Botanisches Institut der Universitat, Frankfurt/Main

Monogen kontrollierte Langzeit-Transformationen der Chlorophylle in Bl1ittern von Arabidopsis lhaliana (1.) Heynh.

A. R. KRANZ

Eingegangen am 7. Februar und am 4. April 1973

Mit 4 Abbildungen

Summary

Monogenic controlled long-time transformations of chlorophylls in leaves of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.

In the biochemical scheme of the chlorophyll synthesis the wellknown, numerous in-vivo forms of the chlorophylls are not considered up to now; at present these forms can only be measured spectroscopically. Monogenic mutants and genotypes synthesized from these parents give the chance to recognize blocked steps in the synthetic pathway rsp. the transformation stages and to detect homo- rsp. heteroallelic interactions of the nuclear genome in the plastid. 1. In a test procedure of derivative spectroscopy combined with electronic data processing

absorption and remission spectra are measured with a common one-beam spectrophoto­meter and after that difference and their derivative spectra are calculated in a computer programm.

2. In light/dark-experiments nine stages of the long-time transformations of the chlorophylls can be proved at the difference and derivative spectra of the in-vivo remission of normal greening leaves of the wildtype (ch+) and three mutants (Ch1, ch2

, Ch3) of Arabidopsis thaliana. In measuring the absorption of the acetone extracts (80 p.c.) the holochromes of the chlorophyllides (CPaH 696, CPbH 675) and of the chlorophylls (CaH 678, CbH 653) are missing as expected.

3. The analysis of the difference and derivative spectra between the mutants and genotypes yields that the primary gene effects of the homoalleles ch1 and ch2 must be searched in the defective enzymatic control of the photoreduction of the protochlorophyllid and/or its holochrome (PCb 629, PCbH 638) to the chlorophyllide (CPb 669) and the effect of the heteroallele Ch3 in the reduced binding of the chlorophyllide (CPa 678) to the protein complexes of the holochromes (CPaH 696, P 705-711).

4. On the basis of the observed monogenic controlled long-time transformation differences the end stages of the chlorophyll biosynthesis are demonstrated in an extended scheme; more­over correspondence and contradiction with other concepts are discussed. The existence of separated pathways of the chlorophyll a and b during the last steps of the pigment bio­synthesis are intensively proved.

Z. P/lanzenphysiol. Bd. 70. S. 333-349. 1973.

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Einleitung

Zwei Schwerpunkte kennzeichnen die Chlorophyllforschung: Die biophysikalische Untersuchung photochemischer Reaktionen des sensibilisierten Chlorophylls und die biochemische Analyse der Chlorophyllsynthese.

Die von verschiedenen Autoren untersuchte Mehrgipfeligkeit der In-vivo-Spektren Iafh nunmehr keinen Zweifel zu, daB im ausdifferenzierten Plastiden zahlreiche Chlo­rophyllformen vorliegen (u. a. MEISTER, 1967; FRENCH und PRAGER, 1969), die offen­bar in bestimmter Relation zu den beiden Photosystemen stehen (FRENCH und BROWN, 1971). Trotz einiger Fortschritte in der chromatografischen Auftrennung von Chloro­phyllrohextrakten (SCHNEIDER, 1969; SCHOPFER und SIEGELMANN, 1969; HENNINGSEN und KAHN, 1971) besteht noch kein endgiiltiges Urteil dariiber, ob die isolierten Frak­tionen mit den zuvor genannten In-vivo-Formen iibereinstimmen (METZNER, 1970). Die im Verhaltnis zu den Endprodukten, Chlorophyll a und b, geringen Mengen der Transformationsprodukte erschweren sicher ihre praparative Darstellung betrachtlich. Defektmutanten mit spezifisch angereicherten Vorstufen wiirden diese Schwierigkeiten verringern. So gelang es FALUDI-DANIEL und Mitarbeitern (FALUDI-DANIEL et al.,

1969) mit In-vivo-Spektren junger Plastiden von zwei Maismutanten eine Anrei­cherung des Protochlorophyllids nachzuweisen. Die dariiber hinaus bekannten zahl­reichen «Chlorophyll-Mutanten» der Algen und hoheren Pflanzen erlaubten die Auf­stellung eines Bildungsschemas des Chlorophylls (u. a. ARONOFF und ELLWORTH, 1968; MACHOLD und SCHOLZ, 1969; WETTSTEIN, 1972). In diesem Schema fanden aber die o. a. zahlreichen In-vivo-Formen des Chlorophylls keine Beriicksichtigung; man setzte mehr oder weniger bewuBt voraus, daB diese Transformationsformen verschie­dene physikalische Zustande des «fertigen» Chlorophyllmolekiils darstellen. Ziel un­serer Untersuchungen ist daher die Klarung folgender Fragen:

1. Gibt es gen-kontrollierte Chlorophylltransformationen? 2. Wenn ja, welche Obergangsschritte sind hiervon betroffen? 3. Liefern die Ergebnisse Hinweise fi.ir ein Gesamtschema der In-vivo-Synthese und

Langzeit-Transformationen des Chlorophy lIs?

Die Beantwortung dieser Fragen wird schlieBlich die heute noch liickenhaften Kennt­nisse iiber die primare und sekundare Wirkung von Kern- und Plastidengenen (KRANZ, 1971; NASYROV, 1971 und 1972) wesentlich beeinflussen.

