Neue Methoden zur Anwendung

von Lipasen in der organischen Synthese

DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultt fr Chemie der Ruhr-Universitt Bochum

vorgelegt von Diplom-Chemiker

Wolfgang Wiesenhfer aus Dsseldorf

Mlheim an der Ruhr

2004

Referent: Professor Dr. M. T. Reetz

Korreferent: Professor Dr. M. Feigel

Tag der mndlichen Prfung: 22.07.04

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Oktober 2001 bis Juni 2004 unter der Leitung

von Prof. Dr. M. T. Reetz am Max-Planck-Institut fr Kohlenforschung in Mlheim an der

Ruhr angefertigt.

Herrn Prof. Dr. M. T. Reetz danke ich sehr herzlich fr die interessanten Themenstellungen,

die gewhrte Freiheit bei der Bearbeitung der Themen und das dabei stets entgegengebrachte

Vertrauen, die Mglichkeit unter hervorragenden Bedingungen interdisziplinr zu arbeiten,

sowie die stete Gesprchsbereitschaft bei fachlichen und darber hinausgehenden Fragen.

Herrn Prof. Dr. M. Feigel danke ich fr die bernahme des Korreferats und Herrn Prof. Dr.

M. Muhler fr sein Auftreten als Drittprfer.

Herrn Dr. Giancarlo Franci danke ich sehr fr die intensive und fruchtbare Zusammenarbeit

bei Versuchen mit ionischen Flssigkeiten, die Einfhrung in das Gebiet der Hochdruck-

chemie, sowie fr die vielen Diskussionen fachlicher und nicht fachlicher Art.

Fr die fachliche Zusammenarbeit auf dem Gebiet Selektion bedanke ich mich bei Herrn Dr.

Andreas Vogel.

Allen Partnern des EU-Projektes Evocatal Directed Evolution of Enantioselective Bio-

catalysts im In- und Ausland bin ich zu dank verpflichtet. Namentlich zu erwhnen sind:

Prof. Dr. W. Quax, Dr. Melloney J. Drge, Ykelien Boersma, Prof. Dr. K. E. Jger, Dr.

Thorsten Eggert, Aileen Funke, Prof. Dr. B. W. Dijkstra, Dr. Gertie van Pouderoyen, Tjaard

Pijning, Dr. R. Verger, Dr. Detlef Stckigt und Dr. J. M. Hilmer

Den Arbeitskreismitgliedern danke ich fr ein ausgezeichnetes Arbeitsklima, Hilfsbereitschaft

und gemeinsame Unternehmungen.

Herrn Prof. W. Leitner, Dr. Nils Theyssen und allen Mitarbeitern der Versuchsanlage und des

Drucktechnikums danke ich fr die sehr angenehme Arbeitsatmosphre in diesem Teil des

Max-Planck-Instituts, insbesondere mchte ich aber Herrn Lder fr das schnelle Beheben

von Kompressorschden danken.

Meinen Laborkollegen Stefanie Dehne, Dr. Andreas Eipper, Dr. Hiromasa Oka und Dr. Thor-

sten Sell danke ich fr die gute Zusammenarbeit im Labor.

Den Chemielaboranten Christian Dams, Bianca Schuchardt und Lars Winkel danke ich fr ihr

Engagement und ihre sorgfltigen Arbeiten.

Stefanie Dehne, Dr. Giancarlo Franci, Bianca Schuchardt, Dr. Nils Theyssen und

Dr. Andreas Vogel danke ich fr sorgfltiges und kritisches Korrekturlesen der vorliegenden

Arbeit.

Der GC-Abteilung und insbesondere Frau J. Rosentreter und Herrn D. Stoffels danke ich fr

die stets schnelle und zuverlssige Durchfhrung unzhliger GC-Analysen.

Fr die Durchfhrung von HPLC-Analysen danke ich Frau H. Hinrichs, Frau S. Schrder und

Herrn A. Deege. Herrn G. Breitenbruch danke ich fr die Untersttzung bei Arbeiten mit

HPLC-Pumpen.

Allen Mitarbeitern der MS-Abteilung danke ich ausnahmslos fr die Messung und Aus-

wertung zahlreicher Massenspektren.

Herrn R. Ettl und Herrn Dr. R. Mynott danke ich fr die Messung und die Hilfe bei der

Auswertung von NMR-Spektren.

Herrn Herrn K. Grfenstein, W. Kersten und Herrn H.-W. Schmidt danke ich fr die

Anfertigung und den Umbau von Autoklaven und sonstigen Apparaturen.

Den anderen Serviceabteilungen des Instituts bin ich fr eine Vielzahl von Analysen ebenfalls

zu Dank verpflichtet.

Frau R. Barabasch und Herrn Dr. W. J. Richter danke ich fr Literaturrecherchen und

Untersttzung bei der Beschaffung von Literatur und Informationen.

Frau Rathofer und ihren Kolleginnen gebhrt ein groes Dankeschn fr die Bewltigung

jeglicher organisatorischer Probleme.

Bei meinem Kollegen Marcus Hermes bedanke ich mich sehr fr die computertechnische und

sonstige Untersttzung.

Der Max-Planck-Gesellschaft zur Frderung der Wissenschaften und der Europischen Union

danke ich fr finanzielle Untersttzung.

Ein besonderer Dank gilt meiner Freundin Stefanie und meinen Brdern Michael und Frank.

Der grte Dank gebhrt meinen Eltern, die mir die Ausbildung ermglicht und mich immer

untersttzt haben.

Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits verffentlicht:

M. T. Reetz, W. Leitner, G. Franci, W. Wiesenhfer

Patentanmeldung, Deutsche Offenlegungsschrift: DE-A 10201778 A1, 17.01.2002 (Inter-

nationale Verffentlichungsnummer: WO 03/060057 A2 und A3)

Verfahren zu Durchfhrung von enzymatischen Reaktionen in ionischen Lsungsmitteln

(Method for carrying out enzymatic reactions in ionic solvents)

M. T. Reetz, W. Wiesenhfer, G. Franci, W. Leitner

Chem. Commun. 2002, 992-993

Biocatalysis in ionic liquids: batch-wise and continuous-flow processes using supercritical

carbon dioxide as the mobile phase

M. T. Reetz, P. Tielmann, W. Wiesenhfer, W. Knen, A. Zonta

Adv. Synth. Catal. 2003, 345, 717-728

Second Generation Sol-Gel Encapsulated Lipases: Robust Heterogeneous Biocatalysts

M. T. Reetz, W. Wiesenhfer, G. Franci, W. Leitner

Adv. Synth. Catal. 2003, 345, 1221-1228

Continuous Flow Enzymatic Kinetic Resolution and Enantiomer Separation using Ionic

Liquid/Supercritical Carbon Dioxide Media

Und wenn ich prophetisch reden knnte

und alle Geheimnisse wsste

und alle Erkenntnisse htte;

wenn ich alle Glaubenskraft bese

und damit Berge versetzen knnte,

htte aber die Liebe nicht,

wre ich nichts

1. Korinther 13, 2

Entscheidend ist auf dem Platz

Addi Preiler

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1.1 Katalyse und Katalysatoren 1

1.2 Chiralitt 2

1.3 Strategien zur Verbesserung der katalytischen Eigenschaften von Enzymen 11

1.4 Nachhaltige Chemie 17

3.1 Biokatalyse in ionischen Flssigkeiten 26

3.2 Kinetische Racematspaltung in ionischer Flssigkeit/scCO2 35

3.3 Spezielle Separierungsstrategien nach lipasekatalysierter kinetischer Racematspaltung 51

3.4 Kinetische Racematspaltung unter Verwendung von ionischen Tags 56

3.5 Lipasenreaktionen in flssigem Polyethylenglykol 72

4.1 Bacillus subtilis Lipase 83

4.2 Synthese kurzkettiger Phosphonsureester und deren Anwendung im

Kristallisationsexperiment 85

5.1 Phage Display als Werkzeug fr die gerichtete Evolution 93

5.2 Neue Materialien fr Phage Display-Anwendungen 101

5.3 Untersuchungen zur Stabilitt von Phosphonsureestern 111

5.4 Cell Sorting zur Selektion enantioselektiver Enzyme 114

Inhaltsverzeichnis I

Abkrzungsverzeichnis III

1 Einleitung 1

2 Aufgabenstellung 25

3 Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 26

4 Arbeiten zur Aufklrung der Enantioselektivitt von Lipase Varianten 83

5 Selektion enantioselektiver Enzymmutanten 93

Inhaltsverzeichnis II

6 Zusammenfassung und Ausblick 134

7 Experimenteller Teil 137

7.1 Materialien und Methoden 137

7.2 Biokatalyse in ionischen Flssigkeiten und scCO2 145

7.3 Synthesen von ionischen Tags 163

7.4 Synthese von Startmaterial fr die Katalyse 172

7.5 Kinetische Racematspaltung unter Verwendung von ionischen Tags 173

7.6 Biokatalyse in Polyethylenglycol (PEG) und scCO2 177

7.7 Synthesen von Phosphonsureestern fr die Kristallisation 186

7.8 Synthesen von Phosphonsureestern fr Phage Display Anwendungen 195

7.9 Synthesen von fluoreszenzmarkierten Substanzen 213

8 Literaturverzeichnis 228

Abkrzungsverzeichnis III

Abkrzungsverzeichnis

AAV Allgemeine Arbeitsvorschrift IL ionische Flssigkeit

abs. absolutiert IR Infrarotspektroskopie

q. quivalent(e) J Kopplungskonstante

arom. aromatisch KF Khlfalle

[BMIM] 1-Butyl-3-methylimidazolium LipA Lipase A von Bacillus subtilis

br breit (NMR, IR) lyo. Lyophilisat

Bu Butyl m Multiplett, mittel

BTA Bis-trifilic-amide ((CF3SO2)2N-) M Molmasse; Magnetrhrplatte

c Konzentration mbar Millibar

CaL B Candida antarctica Lipase B Me Methyl

CP Kompressor min Minuten

CSTR continuous stirred tank reactor MS Massenspektrometrie

d Dublett; Tag m/z Masse/Ladung

Chemische Verschiebung; Deformationsschwingung

NMP N-Methylpyrrolidin-2-on

DC Dnnschichtchromatographie NMR Nuclear Magnetic Resonance

dest. destilliert NV Nadelventil

DMF N,N-Dimethylformamid p para

DSC Di-(N-succinimidyl)carbonat P Druck

EMIM 1-Ethyl-3-methylimidazolim PEG Polyethylenglycol

ee enantiomeric excess PR Druckminderer

EI Elektronenstoionisation PT Druck- und Temperaturkontrolle

Emmax Emissionsmaximum R Reaktor

ESI Elektronensprayionisation rac racemisch

eV Elektronenvolt RT Raumtemperatur

Exc Extinktionsmaximum s Singulett; stark

FI Fluoreszenzintensitt S Substrat; Selektivitt

G Gasuhr scCO2 berkritisches Kohlendioxid

GC Gaschromatographie t Triplett; Tonne

h Stunde T Temperatur

HP HPLC-Pumpe w schwach

HPLC high performance liquid chromatography

Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Katalyse und Katalysatoren

Die chemische Industrie besitzt in allen Industrienationen eine Schlsselfunktion, da sie

Chemikalien in alle anderen Industriezweige liefert. Nahezu alle Gter, die dabei aus Erdl,

Gas, Kohle und nachwachsenden Rohstoffe hergestellt werden, durchlaufen dabei mindestens

einen katalysierten Schritt. Produkte die in diesen Lndern mittels Katalysatoren hergestellt

werden und Prozesse in denen sie angewandt werden, machen dabei durchschnittlich ca.

des gesamten Bruttoinlandproduktes aus.[1] Am Beginn des neuen Jahrtausends berschritt der

Katalysatormarkt erstmals die Zehn Milliarden Dollar Grenze und stellt nach wie vor einen

wachsenden Wirtschaftszweig dar.[1, 2] Die Erforschung von Katalysatoren stellt dabei keine

eigenstndige Wissenschaft dar, sondern ist vielmehr ein verzweigtes und interdisziplinres

Fachgebiet, das sich aus verschiedenen Forschungsgebieten wie Anorganischer Chemie,

Organischer Chemie, Biochemie, Verfahrenstechnik, Materialforschung, Physikalischer

Chemie und Theoretischer Chemie zusammensetzt. Katalysatoren werden aber nicht nur von

Menschen in technischen Prozessen verwendet, sondern treten nahezu immer und berall auf.

