J. Rüschoff und W. Böcker

G. Klöppel, M. Dietel (Hrsg.), Pathologie – Mamma, Weibliches Genitale, Schwangerschaft und KindererkrankungenDOI 10.1007/978–3–642–04564–6_9, © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2013

Inhalt

Östrogen- und Progesteronrezeptoren . . . . . . . . . . . . . . . . 168

Molekulare Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168

ER- und PR-Immunhistochemie und Auswertung . . . 168

Klinisch-pathologische Korrelationen . . . . . . . . . . . . . . 170

Qualitätssicherung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170

Her2/neu-Rezeptoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171

Molekulare Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171

Klinische und therapeutische Bedeutung . . . . . . . . . . . 172

Praxis der Her2-Bestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172

Nachweis der Her2-Rezeptorüberexpression mittels Immunhistochemie (IHC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172

Nachweis der Her2-Genamplifikation mittels In-situ-Hybridisierung (ISH) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174

Qualitätssicherung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176

Plausibilitätsprüfung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178

Neue Entwicklungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178

Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179

9Kapitel 9

Östrogen- und Progesteronrezeptoren sowie Her2

Östrogen- und Progesteronrezeptoren

Der Östrogen(E)- und Progesteron(P)-Rezeptor(R)-Status zählt zu den wichtigen prognostischen Parame-tern des Mammakarzinoms und, noch wichtiger, stellt im Hinblick auf die heutigen Therapiemöglichkeiten mit Tamoxifen und Aromatase-Inhibitoren den ent-scheidenden prädiktiven Faktor für die Planung der en-dokrinen Therapie dar [26, 32, 46, 47, 58, 59] . Bei jedem invasiven Mammakarzinom ist daher vor der Therapie die Bestimmung des ER- und PR-Status notwendig [12] .

Molekulare Grundlagen

Derzeit unterscheidet man ER-alpha und ER-beta, die im Zellkern zusammen mit ihren Liganden und einer Reihe weiterer Koregulatorproteinen ein aktives homo- oder heterodimeres Signaltransduktionsmolekül bilden . Multiple Gene wie z . B . pS2, BCL2 und auch das PR-Gen werden über den ER reguliert, der damit Einfluss auf Wachstum und Differenzierung des normalen Mamma-epithels, der Tumorgenese sowie dem Überleben und Wachstum von Tumorzellen nimmt .

ER- und PR-Immunhistochemie und Auswertung

Seit den 70er Jahren hat sich die immunhistochemische Methode der Rezeptoranalyse durchgesetzt [1, 49, 59] . Der immunhistochemische Nachweis (ER-/PR-ICA („estrogen-/progesteron-receptor-immuno cytochemi-cal assay“) wird heute mittels monoklonaler oder po-lyklonaler Antikörper am Paraffinschnitt durchgeführt (Abb .  9 .1–9 .3) . Positiv reagierende Zellen zeigen eine nukleäre Reaktion . In aller Regel werden für den ER fol-gende drei Antikörper eingesetzt: 6F11, SP1 und 1D5 .

Die Auswertung erfolgt semiquantitativ unter Ein-beziehung der nukleären Färbeintensität und des Pro-zentsatzes positiver Tumorzellen (Tab .  9 .1, 9 .2) . Das Zytoplasma der Tumorzellen zeigt gewöhnlich keine Reaktion . Beim Remmele-Score, der in Deutschland meistens verwendet wird, ergibt das Produkt aus die-sen beiden Faktoren den immunhistochemischen Score

Abb.  9.1 ER-Immunhistochemie mit starker nukleärer Reaktion in >90 % der Tumorzellen, entsprechend einem Remmele-Score 12 und einem Harvey-Score 8 . Der überwiegende Teil der Mammakar-zinome zeigt diesen Befund

Abb.  9.2 ER-Immunhistochemie eines invasiven duktalen Karzi-noms Grad 1 . Etwa 1 % der Tumorzellen zeigt eine starke nukleäre Reaktion . Diese wird nach dem Remmele-Score mit 3 Punkten be-wertet, nach dem Harvey-Score mit 4 Punkten . Die Reaktion ist so-mit als positiv einzuordnen

