 99,6% Übereinstimmung zwischen den beiden

Carboxylesterasen.


1 meivirtgsg dvrgskengi avfrgipyae ppvgahrfta prpprpwdgv rdatefsata

61 prppypeaig allierfipg ddyltlnvwt pdpnavglpv mvwihggaft ngsgsepvyd

121 gaafardgvv fvsfnyrlgi igfadlpdap snrglldqia alewvrdnia rfggdpgnvt

181 vfgesagams vctlmatpra rglfrrailq sgagnmavaa edattiaavi ahrlgvepta

241 aalahvpvaq lldvqqqvaq eiqgapdpav wgeriaggsv llpfapvidg ellsqrpaea

301 iaggaghdvd llfgtttdey rlflaptgll pfitsdyvta hlaksgldad aakaytaegr

361 geepgdilas iitdqvfrip alriaesrvd apartfgyef awrtpqldgi lgachavelp

421 fvfrtldraa slvgtnppee laetvhnawv rfatsgdpgw pawnpetrsv mrfdhpvsem

481 vtdpypatra lwdgvpl

Abbildung 60: Proteinsequenz der TfCa aus T. fusca KW3, die Aminosäuren des aktiven Zentrums und das GXSXG Motiv sind gelb markiert, die identifizierten Unterschiede zu Tfu_2427 aus T. fusca YX sind rot markiert (Billig et al. 2010).

Mit der Sequenz der Carboxylesterase TfCa wurde ein Alignment mit den vier ähnlichsten Enzymen

aus einer Enzymdatenbank (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) protein database;

http://www.genome.jp/kegg/) erstellt. Es sind alles ebenfalls Hydrolasen mit ähnlichen Sequenzen.

Die Enzyme stammen aus Arthrobacter FB24 (art), Streptomyces coelicolor (sco), Frankia alni (fal)

und Saccharopolyspora erythraea (sen). Es ist ersichtlich, dass besonders um die Bereiche der

Aminosäuren der katalytischen Triade die Enzyme viele Übereinstimmungen besitzen. In der

nachfolgenden Abbildung ist das Alignment der 5 Hydrolasen dargestellt. Die grau unterlegten

Sequenzen treten bei mindestens drei der fünf Enzyme auf. Die Aminosäuren der katalytischen

Triade sind fett gedruckt.

http://www.genome.jp/kegg/


1 M----------------------------------------------------------- tfu

1 M----------------------------------------------------------- art

1 MRS---------GQT--------------------------------------------- sco

1 MRPAASPVLSRLGQALAALVCLDAPVSFNPWHALVAVLWWSRRQGTVNGWRAFPVLRDDS fal

1 M----------------------------------------------------------- sen

2 -----------------------------------EIVIRTGSGDVRGSKENGIAVFRGI tfu

2 -----------------------------------DTVVKTTHGQLRGSLADGVHCFLGI art

7 -----------------------------------NPVVRTVHGAVGGRYEHDVAVFRGI sco

61 AVRVRVRDRDRGRVRSVRVGGAMTTVGAVPASAGSRPGARVAGGALCGSRESGVAVFRGI fal

2 -----------------------------------DVIVRTGSGRVRGFSAGDVSVFKGI sen

27 PYAEPPVGAHRFTAPRPPRPWDGVRDATEFSATAPRPPYPEAIGALLIERFIPGD--DYL tfu

27 PFAASTAGVNRLRPPQPVQPWSGVRDAMKYGDSPFQLAPPESAGTEW-DTALAGE--DCL art

32 PYAAPPFGPGRFRPPLPPEPWDGVRDAGSFGPTAPKPPYSEAFARYLSDPAIPGD--DCL sco

121 PYAAPPVGGLRFAAPRPAASWDGVRSALSYGPPPPQ---SDVLGRGPSAEGTPGD--DWL fal

27 PYAAPLDGPARFQAPLPAPSWEGVRDSTAFSASVPQ---EAAPMPGQVSPWKPGDSTECL sen

85 TLNVWTPDPNAVG-LPVMVWIHGGAFTNGSGSEPVYDGAAFARD-GVVFVSFNYRLGIIG tfu

84 NLNVWTPDPGNGG-LPVMVWIQGGAFEIGSTAS--YNGRTFARD-GVICVVINWRVGADG art

90 NLNVWTPEPGPGARLPVLVWLHGGALTRGSSAVPVYDGSTFARD-GVVCVSVNYRLGVEG sco

176 TVNVWSPEPDPAAKLPVMVWIYGGAYAIGASSRPEYDGAHLARDGGVVVVTFDYRLGMEG fal

84 TVNVWSPDVGARG-LPVLVWIHGGMFMHGSSASPAYDGAALARE-GVVFVSLNYRVGYEG sen

143 FADLPDAPSNRGLLDQIAALEWVRDNIARFGGDPGNVTVFGESAGAMSVCTLMATPRARG tfu

140 FLDLGDGQANIGLLDQVAALEWVRGNIAAFGEDPANVTVFGQSAGAMSIGVLLSMPRAEG art

149 YGLFPDAPANAGLRDQIAALQWVRDNIAAFGGDPDRVTVAGQSAGAISTGALLAAPRARG sco

236 FAQITGAPPNRGLLDQVAALEWVRDNIAAFGGDPDEVTVFGESAGGGSVAALLAMPRAAG fal

142 FGWVADAPANRGLLDQIAALRWVRDNIAGFGGDPGNVTVAGQSAGGSSVVALVSSPAARG sen

203 LFRRAILQSGAGNMAVAAEDATTIAAVIAHRLGVEPTAAALAHVPVAQLLDVQQQVAQEI tfu

200 LFRRAILQSGAAHHVLPTETAQRIGGFLSEKLGVSPTREAMAAVPVQRFLAAQTELKADL art

209 LFRRAVLQSGAPE-AADRDKVRRMVRRMASRLKIPATAEAFAAADRDQLLRAQAEV---- sco

296 LFRRAIAQSVPGT-FLSPQLAADIAADCADELGLRPTVADLATVDPALLTVAADTVATDT fal

202 LLRRGIAQSVGGL-FVPEAEARAVAEMVTDQLGVSPTAAELGSLPSEAIHGAQSAPSAAM sen

263 QGA---PDPAVWGERIAGGSVLLPFAPVIDGELLSQRPAEAIAGG-AGHDVDLLFGTTTD tfu

260 AAR---PDPARWGPEVVASSML--WQPSVDGDVIPRRPIERIAAG-AGSTVDVMIGSNAE art

264 ---------GRFSSPVLGGPG---FGLVVDGDVLPRDPLEALVDGDAAPGVDLMMGWTRD sco

355 VAATMATRARRWGQAALRSIL---FAPVVDGEVLPATPWQALAAG-AGRDVDLLAGHTRD fal

261 TA-----DPSAWTNSHTP------YAPMFGDDVLERRPWEALRAG-AGREIDLIAGFTRD sen

319 EYRLFLAPTGLLPFITS--------DYVTAHLAKSGLDAD-AAKAYTAEGRGEEPGDILA tfu

314 DWKLFLAITGVIAKVTERDLAESRSVDGFPPIGVYGLPAETALREYRSHYPASSPGELLA art

312 EYRLWLVPGGLVERVDR-----LGAVALAGARARCHCGNE-VVRGYRAARPGAGTAEIVG sco

411 EQRLFTALTGLLGQVTP--------DQAATALQDFAPGRD-GARRYRDAYPDAGPEQLYE fal

309 ECRVFAAGLDLSG------------SDPVAVARGMRLAPE-ALPRYRAAHPGISDAGLHE sen

370 SIITDQVFRIPALRIAESRVD----APARTFGYEFAWRTPQLDGILGACHAVELPFVFRT tfu

374 AVETDWWVRIPALRLADAHAKALSTASARTYMYEFAWPAPGL----GAVHAMEVPFVFDT art

366 QLVTDHLLRIPMHRVADAR-------PGSSHVYEFAWPSNLPD--LGACHALELGFVFDS sco

462 LVHSDWLFRMPTLHLAQAQVA----GGGRVHLYELTWPAPGMGGALGACHGLDVPLVFGN fal

356 LMLTDSLFRMPTLWCAEGHAE----AGGKTYLYEFAWPAPVLDGAYGACHSIDVPFLFGV sen

426 LDRAAS----LVGTNPP---EELAETVHNAWVRFATSGDPGWPAWNPETRSVMRFDHPVS tfu

430 LDTSSRLFGPLLGTDPP---QELADAMHAAWISFASTGDPGWPGYDLERRATMLFNTG-A art

417 GDGPDA--RRLAGEGAP---QELADAMHGAWVRFAETGDPGWQAWDAA-HPVRVFGDGAP sco

518 LTSGQP--ALLIGDSPTPEATALSARMRSAWTTFATRSDPGWPAYDCDHRLTQIFDTS-P fal

412 LDDEIG--RPLLGDPAPAGFEVLSAQLRRAWTSFAASGDPGWPEFGTDWRLARSWNVP-L sen

479 EMVTDPYPATRALWD-GVPL------------ tfu

486 GVVYDPRSWERDLWE-GVR------------- art

471 HTAYGPLDPEYDLWKADVTVPRGTRPRRLVRR sco

575 VVTAYPEERSRLIWQ-DHSFP----PLLLHAP fal

469 EVVSDPAGESRRIWR-EHA------------- sen

Abbildung 61: Alignment der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 (tfu), der Carboxylesterase Arth_3983 aus Arthrobacter FB24 (art), der Carboxylesterase SCO6127 aus Streptomyces coelicolor (sco), der putativen Carboxylesterase FRAAL0556 aus Frankia alni (fal) und der putativen p-Nitrobenzylesterase SACE_2933 aus Saccharopolyspora erythraea (sen) (Billig et al. 2010).


3.2.12 Homologie-Modeling der TfCa und Vergleich der Struktur mit anderen Hydrolasen

Mit der Proteinsequenz der TfCa wurde mit dem Programm PyMOL eine Modellierung der

Proteinstruktur, unter der Nutzung der thermostabilen Carboxylesterase aus

Geobacillus stearothermophilus (PDB Code 2OGS resp. 2OGT) als Template, vorgenommen

(Abbildung 62, 63) (Liu et al. 2007, Bennett-Lovsey et al 2008). Das aktive Zentrum der

Carboxylesterase mit der katalytischen Triade wurde blau gekennzeichnet.

Abbildung 62: Tertiärstruktur der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3. Rot sind die α-Helices gekennzeichnet und gelb die β-Faltblattstrukturen. Die grünen Bereiche sind Sequenzen ohne eine spezielle Sekundärstruktur. Die drei blau gekennzeichneten Aminosäuren sind die katalytische Triade (Billig et al. 2010).

Abbildung 63: Ausschnitt aus der Tertiärstruktur der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3. Rot sind die α-Helices gekennzeichnet und gelb die β-Faltblattstrukturen. Die grünen Bereiche sind Sequenzen ohne eine spezielle Sekundärstruktur. Die drei blau gekennzeichneten Aminosäuren sind die katalytische Triade.

Zum Vergleich wurden weitere PET-Hydrolasen modelliert. Die modellierte Struktur der Cutinasen

Tfu_0882 aus T. fusca YX ,basierend auf der Lipase von S. exfoliates (SeL), wurde mit dem SWISS-

Model Homologie Modeling Web Server konstruiert (Abbildung 64d) und Tfu_0883, basierend auf

der Lipase von S. exfoliates (SeL, PDB-ID: 1JFR), wurde mit PHYRE erstellt (Abbildung 64e) (Lykidis

et al. 2007, Chen S et al 2008). Von den Sequenzen der Cutinasen von F. solani sp. pisi und

P. mendocina aus der NCBI Protein Data Base und der Sequenz der Cutinase von H. insolens,

modelliert mit dem Wurst Protein Threading Server, wurde mittels PyMOL ein Strukturbild erstellt

(Abbildung 64c, f, b). Die katalytischen Aminosäure-Reste sind blau dargestellt.


Abbildung 64: Homologie-Modelle der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 (a) verglichen mit verschiedenen PET-Cutinasen. Die Strukturen der Cutinasen aus H. insolens (b), F. solani sp. pisi (c), der Cutinasen Tfu_0882 (d) und Tfu_0883 (e) aus T. fusca KW3 und der Cutinase aus P. mendocina (f) sind dargestellt (Billig et al. 2010).

c


3.2.13 Vergleich der TfCa mit bekannten PET-Hydrolasen

Die TfCa unterscheidet sich deutlich von allen anderen bisher bekannten und bereits näher

charakterisierten PET-Hydrolasen nicht nur durch Ihre höhere Größe, sondern auch durch die

Tatsache, dass es sich um eine Carboxylesterase und nicht um eine Cutinase handelt. In der

nachstehenden Tabelle sind die Eigenschaften der TfCa aus T. fusca KW3 verglichen mit den

Cutinasen aus T. fusca DSM 43793 und einem weiteren T. fusca Isolat dargestellt (Kleeberg et al.

2005, Chen S et al. 2008). Diese beiden Cutinasen unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Produktion,

die Erstere wurde als Wildtypenzym durch T. fusca DSM 43793 produziert, die Zweite hingegen

rekombinant in E. coli.

Tabelle 30: Vergleich der Eigenschaften der TfCa mit Cutinasen aus T. fusca.

TfCa aus T. fusca KW3 Cutinase aus T. fusca DSM 43793

(Kleeberg et al. 2005)

Cutinase aus einem T. fusca Isolat

(Chen S et al. 2008)

Molekulargewicht

(ermittelt per Gelelektrophorese)

52,4 kDa 27,4 kDa 29 kDa

pI 4,8 6,43 n. b.

pH Stabilität pH 5–11 n. b. n. b.

