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Anschri/t: Dr. W. PI~ELLWITZ, 6500 MMnz, Langenbeckstr. 1

Nachweis eines kleinmolekularen Glykoproteids bei Neoplasien and die Charakterisierung seiner ehemischen Besonderheiten *

I I . WEICKE~, D. K u ~ N u n d H . STEG~tAN~

Aus der Abteilung ffir StoffweehseIforsehung (Leiter: Prof. Dr. reed. H. WEIOKE~) der ~edizinisehen Universit/its-Poliklinik Heidelberg (Direktor: Prof. Dr. reed. H. Pst~aa~)

Aus d e m U r i n y o n P l a s m o c y t o m e n u n d Makro - g l o b u l i n ~ m i e n k o n n t e n wi r e in k l e inmoleku l a r e s , per- ehlors/~urelSsliches G l y k o p r o t e i d isol ieren, das s ich in se iner K o h l e n h y d r a t z u s a m m e n s e t z u n g v o n a n d e r e n S e r u m - t rod U r i n - G l y k o p r o ~ i d e n u n t e r s e h e i d e t 12, 1~. D ie A u s s e h e i d u n g s m e n g e w a r y o n de r A u s d e h n u n g de r n e o p l a s t i s e h e n Z e l l w u e h e r u n g abhgng ig , s t a n d j e d o c h in k e i n e r d i r e k t e n B e z i e h u n g zu der P a r a p r u t e i n k o n - z e n t r a t i o n des Se rums . D ~ ~ r i n d e m U r i n y o n P a - t i e n t e n m i t m M i g n e n T u m o r e n ebenfa l l s e in Glyko- p r o t e i d m i t w e i t g e h e n d / £ h n l i e h e n p h y s i k o - c h e m i s e h e n E i g e n s e h a f t e n u n d d e m g te iehen P e p t i d - K o h l e n h y d r a t - verh/~ttnis f anden , e r g a b s ieh die F r a g e , ob diese Sub- s t anz be i N e o p l a s i e n a l l geme in v e r m e h r t g e b i l d e t wird . Aus d e m U r i n y o n N o r m a l p e r s o n e n u n d bei P r o t e i n - u r i en a n d e r e r Genese k o n n t e n w i t n u r g a n z ge r inge

* ?Ii t Unterstiitzung der Deutschen Forsctmngsgemein- schaft.

M e n g e n dieses pe reh to r s~ure l6s l i ehen G l y k o p r o t e i d s naehwei sen .

Material Das G l y k o p r o t e i d w u r d e be i 25 Para, p r o t e i n £ m i e n

u n d 16 m a l i g n e n T u m o r e n isol ier t . Ais Verg]e ichs- f/~lle u n t e r s u e h t e n wi r 6 N o r m M p e r s o n e n u n d 10 Pa- t i e n t e n m i t en t z f ind l i chen K r a n k h e i t s b i l d e r n , die en t - s p r e c h e n d d e n m a l i g n e n T u m o r e n ebenfa l l s ~1- u n d ~ - G l o b u ] i n - V e r m e h r u n g i m S e r u m ze ig t en (Tabe l le 2).

Methodik T e c h n i s e h e E i n z e l h e i t e n w u r d e n be re i t s publ i -

zier~a, ~.

Glykoproteid.lsolierung. D e r U r i n w u r d e m i t Mer- t h i o l a t v e r s e t z t , 1000 m l z e n t r i f u g i e r t u n d ansch l i eBend gegen A q u a des t . d i a lys ie r t . Tabe l l e 1 ze ig t das Auf - a r b e i t u n g s s c h e m a des pe rch lo r sgu re l6s l i chen Glyko- pro te ids .

1216 K. W ~ e K ~ et, al.: Nachweis eines kleinmolekularen Glykoproteides bei Neopl~sien Klinische Woehensehrift

T~belle 1. Au[arbeitungsschema des perch lors~iurslgslichen Glykoproteids Urin, dialysiert

65 o C ! pK6,0

60% ] 140% Bence Jones Uroprotein

65 ~ pH 6 16slich 65 o pH 6,0

!

70 o C I pH 8,5

I 150° ° Bence Jones Uroprotein 700 pH 8,5 16slieh 700

pH 8,5

1. Lyophilisation 2. Lipidextraktion (CI-IaOH/CHCI.~)

Lipide

t~iickstand

] Extraktion mit H~O

I I Unl6sliehes Glykoproteid-

in H~O B J-Miseh- Iraktion

wasserlSslich

erhitzen [ 100 ° C |

lO% I 19o% Unl6sliehes Glykoproteid- bei 100 ° BJ-Misch-

fraktion wasserlSslich

aueh bei 100 ~ C

0,6 M I HC10~ !

