Molekularbiologische Indikatoren für Besatzdichtestress bei Regenbogenforellen und Ostseeschnäpeln

ALEXANDER REBL

7. Büsumer Fischtag

2

Optimale Besatzdichten in der Aquakultur

01Konventionelle Aquakultur  Ökologische Fischzucht:

ähnliche Regelung der Besatzdichte

Überbesatz?

Soziale Hierarchie,Aggressionen

Unterbesatz?

Schwarm‐Intelligenz, „Sicherheit“

Stress durch Isolation vom Schwarm

Konkurrenz um Nahrungsquelle

Optimaler Besatz

3

Optimale Besatzdichten in der Aquakultur

01

TierwohlRessourcenschonung

Wirtschaftlichkeit

Hintergrund

Verbrauchermeinung

4

01

“The Progressive Fish-Culturist” 1970Hintergrund

5

“Tierwohl” ist abhängig von der Besatzdichte

Fisch in Aquakultur bei bis zu 1000‐fach höherenDichten als unter natürlichen Umständen gehalten

das beeinflusst oft produktionsrelevante Eigenschaften: 

beeinträchtigtesWachstum(1), verminderte Futteraufnahme(2), erhöhter Stresshormon‐Spiegel(3),erhöhte Anfälligkeit gegenüber Krankheiten(4)

1 ‐ Rowland et al., 2006; 2 ‐ Papoutsoglou et al., 1998; 3 ‐Webster and Marketon, 2008;  4 ‐ Aluru and Vijayan, 2009; 5 ‐ Laursen et al., 2013; 6 ‐ Cowx, 2005; 7‐ Boujar et al., 2002; 8 ‐ Person‐Le Ruyet et al., 2008

01

konkrete Begrenzungen für minimale und maximale Besatzdichte sind noch immer nichtdefiniert(5)

‐ Vorschlag für mögliche Obergrenze : 40 kg Forellen/m³ (6)

‐ andere Studien zeigten dagegen, dass Dichten > 100 kg/m³ das Tierwohl nicht beeinträchtigen(7,8) 

Hintergrund

6

Wie kann Haltungsstress aufgedeckt werden?

01

Hintergrund

Meiste Untersuchungen zu Stress in Fischen: Ansätze zur Analyse vorausgewählter Parameter

Ziel unserer Untersuchungen: Identifizierung neuerund Validierung bekannterTier‐basierter Biomarker und Ableitung von indikativen Funktionspfaden

Funktionspfade, die Besatzdichtestressbeschreiben, sind derzeit nicht bekannt

7

02

Versuch 1

Versuch 2

Niedrig ModeratErhöht/Hoch

400 L

Methoden

Besatzdichte-Experimente

Besatzdichten

9 Tage

Kreislaufsysteme• Wasseraustausch: 0.5 x pro Stunde• Brackwasser : 2.5–6 psu• Wasserbehandlung:  Kiesfilter, 

“Moving Bed Biofilm”,UV‐Bestrahlung

• Temperatur:  18.8–20.5 °C• Sauerstoff:  9.8–12.9 mg/l• pH:  7.2–7.4• Hell:dunkel‐Periode 17.5:6.5• Futter: Trockenpellets (12 h/d)

Keine Sterblichkeiten, Krankheiten odertechnischen Probleme während des Versuchs

10 kg/m3 30 kg/m3 60‐130 kg/m3

Coregonus maraena Oncorhynchus mykiss

8

02

Methoden

Probenahme und Microarray-Experimente

Coregonus maraena Oncorhynchus mykiss

Reviews:  1 ‐ Harper & Wolf, 2009; 2 ‐ Silbergeld, 1974

Probenahme:

• Niere und Leber sind Schlüsselorganeder Stressantwort(1)

• Niere: Sekretion von Hormonen, die Stress‐Funktionspfade induzieren

• Leber: wichtigstes metabolischesOrgan für Energielieferung

• Blut:  klassische Plasmaparameterwerden routinemäßig bei Stress erfasst(2)

