Profen- und Arylessigsäure-Derivate als Strukturanaloga ...pharmchem.pharmazie.uni-halle.de/pdf/rogosch_diplomarbeit.pdf · Die Strukturaufklärung der Cyclooxygenase-1 (COX-1)1

Profen- und Arylessigsäure-Derivate als Strukturanaloga

endogener Cannabinoide

DIPLOMARBEITzur Erlangung des akademischen Grades

Diplompharmazeut

dem

Fachbereich Pharmazeutische Chemie

der Martin-Luther-Universität in Halle-Wittenberg

vorgelegt

von

Tobias Rogosch

aus Werl

1. Gutachter Prof. Dr. P. Nuhn

Fachbereich Pharamzie der Martin-Luther-Universität, Halle

2. Gutachter Prof. Dr. P. Imming

Fachbereich Pharmazie der Philipps-Universität, Marburg

Marburg/Lahn, im August 2003

Danksagung

Ich möchte mich an dieser Stelle bei Herrn Prof. Dr. Imming bedanken.

Als Betreuer dieser Arbeit war er jeder Zeit ein guter Ansprechpartner. Durch zahlreiche Anre-

gungen trug er maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit bei.

Herrn Prof. Dr. Nuhn danke ich für die Unterstützung und Mitbetreuung meiner Arbeit.

Herrn Priv. Doz. Dr. Kathmann (Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Universität

Bonn) danke ich für die Bestimmung der Affinität der Verbindungen zu CB1-Rezeptoren.

Inhaltsverzeichnis i

Inhaltsverzeichnis

I. THEORETISCHER TEIL.............................................................................................................................1

1. ZUSAMMENFASSENDE EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG................................................................................1

2. CANNABINOID-REZEPTOREN UND LIGANDEN...............................................................................................2

3. COX (CYCLOOXYGENASE) UND LIGANDEN .................................................................................................6

4. AUFGABENSTELLUNG ...................................................................................................................................8

5. SYNTHESEN ..................................................................................................................................................9

6. AFFINITÄTSMESSUNGEN .............................................................................................................................11

7. AUSBLICK, WEITERE ARBEITEN..................................................................................................................12

II. EXPERIMENTELLER TEIL .....................................................................................................................13

1. ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN..............................................................................................................13

1.1 Chromatographie ..................................................................................................................................13

1.2 Analytik .................................................................................................................................................13

2. ALLGEMEINE VORSCHRIFTEN.....................................................................................................................15

2.1 AV 1: Synthese der Pentafluorphenolester............................................................................................15

2.2 AV 2: Synthese der Ethanolamide.........................................................................................................15

3. EINZELVERBINDUNGEN ..............................................................................................................................16

3.1 S-Naproxen-pentafluorphenylester .......................................................................................................16

3.2 S-Naproxen-ethanolamid......................................................................................................................17

3.3 R-Naproxen pentafluorphenylester .......................................................................................................18

3.4 R-Naproxen-ethanolamid......................................................................................................................19

3.5 S-Ibuprofen pentafluorphenylester........................................................................................................20

3.6 S-Ibuprofen-ethanolamid......................................................................................................................21

3.7 Indometacin pentafluorphenylester.......................................................................................................22

3.8 Indometacin-ethanolamid .....................................................................................................................23

3.9 S-Flurbiprofen pentafluorphenylester...................................................................................................25

3.10 S-Flurbiprofen-ethanolamid .................................................................................................................26

3.11 R-Ibuprofen pentafluorphenylester.......................................................................................................27

3.12 R-Ibuprofen-ethanolamid......................................................................................................................28

3.13 R-Flurbiprofen pentafluorphenylester ..................................................................................................29

3.14 R-Flurbiprofen-ethanolamid .................................................................................................................30

4. AFFINITÄTSMESSUNG .................................................................................................................................31

III. LITERATURVERZEICHNIS.....................................................................................................................33

Inhaltsverzeichnis ii

Verzeichnis der Abkürzungen iii

Verzeichnis der Abkürzungen:

2-AG 2-Arachidonylglycerol

AcOH Essigsäure

Bmax Maximale Bindungskapazität

t-BuOMe tert. Butylmethylether

cAMP cyclisches Adenosin-3', 5'-monophosphat

CB Cannabinoid-Rezeptor

cGMP cyclisches Guanosin-3', 5'-monophosphat

COX Cyclooxygenase

dc dünnschichtchromatographisch

DCC Dicyclohexylcarbodiimid

DCU Dicyclohexylharnstoff

ECS endogenes Cannabinoid System

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EtOAc Ethylacetat

FAAH Fatty acid amidohydrolase (Fettsäure Amidhydrolase)

g Erdbeschleunigung; 9,81 m/s2

Ki Verdrängungskonstante

LM Lösungsmittel

NSAR Nichtsteroidale Antirheumatika

PI Phosphatidylinositol

RT Raumtemperatur

TMS Tetramethylsilan

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

ZNS zentrales Nervensystem

Theoretischer Teil 1

I. Theoretischer Teil

1. Zusammenfassende Einleitung und Zielsetzung

Die Strukturaufklärung der Cyclooxygenase-1 (COX-1)1 und Cycloxygenase-2 (COX-2)

führte zu einem besserem Verständnis der Struktur-Wirkungs-Beziehungen der nichtsteroi-

dealen Antirheumatika (NSAR). Eine wichtige Gruppe von seit längerem auf dem Markt be-

findlichen NSARs sind die 2-Arylpropion- und Arylessigsäuren, wie zum Beispiel Ibuprofen,

Naproxen, Flurbiprofen (2-Arylpropionsäuren) und Indometacin (Arylessigsäure), die im

Rahmen dieser Arbeit verwendet wurden. Diese Substanzen inhibieren die Oxidation von

Arachidonsäure durch COX und sind dadurch analgetisch und antiphlogistisch wirksam. Bei

den Propionsäure-Derivaten besitzen die Konfigurationsisomere eine unterschiedlich starke

Wirkung. Schon in den 60er Jahren wurde eine deutlich größere Wirksamkeit des

S-(+)-Enantiomers des Naproxen gegenüber dem R-(-)-Enantiomer nachgewiesen.

Allerdings konnten bisher noch nicht alle Wirkungen und Nebenwirkungen zufriedenstellend

geklärt werden. Daraus ergab sich dann die Suche nach anderen bislang unbekannten Wirk-

mechanismen der NSARs. In den letzten Jahren wurden mehrere andere Mechanismen, z.B.

die Hemmung von NF-κB, untersucht. Bei diesen Untersuchungen wurde unter anderem beim

R-Ibuprofen auch eine analgetische Wirkung beobachtet. In üblichen Dosierungen erreicht

R-Ibuprofen nicht eine für COX-Hemmung ausreichende Konzentration in Körperflüssigkei-

ten; die Analgesie muß daher durch Angriff an einer anderen Stelle erfolgen.

Durch die Entdeckung der Arachidonsäuremetabolite als endogene Liganden der Cannabi-

noid-Rezeptoren und dem Nachweis von deren analgetischer Wirkung scheint es naheliegend,

eine Wirkung der COX-Inhibitoren – als Arachidonsäure-Mimetika - an diesen Rezeptoren zu

vermuten. Am ehesten kommen Analoga der endogenen Cannabinoide in Frage, die im Zuge

der Verstoffwechselung der NSARs entstehen können.