I~ 100° o UnlSsliehes Glykoproteid in HCIO~ rein, 16slieh in H~0

bei 100 °, 16slieh in 0,6 M HCIO

Tabelle 2

Folgende Einzeluntersuchungen wurden durch- gefiihrt :

Zonenelektrophorese auf Papier und Mem- branfolien re_it horizontaler Trenntechnik in ver- schiedenen Puffersystemen; die Anf~rbung er- fotgte f~r Proteine mi t Amidosehwarz 10B auf Papier nnd mit Poneeau S auf Acetat-Membran- folien; die freie Aminogruppe wurde mit 2 % i g e m Ninhydrin- Spray dargestellt; der N~chweis redu- zierender OII-Gruppen wurde mit Anilinphthalat und alkalisehem Silbernitrat auf Papier vor- genommen. Die Agar-Elektrophorese erfolgte unter Verwendung einer l%igen Agar-Difco- Nobell6sung p i t 8,6. Die immunologischen Unter- suchungen wurden mit der Immunoelektrophorese n a c h SCIIEIDEGGEI~ 7, der Technik nach OSS~R- MAN 5 und der zweidimensionalen Diffusion im Agar-Gel naeh OVCHT~LO-~¥ 6 durchgeffihrt. Es wurden polyvalente Antiseren und spezielle Anti- seren gegen Antiglobulinfraktion veto Kaninehen (Behring-Werke ~Iarburg) sowie Normalsermn vom Pferd (Institut Pasteur, Paris) verwandt. Die Ultrazentrifugen-Untersuehung wurde mit dem Modell Spineo vorgenommen. Standardzelle und Oberschichtungszelle SB CT ; ohne Korrektur des Johnston-0gston-Effektes s. Die Molekular- gewichtsbestimmung wurde durch Kombination yon Sedimentations- und Diffusionsl£ufen durch- ge~fihrt: eine orientierende Molekulargewichts- bestimmung erfolgte in Diffusionszellen nach der Methode von N o n ~ : a v ~ und A~so~ ~. Als Ver- gleichsprotein wurde Albumin in L6sungen gleicher Konzentrat ion eingesetzt.

Chemische Untersuchungen

Die quanti tat iven Aminos~ure-Besthnmungen wurden mit dem Amino-Acid-Analyser Model1120, Methode yon STEIN und Moo~n s ausgefiihrt.

Serum.Eiweifi/ra]ction, BKS und Konzentration der Gtykoproteid-Ausscheidung im Urin bei malignen Tumoren und Entzi~ndungen

RTalne

8. W. C.F. 8.0. C.M. P.E. K.F. E.W. ~ . K . t:LA. ILH. B.W. I-LK. S. 0. )/f. O. I-LB. S.W.

B.C. S.D. W.F. M.G. P . E . G.K. H . H . M.H. R . H . S.R.

2

2

t i t t

d

Diagnose

BronchiM-Carcinom BronchiM-C~rcmom Bronchial-Carcinom BronchiM-Carcmom Bronchio~l-Carcinom BronehiM-Carcinom BronchiM-Carcinom )/[~gen-Carcinom 5I~gen-Carcinom Kardia- und Larynx-Careinom Colon-Carcinom Hypernephrom Oberkiefer-Carcinom Ohrmuschel-Carcinom Schilddriisen - Careinom diffuse Metasfasen, Prim~rtumor

unbekannt 0steomyelitis Osteomyelitis Osteomyelitis Osteomyelitis Norbus Bechterew Morbus Bechterew para~onsill~rer AbsceG Vaseuli~is Bronehopneumonie ~kute Polyarthritis

Gesamt- eiweilt g-%

8,0 7,3 7,0 6,1 6,1 8,0 6,9 6,9 7,7 7,7 7,2 5,6 7,4 7,5 7,6

7,3 7,1 7,3 6,9 5,9 7,9 8,9 7,0 8,1 7,5 7,1

Serum-Eiweiflelektrophorese tel, %

Albumin t al- I as-

45,0 52,0 36,6 46,0 45,1 51,8 50,6 47,1

44,2 46,0 35,8 49,4 41,4 50,0

56,2 41,5 58,1 30,4 44,0 39,2 36,0 59,4 57,5 34,6 42,2

5,0 5,5 9,9

8,7 9,6

16,9 ~,8 ~,I 3,2 5,8 5,7

5,2 7,0 7,t 6,8 5,3 7,9

8,2 7,1 5,4 8,7 5,1 7,¢ 6,5 5,~ 3,~ 6,7 8,5

12,5 9,6

14,1 I3,1 14,7 8,1 12,9 6,2 14,8 8,7 14,5

I0,0 11,4

13,G 15,6 16,6 12,5 17,9 14,3 9,6 11,0 9,3 13,3 6,6 15,8

ll,C 12,3 15,7 17,1 8,1 12,2

11,¢ 15,9 11, c 18,6 15,2 13,9 14,( 14,6 11,6 11,6 8,7 17,5

12,0 18,7 15,5 14,1

It- Globulin

28,8 23,3 22,5 16,4 25,8 21,0 20,4 25,8

22,0 18,0 25.0 23~2 30,7 19,7

12,3 18,6 16,2 33,3 20,4 24,0 28,1 11,6 12,5 28,0 19,2

]~KS mm n.W.