Dies wurde bereits von Berzelius im Jahre 1836 festgestellt:[3]

Wir bekommen begrndeten Anlass zu vermuten, dass in lebenden Pflanzen und

Tieren Tausende von katalytischen Prozessen zwischen den Geweben und

Flssigkeiten vor sich gehen.

Allerdings dauerte es ber 100 Jahre bis Pauling mit seinem Postulat, dass Biokatalysatoren

den bergangszustand einer chemischen Reaktion stabilisieren, die Grundlage fr die heutige

moderne Katalyseforschung legte.[4, 5] Die fundamentale Eigenschaft von Katalysatoren

chemische Reaktionen zu beschleunigen hat so die Entwicklung der modernen chemischen

Industrie erst ermglicht. Neben der Geschwindigkeit knnen Katalysatoren auch den Verlauf

von chemischen Reaktionen beeinflussen und so Chemo-, Regio- und Stereoselektivitt

lenken. Auf diese Eigenschaft von Katalysatoren soll im nchsten Kapitel nher eingegangen

werden.

Einleitung 2

1.2 Chiralitt

Der Markt fr optisch reine Produkte ist in den letzten Jahren stetig gewachsen, besonders auf

Grund der gestiegenen Nachfrage in der Pharamzie, Agrochemie, Duft- und Aroma-

industrie.[6, 7] So stellen Lipitor und Zocor, die beiden Top-Sale-Drugs des Jahres 2002 mit

einem Gesamtvolumen von 14 Milliarden Dollar, enantiomerenreine kleine Molekle dar

(beide Prparate werden zur Regulierung des Cholesterinspiegels eingesetzt).[6]

N

F

O

NH

O

OOHOH

2

Ca2+

O

O

OOH

O

Lipitor Zocor

erenreinen

Verbindungen im Jahr 2000 die 100 Milliarden Dollar Grenze deutlich berschritt.

Abbildung 1.1 Struktur der beiden Blockbuster des Jahres 2002 Lipitor und Zocor

Enantiomere sind chemische Verbindungen, die sich wie Bild und Spiegelbild verhalten, sich

also nur in ihrem rumlichen Aufbau unterscheiden. Da das Leben auf molekularer Ebene im

Wesentlichen durch chirale Erkennung gesteuert wird, verwundert es nicht, dass biologische

Systeme Enantiomerenpaare als zwei unterschiedliche Verbindungen erkennen und auch

unterschiedlich auf diese reagieren knnen. So schmeckt die natrlich vorkommende

Aminosure L-Asparagin bitter, whrend das knstlich hergestellte D-Asparagin als s

empfunden wird. Seit der allgemein bekannten Arzneimittelkatastrophe im Jahre 1957 mit

dem damaligen Prparat Contergan wurde das Arzneimittelrecht im Hinblick auf den

Einsatz chiraler Wirkstoffe deutlich verschrft. So fordert eine Richtlinie der US-

amerikanischen Food and Drug Administration von 1992 den Einsatz von enantiomeren-

reinen Produkten, sofern die gewnschte Wirkung nicht fr beide enantiomere Wirkstoffe

eindeutig nachgewiesen ist.[7] Fr die Zulassung von neuen chiralen Medikamenten mssen

daher auch alle Stereoisomere selektiv hergestellt und auf Nebenwirkungen getestet werden.

Chemiker werden so mehr und mehr in Verantwortung gezogen Methoden zu entwickeln die

es ermglichen, enantiomerenreine Verbindungen auch im industriellen Mastab zu

synthetisieren. So ist es nicht verwunderlich, dass der Umsatz mit enantiom

Einleitung 3

1.2.1 Methoden zur Gewinnung von optisch aktiven Substanzen

Prinzipiell existieren vier Methoden, die grotechnisch angewendet werden, um enantio-

merenreine Verbindungen herzustellen bzw. zu gewinnen.[7-9]

Isolierung von Naturstoffen aus dem chiralen Pool

Gezielte Steuerung mikrobiologischer Stoffwechselprozesse und Fermentation

Racematspaltung

Umwandlung von prochiralen Verbindungen in eine optisch aktive Substanz

Keiner der vier Methoden kann alleine zu einem Fachgebiet der chemischen oder

biologischen Forschung zugeteilt werden. Ebenso ist auch der bergang der Methoden

untereinander flieend, was im Folgenden nher erlutert wird.

Einige optisch aktive Substanzen knnen aus dem so genannten chiralen Pool gewonnen

werden. Der Einsatz von Naturstoffen wie Milchsure, Aminosuren, Kohlenhydrate oder

Terpene ist wirtschaftlich nur rentabel, wenn eine effiziente Isolierung mglich ist. Da diese

Verbindungen in der Natur bereits in hohen Enantiomerenreinheiten vorhanden sind, kann auf

eine weitere Aufreinigung in den meisten Fllen verzichtet werden. Der Nachteil dieser

Methode liegt in der Limitierung der zugnglichen Produkte aus Naturstoffen, die zumeist nur

in einer optisch aktiven Form vorkommen.

Als eine Weiterentwicklung dieser Methode kann die Ausnutzung von fermentativen oder

mikrobiologischen Prozessen angesehen werden. Sie sind ntzliche Methoden zur Gewin-

nung von komplexen chiralen Moleklen, die zumeist in einem Schritt verlaufen. Dabei fallen

die enantiomerenreinen Verbindungen als Stoffwechselprodukte der Mikroorganismen an. So

knnen z. B. Aminosuren, Vitamine oder Hormone ausgehend von billigen Chemikalien

(vorwiegend Kohlenhydrate), die den Mikroorganismen als Energiequelle dienen, gewonnen

werden. Der Nachteil dieser Methode liegt ebenfalls in der Limitierung der zugnglichen

Produkte, die mikrobielle Metabolite darstellen. Ein Teil dieser Probleme kann durch

Metabolic System Engineering behoben werden, indem bestimmte Stoffwechselschritte im

Organismus unterdrckt bzw. gefrdert werden.[10] Diese Art der Beeinflussung ist technisch

mglich und wird industriell bereits angewandt, stellt aber nach wie vor eine sehr komplexe

und schwierige Aufgabe dar, da das Blockieren von Stoffwechselfunktionen oft ungeahnte

Auswirkungen hat.[11] Die Spaltung von Racematen in die reinen Enantiomere wurde bereits

vor ber einhundert Jahren eingesetzt. Bei der klassischen Racematspaltung durch

Kristallisation beruht die Trennung auf der bevorzugten Kristallisation eines Enantiomers,

whrend das andere Stereoisomer in Lsung bleibt. Diese Trennung ist technisch nur

durchfhrbar, wenn die Racemate als Konglomerate vorliegen, d. h. mechanische Mischungen

Einleitung 4

von Kristallen der beiden Enantiomere sind.[8] Pasteur fhrte als erster eine solche

Racematspaltung im Jahre 1848 bei der Kristallisation von Weinsuresalzen durch.[12] Leider

kristallisieren weniger als 10 % der Racemate als Konglomerate. Sollten die Racemate eine

homogene feste Phase ausbilden, so knnen die Enantiomere dennoch durch Kristallisation

getrennt werden. Dazu werden sie in diastereomere Salze berfhrt, die sich in ihren

Lslichkeiten teilweise stark unterscheiden. Racematspaltung durch Kristallisation wird im

grotechnischen Mastab durchgefhrt.[9] Das chirale Hilfsreagenz muss dazu mindestens in

stchiometrischen Mengen eingesetzt werden. Teilweise wird es sogar eigens fr den

Trennprozess synthetisiert. Trotz des Nachteils des notwendigen Trennschrittes stellt diese

Methode ein wichtiges Werkzeug in der industriellen Gewinnung von enantiomerenreinen

Substanzen dar. Prinzipiell knnen Racemate auch durch chromatographische Methoden

(HPLC) an chiraler Phase separiert werden. Die Kapazitt dieser Methode ist allerdings

beschrnkt und auf Grund des hohen Lsemittelverbrauches eine sehr kostenintensive

Methode, die nahezu nur dann eingesetzt wird, wenn alle anderen Methoden nicht zum

gewnschten Erfolg fhren.

Eine weitere Methode zur Trennung von racemischen Gemischen ist die kinetische

Racematspaltung. Diese erfolgt dadurch, dass eines der Enantiomere mit einem chiralen

Katalysator schneller umgesetzt wird als das andere. Der chirale Katalysator bertrgt dabei

seine chirale Information auf das Substrat, wodurch es zur Vervielfltigung von chiraler

Information kommt. Der Katalysator kann ein klassischer chiraler bergangsmetallkomplex

oder ein Biokatalysator (meist ein Enzym) sein.[13, 14] Besonders die Verwendung von

Enzymen als Katalysatoren fr kinetische Racematspaltungen findet immer mehr Anwendung

in der chemischen Industrie.[9, 15] Dies ist erstaunlich, da die Anwendung dieser Methode zwei

grundlegende Nachteile besitzt. Zum einen muss nach der kinetischen Racematspaltung

immer ein Trennschritt erfolgen, zum anderen betrgt die maximale Ausbeute 50 %. Das

Enantiomer mit der falschen absoluten Konfiguration muss entweder verworfen oder

recycliert werden. Auf dieses spezielle Forschungsgebiet soll im Kapitel 1.2.2.2 nher

eingegangen werden. Neuere Methoden, wie die dynamische kinetische Racematspaltung,

versuchen das Substrat in situ zu racemisieren, wodurch theoretische Ausbeuten von 100 %

mglich sind.[16]

Enantiomerenreine Substanzen knnen auch durch Umwandlung von prochiralen

Substraten in optisch aktive Verbindungen, in Gegenwart eines chiralen Hilfsreagenzes oder

eines chiralen Katalysators, hergestellt werden, was man asymmetrische Synthese nennt.[17]

Die chirale Information des Hilfsreagenzes bzw. des Katalysators wird dabei auf das Produkt

Einleitung 5

bertragen. Die Anwendung von chiralen Hilfsreagenzien ist nur dann sinnvoll, wenn es

mglich ist, die chiralen Hilfsstoffe nach der Reaktion effizient wiederzugewinnen, da es sich

sonst um einen sehr abfallintensiven Prozess handelt. Separierungsschwierigkeiten und die

notwendigen stchiometrischen Mengen der chiralen Hilfsreagenzien beschrnken den

grotechnischen Einsatz daneben erheblich. Eine konomischere Methode ist die Ver-

wendung von chiralen Katalysatoren. Bei dieser Art der asymmetrischen Synthese findet eine

Vervielfltigung der chiralen Information des Katalysators statt.[18] Als Katalysatoren knnen

chirale bergangsmetallkomplexe, Biokatalysatoren oder Organokatalysatoren eingesetzt

werden.[9, 15, 19, 20] Alle drei Katalysatorsysteme stellen leistungsfhige Methoden zur Gewin-

nung von enantiomerenreinen Verbindungen dar. Der Aktualitt und Wichtigkeit dieses

Forschungsgebietes wurde mit der Nobelpreisverleihung im Jahre 2001 an Knowles, Noyori

und Sharpless fr ihre Verdienste, auf dem Gebiet der asymmetrischen Katalyse mit

bergangsmetallkomplexen, Nachdruck verliehen.[20-22] Gewrdigt wurden hier Arbeiten die

bahnbrechende Erfolge mit chiralen bergangsmetallkomplexen verzeichneten. Allerdings ist

die grotechnische Anwendung dieser Katalysatoren oftmals durch die hohen Katalysator-

kosten beschrnkt. Im Gegensatz dazu finden Verfahren mit Enzymen als asymmetrischen

Katalysatoren immer mehr praktische Anwendung.[9, 15, 23, 24]

Welche Methode die beste bzw. wirtschaftlichste ist, hngt von vielen Faktoren ab. Alle

Methoden haben wie im Text angesprochen Vor- und Nachteile, die im Einzelfall gegen-

einander abgewogen werden mssen.