Objekte und Methoden

In den vorangegangenen Publikationen konnte nachgewies,en werden, daB die beiden homoallelen, hellgriinen Mutanten ChI und ch2 sowie eine diesen gegeniiber heteroallele, gel be Mutanten ch:J von Arabidopsis thaliana (L.) HEYNH. ein ausgezeichnetes Material zur Unter­suchung sowohl der Endschritte der Chlorophyllsynthese als auch der Chlorophylltransforma­tionen darstellen (KRANZ 1970 und 1972). Sie besitzen gegeniiber dem Wildtyp (ch+) quantita­tive (ch 2

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Langzeit-Transformationen der Chlorophylle in BHittern von Arabidopsis thaliana 335

In der vorliegenden Arbeit werden diese rezessiven Kerngen-Mutanten, der dominante Wildtyp und die folgenden aus ihrer Kreuzung hergestellten Fe bzw. Fa-Genotypen unter­sucht:

ch'ch+/ch'ch+ ch+ch./ch+ch. ch+ch./ch·ch+

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grune, heterozygote Pflanzen (Hybriden)

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- hellgrune

- gelbe I homozygote Pflanzen (Parentaltypen, Rekombinanten)

Das Material hat gegenuber den in der Chlorophyllforschung haufig benutzten, genetisch nicht exakt definierten «Mutanten" den Vorteil, daB die genetische Grundlage seiner Pla­stidenpigmentbildung genau bekannt ist. Hierdurch wird die Voraussetzung zur Erkennnung von Ein-Gen-Wirkungen mit homo- bzw. heteroalleler Interaktion im Chloroplasten erfUllt.

Dber die Kultur- und Versuchsbedingungen des Pflanzenmaterials wurde bereits fruher berichtet (KRANZ, 1971). Zur Pigmentbestimmung und spektralphotometrischen Messung ka­men noch nicht ausgewachsene Blatter von in einer Klimakammer aufgezogenen Pflanzen, die im Vorblutenstadium waren. Die Plastid en befanden sich demnach in der Endphase ihrer Differenzierung.

Absorptionsspektren, insbesondere Differenz- und Derivativspektren, sind besser zur Charakterisierung von Plastidenpigmenten geeignet als praparative, chemisch-physikalische Analysen einschlie£\ich der Tracer-Technik. So ermoglicht z. Z. allein die optisch-physi­kalische Methode der Spektralanalyse die Durchfuhrung der In-vivo-Messungen. Daher konnte auch nur mit diesem MeBverfahren direkt nachgewiesen werden, daB die Plastiden­pigmente in der lebenden Pflanze in anderen und zahlreicheren Formen vorliegen als im Extrakt organischer Losungsmittel (FRENCH und HARPER, 1956/57; SHIBATA, 1957; KRAS­NOVSKY, 1960; BROWN, 1963; MEISTER und MASLOVA, 1968). Diese Feststellung gilt s1nngemaB auch fUr die Remissionsspektren, sofern die MeBprobe gerichtet bestrahlt wird (METZNER, 1966). Dieses MeBverfahren haben wir in den hier dargestellten Untersuchungen erstmalig mit der Differenz- und Derivativspektroskopie verbunden.

Eine ausfuhrliche Darstellung unserer MeBanordnung liegt bereits vor (VOGT 1971). Mit dem relativ geringen Aufwand eines Einstrahl-Spektralphotometers (Zeiss PMQ II) mit Gittermonochromator, 100 % -Automatik, Kugelansatz und Photomultiplier, TK-Rechner, Drucker und Streifenlocher wird bei gerichteter Probenbestrahlung die Absorption bzw. Re­mission digital registriert und anschlieBend in einem Rechenprogramm mit einem Kleinkom­puter (Olivetti P 101) bzw. dem GroBrechner des ZRI der Universitat Frankfurt (Univac 1108) zu Differenz- und Derivativspektren verarbeitet und danach gezeichnet1). Samtliche Messungen wurden in einem raumklimatisierten Dunkellabor durchgefuhrt. Dort erfolgten auch die Lichtbehandlungen unter einer HPL-Lampe (Philips 250 W) bei einer Strahlungs­energie von 6,5 . 104 erg' S-1 • cm-2 fur A = 642 nm, die damit im Bereich des Aktionsspek­trums der Chlorophyllbildung den wahrend der Pflanzenanzucht eingestellten Energiewerten entsprach.

Die hierbei berechneten GroBen sind wie folgt definiert: Nach LAMBERT-BEER betragt die Extinktion eines Absorptions- bzw. Remissionsspektrums

I" E = log-Is

1) Das Rechen- und Plot-Programm fur den GroBrechner bearbeitete Herr H. A. M. FREY yom ZRI.

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worin 10 die Strahlungsintensitat des Vergleichs (Losungsmittel im Pigmentextrakt bzw. ent­farbtes Vergleichsblatt) und I, die Strahlungsintensitat der Probe (Pigmentextrakt bzw. unter­suchtes Blatt) sind.

Da die Extinktion abhangig ist von der Wellenlange des Mellstrahls, gilt

E = f(A)

und dessen erste Ableitung nach der Wellenlange

dE E' =c --

dJ.

Diese Definitionen sind sinngemall auf Differenzspektren iibertragbar, d. h. wlr erhalten fiir die Extinktionsdifferenz

dE LlEx = f(A) und LIE' = --;rr-

1m Rechenprogramm werden diese Grollen bestimmt aus

LlEx = E j -Ej • K,

worin Ej und E j die Extinktionswerte der 1. und 2. Mellreihe bei der Wellenlange Jon sind Ejmax

und der Korrekturfaktor K = -E-- die maximale Extinktion den Wert Null annehmen .i max

lallt. Auf diese Weise wird der Anteil des am starksten absorbierenden Pigments (Chloro­phyll a bzw. dessen Holochrom) als Bezugspunkt gewahlt.

Zum Ausgleich zufallsbedingter Abweichungen (z. B. Geratefehler) bildet das Programm aus je fiinf Extinktionsdifferenzen Mittelwerte.

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Anschliellend wird hiervon die erste Ableitung berechnet.

LI E' x = Ex n + 1 - Ex /I

Hierbei betragt die Schrittlange der Wellen lange

LI A = An+l - An = 1

Danach werden erneut Mittelwerte aus jeweils fiinf abgeleiteten Extinktionsdifferenzen ge­bildet.