Urin- GIy- koproteid

rag-%

20,4 10,0 20,4 35,0 21,0 20,0 14,0 7,0

26,0 12,0 31,0 12,0 15,0 12,0 26,0

15,0 22,0 15,0 43,0 11,0 1,8

12,0 21,0

6,0 20,0 18,0

Jg. 43. Heft 22 15, November 1965 H. WmCKE~ et al. : Naehweis eines kleinmolekularen Glykoproteides bei Neol?lasien 1217

Hexosen: Anthron- und 0rein-Bestimmungen ; Ex- tinktionswe~te bezogen auf Glucose-, Galaktose-, Man- nose- Standard.

Methylpentosen : Cysteinhydroehlorid- Methode nach DISCHE und StIETTL]ES 2.

Neuramins~ure : gesoreinolsahs£ure-Methode naeh S V E N N E R t I OLlV[ 11 .

Freie Neuramins~ure: Thiobarbiturs/iure-Methode v o n WAt~t~]~N 12.

Neuramins/~ure- Freisetzung : Verwendung von Neuraminidase in einem Substrat-Enzym-Verh/~ltnis yon 10:I . Neuraminidase reinst (]gehring-Werke Mar- burg).

Hexosamine: Bestimmung naeh ELSON-1VIOt~GAN a. Gesamtstickstoff: Bestimmung nach J~JELDAttL

und DUMAS. Polypeptide : Bestimmung m ~ der Biuret-Methode. Die chromatographische Trennung der Aminos£u-

ren wurde zweidimensional aufsteigend anf Whatman- Papier Nr, l durchgef/ihrt.

Die Kohlenhydrate wurden eindimensional auf Whatman-Papier Nr. 1 und mit MN-Cellulose-Dfinn- schiehtehromatographie getrennt.

Die Infrarotspektren wurden mit dem Ger~it nach Perkin-Elmer im KBr-PreBling hergestellt.

Der fermentative Glucose-Nachweis erfotgte nach Itydrolyse mit Glueoxydase-Reagens 1° dureh Zusatz yon T P N zu tIexokinase- und Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase zu TPN H 1

Ergebnisse

Aus dem Urin yon Pat ienten mit malignen Tumo- ren konnten wir mit der oben beschriebenen Methode ein kleinmolekutares Glykoproteid isolieren, das die- selben physiko-chemisehen Eigenschaften und Peptid- Kohlenhydrat-lgelationen besitzt, wir wie sie bereits bei dam Glykoproteid aus dem Urin von Plasmoeytom- Patienten und Makroglobulin/imien W~ldenstr6m mit- geteilt hat ten la, la. Die Urin-Konzentration ging der Ausdehnung des Tumorprozesses und Metastasierung parallel (Tabelle 2, 3). Eine direkte Beziehung zu der Konzentration der ~1- und ~2-Globulin-Konzen- tration im Serum war nieht erkennbar. In der Regel war die Glykoproteid-Ausseheidung der Patienten mit starker BKS-Besehleunigung grSger. Wir fanden je- doeh bei 2 F/~llen mit starker Beeintr/£ehtigung des

3 Fatle 14 Falle 5 Fille 3 Falle

S.W. C.F. S.O. C.M. P.E. K.F. E.W. ~ M.K. R.A. H.H. B.W. H.X. S.O. 3/[.0. H.B. d S.W. d

B.C. S.D. w.F. 3 ~ .G. 3 P.E. 3 G . K . . ~ t t .H. d M.H. 3 g . ~ . ? s . g . ?

K . n . G.D. K.D. L.W. G . H . H.L.

Tabelle 3. Kohle~nhydrat. und Eiu,ei/3gehalt des perchlors~iuretdslichen Glykoproteids, isotiert aus dem Urin