Temperaturstabilität 30–50°C n. b. 40–60°C

pH Optimum pH 6 (CTR Hydrolyse) pH 6,5–7 (BTA Hydrolyse) pH 8 (Triolein, p-NPB Hydrolyse)

Temperatur Optimum 60°C (CTR Hydrolyse) 65–70°C (BTA Hydrolyse) 60°C (Triolein, p-NPB Hydrolyse)

Inhibitoren PMSF TPCK

n. b. PMSF

Hydrolysierte Substrate p-Nitrophenylacetat p-Nitrophenylbutyrat p-Nitrophenylcaprylat CTR

Triglyceride Aliphatische Polyester Aliphatisch-aromatische Copolyester PET-Filme Cutin

p-Nitrophenylbutyrat Triolein Cutin

Aminosäuren der katalytischen Triade

Ser185, Glu319, His415 G-E-S-A-G Motiv

Ser132, Asp176, His210 G-H-S-M-G Motiv

Ser132, Asp176, His210 G-H-S-M-G Motiv

n. b.: nicht bestimmt

Die optimale Temperatur für die CTR Hydrolyse durch die TfCa lag bei 60°C und der optimale pH Wert

bei 60°C war pH 6. Nach 24 Stunden Inkubation lagen die Restaktivitäten bei pH 5 bis 11 bei 40-100%

und somit stabil in einem breiten pH Bereich. Bei einem Inkubationszeitraum von 7 Tagen bei pH 9


und 10 lag die Restaktivität bei 85%, bei den pH Werten 5 und 11 lag sie bei 22% und 16%. Bei

erhöhten Temperaturen (40-50°C) war nach 7 Tagen Inkubation noch 93-100% Restaktivität

nachweisbar. Mit 55°C konnte nach 24 Stunden Inkubation nur noch 1% Restaktivität detektiert

werden. Bei der Ermittlung der Substratspezifität mit p-NPEstern zeigte sich, dass die TfCa Aktivität

gegenüber kurz- und mittelkettigen Substraten (C2 bis C8) besaß, hingegen nicht gegenüber

langkettigen (C16) Substraten. Die Inhibitoren PMSF und TPCK reduzierten die hydrolytische Aktivität

der TfCa, was bedeutet, dass ein Serin und ein Histidin Bestandteil der katalytischen Triade sind.

Durch DTT und EDTA erfolgte keine Inhibition der Esterase, somit sind keine essentiellen

Disulfidbrücken im Enzym enthalten und es benötigt auch keine Metallionen als Cofaktoren. Somit

handelt es sich bei dem aufgereinigten Enzym um eine Serin Hydrolase, welche allerdings kein Cutin

oder PCL hydrolysieren kann und somit nicht zur Gruppe der Cutinasen zählt, wie die meisten PET-

Hydrolasen. Bei der Sequenzbestimmung der Esterase stellte sich heraus, dass es sich um eine

Carboxylesterase mit 42% Übereinstimmung mit der Carboxylesterase Arth_3983 aus

Arthrobacter FB24, 42% Übereinstimmung mit der Carboxylesterase SCO6127 aus S. coelicolor, 43%

Übereinstimmung mit der putativen Carboxylesterase FRAAL0556 aus F. alni und 42%

Übereinstimmung mit der putativen p-Nitrobenzylesterase SACE_2933 aus S. erythraea handelt. Das

katalytische Zentrum der TfCa besteht aus Ser185, Glu319, His415, wobei das Serin in das für

Hydrolasen typische G-E-S-A-G Motiv eingebettet ist.

Durch eine Codon Optimierung, der Klonierung in den pET-20b(+) Vektor mit einer N-terminalen pelB

Signalsequenz und einem C-terminalen His6-Tag und einer anschließenden Transformation in E. coli

BL21(DE3) erfolgte die Erstellung eines rekombinanten Wirtes für die Überexpression der

Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 (Oeser et al. 2010). Die rekombinant produzierte TfCa war in

der Lage PET-Nanopartikel mit einer Rate von 7 nmol/ml freigesetzte TPA bei 24 Stunden Inkubation

bei 50°C und 0,01 mg TfCa zu hydrolysieren.

Bei der TfH Cutinase aus T. fusca DSM 43793 lag das Temperaturoptimum 10-15°C über der

maximalen Wachstumstemperatur des Mikroorganismus, was untypisch für extrazelluläre Enzyme

ist, hingegen für Lipasen, Xylanasen oder PHB-Depolymerasen schon beschrieben wurde.

Anscheinend gibt es laut Kleeberg et al. (2005) einen Überlagerungseffekt bezüglich der

Enzymaktivität und dem zu hydrolysierenden Substrat. Mit höher molekularen Substraten, wie BTA,

welches erst bei höheren Temperaturen aufgrund der höheren Beweglichkeit der Polymerketten

besser abbaubar ist, konnte ein höheres Temperaturmaximum bestimmt werden als mit

niedermolekularen Substraten, wie Ölen oder Fetten. Der schnelle Verlust an Aktivität bei 70°C ist

auf die Denaturierung der Hydrolase zurückzuführen. Das aufgereinigte Enzym verlor nach 30 min bei

70°C 85% seiner Aktivität, wohingegen die Hydrolase in der Enzymrohlösung 60% Restaktivität nach


einer Woche Lagerung bei Raumtemperatur aufwies und bei 70°C nach einer Stunde fast die gesamte

hydrolytische Aktivität verloren ging. Das pH Maximum lag bei pH 6-6,5, verlagerte sich aber bei

geringeren Ionenstärken in Richtung der neutralen pH Werte. Die BTA Hydrolase spaltete Triacetin,

Tributyrin und Tricaproin mit einer ähnlichen Aktivität, hingegen mit den längerkettigen Substraten

Tricaprylin, Tricaprin, Trilaurin und Triolein sank die hydrolytische Aktivität mit zunehmender

Kettenlänge. Des Weiteren konnte die TfH auch eine Vielzahl an Polyestern (PCL,

Poly(trimethylenbrassylat) (SP3/13), Bionolle, Polyesteramid Bayer TIR 1874) hydrolysieren, jedoch

nicht das natürliche Polymer Poly(3-hydroxybutyrat) (PHB).

Das Enzym besteht aus 261 Aminosäuren und wurde als Serin Hydrolase klassifiziert, welche

Esterasen, Lipasen und Cutinasen beinhaltet. Sie besaß eine 65% Ähnlichkeit zu einer Triacylglycerin

Lipase aus Streptomyces albus G26 und eine 62% Ähnlichkeit zu einer Triacylglycerin Acylhydrolase

aus Streptomyces sp. M1127. Das Serin des katalytischen Zentrums war in dem hochkonservierten

Motiv G-H-S-M-G, an der Position 132 im Enzym, eingebettet. Der Anteil an hydrophoben

Aminosäuren (Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp) war mit 42% hoch im Vergleich zu anderen Serin

Hydrolasen, worauf die Probleme bei der Aufreinigung zurück zu führen waren.

Obwohl die TfH aufgrund der Sequenzübereinstimmungen und der Substratspezifität zu den Lipasen

eingeordnet werden könnten, zeigten sie aber auch deutliche Unterschiede im Vergleich zur

Pseudomonas sp. Lipase (PsL) und Aspergillus oryzae Lipase (AoL) bei der Film und Nanopartikel

Hydrolyse. Die Lipasen hydrolysierten nur 40% der Esterbindungen, da sie nur die Oberfläche des

unlöslichen Substrates angreifen. Auch bei weiterer Enzymzugabe gab es keine weitere Hydrolyse,

was bedeutete, dass das Enzym nicht inaktiviert war. Die Hydrolyse stoppte, als das Substrat

komplett in wasserlösliche Zwischenprodukte umgesetzt war und somit die Lipasen keine

hydrophoben Oberflächen für ihre Konformationsänderung zur Verfügung hatten. Somit wurden die

verbleibenden Esterbindungen der Intermediate nicht hydrolysiert. Die TfH hingegen hydrolysierte

100% der Esterbindungen des Polymerfilms und der Nanopartikeln und zeigte somit keine

Grenzflächenaktivierung. Aufgrund der hydrolytischen Aktivität der TfH gegenüber Apfelcutin und

PCL konnte sie zur Gruppe der Cutinasen gezählt werden (Gouda et al. 2002, Kleeberg et al. 2005).

Die TfH wurde durch Dresler et al. 2006 rekombinant in E. coli TG1 mit dem Plasmid pCYTEXP1-

OmpA-bta1-His6 produziert, sekretiert und aufgrereinigt. Dabei erfolgte allerdings keine weitere

Charakterisierung der Cutinase (Dresler et al. 2006).

Nach einer Codon Optimierung wurde das tfh Gen in einen offenen Leserahmen mit der DNA

Sequenz für das N-terminale Signalpeptid der Bacillus megaterium Lipase A und einem C-terminalen

His6-Tag kloniert und unter einem Xylose induzierbaren Promotor rekombinant in

Bacillus megaterium WH323 produziert. Auch hier erfolgte keine weitere Charakterisierung der

rekombinanten Hydrolase (Yang et al. 2007).


Die BTA-Hydrolase aus Thermobifida sp. BCC23166, isoliert aus Proben einer Deponie, wurde durch

Transkonjugation in den Produktionsstamm Streptomyces rimosus R7 mit pIJ-BTA verfügbar

(Sinsereekul et al. 2010). Diese aufgereinigte Hydrolase zeigte einen optimalen Temperaturbereich

von 50-55°C und einen optimalen pH im milden bis basischen Bereich, bestimmt mittels p-NPP als

Substrat. Die rTfH besaß die höchste Aktivität mit kurzkettigen p-Nitrophenylestern, aber auch mit

lankettigen Substraten konnten hydrolytische Aktivitäten nachgewiesen werden, was mit den bereits

referierten Aktivitäten übereinstimmt (Kleeberg et al. 2005). Unter Anwendung der

Oberflächenplasmonresonanztechnik zur Untersuchung der Hydrolyse von Polyestern zeigte sich,

dass die rTfH eine unterschiedliche Bevorzugung von aliphatischen und aliphatisch-aromatischen

Polyestern besitzt und zwar in der Reihenfolge PCL>Ecoflex®>PHB. Diese Unterschiede kommen laut

Sinsereekul et al. (2010) aufgrund unterschiedlicher Bindungseigenschaften der Polyester an das

Enzym und aufgrund verschiedener physikalischer Eigenschaften (Kristallinität) zustande. Aufgrund

unterschiedlicher Filmherstellung und Analysetechniken war in diesem Fall auch ein Abbau von PHB

durch die rTfH nachweisbar. Im Vergleich zur Lipase aus T. lanuginosus zeigte die Hydrolase höhere

Spezifität und Abbauraten gegenüber aliphatisch-aromatischen Copolyestern, analog zu den Studien

von Eberl et al. (2008) (Sinsereekul et al. 2010).

Die 29 kDa Cutinase aus T. fusca WSH03-11 (Chen S et al. 2008, Chen J et al. 2008) zeigte deutliche

Übereinstimmungen mit 2 Enzymen, Tfu_0883 und Tfu_0882, identifiziert im T. fusca YX (Lykidis

et al. 2007). Die Enzyme wurden als Triacylglycerin Lipasen in der genomischen Datenbank

bezeichnet, enthalten eine hochkonservierte Sequenz (GXSXG) und gehören der α/β Hydrolase

Familie an. Für eine weitere Charakterisierung erfolgte die rekombinante Expression der beiden Gene

in E. coli BL21 Rossetta (DE3) PlysS mit dem Vektor pET-20b(+) mit einem C-terminalen His6-Tag und

dem PelB Signalpeptid. Die Cutinasen 1 und 2 hydrolysierten Triolein und p-NPB bei einer optimalen

Temperatur von 60°C und einem optimalen pH von 8. Bei den Thermostabilitätsuntersuchungen

zeigten die beiden Hydrolasen Restaktivitäten von 80% nach 160 Stunden bei 40°C und 50% nach 40

Stunden bei 60°C. Die beiden Isoenzyme waren auch in der Lage, Cutin zu hydrolysieren, womit sie

der Gruppe der Cutinasen zuzuordnen sind. Durch den Inhibitor PMSF, der an das aktive Serin der

katalytischen Triade bindet, erfolgte eine Verminderung der katalytischen Aktivität der Cutinasen.

Zusätzliche Mutationstudien bestätigten, dass die beiden Cutinasen Serin Hydrolasen sind, da beim

Austausch des Serins an der Posititon 188 (Cutinase 1) und 170 (Cutinase 2) keine katalytische

Aktivität mehr zu verzeichnen war (Chen S et al. 2008, Chen J et al. 2008).