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Bei den Remissionsmessungen mull beachtet werden, dall nach KUBELKA und MUNK das diffuse Reflektionsvermogen einer unendlich dicken Probe von ihrem Absorptionskoeffizien­ten und ihrem Streuungskoeffizienten abhangig ist. Diese Bedingungen sind bei In-vivo­Differenzmessungen von Blattern bedeutungslos, wenn sie fiir die Proben und den Vergleich identisch sind. Wir verwenden daher stets ontogenetisch und morphologisch gleiche Blatter und bringen sie durch einen speziellen Probenhalter in die gleiche Position zum Mellstrahl.

1m Gegensatz zu den alteren MeBverfahren der o. a. Autoren schaltet unser Verfahren aile zusatzlichen Fehlerquellen aus, die bei der direkten elektronischen Registrierung der Diffe­rentialquotienten auftreten konnen. Ein weiterer Vorteil besteht in der einmaligen Messung eines Spektrums und der aus ihm gleichzeitig gewonnenen Ableitungskurven. AuBerdem kon­nen aus den MeBkurven aile denkbaren Differenz- und Derivativspektren berechnet und 5tatistisch beurteilt werden. Damit sind die Voraussetzungen erfiillt fiir eine korrekte, verglei­chen de Interpretation der Kurven eines Versuchs.

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Langzeit-Transformationen cler Chlorophylle in Bliittern von Arabidopsis thaliana 337

Ergebnisse

Die Untersuchungen wurden wie eingangs formuliert in zwei Teilaspekte gegliedert. Zur Erfassung der genotypischen Unterschiede bildeten wir die Differenzspektren zwischen dem Wildtyp und den Mutanten, den FrPflanzen sowie zwischen diesen und den F3-Pflanzen. Hierbei war der pigmentarmere Typ stets der Subtrahend. Zur Be­stimmung der Transformationsstufen berechneten wir die Differenzspektren und ihre Ableitungen in der zeitlichen Reihenfolge der Dunkel- und Lichtbehandlungen, wobei die Megwerte des spateren Behandlungszeitpunktes stets den Subtrahenden lieferten.

Bei der Interpretation von Differenz- und Derivativspektren ist folgendes zu be­achten: Verlauft das Differenzspektrum (LIE,) im Positiven, so besitzt der Subtrahend eine geringere Pigmentabsorption bzw. -remission in diesem Bereich; liegt das Spek­trum im Negativen, so besitzt er Pigmentiiberschug. Die Kurvencharakteristik der 1. Ableitung (.~1E',) nach der Wellenlange A lagt folgende Aussagen zu: 1. Ein Null­durchgang bei absteigendem Kurvenverlauf kennzeichnet ein Maximum des Differenz­spektrums. 2. Bei aufsteigender Kurve entspricht der Nulldurchgang einem Minimum des Ausgangsspektrums. 3. Durch die schrittweise urn A = 1 nm erfolgende Differen­zierung kommt es bei der 1. Ableitung zu einer geringen, positiven Verschiebung der charakteristischen Kurvenpunkte urn 0,5 nm gegeniiber dem Differenzspektrum.

1m Verlauf der Untersuchungen war zunachst zu klaren, ob bei unserem Objekt iiberhaupt Transformationsstufen des Chlorophylls in Differenzspektren erfagt wer­den konnen. Belichtet man 20 Tage alte Pflanzen 1 Minute lang mit 18 klx und be­rechnet das Differenzspektrum und dessen 1. Ableitung aus der In-vivo-Blattremis­sion zwischen diesen und den zuvor 16 Stun den dunkel gehaltenen Pflanzen (LIE =

16 Std. D minus 16 Std. D + 1 Min. L), so erhaIt man aus den Maxima und Minima fur ,1E, charakteristische Nulldurchgange fur LIE' x' Sie liegen bei allen Genotypen mehr oder weniger stark ausgepragt bei A = 629, 635, 648, 669, 675, 678, 697, 705 und 712 nm (siehe Tab. 1). Die Werte fur LlEx sind meistens positiv, bei A = 669,675 (auger ch+) und 678 nm jedoch negativ. Dies bedeutet, dag wir im ersten Fall mit einem relativen Extinktionsiiberschug (bezogen auf Emax des fertigen Chlorophylls a bei A = 678 nm) der 16 Std. dunkel gehaltenen Blatter, im zweiten Fall mit einem Oberschug der 1 Min. belichteten Blatter rechnen konnen.

Werden die Remissionsmessungen 30 Min. nach der 1 Min. dauernden Belichtung wiederholt und das Differenzspektrum (1 Min. L minus 35 Min. D) mit seinen Ablei­tungen gebildet, so findet man Maxima und Minima an den gleichen Stellen wieder (siehe Tab. 2); die Lage der AEx-Werte im Positiven und N egativen ist aber wesent­lich verandert. Bei A = 629, 635 und 648 nm liegen sie im negativen Bereich, bei X = 675 und 678 nm mehr oder weniger nahe Null und bei A = 697, 705 und 712 nm stets im positiven Bereich. In bezug auf die Ausgangssituation nach 1 Min. List nach 35 Min. dunkel an den drei ersten Stell en mehr oder weniger gleiche Extinktion und an den letztgenannten Stellen eine wesentlich niedrigere Extinktion festzustellen.

Urn sicher zu sein, dag es sich bei den hier erfagten Langzeitveranderungen bereits ergriinter Blatter tatsachlich urn Primarumwandlungen der Chlorophylle handelt,

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haben wir ebenso behandelte, zuvor jedoch etiolierte StipelbUitter einer Chlorophyll b-freien Erbsenmutante und ihres Wildtyps untersucht. Die hierbei erhaltenen Diffe­renz- und Derivativspektren bestatigten die bei Arabidopsis erzielten Chlorophyll­umwandlungen.