Microarray‐Experimente:Messung der Aktivität von Genen

eines von 60.000 „Genen“

Gene Expression Omnibus Datenbank: 

GSE76543 (Schnäpel)GSE74332 (Forelle)

9

Methoden

Reproduzierbarkeit mit unterschiedlichen Methoden

Quantitative PCR: Überprüfung der Microarray‐Ergebnisse 7 ausgewählte Gene + 3 Normalisierungsgene

02

Profile zu den gewählten Genen zeigen eine hohe Übereinstimmung beider Methoden

Oncorhynchus mykissCoregonus maraena

LightCycler® 96LightCycler® 96

10

03

A

Besatzdichten zeigen bestimmte Genaktivierungsmuster

Satz unterschiedlich exprimierter Gene in der Leber von Schnäpelnist besonders groß bei hoher Dichte im Vergleich zur moderaten Dichte

ErgebnisseLeberLeber

korrigierter p‐value < .05 and absoluter FC > 1.5

Hoher Besatz

Niedriger Besatz

vs.Erhöhter Besatz Moderater Besatz

11

03

A B

Besatzdichten zeigen bestimmte Genaktivierungsmuster

Bei “nicht‐optimaler” Besatzdichte im Vergleich zum moderaten BesatzAnzahl der unterschiedlich exprimierten Gene in der Niere war deutlich höherals in der Leber von Schnäpeln

Schnittmenge von 53 Genen in Niere und Leber beiHochbesatz reguliert

ErgebnisseLeberLeberLeber Niere

Niere

korrigierter p‐value < .05 and absoluter FC > 1.5

Hoher Besatz

Niedriger Besatz

vs.Erhöhter Besatz Moderater Besatz

12

Funktionspfad p‐value SD Regulierte GeneAktiviert in der Leber:

ERK/MAPK signaling 1.5E‐4 HD 11 (187)p53 signaling 4.0E‐3 HD 6 (98)JAK/Stat signaling 2.5E‐2 HD 4 (72)p38 MAP kinase signaling 3.4E‐2 HD 5 (117)

Aktiviert in der Niere:Glycolysis 2.2E‐4 ED 11 (25)Glycolysis 3.8E‐10 HD 4 (25)Glucocorticoid receptor signaling 5.5E‐4 ED 11 (275)Glucocorticoid receptor signaling 3.1E‐6 HD 28 (275)Gluconeogenesis 3.3E‐3 ED 3 (25)Gluconeogenesis 7.6E‐9 HD 10 (25)mTOR signaling  2.7E‐2 ED 6 (188)mTOR signaling  1.5E‐3 ED 16 (188)Glycogen degradation 1.4E‐5 HD 5 (12)JAK/Stat signaling 2.7E‐4 HD 10 (72)SAPK/JNK signaling  6.1E‐4 HD 11 (94)p38 MAP kinase signaling  3.6E‐3 HD 10 (117)Glutamate degradation 3.9E‐3 HD 2 (3)HIF1‐alpha signaling  4.0E‐3 HD 10 (102)Ascorbate recycling 4.8E‐2 ED 1 (4)

Hohe Besatzdichten aktivieren Stress-Funktionspfade

03

Ergebnisse

13

Funktionspfad p‐value SD Regulierte GeneAktiviert in der Leber:

ERK/MAPK signaling 1.5E‐4 HD 11 (187)p53 signaling 4.0E‐3 HD 6 (98)JAK/Stat signaling 2.5E‐2 HD 4 (72)p38 MAP kinase signaling 3.4E‐2 HD 5 (117)

Aktiviert in der Niere:Glycolysis 2.2E‐4 ED 11 (25)Glycolysis 3.8E‐10 HD 4 (25)Glucocorticoid receptor signaling 5.5E‐4 ED 11 (275)Glucocorticoid receptor signaling 3.1E‐6 HD 28 (275)Gluconeogenesis 3.3E‐3 ED 3 (25)Gluconeogenesis 7.6E‐9 HD 10 (25)mTOR signaling  2.7E‐2 ED 6 (188)mTOR signaling  1.5E‐3 ED 16 (188)Glycogen degradation 1.4E‐5 HD 5 (12)JAK/Stat signaling 2.7E‐4 HD 10 (72)SAPK/JNK signaling  6.1E‐4 HD 11 (94)p38 MAP kinase signaling  3.6E‐3 HD 10 (117)Glutamate degradation 3.9E‐3 HD 2 (3)HIF1‐alpha signaling  4.0E‐3 HD 10 (102)Ascorbate recycling 4.8E‐2 ED 1 (4)