Die molaren Massen der Isoenzyme, bestimmt mit der SDS-PAGE, waren 29 kDa, die berechneten

Werte lagen bei 29,220 kDa (Cutinase 1) und 28,997 kDa (Cutinase 2). Das native Molekulargewicht

lag bei 32 kDa, bestimmt per Größenausschlusschromatographie, und bestätigte, dass die Cutinasen

in Lösung monomere Enzyme sind. Bei der Studie der Substratspezifität der Cutinasen zeigten beide


eine höhere Aktivität mit kurzkettigen p-NPEstern, hydrolysieren aber auch langkettige Ester (C16-

C18). Dabei zeichnete sich Cutinase 2 durch eine höhere Hydrolyserate gegenüber Cutinase 1 aus, was

allerdings bei der Hydrolyse von Triolein nicht bestätigt wurde. Somit zeigten sich der 7%-

Sequenzunterschied auch in der hydrolytischen Aktivität der Isoenzyme. Diese Beobachtungen

bestätigten sich auch bei der Untersuchung der CTR-Hydrolyse, bei der die Cutinase 2 deutlich mehr

zyklische Trimere hydrolysierte. Das lässt die Annahme zu, dass die Sequenzunterschiede im Bereich

des aktiven Zentrums oder dessen Umgebung die katalytischen Aktivitäten beeinflussen. Beide

Cutinasen zeigten keine Grenzflächenaktivierung und besitzen keinen Deckel. Ebenfalls benötigen sie

keine Metallionen als Cofaktoren für ihre hydrolytische Aktivität, nachgewiesen mit dem Inhibitor

EDTA. Bei der Untersuchung des Einflusses verschiedener Lösungsvermittler wurde festgestellt, dass

Triton X-100, Tween 20 und TDOC (in Konzentrationen von 1 mM und 10 mM) keine

Aktivitätsänderungen zur Folge hatten, SDS hingegen inhibierte die Cutinasen. In den organischen

Lösungsmitteln Methanol, Ethanol, Aceton, n-Hexan und Dimethylsulfoxid (DMSO) sind die

Isoenzyme stabil, weniger hingegen in Isopropanol und Butanol, was eine breite Anwendung in der

organischen Synthese eröffnet (Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008).

Bei der Suche nach Polymer-abbauenden Isolaten wurde eine thermostabile Hydrolase aus

Thermobifida alba AHK119 identifiziert, deren Gensequenz mit spezifischen Primern kompatibel zur

G-X-S-X-G Consensussequenz (903 bp) amplifiziert wurde (Hu et al. 2010). Die Aminosäuresequenz

bestehend aus 300 AS wurde Est119 benannt und gehört zur Familie der Serin Hydrolasen. Est119

besaß 84% Übereinstimmung mit der Triacylglycerin Lipase (TfH) aus T. fusca DSM 43793 (Kleeberg

et al. 2005), 63% Übereinstimmung mit der Lipase aus S. coelicolor A3(2) M145 (Valdez et al. 1999),

62% Übereinstimmung mit der Lipase aus S. albus G (Cruz et al. 1994) und 61% Übereinstimmung mit

der Lipase aus S. exfoliatus M11 (Wei et al. 1988). Die hoch konservierte Sequenz mit dem aktiven

Serin wurde mit G-H-S-M-G in der Hydrolase identifiziert, die katalytischen Aminosäuren sind Ser129,

His207 und Asp175. Eine N-terminale Signalsequenz von 34 Aminosäuren konnte ebenfalls

identifiziert werden, welche zwischen den Aminosäuren 34 und 35 posttranslational abgeschnitten

wird. Somit besaß das aktive verbleibende Enzym 266 Aminosäuren, eine Größe von 30 kDa

(rechnerisch 29,76 kDa) und lag in Suspension als monomeres Enzym vor. Die optimale Temperatur

für die Hydrolyse von p-NPB lag bei 50°C und der optimale pH Wert bei 6. Bei 50°C und pH 6 erfolgte

die Untersuchung der Substratspezifität der Hydrolase mit p-NP Estern. Mit der steigenden

Kettenlänge von C2-C6 stieg auch die Hydrolyserate an, fiel aber ab C8 stark ab. Aufgrund der

Sequenzübereinstimmungen der Est119 mit der Lipase aus S. exfoliatus M11 ordneten Hu et al.

(2010) sie ebenfalls in die Gruppe III der lipolytischen Enzyme ein.


Tabelle 31: Vergleich der PET-Hydrolasen aus F. solani FsC (Carvalho et al. 1998, Carvalho et al. 1999, Ronkvist et al. 2009), T. insolens HiC (Sandal et al. 1996, Ronkvist et al. 2009), P. mendocina PmC (Bott et al. 2003, Ronkvist et al. 2009), T. fusca

TfH/Cutinase 2 (Kleeberg et al. 2005, Chen S et al. 2008, Chen J et al. 2008) und TfCa (Zimmermann und Billig 2011).

FsC HiC PmC TfH/Cutinase 1 TfCa

Anzahl der

Aminosäuren

197 194 272 261 497

Molekulargewicht 22 kDa 20-21 kDa 30 kDa 28 kDa 52,4 kDa

Isoelektrischer

Punkt

7,2 8 n. b. 6,43 4,8

pH Optimum 6,5-8,5 8,5-9,5 9,0-9,5 6,5-8,0 6,0

Temperatur

Optimum

50°C 75-80°C 50°C 60-70°C 60°C

Katalytische Triade Ser120

Asp175

His188

Ser140

Asp195

His208

Ser126

Asp176

His206

Ser132

Asp176

His210

Ser185 Glu319 His415

GXSXG Motiv G-Y-S-Q-G G-Y-S-Q-G G-H-S-Q-G G-H-S-M-G G-E-S-A-G

Gruppierung Fungale

Cutinase

Fungale

Cutinase

Bakterielle

Cutinase

Bakterielle

Cutinase

Bakterielle Carboxyl-esterase

n. b.: nicht bestimmt

Die Cutinase aus P. mendocina hydrolysierte p-NPB am Besten, hingegen aber keine Triglyceride, was

bedeutete, dass das Enzym mit Cutinaseaktivität keine unspezifische Lipase ist. Die Cutinase zeigte

ein breites pH Optimum zwischen 8,0 und 10,5 mit Apfelcutin als Substrat. Di-

isopropylfluorophosphat (DFP, phosphoryliert Serin) inhibierte das Enzym, was bedeutet, dass ein

aktives Serin bei der katalytischen Hydrolyse beteiligt ist. Die Cutinase war stabil bei 60°C für 1

Stunde und behielt 85% ihrer Aktivität nach 1 Stunde bei 70°C (Sebastian et al. 1987).

Das Molekulargewicht des Proteinmonomers betrug 30 kDa bestimmt mit SDS-PAGE und

Größenausschlusschromatographie. Mit steigender Kettenlänge sank die hydrolytische Aktivität der

Cutinase gegenüber p-NP Estern. Das Enzym wurde nicht durch Thiol-nachweisende Agenzien

inhibiert, womit keine katalytisch aktive -SH Gruppe vorhanden ist, ebenso benötigt die Cutinase

keine Metallionen als Cofaktoren, nachgewiesen mit EDTA (Sebastian et al. 1988).

Nach der Identifikation des PmC-Gens und dessen rekombinanter Expression in E. coli erfolgten

spezifische und unspezifische Mutagenesen zu Steigerung der Thermostabilität und der spezifischen

Aktivität der Cutinase (Boston et al. 1997, Bott et al. 2003).

Bei der Hydrolyse von PET-Filmen zeigte die modifizierte PmC die maximale Aktivität bei 50°C und pH

9,5 und somit eine gute Stabilität im alkalischen Bereich (Ronkvist et al 2009).

Die mit P. menocina ATCC 53552 gewonnene Rohenzymlösung wurde zunächst auf ihre

hydrolytischen Eigenschaften mittels p-NP Ester getestet (Tabelle 32). Nach der Aufreinigung und der

damit verbundenen Identifikation der beiden Hydrolasen Lipase 1 und 2 mit cutinolytischen

Aktivitäten, erfolgte die Bestimmung der hydrolytischen Verhältnisse von p-NPB/p-NPC. Lipase 1


zeigte ein Verhältnis von 4,6 und Lipase 2 1,4. Beide Enzyme besaßen ein Molekulargewicht von

30 kDa (Gray et al. 1995).

Die Enzympräparation der Fusarium solani Cutinasen hydrolysierte ebenfalls verschiedene

Modellestersubstrate, allerdings nicht Triglyceride und enthielt somit keine unspezifische Lipase. Bei

der Hydrolyse von p-Nitrophenylpalmitat zeigte die Präparation ein deutliches pH Optimum bei 8,5

und mit Triton X-100 erfolgte eine Steigerung der hydrolytischen Aktivität (maximale Aktivität wurde

mit 3,7 mg/ml des Detergenz erreicht). Mit p-Nitrophenylester von C2-C18 ergaben sich vergleichbare

Werte für Km und Vmax, was auf keine vorhandene Spezifität schließen lässt. DFP inhibierte die

Enzympräparation, hingegen Jodacetamid und p-Chlormercuribenzoesäure (reagieren beide mit SH-

Gruppen, Cystein) hatten keinen Einfluss auf die Enzymaktivität, was bedeutet, dass es sich bei den

Fusarium Depolymerasen um Serin Hydrolasen handelt (Purdy und Kolattukudy 1973). Das

Molekulargewicht der Cutinase-Isoenzyme lag bei 22 kDa und das der Esterase bei 52 kDa (Purdy und

Kolattukudy 1975a). Die Cutinasen zeigten unter dem pH-Wert 7 geringe Aktivität, oberhalb von 7

stieg die Aktivität an bis pH 10. Oberhalb von pH 10 fiel die Hydrolyserate wieder ab.

Die beiden Cutinasen zeigten eine sinkende Hydrolyserate mit steigender Kettenlänge der Acylketten

der p-NP Esterer. Nur die berechneten Hydrolysegeschwindigkeiten V für p-Nitrophenyl-Acetat und

Butyrat waren für beide Cutinasen ähnlich, im weiteren Verlauf der Hydrolyse mit längeren p-

NPEstern zeigte die Cutinase I deutlich höhere Werte als die Cutinase II. Somit unterschieden sich die

beiden Cutinasen in ihren Fähigkeiten bei der Hydrolyse von löslichen Substraten, hingegen nicht bei

der Hydrolyse von Cutin. Die unspezifische Esterase hingegen zeigte mit den p-NP Estern deutlich

höhere Hydrolyseraten als die beiden Cutinasen und mit steigender Kettenlänge fiel die

Hydrolyseaktivität der Esterase nicht so stark ab wie bei den Cutinasen. Somit sind die Cutinasen

spezifischer für kurzkettige Ester im Gegensatz zur Esterase mit einem breiteren Hydrolysespektrum.

Bei den Studien zur Identifikation der Aminosäuren am aktiven Zentrum zeigte sich, dass die beiden

Cutinasen durch Dip-F, Paraoxon und Parathion inhibiert wurden, jedoch nicht durch N-

Ethylmaleimid, Jodoacetamid und p-Chloromercuribenzoat (Purdy und Kolattukudy 1975b). Somit

konnte nachgewiesen werden, dass die Cutinasen Serin Hydrolasen sind, jedoch keine Sulfhydryl-

Hydrolasen, wobei auch hier die Cutinase I stärker inhibiert wurde als die Cutinase II. Die

unspezifische Esterase wurde ebenfalls durch Dip-F und Paraoxon inhibiert, wobei Paraoxon das

Enzym stärker inhibierte. Bei den Cutinasen war es genau umgekehrt. Somit ist die unspezifische

Esterase ebenfalls eine Serin Hydrolase. Bei weiteren Untersuchungen stellte sich heraus, dass die

beiden Cutinasen nur ein aktives Serin besitzen. Eine genauere Studie zum Hydrolysemechanismus

der Cutinasen und der unspezifischen Esterase beim Cutinabbau sollte klären, ob diese Enzyme

eventuell parallel als Endo- und Exoenzyme agieren. Zunächst zeigte sich, dass die beiden Cutinasen

keine Unterschiede in ihren Spezifitäten und Art der Hydrolyse besaßen. Die Esterase hydrolysierte


kein Cutin und nur geringe Mengen an Oligomer im Vergleich zu den Cutinasen. Das bedeutet, dass

die Esterase für den Cutinabbau nicht essentiell ist und somit eine noch unbekannte Funktion besitzt.

Eventuell ist sie beteiligt an der Hydrolyse von cutikulären Wachsestern und wird deshalb mit den

Cutinasen coinduziert (Purdy und Kolattukudy 1975b).

Die 3-dimensionale Struktur einer Cutinase aus F. solani sp. pisi wurde nach der Klonierung und

Expression in E. coli mit einer Auflösung von 1,6 Å und 1,0 Å untersucht. Die Cutinase besteht aus 197

Aminosäuren und ist ein kompaktes Monomer von einer Größe von 45x30x30 Å. Der isoelekrische

Punkt lag bei 7,8. Das aktive Serin 120 ist in die Konsensus Sequenz Gly-Tyr-Ser-Gln-Gly eingebettet

und die beiden weiteren aktiven Aminosäuren sind Asp175 und His188. Das aktive Zentrum ist sehr

gut zugänglich auf der Oberfläche des ellipsoiden Proteins und ist umgeben von den

Aminosäureschleifen 80-87 und 180-188, welche sehr hydrophob sind (Carvalho et al. 1998).

Die Cutinase besaß vier nichtvariable Cysteine, welche zwei Disulfidbrücken ausbilden und somit eine

wichtige Rolle bei der Strukturbildung besitzen. Das aktive Zentrum zeichnete sich durch eine hohe

Flexibilität aus, was die Anpassung an verschiedene Substrate ermöglicht.