Die zuvor gestellte Frage nach der Erfagbarkeit von Transformationsstufen des Chlorophylls bei unseren Objekten unter den angewendeten Versuchsbedingungen kann bejaht werden. Richtung und Grogenordnung der In-vivo-Remissionsanderun­gen entsprechen prinzipiell den Ergebnissen frliherer Autoren (SHIBATA, 1957; BROWN, 1963; MEISTER, 1967) an etiolierten Pflanzen, wenn auch Unterschiede in der Lage und Anzahl der charakteristischen Wellenlangen vorhanden sind; hierliber wird noch zu diskutieren sein. Darliber hinaus ist uns damit der Nachweis der Transformations­stufen an normal ergrlinten Blattern 20 Tage alter Pflanzen gelungen.

Wenden wir uns nun der Frage nach den genotypisch bedingten Unterschieden in den Dbergangsverbindungen der Chlorophylle zu. Die zwischen den verschiedenen Genotypen berechneten Differenz- und Derivativspektren aus In-vivo-Remissions­messungen an 16 Std. dunkel gehaltenen Blattern ergaben ebenfalls charakteristische Nulldurchgange flir LlE'x. Sie lagen meist in den Bereichen von A = 625 bis 630, 645 bis 650, 675 bis 680, 690 bis 695 und 700 bis 710 (siehe Abb. 1 und 2). Dberblickt man den Kurvenverlauf flir /lEx der einzelnen Spektren, so fallt zunachst auf, dag nur im Spektrum ch" minus ch' negative Werte auftreten und die grogten Differenzen bei A = 646 und 695 nm bestehen. Diese Ergebnisse treffen auch flir Spektren der F3-

Pflanzen (Hybriden und Rekombinanten) zu; die Dbereinstimmung der Kurvenver­laufe ist nahezu vollstandig.

Vergleicht man Hohe und Verlauf der einzelnen Differenzspektren zwischen den verschiedenen Genotypen, so ergibt sich folgendes: Die Extinktionsdifferenz ist unter­halb der auf A = 678 nm bezogenen maximalen Extinktion (LIE" = 0) des Chloro­phyll a-Holochroms zwischen dem Wildtyp und den Mutanten am grog ten und ober­halb dieses Bezugspunktes relativ kleiner (siehe Abb. 1). /lEx verhalt sich dagegen in den Differenzspektren zwischen den Mutanten genau umgekehrt, ausgenommen bei ch2 minus ch' (siehe Abb. 2). Wenn wir aufgrund der Ergebnisse frliherer Autoren vor­aussetzen, dag die Transformationsstufe des Protochlorophyllids unterhalb und die der Chlorophyllide oberhalb der maximal en Extinktion des Chlorophyll a-Holo­chroms absorbieren, so erlauben unsere Ergebnisse die SchluMolgerung, dag die Mu­tanten gegenliber dem Wildtyp vor all em im Protochlorophyllid, die Mutanten unter­einander dagegen vorwiegend in den Chlorophylliden quantitativ differieren. In den aus Acetonextrakten der gleichen U ntersuchungsobjekte berechneten Differenz- und Derivativspektren fehlen daher ab 678 nm die Maxima und Nulldurchgange vollstan­dig, da die Eiweigkomponente des Chlorophyllid-Holochroms durch das Extraktions­mittel yom Pigment getrennt wird.

Betrachten wir die Derivativspektren genauer, so sind in Abbildung 1 die Null­durchgange flir den Wildtyp minus den Mutanten bei A = 627 und 647 nm nahezu identisch, oberhalb 678 nm aber sehr verschieden (flir ch+ minus ch' A = 692, cl?+ minus

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Langzeit-Transformationen der Chlorophylle in BJ;ittern von Arabidopsis thaliana 341

.450 .045

./,1)0 .040

.350 .D35

.300 .030

.250 .025

.200 .020

.150 .D15

;(10 .010

.050 .IllS

~050 -.IXl5

-.100 -.010

~250 -.025

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620 630 640

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Abb. 1: Differenz- (LIE,,) und Derivativspektren (LI E' ,,) aus In-vivo-Blattremissionsmessungen zwischen dem Wildtyp (ch+) und drei Kerngen-Mutanten (chI, ch2

, cha) nach 16 Stunden dunkel (D). (Vers.Nr. 72-2, 20 Tage alte Pfi., LlE-Bezugswert b. A = 678 nm.) - = ch+ minus chI, --- = ch+ minus ch2 , - ' -'- ' = ch+ minus chao Fig. 1: Difference (LIE,,) and derivative spectra (LIE' x) from measurements of the in vivo­leaf remission between the wildtype (ch+) and the nuclear gene mutants (ch 1,ch2, chs) after 16 hours dark (D) (Exp.no. 72-2, plants 20 days old, reference value for LI E at A = 678 nm.)

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342 A. R. KRANZ

.250 .025

.200 D20

.150 ,015

.100 .Q1O

D50 .005

620

~lSO -D15

~,

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I " I I \ I \I

Abb. 2: Differenz- (LlEx) und Derivativspektren (,;IE'x) aus In-vivo-Blattremissionsmessungen zwischen den homoallelen Kerngen-Mutanten ch 1 und cl} und der heteroallelen Kerngen­Mutante ch3 nach 16 Stun den dunkel (D). (Vers.Nr. 72-2, 20 Tage alte Pfl., Ll E-Bezugs­wert b. ;, = 678 nm.) - = ch2 minus ch', --- = ch1 minus cha, - ' - ' -'- = ch2 minus ch:l •

Fig. 2: Difference (11 Ex) and derivative spectra (LI E' x) from measurements of the in vivo­leaf remission between the homoallelic nuclear gene mutants chi and ch2 and the heteroallelic nuclear gene mutant ch:J after 16 hours dark (D). (Exp.no. 72-2, plants 20 days old, reference value for ! IE at ;, ~.~ 678 nm.)

ch2 }, = 698 und ch+ minus ch il A = 703; vergleiche hierzu Tab. 3). Das heiBt, die