Abb.  9.3 ER-Immunhistochemie eines invasiven duktalen Karzi-noms Grad 2 . Etwa 15 % der Tumorzellen zeigen eine schwache bis mäßige nukleäre Reaktion . Diese wird nach dem Remmele-Score mit 2 oder 4 Punkten bewertet, nach dem Harvey-Score mit 4 Punk-ten . Die Reaktion wird als positiv eingeordnet

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(IRS), der sich zwischen 0 und 12 bewegt (Tab . 9 .1) . Ein Score von 0–2 grenzt die rezeptornegativen von den re-zeptorpositiven Karzinomen ab [46, 49, 59] . Nach Har-vey und Mitarbeitern ergibt sich der Gesamtscore aus der Summe der Einzelscores, wobei die Färbeintensität mit 0–3 Punkten, der Anteil positiver Tumorzellen mit 0–5 Punkten bewertet wird (Tabelle 9 .2) . Gesamtscores ab 3 Punkten werden als positiv gewertet . Nur 10 % der Fälle zeigen eine ER-Expression in 1–10 % der Tumor-zellen . Die Autoren konnten in großen Studien nachwei-sen, dass der positive ER-Status (>3 Punkte) ein schwa-cher prognostischer, aber ein guter prädiktiver Faktor ist . In der ER-positiven Gruppe konnte das erkran-kungsfreie 5-Jahres-Überleben durch endokrine The-rapie um 30 % verbessert werden . Die European Breast Screening Pathology Working Group (EBSPWG) [37], die American Society of Clinical Oncologists (ASCO) und das College of Americal Pathologists (CAP) [19] sowie andere Autoren [2] interpretieren Karzinome mit 1 % positiven Tumorzellkernen als positiv . Dieser An-satz wird begründet durch die Untersuchung von Har-

vey et  al . [21], die selbst bei 1 % schwach angefärbter Tumorzellen einen Benefit der endokrinen Therapie feststellen konnten, sowie durch die Empfehlungen der NIH-Konsensus Konferenz (2001) [11] . Schnitt und Collins [56] beurteilen den Rezeptorstatus als positiv, wenn >10 % der Tumorzellen reagieren, als schwach positiv bei 1–10 % positiver Zellen und schließlich als negativ bei fehlender Kernfärbung .

Tumoren können ER und PR koexprimieren oder sie exprimieren nur einen der beiden Rezeptoren . Studien deuten darauf hin, dass der Nachweis des PR an einen intakten ER-regulierten Pathway geknüpft ist . Hier-für spricht die Tatsache, dass Patientinnen mit fortge-schrittenen Karzinomleiden mit positivem ER und PR ein besseres Ansprechen auf eine endokrine Therapie zeigten als Patientinnen mit ausschließlich positivem ER [1] . Selbst ER-negative/PR-positive Karzinome zei-gen eine höhere Ansprechrate als der doppelnegative Phänotyp, was auf einen intakten Signaltransduktions-weg hindeutet [15, 61] . Allerdings ist darauf hinzuwei-sen, dass der PR schwieriger zu bewerten ist als der ER

Tabelle 9.1 Rezeptorimmunhistochemie und Scoring nach Remmele und Stegner [49]

Färbeintensität Anteil der positiven Kernfärbungen

0 = keine Färbung 0 = keine positiven Kerne

1 = schwache Färbung 1 = 1–9 %

2 = mäßige Färbung 2 = 10–50 %

3 = starke Färbung 3 = 50–80 %

4 = >80 %

Der Gesamtscore ergibt sich aus dem Produkt von Intensitätsscore und Anteilscore . Der maximale Score ist somit 12 . Ein Score von 0 ist als negativ, 1–3 als schwach positiv, 4–6 als mäßig positiv und 8–12 als stark positiv zu werten .

Tabelle 9.2 Rezeptorimmunhistochemie und Scoring nach Harvey [2, 21]

Färbeintensität Anteil positive Tumorkerne

0 = keine Färbung 0 = keine Färbung

1 = schwache Färbung 1 = <1 % Kernfärbung

2 = mäßige Färbung 2 = 1–10 % Kernfärbung

3 = starke Färbung 3 = 11–33 % Kernfärbung

4 = 34–66 % Kernfärbung

5 = 67–100 %

Der Gesamtscore ergibt sich aus der Summe der Einzelscores mit einem Maximum von 8 . Bei heterogener Färbeintensität wird die mittlere geschätzte Färbeintensität genommen . Gesamtscores von 0–2 sind als negativ, 3–4 als schwach positiv, 5–6 als mäßig positiv und 7–8 als stark positiv zu bewerten .