Ziel dieser Arbeit war es, mögliche Metabolite dieser NSARs herzustellen und auf Affinität

zu Cannabinoid-Rezeptoren zu testen.

(1) Picot et al. Nature 1994, 367, 243-249


2. Cannabinoid-Rezeptoren und Liganden

Die Isolierung und Strukturaufklärung des Hauptwirkstoffs von Cannabis sati-

va, ∆9-Tetrahydrocannabinol, Mitte der 1960er Jahre2 markierte einen Meilenstein im Ver-

ständnis der Wirkung von Cannabis-Produkten. Aber es hat danach noch Jahre gedauert, bis

das endogene Cannabinoid-System (ECS) charakterisiert war.3 1988 wurden erstmals eindeu-

tige Beweise für die Existenz von spezifischen Bindestellen für Cannabinoide im Gehirn von

Ratten erbracht4.

Das endogene-Cannabinoid System ist hauptsächlich für die Wirkung der Cannabinoide ver-

antwortlich. Es besteht aus zwei G-Protein-gekoppelten membranständigen Rezeptoren -

Cannabinoid-Rezeptor 1 (CB1)5 und Cannabinoid-Rezeptor 2 (CB2)6 - und den endogenen

Liganden (Endocannabinoiden) wie Anandamid (Arachidonylethanolamid)7, 2-Arachidonyl-

glycerol8 und Noladinether (2-Arachidonylglycerylether)9 sowie einem Inaktivierungssystem.

Diese Endocannabinoide sind keine Peptide wie die endogenen Liganden anderer G-Protein

gekoppelter Rezeptoren, sondern Derivate des nicht-oxidativen Metabolismus einer Fettsäure

und werden zur Familie der Eicosanoide gerechnet.

Abb. 2.1 Biosynthese und Abbau von 2-Arachidonylglycerol

(2) Mechoulam et al. Tetrahedron 1965, 21, 1223-1229 (6) Munro et al. Nature 1993, 365, 61-65

(3) Martin et al. J Pharmacol Exp Ther 2002, 301, 790-796 (7) Devane et al. Science 1992, 258, 1946-1949

(4) Devane et al. Mol Pharmacol 1988, 34, 605-613 (8) Sugiura et al. Biochem Biophys Res Commun 1995, 215, 89-97

(5) Matsuda et al. Nature 1990, 346, 561-564 (9) Hanus et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2001, 98, 3662-3665

Phosphatidylinositolbiphosphat (PIP2)

Phosphatidylinositol (PI)

Diacylglyerol Lysophosphatidylinositol (LysoPI)

2-Arachidonylglycerol

Triacylglycerol

PA, PC, PE

Phospholipase C Phospholipase A1

Diacylglycerollipase

Monoacylglycerolacyltransferase

Phospholipase C

Arachidonsäure2-Arachidonyl LPA

Phosphatase MonoacylglycerolkinaseMonoacylglycerollipase

PA

CDP-diacylglycerol

PC, PE


2-Arachidonylglycerol wird auf zwei verschiedenen Wegen gebildet (Abb. 2.1). Der erste

Stoffwechselweg besteht aus der schnellen Hydrolyse Phosphatidylinositols (PI) durch die

Phospholipase C und der nachfolgenden Hydrolyse des entstandenen Diacylglycerols durch

die Diacylglycerollipase.10

Beim zweiten Weg wird PI zuerst durch die Phospholipase A1 zu LysoPI hydrolysiert und

anschließend durch die Phospholipase C zu 2-AG.11

Abb. 2.2 Biosynthese und Abbau von Anandamid

Auch für die Biosynthese von Anandamid sind zwei Stoffwechselwege bekannt (Abb. 2.2).

Die erste – weniger wichtige – Variante ist die direkte N-Acylierung von Ethanolamid durch

die Anandamid-Amidhydrolase/Fettsäure-Amidhydrolase, die eigentlich für den Abbau von

(10) Prescott et al. J Biol Chem 1983, 258, 764-769 (14) Vogel et al. J Neurochem 1993, 61, 352-355

(11) Ueda et al. J Neurochem 1993, 61, 1874-1881 (15) Felder et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1993, 90, 7656-7660

(12) Kurahashi et al.. Biochem Res Commun 1997, 237, 512-515 (16) Childers et al. Biochem Pharmacol 1994, 47, 711-715

(13) Schmid et al. Prog Lipid Res 1990, 29, 1-43 (17) Bayewitch et al. FEBS Lett 1995, 375, 143-147

O

OO

P OO

O

O

R1R2

OCH2

CH2

NH2 O

OO

P OO

OR3

OX

O

ONH

CH2

CH2

O

OO

P OO

O

O

R1R2

OO

OHO

PO

OR3

OO X

O

OO

P OHO

O

O

R1R2

O

ONH

CH2

CH2

OHO

OH

NH2CH2

CH2

OH

+

Ca2+ Transacylase

Phosphatidylethanolamin (PE) Phospholipid (1-O-arachidonyl)

+

N-arachidonyl PE Lysophospholipid

Phosphodiesterase

+Anandamid Arachidonsäure

Ethanolamid

FAAH


Anandamid verantwortlich ist, bei genügent hoher Arachidonsäure- und Ethanolamin-

konzentration aber auch die Synthese katalysiert.12

Anandamid wird hauptsächlich durch die Umsetzung von N-Arachidonyl-Phosphatidyl-

ethanolamin durch die Phosphodiesterase gebildet werden. Dieser Weg ist der Hauptsynthe-

seweg für verschiedene N-Acylethanolamide wie z.B. N-Palmityl- und N-Stearyl-

ethanolamid.13

Die beiden Cannabinoid-Rezeptoren sind über inhibitorische G-Proteine (Gi-Proteine) an die

Adenylatcyclase gekoppelt14-17 und verhindern so die Umwandlung von Adenosinmonophos-

phat (AMP) in cyclisches AMP (cAMP).

CB1-Rezeptoren wurden erstmals 1990 geklont, weisen sieben Transmembrandomänen auf,

bestehen aus 472 Aminosäuren5 und kommen hauptsächlich im zentralen Nervensystem

(ZNS) vor, vorwiegend auf Interneuronen in Regionen, die für Motorik, Schmerzempfinden

und Lernen zuständig sind; eine weiter Funktion ist die Regulierung der Neurotransmitter-

Freisetzung durch die negative Beeinflussung von spannungsgesteuerten Ca2+-Kanälen des

N-, P/Q- und L-Typs15,18-20 und die positive Beeinflussung von A-Typ und einwärts gerichte-

ten K+-Kanälen19,21,22. Es wird auch die Freisetzung von Arachidonsäure bewirkt23,24.

CB2-Rezeptoren wurden 1993 geklont, weisen auch sieben Transmembrandomänen auf, be-

stehen aus 360 Aminosäuren6 und sind im Immunsystem in Mastzellen, B- und

T-Lymphozyten lokalisiert. Ihre Funktion ist noch nicht eindeutig geklärt, aber sie scheinen

die Cytokin-Freisetzung zu beeinflussen.

CB1- und CB2-Rezeptoren sind zu 44% identisch (in den Transmembrandomänen zu 68%).