Hohe Besatzdichten aktivieren Stress-Funktionspfade

Signalpfade der Stress‐aktivierten Proteinkinase

Signalpfade der “Stress‐kinase” p38 

Effektorpfad zur Energielieferung

Effektorpfad zu antioxidativen Funktionen

03

Ergebnisse

14

Hohe Besatzdichten aktivieren ImmunpfadeAktivierte Pfade p‐value SD Regulierte Gene

Aktiviert in der Leber:Acute‐phase response signaling 1.3E‐10 HD 18 (169)Protein kinase C‐θ signaling in T lymphocytes 4.0E‐6 HD 11 (118)Interleukin‐6 signaling 1.2E‐5 HD 10 (116)Complement system 1.9E‐5 HD 7 (37)Phosphoinositide 3‐kinase signaling in B lymphocytes 2.8E‐5 HD 10 (128)iCOS‐iCOSL signaling in T helper cells 4.2E‐5 HD 9 (108)B cell receptor signaling 8.0E‐5 HD 11 (174)CD28 signaling in T helper cells 8.6E‐5 HD 9 (118)

Aktiviert in der Niere:Production of nitric oxide and reactive oxygen species in macrophages 1.3E‐5 ED 11 (180)Production of nitric oxide and reactive oxygen species in macrophages 9.3E‐9 HD 25 (180)Phagocytosis in macrophages and monocytes 1.7E‐5 ED 8 (93)Phagocytosis in macrophages and monocytes 5.7E‐9 HD 18 (93)fMLP (N‐formyl‐methionyl‐leucyl‐phenylalanine) signaling in neutrophils 5.1E‐5 ED 8 (108)fMLP signaling in neutrophils 1.9E‐9 HD 20 (108)Interleukin‐8 signaling 8.5E‐5 ED 10 (184)Interleukin‐8 signaling 1.5E‐8 HD 25 (184)CD28 signaling in T helper cells 5.1E‐8 HD 19 (118)Leukocyte extravasation signaling 6.4E‐8 HD 25 (198)Tec kinase signaling 2.7E‐7 HD 21 (157)High‐mobility group protein B1 signaling 7.3E‐6 HD 15 (120)B cell receptor signaling 2.0E‐5 HD 19 (174)Acute‐phase response signaling 4.6E‐5 HD 17 (169)Chemokine signaling 4.8E‐5 HD 11 (71)Role of pattern recognition receptors in recognition of bacteria and viruses 5.5E‐5 HD 14 (126)Interleukin‐6 signaling 8.3E‐5 HD 13 (116)

03

Ergebnisse

15

03

Immun- und Stresspfade verzahnen sich bei hohem Besatz

IL1

Zentrale Position von Interleukin‐1 –ein stark vernetzter Faktor

Gene und Funktionswege, die gemeinsam in Leber und Niere von gestressten Schnäpeln aktiviert sind

• IL1B spielt eine prominente Rolle bei der Regulation stress‐aktivierter Immunantworten(1,2) 

1 ‐Metz et al., 2006; 2 ‐ Aluru and Vijayan, 2009;3 ‐ Cairns et al., 2008; 4 ‐Momoda et al., 2007; 5 ‐Wiseman et al., 2007 

Ergebnisse

• die Antwort des Immunsystems auf Stress ist konserviert (3,4,5)

16

Antikörper erkennen Leukozytenpopulationen in Lachsfischen

MAb 30MAb 42 MAb 1.14 MAb N2

03

Ergebnisse

SatzfunktionalerAntikörper fürForelle und Schnäpel

Hypothese: Bei höheren Besatzdichten zirkulieren bestimmte Immunzelltypen im Blut