Östrogen- und Progesteronrezeptoren sowie Her2 Kapitel 9 169

und die Befundkonstellation ER–/PR+ selten ist . In den aktuellen ASCO/CAP-Empfehlungen wird deshalb bei ER–/PR+ eine Testwiederholung empfohlen, um eine falsch-negative ER- und falsch-positive PR-Befundung auszuschließen [19] .

Klinisch-pathologische Korrelationen

Zwischen klinisch-pathologischen Parametern und dem Rezeptorstatus bestehen bestimmte Korrelationen . So sind Karzinome postmenopausaler Frauen zu 90 % re-zeptorpositiv [27, 34, 38] . Grad-1-Karzinome sind zu 80–90 % rezeptorpositiv, Grad-2- und Grad-3-Karzi-nome nur in 50–80 % [45, 48] . Die Häufigkeit der Re-zeptorexpression ergibt eine Korrelation zum Keratin-expressionsmuster [14, 22, 38, 44, 58]: Karzinome vom luminalen Pänotyp sind in ca . 80 % ER-positiv, Karzi-nome vom basalen Phänotyp nahezu immer ER-negativ . Invasive lobuläre Karzinome sind in etwa 80 %, IDC-NST in 55–65 %, tubuläre Karzinome in 90–100 %, papilläre Karzinome in 100 %, muzinöse Karzinome in 60–70 % und medulläre Karzinome in 5–25 % positiv . Apokrine Karzinome sind überwiegend negativ [35] . In der Regel verhalten sich Primärtumor und Metastase hinsicht-lich des ER konkordant [13, 24, 58] . Ein Wechsel von ER-Positivität zu -Negativität kann aber bei einer Pro-gression bzw . bei Metastasen in bis zu 10 % beobachtet werden; dies gilt insbesondere auch nach neo adjuvanter Therapie .

Ein Hauptproblem der Rezeptoranalyse sind falsch-negative Ergebnisse . Die ausführlichen Daten des Uni-ted Kingdom National External Quality Assessment Service (UK NEQUAS-ICC) haben gezeigt, dass die Rate falsch-negativer ER-Ergebnisse zwischen 10 und 60 % (bei über 350  Teilnehmern aus mehr als 50  Ländern) schwanken . Hierbei spielen offenbar zahlreiche Fak-toren eine Rolle wie Fixation, Antigen-Retrieval, Wahl der Primärantikörper, Detektionssystem und schließ-lich auch Interpretation und gewählter Cut-off-Punkt der Immunhistochemie . Von zentraler Bedeutung sind aber die Fixation (mindestens 6 Stunden in neutralem Formalin [17]) und das Antigen-Retrieval [25, 50] . Eine weitere Erklärung für die diskrepanten Ergebnisse ist, dass es für die Interpretation und das Scoring von ER und PR derzeit noch keinen Goldstandard gibt [55] . Jedoch fand sich in Allreds Labor bei guter Definition und standardisierter technischer Bedingung eine In-tra- und Interobserver- Übereinstimmung für alle ER-Bestimmungen in über 90 % der Fälle [1] . Bässler gibt für den ER einen Übereinstimmungsgrad zwischen 80 und 89 % an [4] .

Qualitätssicherung

Um eine hohe Qualität der Rezeptortestung zu erzielen, ist es erforderlich, bestimmte Maßnahmen der Quali-tätssicherung für die tägliche Praxis zu treffen:– Das Gewebe sollte sofort (möglichst frühzeitig nach

chirurgischer Entnahme) und ausreichend lange fi-xiert werden (Mindestzeit 6  Stunden in neutralem Formalin) .

– Für das Antigen-Retrieval empfehlen wir 0,01 M Ci-tratpuffer pH  6,0 . Die Dauer des Antigen-Retrieval ist mitentscheidend für den Erfolg der Rezeptorbe-stimmung [3] .

– Grundsätzlich sollten nur standardisierte und ausge-testete Primärantikörper verwendet werden .

– Die Kerngegenfärbung sollte eine schwache Rezep-torfärbung nicht verdecken .