Diagnose t Glp NAh~Asv NANA w mg- g

25,0 20,0 50,0 20,0

20,4 10,0 20,4 35,0 21,0 20,0 14,0 7,0

26,0 12,0 31,0 12,0 15,0 t2,0 26,0

15,0

22,0 15,0 43,0 11,0 1,8

12,0 21,0 6,0

20,0 18,0

N P . A Or

A. Paraprotein&nien 8,8 55,2 1 9 , 0 t8,0 7,6 48,1 18,3 23,6 6,7 42,0 2 3 , 0 22,0 9,4 56,2 2 0 , 0 19,0

8~0 7,3 7,6 8,5 6,7 6,6 7,0 7,2 8,7 8,2 9,0 8,9 8,5 7,0

10,8

B. Tumoren 50,0 2 5 , 0 27,0 45,6 25,0 25,0 47,5 17,o I 2o,o I 53,1 20,0 I 18,0 42,0 15,01 16,0 41,0 19,0 / 23,0 45,0 18,0 125,0 45,1 25,0 I 23,0 54,3 15,0 / 22,01 51,0 14,0 I 27,0 I 56,3 14,5 I 19,0 55,6 16,01 18,0 53,0 20,0I 19,01 43,7 2 2 , 0 30,0 67,5 ]4,0 28,0 I

20,0 23,0

25,0 27,0 46,0 25,0 30,0 26,0 27,0 2%0 22,0 23,0

Plasmoeytom, Gamma/t Plasmocytom, Gamma ss

I Plasmocytom, Gamma 1 A Ptasmocy~om, Gamma 1 5'Ii

i BronchiM-Careinom BronehiaLCaxcinom Bronehial-Carcinom Bronchial-Carcinom Bronehial-Careinom Bronehial-Careinom Bronehial-Careinom Magen-Carcinom Magen-Carcinom Kardi~- und Larynx-Carcinom Colon-Careinom Hypernephrom Oberkiefer-Carcinom Ohrmusehel-Carcinom Sehilddriisen-Carcinom diffuse Netastasen,

Primgr-Tumor unbekannt

Osteomyelitis Osteomyelitis Osteomyelitis Osteomyelitis Morbus Bechterew Morbus Bechterew paratonsill~rer Absceg Vasculitis Bronchopneumonie akute Polyarthritis

1,0 2,0 2,5 6,0 3,0

<0,1

8,5 53,0

C. Entziindungen. 9,1 56,8 21,0 7,2 45,0 25,0 3,66 22 .9 46,0 6,9 4311 20,0 7,9 49,0 25,0 8,96 56 ,0 I9,0 7,7 48,0 22,0 8,0 90,0 25,0 7,5 46,9 18,0 8,7 54,3 20,0

D. Normalpersonen 6.7 41,8 I 20,0 19,0 5,6 35,0 2 0 , 0 24,0 7,0 44,0 25 ,0 25,0 7,6 47,6 21 ,0 24,0 7,6 47,6 2 2 , 0 23,0

7,5 60,0 8,4 65,0 7,6 65,0 7,8 62,0

ttex. I Fuc.

10,7 I 4,0 10,1 4,0 11,2 4,0 11,0 3,0

40,7 43,1 45,2 41,0

(~es. %

96,0 91,3 87,2 97,2

8,5 9,0 8,2 8,8 8,0 9,0 8,5 5,2 6,2 9,5 6,5 7,3 8,0 8,4 4,5

8,4

66,6 57,7 56,0 63,0 40,5 62,7 61,2 38,1 70,0 66,6 69,5 55,3 50,0 63,4 55,3

41,3

8,5 4,0 9,2 4,0

10,0 3,5 8,0 4,0

12,0 3,5 10,51 6,2 12,01 4,0 14,o I 4,0 8,2 4,5

13,0 4,0 8,0 I 4,5

4,0 5,5

10,0 4,5 I0,0 3,0

11,5 1 4,2

47,0 97,0 47,2 93,0 40,2 87,7 44,2 98,0 39,0 81,0 46,7 87,7 46,0 91,0 47,6 92,6 37,4 91,7 47,0 98,0 38,0 94,3 37,5 93,0 43,0 I 96,0 48,5 92,2 38,5 100,0

t 45,3 I 98,4

9,1 8,2 3,8 8,5 7,6 7,7 7,4 8,4

10,0 7,6

70,0

67,0 65,2

61,4 63,0 40,8 68,1 65,2

11,6 12,0 6,0

11,0 9,0 7,4

12,0 12,0 10,0 9,0

3,1 46,8 4,5 50,7 4,5 61,0 4,0 46,0 4,6 49,0 5,0 42,6 4,0 49,0 4,5 51,5 4,8 44,8 4,0 42,0

10GO 95,7 83,0 89,0 98,0 98,6 97,0

100,0 91,7 96,3

8,0 8,8 9,8 7,3 6,5 52,I

11,0 4,5 8,5 4.5

10,0 5,0 10,0 4,5 11,0 4,6

43,0 43,0 49,8 45,3 44,6

84,8 78,0 93,8 93,0 92,2

Abki&zungen: Glp : perchlors~urelSsliches Glykoproteid, N : Stiekstoff, P = Gesamtprotein, A=:Anthron-Reaktion, O r - Orein-Reak%ion, NANAsv = Neuramins~ure-Bestimmung nach SVE~NERHOL~, NAANAw = prozentualer Anteil der freien Neuraminsaure, bestimmt nach WARa~, Hex. Hexosamin, Fuc. = Fucose, KK% = Kohlenhydrate.