Trotz dass die Cutinasen lipolytische Aktivitäten besaßen, unterscheiden sie sich von den klassischen

Lipasen aufgrund der fehlenden Grenzflächenaktivierung. Bei der Cutinase besitzen die das aktive

Zentrum umgebende Proteinschleifen 80–87 und 180–188 hydrophobe Aminosäuren (Leu81, Gly82,

Ala85, Leu86, Pro87, Leu182, Ileu183 und Val184) welche die Interaktion zwischen Substrat und

Bindungstasche fördern. Abgesehen von zwei Seitenkettenbindungen von Aminosäuren, Leu81 und

Val184 bzw. Leu182 und Asn84, ist das katalytische Serin nicht verdeckt durch Proteinschlaufen,

sondern frei zugänglich für Lösungsmittel und Substrat. Somit ist keine Grenzflächenaktivierung nötig

für die Ausbildung der lipolytischen Aktivität, lediglich eine Neuorientierung einiger lipophiler

Seitenketten, z.B. Leu81 und Leu182, was als ein „Mini-Deckel“ bezeichnet werden kann, erfolgt vor

der Hydrolyse. Mit Hilfe der zeitbezogenen Fluoreszenz Analytik konnte die Bildung von Enzym-Lipid

Ansammlungen nachgewiesen werden, was bedeutet, dass sich die Cutinasen eher wie Lipasen ohne

Deckel als wie Esterasen verhalten (Carvalho et al. 1999)

Eine rekombinant produzierte F. solani pisi Cutinase zeigte eine optimale Temperatur von 30°C für

die Triolein Hydrolyse und 40°C für die Hydrolyse von p-NPB, wobei der optimale pH für beide bei 8

lag. Die Thermostabilität betrug mit 50% Restaktivität 85 Stunden bei 40°C bzw. 5 min bei 60°C (Chen

S et al. 2008). Bei der Hydrolyse von PET-Filmen zeigte die rekombinante FsC bei 50°C ihre maximale

Aktivität von 1,8 µmol/mL/h. Bei 60°C hingegen verlor sie ihre gesamte Aktivität. Der Einfluss des pH-

Wertes auf die PET Hydrolyse bei 50°C wurde ebenfalls untersucht und zeigte, dass die FsC Aktivität

sich im Bereich von pH 6,5 bis 8,5 nur gering ändert (1,9-1,6 µmol/mL/h), allerdings bei pH 9 auf

0,2 µmol/mL/h absank. Sie besaß somit eine geringe Stabilität im alkalischen Bereich. Die maximal

erreichte Abbaurate lag bei 0,9 µmol/mL/h für die FsC bei 40°C (Ronkvist et al 2009).


Die aufgereinigte Humicola (Thermomyces) insolens Cutinase HiC zeigte ein Molekulargewicht von

20-21 kDa und einen pI von 8. Das hydrolytische Enzym wurde durch PMSF inhibiert, somit ist ein

Serin Bestandteil des aktiven Zentrums. Das pH Optimum für die Hydrolyse von Tributyrat wurde

mittels pH-Stat bestimmt und lag bei 8. Die Cutinase zeigte aber auch bei pH 9 und 10 noch hohe

Aktivitäten (Sandal et al. 1996).

Nachdem verschiedene Substitutionen an dieser Cutinase durch molekularbiologische Methoden

erfolgten, wurden von der rekombinant produzierten Hydrolase weitere Eigenschaften bestimmt. Bei

einem pH Wert von 8 stieg die Hydrolyserate eines PET-Films mit steigender Temperatur von 30 bis

80°C um das 30fache auf 10,6 µmol/mL/h. Bei 90°C sank die Aktivität steil ab auf Null, wahrscheinlich

aufgrund von Denaturierung. Weitere Temperatur-abhängige Filmhydrolyse-Studien zeigten, dass ein

drastischer Anstieg der Hydrolyseaktivität oberhalb von 65°C erfolgte, da diese Temperaturen nahe

der Glasübergangstemperatur des PETs lag (75°C). Die maximale initiale Aktivität der HiC lag bei

13,6 µmol/mL/h bei 80°C und pH 8,5. Die maximale Hydrolyserate bei 70°C lag bei 6,1 µmol/mL/h

(Ronkvist et al. 2009).

Beim Vergleich dieser fünf verschiedenen PET-Hydrolasen wird zunächst deutlich, dass sie aufgrund

der Herkunft, Größe und Klasse in drei verschiedene Gruppen eingeteilt werden können, was in

Tabelle 30 auch schon erfolgt ist. Allerdings gibt es auch deutliche Unterschiede zwischen den

Enzymen, z.B. die optimalen Temperaturen und pH Werte oder die Fähigkeit zur Hydrolyse von

Triglyceriden (FsC und PmC hydrolysieren keine TAGs, HiC und TfH hydrolysieren TAGs). Da diese

Eigenschaften aber aufgrund von enzymatischen Assays bestimmt wurden, sind eine Vielzahl von

möglichen Einflüssen (z.B. verwendetes Substrat, Analytik, Puffer, Enzymmenge u.ä.) vorhanden,

welche zur Verschiebung der Ergebnisse beitragen können. Somit würde eine genauere

Untersuchung der Enzyme unter gleichen katalytischen Bedingungen mehr Klarheit über ihre

Einordnung bringen. Interessanterweise zeigten sich zwischen dem Pilz F. solani f. pisi und dem

Bakterium T. fusca einige Parallelen in Bezug auf die Enzymproduktion. Beide bilden zwei Cutinase-

Isoenzyme, welche sich hinsichtlich spezifischer Hydrolyseeigenschaften unterscheiden. Bei beiden

Organismen besitzen die Isoenzyme die gleiche Anzahl an Aminosäuren, unterscheiden sich

allerdings hinsichtlich der Sequenz im geringen Maße (T. fusca 7%, bei F. solani keine Angabe). Von

deutlich höherem Interesse für die vorliegende Studie war allerdings, dass der Pilz ebenfalls eine

Esterase von 52 kDa produzierte. Da zum damaligen Zeitpunkt, als die Studien zu diesen

eukaryotischen Enzymen erfolgten, die beiden Cutinasen von deutlich höherem Interesse waren,

erfolgten keine weiterführenden Untersuchungen, wie z.B. eine Sequenzierung der Esterase. Die

F. solani f. pisi Esterase unterscheidet sich von der TfCa dadurch, dass diese p-NPB und p-NPP

hydrolysiert, die TfCa hingegen nicht (Purdy und Kolattukudy 1975b, Billig et al. 2010).


Tabelle 32: Kinetische Parameter Km und Vmax bestimmt für verschiedene p-NP Ester für die Hydrolasen TfCa, TfH 1/2 (Chen et al. 2010), PmC

a (Sebastian et al. 1988), PmC

b (Gray et al. 1995), FsC (Purdy und Kolattukudy 1973), FsC 1, FsC 2 und FsE

(Purdy und Kolattukudy 1975b). Die geringsten Km Werte je Enzym sind hervorgehoben, ebenso die höchsten Vmax Werte.

p-

NPEster

TfCa

Km1 Vmax

3

TfH 1/2

Km1

PmCa

Km1 Vmax

2

PmCb

Km1 Vmax

3

FsC

Km1 Vmax

3

FsC 1

Km1 Vmax

3

FsC 2

Km1 Vmax

3

FsE

Km1 Vmax

3

C2 0,27 6100 6,7 5400 68,0 1,5 97 2,3

C4 0,16 8100 0,67/0,51 2,7 77 3,5 1,0 7,5 1,2 5,2 2,0

C6 2,1 18 1,7 8000 8,9 0,46 8,6 0,2 1,7 0,89

C8 0,20 4000 17,6 35 0,21 802000 0,68 3600 8,8 0,17 5,9 0,06 2,2 0,66

C10 39,8 16 1,3 3300 4,8 0,04 3,6 0,01 1,4 0,4

C12 35,5 14 0,17 214000 2,2 3500 5,6 0,01 4,5 0,002 2,1 0,52

C14 22,7 8 1,6 2500 1,3 0,36

C16 45,4 9 0,18 112000 1,0 0,31

C18 2,7 2900 1,0 0,29

1 M x 10

-4

2 µmol/min/ml

3 nmol/min/mg

Für eine bessere Übersicht über die katalytischen Eigenschaften der PET hydrolysierenden Enzyme

und der Esterase aus F. solani f. pisi (FsE) erfolgte die Gegenüberstellung ihrer kinetischen Parameter

bei der p-NP Ester Hydrolyse in Tabelle 32.

Es ist ersichtlich, dass die höchste Reaktionsgeschwindigkeit die P. mendocina Cutinase mit p-NP-

Caprylat aufwies (Gray et al. 1995). Desweiteren zeigten die TfCa und die Cutinase von F. solani

(Purdy und Kolattukudy 1973) ähnliche maximale Geschwindigkeiten gegenüber p-NP-Butyrat bzw. p-

NP-Caproat. Die niedrigsten Geschwindigkeiten wurden mit den drei hydrolytischen Enzymen aus

F. solani durch Purdy und Kolattukudy (1975b) bestimmt. Die beiden Cutinasen zeigten ihre

maximalen Geschwindigkeiten mit p-NP-Acetat als Substrat und die unspezifische Esterase mit p-NP-

Butyrat, analog zur TfCa, aber 4000fach geringer. Die geringsten Km Werte je Enzym sind

hervorgehoben, ebenso die höchsten Vmax Werte. Die geringsten Km Werte zeigten die TfCa mit p-NP-

Butyrat und die Pseudomonas mendocina Cutinase mit p-NP-Laurat. Dabei wird deutlich, dass die

PET-Hydrolasen ihre höchste Affinität gegenüber kurz- und mittelkettigen Estern (C4-C10) besitzen, die

FsE hingegen im langkettigen Bereich. Des Weiteren ist ersichtlich, dass die TfCa die höchste Affinität

gegenüber den p-NP Estern besaß.

Da es aber keinen direkten Zusammenhang zwischen der Hydrolyse von p-NP Estern und PET gibt, ist

die Tabelle 32 nicht aussagekräftig beim Vergleich der PET-Hydrolasen in Bezug auf die PET-

Hydrolyse. Um die kinetischen Daten für die PET-Hydrolyse, auch verschiedener Substrattypen,

vergleichen zu können, müssten die Enzyme unter gleichen Bedingungen bzw. optimalen

Hydrolysetemperaturen und pH-Werten eingesetzt werden. Für die FsC, PmC und HiC erfolgte das


bereits durch Ronkvist et al. (2009), mit der TfCa und den beiden Cutinasen aus T. fusca KW3 wurden

verschiedene Hydrolysestudien durchgeführt, welche im nächsten Kapitel zusammengefasst sind.

3.3 Hydrolyse von PET Substraten durch prokaryotische und eukaryotische Hydrolasen

Es erfolgte die Untersuchung der Hydrolyse von zyklischen PET-Trimeren, unbehandelten PET-Fasern

und einer APET-Folie durch die PET-Hydrolasen aus T. fusca KW3 und weiteren PET-Hydrolasen. Bei

den Enzymen handelte es sich um die rekombinant produzierten Cutinasen 1 und 2 aus T. fusca

WSH03-11 (Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008), die Cutinasen aus F. solani sp. pisi (Chen et al. 2010,

Vertommen et al. 2005) und eine Cutinasepräparation von Novozymes (NS-29061, LN05012). Bis zu

diesem Zeitpunkt wurden die meisten Hydrolysestudien mit der Cutinase aus F. solani sp. pisi

durchgeführt, welche deshalb bei den folgenden Untersuchungen als Vergleich eingesetzt wurde.

Zur Abschätzung der Reinheit der Enzympräparationen wurden Aliquote auf ein SDS Gel aufgetrennt.

Abbildung 65: SDS-PAGE der für die Abbauuntersuchungen eingesetzten Hydrolasen, linkes Gel mit Aktivitätsfärbung, rechtes Gel Aktivitäts- und Coomassie-Färbung. Spur 1: Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3; Spur 2: rekombinante Cutinase 1 von T. fusca WSH03-11 (Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008); Spur 3: rekombinante Cutinase 2 von T. fusca WSH03-11 (Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008); Spur 4: rekombinante Cutinase von F. solani pisi (Chen et al. 2010); Spur 5: Cutinase aus Fusarium solani sp. pisi (Vertommen et al. 2005); Spur 6: Cutinase von Novozymes. Zum Vergleich die Kulturüberstände verschiedener MSV-Medien, Spur 7: Cutin-induzierte Hydrolase aus T. fusca KW3; Spur 8: Suberin-induzierte Hydrolase aus T. fusca KW3; St

1: Spectra™ Multicolor Broad Range Protein Ladder (Fermentas); St

2:

PageRulerTM

Plus Prestained Protein Ladder (Fermentas).

Die Hydrolasen aus T. fusca (Billig et al. 2010, Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008) (Spuren 1-3) sind

aufgrund der Aktivitätsfärbung eindeutig im Gel identifizierbar und die Enzympräparationen zeichnen

sich durch eine hohe Reinheit aus. Die rekombinante Cutinase von F. solani pisi (Chen et al 2010)

(Spur 4) zeigte keine Aktivität und auch keine Proteinbande auf dem Gel. Wahrscheinlich wurde zu

wenig Protein aufgetragen bzw. die Cutinase war nicht aktiv gegenüber dem Substrat der

Aktivitätsfärbung. Die Cutinase aus F. solani sp. pisi (Vertommen et al. 2005) zeigte ebenfalls keine

Aktivität, aber eine Proteinbande (Spur 5), was ebenfalls auf ein Inaktivität des Cutinase gegenüber

St1 1 2 3 4 5 6 St

2 7 8 St

1 1 2 3 4 5 6 St

2 7 8

260 kDa 135 kDa 95 kDa 72 kDa

52 kDa

42 kDa

34 kDa

26 kDa

17 kDa 10 kDa

250 kDa 130 kDa 95 kDa 72 kDa

55 kDa

36 kDa

28 kDa

17 kDa 11 kDa


2-Naphthylacetat hinweist. Beide Enzyme wiesen aber deutliche Aktivitäten mit p-NPB auf. Die

Cutinasepräparation von Novozymes wies eine deutliche Esteraseaktivität im Gel auf (Spur 6).