– Für die Auswertung der Rezeptorimmunhistoche-mie ist eine Verwendung von Kontrollschnitten mit bekannter fehlender, mäßiger oder starker Rezep-torexpression empfehlenswert, um tagesabhängige Schwankungen in den Immunfärbungen zu erfas-sen .

– Der Vergleich mit der Immunreaktion in normalem Mammagewebe kann ebenfalls als Vergleich heran-gezogen werden . Bei fehlender Immunreaktion in Kontrollschnitten oder im Normalepithel sollte der Test wiederholt werden [19] .

– Regelmäßige Teilnahme an externen Ringversuchen (in Deutschland z . B . QuIB – Qualitäts-Initiative Pa-thologie; http://www .dgp-berlin .de/index .php/ring-versuche) kann helfen, den eigenen Standard besser zu beurteilen .

– Die Interpretation sollte grundsätzlich durch erfah-rene Mammapathologen/innen erfolgen .

– Da aktuell Karzinome mit ≥1 % ER- oder PR-im-munreaktiven Tumorzellen als Hormonrezeptor po-sitiv gelten, wird international der Harvey- (oder Allred-) Score zur Bestimmung des Rezeptorgehalts beim Mammakarzinom bevorzugt (s .  Tab .  9 .2) . Bei Verwendung des Remmele-Scores ist darauf zu ach-ten, dass der Anteil positiver Tumorzellen in der Ka-tegorie  1 nicht mehr mit <10 %, sondern als 1–9 % definiert wird (s . Tab . 9 .1) .

Aus therapeutischer Sicht ist darauf hinzuweisen, dass auch Patientinnen mit niedrigen Gesamtscore durch-aus auf eine endokrine Therapie ansprechen können [21] .Nach aktuellen St . Gallen Empfehlungen (2011) folgt die Therapie des Mammakarzinoms einer modularen Subtypisierung anhand von Hormonrezeptor- und Her2-Status sowie der Ki-67 Proliferationsrate:Luminal A: ER und/oder PR positiv, Her2 negativ und Ki-67 niedrig (<14 %)

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Luminal B: – Her2 negativ und ER u ./o . PR positiv sowie Ki-67 hoch (>=14 %) oder

– Her2 positiv und ER u ./o . PR positiv, Ki-67 hoch oder niedrig

Her2 positiv: Her2 positiv und ER/PR negativTriple negativ: ER, PR und Her2 negativ(http://ncbi .nlm .nih .gov/pubmed/21709140; s . auch S3 Leitlinie Mammakarzinom 2012: http://www .awmf .org/leitlinien/detail/II/032-045OL .html .)

Her2/neu-Rezeptoren

Seit der Zulassung von Trastuzumab (Herceptin) als der ersten, gezielt gegen den epidermalen Wachstumsfakto-rrezeptor  2 (ErbB2 oder Her-2/neu) gerichteten Anti-

körpertherapie beim metastasierten (1998) und nicht-metastasierten (2006) Mammakarzinom kommt der Bestimmung des Her2-Status eine zentrale Bedeutung zu . Nur solche Karzinome, die entweder den Rezeptor überexprimieren oder eine Amplifikation des Gens auf-weisen, sind demnach für eine Anti-Her2-Therapie ge-eignet [40, 57] .

Molekulare Grundlagen

Die humane epidermale Wachstumsfaktorfamilie um-fasst vier Rezeptoren (Her1 bis Her4), die entweder durch Ligandenbindung oder ligandenunabhängig durch Überexpression aktiviert werden . Durch Dimeri-sierung kommt es zur Phosphorylierung intrazellulärer

Abb.  9.4 Her-/ErbB-Rezeptor-Familie (mod . nach http://www .cancernetwork .com/image) . Aktivierung und Signaltransduktion der ErbB-/Her-Proteine und Bindung inhibitorischer zielgerichteter Medikamente: Trastuzumab bindet als monoklonaler humanisier-ter Antikörper extrazellulär in der juxtamembranösen Region mit

bislang nicht gesichertem Mechanismus der Signaldisruption . Per-tuzumab inhibiert die Rezeptordimerisierung . Lapatinib bindet als kleines inhibitorisches Molekül an die intrazelluläre Tyrosinkinase-domäne von ErbB1 und ErbB2 . (Aus [52a])