Maxima bzw. Minima fur l lEx sind gegeneinander verschoben. Fur die Nulldurch­gange der Derivativspektren zwischen den Mutanten in Abb. 2 gilt das Umgekehrte. Bei A = 692 nm ist LI E' x stets Null, unterhalb A = 678 nm liegen die Nulldurchgange jedes Spektrums an anderer Stelle (fur ch2 minus Ch' bei ). = 664 und 648, fur ch' minus chJ bei A = 658 und 644, fur ch2 minus Ch3 bei A = 656 und 638); nur bei }. = 628 nm ist ,lE', wieder stets Null. Dieses Resultat bedeutet, daB zwischen dem Wildtyp und den Mutanten im Bereich der Protochlorophyllidabsorption keine we­sentlichen qualitativen Extinktionsdifferenzen bestehen, im Bereich der Chlorophyl­lidabsorption jedoch groBere qualitative Unterschiede vorliegen. Zwischen den Mutan-

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Langzeit-Transformationen der Chlorophylle in Bliittern von Arabidopsis thaliana 343

ten existieren dagegen fur die Chlorophyllvorstufe bei A = 628 nm und die -zwischen­stufe bei }, = 692 nm keine bedeutenden qualitativen Extinktionsdifferenzen, daruber

hinaus aber an sechs Stell en betdichtliche Unterschiede.

Tab. 3. Nulldurchgange von I1E'" in A (nm) der entsprechenden Maxima bzw. Minima von LlEx in den Differenz- und Derivativspektren zwischen den verschiedenen Genotypen von Arabidopsis thaliana. (Vers.Nr. 72-2, 20 Tage alte Pfl., I1E-Bezugswert bei A = 678 nm.) Table 3: Zero transitions of LlE'x in }, (nm) of the coordinated maxima and minima of LI Ex of the difference and derivative spectra between the different genotypes of Arabidopsis thaliana. (Exp. no. 72-2, plants 20 days old, reference value for LIE at A = 678 nm.)

Genotypen- Wellenlange der Nulldurchgange von LIE' x Differenz

ch+cht/ch+ch, - 627 647 692 chlcht/chlch t ch+cht/ch+ch+ - 627 647 698 ch2ch ,-Ich2ch+ ch+ch,/ch+ch+ - 627 647 703 ch+chs/ch+ch:J

ch2ch t /ch2ch t - 628 648 664 692 chlch,/chlch+ chlch,/chlch t - 628 644 658 692 ch + ch3/ ch + ch'l ch2ch t/ch2ch t - 628 638 656 692 ch + cha/ ch + ch3

Zunadist ist festzustellen, dag bei unseren 16 Std. dunkel gehaltenen Untersuchungs­objekten genotypisch bedingte Unterschiede vorliegen, die sowohl in qualitativer als auch in quantitativer Hinsicht bestimmte Vor- und Zwischenstufen der Chlorophyll­transformation betreffen. In der folgenden Diskussion soil u. a. der Versuch unter­nommen werden, die Zusammenhange zwischen den Pigmentvor- und -zwischenstufen in einem gemeinsamen Bildungsschema darzustellen.

Wie fruher festgestellt (KRANZ, 1971), bestehen zwischen den Mutanten und dem Wildtyp Unterschiede im Zustand zweier Kerngene und deren qualitativer und quan­

titativer Wirkung auf die fertigen Chlorophylle a und b. Die Rekombinanten und Hybriden ihrer Kreuzungen mit dem Wildtyp und untereinander entsprachen hierbei weitgehend den beteiligten Eltern bzw. dem Wildtyp. Daher stell ten wir uns nun die Frage, ob die Rekombinanten und Hybriden auch in qualitativer und quantitativer Hinsicht keine Unterschiede in den Chlorophylltransformationsstufen gegenuber den

entsprechenden Genotypen der Eltern besitzen. Hierzu wurden Differenzspektren

berechnet. Aus Pigmentextrakten in 80 Ofoigem Aceton erhielten wir z. B. sehr geringe

Extinktionsdifferenzen zwischen den FI-Hybriden dreier Kreuzungen mit dem Wild­typ, die im Verhaltnis zu den bisher behandelten Differenzspektren zwischen den rei­

nen Eltern auch im verdoppelten Magstab der Abb. 3 unwesentlich erscheinen. Ins-

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344 A. R. KRANZ

.050 .005

.025 .0025

61.0 650 fj/Q 68l 690 700 nm

-.050 -.005

Abb. 3: Differenz- (I1Ex) und Derivativspektren (,.1E'x) aus Absorptionsmessungen im Aceton­extrakt (80 Ofo) zwischen den FcHeterozygoten von drei Kreuzungen und dem Wildtyp. (Vers.Nr. 71-5, 45 Tage alte Pfl., ,.1E-Bezugswert b. A = 664 nm.) Fig. 3: Difference (if Ex) and derivative spectra (,.1 E' x) from measurements of the acetone extract (80 p.c) between the Ft heterozygotes of three crosses and the wildtype. (Exp.no. 71-5, plants 45 days old, reference value for ,.1E at A = 664 nm.)

----= LlEx, -'-'-'-'- = L1E'x, ------ =, liE" . . . . . . = f1Ej(,

} FI (ch3xch+) minus ch+,

FI (Chlxch3) minus ch+, FI (Ch3xchl) minus ch t

.

besondere bei den Spektren der reziproken Ft-Heterozygoten der Kreuzung zwischen den Mutanten ch' und Ch3 sind die Abweichungen von ,.1Ex = 0 sehr gering und der Kurvenverlauf bis }, = 675 identisch. Nur die Differenzkurve der FI-Heterozygote aus ch.1 X ch+ besitzt im Negativen je ein flaches Minimum bei }, = 640-675 nm. Dies bedeutet, dag diese Hybride hier einen geringen Pigmentunterschied gegeniiber dem Wildtyp besitzt, und somit die in ihr kombinierten Allele des Wildtyps (ch+) und der Mutante (Ch.1) nicht die Syntheseleistung der Normalform bewirken.