1.2.2 Biokatalyse

In den letzten zwanzig Jahren hat sich die Biokatalyse neben vielen anderen Methoden als ein

Standardwerkzeug in der organischen Chemie etabliert,[25, 26] insbesondere auf dem Gebiet der

enantioselektiven Katalyse.[9] Neben Enzymen knnen auch Antikrper[27, 28] und

Ribozyme[29-33] katalytische Aktivitt besitzen und somit als Biokatalysatoren angesehen

werden. Allerdings ist die katalytische Aktivitt und Stabilitt der beiden zuletzt genannten

Katalysatortypen begrenzt, so dass fr diese noch keine synthetische Anwendung besteht.

Ein entscheidender Aufschwung fr den Einsatz von Enzymen in der organischen Synthese

wurde von Klibanov durch deren Verwendung in organischen Lsungsmitteln bewirkt,[34]

obwohl die Anwendung im nichtwssrigen Medium schon im Jahr 1900 beschrieben worden

ist.[35] Die hohe Attraktivitt von Enzymen im Vergleich zu konventionellen Katalysator-

systemen begrndet sich vor allen Dingen in ihrer Effizienz Reaktionen zu beschleunigen und

Einleitung 6

ihrer hufig exzellenten Chemo-, Regio-, Diastereo- und Enantioselektivitt sowie ihrer

Anwendbarkeit unter milden Bedingungen.

Allerdings ist die Anwendung von Biokatalysatoren in der organischen Synthese nicht trivial

und bringt teilweise erhebliche Probleme mit sich, bedingt durch die Tatsache, dass bislang

nur eine beschrnkte Anzahl an Biokatalysatoren verfgbar ist und diese meist nur ein

beschrnktes Substratspektrum und eingeschrnkte operationelle Stabilitt besitzen.[24] Durch

Genomprojekte wird seit etlichen Jahren versucht, neue Enzyme zu identifizieren und somit

das Angebot an Biokatalysatoren zu vergrern. Daneben knnen Immobilisierungstechniken

die operationelle Stabilitt deutlich erhhen und somit die Desaktivierung von Enzymen

verhindern.[36-40] Inzwischen sind darber hinaus eine Vielzahl von Strategien, wie z.B.

gerichtete Evolution, entwickelt worden, um die Aktivitt und Selektivitt von Biokatalysa-

toren erheblich zu verbessern (vgl. Kapitel 1.3.1).

Bis zum heutigen Tag sind ber 3000 Enzyme identifiziert und charakterisiert worden, von

denen besonders die Enzymklasse der Hydrolasen mit ca. 65 % die strkste Nutzung

erfhrt.[41] Aus der Enzymklasse der Hydrolasen wird allerdings ein Enzym besonders hufig

verwendet, nmlich die Enzymgruppe der Lipase, auf die im nchsten Kapitel eingegangen

werden soll.

1.2.2.1 Lipasen

Lipasen (Triacylglycerin-Hydrolasen, EC 3.1.1.3.) gehren zur Enzymklasse der Hydrolasen.

Sie katalysieren im Stoffwechsel von Pilzen, Bakterien und allen hheren Lebewesen die

Spaltung von Triacylglyceriden. Die erstmalige Isolierung einer Lipase (aus Schweine-

Pankreas) gelang Willsttter im Jahre 1923.[42] Eine vollstndige Aufreinigung gelang jedoch

erst 1969 durch Verger.[43] Lipasen werden meist durch Extraktion von tierischem oder

pflanzlichem Gewebe sowie durch Kultivierung von Mikroorganismen gewonnen. Sie sind

grenzflchenaktive Enzyme, was bedeutet, dass ihre Aktivitt erst bei Vorliegen einer

Phasengrenze stark gesteigert wird.[44] Diese Tatsache stellt den Hauptunterschied zu

Esterasen dar. Gegenber wasserlslichen Substraten zeigen Lipasen solange geringe

Aktivitt, bis die kritische Mizellenkonzentration der Substrate berschritten und eine Fett-

Wasser-Grenzflche gebildet wird. Als Ursache fr diese Grenzflchenaktivierung gilt das

Vorliegen einer -helikalen, hydrophoben Domne (auch Deckel oder Lid genannt), die das

aktive Zentrum verbirgt. Erst bei Kontakt mit einer hydrophoben Schicht findet eine

Konformationsnderung der Lipase statt, die den Deckel anhebt und das aktive Zentrum

freisetzt. Durch Kristallisation der Lipase von Mucor miehei mit und ohne Inhibitor sowie

Einleitung 7

durch Kristallisation der Lipase aus der menschlichen Bauchspeicheldrse konnten anhand

der Strukturaufklrung eine Konformationsnderung des -helikalen Deckels durch den

Inhibitor besttigt werden.[45-47] Das aktive Zentrum von Lipasen, die sogenannte katalytische

Triade, wird aus den Aminosuren Asparagin, Histidin und Serin gebildet.[48] In einigen

Fllen (z.B. bei der Lipase aus Geotrichum candidum) ist die Aminosure Asparaginsure

gegen Glutaminsure ausgetauscht.[49] Abbildung 1.2 zeigt den allgemein anerkannten

Reaktionsmechanismus einer Esterhydrolyse.

O

O

NH NH O

Ser

RRO

O

O

O NH N+

HRRO

O

OSer

-ROHO

O

NH N

SerO

O R

Nu

O

O

NH N+

HRO

OSer

Nu

RO

Nu Abbildung 1.2 Mechanismus der Umsetzung von Estern mit Nucleophilen im aktiven Zentrum einer Lipase durch die katalytische

Triade

Die Imidazolgruppe am Histidin erhht die Nucleophilie des Serin-Restes, whrend die

Aspartat-Carboxylgruppe die durch die Protonierung des Histidins entstandene positive

Ladung stabilisiert. Die Hydroxylfunktion des Serins greift nucleophil am Carbonylkohlen-

stoff des Esters an, woraufhin der Acyl-Enzym-Komplex gebildet wird. Der so gebildete

tetraedrische bergangszustand wird ber Wasserstoffbrckenbindungen stabilisiert. Der

Acyl-Enzym-Komplex wird im Fall der Esterhydrolyse durch Wasser als Nucleophil ange-

griffen. Nach Durchlaufen einer zweiten tetraedrischen Zwischenstufe wird das Produkt

gebildet. In der Vergangenheit wurden bereits einige Strukturen grerer Lipasen aufge-

klrt.[50] Es zeigte sich, dass alle einem speziellen Faltungsmuster folgen, der sogenannten

,-Hydrolasefaltung.[51] Dieses charakteristische Faltungsmotiv besteht aus acht, fast voll-

stndig parallelen -Faltblatt-Strngen, welche durch -Helices flankiert werden (siehe

Einleitung 8

Abbildung 1.3). Die rot dargestellten -Faltblatt-Strukturen sind gegeneinander verdreht, so

dass 1 und 8 etwa im rechten Winkel zueinander stehen. Verbunden werden die einzelnen

-Faltblatt-Strnge durch die in blau dargestellten -Helices A bis F.

Abbildung 1.3 , -Hydrolasefold nach OLLIS: roter Pfeil = -Faltblatt, blauer Zylinder = -Helix. Die katalytische Triade ist

schematisch in Form schwarzer Kugeln dargestellt, als angreifendes Nukleophil ist hier Serin gewhlt und als Sure Aspartat.

Lipasen knnen, wie in Kapitel 1.2.1 beschrieben, bei enantioselektiven Reaktionen

eingesetzt werden, wobei sie als chiraler Katalysator in kinetische Racematspaltungen oder

Desymmetrisierungen zum Einsatz kommen knnen. Daneben stellen sie aber auch ein

leistungsfhiges Werkzeug in der Totalsynthese von komplexen Moleklen und insbesondere

in der Schutzgruppenchemie dar, da mit ihnen Esterbindungen unter milden Bedingungen

gio- und stereoselektiv geknpft bzw. verseift werden knnen.[52] Auf den Einsatz von

nchsten Kapitel einge-

gangen werden.

erbindungen herzustellen. Der Vorteil dieser Methode

spruches der Substitu-

re

Lipasen in der kinetischen Racematspaltung soll nun gesondert im

1.2.2.2 Lipasekatalysierte kinetische Racematspaltung

Wie bereits in Kapitel 1.2.1 beschrieben stellen kinetische Racematspaltungen eine mgliche

Methode dar, um enaniomerenreine V

liegt darin, dass es bei der Umsetzung von achiralen Substraten, die zumeist gnstig in

grotechnischen Prozessen hergestellt werden knnen, zu einer Vervielfltigung der chiralen

Information des Katalysators kommt.

Kazlauskas schlug 1991 ein Modell vor, mit dessen Hilfe vorausgesagt werden kann, welches

Enantiomer eines sekundren Alkohols bei einer lipasekatalysierten Reaktion schneller

reagiert.[53] Die Vorhersage erfolgt ber Bewertung des sterischen An

Einleitung 9

enten im Substratmolekl. Abbildung 1.4 zeigt das jeweils bevorzugt umgesetzte Enantiomer.

Im Falle von chiralen sekundren Alkoholen (1) wird das (R)-Enantiomer bevorzugt

umgesetzt, bei chiralen Suren (2) wird das (S)-Enantiomer bevorzugt.

R2

R1O

HR3

O

1

R2R1

H O

O

R3 2

R3 O

O

H

mittel

H

mittelgro

OR3O

gro

(R) (S) Abbildung 1.4 Kazlauskas-Regel fr lipasekatalysierte Hydrolysereaktionen: Als Sequenzregel gilt: gro > mittel, abgebildet ist

jeweils das bevorzugt umgesetzte Enantiomer

Entscheidend fr die Enantioselektivitt von lipasekatalysierten Reaktionen ist der Unter-

schied der bergangszustands-Energien der mglichen Enzym-Substrat-Komplexe. Dieser

rt hingegen ist unabhngig vom Umsatz und ist

definiert als das Verhl en

Enantiomere mit vR fr das (R)- und mit vS fr das (S)-Enantiomer. Es ist dem in der Metall-

energetische Unterschied spiegelt sich letztendlich auch in den unterschiedlichen Reaktions-

geschwindigkeiten der beiden Enantiomere eines Racemates wieder, ber die der sogenannte

E-Wert berechnet wird.

Sih stellte ein Modell fr die Enantiodifferenzierung einer solchen kinetischen Racemat-

spaltung auf, das die Berechnung der Enantiomerenberschsse in Abhngigkeit von der Zeit

ermglicht.[54, 55] Sih fhrte den sogenannten E-Wert (E) als Ma fr die Enantioselektivitt

ein, der die Selektivitt einer kinetischen Racematspaltung mit dem Umsatz und dem

Enantiomerenberschu (ee) in Verbindung setzt. In einer kinetischen Racematspaltung ist

der ee-Wert vom Umsatz abhngig, was bei einem Vergleich von verschiedenen experimen-

tellen Daten zu Problemen fhrt. Der E-We

tnis der Reaktionsgeschwindigkeiten (v) der beiden umgesetzt

Katalyse gebruchlichen s-Wert quivalent:[54]

S

RvE = (1) v

Einleitung 10

Da es sich bei Racematspaltungen hufig um reversible Reaktionen handelt, muss bei hohen

Umstzen die Rckreaktion bercksichtigt werden, da die Reversibilitt der Reaktion zu einer

Erniedrigung der optischen Reinheit fhrt. Durch das Einbeziehen der

Gleichgewichtskonstante K und des Umsatzes c in die Berechn

folgende Gleichung:[54]

ung des E-Wertes erhlt man

)]-(1cK)(1-ln[1 Ree+)](1cK)(1-ln[1 ReeE ++= (2)

Fr niedrige Umstze (c < 40%) vereinfacht sich Gleichung (2) zu:[54]

)]1()1ln[()]1()1ln[(E Reec

Reec+= (3)

Fr irreversible Reaktionen ist der E-Wert unabhngig vom Umsatz. Straathof und Jongejan

zeigten, dass der E-Wert fr diese Reaktionen sehr przise aus den Enantiomerenber-

schssen des Produkts eeP und des Edukts eeS berechnet werden kann:[56]

+

+

=

p

s

s

p

eeeeee

1

1ln

E (4)

Hgeberg wies allerdings darauf hin, dass eine Irreversibilitt in Umesterungen prinzipiell

nicht erreichbar ist, solange der gebildete Produktester auch als Acylierungsmittel fr das

Edukt zur Verfgung steht.