Östrogen- und Progesteronrezeptoren sowie Her2 Kapitel 9 171

Rezeptortyrosinkinasen mit konsekutiver Signaltrans-duktion, wobei sich in Abhängigkeit vom Dimerisie-rungspartner (10 Kombinationsmöglichkeiten) unter-schiedliche Auswirkungen auf Wachstum, Apoptose, Migration und Angiogenese ergeben . Her2 ist dabei einer der wichtigsten Koordinatoren der intrazellu-lären Signaltransduktion . Dieser Rezeptor, für den bislang kein Ligand gefunden worden ist, liegt bereits in aktivierter, bindungsbereiter Konfiguration in der Zellmembran vor [20] . Während Her1/2-Heterodimere die frühe Invasion begünstigen sollen, werden Her2/3-Heterodimere für Tumorprogression und als mögliche Ursache von Therapieresistenz gegenüber Trastuzumab diskutiert, wobei Her2 die Funktion der intrazellulären Signaltransduktion übernimmt, da Her3 keine eigene Tyrosinkinaseaktivität aufweist (Abb . 9 .4) [31, 60] .

Die Häufigkeit Her2-positiver Mammakarzinome ist abhängig vom Tumorstadium und liegt für das fort-geschrittene, hämatogen metastasierte Karzinom zwi-schen 20–25 %, für das frühe, lokal begrenzte invasive Mammakarzinom (pN0/pN1) bei etwa 15–20 % [65] . Die höchsten Her2-Positivitätsraten finden sich mit ca . 60 % beim DCIS „high grade“ [29] . Her2-positive Karzi-nome kennzeichnen einen eigenständigen molekularen Weg der Karzinogenese, der mit einer ungünstigen Pro-gnose einhergeht . Diese Karzinome werden heute neben den prognostisch ähnlich ungünstigen basal-typischen (meist triple, ER-/PR-/Her2-negativen) Karzinomen den prognostisch günstigeren, sog . luminal-typischen Mammakarzinomen gegenübergestellt (Übersicht in Boecker [5]) .

Klinische und therapeutische Bedeutung

Slamon und Mitarbeiter konnten erstmals zeigen, dass die Überexpression oder Amplifikation des humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor-2-Gens beim nodal-positiven Mammakarzinom einen ungünstigen Prognosefaktor darstellt [57] . In zahlreichen nach-folgenden Studien wurde dieser Befund auch für das nodal-negative Karzinom bestätigt, wobei dem Her2-Status in der Regel eine unabhängige prognostische Bedeutung zukommt [41, 52] . Basierend auf diesen Studien wurde der Her2-Rezeptor als potentielles Ziel für neuartige, zielgerichtete Therapien ausgewählt . In-zwischen stehen zwei Typen von Medikamenten zur Verfügung:– humanisierte Antikörper, die an die extra zelluläre

Domäne des Her2-Rezeptors binden, wie z . B . Trastu-zumab und Pertuzumab, und

– sog . „small molecules“ (chemische Substanzen), die intrazellulär durch Bindung an Aktivierungs-/Phos-phorylierungsdomänen ihre rezeptorinhibierende Wirkung ausüben (s . Abb . 9 .4) .

Für den Einsatz dieser zurzeit verfügbaren Her2-gerich-teten Medikamente ist der Nachweis einer Überexpres-sion und/oder Amplifikation des Her2-Gens erforderlich .

Praxis der Her2-Bestimmung

Die Bestimmung des Her2-Status ist heutzutage ne-ben der Hormonrezeptoruntersuchung ein „obligater“ Bestandteil der Diagnostik des Mammakarzinoms [9, 16] . Es stehen verschiedene Testplattformen für die Her2-Testung zur Verfügung (Tab . 9 .3) . Am Formalin-fixiertem Gewebe sind derzeitig der immunhistoche-mische Rezeptornachweis (IHC) und der Nachweis der Genamplifikation mittels In-situ-Hybridisierung (ISH) am gebräuchlichsten . Nach den Empfehlungen der Amerikanischen Gesellschaft für klinische Onko-logie (ASCO) und der amerikanisch-kanadischen Pa-thologengesellschaft (USCAP) [65] ist es freigestellt, ob man zuerst mit der IHC oder mit der ISH beginnt . In beiden Fällen ist es erforderlich, die Indikationen für die jeweils andere Methode zu kennen und diese v . a . bei grenzwertigem Befund als Kontrolle mit einzuset-zen . Am Ende steht eine möglichst verlässliche Angabe zum Her2-Status (positiv vs . negativ; Abb . 9 .5), der sich ausschließlich auf den invasiven Tumorteil bezieht; In-situ-Anteile sind von der Beurteilung auszuschließen, da diese gelegentlich im Her2-Status vom invasiven An-teil abweichen können und bislang nur für das invasive Her2-positive Mammakarzinom die Wirksamkeit ziel-gerichteter Therapien belegt ist .