1218 H. WEXCKE~ e~ M.: Nachweis eines kleinmolekularen Glykoproteides bei Neoplasien Klinische . Wochenschrift

Q

e e -,

e Q

t 2 3 # 5 6 7 8 9 Abb. 1. Dfinnschichtehromatogramm, ~N-Cellulose. Laufmittel: Wasser: Xthylmethylketon:Ameisens~ure:t.Butanol=8:6:3:8. Trennzeit 2 Std. Sprt~hmittel Anilinph~hata~. i ~ibose; 2 Fucose; 3 Ehamnose, ~ Glucose; 5 l~annose; 6 Galaktose; 7 Urin-Glykoproteid yon :Entztindungen, hydro- lysiert mit Amberlite pit 1, 4 S~d; 8 Urin-Glykoproteid yon Tumoren, hydrolysiert s. 7; 9 Zuckerstandard, Glucose, GMaktose, hLunnose, ~ibose, l~hamnose, Fucose. Intensit~szunahme der Glucose- und GMaktose-Spots bei Entztindungen, Intensit~tsabnahme der Nannose und einer noch nieht

identifizierten Pentose

T~belle 4. Chemische und physikalisehe Eigenscha/ten des perchlors~urel6sl,ichen Glykoproteids aus Plasmoeytom-Urb~

KristMlisation aus wgi3rigem Atha.nol. Hitzebestgndig bis 100 s C. L6slich in 0,6 M HCIO 4. hnmuno- und Zonenelektrophorese: ~yBereich. JP: pH 2--3. Anfgrbbarkeit: Amidosehwarz 10 B (.+-),

AnilinphthMa~ (+), Ninhydrin +

~¢iG: gel.: 19000, ber.: 19215. S°0w = 1,43×10 -42. ElementuranMyse: C: 47,00%, H: 6,75%, N: 10,8%, S: 1,0%. Summenformeh gel.: C77sH12s:OsgsN:tssSs,

ber. : C7791-11343 0428 Nil s S 6 . Peptide: 41%, Kohlenhydrate: 39%, NANA: 7%

Molares Verh~ltnis:

Aminosguren Lys 7 His 2 Arg 2 Asp 7 Thr 10 Ser 9 Glu 14 Pro 8 Gly 4 Alg 12 Cys--SH 6 Vs.1 9 Met Ileu 3 Leu 6 Tyr 6 Phe 3 N H 2 - (21)

Kohlenhydrate Gu 10 ~[~ 5 Glu 5 Fu 4 Rh 2 Rib G1A 8 Ga.A 2 NANA 5

Gesamtbitdes durch ausgedehnte Metastasierung bei unbekanntem Pr im~r tumor und bei einem Pat ienten mit histologisch gesichertem Larynx- und Magen-Carci- nora eine relativ groBe Glykoproteid-Ausscheidung im Urin bei normaler oder nur leicht beschleunigter BKS. Elektrophoret iseh wanderte das Glykoproteid auf Acetatfolien Puffer p H 8,6 zwischen tier Albumin- und ~-Globul in-Frak t ion und konnte mi t Ponceau S (Pro- tein-F~rbung) und Sehiffscher Reagens (Glykoproteid- F~rbung) dargestellt werden. Immunoelekt rophoret isch konnte eine Praeipitationslinie ebenfalls im sehnellen ~ - Globulin-Bereich nachgewiesen werden. Das Peptid- Kohlenhydratverh~l tnis betrug bei malignen Tumoren und Paraprotein~mien 50:43. Die Aminos£u~e-Chro- ma togramme zeigten n i t Ausnahme der Intensi t~ts- Verminderung oder dem vollkonmlenen Fehlen des Methiorfin-Fleeks in dem Chromatogramm bei Plas- mocy tomen keine verwertbaren Unterschiede. Die prozentuale Kohlenhydra t -Ver te i lung der Hexosen, Hexosamine und Fueose ergaben gute Ubereinstim- mung. Der Neuraminsauregehal t des Urin-Glykopro- teids bei Adeno-Carcinom des Magen-Darmtraktes lag eindeutig niedriger als bei den Glykoproteiden der ParaproteJn~mien und malignen Tumoren anderer Lo- kalisation und histologischer Struktur . Die mit 5ieur- aminidase durchgeffihrte enzymatische Neuramin- si~ure-Freisetzung betrug bei den Urin-Glykoproteiden Mler Fi~lle etwa 60--70% (Tabelle 3). Aus Tabelle 4 sind die physiko-chemischen Eigenschaften, das Mole- kulargewicht und die molare l%atio der Aminosi~nre- und Kohlenhydratverteilung des Glykoproteids zu er- sehen.