Es gibt inzwischen auch Beweise, daß noch ein oder mehrere zusätzliche Cannabinoid-

Rezeptoren existieren25-27. Darauf soll im Rahmen dieser Arbeit aber nicht weiter eingegan-

gen werden.

Das Inaktivierungs-System besteht aus der Wiederaufnahme von Anandamid und dem intra-

zellulärem Metabolismus durch die Fettsäureamidhydrolase (FAAH)28.

Das ECS ist an der Regulierung einer Vielzahl an physiologischen Funktionen beteiligt, wie

Antinozizeption, Gehirnentwicklung, Gedächtnis, retrograde neuronale Kommunikation,

(18) Mackie et al. Mol Pharmacol 1993, 44, 498-503 (22) McAllister et al. J Pharmacol Exp Ther 1999, 291, 618-626

(19) Mackie et al. J Neurosci 1995, 15, 6552-6561 (23) Shivachar et al. Biochem Pharmacol 1996, 51, 669-676

(20) Gebremedhin et al. Am J Physiol 1999, 276, 2085-2093 (24) Berdyshev et al. Eur J Pharmacol 1997, 330, 231-240

(21) Felder et al. Mol Pharmacol 1995, 48, 443-450 (25) DiMarzo et al. J Neurochem 2000, 75, 2434-2444


Kontrolle der Motorik, kardiovaskuläre und immunologische Regulierung und Zellproliferati-

on.

In Folge dessen sind Verbindungen, die das ECS beeinflussen, potentielle Therapeutika für

die Behandlung von verschiedenen neurodegenerativen Krankheiten wie Multipler Sklerose29

oder Chorea Huntington30 und auch für die Behandlung von Schmerzen31. Auch zur Behand-

lung von Übergewicht, das als eine der Hauptursachen für viele Erkrankungen, wie z.B. Dia-

betes Typ II und Hypertonie gilt, lassen sich CB-Antagonisten einsetzen.32,33

Abb. 2.3 Strukturformeln der Endocannabinoide

In Tabelle 2.1 sind die Ki Werte der Endocannabinoide aufgeführt.

Anandamid Noladinether 2-Arachidonylglycerol

CB1 89 34 21.2 9 58.3 34

CB2 371 34 >3000 9 145 34

Tab. 2.1: Ki [nM]

(26) Pertwee et al. . Life Sci 1999, 65, 597-605 (30) Lastres-Becker et al. Synapse 2002, 44, 23-35

(27) Breivogel et al. Mol Pharmacol 2001, 60, 155-163 (31) Giuffrida et al. J Pharmacol Exp Ther 2001, 298, 7-14

(28) Deutsch et al. Biochem Pharmacol 1993, 46, 791-796 (32) Druce et al. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2003, 6, 361-367

(29) Baker et al. Faseb J 2001, 15, 300-302 (33) Lange et al PCT Int. Appl.; (Solvay Pharmaceuticals). Wo, 2001

OOH

OH

Noladinether

O

O

OH

OH


NH

OHO

Anandamid


3. COX (Cyclooxygenase) und Liganden

Nichtsteroidale Antirheumatika (NSAR) wie Ibuprofen, Indometacin oder Naproxen werden

in therapeutischen Dosen für die Behandlung von Schmerzen, Entzündungen und Fieber ein-

gesetzt. Sie entfalten ihre Wirkung über die Hemmung der Cyclooxygenasen (COX)35. Bis-

lang sind zwei Isoenzyme der COX bekannt: COX-1, ein konstitutives Enzym in zahlreichen

Körpergeweben, und COX-2, ein induzierbares Enzym im Gehirn. Diese Enzyme katalysieren

die Umwandlung der Arachidonsäure, eine vierfach ungesättigte C20-Fettsäure, in

Prostaglandine. Prostaglandine sind Hormone, die lokal und in geringen Konzentrationen von

bestimmten Zelltypen freigesetzt werden und am Freisetzungsort über Membranrezeptoren

ihre Wirkung entfalten, z.T. auch von cAMP und cGMP vermittelt.

Die biologischen Effekte dieser Eicosanoide sind sehr vielfältig, dazu gehören u.a. die:

- Regulation der Gefäß-Muskulatur

- Regulation der Nierendurchblutung

- Regulation der Thrombocytenaggregation (TXA2, PGI2)

- Funktion als Schmerzmediatoren

- Funktion als Fieberinduktoren

- Bronchokonstriktion (PGF2α, PGD2, TXA4, PGG2)

- Bronchodilatation (PGE2, PGI2)

- Funktion als Modulatoren von Immunantworten

- Regulation im ovariellen Zyklus

- Regulation der Magenschleim- und Magensäureproduktion (PGE2, PGI2)

Aufgrund der Beteiligung an diesen physiologischen Vorgängen ist die selektive Hemmung

der erhöhten Prostaglandinfreisetzung bei pathophysiologischen Prozessen wie z.B. Entzün-

dungen oder Schmerz wünschenswert.

Die COX katalysieren die Umwandlung der Arachidonsäure in cyclische Endoperoxide

(Prostaglandin H2 und G2), der Vorstufe der Prostaglandine, Thromboxan A und Prostacyclin.

Dabei werden zwei Reaktionsschritte unterschieden, die durch verschiedene Domänen der

COX katalysiert werden (Abb.2.4).

(34) Pertwee Tocris Review No. 16 2001 (35) Laneuville et al. J Pharmacol Exp Ther 1994, 271, 927-934


- Die Cyclyoxygenase-Reaktion, bei der es zur Ausbildung des C-5 Ringsystems kommt

(PGG2)

- Die Peroxidase-Reaktion, bei der die Peroxidfunktion am C-15 zum Alkohol reduziert

wird (PGH2)

Abb. 2.4 Arachidonsäure-Kaskade

Hinweise auf ein weiteres Isoenzym wurden 1997 erstmals entdeckt. COX-3 wird vom selben

Gen wie COX-1 codiert, nur das Splicing der RNA ist verschieden. Durch das Beibehalten

des ersten Introns könnte die Faltung, Dimerisierung und die Bindetasche verändert wer-

den.36,37

(36) Chandrasekharan et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002, 99, 13926-13931 (37) Schwab et al. The Lancet 2003, 361, 981-982

Phospholipide

Phospholipase A2

AnandamidFAAH

Arachidonsäure

LipoxygenaseCOX-1 und COX-2

PGG2 HPETE

HETE

Leukotriene

PER

PGH2

PGD2

PGE2

PGF2a PGI2TXA2


Monoacylglycerollipase


4. Aufgabenstellung

Ibuprofen und Flurbiprofen inhibieren die Fettsäureamidhydrolase, die für die Hydrolyse von

Anandamid zu Arachidonsäure und Ethanolamid verantwortlich ist. Hierbei fällt auf, daß das

R-(-)-Enantiomer des Ibuprofens eine etwa zwei- bis dreifache Potenz gegenüber dem S-(+)-

Enantiomer hat38. Beim Flurbiprofen sind beide Enantiomere equipotent.