17

Immunzell-Populationen verändern sich mit der Besatzdichte

der Anteil myeloider Zellen steigt von 8 % auf 51 % mit steigender Besatzdichte

die Anzahl myeloider Zellen steigt, aber die Anzahl der Thrombozyten und auch der B‐Zellen reduziert sich mitsteigender Besatzdichte

03Morphologie ‐ kleine, nichtgranulierte versus größere, granulierte Zellen:

Satz kreuzreagierender Antikörper: 

Ergebnisse

Moderater Besatz

Hoher Besatz

Moderater Besatz

Hoher Besatz

Moderater Besatz

Hoher Besatz

Moderater Besatz

Hoher Besatz

FACS: Fluoreszenz-aktivierteZellsortierung

18

03

Besatzdichte-Stress erhöht die phagozytotische Aktivität

Funktionspfad p‐value SD Beteiligte GeneAktiviert in der Leber:

Phagozytose in Macrophagen und Monozyten 1.7E‐5 ED 8 (93)Phagozytose in Macrophagen und Monozyten 5.7E‐9 HD 18 (93)

Ergebnisse

Moderater Besatz

Hoher Besatz

Moderater Besatz

Hoher Besatz

19

Zusammenfassung: Besatzdichtestress im Schnäpel

Bei höheren Besatzdichten sind im Schnäpel sehr viele Gene in Leber und Niere aktiviert.

Ein Großteil dieser Gene ist an stress‐ und immunrelevanten Funktionspfaden beteiligt, das deutet längerfristig auf Immunsuppression hin:„conserved transcriptional response to adversity” (1)

04

Zusammenfassung I

1 ‐ Irwin and Cole, 2011

20

03

Erhöhte Besatzdichten bewirken ähnliche Genaktivitäten in der Leber

Anzahl der bei erhöhten Besatzdichten regulierten Gene war in der Leber von Forellen und Schnäpeln ähnlichverglichen mit Forellen unter “optimalen” Besatzdichten

↑   2↑  1 ↑   8↓  4 ↓ 41 ↓ 38

Forelle Leber

Erhöhter Besatz

Hoher Besatz

Aber: geringere Anzahl positiv regulierter Gene

Ergebnisse

Schnäpel Leber

korrigierter p‐value < .05 and absoluter FC > 2 

21

03 nur ein Gen wurde bei hohen Besatzdichten in der Niere von Forellen aktiviert

verglichen mit Forellen unter “optimalen” Besatzdichten

korrigierter p‐value < .05 and absoluter FC > 2 

↑  1 Forelle Niere

Hoher Besatz

kodiert die Glycogenphosphorylase

katalysiert und reguliert den Abbauvon Glycogen zu Glucose‐1‐phosphat:Bereitstellung von Energie! 

Erhöhte Besatzdichten bewirken kaum Veränderungen in der Forellen-NiereErgebnisse

Schnäpel Niere

22

03

Erhöhte Besatzdichten erhöhen den Blutzuckerspiegel in Forellen

Plasma‐Analyse

Ergebnisse

Nicht der Cortisol‐, aber der Blutzucker‐spiegel zeigtensignifikanteVeränderungen:

Blutzucker

23

Gedämpft in der Leber:Protein ubiquitination pathway 1.23E‐05 HD 8 (255)

2.09E‐02 ED 3 (255)Cholesterol biosynthesis 2.20E‐04 HD 3   (28)

4.88E‐07 ED 3   (28)mTOR signaling 1.21E‐03 HD 5 (188)

9.30E‐03 ED 3 (188)Retinol biosynthesis 8.54E‐03 HD 2   (33)

2.63E‐03 ED 2   (33)PI3K/AKT signaling 1.53E‐02 HD 3 (123)

3.27E‐02 ED 3 (123)Glutathione biosynthesis 1.26E‐02 HD 1     (3)

4.64E‐03 ED 1     (3)

Erhöhte Besatzdichten dämpfen viele Funktionspfade in Forellen

Aktivierte Pfade p‐value SD Beteiligte GeneAktiviert in der Leber:

