Oberflächenmodifikation von Polyelektrolytmikrocontainern ... · Oberflächenmodifikation von Polyelektrolytmikrocontainern (PEMC) auf biologischen Templaten Charité University

Oberflächenmodifikation von Polyelektrolytmikrocontainern (PEMC)

auf biologischen Templaten

CharitéUniversity Medicine of Berlin

Hans Bäumler, M. Brähler, M. Fischer, E. Gabers, A. Krabi, R. Mitlöhner, P. Rösch, C. Watermann

Charité – Universitätsmedizin Berlin, Humboldt Universität zu Berlin und Freie Universität Berlin,

D-10098 Berlin

[email protected]

Frankfurt M. 2005


EinleitungDiagnostik und Therapie zahlreicher Erkrankungen sindheute meist noch in 2 verschiedenen Welten angesiedelt– Diagnostik bis zur molekularen Ebene:

» Molekularpathologie, » Genanalysen, » Immundiagnostik, » Positron Emmissionstomografie (PET), » Kernspinresonanz Tomografie (MRT)» Durchflusszytometrie


Diagnostik und Therapie zahlreicher Erkrankungen sindheute meist noch in 2 verschiedenen Welten angesiedelt

– Therapie meist systemisch» Medikamente mit (kalkulierbaren)

Nebenwirkungen» Chemo- und Strahlentherapie» Tumorchirurgie» Organtransplantation


Vision für eine Therapie auf molekularer Ebene

Tumortherapie durch Nanoteilchen, die den Tumor finden und ohne andere Nebenwirkungen nur die Tumorzellen zerstören bzw. das außer Kontrollegeratene Wachsen der Zellen verhindern


Problem

• Wie finden die Nanoteilchen den Zielort?• Wie wird die für die therapeutische Wirkung

erforderliche Konzentration an Molekülen erreicht?• Wie werden unerwünschte Nebenwirkungen

vermieden (Anreicherung in Leber, Gehirn, RES)?


Wie finden die Nanoteilchen das Zielobjekt?

• Lokalisation des Zielobjektes durch einOrtungssystem, das auf chemische bzw. immunologische Signale anspricht

– z.B. tumorspezifische Antikörper


Wie wird die für die therapeutische Wirkungerforderliche Konzentration an Molekülen am Zielort erreicht?

Antigen-Antikörper-Reaktion (Andocken derNanopartikel) plus multiple Bindung therapeutischwirksamer Moleküle


Wie werden unerwünschte Nebenwirkungenvermieden wie z.B. Anreicherung derNanopartikel in Leber, Gehirn, RES oder toxischeWirkung der modifizierten Nanopartikelaußerhalb des Ziels?

• Aktvierung erst am Zielort• Verwendung biokompatibler Partikel• Nutzung der Blut-Hirn-Schranke• Induktion der Phagozytose• Abbau der Nanopartikel am Zielort


Lösung☺Satelliten-Navigationssystem zur Lenkung von U-Booten mit zielsuchenden Torpedos• Satelliten-Navigationssystem:

» MRT, PET, CT• U-Boot:

» Mikrokapseln mit Sensoren» Mikrokapseln definierter Lebensdauer

• Torpedos: » Nanopartikel mit Antikörpern» Nanopartikel mit/als Zytostatika» Nanopartikel als Target für Mikrowellen


Mikrokapseln in der Größenordnung von 100 nm bis < 8µm

Liposomen– Bekanntes Beispiel für kugelförmige, geschlossene,

dünne Filme – Begrenzte Stabilität – Niedrige Permeabilität für polare Moleküle– Polydispers– Nicht deformierbar


Layer by Layer Adsorption • auf Oberflächen: Decher 1997 • auf synthetischen Partikeln: MPI Colloids

and Surfaces Golm - Möhwald et al. 1998 • auf biologischen Templaten: Charité Berlin

– Bäumler et al. 1999

Polyelektrolytmikrokapseln (PEMC)


Herstellung der PEMC unter Verwendung biologischer Template

Templat: Hefezellen

CLSM-Bild Durchlicht-Bild


Herstellung der PEMC unter Verwendung biologischer TemplateTemplat: E. Coli Bacterium

Atomkraftmikroskopie-Bild


Herstellung der PEMC unter Verwendung biologischer Template

Templat: Rote Blutzelle

ElektronenmikroskopischeAufnahme

LbL adsorptionPreparation of PEMC


RBC template

NaOClnegatively charged polymer

positively charged polymer

Digestion of the corePEMC


PEMC – Template RBCCLSM-Aufnahmen

Discocyte Echinocyte

Oberflächeneigenschaften der PEMC biologischer Template


• Elektrische und dielektrische Eigenschaften– Partikelelektrophorese– Partikel-Elektrorotation

• Mechanische Eigenschaften– Mikropipette (Biege-, Schermodul)– Atomkraftmikroskopie (Wandstärken, Rauhigkeit)– Konfokale Laserscanningmikroskopie (Permeabilität)

• Biochemische und immunologische Eigenschaften– Enzymaktivitäten– Antigen-Antikörper-Bindung– In vitro Phagozytose

• Einbau von Nanopartikeln• Tierexperimente



• Elektrische und dielektrische Eigenschaften– Partikelelektrophorese


10-8 m2s -1V-1

-3,0

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

RBC RBC Dx PEMC Dx RBC PSS PEMC PSS

Elec

troph

oret

ic m

obili

ty

RBC: Rote BlutzelleRBC Dx : RBC mit DxSO4/PAH beschichtetRBC PSS: RBC mit PSS/PAH beschichtet