Aufgrund der detektierten Größe im Gel (ca. 20 kDa) handelt es sich vermutlich um eine Cutinase aus

T. insolens oder F. solani pisi. Zum Vergleich wurden ebenfalls die zellfreien Überstände aus Kulturen

mit Cutin-MSV und Suberin-MSV in Spur 7 und 8 aufgetragen, welche eine Esterase im Bereich von

28 kDa aufweisen, aber ebenfalls noch weitere Proteine.

Nach Auftrag der verschiedenen Enzympräparationen auf PCL Agarplatten wurde die bereits erfolgte

Einordung der PET-Hydrolasen in Cutinasen und Carboxylesterase bestätigt. Die Cutinasen waren in

der Lage, das Biopolymer Cutin abzubauen und ebenfalls PCL, wohingegen die Carboxylesterase diese

beiden Polymere nicht hydrolysierte. Alle Cutinasen zeigten eine Hofbildung auf den PLC-

Agarplatten, hingegen wies die TfCa, eine Carboxylesterase, keinen PCL-Abbau auf (Abbildung 66).

Die rekombinant produzierten TfCa, TfCut1 und TfCut2 aus T. fusca KW3 zeigten dasselbe

Abbauverhalten (Abbildung 66).

Abbildung 66: PCL Abbautest der für die Abbauuntersuchungen eingesetzten Hydrolasen (obere Reihe: Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 (links), rekombinante Cutinase 1 von T. fusca WSH03-11 (Mitte, Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008), rekombinante Cutinase 2 von T. fusca WSH03-11 (rechts, Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008); mittlere Reihe: rekombinante Cutinase von F. solani pisi (links, Chen et al 2010), Cutinase aus F. solani sp. pisi (Mitte, Vertommen et al. 2005), Cutinase von Novozymes (rechts); untere Reihe : rekombinant produzierten Hydrolasen aus T. fusca KW3: Carboxylesterase TfCa (links), Cutinase TfCut1 (Mitte), Cutinase TfCut2 (rechts).


3.3.1 Partielle Hydrolyse von APET-Filmen durch die PET-Hydrolasen

In den nachfolgenden Diagrammen ist die Bildung von Hydrolyseprodukten aus APET-Film durch die

PET-Hydrolasen dargestellt.

Abbildung 67: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit TfCa aus T. fusca KW3.

Abbildung 68: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11

von Chen et al. 2010 und Chen J et al. 2008.

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50 60 70 80

lös

lic

he

Hyd

roly

se

pro

du

kte

(µ

M/g

Su

bs

tra

t)

Inkubationszeit (h)

TPA MHET BHET EMT EBT Summe

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

0 10 20 30 40 50 60 70 80

lös

lic

he

Hyd

roly

se

pro

du

kte

(µ

M/g

Su

bs

tra

t)

Inkubationszeit (h)



Abbildung 69: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinase aus F. solani pisi von

Vertommen et al. 2005.

Abbildung 70: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinase aus F. solani pisi von Chen

et al. 2010.

0

100

200

300

400

500

0 10 20 30 40 50 60 70 80

lös

lic

he

Hyd

roly

se

pro

du

kte

(µ

M/g

Su

bs

tra

t)

Inkubationszeit (h)


0

50

100

150

200

250

300

0 10 20 30 40 50 60 70 80

lös

lic

he

Hyd

roly

se

pro

du

kte

(µ

M/g

Su

bs

tra

t)

Inkubationszeit (h)



Abbildung 71: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinasepräparation von

Novozymes.

Während der drei Tage Inkubation setzte die Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11 die höchste Menge

an löslichen Hydrolyseprodukten vom APET-Film frei (Abbildung 69). Gegenüber der

Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 war dies das 475fache an löslichen Hydrolyseprodukten,

gegenüber den F. solani pisi Cutinasen FsC und FspC waren es das 24fache und 40fache und

gegenüber der eukaryotischen Cutinase-Präparation war es das 114fache an löslichen

Hydrolyseprodukten. Alle PET-Hydrolasen wurden mit der Aktivität von 4 U/ml eingesetzt.

Tabelle 33: Vergleich der freigesetzten Abbauprodukte der PET-Hydrolasen mit APET-Film.

Enzym Temperatur Hydrolyseprodukte (%)

TPA MHET BHET EMT EBT

TfCa 50°C 45 10 0,1 0 45

T. fusca Cutinase 22 60°C 57 42 0,5 0,01 0

FsC1 30°C 0 53 2 8 37

FspC2 30°C 21 78 0,4 0,4 0

Novozymes Cutinase Präparation 30°C 18 82 0 0 0

1 Vertommen et al. 2005

2 Chen et al. 2010

Mit 45% waren Terephthalsäure (TPA) und 1,2-Ethylen-bis-terephthalat (EBT) die

Haupthydrolyseprodukte der Carboxylesterase TfCa, bei der Cutinase FsC waren es mit 53% Mono(2-

Hydroxyethyl)Terephthalat (MHET) und 37% EBT. Die Cutinase setzte als einziges Enzym kein TPA

frei, hingegen aber die höchste Menge an 1,2-Ethylen-mono-terephthalat-mono(2-

hydroxyethylterephthalat) (EMT, 8%) verglichen mit den anderen PET-Hydrolasen. Die

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50 60 70 80

lös

lic

he

Hyd

roly

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pro

du

kte

(µ

M/g

Su

bs

tra

t)

Inkubationszeit (h)



Haupthydrolyseprodukte der Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11 waren mit 57% und 42% TPA und

MHET, ebenso bei FspC mit 78% MHET und 21% TPA. Es wurden nur geringste Mengen an Bis(2-

Hydroxyethylterephthalat) (BHET) freigesetzt. Die Hauptabbauprodukte der Cutinase-Präparation

von Novozymes war MHET mit 82% und TPA mit 18%. Es wurden keine weiteren Produkte detektiert

(Tabelle 33). Die Freisetzung der Hydrolyseprodukte erfolgte über den gesamten

Inkubationszeitraum.

Beim Vergleich der verschiedenen F. solani pisi Cutinase-Präparationen (Abbildung 68, 70), bei denen

jeweils 4 U/ml Esteraseaktivität zum APET-Filmabbau eingesetzt wurden, zeigte sich ein ähnliches

Abbauverhalten in Bezug auf Menge und Verteilung der Hauptabbauprodukte. MHET als

Hauptprodukt wurde mit 53% (Vertommen et al. 2005) und 57% (Chen et al. 2010) für die

eukaryotischen Cutinasen identifiziert. Alle weiteren Hydrolyseprodukte unterschieden sich

allerdings in der freigesetzten Menge bei den beiden Cutinasen. Diese Unterschiede könnten durch

Modifikationen bei der rekombinanten Expression entstanden sein, wie zum Beispiel bei der Codon-

Optimierung, beim Entfernen und Anfügen von Signalpeptiden, durch eine fehlende

posttranslationale Modifikation oder durch eine andere Faltung im Expressionswirt (Vertommen

et al. 2005, Chen et al. 2010, Chen S et al. 2008, Chen J et al. 2008). Von den zuvor für den Abbau von

APET-Film eingesetzten Hydrolasen zeigte die Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11 die höchste

Aktivität. Dies könnte auf die höhere Inkubationstemperatur von 60°C und der damit verbundenen

höheren Beweglichkeit der PET-Ketten auf der Filmoberfläche zurückgeführt werden (Marten et al.

2005). Die gleichen Beobachtungen machten auch Ronkvist et al. 2009, die eine modifizierte

Humicola (Thermomyces) insolens Cutinase bei 70°C mit PET-Filmen inkubierten und dabei die

höchste Aktivität verzeichneten im Vergleich zu einer Pseudomonas mendocina Cutinase bei 50°C

und einer Fusarium solani Cutinase bei 40°C (Ronkvist et al. 2009). Des Weiteren begünstigte die

Lage des aktiven Zentrums der Cutinase direkt an der Oberfläche des Enzyms ebenfalls die

Hydrolyseaktivität mit PET-Filmen (Abbildung 64d). Das aktive Zentrum der Carboxylesterase TfCa

liegt hingegen in einer Bindungstasche und ist somit schwerer zugänglich, besonders für größere

Substrate, wie den APET-Film (Abbildung 64a). Des Weiteren lag die Inkubationstemperatur der TfCa

mit APET-Film bei 50°C und somit 10°C geringer gegenüber der Cutinase, was eine niedrigere

Aktivität der Polymerketten zur Folge hat und somit die Hydrolyseaktivität des Enzyms beeinträchtigt

(Marten et al. 2005). Die eukaryotischen Cutinasen wurden aufgrund ihrer geringeren

Thermostabilität bei 30°C inkubiert, wobei die PET-Ketten des APET-Films noch weniger beweglich

waren und dadurch geringer mit dem aktiven Zentrum wechselwirken konnten.

Nach der Hydrolyse der APET-Filme durch die TfCa und die Cutinase FsC wurde die Oberfläche der

Filme rasterelektronenmikroskopisch analysiert (Abbildung 72). Im Vergleich zur unbehandelten

Kontrolle (A) wies die mit der Carboxylesterase behandelte Oberfläche kleine Löcher auf (B). Der


APET-Film, welcher von der eukaryotischen Cutinase angegriffen wurde, zeigte hingegen einen

großflächigen Abbau (C).

Abbildung 72: Rasterelektronenmikroskopische Analyse der enzymatisch behandelten APET-Film Oberflächen: Unbehandelte Kontrolle (A), Inkubation mit TfCa bei 50°C 74 h (B) und Inkubation mit Cutinase FsC bei 30°C 74 h (C).

Alle bisherigen Studien zur Oberflächenmodifikation durch Mikroorganismen oder Enzyme verglichen

die Oberflächenstrukturen nur mit einer Kontrolle bzw. einer alkalische Oberflächenhydrolyse der

Fasern oder Filme. Diese Hydrolysebehandlungen erfolgten hingegen mit zwei verschiedenen

Enzymen, deren Veränderungen auf der Oberfläche miteinander verglichen werden konnten und

deutliche Unterschiede untereinander, aber auch zu einer alkalischen Hydrolyse aufwiesen

(Abbildung 72, Yoon et al. 2002). Die Ausbildung verschiedener Oberflächenstrukturen, abhängig von

der Behandlung (enzymatisch oder chemisch), wurde bereits in anderen Studien dargelegt. Yoon

et al. wiesen als Erste nach, dass nach der Behandlung von PET-Fasern mit einer PET-Hydrolase die

Faseroberfläche signifikante Oberflächenmodifikationen aufwiesen, welche sich von denen bei einer

NaOH Behandlung deutlich unterschieden (Yoon et al. 2002). Auch Zhang et al. behandelten PET-

Fasern mit Mikroorganismen und einer Lipase und konnten mittels SEM eine deutliche

Oberflächenerosion im Vergleich zu unbehandelten Fasern nachweisen (Zhang et al. 2004). Ähnliche

Ergebnisse wurden auch von Kim und Song 2006 veröffentlicht, die die Oberflächenhydrolyse von

PET-Fasern mit einer Lipase und NaOH verglichen und unterschiedliche Oberflächenstrukturen

nachwiesen. Im Gegensatz dazu konnten bei weiteren Untersuchungen mit PET-Fasern beim

Vergleich der enzymatischen und basischen Hydrolyse bei der enzymatischen Behandlung keine

Veränderung der Oberflächenstruktur im Vergleich zur Kontrolle nachgewiesen werden (Eberl et al.

2008, Brueckner et al 2008). Diese Beobachtungen wurden auf eine besonders faserschonende und

minimale Oberflächenmodifikation zurückgeführt. Es könnte allerdings auch auf eine zu geringe

Inkubationszeit oder Enzymmenge hinweisen, womit die möglichen Auswirkungen der

enzymatischen Behandlung noch nicht für die Oberflächenanalyse sichtbar waren. Feuerhack et al.

wiesen, ähnlich zu allen anderen Autoren, ebenfalls eine leichte Oberflächenveränderung nach der

enzymatischen Hydrolyse der PET-Fasern durch eine Enzympräparation von T. fusca KW3 nach

(Feuerhack et al 2008).

A B C


Die Untersuchung der veränderten Oberflächenstrukturen von PET-Filmen erfolgte erstmals durch

Donelli et al. 2009 und Ronkvist et al. 2009. Dabei konnten Donelli et al. keine Veränderungen der

Oberflächenstruktur nach der enzymatischen Hydrolyse nachweisen, hingegen aber deutliche

Veränderungen nach der Hydrolyse mit NaOH (Donelli et al. 2009). Dabei handelte es sich allerdings

um einen PET-Film mit einer Kristallinität von 34,8%, welcher sich im Gegensatz zu amorphen PET-

Filmen für enzymatische Hydrolysen nicht eignet. Diese Tatsache bestätigte Ronkvist et al. bei der

enzymatischen Oberflächenhydrolyse eines gering-kristallinen PET-Films mit einer Kristallinität von

7,0% ± 0,5%. Während der verwendete kristalline PET-Film (35,0% ± 0,5%) kaum von den Enzymen

hydrolysiert wurde, konnten mit dem amorphen PET-Film deutliche Oberflächenveränderungen

mittels SEM nachgewiesen werden (Ronkvist et al. 2009). Bei einem zeitlichen Vergleich der

hydrolysierten Oberflächenstrukturen nach 12, 48 und 96 Stunden zeigte sich eine deutliche

Zunahme an porösen Strukturen. Die nachgewiesenen Strukturen gleichen allerdings nicht den

Oberflächenstrukturen aus der Abbildung 72 nach 74 Stunden Inkubation. Mögliche Erklärungen sind

zum Einen ein unterschiedliches Hydrolyseverhalten der verschiedenen Enzyme und zum Anderen

die Variationen bei den Inkubationstemperaturen (HiC bei 70°C (Ronkvist et al. 2009), TfCa bei 50°C

und FsC bei 30°C). Aus diesem Grund waren die Polymerketten des Films unterschiedlich mobil und

nur bei hohen Temperaturen besser hydrolysierbar (Marten et al. 2005).