Durch die Inhibition von sowohl COX wie auch FAAH steigt die Arachidonsäure-

Konzentration und damit auch die Anandamidsynthese und gleichzeitig wird auch der Abbau

von Anandamid verlangsamt. Dies deutet auf eine indirekte analgetische Wirkung der NSAR

über das Endocannabinoidsystem hin. Versuche hierzu haben gezeigt, daß die durch Flurbi-

profen erzeugte Analgesie nur unbedeutend durch eine Coinjektion von PGE2 aufgehoben

wird; bei gleichzeitiger Gabe des selektiven CB1-Rezeptor-Blocker AM-251 wurde die Anal-

gesie allerdings fast vollständig aufgehoben39.

Neben der FAAH-Hemmung kommt eine direkte Wirkung von Profenmetaboliten an

CB-Rezeptoren in Frage. Deshalb sollten - wie schon eingangs dargelegt - im Rahmen dieser

Arbeit Arylessigsäure- und Arylpropionsäureanaloga des endogenen Cannabinoids Ananda-

mid synthetisiert werden.

Am ehesten kommen Analoga der endogenen Cannabinoide in Frage, die im Zuge der Ver-

stoffwechselung der NSAR entstehen können.

Ziel dieser Arbeit war es, mögliche Metabolite dieser NSARs herzustellen und auf Affinität

zu Cannabinoid-Rezeptoren zu testen.

Das präparative Vorgehen bei der Synthese der Ethanolamide ist in Abb. 5.1 gezeigt.

(38) Fowler et al. Arch Biochem Biophys 1999, 362, 191-196 (39) Ates et al. Eur J Neurosci 2003, 17, 597-604


5. Synthesen

Abb. 5.1 Syntheseplan der Ethanolamide

Der erste Schritt war eine Aktivierung der Carbonsäurefunktion der Arylpropionsäuren bzw.

Arylessigsäure (1a-g) mit N,N´-Dicyclocarbodiimid (DCC). Die aktivierten Säuren sind dann

mit Pentafluorphenol (2) (nukleophile Substitution) zu Pentafluorphenylestern (3a-g) umge-

setzt worden. Die entstandenen Ester sind sehr stabil gegenüber Sauerstoff-Nukleophilen,

reagieren aber gut mit Stickstoff-Nukleophilen.40

Dieser Schritt war notwendig, um die Entstehung von 2-Amino-ethylestern zu verhindern.

Anschließend wurden die Pentafluorphenylester (3a-g) mit Ethanolamin (4) zu den jeweiligen

Ethanolamiden (5a-g) umgesetzt.

Der Erfolg der Umsetzung wurde durch 1H-NMR, Massenspektroskopie und Elemantaranaly-

se bestätigt.

Die folgende Tabelle listet die synthetisierten Verbindungen mit dem zugrunde liegenden

Profen auf. Details der Synthese finden sich im experimentelle Teil.

(40) Imming et al. Arch Pharm 1995, 328, 87-91

OHR

O

OHF

F

FF

F

OF

F

FF

F

R

O

OH

NH2 NH

R

OOH+

+ DCC

in EtOAc

+

in CHCl3

1 2 3

4

5


R Substanzbezeichnung1 -OH S-(+)-Naproxen3 -O-C6F5 S-(+)-Naproxen-pentafluorphenylester5 -NH-CH2-CH2-OH S-(+)-Naproxen-ethanolamid1 -OH R-(-)-Naproxen3 -O-C6F5 R-(-)-Naproxen-pentafluorphenylester5 -NH-CH2-CH2-OH R-(-)-Naproxen-ethanolamid1 -OH S-(+)-Ibuprofen3 -O-C6F5 S-(+)-Ibuprofen-pentafluorphenylester5 -NH-CH2-CH2-OH S-(+)-Ibuprofen-ethanolamid

1 -OH Indometacin

3 -O-C6F5 Indometacin-pentafluorphenylester

5 -NH-CH2-CH2-OH Indometacin-ethanolamid

1 -OH S-(+)-Flurbiprofen

3 -O-C6F5 S-(+)-Flurbiprofen-pentafluorphenylester

5 -NH-CH2-CH2-OH S-(+)-Flurbiprofen-ethanolamid1 -OH R-(+)-Ibuprofen3 -O-C6F5 R-(+)-Ibuprofen-pentafluorphenylester

e

f

c

d

a

bO

R

O

O O

R

O

R

N

O

O

O Cl

R

F

O

R

O

R


R Substanzbezeichnung1 -OH S-(+)-Naproxen3 -O-C6F5 S-(+)-Naproxen-pentafluorphenylester5 -NH-CH2-CH2-OH S-(+)-Naproxen-ethanolamid1 -OH R-(-)-Naproxen3 -O-C6F5 R-(-)-Naproxen-pentafluorphenylester5 -NH-CH2-CH2-OH R-(-)-Naproxen-ethanolamid1 -OH S-(+)-Ibuprofen3 -O-C6F5 S-(+)-Ibuprofen-pentafluorphenylester5 -NH-CH2-CH2-OH S-(+)-Ibuprofen-ethanolamid

1 -OH Indometacin

3 -O-C6F5 Indometacin-pentafluorphenylester

5 -NH-CH2-CH2-OH Indometacin-ethanolamid

1 -OH S-(+)-Flurbiprofen

3 -O-C6F5 S-(+)-Flurbiprofen-pentafluorphenylester

5 -NH-CH2-CH2-OH S-(+)-Flurbiprofen-ethanolamid1 -OH R-(+)-Ibuprofen3 -O-C6F5 R-(+)-Ibuprofen-pentafluorphenylester5 -NH-CH2-CH2-OH R-(+)-Ibuprofen-ethanolamid

1 -OH R-(+)-Flurbiprofen

3 -O-C6F5 R-(+)-Flurbiprofen-pentafluorphenylester

5 -NH-CH2-CH2-OH R-(+)-Flurbiprofen-ethanolamid

g

e

f

c

d

a

bO

R

O

O O

R

O

R

N

O

O

O Cl

R

F

O

R

O

R

F

O

R

6. Affinitätsmessungen

Die Affinitätsmessungen wurden nach der Radioligandbindungsmethode von Kathmann et

al.41 durchgeführt. Zerebraler Cortex von männlichen Ratten wurde für die Gewinnung der

CB1-Rezeptoren benutzt. Diese wurden mit [3H]SR 141716, einem selektiven

CB1-Antagonisten, in einer Konzentration von 0.5 nM inkubiert, mit den Ethanolamiden ver-

setzt und anschließend die verbliebene Radioaktivität gemessen.

Die hier synthetisierten Verbindungen haben keine Affinität (Ki > 3 µM) zum CB1-Rezeptor.

(41) Kathmann et al. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 1999, 359, 466-470


7. Ausblick, weitere Arbeiten

Eine Affinität der Ethanolamide der Profene zu CB1-Rezeptoren existiert nicht. Affinitäts-

Messungen an CB2-Rezeptoren, die in Bezug auf das Substrat weniger anspruchsvoll sind,

und an FAAH stehen noch aus.

Im Rahmen einer weiteren noch nicht abgeschlossenen Arbeit müssen noch andere Metabolite

der Profene, wie z.B. die symmetrischen Glycerolester – als Analoga von

2-Arachidonylglycerol – hergestellt und an diesen Rezeptoren und Enzymen getestet werden.