Diskussion

Unsere Methode der digitalen Messung von Absorptions- bzw. Remissionsspektren in einem Langzeitexperiment und ihre anschliegende Verrechnung zu Differenz- und Derivativspektren in Datenverarbeitungsanlagen liefert ein wei teres Beispiel, welche Fortschritte in der Pigmentforschung durch den Einsatz der EDV moglich sind. FRENCH und BROWN (1971) waren auf diesem Wege erfolgreich vorangeschritten, nachdem sie die ausschliegjich auf optischen Methoden beruhende Differenzspektrophotometrie nicht fiir ausreichend hielten, urn dicht benachbarte Extinktionsmaxima verschiedener Chlorophyllformen zu erfassen. Durch mathematisch-statistische Kurvensimulation in Computerprogrammen gelang ihnen schliegjich die Auflosung multipler Pigment-

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Langzeit-Transformationen der Chlorophylle in Bliittern von Arabidopsis thaliana 345

spektren in ihre einzelnen Komponenten. Die Oberlappung verschiedener Spektren im Gemisch eines Extraktes oder lebenden Blattes kann aber, wie unsere Ergebnisse zeigen, auch in Differenzkurven erkannt werden, wenn die Extinktionsdifferenzen (LIE,,) zu Derivativspektren (AE' x) verrechnet und geeignete Langzeitexperimente an einem ausgewahlten, genetisch definierten Material durchgeftihrt werden.

Oberblickt man die Chlorophyllforschung, so lassen sich vier Vorstellungen iiber die Langzeit-Transformation des Chlorophylls unterscheiden. In dem «SHIBATA-MEISTER­Konzept» (MEISTER, 1967) entstehen in 3 bis 4 Reaktionsschritten aus 1 Protochloro­phyll(id) (P 650) 3 Chlorophyll a-Formen (Ca 673, 677, 684) und 1 Chlorophyll b (P 650). In dem spater von KRASNOVSKY und seinen Mitarbeitern (LANG et a!., 1969) formulierten Konzept verlauft die In-vivo-Umwandlung der Chlorophylle in 5 Re­aktionsschritten von 2 Protochlorophylliden (P 655, 635) tiber 2 Chlorophyllide (CP 690, 680) zu 1 bis mehreren Chlorophyll-Aggregaten (Ca 686 usf.). Mit Hilfe ihrer neuen EDV-Programme unterscheiden FRENCH und BROWN (1971) 4 bis 6 Chlo­rophyll a-Formen (Ca 662, 670, 677, 683, 692, 705) und 2 Chlorophyll b-Formen (Cb 640, 650) in fertigen Plastiden verschiedener Pflanzenspezies. Dabei beachten sie allerdings nicht die Frage nach ihrer genetisch kontrollierten Bildung. Neuerdings hat THORNE (1971) sich mit dem Problem der Chlorophylltransformationen in Langzeit­reaktionen befaBt und ein Konzept entwickelt, in welchem aufgrund von Fluoreszenz­messungen an Bohnenblattern in 2 Licht- und 2 Dunkelaktivierungsschritten aus 3 Pro­tochlorophylliden (P 628, 637, 651) tiber ein Intermediat mit Emax = 668 nm, 2 Chlo­rophyllide (CP 678, 683) und schlieJ31ich 1 Chlorophyll (C 672) gebildet werden.

Diese Konzepte zeigen, wie mit der Verbesserung der Methoden die Anzahl der Transformationsstufen von 4 auf 7 zugenommen hat. Die Obereinstimmung ihrer Elllax- Werte mit unseren Ergebnissen (AErnax bzw. LIE' = 0) ist auffallend. Die Abwei­chungen sind so gering, daB sie durch die Objektunterschiede und/oder die Grenzen der MeBgenauigkeit verursacht sein konnen. Auf dieser Grundlage haben wir unsere zu einer weiteren Vermehrung der Transformationsstufen ftihrenden Ergebnisse in einem Schema zusammengefafh (Abb. 4). In Obereinstimmung mit den zuvor dargestellten Konzepten unterscheiden wir 4 abschlieBende Stufen der Chlorophyll-Biosynthese, die des Mg-Protoporphyrins IX und seiner Esterverbindungen, der Protochlorophyllide, der Chlorophyllide und der Chlorophylle. Hierbei kommt es in den drei letzten Stu­fen zur Bindung des Pigmentmolektils an EiweiBkomplexe (Holochrombildung). Wir gehen zunachst davon aus, daB in jeder dieser Stufen Holochrome entstehen, da in jeder Stufe proteinabhangige Fluoreszenzanregung nachgewiesen wurde (THORNE, 1971). Unsere Untersuchungsergebnisse stimmen vollsrandig mit den genannten Kon­zepten darin tiberein, daB der Obergang von der Protochlorophyllid- zur Chloro­phyllidstufe photochemische Hydrierungsreaktionen und die Umwandlung der Chlo­rophyllid-Holochrome zu den Chlorophyll-Holochromen im Dunkel ablaufende Phy­tylierungsreaktionen darstellen.