Bei den Abbauuntersuchungen wurden neben den erwarteten PET Monomeren TPA, MHET und

BHET auch zwei weitere Abbauprodukte mittels RP-LC-MS detektiert. Bei den Produkten handelte es

sich um 1,2-Ethylen-mono-terephthalat-mono(2-hydroxyethylterephthalat) (EMT) und 1,2-Ethylen-

bis-terephthalat (EBT), zwei weitere Dimere des PET. Die Strukturen, die dazugehörigen molaren

Massen und die MS-Spektren der Hydrolyseprodukte sind nachstehend zusammengefasst.

Vertommen et al. hatten 2005 auch zwei unbekannte Hydrolyseprodukte detektiert, denen sie keine

Struktur zuordnen konnten und bezeichneten sie als Produkt A und B (Rt 18,1 und 18,7 min). Sie

vermuteten, dass es sich dabei um Dimere des PET handelte (Vertommen et al. 2005). Aufgrund der

übereinstimmenden Retentionszeiten handelt es sich bei den beiden unbekannten Dimeren

wahrscheinlich um die identifizierten Produkte EMT und EBT.


Abbildung 73: Chromatogramm der HPLC Analyse des enzymatischen APET Abbaus durch die TfCa.

EMT

EBT

TPA

MHET

BHET

10 15 20

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

AU

5 25

Retentionszeit (min)

1.50

UV

(2

41

nm

)

(24

1n

m)


121.0

164.9

262.9 284.9

352.9

413.1

0

2

4

6

Intensity x 104

100 150 200 250 300 350 400 450 m/z

O

O

COH

OH

TPA (MG: 166,1)

120.9

208.8

306.9

440.9

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Intensity x 106

100 150 200 250 300 350 400 450 m/z

O

O

C

OH

OOH

MHET (MG: 210,17)

120.9

252.9

0

1

2

3

4

Intensity x 105

125 150 175 200 225 250 275 300 325 350m/z

O

O

CO

OH

OOH

BHET (MG: 254,24) 357.0

0

1

2

3

4

5

Intensity x 105

100 150 200 250 300 350 400 450 m/z

O

OO

O

O

O

OH

OH

EBT (MG: 358,27)

401.0

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Intensity x 106

100 150 200 250 300 350 400 450 m/z

O

OH

OO

O

O

O

O

OH

EMT (MG: 402,34)

Abbildung 74: MS-Spektren der Hydrolyseprodukte: TPA (m/z: 121,0; 164,9; 352,9), MHET (m/z: 120,9; 208,8; 440,9), BHET

(m/z: 120,9; 252,9), EBT (m/z: 357,0) und EMT (m/z: 401,0).


3.3.2 Partielle Hydrolyse von PET-Fasern durch die PET-Hydrolasen

In den nachfolgenden Diagrammen ist die Bildung von Hydrolyseprodukten aus PET-Fasern durch die

PET-Hydrolasen dargestellt.

Abbildung 75: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit TfCa aus T. fusca KW3.

Abbildung 76: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit der Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11

von Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008.

0

25

50

75

100

125

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Inkubationszeit (h)



Abbildung 77: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit der Cutinase aus F. solani pisi von

Vertommen et al. 2005.

Abbildung 78: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit der Cutinase aus F. solani pisi von Chen

et al. 2010.

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25

50

75

100

125

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30

40

50

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Inkubationszeit (h)



Abbildung 79: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit der Cutinasepräparation von Novozymes.

Die Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11 setzte während der Inkubation mit PET-Fasern die höchsten

Mengen an Hydrolyseprodukten frei. Verglichen mit der TfCa war das nach dreitägiger Inkubation das

2,75fache, mit der Cutinase-Präparation von Novozymes das 2,3fache und mit den beiden Cutinasen

aus F. solani pisi FsC und FspC das 3,8fache und 6,5fache.

Tabelle 34: Vergleich der freigesetzten Abbauprodukte der PET-Hydrolasen mit PET-Fasern.

Enzym Temperatur Hydrolyseprodukte (%)


TfCa 50°C 67 31 0 0,3 2

T. fusca Cutinase 22 60°C 78 22 0 0 0

FsC1 30°C 1 84 2 1 12

FspC2 30°C 14 69 0 18 0



2 Chen et al. 2010

Dabei produzierte TfCa während der gesamten Inkubation Abbauprodukte, welche durch

Umkehrphasen HPLC nachgewiesen wurden (Tabelle 34). Die Cutinase aus F. solani pisi hingegen

setzte die meisten Hydrolyseprodukte in den ersten 24 Stunden der Inkubation frei. Mit 67% und

31% waren TPA und MHET die Haupthydrolyseprodukte der TfCa, wobei die Menge an TPA während

der gesamten Behandlung stetig anstieg, aber die Menge an MHET nach 24 Stunden bis 72 Stunden

Inkubation konstant blieb. Die Haupthydrolyseprodukte der FsC waren MHET (84%) und EBT (12%).

Im Gegensatz zum APET-Film Abbau wurden durch die FsC von den PET-Fasern geringe Mengen an

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

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M/g

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Inkubationszeit (h)



TPA freigesetzt. Hingegen wurde das während der ersten 24 Stunden gebildete EBT während der

weiteren Reaktionszeit wieder abgebaut.

Die beiden Cutinasen Cutinase 2 aus T. fusca und FspC aus F. solani zeigten bei der enzymatischen

Hydrolyse der höherkristallinen PET-Fasern unterschiedliche Hauptprodukte und Aktivitäten

gegenüber den Fasern. Dabei produzierten beide Enzyme während der gesamten Reaktionszeit

Abbauprodukte, welche durch Umkehrphasen HPLC nachgewiesen wurden (Tabelle 34). Mit 78% und

22% waren TPA und MHET die Abbauprodukte der Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11, wobei die

Menge an TPA während der gesamten Behandlung stetig anstieg, aber die Menge an MHET nach

24 Stunden bis zum Ende der Inkubation konstant blieb. Die Haupthydrolyseprodukte der

eukaryotischen Cutinase waren MHET (69%) und EBT (18%). Ein ähnliches Verhalten zeigte auch die

F. solani pisi Cutinase FsC mit PET-Fasern und eine Esterase aus Penicillium citrinum, die

hauptsächlich MHET und BHET und nur geringe Mengen an TPA von PET-Textilien freisetzte, was

bedeuten könnte, dass eukaryotische hydrolytische Enzyme ähnliche Abbaumechanismen besitzen

(Liebminger et al. 2007). Vergangene Studien haben ebenfalls bestätigt, dass die eukaryotische

Cutinase aus F. solani pisi nur geringe Aktivitäten gegenüber höher kristallinen PET-Filmen aufweist

(Vertommen et al. 2005). Die eukaryotische Cutinase setzte das 5fache an löslichen Produkten

während der Inkubation mit niederkristallinen APET-Filmen (4%) frei im Vergleich zur Inkubation mit

höherkristallinen PET-Fasern (Abbildung 68, 77), was mit bereits veröffentlichten Studien zum

Abbauverhalten dieser Cutinase in Bezug auf die Kristallinität übereinstimmt (Müller et al. 2005,

Vertommen et al 2005). Der Abbau von aromatischen Polyester wird durch die geringe Beweglichkeit

der Polymerketten im kristallinen Bereich behindert (Marten et al. 2003, 2005).

Die Hauptabbauprodukte der Cutinase-Präparation von Novozymes waren MHET (57%) und EBT

(24%). Beim Vergleich der freigesetzten Hydrolyseprodukte über die Reaktionszeit der Cutinase-

Präparation mit den eukaryotischen Cutinasen (Vertommen et al. 2005, Chen et al. 2010) zeigte sich,

dass die hydrolytische Aktivität für alle drei Enzyme ähnlich war. Aus diesen Beobachtungen kann

geschlussfolgert werden, dass in der Enzympräparation von Novozymes eine eukaryotische Cutinase

enthalten sein könnte.

3.3.3 Hydrolyse von PET-Trimeren durch die PET-Hydrolasen

In den nachfolgenden Diagrammen ist die Bildung von Hydrolyseprodukten aus CTR durch die PET-

Hydrolasen dargestellt.


Abbildung 80: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit TfCa aus T. fusca KW3.

Abbildung 81: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase 1 aus T. fusca

WSH03-11 von Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008.

0

5000

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15000

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Inkubationszeit (h)



Abbildung 82: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase 2 aus T. fusca

WSH03-11 von Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008.

Abbildung 83: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit rekombinanter TfCut1.

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Inkubationszeit (h)



Abbildung 84: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit rekombinanter TfCut2.

Abbildung 85: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase aus F. solani pisi von Vertommen et al. 2005.

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Inkubationszeit (h)



Abbildung 86: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase aus

F. solani pisi von Chen et al. 2010.

Abbildung 87: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase-Präparation

von Novozymes.

0

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Inkubationszeit (h)


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15000

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0 10 20 30 40 50 60 70 80

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Inkubationszeit (h)



Beim Vergleich wird deutlich, dass die bakterielle Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11 die höchste

Menge an Hydrolyseprodukten freisetzte. Im Vergleich zu den PET-Hydrolasen TfCa, T. fusca Cutinase

1, rTfCut1, rTfCut2, FsC, FspC und der Novozymes Cutinase Präparation war das das bis zu 1.4fache.

Es ist auch ersichtlich, dass alle PET-Hydrolasen mit den zyklischen Trimeren einen ca. 100fach

höheren Abbau erzielten als mit den beiden längerkettigen Substraten.

Tabelle 35: Vergleich der freigesetzten Abbauprodukte der PET-Hydrolasen mit PET-Trimeren.

Enzym Konz. Temperatur Hydrolyseprodukte (%)


TfCa 40 U

40 U

40 U

50°C 41 36 16 8 0



rTfCut1 39 U

58 U

60°C 11 72 17 0 0

rTfCut2 60°C 18 62 16 4 0

FsC1 40 U

40 U

40 U

30°C 3 61 34 2 0

FspC2 30°C 6 76 17 1 0



2 Chen et al. 2010

TfCa setzte TPA (41%), MHET (36%) und BHET (16%) als Hauptabbauprodukte frei, hingegen

produzierte die Cutinase FsC 61% MHET, 34% BHET und geringe Mengen von EMT und TPA (Tabelle

35). Der Großteil der Hydrolyseprodukte wurde von den Enzymen nach 24 Stunden Reaktion

freigesetzt. Die eukaryotische Cutinase FspC setzte die Hydrolyseprodukten über 72 Stunden

Reaktionszeit frei. Hingegen produzierte die T. fusca Cutinase 2 die höchste Menge an

Hydrolyseprodukten in 16 Stunden Inkubation und die T. fusca Cutinase 1 bereits in 2 Stunden. Diese

Werte wurden auch für den Vergleich der freigesetzten Hydrolyseprodukte in Tabelle 35 verwendet.

Die Hauptprodukte der T. fusca Cutinase 2 waren MHET (68%) und BHET (20%). Bei der T. fusca

Cutinase 1 waren es 68% MHET und 13% BHET und bei der FspC 76% MHET und 17% BHET. Trotz der

unterschiedlichen Inkubationstemperaturen lagen die Konzentrationen der freigesetzten

Hydrolyseprodukte in einem ähnlichen Bereich, was mit der Struktur der Trimere und der daraus

folgenden Unabhängigkeit gegenüber der Inkubationstemperatur begründet werden kann. Die

Beweglichkeit langer Polymerketten wird beeinflußt durch die Inkubationstemperatur und somit ist

der enzymatische Abbau dieser Polymerketten mit steigender Inkubationstemperatur deutlich höher

(Marten et al. 2005). Die zyklischen PET-Trimere sind Oligomere, welche eine größere Oberfläche

besitzen und damit leichter zugänglich sind für hydrolytische Angriffe. Somit ist der enzymatische

Abbau von CTR abhängig von der zur Verfügung stehenden Oberfläche und weniger von der

Inkubationstemperatur. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die beiden Cutinasen der


untersuchten T. fusca Stämme in der Lage sind, PET abzubauen, was mit bereits veröffentlichen

Untersuchungen übereinstimmt (Müller et al. 2005, Eberl et al. 2008, Eberl et al. 2009).

Beim Vergleich der Cutinase FsC und FspC aus F. solani pisi (Vertommen et al. 2005, Chen et al. 2010)

zeigte sich, dass auch hier gute Übereinstimmungen bezüglich der Menge der Hydrolyseprodukte

und der Verteilung der Hauptprodukte vorliegen. Die Hauptabbauprodukte der Cutinasepräparation

von Novozymes waren MHET mit 70% und BHET mit 20% (Abbildung 87). Beim Vergleich des Abbaus

der Cutinasepräparation mit den eukaryotischen Cutinasen (Vertommen et al. 2005, Chen et al.

2010) zeigte sich, dass sie ähnliche Produkte auch für alle drei Substrate freisetzten. Diese

Beobachtung bestätigt, dass in der Enzympräparation von Novozymes wahrscheinlich ebenfalls eine

eukaryotische Cutinase enthalten ist.