Erst danach läßt sich eine direkte Wirkung der Stoffwechselmetabolite der Profene auf das

ECS bestätigen oder ausschließen.

Experimenteller Teil 13

II. Experimenteller Teil

1. Allgemeine Vorbemerkungen

1.1 Chromatographie

Zur Dünnschichtchromatographie wurden DC-Fertigfolien Polygram SIL G/UV254 der Firma

Macherey-Nagel, Düren, verwendet. Die Detektion erfolgte im UV-Licht bei 254 nm.

Die Flash-Säulenchromatographie wurde entsprechend der Methode von Still et al.42 mit Kie-

selgel 60, Korngröße 40-63 µm (230-400 mesh ASTM) der Firma Merck, Darmstadt, durchge-

führt.

1.2 Analytik

NMR-Spektren: 1H- und 13C-Messungen wurden an einem Jeol JNM-GX-400 und Eclip-

se+ 500 durchgeführt. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm angegeben und beziehen

sich auf die δ-Skala. Als Standards dienten internes Tetramethylsilan (TMS) oder das verwen-

dete Lösungsmittel. Zur Charakterisierung der Signale wurden folgende Abkürzungen verwen-

det:

s Singulett

d Duplett

dd Dublett von Dubletts

t Triplet

q Quartett

m Multiplett

(42) Still et al. J Org Chem 1978, 43, 2923-2925


Massenspektrometrie: Die Aufnahme der Massenspektren wurde mit einem doppelfokusie-

renden Sektorfeld-Massenspektrometer vom Typ VG 7070 H der Firma Vacuum Generators

(Elektronenstoßionisation, 70 eV) durchgeführt. Es sind relative Peakintensitäten angegeben.

Elementaranalysen: Die Elementaranalysen wurden mit einem CH-Analyser nach Salzer der

Firma Labormatic/Wösthoff und einem CHN-Autoanalyser der Firma Hewlett-Packard durch-

geführt.


2. Allgemeine Vorschriften

2.1 AV 1: Synthese der Pentafluorphenolester

Die entsprechende Arylpropionsäure bzw. Arylessigsäure (1a-g) wird in Ethylacetat (EtOAc)

gelöst und Pentafluorphenol (2) im Stoffmengenverhältnis 1:1 dazu gegeben. Der Reaktionsan-

satz wird auf 0 °C gekühlt, nach 3 min. wird Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 10%igem

Überschuß dazugegeben und 1 h bei 0°C gerührt. Nach etwa 10 min. fällt Dicyclohexylharn-

stoff (DCU) aus. Der Ansatz wird weitergerührt, bis er sich auf RT erwärmt hat. Anschließend

wird durch Zugabe von 2 ml H2O / 1 ml AcOH das restliche DCC umgesetzt. Zur Entfernung

des DCU wird filtriert und danach zur Trockne eingeengt.

Der Rückstand wird zur Reinigung per Flash-Chromatographie in dem jeweiligen Eluens auf-

genommen und über die Säule gereinigt. Die gereinigte Phase wird wieder zur Trockne einge-

engt und aus einem passenden LM auskristallisiert oder mit n-Pentan gewaschen und anschlie-

ßend an der Ölpumpe getrocknet.

2.2 AV 2: Synthese der Ethanolamide

Die entsprechenden Pentafluorphenolester (3a-g) werden in CHCl3 gelöst und Ethanolamin (4)

wird tropfenweise im Stoffmengenverhältnis 1:1 zugesetzt. Der Ansatz wird 1 h bei RT gerührt

und anschließend zur Trockne eingeengt.

Der Rückstand wird in 25 ml EtOAc / 10 ml HCl 3% aufgenommen und zweimal mit H2O und

gesättigter Kochsalz-Lösung gewaschen. Die EtOAc-Phase wird über MgSO4 getrocknet und

zur Trockene eingeengt. Die Reinigung erfolgt entweder über Umkristallisierung aus einem

passenden LM oder durch Flash-Chromatographie, Waschen mit n-Pentan und anschließendes

Trocknen an der Ölpumpe.


3. Einzelverbindungen

3.1 S-Naproxen-pentafluorphenylester

2-(6-Methoxy-naphthalen-2-yl)-propionsäure pentafluorphenyl ester

4.61 g (20 mmol) S-(+)-Naproxen (1a) werden gemäß AV 1 mit 3.68 g (20 mmol) Pentafluor-

phenol (2) und 4.6 g (22 mmol) DCC in 200 ml Ethylacetat umgesetzt.

Die Reinigung erfolgt per Flash-Chromatographie mit einem Gemisch von t-BuOMe / n-Hexan

(5:95). Nach dem Einengen zur Trockne wird der Rückstand aus n-Hexan umkristallisiert.

Eigenschaften: weißer, kristalliner Feststoff

Ausbeute: 5.71 g (72%)

EI-MS (70 eV / 210 °C): m/z (%) = 185 (100), 396 (M+) (54.0), 186 (15.3), 397 (12.4)

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 7.76-7.72

7.44-7.42 (m, 6H, aromat. H-Atome)

7.17-7.13

4.22-4.18 (q, 1H, -CH-COO-)

3.91 (s, 3H, -OCH3 ),

1.72-1.71 (d, 3H, -CH3 )

C20H13F5O3 (396.33) : Ber.: C 60.60 H 3.30

Gef.: C 60.75 H 3.51

O

OH

O

OHF

FFF

F

O O

O

F

FF

FF

+ + DCCin Ethylacetat

1a 2 3a


3.2 S-Naproxen-ethanolamid

N-(2-Hydroxy-ethyl)-2-(6-methoxy-naphthalen-2-yl)-propionamid

4.75 g (12 mmol) S-Naproxen-pentafluorphenylester (3a) werden gemäß AV 2 mit 0.75 ml

(12 mmol) Ethanolamin (4) in 20 ml CHCl3 umgesetzt.

Die Reinigung erfolgt durch Umkristallisieren aus einem Gemisch von t-BuOMe / EtOAc

(3:1).



EI-MS (70 eV / 300 °C): m/z (%) = 185 (100), 273 (M+) (54.5), 186 (34.6), 274 (10.8)

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 7.67-7.62


7.13-7.08

6.04 (1H, -NH)

3.88 (s, 1H, -OCH3)

3.67-3.63 (q, 1H, -CH-CON-)

3.55 (2H, -CH2-OH)

3.33-3.21 (m, 2H, -CH2-NH-)

3.14 (1H, -OH)

1.55-1.53 (d, 3H, -CH3)

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ = 175.7, 157.7, 136.2, 133.7, 129.2, 128.9, 127.5, 126.1,

119.1, 105.6, 62.2, 55.3, 46.3, 42.6, 18.5

C16H19NO3 (273.36) : Ber.: C 70.30 H 6.95 N 5.13

Gef.: C 70.31 H 6.76 N 5.68

O O

O

F

FF

FF

NH2OH

O O

NH

OH+in CHCl3

3a 4 5a


3.3 R-Naproxen pentafluorphenylester

2-(6-Methoxy-naphthalen-2-yl)-propionsäure pentafluorphenyl ester

4.61 g (20 mmol) R-(-)-Naproxen (1b) werden gemäß AV 1 mit 3.7 g (20 mmol) Pentafluor-



(5:95). Nach dem Einengen zur Trockne wird der Rückstand aus n-Hexan umkristallisiert.