Dartiber hinaus mtissen wir annehmen, daB beide Reaktionen in zwei weitgehend getrennten Wegen ablaufen, denn bei der Bildung der Protochlorophyllide (PC) und

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346 A. R.KRANZ

Ausgongsstufe

Mq - ProtORQrilbl'd!!, r -- I

Vorstufe

Protochloroilbyll id

I

Zwischenstufe

Chloroplly""ll.:..:i d=---_-,

Endstufe

Chlorophyll

~

PCa CPO 635 678

P CoH Jj-----. { : --- ~ ~~: i--~2H e------~t-

Licht P 705-711

------------~. CaH 678

PCb

@) 629} CPb ( Cb 647 )

+---+------+{ CPbH r PCbH 1 0 I

638 I I I

675 ~ Cb H 653

@) @ Abb.4: Schema der kerngen-kontrollierten, langzeitigen Chlorophylltransformationen bei Arabidopsis thaliana aufgrund der vorliegenden Ergebnisse. PC".h = Protochlorophyllid a rsp. b, PCa.l,H = Protochlorophyllid-Holochrom a rsp. b, CP a.h = Chlorophyllid a rsp. b, CP".hH = Chlorophyllid-Holochrom a rsp. b, C".bH O~ Chlorophyll-Holochrom a rsp. b. Fig. 4: Scheme of the longtime chlorophyll transformation and their monogenic control III

Arabidopsis thaliana based on the data presented.

ihrer Umwandlung zu den Holochromen (PCH) bestehen quantitative Unterschiede zwischen den Genotypen; der Wildtyp bildet im Dunkeln mehr PCa und PCb als die drei Mutanten (siehe Tab. 1 und 2, Spalte 1 und 2). Dies gilt vermutlich auch fur die Protochlorophyllid-Holochrome a und b (Tab. 1, Spalte 6), doch ist hier keine eindeu­tige Aussage moglich, da ihre Extinktionsmaxima sich im Bereich der maximalen Ab­sorption des Chlorophyll b-Holochroms (CbH) befinden. Qualitative Unterschiede sind aber bei der Chlorophyllid- (CP) Bildung festzustellen (Tab. 2, Spalte 3 und 7). Der Wildtyp und die Mutante Ch3 besitzen im Licht mehr CPa und CPb als die homo­allelen Mutanten ch' und chz. Diese haben im Licht nur im CPa einen Oberschug, d. h. ihre CPb-Bildung mug weitgehend blockiert sein. Auch in der nachfolgenden Pigment­bin dung an den Eiweigkomplex wirken sich diese qualitativen Unterschiede aus (Tab. 2, Spaltc 4 und 5), indem wiederum ch+ und Ch3 im Licht mehr CPbH und ChI sowie chz keinen CPbH-Oberschug besitzen. Dagegen wird CPaH bei allen Genotypen gebildet und im Dunkeln umgewandelt. Unsere qualitativen und quantitativen Aus­sagen zur Chlorophyll-Holochrom-Bildung sind erschwert, da die Extinktionsmaxima mehrerer Pigmentformen sich im Bereich der grog ten Absorption des CaH und CbH

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Langzeit-Transformationen cler Chlorophylle in Blattern von Arabidopsis thaliana 347

iiberlagern (Tab. 2, Spalte 6 und 7). Es fallt aber auf, dag gleiche quantitative Unter­schiede zwischen den Genotypen wie bei den Protochlorophylliden bestehen (Spalte 1 und 2). Da wir bei Chi und ch2 mit weitgehender Blockade der CbH-Bildung rechnen konnen, besteht in dies em Spektralbereich kein wesentlicher CbH-Anteil an der Ex­tinktionsdifferenz und deshalb sprechen die gefundencn LlEx-Unterschiede fur die Existenz eines oder mehrerer PCH (Spalte 6). Dariiber hinaus ist folgendes zu beden­ken. Da wir im Gegensatz zu THORNE (1971) in Langzeit-Experimenten Remissions­messungen durchfuhrten, konnen wir nicht entscheiden, ob die photochemischen Hy­drierungen an den Holochromen der PC und/oder den proteinfreien Pigmenten ab­laufen (siehe Schema Abb. 4). Nach vorherrschender Ansicht sind diese Umwandlun­gen ausschliemich im Holochromzustand moglich. NADLER und GRANICK (1970) neh­men sogar an, dag der Proteinkomplcx des Holochroms als Protoenzym mehrmals

funktionieren kann.

An den signifikant niedrigeren LlEx-Werten der heteroallelen cha gegenuber den anderen Genotypen (Tab. 2, Spalte 8) ist zu erkennen, dag bei ihr die CPaH-Um­wandlung zu P 705 wahrscheinlich quantitativ blockiert ist. Offensichtlich wirkt das chrAllel auf beide Transformationswege der Chlorophylle ein. Augerdem pravaliert es schwach uber das betreffende Wildallel ch+, denn die Heterozygote ch+/ch3 absorbiert im Acetonextrakt im Bereich des CPa und Ca (Emax = 678, 664) sowie des CPb und Cb (Em ax = 669, 647) etwas weniger als der Wildtyp (siehe Abb. 3). Doch besteht diese Interaktion nicht mit dem Heteroallel chl, da in der doppelt heterozygoten Fl der Kreuzungen ChI X cha und ch:1 X Chi dieser Effekt nicht auftritt. Hieraus folgt, dag die prim are Wirkung der Homoallele ch 1 und ch2 in dem Ausfall der enzymati­schen Steuerung der photochemischen Reduzierung des PCb bzw. PCbH zum CPb bzw. CPbH, die Wirkung des Heteroallels cha in der verminderten Bindung des CPa an die Eiweigkomplexe des CPaH und P 705 zu suchen ist. Diese Feststellung steht im Einklang mit der Tatsache, dag die Lamellarstruktur des Ch.1 entgegen den beiden anderen Mutanten starke Defekte zeigt (VELEMINSKY und ROBBELEN, 1966), und wir in fruheren Untersuchungen (KRANZ, 1971) Hinweise fur die Existenz eines Wirk­stoffes im plastidenfreien Extrakt des Wildtyps erhielten, der die photochemische Um­wandlung von Cb-Vorstufen im chrPlastiden reguliert. In weiteren Untersuchungen wird zu klaren sein, ob und in welchem Umfang die von HENNINGSEN (1970) an Boh­nen-Etioplasten beobacnteten licht- und temperaturabhangigen Membranstrukturver­anderungen wahrend der Photoreduktion und Phytilierung in unserem Material be­troffen sind.