Nach Zusatz yon Urin-Glykoproteid der Tumor- Pat ienten zu Citrat-Blut yon Normalpersonen ging die Zunahme der initialen Senkungsbesehleunigung der Konzent ra t ion des zugesetzten Glykoproteids parallel. Die Glykoproteid-Ausscheidung bei Tumoren und Paraproteinamien war um das Zehnfache h6her als bei Normalpersonen. Der gesamte Kohlenhydra tgeha l t lag niedriger und die Pept id-Konzent ra t ion war etwas h6her. Bei akut entziindlichen Krankheitsbildern, die mi t starker Senknngsbesehleunigung und einer ~-1-, c%-Globulin-Vermehrung einhergingen, fanden wir Glykopro te id-Konzent ra t ionen ira Urin, die e t w a denen der Tumoren und Paraproteingmien entspraehen. Der Kohlenhydra tgehal t war jedoeh deutlieh h6her und die Pept id-Konzent ra t ion geringer (Tabelle 5). Die Aminosaure-Chromatogramme zeigten keine signi- f ikanten Untersehiede. Die Differenzierung der einzel- nen Zuekerkomponenten konnten wir bis jetzt nur bei dem Glykoproteid tier Paraprotein£mien durehfiihren und fanden dabei ghamnose , die normalerweise nieht in den Glykoproteiden des Serums und Urins vor- kommt. Die Untersuchungen der einzelnen Zueker- komponenten der Glykoproteide der Tumoren im Ver- gleich zu aku t entziindliehen Erkrankungen und Nor-

Tabelte 5. Mittelwerte des Kohlenhydrat- und Eiweiflgehaltes de8 perchlorsgureldstichen Glyko~'oteids, isoliert aus dem Urin von Paraproteingmien, mali ,hen Tumoren, EntziZndungen u~l Norma~ )ersonen

Paraprotein~mien . . . . . . .

~[a]igne Tumoren . . . . . . . .

Entzfindungen . . . . . . . .

Normalpersonen . . . . . . . .

Fa]Izahl Glp rag- %

25 28,7 8,1 16 18,5 8,1 l0 16,9 7,5

2,9 6,9 Prozentualer Anteil der freien Neuramins~ure.

N P

I 50,4 50,2 47,2 43,2

20,1 18,7 24,1 21,6

Or

20,6 22,6 28,0 23,0

NANAsv

7,8 7,7 7,8 8,1

NANA~

62,0 57,3 62,8 56,3

~ex.

10,7 10,3 10,0 10,1

Fuc. XH %

3,7 42,5 4,2 43,3 4,3 48,4 4,6 45,1

~es° %

92,9 93,3 94,9 88,3

Jg. 43, t ief t 22 15. November 1965 I-[. W E m K E g e t a l . : N a c h w e i s e i n e s k l e i n m o l e k u l a r e n G l y k o p r o t e i d e s b e i N e o p l a s i e n 1 2 1 9

m.alpersonen sind noch nicht abgesehlossen. Die Rela- tionen der Hexosen Galaktose, Glucose untersebieden sieh yon den Relationen bei Entztindungen und Nor- malpersonen (Abb. 1). IR-Spektren der Glykoproteide yon Paraprotein/~mien und malignen Tumoren, Nor- malpersonen und akuten Entziindungen lassen diese Differenzen der Kohlen-

hydrat-Komponente ~000 30002500

durch geringere Auswir- ktmgen der Hydroxyl- ~ bande and der Bande der CO-Einfaehbindung, die bei Neoplasien geringere Intensit~t aufweisen, er- kennen (Abb. 2). N

Diskussion Da die Konzentration

des hier besehriebenen Glykoproteids bei Neo- plasien erheblieh grSger 2 3 4

ist als bei Normalpersonen und mit der Ausdehnung des Tumorprozesses weiter ansteigt, erscheint die I% Frage bereehtigt, ob die qualitative Zusammen- setzung und die Urin- Konzentration dieser Sub- stanz in einer direkten Beziehung zu dem Tumor- stoffweehsel stehen. Einige physiko-chemisehe Eigen- sehaften, Zusammenset- zung der Kohlenhydrat- Komponenten und Unter- 2 3 ~ 5 sehiede der gesamten