HIF1 alpha signaling  2.00E‐02 HD 3 (102)

03

Ergebnisse

24

Lachsfisch‐Art

Besatzdichte[kg/m3]

Dauer des Experiments

Potenzieller Stressor Regu‐lation

Gewebe Referenz

O. myk 40, 80 9 months Fin damage ↑ Dorsal, caudal, pectoral fin North et al., 2006

O. myk 75, 120  84 days Fin damage ↑ Dorsal, pectoral fin Person‐Le Ruyet et al., 2008S. sal 30 10 weeks ALP,  alkaline phosphatase ↑ Blood Liu et al., 2015O. myk 45 1 month Cholesterol ↓ Blood plasma Yarahmadi et al., 2014O. myk 40, 80  9 months Cortisol ↓ Blood plasma North et al., 2006O. myk 120 2 weeks Cortisol ↑ Blood plasma Person‐Le Ruyet et al., 2008S. sal 30 10 weeks Cortisol ↑ Blood plasma Liu et al., 2015S. fon 120 1 month FBP1, fructose‐1,6‐bisphosphatase ↑ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 20, 25, 30  2 months G6PD, glucose‐6‐phosphate dehydogenase ↑ Kidney Aksakal et al., 2011S. fon 120 1 month G6PD ↓ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 30  2 months G6PD ↓ Liver, muscle, gill Aksakal et al., 2011S. fon 120 1 month GK,  glycerol kinase ↑ Liver Vijayan et al., 1990S. fon 120 1 month Glucose ↓ Blood plasma Vijayan et al., 1990O. myk 45 1 month Glucose ↑ Blood plasma Yarahmadi et al., 2014S. fon 120 1 month Glycogen ↓ Liver Vijayan et al., 1990S. fon 120 1 month GPD1, glycerol‐3‐phosphate dehydrogenase 1 ↑ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 25, 30  2 months GR, glutathione reductase ↓ Liver, muscle, gill Aksakal et al., 2011S. fon 120 1 month HADH, hydroxyacyl‐CoA dehydrogenase ↑ Liver Vijayan et al., 1990S. fon 120 1 month HK1, hexokinase ↓ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 25, 30  2 months HSP70, heat shock protein, 70 kDa ↑ Muscle Aksakal et al., 2011S. sal 30 10 weeks IgM, immunoglobulin M ↓ Blood Liu et al., 2015S. sal 30 10 weeks Maleic dialdehyde ↑ Blood plasma Liu et al., 2015S. fon 120 1 month PFKM, phosphofructokinase ↑ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 20, 25, 30  2 months PGD, phosphogluconate dehydrogenase ↑ Kidney Aksakal et al., 2011O. myk 25, 30  2 months PGD ↓ Liver, muscle, gill Aksakal et al., 2011O. myk 45 1 month Triglyceride ↓ Blood plasma Yarahmadi et al., 2014

Widersprüchliche Biomarker in Lachsfischen

03

Diskussion

25

Lachsfisch‐Art

Besatzdichte[kg/m3]