Unsere Vorstellung iiber die Existenz getrennter Reaktionswege des Ca und Cb in der Endphase der Chlorophyllbiosynthese steht im Gegensatz zu den Ergebnissen anderer Autoren. Diescn war aber entweder eine die Cb-Umwandlung einschliegende, vollstandige spektralanalytische Erfassung der Transformationsstufen nicht moglich - weil sie die Startphase der Ergriinung in etiolierten Blattern untersuchten (VIRGIN und FRENCH, 1972), in der die Cb-Synthese bekanntlich mit erheblicher Verzogerung gegenuber Ca anlauft - oder sie bilanzierten die Umwandlungsreaktionen in 14 C-

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348 A. R. KRANZ

Markierungsversuchen (SHLYK, 1970), wobei sie in ihren Pigmentextrakten ebenfalls nicht alle Obergangsverbindungen der Chlorophylle unseres Schemas erfassen konnten. Die Diskussion der Frage, ob die mutierten Gene unseres Pflanzenmaterials die Ko­dierung von Struktur- und/oder Enzymproteinen der Endphase der Chiorophyllsyn­these beeintrachtigen, erscheint uns z. Z. verfriiht, zumal auch die Experimente mit In­hibitoren von NADLER und GRANICK (1970) sowie SHLYK et al. (1972) noch keine ein­deutige Klarung dieses Problems brachten.

Es bleibt weiteren Untersuchungen vorbehalten, unsere Ergebnisse an einer grageren Zahl von Objekten zu iiberpriifen. Hierbei wird es interessieren

1. ob es mit neuen Aufbereitungsverfahren gelingt, alle Chlorophyllvorstufen zu iso­lieren,

2. die Photoaktivitat der verschiedenen Umwandlungsreaktionen des PC quantitativ zu erfassen,

3. welche Beziehungen zwischen den o. a. Transformationen der Chiorophyllbildung und den im Kurzzeitexperiment auftretenden Pigmentanderungen der Photosy­sterne I und II auftreten,

4. die Ursachen des quantitativen Effekts aller drei Mutantenloci auf die Photochlo­rophyllidbildung zu kIaren,

5. schliemich die beobachteten Pigmentumwandlungen in ihrer Abhangigkeit yom genetischen Material der Plastiden zu untersuchen. Die Bemiihungen zur Lasung des Problems der primaren Genwirkung im Chloro­

plasten werden damit neue Impulse erhalten.

Der Deutschen Forschungsgerneinschaft rnochte ich besonders danken; sie unterstiitzte die derivativspektroskopischen Untersuchungen durch eine groihiigige Sachbeihilfe. Frau B. KIRCH­HElM ist fiir ihre unerrniidliche technische Mitarbeit zu danken.

Literatur

ARONOFF, S., and R. K. ELLSWORTH: Photosynthetica 2, 288 (1968). BROWN, J. S.: Photo chern. Photo bioI. 2, 159 (1963). FALUDI-DANIEL, A., et al.: Progr. Photosynth. Res. II, 592 (1969). FRENCH, C. S., and G. E. HARPER: Carnegie Inst. Wash. Year Book 56, 281 (1956/57). FRENCH, C. S., and L. PRAGER: Progr. Photosynth. Res. II, 555 (1969). FRENCH, C. S., and J. S. BROWN: IInd Internat. Congr. Photosynth., Stresa pg. 271 (1971). HENNINGSEN, K. W.: J. Cell. Sci. 7, 587 (1970). HENNINGSEN, K. W., and A. KAHN: Plant Physiol. 47, 685 (1971). KRANZ, A. R.: Arabid. Inf. Servo 7, 28 (1970). - Theoret. Appl. Genet. 41, pg. 45, 91 and 191 (1971). - Arabid. Inf. Servo 9, 19 (1972). KRASNOVSKY, A. A.: Ann. Rev. Plant Physiol. 11,363 (1960). MACHOLD, 0., und G. SCHOLZ: Naturwiss. 56,447 (1969). MEISTER, A.: Photosynthetica 1, 149 (1967). MEISTER, A., and T. G. MASLOVA: Photosynthetica 3, 63 (1968). METZNER, H.: Z. Pflanzenphysiol. 54, 183 (1966). - Fortschr. Bot. 32, 55 (1970).

Z. P/lanzenphysiol. Ed. 70. S. 333-349. 1973.

Langzeit-Transformationen der Chlorophylle in Bliittern von Arabidopsis thaliana 349

NADLER, K., and S. GRANICK: Plant Physiol. 46, 240 (1970). NASYROV, Y. S., et a!.: Akad. Wi~s. UdSSR, Biochem. Biophys. Photosynth. Irkutsk. pg. 121

(1971). - Genet. Aspects Photosynth., All-Union Symp., Dushanbe, pg. 24 (1972). SCHNEIDER, H.: Pro gr. Photosynth. Res. II, 552 (1969). SCHOPFER, P., and H. W. SIEGELMANN: Progr. Photosynth. Res. II, 611 (1969). SHIBATA, K.: J. Biochem. Japan 44, 147 (1957). SHLYK, A. A.: Acad. Sci. BSSR, Lab. Biophys. Isotopes, Minsk 1965. Eng!. Trans!. Jerusalem

(1970). SHLYK, A. A., et a!.: Genet. Aspects Photosynth., All-Union Symp. Dushanbe, pg. 37 (1972). THORNE, S. W.: Biochim. Biophys. Acta 226,113 (1971). VELEMINSKY, J., und G. ROBBELEN: Planta 68, 15 (1966). VIRGIN, H. 1., and C. S. FRENCH: Carnegie Inst. Wash. Year Book 71, 187 (1972). VOGT, B.: Staatsex.arb. Bio!., unveroffentlicht (1971). WETTSTEIN, D. v.: Genet. Aspects Photosynth. All-Union Symp., Dushanbe pg. 21 (1972).

Prof. Dr. A. R. KRANZ, D-6000 Frankfurt/M.-l, Siesmayerstr. 70.

z. PJlanzenphysiol. Bd. 70. S. 333-349. 1973.