Kohlenhydrat-Konzen- tration erlauben weiterhin eine Differenzierung yon t% den Gtykoproteiden akut entz/indlicher Erkran-

kungen, bei denen eben- falls gleieh hohe Glyko- protein-Urin - Konzentra - tionen ermittelt worden waren. Das Molekutar- gewicht um 20 000 und die elektrophoretiseheWande- rungsgeschwindigkeit im Bereich zwischen Albu- 2 3 ~ s rain- und cq-Fraktion zeigen, dab es sich nieht urn eines der zonenelektro- phoretisch nachweisbaren ~.-~Serum-Globuline han- deln kann. Da es relativ kleinmolekular is~, wird es fiber die Niere ausgesehieden, so dab die Serum-Konzentra- tion zu niedrig liegt, um es zonenelektrophoretisch naehzweisen. Wie aus dem Modellversueh der Blut- senkung von Normalpersonen mit Glykoproteid-Zusatz zu ersehen ist, k6nnte diese Substanz einer der Fak- toren sein, die zu der starken Blutsenkungsbesehleuni- gung ffihrt, die wir bei malignen Prozessen und Ent- z/indungen h£tffig beobaehten. Ob die histologisehe Struktur und Organlokalisation der malignen Tumoren

Kiln. Wsehr., 43. Ja.hrg.

die ehemisehe Zusammensetzung des Glykoproteids beeinflussen, kann naeh der relativ kleinen Fallzaht noch nicht entsebieden werden, jedoch erseheint es bernerkenswert, dab der Neuramins~.uregehalt des Glykoproteids bei Adeno-Carcinom des Magen-Darm- traktes signifikant r~iedriger liegt als bei Tnmoren

200018001500 1400

- ! ' ! ! !

5 6

1200 1000

7 8 9 10 a NormalI)erson~

900 000 700 cm"

11 12 13 14 1 5 ~

4000 30002500 200018001500 I400

NS

S 7 8

1200 1000

9 I0

b Entzfind~tngen

4000 30002500 200018001600 1~00

6

1200

~ t t r ~

7 8 9

c Tumoren

1000

g ~

10

900 800 700 cm"

11 12 13 14 15/J.

900 800 700 cm "~

11 t2 13 14 15~

Abb. 2. IR-Spektrum der perchlors:~urelSslichen Glykoproteide. Entsprechend den hSheren Itexosewerten zu Gesamtkohlenhydraten der Gtykoproteide bei Kormalpersonen und Entzfindungen sind die itir Xohlenhydrate

eharakteristisehen Banden 3300/cm (3 ~) f~r Ot t -Grappen uncl 1070/cm a n d 1030/cm (9,3--9,7 Ft) ftir C0-Einfachbindung in den Spektren a u~d b intensiver als bei Neoplasien

anderer histologischer Struktur nnd Lokalisation. Die bier besehriebene Darstellungsmethode dieses EiweiB- Symplexes ermSglicht es, eine Substanz in relativ grogen Mengen zu isolieren, die unter -Umst/~nden I~iiekschltisse auf Stoffwechselvorg~tnge bei Neoplasien erlaubt.

Zusammen/assung. Bei Paraprotein/imien und ma- lignen Tumoren konnten wit ein kleinmolekulares per- chtorsgurelSstiehes GIykoproteid ans dem Urin iso- ]ieren. Es unterseheidet sieh in Peptid- und Kohlen-

1220 L. Lv~z~a~_~ und C. G. Se~t~D~: Untersuchungen fiber die kombonierte eytostatisehe Therapie KUnische Wochenschri ft

hydra tve rh~ l tn i s sen und seiner K o h l e n h y d r a t - Z u s a m - mense tzung yon Ur in -Glykopro te iden , die wir m i t der gleiehen Methodik bei Normalpersonen und entzi ind- l ichen E r k r a n k u n g e n fanden. Es h a t ein Molekular- gewieht u m 20000, e lek t rophore t i seh wande r t es auf Aeeta t fol ie bei p H 8,6 zwisehen Albumin und ~ - G l o - bu l in -Frak t ion . Es i s t m i t Poneeau S (Prote in-F~r- bung) a n d Sehiffseher g e a g e n s (Glykopro te id -Fgr - bung) dars te l lbar . Immunoe lek t rophore t i s eh l iegt seine Prae ip i ta t ions l in ie im Bereieh des sehnellen ea-Gtyko- proteids . Neben Glucose, Galaktose , Mannose und Fueose en tha l t es eine n ieh t ident i f iz ie r te Kohlen- h y d r a t k o m p o n e n t e , die normaterweise n ieh t bei den Glykopro te iden des Serums naehweisbar ist. Der Neuramins / iu regeha l t be t r~gt 8 - - 9 %, wovon 60- -70 % m i t Neuramin idase freizusetzen sind. Die Aminos/~ure- Ver te i lung ergibt keine sieheren Untersehiede. Die U r i n - K o n z e n t r a t i o n des Glykopro te ids is t yon der Ausdehnnng des neoplas t i sehen Prozesses abhgngig. Bei Adenoeare inom des Magen-Darmt rak t e s is t die Neuramins~ure -Konzen t r a t ion u m 20- -30 % niedr iger als bei Tumoren a.nderer his tologiseher S t r u k t u r u n d Lokal isa t ion . Es wird d iskut ie r t , ob diese Subs tanz inBeziehung zu dem neoplas t i sehen Zellstoffweehsel s teht .