Dauer des Experiments

Potenzieller Stressor Regu‐lation

Gewebe Referenz

O. myk 40, 80 9 months Fin damage ↑ Dorsal, caudal, pectoral fin North et al., 2006

O. myk 75, 120  84 days Fin damage ↑ Dorsal, pectoral fin Person‐Le Ruyet et al., 2008S. sal 30 10 weeks ALP,  alkaline phosphatase ↑ Blood Liu et al., 2015O. myk 45 1 month Cholesterol ↓ Blood plasma Yarahmadi et al., 2014O. myk 40, 80  9 months Cortisol ↓ Blood plasma North et al., 2006O. myk 120 2 weeks Cortisol ↑ Blood plasma Person‐Le Ruyet et al., 2008S. sal 30 10 weeks Cortisol ↑ Blood plasma Liu et al., 2015S. fon 120 1 month FBP1, fructose‐1,6‐bisphosphatase ↑ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 20, 25, 30  2 months G6PD, glucose‐6‐phosphate dehydogenase ↑ Kidney Aksakal et al., 2011S. fon 120 1 month G6PD ↓ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 30  2 months G6PD ↓ Liver, muscle, gill Aksakal et al., 2011S. fon 120 1 month GK,  glycerol kinase ↑ Liver Vijayan et al., 1990S. fon 120 1 month Glucose ↓ Blood plasma Vijayan et al., 1990O. myk 45 1 month Glucose ↑ Blood plasma Yarahmadi et al., 2014S. fon 120 1 month Glycogen ↓ Liver Vijayan et al., 1990S. fon 120 1 month GPD1, glycerol‐3‐phosphate dehydrogenase 1 ↑ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 25, 30  2 months GR, glutathione reductase ↓ Liver, muscle, gill Aksakal et al., 2011S. fon 120 1 month HADH, hydroxyacyl‐CoA dehydrogenase ↑ Liver Vijayan et al., 1990S. fon 120 1 month HK1, hexokinase ↓ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 25, 30  2 months HSP70, heat shock protein, 70 kDa ↑ Muscle Aksakal et al., 2011S. sal 30 10 weeks IgM, immunoglobulin M ↓ Blood Liu et al., 2015S. sal 30 10 weeks Maleic dialdehyde ↑ Blood plasma Liu et al., 2015S. fon 120 1 month PFKM, phosphofructokinase ↑ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 20, 25, 30  2 months PGD, phosphogluconate dehydrogenase ↑ Kidney Aksakal et al., 2011O. myk 25, 30  2 months PGD ↓ Liver, muscle, gill Aksakal et al., 2011O. myk 45 1 month Triglyceride ↓ Blood plasma Yarahmadi et al., 2014

Widersprüchliche Biomarker in Lachsfischen

03

Cortisol‐Spiegel steigt (Person‐Le Ruyet et al., 2008; Pickering & Pottinger, 1987; Pickering et al., 1991),sinkt (Leatherland & Cho, 1985; North et al., 2006; Procarione et al., 1999)oder bleibt konstant (Kebus et al., 1992; Leatherland, 1993) mit steigender Besatzdichte in Lachsfischen

Blutzucker‐Spiegel steigt (Trenzado et al., 2006; Yarahmadi et al., 2014),sinkt (Vijayan et al., 1990)oder bleibt konstant (Laidley & Leatherland, 1988; Melotti et al., 2010) mit steigender Besatzdichte in Lachsfischen

Hitze‐Schock‐Protein‐70‐mRNA‐Konzentration steigt (Aksakal et al., 2011),sinkt (Alves et al., 2010; Salas‐Leiton et al., 2010)oder bleibt konstant (Zarate & Bradley, 2003) mit steigender Besatzdichte in Lachsfischen

Diskussion

26

04

Zusammenfassung II

Schlussfolgerungen

1 ‐ Barton, 2002 (Review); 2 ‐ Barton and Schreck, 1987; 3 ‐ Jentoft et al., 2005

Besatzdichte wird als maßgeblicher Stressorin der Aquakultur betrachtet(1), der Physiologie und Tierwohl beeinträchtigt.

Dank generationenwährender Zucht ist die Stressempfänglichkeit von Regenbogenforellen recht gering (2,3).

Schnäpel sind relativ neu als Zuchtfischeetabliert (seit 1990er Jahren in Finnland) und daherwesentlich empfindlicher gegenüber Stress.

optimal für Forellenzucht:  höhere Dichte > 60 kg/m3

optimal für Schnäpelzucht:  geringere Dichte unter 30 kg/m3

27

05

Danke:DAN

KE!

Carsten Kühn, Ralf Bochert, Peter Luftund den Mitarbeitern der LFA‐MV

Bernd Köllner, Tomáš Korytář

Gefördert durch denEuropäischen Fischereifondsund das Ministerium fürLandwirtschaft, Umwelt und VerbraucherschutzMecklenburg‐Vorpommern

Leibniz-Institut für Nutztierbiologie FBN

Wilhelm-Stahl-Allee 218196 Dummerstorf

05

DANKE!

Danke für Ihre Aufmerksamkeit!