+

s

s

eeeeee

1

1ln

b durchgefhrt werden kann [54]

sich icht umgesetzten Edukt effizient abtrennen lsst. Auf dieses

[57] In der Literatur finden sich verschiedene Richtwerte ab wann

eine kinetische Racematspaltung effizient in industriellem Masta

(Sih schlgt z. B. einen Richtwert fr E von 100 vor ). Die Praktikabilitt von kinetischen

Racematspaltungen ist allerdings nicht nur vom EWert abhngig, sondern auch davon, ob

das Produkt vom n

Grundlegende Problem wird in Kapitel 3.3 eingegangen werden.

Einleitung 11

1.3 Strategien zur Verbesserung der katalytischen Eigenschaften von Enzymen

Besitzt ein Enzym fr eine gewnschte Reaktion mangelnde Aktivitt oder Selektivitt, so

kann nach einem anderen Enzymen aus dem vorhandenen genetischen Pool gesucht werden,

das die gewnschten Ei tegie ist, Methoden an-

zuwenden, die die gewnschte Eigenschaft des Enzym ierfr steht heutzutage

ein ichkei

knnen etzung u

sind. In Tabelle 1.1 sind die m z

beschrTabelle 1.1 Strategien zur Optimierung von Biotransformationen

genschaften besitzt. Eine weitere mgliche Stra

s verbessern. H

ganzes Arsenal an Mgl

und deren Ums

ten zur Verfgung, deren Erfolgsaussichten stark differieren

nd Anwendung ebenfalls sehr unterschiedlich im Aufwand

glichen Strategien aufgezhlt und deren Potential kur

ieben.

Strategie Wirkung/Ziel

Einsatz in organischen Umkehrung der Reaktionsfhrung mglich, mit teilweiser Ste tt Lsemitteln[34] igerung der Aktivitt und Regio- und Enantioselektivi

Immobilisierung von Er er auch zur Erhhung der Selektivitt

Io Reaktionsmedie 62] Erhhung der Selektivitt

Optimierung der Erhhung der Stabilitt und Aktivitt, aber auch zur

Einsatz rekombinanter Hauptschlich Erhhung der Enzymproduktion und

P ] Vernderung des katalytischen Profils (Beeinflussung von

Molecular Modeling[70-72] Voraussagen, welche Aminosureaustausche zur

Enzymen[39, 40, 58] hhung der operationellen Stabilitt und Aktivitt, ab

nische Flssigkeiten alsn[59-

Erhhung der Stabilitt und Aktivitt, aber auch zur

Imprinting[63] Erhhung der Selektivitt fr ein bestimmtes Substrat

Reaktionsbedingungen[14] Erhhung der Selektivitt

DNA[64, 65] Enzymaktivitt

unktmutagenese[64, 66-69Aktivitt, Selektivitt, Stabilitt, Substratspektrum)

Verbesserung des katalytischen Profils fhren knnen

Optimierung von Fermentationsbedingungen[25]

Hauptschlich Erhhung der Enzymproduktion und Enzymaktivitt

Gerichtete Evolution von Enzymen[64, 73-81]

Vernderung des katalytischen Profils (Beeinflussung von Aktivitt, Selektivitt, Stabilitt, Substratspektrum)

Einleitung 12

In der Literatur werden die aufgelisteten Strategien unterschiedlich diskutiert und so ist es

nicht verwunderlich, dass zu fast jeder Strategie unterschiedliche Resultate im positiven wie

im negativen Sinn publiziert sind. Welche Strategie letztlich zum Erfolg, d.h. zu einem

und ist stark von

ktion) auf die gewnschte Eigenschaft und Identifizierung

tzt genannte Methodik wird separat

glicht schlielich die Untersuchung des Enzyms auf die gewnschte

Eigenschaft; Identifikation einer verbesserten Variante und Rckfhrung der zugehrigen

DNA in Schritt 1 tens zwei Zyklen

verbesserten Biokatalysator fhrt, kann nicht pauschal beantwortet werden

der jeweiligen Problemstellung abhngig. Trotz allem soll auf zwei Punkte - den Einsatz von

ionischen Flssigkeiten und auf die gerichtete Evolution von Enzymen - im Folgenden nher

eingegangen werden.

1.3.1 Gerichtete Evolution von Enzymen mittels Screening

Die gerichtete Evolution von Enzymen macht sich die natrliche Kraft der Darwinistischen

Evolutionsprinzip[82] zur Verbesserung von Enzymeigenschaften zu Nutze. Mehrere Zyklen

von Mutation, Screening (bzw. Sele

des verbesserten Klons im Labormastab fhren zu verbesserten Enzymvarianten.

Es sei an dieser Stelle darauf hin gewiesen, dass es zwei verschiedene Arten der Auffindung

von verbesserten Enzymvarianten gibt, nmlich die durch aktives Suchen (Screening) oder die

durch Selektion von verbesserten Varianten. Auf die zule

im nchsten Kapitel eingegangen.

Diese Imitation der natrlichen Evolution, die auf hnliche Art die Funktion und Wirkungs-

weise von Enzymen ber Jahrmillionen auf einen bestimmten Zweck hin optimiert hat, kann

so im Reagenzglas in kurzer Zeit zum Erfolg fhren. Die schematische Vorgehensweise der

Evolution im Reagenzglas ist in Abbildung 1.5 skizziert.

Zunchst muss das Ausgangsgen, welches das zu verbessernde Enzym kodiert, erkannt und

ausgewhlt werden. Verschiedenste Mutagenesemethoden knnen zur Erzeugung von

Bibliotheken in Schritt 2 herangezogen werden.[83] Die DNA-Bibliothek wird anschlieend in

einen geeigneten Expressionsvektor kloniert und dieser nach Ligation in kompetente Zellen

eines Wirtsorganismus (z. B. Escherichia coli) transformiert. berexpression im jeweiligen

Wirtsorganismus erm

komplettiert den Zyklus. Nach Durchlaufen von mindes

kann man von einem evolutionren Druck auf die gewnschte Eigenschaft sprechen. Wird nur

ein Zyklus durchlaufen, erhlt man lediglich eine Bibliothek von Zufallsvarianten des

untersuchten Enzyms.

Einleitung 13

Abbildung 1.5 Schematische Darstellung der gerichteten Evolution von Enzymen

Durch diesen Ansatz knnen eine Vielzahl an Enzymeigenschaften wie Thermostabilitt,

pH-Stabilitt, Substratspezifitt oder Aktivitt in organischen Lsemitteln verbessert

werden.[64] Fr die pharmazeutische Industrie ist vor allem die Verbesserung der Enantio-

selektivitt von Enzymen in einer gegebenen Umsetzung von hohem Interesse. Durch

gerichtete Evolution kann ein Enzym mit niedriger Selektivitt in einer gegebenen Umsetzung

in wenigen Zyklen zu einem hochselektiven Enzym optimiert werden (siehe Abbildung 1.6).

Ein groer Vorteil dieser Methode ist, dass Kenntnisse ber die Struktur des Enzyms oder den

Reaktionsmechanismus hierbei nicht erforderlich sein mssen.

Einleitung 14

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6

Mutanten-Generation

ee / %

Wildtyp 1 2 3 4 5

Abbildung 1.6 Steigerung der Enantioselektivitt mittels gerichteter Evolution

Das erste Beispiel fr die Steigerung der Enantioselektivitt einer Lipase stammt von Reetz,

der den E-Wert der Pseudomonas aeruginosa Lipase A in e enantioselektiven

Esterhydrolyse deutlich steigern konnte. Neben der Steigerung des Wildtyp E-Wertes von

E = 1.1 auf E = 25 konnt

iner

e die natrliche Selektivitt bezglich des Modellsubstrats auch bis

auf einen Selektivittsfaktor von E = 51 umgekehrt werden.[76, 79, 80, 84] Wichtig bei der An-

andomisierung wendung von gerichteter Evolution ist die Wahl der Mutagenesemethode zur R

des Ausgangsgens, denn je nach Grad der Diversifizierung entstehen unterschiedlich groe

Bibliotheken, die den so genannten Sequenzraum bilden der unterschiedlich durchwandert

werden muss. Die Anzahl der mglichen Varianten N bei einem Enzym bestehend aus X

Aminosuren bei M randomisierten Positionen kann mit folgender Formel berechnet werden:

!)!(!19MMX

XMN

= (5)

M = Anzahl der ausgetauschten Aminosuren, X = Sequenzlnge, N = Bibliotheksgre

Werden in einem Mutageneseexperiment beispielsweise nur zwei Aminosuren zufllig

ausgetauscht, entsteht bei einer Sequenzlnge von 200 Am6

inosuren eine theoretische

Bibliotheksgre von ber 710 Enzymvarianten (siehe Tabelle 1.2).

Einleitung 15

Tabelle 1.2 Theoretische Bibliotheksgre bei M Aminosuresubstitutionen an einem Enzym der Sequenzlnge N

M N = 5 N = 200

1 95 3 800

2 14 440 7 183 900

68 590 9 008 610 600

4 651 605 8 429 907 368 950

5 2 476 099 6 278 520 528 393 960

6 3 876 986 426 283 270 000

7 2 042 510 281 040 010 000 000

3

Es ist einleuchtend, dass mit herkmmlichen Screening-Methoden derartige Bibliotheken

nicht mehr komplett durchmustert werden knnen, insbesondere wenn es darum geht,

Enantioselektivitt zu bestimmen. In jngster Zeit sind eine Reihe von sehr schnellen und

przisen Hochdurchsatz Screening-Verfahren entwickelt worden mit denen mehrere Tausend

Enantiomerenbestimmungen am Tag durchgefhrt werden knnen.[85-87] Doch auch diese

kommen schnell an ihre Grenze (siehe Tabelle 1.2), wenn es sich um sehr groe

Mutantenbnke handelt.

1.3.2 Selektionssystemen zur Analyse von Proteinfunktionen

Die Identifizierung interessanter Varianten in groen kombinatorischen Bibliotheken (oder

Genbanken) kann entweder, wie im vorherigen Kapitel dargestellt, durch die individuelle

Prfung aller Mitglieder erreicht werden (Screening) oder aber indem man Bedingungen

verwendet, unter denen nur die interessanten Varianten auftreten (Selektion). Generell

erfordern Screeningstrategien eine aktive Untersuchung aller in der Bibliothek vorhandenen

Varianten, wohingegen bei Selektionsstrategien ein Auswahlprozess nur die bevorzugten

Varianten begnstigt.[74, 88] Der wichtigste Vorteil der Selektion gegenber dem Screening ist

die Mglichkeit der simultanen Analyse von wesentlich mehr Bibliotheksmitgliedern. Dies

basiert auf der T ten. So knnen

Prinzipiell gibt es zwei Grundstrategien bei der Anwendung von Selektionsmethodiken. Die

eine Strategie wird als in vivo Selektion, die andere als in vitro Selektion bezeichnet.[74] Bei

atsache, dass uninteressante Varianten nie in Erscheinung tre

bis zu 1010 Klone in einem einzigen Selektionsexperiment beurteilt werden, wofr es selbst

mit den schnellsten Screening Assays Jahre brauchen wrde.[89]

Einleitung 16

der in vivo Stra gebunden, und

auf diese Weise erfolgt die pel erscheinende Selektion. Oft ist es

dings s geeigne

zu entwickeln. Insbesondere kann ein Selektionsschemata fr Enzyme, die in unnatrlichen