Summary. In cases of paraproteinemia and malignant tumors we were able to isolate a low-molecular g]ycoprotein, soluble in perehlorie acid, from the urin. Using the same methodology we found that in its peptide and carbohydrate ratios it differs from urin glycoproteins we found in normal persons and inflammatory diseases. Its molecular weight lies around 20,000 and electrophoreticMly, on acetate foil with a pH of 8,6, it migrates between albumen and the ~-globulin fraction. I t may be obtained from Ponceau S (protein colour- ing) and Schiff's reagent (glycoprotein eolouring). Immuno- electrophoretieally its precipitation line lies within the range of the fast e~-glycoproteins. Besides glucose, galactose, man- nose and fucose it. also contains a pentose which is not normally detectable in the glyeoproteins of serum. The neuraminic acid content lies between 8--9%, of which 60--70% may be liberated with neuraminidase. The amino acid distribution shows no safe differences. The nrin concen- tration of the glycoprotein is dependent on the expansion

of the neoplastic process. The neuraminic acid concentration in the case of an adenocarcinoma of the gastro-in~estinaI tract is lower by 20--30% than in cases of tumours of a different histological structure and locMisation. I t is being discussed wether this substance is connected with the neoplastic cell metabolism.

Herrn Dr. H. OTTI~G, Max Planck-Institut fiir medizini- sche Forsehung, Heidelberg, danken Mr fiir die Anfertigung und Interpretation der It~-Kurven.

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Anschri/t: Prof. Dr. H. Wnm~E~ Med. Univ.-PoliMinik 69 Heidelberg, Hospitalstr. 3

Untersuehungen fiber die kombinierte cytostatisehe Therapie Der Einl lug von Cyclophosphamid und Mitomycin C auf den Cortisonabbau in der Leber

L. LUTZMANN U. C. G. SCItNIDT*

Aus der Medizinischen Ktinik und Poliklinik der lJniversit~it l~itinster (Direktor: Prof. Dr. W. H. H.~vsS)

Die Chemotherapie mal igner Tumoren mi t te l s der als Cy tos t a t i ea bezeiehneten Verb indungen is t m i t versehiedenen toxisehen Nebenwi rkungen behaf te t . Infolge der noeh n ieht zu umgehenden Sehgdigung des Wir t so rgan i smus erziel t diese Therap ie keine kura- r iven Wirkungen . Dagegen sind pa l l ia t ive Ef fek te mi t kl iniseher Besserung, die aueh zu passagerer Be- sehwerdefre ihei t f i ihren k6nnen, mSglieh. Die e inmal erziel te Remiss ion is t nu r sel ten dm'eh das gleiehe P r a p a r a t zu wiederholen. Daher b i lde t der E i n t r i t t der Therapieres is tenz den zur Zei t unve rme idba ren End- p u n k t jeder A r t yon Chemotherap ie b6sar t iger Ge- sehwtilste a n d Hi~moblastosen.

Zahlreiehe Un te r suehungen b e g r / i n d e n die An- nahme, dag die Therapieres is tenz mal igner Tumoren dureh eine ehemotherapeu t i seh induzier te Selekt ion

* Der Deutsehen Forschungsgemeinschaft danken wir fiir die Unterstfitzung der vorliegenden Arbeit.

ausgelSst wird 1-7. Hierbe i is t yon Bedeutung , dab aueh his tologiseh homogen s t ruk tu r i e r t e Gesehwii ls te aus einer in ihren biologisehen Eigensehaf ten hetero- genen Zel lpopula t ion au fgebau t s ind 8. Es war daher nahel iegend, den Versueh zu un te rnehmen , dureh K o m b i n a t i o n versehiedener Cy tos t a t i ea m i t nnter - sehiedl iehem bioehemisehen Angr i f f spunk t die En t - wieklung der Chemotherapieres is tenz zu verz6gern und den eaneeros ta t i sehen Ef fek t zu s teigern s-15. Dies kann sowohl in F o r m der mul t ip len Sequenzbloekade 9 als aueh du tch a l t e rna t ive Para l l e tb loekade 1° yon Stoffweehselket ten gesehehen.

Eigene exper imente l le und klinisehe Studien be- seh~.ftigen sieh m i t der eaneeros ta t i sehen W i r k u n g der K o m b i n a t i o n yon Cyetophosphamid (Endoxan) a n d Mi tomyein C is, 16, 17. Die App l ika t ion /~quitoxischer Dosen be ider Verb indungen bewi rk t eine Potenz ie rung des ey tos ta t i sehen Effektes. D a den Cy tos t a t i ea