EI-MS (70 eV / 140 °C): m/z (%) = 185 (100), 396 (M+) (50.6), 186 (15.5), 397 (11.7)

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 7.75-7.69


7.16-7.12

4.22-4.17 (q, 1H, -CH-COO-)

3.94-3.88 (s, 3H, -OCH3)

1.71-1.70 (d, 3H, -CH3)

C20H13F5O3 (396.33) : Ber.: C 60.60 H 3.30

Gef.: C 60.72 H 3.64

O

OH

O

OHF

FFF

F

O O

O

F

FF

FF


1b 2 3b


3.4 R-Naproxen-ethanolamid

N-(2-Hydroxy-ethyl)-2-(6-methoxy-naphthalen-2-yl)-propionamid

3.96 g (10 mmol) R-Naproxen-pentafluorphenylester (3b) werden gemäß AV 2 mit 0.63 ml


Die Reinigung erfolgt durch Umkristallisieren aus t-BuOMe / EtOAc (3:1).



EI-MS (70 eV / 210 °C): m/z (%) = 185 (100), 273 (M+) (57.7), 186 (33.9), 274 (11.2)

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 7.69-7.63


7.13-7.08

5.97 (1H, -NH)

3.88 (s, 3H, -OCH3)

3.67-3.64 (q, 1H, -CH-CON-)

3.57 (2H, -CH2-OH)

3.35-3.22 (m, 2H, -CH2-NH-)

2.99 (1H, -OH)

1.58-1.55 (d, 3H, -CH3)

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ = 175.8, 157.7, 136.2, 133.7, 129.2, 128.8, 127.5, 126.1,

119.2, 105.6, 62.3, 55.3, 46.9, 42.6, 18.5

C16H19NO3 (273.36) : Ber.: C 70.30 H 7.02 N 5.13

Gef.: C 70.48 H 6.70 N 5.60

O O

O

F

FF

FF

NH2OH

O O

NH

OH+in CHCl3

3b 4 5b


3.5 S-Ibuprofen pentafluorphenylester

2-(4-Isobutyl-phenyl)-propionsäure pentafluorphenyl ester

4.13 g (20 mmol) S-(+)-Ibuprofen (1c) werden gemäß AV 1 mit 3.68 g (20 mmol) Pentafluor-



(2:8). Nach dem Einengen zur Trockne wird der Rückstand mit n-Pentan gewaschen und an der

Ölpumpe getrocknet.

Eigenschaften: farbloses Öl


EI-MS (70 eV / 90 °C): m/z (%) = 161 (100), 162 (14.3), 189 (6.7), 118 (4.9), 372 (M+) (4.5)

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 7.14-7.12 (m, 4H, aromat. H-Atome)

4.04-4.03 (q, 1H, -CH-COO-)

2.47-2.45 (d, 2H, (CH3)2-CH-CH2-)

1.86-1.83 (m, 1H, (CH3)2-CH-)

1.63-1.62 (d, 3H, -CH3)

0.89-0.87 (m, 6H, (CH3)2-CH-)

C19H17F5O2 (372.36) : Ber.: C 61.28 H 4.61

Gef.: C 60.56 H 4.61

OH

O

OHF

FFF

F

O

O

F

FF

FF


1c 2 3c


3.6 S-Ibuprofen-ethanolamid

N-(2-Hydroxy-ethyl)-2-(4-isobutyl-phenyl)-propionamid

4.85 g (13 mmol) S-Ibuprofen-pentafluorphenylester (3c) werden gemäß AV 2 mit 0.81 ml


Die Reinigung erfolgt durch Flash-Chromatographie mit EtOAc. Nach dem Einengen zur

Trockne wird der Rückstand mit n-Pentan gewaschen und an der Ölpumpe getrocknet.



EI-MS (70 eV / 150 °C): m/z (%) = 161 (100), 162 (86.8), 118 (50.6), 103 (30.7), 249 (M+)

(22.1)


6.00 (1H, -NH)

3.59 (m, 2H, -CH2-OH)

3.54-3.50 (q, 1H, -CH-CON-)

3.36-3.23 (m, 2H, -CH2-NH-)

3.11 (1H, -OH)

2.42-2.41 (d, 2H, (CH3)2-CH-CH2-)

1.83-1.80 (m, 1H, (CH3)2-CH-)

1.48-1.46 (d, 3H, -CH3)

0.87-0.84 (d, 6H, (CH3)2-CH-)

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ = 175.9, 140.7, 138.3, 129.6, 127.4, 127.2, 62.2, 46.5, 45.0,

42.6, 30.1, 22.3, 18.5

C15H23NO2 (249.39) : Ber.: C 72.24 H 9.31 N 5.62

Gef.: C 71.94 H 9.16 N 5.84

NH2OH

O

NH

OHO

O

F

FF

FF

+in CHCl3

3c 4 5c


3.7 Indometacin pentafluorphenylester

[1-(4-Chloro-benzoyl)-5-methoxy-2-methyl-1H-indol-3-yl]-essigsäure pentafluorphenyl ester

4.65 g (13 mmol) Indometacin (1d) werden gemäß AV 1 mit 2.39 g (13 mmol) Pentafluorphe-

nol (2) und 3.14 g (15 mmol)DCC in 250 ml t-BuOMe umgesetzt.

Die Reinigung erfolgt durch Einengen auf ca. 40 ml und anschließendes Auskristallisieren las-

sen.



EI-MS (70 eV / 240 °C): m/z (%) = 523 (M+) (100), 139 (75.5), 525 (M+) (36.8), 312 (30.8)

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 7.67-7.64 (dd, 2H, aromat. H-Atome)

7.48-7.45 (dd, 2H, aromat. H-Atome)

6.94 (d, 1H, 4-H)

6.87-6.86 (d, 1H, 7-H)

6.70-6.67 (dd, 1H, 6-H)

4.00 (s, 2H, 3-CH2-)

3.83 (s, 3H, -OCH3)

2.42-2.40 (s, 3H, 2-CH3)

C25H15ClF5NO4 (523.86) : Ber.: C 57.31 H 2.89 N 2.67 Cl 6.77

Gef.: C 56.81 H 3.45 N 3.1 Cl 9.59

OHF

FFF

F

N

O

O

OH

O Cl

N

O

O

O Cl

OF

F F

F F+ + DCCin Ethylacetat

1d 2 3d


3.8 Indometacin-ethanolamid

2-[1-(4-Chloro-benzoyl)-5-methoxy-2-methyl-1H-indol-3-yl]-N-(2-hydroxy-ethyl)-acetamid

5.76 g (11 mmol) Indometacin-pentafluorphenylester (3d) werden gemäß AV 2 mit 0.68 ml


Hier erfolgte beim Waschen mit H2O keine Phasentrennung. Deshalb wurde das EtOAc abge-

dampft und die verbleibende H2O-Phase filtriert. Der Rückstand wurde in EtOAc gelöst und

umkristallisiert.