Umgebunge anischen L sein soll h

sein.[9 der angestrebten Reaktion an das berleben der Zellen im

Selektionsschritt bedarf unter U klun d

intellige nordnungen. Jedes Selektionssystem, besonders ein sehr kompli-

z tes, birgt ets die M bens er

gar unerwnschte Lsungen der g ensaufgabe auftauchen.[92, 93]

lic auch bei o Selektion in

vivo Selektion liegt darin, dass der evolutive Druck bei der in vitro Selektion nicht an das

berleben eines Organismuses gebun in muss. A

nicht zwang ollstndige, ganismen eingesetzt werden mssen, ist die

e n e geneti Methode die Kopplung von

Phnotyp (Protein) und Genotyp (DNA), denn nur solche t

w den, s rvielfltigen bzw. vervielfltigt werden. Einig er Literatur als

Selek te Met e zum B

T hnik, ei Teile vo

.4). Trotzdem folgen alle Anstze einer allgemeinen Strategie zur Analyse der Protein-

tegie ist die angestrebte Reaktion an das berleben der Zelle

auf den ersten Blick sim

te Selektionsstrategien faller chwierig, r beliebige katalytische Umsetzungen

n wie org semitteln aktiv en, schwierig oder sogar unmglic0, 91] Die Kopplung

mstnden der Entwic g von komplexen, nichttrivialen un

nten Versuchsa

dabei stier glichkeit, dass berle fhige, aber unvorhergesehene od

estellten berleb

der in vitrhn he Probleme knnen auftauchen. Der Unterschied zur

den se uch wenn bei der in vitro Selektion

slufig v

tielle Grundlage fr di

lebensfhige Or

sche Selektion auch bei dieser sse

Systeme knnen, wenn sie selektier

e in der ich selbst ve

tionssysteme diskutier

vereinigen dab

hodiken, wi

n Screening- und Teile von Selektionsassays (siehe Kapitel

eispiel die Zelloberflchen-Display-

ec

5

funktion, die in Schema 1.1 dargestellt ist.[88]

Schema 1.1 Allgemeine Strategie zur Analyse der Proteinfunktion in groem Mastab

erfolgreich angewendeten in vitro Selektionssysteme

aufgelistet, die bereits in mehreren bersichtsartikeln miteinander verglichen wurden.[74, 88]

In Tabelle 1.3 sind die bislang

Einleitung 17

Tabelle 1.3 Die Verknpfung von Genotyp und Phnotyp in verschiedenen Testsystemen

Nr. Methode Genotyp und Phnotyp

Testsystem (Selektion oder Screening)Verknpfung zwischen

1 Phagen-Display-

Technik Phagenpartikel Bindung an eine Affinittsmatrix

2 R

ik Ribosomenkomplex Bindung an eine Affinittsmatrix

3 Bindung an eine Affinittsmatrix

ibosomen-Display-

Techn

mRNA-Peptid-

Fusion Peptid-mRNA-Fusion

4 Peptid am Plasmid Peptid-Plasmid-

Komplex Bindung an eine Affinittsmatrix

5 Zelloberflchen-

Display-Technik Zelle Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung

6 In-vitro-

Kompartimentierung

Wasser-in-l-

Trpfchen PCR

7 Genetisches

Testsystem Zelle

Komplementation, kolorimetrische

Tests

8 Mikrotiterplatten und

Proteinchips

Rumliche

Adressierung

Radiometrisch, UV/Vis-Absorption

oder Fluoreszenztest

Auf das von Smith im Jahre 1985 entwickelte so genannte Phage Display, das ein leistungs-

fhiges Werkzeug auf dem Gebiet der in vitro Evolution darstellt, wird in Kapitel 5.1

gesondert eingegangen.[94-96] Ebenso auf das Zelloberflchendisplay im Kapitel 5.4.

Ein Nachteil aller Selektionsmethodiken als Werkzeug in der gerichteten Evolution ist, dass

u verbessernde System vorliegen mssen, im Gegensatz relativ viele Informationen ber das z

zu den meisten Screening Anstzen. Auch kann eine zu groe Hufung von falsch-positiven

Resultaten ein effizientes Screening ntig machen oder das System muss so umgestaltet

werden, dass der unerwnschte Hintergrund durch die Einfhrung eines weiteren Selektions-

schrittes eliminiert wird.

1.4 Nachhaltige Chemie

Wie in Kapitel 1.3 dargestellt, gibt es mehrere Strategien um die katalytischen Eigenschaften

von Enzymen zu verbessern. Eine Strategie kann unter anderem die Verwendung von

ionischen Lsemitteln sein (siehe Kapitel 3.1). Gegenber organischen Lsemitteln knnen

Einleitung 18

ionische Lsemittel daneben noch weitere Vorteile mit sich bringen, auf die im Folgenden

nher eingegangen wird.

Viele Umsetzungen in der Chemie werden in Lsung unter Einsatz eines Lsemittels durch-

gefhrt. Lsemittel werden dabei hauptschlich verwendet um:

n und Hot-Spots zu verhindern und

die Produkte leichter zu isolieren

Groe Mengen an Lsemittelabfllen fallen daher bei der Produktion von relativ geringen

Mengen an chemischen Erzeugnissen an, speziell auf dem Gebiet der Feinchemikalien-

produktion. semittel knn che Flssigkeiten, ber-[97]

Substanzen. Es ist viel mehr das Streben nach an chemischer Effizienz,

denn elegante Chemie bentigt nu indestma an Reagenzien, in einer hoch

selektiven Weise einzelne Produkte in quantitativen Ausbeuten herzustellen, und dies ohne

die Bildung von Nebenprodukten und die Notwendigkeit von Aufreinigungsschritten.[99, 100]

Somit kann man jeden, der sich esserung der Ef z von chemischen

Reaktionen oder Verfahren beschftig emiker bezeic n.[101-104]

1.4.1

man im Allgemeinen Flssigkeiten, die nur aus Ionen

bes e punkte unter 100 C liegen. Letztere Eigenschaft grenzt sie von

klassischen [105] bgrenzung ist mit der Tatsache

begrndet, dass unterhalb eines Schmelzpunktes 100 C eine sprunghafte Verbesserung in der [106]

ionische Flssigke

Entwicklung von ionischen Flssigkeiten [107] Die ersten

Publikationen in denen ionische Flssigkeiten als neuartige Lsemittel fr die Katalyse und

die Reaktionspartner in einer homogenen Phase miteinander in Kontakt zu bringen,

den Ablauf der Reaktion besser zu kontrollieren und dadurch hhere Selektivitten zu

erreichen,

die Reaktionstemperatur zu kontrolliere

Ersatzstoffe fr organische L en ionis

kritische Fluide, perfluorierte Lsemittel und Wasser sein. Ob ihre Verwendung eine

nachhaltigere Verfahrensfhrung ermglicht oder sogar durch Entsorgungsprobleme grere

Umweltschden entstehen, ist vom Einzelfall abhngig.[98] Als ein Teilgebiet ist diese

Problematik in den Grundstzen der Green Chemsitry angesiedelt. Nachhaltige Chemie

ist aber weitaus mehr als nur die Vermeidung von organischen Lsemitteln und giftigen

einem Hchstma

r ein M um

mit der Verb fizien

t, als grnen Ch hne

Ionische Flssigkeiten

Unter ionischen Flssigkeiten versteht

teh n und deren Schmelz

Salzschmelzen ab. Der Grund fr diese klare A

Anwendbarkeit als Ersatz fr organische Lsemittel vorliegt. Whrend man bei

Salzschmelzen an hochschmelzende, hochviskose und sehr korrosive Medien denkt, sind

iten bereits bei niedrigen Temperaturen Flssig und niedrig viskos. Die

reicht bis in das Jahr 1914 zurck.

Einleitung 19

organische Synthese eingesetzt wurden erschienen allerdings erst Ende der achziger Jahre.[108,

109] Seitdem hat die Anzahl nen, bei denen ionische Flssigkeiten verwendet

wurden, sprunghaft zugenommen (siehe Abbildung 1.7).[110]

an Publikatio

Abbildung 1.7 Anzahl an Publikationen, die den Begriff ionic liquid im Titel, Abstract oder in den Schlsselworten hatten[110]

Ionische Flssigkeiten werden in der Regel im ersten Schritt durch Quaternisierung eines

Amins oder eines Phosphans hergestellt. Zunchst wird dabei hauptschlich eines der in

Abbildung 1.8 dargestellten Kationen erzeugt.

N+

N R1R2

N+

R

R1

P+

R1

N+

R3R2

R3R2 R4R4

Imidazolium-Ion Pyridinium-Ion Ammonium Ion Phosphonium-Ion Kationen in ionischen Flssigkeiten

igenschaft des Kations und der Lage des Schmelzpunktes bestehen kann. Tabelle 1.4 Schmelzpunkt unterschiedlicher Chloride

Salz Schmelzpunkt

Abbildung 1.8 Wichtige Arten von

Sollte das gewnschte Anion der Ionischen Flssigkeit nicht bereits aus dem Alkylierungs-

reagenz resultieren, muss nach der Alkylierungsreaktion noch ein Anionenaustausch erfolgen.

Zentrales Kriterium bei der Beurteilung einer ionischen Flssigkeit ist wie bereits erwhnt der

Schmelzpunkt. Tabelle 1.4 zeigt eindrucksvoll welcher Zusammenhang zwischen Struktur

bzw. chemischer E

NaCl 803

KCl 772

R1 125 = R2 = Me NN R1 = Me; R2 = Et a 87

+ R1R2

Cl R1 = Me; R2 = n-Bu b 65 a [EMIM]: 1-Ethyl-3-methylimidazolium-Ion; b [BMIM]: 1-Butyl-3-methylimidazolium-Ion

Einleitung 20

Als Grnde fr niedrige Schmelzpunkte werden in der Literatur dabei folgende Kriterien als

besonders wichtig hervorgehoben:[106]

niedrige Symmetrie

geringe intermolekulare Wechselwirkung

gute Ladungsverteilung

Aber auch die Art des Anions hat Einfluss auf die Eigenschaften von ionischen Flssigkeiten,

wie man aus der Lage der Schmelzpunkte in Tabelle 1.5 entnehmen kann. Tabelle 1.5 Einfluss verschiedener Anionen auf den Schmelzpunkt von Imidazolimsalzen

Imidazoliumsalz Schmelzpunkt

[EMIM] Cl 87

[EMIM] NO3 38

[EMIM] AlCl4 7

[EMIM] BF4 6

[EMIM] (CF3SO2)2N a -3

[EMIM] CF3CO2 -14 a (CF3SO2)2N-: Bis-trifilic-amide (engl.) [BTA]

Ionische Flssigkeiten besitzen keinen messbaren Dampfruck und sind deshalb aus

verfahrenstechnischer Sicht von groem Interesse. Auf Grund dieser Tatsache knnen

Produkte destillativ aus der Reaktionslsung abgetrennt werden ohne dass Probleme der

Azeotropbildung von Produkt und Lsemittel auftreten. Auerdem bilden ionische Flssig-

keiten auf Grund dieser Tatsache keine explosionsfhigen Gas/Luftgemische, wie es die

meisten organischen Lsemittel tun und knnen deshalb als besonders sicher im Bezug auf

den Explosionsschutz eingestuft werden.

Bislang gibt es nur einen industriellen Prozess, in dem ionische Flssigkeiten eingesetzt

werden.[111] Allerdings wird die ionische Flssigkeit hier nicht als Lsemittel verwendet,[106,

112] sondern fllt als Nebenprodukt nach Protonierung einer Hilfsbase als flssige Salzfracht

an, die sich leichter durch flssig/flssig Extraktion abtrennen lsst als ein Feststoff durch

Filtration.