Nachweis der Her2-Rezeptorüberexpression mittels Immunhistochemie (IHC)

Für die immunhistochemische Rezeptorbestimmung hat sich der Einsatz FDA-zugelassener Testkits und die Nutzung von Färbeautomaten (Immunostainer) bewährt; die Erfolgsraten in externen Qualitätssiche-rungsprogrammen, wie z . B . QuIP (s .  unten), sind bei diesem Vorgehen am höchsten . Für die Auswertung der gefärbten Präparate wird ein Immuno-Score bestimmt, der von negativ (Score  0 und 1+), über grenzwertig (Score  2+) bis positiv (Score  3+) reicht und auf einer Kombination aus Intensitäts-Scoring und dem Nachweis einer ringförmig ausgebildeten Färbung beruht . Um die Rate möglicher falsch-positiver immunhistochemischer Beurteilungen zu begrenzen, wurde seitens der ASCO/CAP die Empfehlung ausgesprochen, nicht nur IHC 2+, sondern auch IHC3+ mit 10–30 % positiven Tumorzel-len mittels (F)ISH abzusichern (s . Abb . 9 .5) .

Aus eigener Erfahrung anhand der Hera-Studie [40] ergibt sich die höchste Übereinstimmung zwischen

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FISH und IHC bei solchen Tumoren, die gleichsam mit „bloßem“ Auge in der Übersichtsvergrößerung (2,5:1 bis 5:1) eine kräftige Membranfärbung mit typischer-weise über 80 % gefärbten Zellen zeigen . Benötigt man eine höhere Vergrößerung (Objektiv 10- bis 20-mal), um sich der Vollständigkeit der Membranfärbung zu versichern, handelt es sich bereits um einen IHC2+-Score . Bei Anwendung dieser sog . Vergrößerungsregel [52] ergibt sich eine enge Korrelation zwischen IHC und ISH (>95 % IHC3+ ISH-positiv und <5 % IHC0/1+ ISH-positiv) . Bei inkompletter Membranfärbung ent-scheidet der Prozentsatz (< >10 %), ob es sich um einen

IHC1+- oder IHC0-Score handelt (Abb .  9 .6) . Grund-sätzlich ist vor der eigentlichen Auswertung eines Her2-gefärbten Schnittes die Frage nach der Auswert-barkeit zu stellen . So können eine granuläre anstelle von linearer Membranfärbung, die Abnahme der Fär-beintensität vom Präparatrand zum Zentrum oder aus-geprägte zytoplasmatische Färbungen ohne eindeutige Membranfärbung Hinweise auf Fixierartefakte geben . In jedem solcher Fälle sowie bei ausgeprägten Rand- und Quetschartefakten ist eine Befundüberprüfung durch ISH angezeigt – nach dem Prinzip: „In any doubt do (F)ISH!“ .

Tabelle  9.3 Gebräuchliche Her-2-Test- und Analysesysteme . (Mod . nach http://www .nordiqc .org/Run-33-B12-G2/Assessment/assess-ment-B12-HER2_IHC .htm, http://www .accessdata .fda .gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfivd/index .cfm)

Nachweisprodukt Nachweismethode

Genkopienzahl (Amplifikation)

FISH PathVysion* (Vysis/Abbott)

PharmDx-Kit* (Dako)

Einfarben-ISH Spot-Light-CISH* (Invitrogen)

ZytoDot Spec (Zytovision)

Inform-Her2 SISH (Roche-Ventana)

Zweifarben-ISH ZytoDot-2C (Zytomed-Systems, Zytovision)

BDISH-Assay (Roche-Ventana)

Quantitat . PCR DNA-Quantif . Kit (Roche)

mRNA Transkripte (qRT-PCR) RNA-Quantif . Kit (Roche)