PEMC Dx bzw. PSS:DxSO4 /PAH bzw. PSS/PAH-PEMC

• Elektrische und dielektrische Eigenschaften– Partikelelektrophorese


Die Oberflächenladung der PEMC ist stets negativ!Oberflächeneigenschaften der PEMC biologischer Template


10-8 m2s -1V-1

-3,0

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

RBC RBC Dx PEMC Dx RBC PSS PEMC PSS

Elec

troph

oret

ic m

obili

ty

RBC: Rote BlutzelleRBC Dx : RBC mit DxSO4/PAH beschichtetRBC PSS: RBC mit PSS/PAH beschichtet

PEMC Dx bzw. PSS:DxSO4 /PAH bzw. PSS/PAH-PEMC



• Elektrische und dielektrische Eigenschaften• Mechanische Eigenschaften

– Mikropipette (Biege-, Schermodul)– Atomkraftmikroskopie (Wandstärken, Rauhigkeit)– Konfokale Laserscanningmikroskopie (Permeabilität)


Deformability of PSS/PAH PEMC -

RBC template

Buckling pressureMicropipette inner diameter 4.5 µm

Oberflächeneigenschaften der PEMC von biologischen Templaten

Mechanische EigenschaftenType of particle Bending modulus

[Nm] RBC 1.8 x 10-19

[(HSA/PSS)/PAH]2/(HSA/PSS) 3.5 x 10-19

(PSS/PAH)2/PSS 1.8 x 10-18

Biegemodul der PEMC in der Größenordnung vom RBC Biegemodul – hohe Deformierbarkeit



0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 1 2 3 4 5 6 7

Number of additional layers

Pres

sure

[mm

H2O

]Adsorption von PSS/PAH auf PEMC

Zunahme des Buckling Druckes

Abnahme derDeformierbarkeit

Dominanz derPlastizität

Weiterbeschich-tung der PEMC mit Polyelektrolyten:

(PSS/PAH)2PSS (DxSO4/PAH)2 DxSO4

Wall thickness of PEMC


nm nm

µm µm

Biomacromolecules 2002


0

5

10

15

20

25

30

35

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19

Number of layers

Wal

l thi

ckne

ss [n

m]

PSS/PAH PEMC DXSO4/PAH PEMC (PSS+HSA)/PAH PEMC

Wall thickness of PEMC prepared

with different polyelectrolytes in dependence on the

number of adsorbed layers

Polyelectrolyte microcapsules (PSS/PAH) in H2O

1mg/ml FITC - labelled albumin Mw = 65 kDa (negatively charged) Charité

University Medicine of Berlin

1mg/ml FITC - labelled dextran Mw = 70 kDa (neutral)

Permeation of salt solutions into dextran PEMC

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40Time [min]

rela

tive

part

icle

num

ber [

%]

0 mM 0.5 mM 1.54 mM

Nicht abgeschirmte Ladungen der PEMC verhindern die schnelle Permeation von Ionen




• Elektrische und dielektrische Eigenschaften• Mechanische Eigenschaften• Biochemische und immunologische

Eigenschaften– Enzymaktivitäten– Antigen-Antikörper-Bindung– In vitro Phagozytose

Einbau von Enzymen in die PEMC-Wand Enzymzuwachs mit jeder Schicht y = 0,23x - 0,23

Trypsinaktivitätin der PEMC Wand: 30 % der Aktivität des freien Trypsins

Substrat erreicht auch die tiefer liegenden Schichten

y = 0,2287x - 0,2348R2 = 0,9625

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Zahl der Trypsinschicht

Konz

entra

tion

µg/K

apse

l

0

10

20

30

40

50

Aktiv

ität/T

ryps

inko

nz. %

Konzentration µg/Kapsel Aktivität/Trypsinkonz. %Linear (Konzentration µg/Kapsel)


PEMC

PEMC mit und ohne Oberflächenmodifikation durch Antigene


Phagocytosis of PEMC

0

20

40

60

80

100

Monocytes Granulocytes

Phagozytose der PEMC hauptsächlich durch Monozyten

PEG-Beschichtung reduziert Phagozytoseauf < 5 %

CharitéUniversity Medicine of Berlin(DxSO4/DEAEDx-PAH)2DxSO4 + mPEG

E. coli(DxSO4/DEAEDx-PAH)2DxSO4




Eigenschaften• Einbau von Nanopartikeln


Electron microgram of PSS/PAH-microcapsules (PEMC) with nanomagnets

5 µm

J. of Magnetism and Magnetic Materials (2001)




Eigenschaften• Einbau von Nanopartikeln• Tierexperimente

DurchflusszytometrieBlutentnahme nach PEMC Injektion


• Blutprobe 3 min nach Injektion der mPEG PEMC (FITC markiert)

• 0,3 % PEMC im Blut (FACS-Messung)

Milz Leber2. häufig

Lunge3. häufigHäufigster Fundort von PEMC


Gehirn Lymphknoten caudaleGekrösewurzel

Herz Niere

Phagozytierte PEMC Vereinzelte PEMC Seltener FundortCharité

University Medicine of Berlin



Tierexperimente• PEMC nehmen an der Zirkulation teil• Nachweis der PEMC in allen Organen• Keine Anhäufung in der Milz• Verlängerung der Verweildauer durch

weitere Oberflächenmodifikation


Zusammenfassung• stabil gegenüber physikalischen und chemischen

Einflüssen• permeabel für polare Moleküle und

Makromoleküle• monodispers • beliebige Form im Größenbereich von 100 nm –

10 µm• Wandstärke und Deformierbarkeit einstellbar • Oberfläche beliebig modifizierbar


Dank

• Allen Mitarbeitern des Instituts• MPI Colloids and Surfaces Potsdam-Golm• Björn Neu – USC, L.A. California• Tom Kareco, University of British Columbia• BM für Bildung und Forschung

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