1.4.2 berkritisches Kohlendioxid

Als berkritische Fluide bezeichnet man Reinstoffe oder Gemische, deren Temperatur

oberhalb der kritischen Temperatur (Tc) und des kritischen Drucks (pc) liegen.[113]

Phasendiagramm eines reine bildung 1.9) wird hierdurch

Im

n Stoffes (pT-Diagramm, siehe Ab

Einleitung 21

eine einseitig rechtwinkelige Zustandsflche aufgespannt, deren Eckpunkt dem kritischen

Punkt entspricht.

zwei definiertePhasen

einePhase

undefinierterMeniskus

zwei definiertePhasen

einePhase

undefinierterMeniskus

Abbildung 1.9 Phasendiagramm (pT-Diagramm) des reinen Kohlendioxids mit entsprechenenden Photos des jeweiligen [114]

In der Abbildung 1.9 sind neben dem pT-Diagramm auch drei Photos eines mit CO2 befllten

Fenstera f dem ersten Photo, das bei einer Temperatur von 17 C

nschaften von Flssigkeiten, Gasen und berkritischen Fluiden zeigt, dass

berkritische Fluide hufig die Vorteile von Gasen und Flssigkeiten vereinen. Trotz Flssig-

Phasenzustandes

utoklaven dargestellt. Au

aufgenommen wurde, koexistieren eine Gas- und Flssigphase. Die flssige Phase besitzt eine

Dichte von ca. 0.80 g/ml, die Gasphase ca. 0.14 g/ml (Mittelwert = 0.47 g/ml ~ kritische

Dichte). Eine Erwrmung dieses Systems fhrt zu einer Stoffmengenzunahme der flssigen

Phase unter deren Dichteverringerung. Entgegengesetztes gilt fr die Gasphase. Durch die

Erwrmung steigt der Menniskus des Flssigkeitsspiegel an und wird immer weniger definiert

je nher man dem kritischen Punkt kommt. Gleichzeitig wird die Dichte der Gasphase weiter

erhht und die der Flssigkeit weiter abgesenkt. Bei dem Erreichen der kritischen Temperatur

(31.0 C) besitzen beide Phasen identische Dichten und gehen in eine homogene Phase - die

berkritische Phase - ber (gelb unterlegtes Gebiet im Phasendiagramm, Abbildung 1.9). Ein

Vergleich der Eige

Einleitung 22

keits-hnlichen Dichten, Wrmeleitfhigkeiten und spezifischen Wrmekapazitten besitzen

sie eine sehr geringe Oberflchenspannung, eine geringe dynamische Viskositt und hohe

Diffusionsraten. Ferner ist ihre unbegrenzte Mischbarkeit mit gasfrmigen Reaktanden zu

nthesechemie sind

insbesondere solche berkritischen Fluide als L sungsmittel von Bedeutung, deren kritische

Konst gute

nennen, die es erlaubt, deren Konzentrationen am Reaktionsort durch Homogenisierung

erheblich zu erhhen, wodurch potentiell Reaktionsgeschwindigkeiten gesteigert werden

knnen. Aus dem Blickwinkel der Prozess-Sicherheit ermglicht dies aber auch die effektive

Verdnnung brennbarer oder explosionsgefhrlicher Gase. In der Sy

anten in vergleichsweisen milden Regionen liegen (vgl. Abbildung 1.10), die

Lsungseigenschaften zeigen und sich unter Reaktionsbedingungen weder reaktiv noch korro-

siv verhalten.

0

50

100

150

200

250

bar

NH

H2O

-200 -100 0 100 200 300 400

T / C

p /

N2 Ar

O2 CH4 C2H4CHF3

CO2C2H6

SF6

C3H6C3H8

3

n-butann-pentan

Abbildung 1.10 Kritische Daten einiger Reinstoffe

Ferner sollten sie preiswert, gesundheitlich unbedenklich und gefahrlos in die Umwelt

emittierbar sein. Bei einer solchen vergleichenden Betrachtung verschiedener berkritischer

Fluide sticht insbesondere berkritisches CO2 (scCO2) als Reaktionsmedium heraus. Es erfllt

fr viele Applikationen alle genannten Voraussetzungen.[114, 115] Die fr die Mehrzahl der

organischen Lsemittel geltende schdliche Emissions- und Immissionswirkung trifft auf

berkritisches CO2 nicht zu, da es bei kontrolliertem Eintrag in die Umwelt weder hu-

mantoxikologische noch kotoxikologische Wirkung zeigt. Aus der Perspektive der Treib-

hausproblematik ist zu bemerken, dass durch die Verwendung von komprimiertem CO2 als

Reaktionsmedium der anthropogen erbrachte Eintrag in die Umwelt nicht erhht wird, da die

kostengnstig isolierbaren Kapazitten an CO2, die insbesondere bei der Wasserstoff- und

Ammoniaksynthese anfallen, bisher nur zu einem geringen Mae genutzt werden.

Einleitung 23

Die rckstandslose Verdampfbarkeit prdestiniert scCO2 darber hinaus fr die Herstellung

rungsmitteladditiven und mikroelektronischen Bauteilen.

alternativen

Flssigkeiten und

n ist die Verwendung Letzterer zur

Brennecke et al. im Fachjournal Nature ein Konzept vor, mit dem in ionischer

lssigkeit gelste Substanzen, ohne Verwendung von organischen Lsemitteln, effizient

xtrahiert werden knnen.[118]

ie Forscher konnten in der ionischen Flssigkeit [BMIM] [PF6] gelstes Naphthalin in

semittelfreier Form und ohne nachweisbare Kreuzkontamination nach Extraktion mit scCO2

erhalten (siehe Abbildung 1.11). Nach der Extraktion und Entspannen auf Normaldruck

konnte die ionische Flssigkeit in reiner Form wieder gewonnen werden.

von Kosmetika, Pharmaka, Nah

Darber hinaus existieren erste Textilreinigungsprozesse, die auf diesem

Reaktionsmedium basieren und somit den Einsatz perchlorierter organischer Lsungsmittel

umgehen.[97, 114, 116] Die Entkoffeinierung von grnen Kaffeebohnen (vor dem Rstprozess)

unter Verwendung von scCO2 wurde von Zosel bereits in den sechziger Jahren mittels

Destraktion (Kombination aus Destillation und Extraktion) am Max-Planck-Institut fr

Kohlenforschung entwickelt.[117] Nach diesem Verfahren werden heutzutage weltweit mit

etwa 100.000 Tonnen pro Jahr mehr als 50% des entkoffeinierten Kaffees hergestellt.

1.4.3 Besonderheiten des Zweiphasensystems ionische berkritisches CO2

Wie in Kapitel 1.4.1 erwhnt, knnen ionische Flssigkeiten als Ersatzstoffe fr flchtige

organische Lsemittel in vielen Reaktionen eingesetzt werden. Trotz allem ist es oft schwierig

die Produkte aus der ionischen Flssigkeit zu isolieren. Einige ionische Flssigkeiten sind

nicht wassermischbar, was eine Extraktion der Produkte mit Wasser erlaubt, gleichzeitig aber

die Substanzbreite auf polare und hydrolysestabile Verbindungen einschrnkt. Prinzipiell

knnen die Produkte auch aus der ionischen Phase durch Destillation entfernt werden, was

aber wegen Thermolabilitt teilweise nicht mglich ist. Extraktionen mit organischen

Lsemitteln fhren oft zu Kreuzkontaminationen. Danebe

Extraktion der Produkte kaum sinnvoll, da man die Vorteile der ionischen Flssigkeiten

dadurch nivelliert.

1999 stellten

F

e

D

l

Einleitung 24

Abbildung 1.11 Extraktion von reinem und in [BMIM] [PF6] gelstem Naphthalin mit scCO2 bei 40 C und 138 bar

Neben diesen Extraktionsergebnissen konnten auch andere interessante Eigenschaften dieses

Zweiphasensystems festgestellt werden. Die ionische Flssigkeit lste sich zwar nicht im

berkritischen CO2, allerdings lsen sich erhebliche Mengen CO2 in der ionischen Flssig-

keit. So wurde beobachtet, dass das Volumen einer ionischen Flssigkeit um bis zu 20 %

zunimmt, wenn sie einem CO2-Druck von 80 bar ausgesetzt wird.[118-120] Diese hohe

Lslichkeit von CO2 in ionischen Flssigkeiten fhrt zu einer erheblichen Viskosittsab-

senkung und somit zu besserer Diffusion, was letztlich gesteigerten Reaktionsraten zulsst.

Aufgabenstellung 25

2 Aufgabenstellung

Die Aufgabenstellung dieser Dissertation gliedert sich in drei Teile:

Thema des ersten Teils war die Untersuchung von Lipasereaktionen in ionischen Flssig-

keiten. Hauptschwerpunkt der Untersuchungen war dabei die Etablierung eines effizienten

Produktseparierungssystems. Die Produkte einer lipasekatalysierten Reaktion sollten nach der

Umsetzung in der ionischen Flssigkeit mittels berkritischem Kohlendioxids, unter

Vermeidung von organischen Lsemitteln, extrahieret werden. Des Weiteren sollte untersucht

werden, ob sich die Produkte einer lipasekatalysierten kinetischen Racematspaltung selektiv

aus der ionischen Flssigkeit extrahieren lassen. Ziel dieser Arbeiten sollte demnach sein eine

effiziente Methode zur Separierung von Enantiomeren zu etablieren.

Die Aufgabe des zweiten und dritten Teils dieser Dissertation war die Weiterfhrung der

Arbeiten von Rggeberg. Zum einen sollten weitere Phosphonsureester fr Co-Kristallisa-

tionsexperimente mit Lipasen synthetisiert werden (Ziel dieser Experimente war die Enantio-

selektivitt verschiedener Lipase Varianten zu erklren). Zum anderen sollte das Phage

Display-Projekt zur Selektion enantioselektiver Enzymmutanten fortgefhrt werden. Hierzu

sollten weitere Phosphonsureester als bergangszustandsanaloga chiraler Carbonsureester

synthetisiert und immobilisiert werden. Diese sollten im Rahmen des EU-Projekts Evocatal

Directed Evolution of Enantioselective Biocatalysts zur Verbesserung des katalytischen

Profils der Bacillus subtilis Lipase A eingesetzt werden.

Weiterhin sollte untersucht werden, ob sich neben dem Phage Display Ansatz andere

Selektionssysteme unter Umstnden besser eignen, um enantioselektive Enzymvarianten zu

selektieren.

Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 26

3 Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien

3.1 Biokatalyse in ionischen Flssigkeiten

Wie bereits in Kapitel 1.4.1 angedeutet stellen ionische Flssigkeiten eine interessante

Alternative zu konventionellen, organischen Lsemitteln dar. Sie knnen in einer Vielzahl

von Reaktion eingesetzt werden, zu denen auch enzymkatalysierte Reaktionen zhlen. Die

erste in der Literatur erwhnte Biotransformation in ionischen Flssigkeiten war die Synthese

von Z-Aspartam in [BMIM] [PF6], katalysiert vom Enzym Thermolysin.[121] Kurze Zeit spter

wurde die e ekataly ierte n in ionischen Flssigkeiten erwhnt.[122] Seitdem

Flssigkeiten erschienen, die bereits en Review-Artikeln zusammengefasst

rste lipas s Reaktio

sind in der Literatur eine groe Anzahl von Verffentlichungen ber Biokataylse in ionischen

in mehrer

wurden.[59, 61, 62] In Kapitel 1.4.1 sind einige Vorteile, die die Verwendung von ionischen

Flssigkeiten mit sich bringen, beschrieben, wie z.B. der vernachlssigbare Dampfdruck. Sie

weisen daneben bei der Verwendung in biokatalytischen Reaktionen einige bemerkenswerte

Eigenschaften auf. Ionische Flssigkeiten auf der Basis von alkyliertem Methylimidazol sind

polare Lsemittel und besitzen auf der Reichardts Polarittsskala Werte, die mit Methanol

und DMF vergleichbar sind (siehe Abbildung 3.1).[123] Obwohl polare organische Lsemittel

Enzyme deaktivieren, wobei als Ursache der Entzug von Wasser vom Enzym durch das

polare Lsemittel vermutet wird[124], tun dies ionische Flssigkeiten nicht, was die mgliche

Substratpalette deutlich vergrert.[60, 125]

Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 27

Abbildung 3.1 Umstze von Pseudomonas cepacia Lipase katalysierten Reaktionen in Abhngigkeit der Lsem

(ETN = Reichardts normalisierte Skala fr Lsemittelpolaritt; Wasser = 1, TMS = 0))[62]

In allen, bis zum Beginn dieser Dissertation, publizierten Verffentlichungen

katalyse in ionischen Flssigkeiten wurde von nachhaltiger Chemie gesproc

Reaktionen nicht in organischen Lsemitteln durchgefhrt wurden. In diesen P

wurde allerdings nicht erwhnt, dass diese zur Aufarbeitung verwendet wurden

einer Ausnahme wurden die Produkte destillativ separiert [126]). Die Verwe

organischen Lsemitteln zur Extraktion der Produkte ist kaum sinnvoll, da man d

in ionischen Flssigkeiten durchfhrt um gerade diese zu vermeiden. Man

festhalten, dass fast alle, bis zum Beginn dieser Dissertation, verffentlichten en

Reaktionen in ionischen Flssigkeiten nicht als nachhaltige Verfahren bezeic

knnen.