Eigenschaften: weiß-gelblich, kristalliner Feststoff


EI-MS (70 eV / 380 °C): m/z (%) = 402 / 400 (M+) (35.7 / 100), 139 (90.5), 312 (73,7)

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 7.65-7.63 (dd, 2H, aromat. H-Atome)

7.47-7.45 (dd, 2H, aromat. H-Atome)

6.88-6.87 (d, 1H, 4-H)

6.86-6.84 (d, 1H, 7-H)

6.69-6.67 (dd, 1H, 6-H)

6.04 (1H, -NH)

3.80 (s, 3H, -OCH3)

3.66-3.62 (m, 4H, -CH2-OH / 3-CH2-)

3.37-3.35 (m, 2H, CH2-NH-)

2.37 (s, 3H, 2-CH3)

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ = 171.3, 168.3, 156.3, 139.6, 136.4, 133.5, 131.2, 130.9,

130.2, 129.2, 115.1, 112.6, 112.3, 100.8, 62.5, 55.8,

42.6, 32.1, 13.3

NH2OH

O

N

O

O

O Cl

F F

F

FF

O

N

O

O Cl

NH OH

+in CHCl3

3d 4 5d


C21H21ClN2O4 (400.89) : Ber.: C 62.91 H 5.29 N 6.99 Cl 8.84

Gef.: C 62.79 H 5.35 N 7.22 Cl 8.73


3.9 S-Flurbiprofen pentafluorphenylester

2-(2-Fluoro-biphenyl-4-yl)-propionsäure pentafluorphenyl ester

0.49 g (2 mmol) S-(+)-Flurbiprofen (1e) werden gemäß AV 1 mit 0.37 g (2 mmol) Pentafluor-

phenol (2) und 0.46 g (2.2 mmol) DCC in 20 ml Ethylacetat umgesetzt.


(5:95). Nach dem Einengen zur Trockene wird der Rückstand mit n-Pentan gewaschen und an

der Ölpumpe getrocknet.



EI-MS (70 eV / 500 °C): m/z (%) = 199 (100), 410 (M+) (34.7), 200 (16.4), 163 (12.3)


7.16-7.11

4.06-4.03 (q, 1H, -CH-COO-)

1.63-1.62 (d, 3H, -CH3)

C21H12F6O2 (410.33) : Ber.: C 61.47 H 2.95

Gef.: C 62.46 H 3.58

OH

O

F

OHF

FFF

F

O

O

F

FF

FFF


1e 2 3e


3.10 S-Flurbiprofen-ethanolamid

2-(2-Fluoro-biphenyl-4-yl)-N-(2-hydroxy-ethyl)-propionamid

0.7 g (1.7 mmol) S-Flurbiprofen-pentafluorphenylester (3e) werden gemäß AV 2 mit 0.1 ml

(1.7 mmol) Ethanolamin (4) in 20 ml CHCl3 umgesetzt.

Nach dem Einengen zur Trockne erfolgt die Reinigung durch Waschen mit n-Pentan und

Trocknung an der Ölpumpe.

Eigenschaften: weiße, halbfeste Masse


EI-MS (70 eV / 180 °C): m/z (%) = 200 (100), 199 (41.4), 185 (26.5), 287 (M+) (24.4)


7.16-7.10

6.06 (1H, -NH)

3.73-3.70 (t, 2H, -CH2-OH)

3.65-3.59 (q, 1H, -CH-CON-)

3.43-3.41 (m, 2H, -CH2-NH-)

1.58-1.54 (d, 3H, -CH3)

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ = 175.3, 159.8 (1JCF = 249.5 Hz), 142.2, 135.2, 131.2, 128.9,

128.5,

127.8, 123.6, 115.4, 115.2, 62.4, 46.5, 42.7, 18.5

C17H18FNO2 (287.36) : Ber.: C 71.05 H 6.33 N 4.88

Gef.: C 70.83 H 6.24 N 4.73

NH2OH

O

NH

OH

F

O

O

F

FF

FFF

+in CHCl3

3e 4 5e


3.11 R-Ibuprofen pentafluorphenylester

2-(4-Isobutyl-phenyl)-propionsäure pentafluorphenyl ester

0.41 g (2 mmol) R-(-)-Ibuprofen (1f) werden gemäß AV 1 mit 0.37 g (2 mmol) Pentafluorphe-

nol (2) und 0.46 g (2.2 mmol) DCC in 20 ml EtOAc umgesetzt.


(2:8). Nach dem Einengen zur Trockne wird der Rückstand mit n-Pentan gewaschen und an der

Ölpumpe getrocknet.



EI-MS (70 eV / 70 °C): m/z (%) = 161 (100), 162 (14.5), 189 (6.2), 119 (5.2), 372 (M+) (4.0)


4.04-4.01 (q, 1H, -CH-COO-)

2.47-2.45 (d, 2H, (CH3)2-CH-CH2-)

1.88-1.82 (m, 1H, (CH3)2-CH-)

1.63-1.62 (d, 3H, -CH3)

0.90-0.88 (d, 6H, (CH3)2-CH-)

C19H17F5O2 (372.36) : Ber.: C 61.28 H 4.61

Gef.: C 62.2 H 4.78

OH

O

OHF

FFF

F

O

O

F

FF

FF


1f 2 3f


3.12 R-Ibuprofen-ethanolamid

N-(2-Hydroxy-ethyl)-2-(4-isobutyl-phenyl)-propionamid

0.63 g (1.7 mmol) R-Ibuprofen-pentafluorphenylester (3f) werden gemäß AV 2 mit 0.1 ml


Die Reinigung erfolgt durch Flash-Chromatographie mit EtOAc. Nach dem Einengen zur

Trockne wird der Rückstand mit n-Pentan gewaschen und an der Ölpumpe getrocknet.



EI-MS (70 eV / 200 °C): m/z (%) = 162 (100), 161 (90.3), 120 (52.9), 106 (31.6), 249 (M+)

(25.1)


5.89 (1H, -NH)

3.68-3.66 (t, 2H, -CH2-OH)

3.59-3.57 (q, 1H, -CH-CON-)

3.37-3.36 (m, 2H, -CH2-NH-)

2.45-2.43 (d, 2H, (CH3)2-CH-CH2-)

1.85-1.82 (m, 1H, (CH3)2-CH-)

1.52-1.51 (d, 3H, -CH3)

0.92-0.88 (d, 6H, (CH3)2-CH-)

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ = 176.6, 141.0, 138.0, 129.8, 127.3, 62.7, 46.6, 45.0, 42.8,

30.1, 22.4, 18.4

C15H23NO2 (249.39) : Ber.: C 72.24 H 9.31 N 5.62

Gef.: C 71.89 H 8.96 N 5.71

NH2OH

O

O

F

FF

FF

O

NH

OH+in CHCl3

3f 4 5f


3.13 R-Flurbiprofen pentafluorphenylester

2-(2-Fluoro-biphenyl-4-yl)-propionsäure pentafluorphenyl ester

0.49 g (2 mmol) R-(-)-Flurbiprofen (1g) werden gemäß AV 1 mit 0.37 g (2 mmol) Pentafluor-

phenol (2) und 0.46 g (2.2 mmol) DCC in 20 ml EtOAc umgesetzt.


(5:95). Nach dem Einengen zur Trockne wird der Rückstand mit n-Pentan gewaschen und an

der Ölpumpe getrocknet.