Die Cutinase aus H. insolens DSM 1800 hydrolysierte zyklische PET-Trimere unter Freisetzung von

BHET, MHET und TPA (Hooker et al. 2003). Bei der Studie des Einflusses der Partikelgröße der CTR auf

ihre Abbaubarkeit zeigte sich, dass kleinere Partikel mit einer größeren Oberfläche schneller

abgebaut wurden als größere. Der Abbau wurde von der zur Verfügung stehenden Oberfläche

stärker beeinflusst als von der Kristallinität des PET (Figueroa et al. 2006). Somit wäre es möglich, die

Hydrolyseraten der beiden verwendeten Enzyme noch zu steigern, indem statt der verwendeten

grobdispersen Partikel kleinere mit einer größeren Oberfläche eingesetzt werden würden.

Die rekombinanten Hydrolasen aus T. fusca KW3 zeigten ähnliche Hydrolyseeigenschaften. Im

Gegensatz zu den anderen Enzymen setzten die Enzyme die Hydrolyseprodukte bereits nach 8

Stunden Inkubation frei. Das Hauptprodukt war MHET mit 72% (rTfCut1) bzw. 62% (rTfCut2) und TPA

mit 11% (rTfCut1) bzw. 18% (rTfCut2). BHET als Produkt wurde mit 17% (rTfCut1) und 16% (rTfCut2)

freigesetzt. Die beiden Cutinasen setzten nur 3% EMT (rTfCut2) oder gar kein EMT (rTfCut1) frei. Die

Hydrolyseaktivität unterschied sich nur in der Freisetzung von TPA, wobei die rTfCut2 während der

gesamten Reaktion TPA freisetzte und die rTfCut1 nur in den ersten 4 Stunden (Abbildung 86, 87). Im

Vergleich dazu zeigten die Cutinase 1 und 2 aus T. fusca WSH03-11 deutlichere Unterschiede bei der

Freisetzung der Hydrolyseprodukte aus CTR (Abbildung 81, 82). Dies könnte auf einen größeren

Unterschied zwischen den beiden Isoenzymen aus T. fusca WSH03-11 hinweisen im Vergleich zu den

beiden Cutinasen aus T. fusca KW3.

Die mit den verschiedenen Hydrolasen erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 36 zusammengefasst. Es

zeigte sich, dass alle Enzyme die drei verschiedenen Substrate hydrolysierten. Das

Haupthydrolyseprodukt war in den meisten Fällen MHET, gefolgt von TPA und BHET. Für jedes PET-

Substrat sind in der Tabelle die beiden Hauptprodukte blau unterlegt. Dabei konnte kein direkter

Zusammenhang zwischen den Hydrolasen und den freigesetzten Produkten nachgewiesen werden.

Aufgrund der ähnlichen katalytischen Triade aller Hydrolasen sind ähnliche hydrolytische


Eigenschaften der Enzyme gegenüber einem identischen Substrat nicht überraschend. Dies bezieht

sich nur auf den Abbau von PET. Die Enzyme hydrolysierten hingegen mit unterschiedlicher Effizienz

den Biopolyester Cutin, wobei nur die Cutinasen aktiv gegenüber dem Biopolyester waren.

Die aktivste Hydrolase für den hydrolytischen Abbau aller drei Substrate war die Cutinase 2 aus

T. fusca WSH03 (Chen S et al. 2008, Chen J et al. 2008, Chen et al. 2010). T. fusca Cutinase 2 setzte

aus den CTR 27,5 mM Produkte/g Substrat frei, aus dem APET-Film 9,5 mM Produkte/g Substrat und

aus den PET-Fasern 0,3 mM Produkte/g Substrat.

Tabelle 36: Vergleich der Abbauprodukte der PET Hydrolasen mit den drei PET Substraten. Die beiden Hauptprodukte des Enzyms sind blau unterlegt.

Enzym Konz. Substrat Temp. Lösliche Hydrolyseprodukte (µM/g Substrat)

TPA MHET BHET EMT EBT Gesamt

TfCa 40 U

CTR

50°C 9924 9189 3988 1664 0 24765

rTfCut1 39 U

58 U

60°C 1810 10932 2746 0 0 15064

rTfCut2 60°C 2864 9889 2594 539 0 15886

T. fusca Cutinase 1 40 U

40 U

40 U

40 U

40 U

60°C 1410 14770 2872 2539 0 21591

T. fusca Cutinase 2 60°C 3175 18820 5488 0 0 27483

FsC1 30°C 604 11890 6557 342 0 19393

FspC2 30°C 1509 18862 4238 163 0 24772

Novozymes Cutinase

Präparation

30°C 588 14590 4139 0 1393 20710

TfCa

40 U APET

50°C 9 2 0.02 0 9 20

Cutinase 2 60°C 5432 4013 47 1 0 9493

FsC1 30°C 0 214 8 33 149 404

FspC2 30°C 50 186 1 1 0 239

Novozymes Cutinase

Präparation

30°C 15 68 0 0 0 83

TfCa

40 U Fasern

50°C 79 38 0 0.3 2 120

Cutinase 2 60°C 258 73 0 0 0 331

FsC1 30°C 1 72 2 1 10 86

FspC2 30°C 7 36 0 9 0 51

Novozymes Cutinase

Präparation

30°C 23 83 6 0 35 146


2 Chen et al. 2010

Die Carboxylesterase TfCa zeigte eine hohe Hyrolyserate beim Einsatz zur CTR Hydrolyse, hingegen

nicht bei der Hydrolyse der PET-Fasern oder des PET-Films. Diese Spezifität zeichnet die

Carboxylesterase für die Hydrolyse von kurzkettigen PET Substraten als besser geeignet aus.


Hooker et al. 2003 zeigten bei ihren hydrolytischen Studien zum CTR Abbau durch eine eukaryotische

Cutinase, dass bei Einsatz einer genügend großen Menge des Enzyms CTR vollständig zu TPA

hydrolysiert wird. Vergleichende Studien wurden dazu mit rTfCa und rTfCut2 mit verschiedenen

Enzymkonzentrationen durchgeführt.

In der nachstehenden Tabelle sind die Enzymaktivitäten mit p-NPB als Substrat der beiden Enzyme

bei den jeweiligen Protein-Konzentrationen zusammengefasst.

Tabelle 37: Proteinkonzentration der eingesetzten Enzyme und die dazugehörigen p-NPB-Aktivitäten in den Ansätzen des Abbauversuchs.

Protein

(µg/ml)

rTfCa

(U/ml)

rTfCut2

(U/ml)

5 4 536 648

10 9 072 1 296

50 45 360 6 481

75 68 040 9 722

100 90 720 12 962

250 226 800 32 405

Abbildung 88: Effekt der rTfCa Konzentration auf die Hydrolyse von PET-Trimeren (Reaktionszeit 4 Stunden).


Abbildung 89: Effekt der rTfCut2 Konzentration auf die Hydrolyse von PET-Trimeren (Reaktionszeit 4 Stunden).

Die eingesetzten Enzymaktivitäten mit p-NPB der rTfCa und rTfCut2 unterschieden sich um den

Faktor 10.

Beim Vergleich der beiden Diagramme wird sichtbar, dass beide Enzyme mit zunehmender

Enzymkonzentration MHET als Hauptprodukt freisetzten. TfCa bildete während allen Inkubationen

bei einer Reaktionszeit von 4 bzw. 8 Stunden kein EBT und TPA nur in geringen Mengen, die aber mit

zunehmender Enzymkonzentration und Inkubationsdauer zunehmen (Abbildung 88 und 90). Dies

bestätigte die zuvor durchgeführte Hydrolyse der CTR durch die TfCa über 74 Stunden. Die

Freisetzung der TPA erfolgte über den gesamten Reaktionszeitraum und die Konzentration von

9,9 mM TPA/g Substrat wurde erst am Ende der Reaktion nachgewiesen. Als zweites Hauptprodukt

setzte die Esterase bei den Ansätzen mit 5, 10, 50 und 75 µg/ml Enzym EMT frei, bei den Ansätzen

mit 100 und 250 µg/ml BHET und EMT in annähernd gleichen Mengen. Mit zunehmender

Enzymmenge und Inkubationsdauer stieg die freigesetzte Menge an MHET, BHET und TPA,

wohingegen die freigesetzte Menge an EMT mit der zunehmenden Enzymmenge und

Inkubationsdauer sank. Die maximale Freisetzung an Hydrolyseprodukten wurde bei den Ansätzen

mit 50 µg/ml Enzym und 4 Stunden Inkubation mit 54,3 mM/g Substrat detektiert, wobei bei den

Ansätzen mit den höheren Enzymkonzentrationen die Mengen an freigesetzten Hydrolyseprodukten

stagnierten. Die TfCut2 zeigte ähnliche Hydrolyse-Eigenschaften wie die Esterase, obwohl nur 1/10

der p-NPB Aktivität eingesetzt wurde. Ein deutlicher Unterschied zur TfCa war, dass mit 5 und

10 µg/ml auch EBT als Hydrolyse-Produkt freigesetzt wurde, welches bei höheren

Enzymkonzentrationen direkt weiter hydrolysiert wurde (Abbildung 89 und 91). Des Weiteren konnte

für die Cutinase nachgewiesen werden, dass mit zunehmender Enzymkonzentration die Freisetzung

an TPA steigt. Die maximal freigesetzte Menge an Hydrolyse-Produkten mit 49,4 mM/g Substrat

wurde mit 250 µg/ml Enzym und 4 Stunden Inkubationszeit detektiert. Wie bei TfCa war auch bei


TfCut2 MHET das Haupthydrolyseprodukt bei allen Enzymkonzentrationen. Es erfolgte eine Zunahme

der MHET Menge bei den Enzymkonzentrationen von 5-50 µg/ml und eine gleichbleibend

freigesetzte Menge an MHET bei den höheren Enzymkonzentrationen. Mit steigender

Enzymkonzentration bis 50 µg/ml stieg die freigesetzte Menge an EMT an und sank bei höheren

Enzymkonzentrationen ab. Hingegen stieg die freigesetzte Menge an TPA und BHET mit

zunehmender Enzymkonzentration.

Abbildung 90: Effekt der Reaktionszeit auf die Hydrolyse von PET-Trimeren mit rTfCa.

Abbildung 91: Effekt der Reaktionszeit auf die Hydrolyse von PET-Trimeren mit rTfCut2.

Mit beiden Enzymen, der Carboxylesterase TfCa und der Cutinase TfCut2, konnte bei höheren

Enzymkonzentrationen (≥ 50 µg/ml) keine weitere Freisetzung der Hydrolyseprodukte detektiert

werden. Es wurde jedoch eine Verschiebung der Produktmengen zueinander festgestellt. Bei beiden

Enzymen stieg die Freisetzung an TPA mit steigender Proteinkonzentration, allerdings konnte kein


Umsatz mit 100% TPA als Produkt erreicht werden, wie es Hooker et al. 2003 beschrieben hat. Dies

könnte an der unterschiedlichen Herstellung der CTR-Suspension liegen. Bei Hooker et al. wurden die

CTR zunächst in Dioxan gelöst und anschließend eine Suspension mit Puffer hergestellt, dagegen

wurden die zyklischen Trimere für die Hydrolyse durch die PET-Hydrolasen direkt in die Pufferlösung

gegeben. Durch die CTR-Stammlösung in Dioxan entstanden beim Verdünnen mit Puffer eine

Suspension mit sehr kleinen Partikeln, was eine große Oberfläche der CTR zur Folge hatte, die für die

Hydrolyse durch die Cutinase von Vorteil war (Figueroa et al. 2006). Des Weiteren war die

eingesetzte CTR Konzentration und die Enzymkonzentration bei Hooker geringer (0,74 mM CTR,

Enzymkonzentration 75-200 LU/ml) im Vergleich zur Trimer Hydrolyse (52,1 mM CTR,

Enzymkonzentration rTfCa 4500-226800 p-NPB-U/ml bzw. rTfCut2 650-32400 p-NPB-U/ml). Sie

wiesen nach, dass nach vollständiger Hydrolyse der CTR das vorhandene MHET weiter zu TPA

hydrolysiert wurde und somit eine vollständige Hydrolyse der CTR zu TPA erfolgte (Hooker et al.

2003). Die PET-Trimere lagen für die enzymatische Hydrolyse hingegen im Überschuss vor. Somit

erfolgte zunächst die Spaltung der Trimere zu Dimeren, jedoch nicht die vollständige Hydrolyse zu

TPA, solang noch genügend Substrat (CTR) zur Verfügung stand.

In den erfolgten Studien konnte gezeigt werden, dass T. fusca neben den beiden PET-

hydrolysierenden Cutinasen Tfu_0882 und Tfu_0883 (BTA1 und BTA2, TfCut1 und TfCut2, Cutinase 1

und 2) auch eine PET-hydrolysierende Carboxylesterase bildet. Somit wurde die Behauptung von Hu

et al. 2010, dass T. fusca nur zwei Enzyme produziert, die synthetische Polyester abbauen, widerlegt.

Da die PET-hydrolysierenden Enzyme verschiedenen EC-Klassen (EC 3.1.1.1 und EC 3.1.1.3)

zugeordnet sind, unterstützt die Entdeckung die Auffassung, dass aufgrund der EC-Klasse kein

Aufschluss über die hydrolytischen Eigenschaften von Enzymen möglich ist (Sinsereekul et al. 2010,

Eberl et al. 2008). Somit ist die Einordnung der Enzyme in Klassen aufgrund ihrer allgemeinen

hydrolytischen Eigenschaften gegenüber einem Substrat nicht aussagekräftig, da meist mehr als ein

Substrat durch das Enzym umgesetzt wird. Vernünftiger wäre es, die Zuordnung der Enzyme

aufgrund struktureller Eigenschaften vorzunehmen, wie es bereits für die lipolytischen Enzyme durch

Hausmann und Jaeger (2010) erfolgte.