Wie in Kapitel 2 beschrieben sollte im Rahmen dieser Dissertation untersucht w

mglich wre, Lipasenreakt chzufhren, dab

ass Biokatalyse in berkritischem Kohlendioxid schon s

80er Jahre bekannt ist.[127, 128] In vielen Publikationen wurde dabei oft

Hauptproblem [129] um einen von der geringen Stabilitt von Enzym

und zum anderen von der beschrnkten Substratlslichkeit und damit eingeschr

an durchfhrbaren T

ionen in ionischen Flssigkeiten dur

Stabilitt von Lipasen in ionischen Flssigkeiten auszunutzen und die Pr

berkritischem Kohlendioxid in einem nachhaltigem Verfahren zu extrahiere

dieser Stelle angemerkt, d

en berichtet. Z

ransformationen. ittelpolarit

ber

hen, da

ublikatio

(lediglic

ndung

ie Reak

kann

zymatisc

hnet we

erden, o

ei die h

eit Mitte

von z

e in sc

nkten B

odukte

n. Es se

n

t

Bio-

die

nen

h in

von

tion

also

hen

rden

b es

ohe

der

wei

CO2

reite

mit

i an

Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 28

Um einen ersten Eindruck von der Praktikabilitt von ionischen Flssigkeiten als Lsemittel

fr lipasekatalysierte Umsetzungen zu erhalten, wurde zu Beginn eine Versuchsreihe von

kinetischen Racematspaltungen in verschiedenen ionischen Flssigkeiten und zum Vergleich

im Standardlsemittel Isooctan durchgefhrt. Dabei wurde der racemische Alkohol

2-Octanol mit Vinylacetat und Candida antarctica Lipase B als Katalysator in den ionischen

Flssigkeiten [BMIM] [BTA], [BMIM] [PF6], [BMIM] [BF4] und Isooctan analog Schema

3.14 acetyliert.

+ OO

OH

+ O

O

CaL BLM

- CH3CHO

OH

(rac)-3 4 (S 3 Schema 3.1 Kinetische Racematspaltung von (rac)-2-Octanol mit Vinylacetat als A g e B

als Katalysator

Tabelle 3.1 zeigt die Ergebnisse der Versuchsreihe. D Bi

Lsemitteln eine hohe und vergleichbare Aktivitt. Im Gegensatz die Ergebnisse

der chiralen Analysen relativ stark. Beim Vergleich der ionischen Flssigkeiten untereinander

fllt auf, dass das jeweilige Anion der ionischen Flssigkeit hohen Einfluss auf die Enantio-

diskriminierung hat. In [BMIM] [BTA] ist sie am besten und in [BMIM] [PF6] am

beeinflusst.

Erstaunlicherweise zeigt das eingesetzte Lyop at eine deutlich hhere Aktivitt als das

Sol-Gel-Immobilisat und das Novo SP 435, im Gegensatz zu organischen Lsemitteln, in

)- (R)-5 cylierun smittel und Candida antarctica Lipas

er okatalysator zeigt in allen

dazu streuen

schlechtesten, wenn man den Umsatz nach 18 Stunden und die Enantiomerenberschsse bei

ca. 50 % Umsatz vergleicht. Eine genaue Erklrung fr diesen Effekt kann zum jetzigen

Zeitpunkt noch nicht gegeben werden. Anschlieend wurde untersucht, ob die Trgerung des

Biokatalysators die Aktivitt und Enantioselektivitt fr diese Reaktion

hilis

denen Immobilisate hhere Aktivitt zeigen.[130]

Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 29

Tabelle 3.1 Ergebnisse der kinetischen Racematspaltung von 2-Octanol in verschiedenen Lsemitteln und CaL B-Katalysatoren

Umsatz [%] Eintrag

Nr. Lsemittel Biokatalysator

ee (3)a

[%]

ee (5)a

[%]

Aktivitt d

[molmin-1g-1] 15 min 18 h 68 h

1

b Isooctan CaL B Lyophilisat > 99.5 88.6 - 53.0 82.2 -

2b [BMIM][PF ] CaL B Lyophilisat 94.9 89.8 - 51.4 100 -

3

6

b [BMIM][BF ] CaL B Lyophilisat > 99.5 85.7 - 53.9 70.8 -

4

4

b [BMIM][BTA] CaL B Lyophilisat 99.2 98.7 - 50.1 65.2 -

5c [BMIM][BTA] CaL B Lyophilisat 98.4 97.8 5800 41.6 - 57.0

6c [BMIM][BTA] Novo SP 435 > 99.5 98.2 1190 11.8 - 50.4

7c [BMIM][BTA] Sol-Gel-Immobilisat > 99.5 96.6 1250 10.4 - 50.9 a gemessen bei ca. 50 % Umsatz; b Biokatalysator = 5 mg, c Biokatalysator = 2.5 mg, d bezogen auf eingesetzte

Menge Biokatalysator

Nach diesen Vorversuchen wurden die ersten Experimente zum eigentlichen Hauptthema

durchgefhrt, die Extraktion der Produkte mittels berkritischem Kohlendioxid. Die

Verwendung komprimierter Gase erfordert neben besonders gewissenhafter Planung und

Ausfhrung der Experimente natrlich spezielle Ausrstung, insbesondere Autoklaven-

technik. Als Standardreaktionsgefe kamen dabei 10-ml Fensterautoklaven aus Edelstahl

(V4A-Edelstahl) zum Einsatz (siehe Abbildung 3.2)

Sichtfenster

6 mm Verschraubung(Anschluss einer Kapillarezum CO Einlass mglich)2

1.6 mm Anschluss mit Ventil(Auslassffnung des

CO2-Gasstroms)

Manometer

1.6 mm Anschluss mit Ventil(Auslassffnung des

CO2-Gasstroms)

Manometer

6 mm Verschraubung(Anschluss einer Kapillarezum CO Einlass mglich)2

Sichtfenster

Abbildung 3.2 Fensterautoklav mit 10 ml Volumen

In einem solchen Autoklaven wurde zunchst 1-Octanol mit Vinylacetat in der ionischen

Flssigkeit [BMIM] [BTA] mit Candida antarctica Lipase B analog Schema 3.14 bei

Normaldruck verestert.

[BMIM][BTA], CaL B

-CH3CHOOH

+ O

O O

O

6 4 7 Schema 3.2 Acetylierung von 1-Octanol in [BMIM] [BTA] mit Vinylacetat als Acylierungsmittel und CaL B als Biokatalysator

Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 30

Die Reaktion verlief glatt ohne Bildung von Nebenprodukten. Das Produkt und Acetaldehyd

konnten lsemittelfrei ohne nachweisbare Kontamination mit ionischer Flssigkeit extrahiert

werden. Schema 3.3 zeigt dabei den verwendeten Aufbau fr die Extraktion der Produkte. Die

Isolierung erfolgte durch Ei p iertem CO2 mittels einer Kapillare in die

ionisch

Reaktor ber Kopf und wurde schlielich i beheizten Nadelventil auf Atmosphren-

nleiten von kom rim

e Phase. Das komprimierte CO2 verlie nach Passieren der ionischen Phase den

n einem

druck entspannt, woraufhin das Produkt aus dem Gasstrom ausfiel und in einer Khlfalle

aufgefangen wurde.

R C O 2

M IL/ E

P T

C P

K F

N V G

C O 2

M NV KF G

Magnetrhrplatte Nadelventil Khlfalle Gasuhr

CP PT R IL/E

Kompressor Druck- und Temperaturkontrolle Reaktor (Abbildung 3.2) ionische Flssigkeit und Enzyme

Schema 3.3 Schema des apparativen Aufbaus

Die hohe katalytische Aktivitt und quantitativer der Umsatz wurden ebenfalls in drei

weiteren Zyklen beobachtet, wobei die Ausbeute mit jedem Zyklus zunahm und schlielich

98 % betrug (siehe Abbildung 3.3). Dies stimmt mit den Beobachtungen von Brennecke, bei

der Extraktion von Naphthalin aus [BMIM] [PF6], berein (siehe Kapitel 1.4.3).

1 23

4

Ausbeute

Umsatz0

20

40

Zyklus Nr.

60

80

100

[%]

Ausbeute Umsatz Abbildung 3.3 Recyclisierung des in Schema 3.2 dargestellten IL/Enzymansatzes

Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 31

Ebenfalls vollstndiger Umsatz konnte beobac t werden, wenn unmittelbar nach der Sub-

heit von CO in der ionischen Flssigkeit keinen Einfluss auf die Reaktion hat.

hren von Zosel mittels

berkritischem CO2 im groen Mastab betrieben wird, dass Hochdruckextraktionen mit

scCO2 durchaus mglich und rentabel sein knnen.[113, 117] Um Reaktionen aber mglichst

wirtschaftlich in berkritischem CO2 durchzufhren, ist es wichtig hohe Raumzeitausbeuten

fr die verwendeten Reaktoren zu erreichen, da dann die Reaktorkosten vernachlssigbar

werden. Raumzeitausbeuten sind generell in kontinuierlich arbeitenden Reaktoren hher als in

vergleichbaren diskontinuierlichen Reaktoren.[131] Aufgrund der gefundenen hohen

katalytischen Aktivitt der Lipase bei der Acylierung von 1-Octanol in ionischer Flssigkeit

und der konstant hohen Aktivitt ber vier Reaktionszyklen wurde versucht diese Reaktion in

einem kontinuierlich arbeitenden Reaktor durchzufhren. Dabei wurde ein 10 ml Fenster-

autoklav als kontinuierlich betriebener Rhrkessel verwendet. Es wurde eine Substratlsung,

bestehend aus 1-Octanol und Vinylacetat (molares Verhltnis: 1 : 2), mittels einer HPLC-

Pum In

Abbildung 3.4 erkennt man, dass der Umsatz ber 24 Stunden konstant hoch ist. Die mittlere

hte

stratzugabe direkt CO2 aufgepresst wurde. Damit konnte gezeigt werden, dass die Anwesen-

2

Wie bereits erwhnt erfordern Reaktionen in berkritischem Kohlendioxid Hochdruck-

apparaturen. Es ist einleuchtend, dass die Kosten fr Hochdruckreaktoren deutlich hher sind

als fr Normal- bzw. Niederdruckreaktionsgefe. Andererseits verdeutlicht die Tatsache,

dass die Entkoffeinierung von Rohkaffee nach dem Verfa

pe in den scCO2-Strom eingebracht, die dann die ionische Phase im Reaktor passierte.

Aktivitt liegt dabei bei 2400 molmin-1g-1. Zum Vergleich wurde eine zweite Versuchs-

reihe ohne ionische Flssigkeit und ansonsten identischen Bedingungen durchgefhrt. Man

erkennt, dass der Umsatz ohne ionische Flssigkeit im Mittel um 10 % geringer ist.

Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 32

0

80

100

40Um

satz

[%] 60

20

0 5 10 15 20 25Zeit [h]

mit ionischer Flssigkeit ohne ionische Flssigkeit

Abbildung 3.4 Vergleich des Umsatzverhaltens fr die in Schema 3.2 dargestellten Reaktion in An- und Abwesenheit von ionischer

nd

amamoto fr diese simple direkte Kondensation im Science

Magazin verffentlicht, was fr die Aktualitt des Themas und die prparative Bedeutung fr

solche Reaktionen spricht.[132] Bei Verwendung solcher Substrate ist die richtige Wahl der

Reaktionsbedingungen im Zweiphasensystem ionische Flssigkeit/scCO2 entscheidend. Als

erste Reaktion dieses Typs wurde die in Sc a 3.4 dargestellte Veresterung von Isoamyl-

a r

Hauptbestandteil des Bananenaromas ist.