Eigenschaften: farbloser, kristalliner Feststoff


EI-MS (70 eV / 160 °C): m/z (%) = 410 (M+) (100), 200 (66.1), 411 (23.0), 184 (14.0)


7.24-7.18

4.13-4.10 (q, 1H, -CH-COO-)

1.70 (d, 3H, -CH3)

C21H12F6O2 (410.33) : Ber.: C 61.47 H 2.95

Gef.: C 62.15 H 3.9

OH

O

F

OHF

FFF

F

O

O

F

FF

FFF


1g 2 3g


3.14 R-Flurbiprofen-ethanolamid

2-(2-Fluoro-biphenyl-4-yl)-N-(2-hydroxy-ethyl)-propionamid

0.62 g (1.5 mmol) R-Flurbiprofen-pentafluorphenylester (3g) werden gemäß AV 2 mit 0.09 ml


Nach dem Einengen zur Trockne erfolgt die Reinigung durch Waschen mit n-Pentan und

Trocknung an der Ölpumpe.

Eigenschaften: weiße, halbfeste Masse

Ausbeute: 0,37 g (64%)

EI-MS (70 eV / 260 °C): m/z (%) = 200 (100), 199 (47.6), 287 (M+) (36.9), 185 (25.3), 90

(16.9)


7.10-7.04

6.04 (1H, -NH)

3.66-3.64 (t, 2H, -CH2-OH)

3.59-3.54 (q, 1H, -CH-CON-)

3.37-3.33 (m, 2H, -CH2-NH-)

1.50-1.48 (d, 2H, -CH3)

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ = 175.4, 159.8 (1JCF = 249.5 Hz), 142.1, 135.2, 131.2, 128.9,

128.5,

127.8, 123.6, 115.4, 115.2, 62.3, 46.5, 42.7, 18.4

C17H18FNO2 (287.36) : Ber.: C 71.05 H 6.33 N 4.88

Gef.: C 70.78 H 6.12 N 4.54

NH2OH

O

NH

OH

F

O

O

F

FF

FFF

+in CHCl3

3g 4 5g


4. Affinitätsmessung

Für die Experimente wurden männliche Wistar-Ratten verwendet. Die Tiere wurden durch De-

kapitation getötet, das Gehirn entnommen und der zerebrale Kortex wurde sofort präpariert.

Der Hirnkortex wurde mit Hilfe eines Potter-Elvehjem-Gerätes (Glaszylinder mit rotierendem

Teflonpistill) bei 1200 U/min mit 10 Auf- und Ab-Bewegungen pro Minute in 25 Volumentei-

len eines eiskalten Tris-HCl-Puffers (Tris 50 mmol/l; pH 7,5; EDTA 5 mmol/l; Saccharose

10,27%; 4°C) 1 Minute lang homogenisiert. Anschließend wurde das Homogenat in einer

Kühlzentrifuge (Beckman J2-21) bei 3500 U/min, entsprechend 1000 g, für eine Dauer von

10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abermals für 10 Minuten bei

21.000 U/min, entsprechend 35.000 g, und 4°C zentrifugiert. Das so gewonnene Pellet wurde

dreimal mit 10 Volumenteilen des Tris-HCl-Puffers (Tris 50 mmol/l; pH 7,5; EDTA 5 mmol/l)

gewaschen, wobei es bei 25°C 10 Minuten stehengelassen und anschließend 10 Minuten bei

35.000 g und 4°C zentrifugiert wurde. Dieses Pellet P2 wurde abermals mit dem Potter-

Elvehjem bei 1200 U/min und 10 Auf- und Ab-Bewegungen 1 Minute lang homogenisiert und

in Portionen zu je 5,0 ml bei -80°C eingefroren.

Die Bindungsexperimente wurden mit einem Tris-HCl-Puffer (Tris 50 mmol/l; pH 7,5; EDTA

5 mmol/l) in einem endgültigen Reaktionsansatz von 0,5 ml in Eppendorf-Reaktionsgefäßen

(2,0 ml) durchgeführt. Es wurden für die Verdrängungsexperimente jeweils 200 µl Tris-HCl-

Puffer, 50 µl [3H]-SR-141716 und 50 µl der zu untersuchenden Substanz in entsprechender

Konzentration vorgelegt und mit Zugabe von 200 µl des Proteinhomogenates, zwischen 0,2 -

0,3 mg Protein enthaltend, wurde die Reaktion gestartet. [3H]- SR-141716 wurde für die Ver-

drängungsexperimente in einer Konzentration von 0,2 nmol/l verwendet. Die Inkubation bei

30°C in einem Wasserbad (GFL 1003) wurde nach einer Dauer von 40 Minuten durch rasche

Vakuumfiltration mit einem Inotech Cell Harvester über, mit 0,3 % Polyethylenimin vorbe-

handelten,43 Whatman GF/C-Filtern mit einem Restdruck von 400 mbar beendet. Die Inkubati-

onsgefäße und GF/C-Filter wurden anschließend mit jeweils dreimal 2 ml Tris-HCl-Puffer

(Tris 50 mmol/l; pH 7,5; EDTA 5 mmol/l; 4°C) gewaschen. Die Filter wurden in Mini Poly-Q

Vials mit je 6,0 ml Szintillatorflüssigkeit (Ready-Gel® ) versetzt, 12 Stunden geschüttelt und

die Radioaktivität wurde durch Flüssigkeitsszintillationszählung (Beckman LS 6000TA) be-

stimmt.

(43) Bruns et al. Anal Biochem 1983, 132, 74-81


Bestimmung der Affinität Ki des Cannabinoid CB1 Rezeptors (3H-SR 141716) an Rattenhirn-

cortexmembranen

Substanz Mr Ki Bmax (pmol/mg P.)

SR 141716 2.88 ± 0.7 nM 0.55 ± 0.02

S-(+)-Naproxen-ethanolamid (TR 02) 273.36 > 3 µM -

R-(-)-Naproxen-ethanolamid (TR 04) 273.36 > 3 µM -

S-(+) Ibuprofen-ethanolamid (TR 06) 249.39 > 3 µM -

Indomethacin-ethanolamid (TR 08) 400.89 > 3 µM -

S-(+)-Flurbiprofen-ethanolamid (TR 10) 287.36 > 3 µM -

R-(-)-Ibuprofen-ethanolamid (TR 14) 249.39 > 3 µM -

R-(-)-Flurbiprofen-ethanolamid (TR16) 287.36 > 3 µM -

Keine der oben genannten Substanzen hatte eine Affinität zum Cannabinoid CB1 Rezeptor.

Alle Bindungsversuche wurde in Dreifachbestimmung (n = 3) durchgeführt.

-10 -9 -8 -7 -6 -5

0

50

100TR 04

TR 08TR 10

TR 02

TR 06

TR 12TR 14SR 141716

Drug (log M)

Spec

ific

3 H-S

R 1

4171

6bi

ndin

g (%

of c

ontr

ols)

Literaturverzeichnis 33

III. Literaturverzeichnis

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37

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur unter Benutzung der

angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe.

Marburg/Lahn, im August 2003

Documents

Profen- und Arylessigsäure-Derivate als Strukturanaloga ...pharmchem.pharmazie.uni-halle.de/pdf/rogosch_diplomarbeit.pdf · Die Strukturaufklärung der Cyclooxygenase-1 (COX-1)1