In den vergangenen Jahren erfolgten einige Studien zur näheren Untersuchung der Mechanismen bei

der Hydrolyse von PET durch Hydrolasen (Eberl et al. 2008, Sinsereekul et al 2010, Hu et al. 2010,

Donelli et al. 2010). Es ist noch nicht eindeutig geklärt, ob es Unterschiede bezüglich der Hydrolyse

zwischen den Enzymgruppen der Cutinasen, Lipasen oder Carboxylesterasen gibt oder ob die

Hydrolyse bei allen ähnlich abläuft. Bei den in dieser Arbeit durchgeführten Studien baute die TfCa

bevorzugt kleine PET Substrate, in Form von CTR, ab. Die Cutinasen, besonders die Cutinasen aus

T. fusca, wiesen gegenüber allen PET Substraten eine hohe Aktivität auf. Diese Hydrolyse-

eigenschaften sind von den beiden Enzymgruppen bereits gegenüber den p-NP Estern bekannt.


Grund dafür ist die Konformation bzw. Struktur des aktiven Zentrums der Enzyme. Bei der Cutinase

liegt das aktive Zentrum an der Proteinoberfläche und ist leicht zugänglich für kurz- und langkettige

Substrate. Das aktive Zentrum der Carboxylesterase liegt in einer Bindungstasche bzw. Spalte und ist

zwar zugänglich für kurzkettige Substrate, aber nicht für langkettige. Diese Beobachtungen

bestätigen auch die SEM Aufnahmen der APET-Filme nach der hydrolytischen Behandlung mit den

beiden Enzymen. Der APET-Film, inkubiert mit TfCa, wies nur kleine, lochförmige

Oberflächenveränderungen auf. Nach der Inkubation des APET-Films mit der Cutinase wies dieser

großflächige Abbauspuren auf.

Die Temperaturabhängigkeit des PET Abbaus konnte ebenfalls für langkettige Substrate bestätigt

werden (APET-Film und Fasern). Die Inkubationstemperatur hatte einen Einfluss auf den Abbau des

APET-Films, da aufgrund der höheren Temperatur die Polymerketten mobiler waren und besser mit

dem aktiven Zentrum wechselwirken konnten. Die eukaryotischen Cutinasen aus F. solani pisi,

inkubiert bei 30°C, zeigten eine geringere hydrolytische Aktivität gegenüber dem APET-Film und PET-

Fasern als die Cutinasen aus T. fusca, inkubiert bei 60°C. Bei den kurzkettigen Substraten wie den

PET-Trimeren hatte die Inkubationstemperatur einen geringeren Einfluss auf die Hydrolyse. Bei der

Hydrolyse der CTR ist die für die Hydrolyse zur Verfügung stehende Oberfläche wichtiger.

Zusammenfassend können für den durchgeführten PET Abbau folgende Schlussfolgerungen gezogen

werden. Langkettige PET Substrate werden mit höherer Effizienz bei hohen Inkubationstemperaturen

und geringer Kristallinität und bevorzugt von Cutinasen abgebaut. Bei kurzkettigen Substraten ist für

den hydrolytischen Abbau die Partikelgröße des Substrats von Bedeutung. Die Inkubations-

temperatur ist bei den kurzkettigen Substraten nur abhängig vom hydrolysierenden Enzym. Ein

Abbau der kurzkettigen PET-Substrate kann sowohl durch die Carboxylesterase, als auch durch die

Cutinasen erfolgen.

Ausblickend muss für weitere Untersuchungen der Kinetik der PET Hydrolysen eine PET-spezifische

Aktivitätsbestimmung mit einer schnellen und einfachen Auswertung ausgearbeitet werden, um die

verschiedenen PET-Hydrolasen zu testen. Für die PET-spezifische Aktivitätsbestimmung wird ein

kurzkettiges PET-ähnliches Substrat benötigt, bei dem ein genauer Umsatz bestimmt werden kann,

dass heißt, wenn 1 mol Produkt detektiert wird, muss daraus folgen, dass 1 mol Substrat verbraucht

bzw. umgesetzt wurde. Da die CTR aus mehreren Molekülen TPA bestehen, ist die direkte Zuordnung

der gebildeten Hydrolyseprodukte so nicht möglich. Die Bedingungen für die Anwendung eines

Substrats für die Aktivitätsbestimmung ist entweder

a) es wird während der Hydrolyse nur ein Molekül TPA pro einem Molekül Substrat freigesetzt

(mögliches Substrat BETEB bzw. 3PET)

oder wenn mehrere Moleküle TPA vorhanden sind


b) ein Molekül TPA pro einem Molekül Substrat muss gesondert markiert sein und somit wird

nur dieses markierte Molekül mit einer geeigneten Methode detektiert (beispielsweise

Isotopenmarkiert (Deuterium), Fluoreszenzmarker oder ähnliches).

Eine andere Möglichkeit der Analytik wäre der Nachweis eines komplexierten Substanzmoleküls nach

der Hydrolyse des CTR-Rings. Durch die Komplexierung dieser Substanz im Inneren des CTR-Rings ist

sie nicht nachweisbar. Erst bei der Hydrolyse wird sie freigesetzt und kann mit einer spezifischen

Nachweismethode detektiert werden. Für diese Methode wird allerdings ein deutlich höherer

Arbeitsaufwand benötigt, da bisher in der Literatur keine Substanz bekannt ist, die mit CTR

komplexiert.

Zusammenfassung 165

4 Zusammenfassung

Der Actinomycet T. fusca KW3, isoliert aus Kompost, bildete während der Kultivierung im

Mineralsalz-Spurenelement-Vitamin-Minimalmedium nach Zusatz von PET-Fasern eine 52 kDa

Carboxylesterase (TfCa), welche effizient zyklische PET-Trimere (CTR) hydrolysiert. Die TfCa besitzt

einen pI von 4.8, eine Substratspezifität gegenüber kurzkettigen p-Nitrophenyl-Estern und wird durch

Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Tosyl-L-Phenylalanin-Chloromethylketon (TPCK) in der

Aktivität gehemmt. Die Carboxylesterase hydrolysiert kein Cutin oder Poly-ε-caprolacton (PCL). CTR

hingegen wurden durch die TfCa mit einem Km von 0,5 mM und einer Vmax von 9,3 µmol/min/mg bei

optimalen Bedingungen (60°C, pH 6) hydrolysiert. Das aktive Zentrum der Carboxylesterase besteht

aus den Aminosäuren Ser185, Glu319 und His415, wobei das Serin in das katalytische Motiv G-E-S-A-

G eingebettet ist.

Während der Reaktion setzte die TfCa auch Hydrolyseprodukte aus PET-Fasern und -Filmen frei. Der

Nachweis der Hydrolyse erfolgte durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

der Abbauprodukte und bei den PET-Filmen zusätzlich mittels Rasterelektronenmikroskopie. Dabei

zeigte die Carboxylesterase verglichen mit anderen PET-Hydrolasen eine geringere Effizienz, was

durch die Lage des aktiven Zentrums in einer Bindungstasche und der daraus folgenden schlechten

Zugänglichkeit für polymere Substrate begründet werden kann. Bei der Hydrolyse der viel kleineren

CTR war die TfCa deutlich effektiver, was auf eine höhere Spezifität gegenüber kurzkettigen PET

Substraten hinweist.

Beim Abbau von PET Substraten wurde das Produktspektrum der TfCa und anderer PET-Hydrolasen

miteinander verglichen. Dabei zeigten die Hydrolasen ähnliche Abbaumechanismen. Das

Haupthydrolyseprodukt war, außer bei der TfCa aus T. fusca KW3 und der Cutinase 2 aus T. fusca

WSH03-11, unabhängig vom Substrat, MHET, der Monoester der Terephthalsäure. TfCa aus T. fusca

KW3 und die Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11 produzierten als Haupthydrolyseprodukt

Terephthalsäure. Zu Beginn der Hydrolyse wurden bevorzugt die Dimere EMT oder EBT freigesetzt,

welche nach längeren Reaktionszeiten weiter hydrolysiert wurden. Aufgrund der ähnlichen aktiven

Zentren an der Oberfläche der Proteine ist auch ein Abbau von PET-Fasern und Filmen durch diese

Enzyme möglich.

Literaturverzeichnis 166

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Publikationen 181

6 Publikationen

Zimmermann W, Billig S. Enzymes for the biofunctionalization of poly(ethylene terephthalate). In:

Biofunctionalization of Polymers and their Applications, Scheper T (Series Ed) Advances in

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10.1007/10_2010_87

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Escherichia coli BL21(DE3). (2010) Journal of Biotechnology. 146, 100-104

Chen S, Su L, Billig S, Zimmermann W, Chen J und Wu J. Biochemical characterization of the

cutinases from Thermobifida fusca. (2010) Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 63, 121-127

Korpecka J, Heumann S, Billig S, Zimmermann W, Zinn M, Ihssen J, Cavaco-Paulo A und Guebitz

GM. Hydrolysis of Cutin by PET-Hydrolases. (2010) Macromolecular Symposium. 296, 342–346

Poster und Vorträge 182

7 Poster und Vorträge

Vorträge bei nationalen und internationalen Veranstaltungen

10/2008 European BioPerspectives in Hannover

Purification and characterization of a carboxyl esterase from

Thermobifida fusca KW3 degrading poly(ethylene terephthalate) trimers

09/2008 Workshop of COST 868 action in Varna

Polyester-cleaving hydrolases from the actinomycete Thermobifida fusca

04/2008 Workshop of COST 868 action in Bratislava

Degradation and modification of poly(ethylene terephthalate) substrates

with an esterase from Thermobifida fusca KW3

04/2007 Workshop of COST 868 action in Sitges / Barcelona

Production of a poly(ethylene terephthalate) hydrolyzing esterase from

Thermobifida fusca KW 3

Postepräsentation bei nationalen Veranstaltungen

09/2010 Workshop of COST 868 action in Analipsi, Crete

Characterization of an extracellular PET-hydrolyzing carboxylesterase

from Thermobifida fusca

05/2009 Biokatalyse: Neue Verfahren, neue Produkte, Bad Schandau

Aufreinigung und Charakterisierung einer Polyethylen-terephthalat-

Trimer spaltenden Carboxylesterase aus Thermobifida fusca KW3

04/2007 Annual Conference of the VAAM, Osnabrück

Degradation of PET (poly ethylene terephthalate) oligomers by an

esterase from Thermobifida fusca

12/2006 5th Leipzig Research Festival for Life Sciences

Degradation of PET (poly (ethylene terephthalate)) Oligomers by an

esterase from Thermobifida fusca

05/2006 5th Biotechnology Symposium of the University of Leipzig

Production of an esterase from Thermomonospora (Thermobifida) fusca

cultivated on cutin, suberin and poly(ethylene terephthalate) substrates

03/2006 Annual Conference of the VAAM, Jena

Production of an esterase from Thermomonospora (Thermobifida) fusca

cultivated on cutin, suberin and poly(ethylene terephthalate) substrates

12/2005 4th Leipzig Research Festival for Life Sciences

Charakterisierung einer Polyesterase aus Thermomonospora fusca für

den biokatalytischen Abbau von PET-Oligomer

Lebenslauf 183

8 Lebenslauf

Promotion

04/2005-03/2008 Promotionsstipendiatin der Deutschen Bundesstiftung Umwelt

(DBU) an der Technischen Universität Chemnitz und der Universität

Leipzig

Professur Mikrobiologie und Bioverfahrenstechnik

„Induktion und Aufreinigung einer Polyesterase aus

Thermobifida fusca KW 3 zur Untersuchung und Optimierung eines

biokatalytischen Abbaus von PET-Oligomer“

http://www.dbu.de/stipendien_20004/730_db.html

Auslandsaufenthalt

11/2009 Proteinanalytik mittels MALDI Tof/Tof

State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process

Engineering, Chinese Academy of Science, Beijing

09/2007 Short Term Scientific Mission

Unterstützt durch die COST 868 Action (Biotechnical functionalisation

of renewable polymeric materials) durchgeführt an der Universität

Twente, Niederlande

Berufspraxis

04/2008-03/2010 Universität Leipzig

Mitarbeiterin der AG für Mikrobiologie und Bioverfahrenstechnik

03/2004-03/2005 Technische Universität Chemnitz

Mitarbediterin der AG Bioverfahrenstechnik

01/2003-06/2003 Mitarbeiterin des Forschungszentrum Mittweida e. V.

Universitäre Ausbildung

1996 - 2003 Technische Universität Berlin

Dipl.-Ing. der Medizinischen Biotechnologie („gut“; 1,6)

Diplomarbeit mit dem Thema:

„Probiotische Mikroorganismen in Gärgetränken (bzw. fermentierten

Getränken) – Identifizierung und Stabilitätsuntersuchungen“

Schulbildung

1992 - 1996 Städtisches Gymnasium Mittweida

Allgemeine Hochschulreife („gut“; 1,8)

1984 - 1992 Polytechnische Oberschule Mittweida

http://www.dbu.de/stipendien_20004/730_db.html

Documents

Abbau von Polyethylenterephthalat mit PET …€¦ · II Bibliographische Beschreibung Autor Billig, Susan Thema Abbau von Polyethylenterephthalat mit PET-Hydrolasen aus Thermobifida