Flssigkeit im kontinuierlichem Betrieb

Neben aktivierten Vinylestern lassen sich aber auch direkte Kondensationen von Suren u

Alkoholen zum entsprechenden Ester durchfhren. Solche direkten Veresterungen sind

hinlnglich bekannt und scheinen auf den ersten Blick simple und standardisierte Reaktionen

darzustellen. Dennoch wurde erst krzlich ein neues Katalysatorsystem und ein spezieller

apparativer Aufbau von Y

hem

lkohol mit Hexansure zum entsprechenden Isoamylhexanoat untersucht, das de

OH + OH

O CaL B

O

O+ H2O

[BMIM][BTA]8 9 10 11

Schem lichen

g 3.5). Vergleicht man dazu die Ergebnisse, der ansonsten identisch durchgefhrten

a 3.4 Lipasekatalysierte direkte Kondensation von Hexansure und Isoamylalkohol in [BMIM] [BTA] im kontinuier

Betrieb

Bei der Wahl von Standardbedingungen, d.h. Durchfhrung der Reaktion bei niedriger

Temperatur (T = 45 C), kommt die Reaktion nach 24 Stunden nahezu zum Erliegen (siehe

Abbildun

Versuchsreihe bei 70 C, so sieht man, dass der Umsatz sogar ber einen Zeitraum von

75 Stunden konstant hoch ist. Der Grund fr das bessere Umsatzverhalten bei 70 C ist die

Tatsache, dass Wasser bei 70 C auf Grund eines hohen Dampfdruckes bei dieser Temperatur

Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 33

deutlicher besser lslich in scCO2 ist als bei 45 C. Auf dieses Phnomen wird detaillierter in

Kapitel 3.2 eingegangen.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Um

satz

[%]

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Zeit [h]

75 C 45 C

Abbildung 3.5 Einfluss der Temperatur bei der direkten Kondensation von Isoamylalkohol und Hexansure

Bei dieser Reaktion wurde der Alkohol zwecks Gleichgewichtsverschiebung im dreifachen

berschuss eingesetzt. Es sind aber auch Reaktionen bei 1 : 1 Stchiometrie mglich. Zum

Beispiel kann 1-Octanol mit Oktansure oder Ethanol und Hexansure in [EMIM][BTA] und

Candida antarctica Lipase B verestert werden. Zwar sind die Umstze auf Grund der

ungnstigeren Gleichgewichtslage nicht so hoch, dafr aber ebenfalls ber einen langen

Zeitraum konstant. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3.6 graphisch dargestellt.

0

10

20

30

40

0 0

Zeit [h]

50

Um

satz

[%]

60

70

80

90

100

10 2 30 40 50

1-Octanol nsur+ Okta e Ethanol u

ngzeitstabilitt von Candida antarctica Lipase B bei der direkten Kondensation von 1-Octanol mit Oktansure und

+ Hexans re

Abbildung 3.6 La

Ethanol mit Hexansure in der ionischen Flssigkeit [EMIM] [BTA]

Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 34

Fr die direkte Kondensation von 1-Octanol und Oktansure wurde noch eine weitere

Versuchsreihe angeschlossen. Dabei sollte untersucht werden, ob sich das Gleichgewicht

dieser Reaktion durch richtige Wahl der Extraktionsbedingungen verschieben lsst. Dazu

wurde der in Schema 3.5 dargestellte apparative Aufb u gewhlt. a

CO2

R1CO2

M

PT

CPPR

KF-1

GPT

EH

IL/E

R2

S/

HP

P

NV

tanoat und Wasser) im berkritischen CO2 gleich gut lsen sollten (vgl. Vorver-

such). Im Abscheider (R2) wurde mit 80 bar und 90 C eine deutlich niedrige CO2-Dichte bei

hoher Temperatur gewhlt. Bei diesen Bedingungen ist die Lslichkeit einer Verbindung stark

vom Dampfdruck abhngig und der Einfluss der Polaritt vernachlssigbar. Zu Beginn des

Versuches wurden im Abscheider 100 ml einer 1 : 1 Mischung der beiden Edukte vorgelegt.

Dieses Gemisch wurde mittels einer modifizierten HPLC-Pumpe in den vom Kompressor

ommenden CO2-Strom eingebracht. Nachdem der CO2-Strom den Reaktor R1 passiert hatte,

gelangte er nach Druckm 2

Schema 3.5 Apparativer Aufbau zur Verschiebung des Gleichgewichtes bei der direkten Kondensation non 1-Octanol und

Oktansure

Der Aufbau bestand prinzipiell aus zwei Einheiten. Einem Reaktor (R1) und einem Abschei-

der (R2), die ber einen Druckminderer (PR) miteinander verbunden sind. Im Reaktor R1,

einem 10 ml Autoklav mit Rhrkern, in dem sich 10 mg Candida antarctica Lipase B als

Lyophilisat in 2 ml der ionischen Flssigkeit [EMIM] [BTA] befanden, wurde mit 150 bar

und 60 C eine CO2-Dichte gewhlt, bei der sich die beiden Produkte der Reaktion

(1-Octylok

k

inderung in den Abscheider, indem sich sofort aus dem CO -Strom

eine Flssigkeit (S/P) abschied, die mittels der HPLC-Pumpe recyclisiert wurde. Der CO2-

Strom hingegen, in dem sich keine organische Komponente dafr aber Wasser lsen sollte,

wurde mittels eines Nadelventils auf Atmosphrendruck entspannt. Abbildung 3.7 zeigt das

Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 35

Umsatzverhalten der Reaktion bei Verwendung der Apparatur (Probennahme am Boden des

Abscheiders nach definierten Zeiten).

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200

Zeit [h]

Um

satz

[%]

direkte Kondensation von 1-Octanol und Oktansure

Abbildung 3.7 Umsatzverhalten der direkten Kondensation von 1-Octanol und Oktansure bei Verwendung der in Schema 3.5

dargestellten Apparatur

Man erkennt, dass sich der Umsatz, gegenber dem in Abbildung 3.6 dargestellten Ergebnis,

deutlich steigern lsst. Allerdings konnte bei diesem Versuch nicht gezeigt werden, dass sich

auf diese Weise das Gleichgewicht verschieben lsst, denn es wurde neben dem Wasser auch

der Alkohol in deutlichen Mengen extrahiert. Nach Abbruch der Versuchsreihe war das

stchiometrische Verhltnis des Restgehaltes von Alkohol zu Sure im Abscheider daher

nicht mehr 1 : 1 sondern 1 : 2.5.

3.2 Kinetische Racematspaltung in ionischer Flssigkeit/scCO2

Neben achiralen Veresterungen lieen sich auch kinetische Racematspaltungen lipase-

katalysiert in ionischer Flssigkeit/scCO2 durchfhren. Zunchst wurde die in Schema 3.6

dargestellte Acetylierung von 1-Phenylethanol mit Candida antarctica Lipase B als

Biokatalysator untersucht.

OH

+ OO

[BMIM] [BTA], CaL B

- CH3CHOO

O

+ OH

(rac)-12 4 (R)-13 (S)-12 Schema 3.6 Kinetische Racematspaltung von (rac)-1-Phenylethanol mit Vinylacetat als Acylierungsmittel und Candida antarctica

Lipase B als Katalysator im ionischen Lsemittel [BMIM] [BTA]

Die Lipase zeigt im ionischen Lsemittel ber vier Reaktionszyklen eine hohe Enantio-

selektivitt, Aktivitt und Stabilitt (siehe Abbildung 3.8).

Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 36

1 2 34

(S)

(R)- cetat

-1-Phenylethanol

1-Phenylethyla0102030405060

8090

ee [%]

Zyklus Nr.

Abbildung 3.8 Ergebnisse der in Schema 3.6 dargestellten kinetischen Racematspaltung von (rac)-1-Phenylethanol

Die Produkte konnten nach beendeter Reaktion mit scCO2 aus der ionischen Flssigkeit

extrahiert werden und fielen i ie r i sig im li-

sierte Lipase konnte ohne Verlust an Aktivitt oder Abfall der Enantioselektivitt recyclisiert

erden.

biokatalytischen

Reaktion eine Komponente selektiv aus der io schen Flssigkeit extrahiert werden knnte.

Um d hrt,

anschlieend wurde aber nicht wie zuvor bei hoher Dichte extrahiert, sondern die CO -Dichte

100

70

lsemittelfre an. D in de onischen Fls keit mobi

w

Allerdings hat man bei kinetischen Racematspaltungen nach durchgefhrter Reaktion erst ein

Teil der notwendigen Arbeit zur Enantiomerentrennung durchgefhrt, denn Edukt und

Produkt mssen anschlieend voneinander separiert werden. Im oben geschilderten Fall

wrde eine ideale Prozessfhrung vorliegen, wenn nach der durchgefhrten

ni

ies zu untersuchen, wurde die in Schema 3.6 dargestellte Reaktion erneut durchgef

2

variiert. Die Variation der CO2-Dichte kann, wie in Kapitel 1.4.2 bereits gesagt, prinzipiell

auf zwei verschiedene Weisen erfolgen. Zum einen kann die Dichte durch Erhhen der

Temperatur oder durch Herabsetzten des Druckes gesenkt werden. In Abbildung 3.9 ist der

Zusammenhang zwischen Druck, Temperatur und CO -Dichte dargestellt.2

Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 37

-13 C

107 C87 C67 C47 C27 C

7 C

A

B

p / bar

C

A nl (CO2) = B ng (CO2)

/ g

ml-1

17

27 37Tc47 57 67 77

17

27C

O2 (

l + g

)

CO

2 (l) CO2 (SCF)

(CO2, SCF) = 0.70 g / ml:

Abbildung 3.9 Die Dichte von reinem CO2 als Funktion des Drucks und der Temperatur[133]

Die Extraktion wurde bei einer Temperatur von 60 C durchgefhrt und der CO2-Druck

schrittweise erhht. Tabelle 3.2 zeigt die Ergebnisse dieser selektiven Extraktion die durch

Verwendung unterschiedlicher CO2-Dichten erzielt werden kann. Tabelle 3.2 Extraktion der Produkte der in Schema 3.6 dargestellten Reaktion bei 60 C und unterschiedlichen CO2-Drcken

Khlfalle Zeit Druck Auswaage Selektivitt ee (R)-13 ee (S)-12

Nr. [h] [bar] [g] [%] [%] [%]

1 2 70 0.06 58.8 (13) 99.3 98.9

2 4 90 0.29 56.7 (13) 99.2 99.3

3 7.3 150 0.06 72.5 (12) > 99.5 > 99.5

Zunchst wurde das Acetat auf Grund der geringeren Polaritt und der guten Lslichkeit von

Acetaten in scCO2 im Extrakt angereichert. Im spteren Verlauf der Extraktion erhlt man

schlielich den Alkohol.[134, 135] Diese Abhngigkeit der Lslichkeit von der Polaritt ist

hinlnglich bekannt und konnte bereits zuvor fr eine Reihe von verschieden polaren

Substanzen demonstriert werden (siehe Abbildung 3.10).

Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 38

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

0,1

1E-4

1E-3

0,01x

i gel

ste

Sub

stan

z

p / bar

15SH

15

15OH

15OH

O

H

Abbildung 3.10 Lslichkeit verschiedener funktioneller Gruppen berkritischem CO bei 47 C als Funktion des Drucks[136]

Allerdings von 59 %

tweder bedeutend besser oder schlechter CO2-lslich wrde als der

kor

Die re Polaritt, den Dampfdruck,

Coh bestimmt.[113] Bei

am beeinflusst

ampfdruck ber den Einfluss

ag

in 2

sind die in Tabelle 3.2 dargestellten Ergebnisse mit einer Selektivitt

eher mig. hnlich schlechte Ergebnisse wurden bei Verwendung von 1-(2-Naphthyl)

ethanol statt des 1-Phenylethanols erzielt. Auf Grund dieser schlechten Selektivitten bei der

Extraktion des Alkohols wurde eine neue Strategie entwickelt, um prparativ sinnvolle

Separierungsselektivitten bei gleichzeitig hohen Enantiomerenberschssen zu erhalten.

Eine nahe liegende Taktik war den zu bildenden Ester durch molecular engineering so zu

whlen, dass er en

respondierende Alkohol.

Lslichkeit einer Substanz in CO2 wird besonders durch ih

esive Energie und die Anwesenheit von speziellen CO2-philer Gruppen

der Variation der Extraktionseigenschaften des Esters wurde sich fr die nderung des

D pfdruckes entschieden, da dieser direkt durch die Kettenlnge des Acylrestes

wird. Wenn die Acylkette lang genug ist, sollte der niedrige D

der Polaritt berwiegen und der Ester sollte CO2 unlslicher werden. Erfreulicherweise l

mit Laurinsurevinylester, das als Copolymer fr die Olefinpolimerisation als Bulkchemikalie

hergestellt wird, ein gnstiges Acylierungsmittel mit langer Acylkette vor. Die diesem

Konzept einer Inversselektive Extraktion zu Grunde liegende Reaktion wrde also wie folgt

aussehen:

Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 39

R1 R2

OH

H(CH2)11

O

OR1 R2

OH

R1 R2

O

O

++

ionische FlssigkeitLipase

selektive Extraktion mit scCO2

-CH3CHO

Schema 3.7 Lipase