Rezeptorprotein

IHC: Überexpression HercepTest* (A0485 polyclonal, Dako)

PathWay* (4B5, Roche-Ventana)

TAB250 (Invitrogen/Zymed)

SP3 (Thermo/Labvision)

CB11 (Novocastra/Leica; Neomarkers/Thermo)

3B5 (Neomarkers/Thermo)

ELISA: extrazelluläre Domäne Her-2/neu Assay* (Bayer, Oncogene)

Bildanalysesysteme

Für FISH Ariol* (Applied Imaging)

AutoVysion* (Vysis), Duet* (BioView)

Iconoscope OncoFISH* (Ikonisys)

Für IHC ACIS* (Dako), VIAS (Roche-Ventana)

* FDA-zugelassen

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Nachweis der Her2-Genamplifikation mittels In-situ-Hybridisierung (ISH)

Für die Bestimmung der Her2-Genamplifikation ste-hen grundsätzlich zwei Verfahren zur Verfügung, die Ein- und Zweifarben-ISH . Typischerweise handelt es sich bei der FISH um ein Zweifarbenverfahren, bei dem sowohl die Chromosom-17-Zahl (Markierung der Zentromerregion) wie auch die auf dem jeweiligen Chromosom nachweisbaren Her2-Gene in mindestens 20 in einem Blickfeld gelegenen Tumorzellen bestimmt werden (Abb . 9 .7) . Aus dem Quotienten von Gen- und Chromosomensignalen wird die Ratio gebildet; bei Werten über 2,2 liegt definitionsgemäß eine Her2-Ge-namplifikation vor (FISH-positiv) . Werte zwischen 1,8 und 2,2 . werden als grenzwertig eingestuft und bedür-fen einer Absicherung, z . B . durch Auszählung weiterer 20  Zellen in einem weiteren Tumorareal . Bei Ratio-

werten unter 1,8 liegt keine Her2-Genamplifikation vor (FISH-negativ) .

In den letzten Jahren wurden zur FISH-Technik alternative Verfahren eingeführt, die auch mit Hilfe eines Lichtmikroskops ausgewertet werden können . Zunächst wurden dafür Einfarbenverfahren, wie z . B . die chromogene In-situ-Hybridisierung, CISH, oder die Silber-in-situ-Hybridisierung, SISH, eingeführt . Diese Verfahren sind technisch weniger aufwendig (Lichtmikroskop anstatt Fluoreszenzmikroskop), er-lauben eine bessere Beurteilung der Gewebemorpho-logie, haben nicht das Problem des Ausbleichens und können langfristig unter Routinebedingungen gelagert werden . Bestimmt wird analog zur FISH-Untersuchung die mittlere Her2-Genzahl (Gencount) pro 20  Tumor-zellen . Entsprechend den ASCO/CAP-Empfehlungen gilt ein Gencount von >6 als ISH-positiv, der Bereich zwischen 4–6 als grenzwertig und ein Gencount <4 als ISH-negativ (vgl . Abb . 9 .5) . Es besteht eine gute Über-

Abb. 9.5 Testalgorithmus (nach [39] und *S3-Leitlinie http://www .leitlinien .net/) . Bei stringenter Beachtung von Gewebe-, Test- und Auswertungsqualität können IHC oder ISH gleichwertig eingesetzt werden . IHC 2+ erfordert ISH, grenzwertiger ISH-Befund ggf . eine Überprüfung mittels IHC . Negativ und positiv sollten auf sicherem

IHC-Befund (meist in der Übersicht beurteilbar) und/oder ISH-Ratio-Wert beruhen, insbesondere um Polysomien (CEP  17 ≥3) sicher zu klassifizieren . Jeglicher Zweifel begründet wechselseitige Testabsicherung . (Aus [52a])

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einstimmung zwischen C/SISH und FISH [28, 62] . Bei grenzwertigen Befunden empfiehlt sich die Überprü-fung des Chromosomencounts, um so die Ratio als weiteres diagnostisches Entscheidungskriterium heran-ziehen zu können . Aktuell kommen Zweifarben-ISH-Techniken auf den Markt, die analog zur FISH neben den Her2-Gensignalen auch die Chromosom-17-Beur-teilung im Lichtmikroskop erlauben (Her2-ZytoDot-Zweifarben-CISH, „Brightfield-double-ISH“, BDISH) . So lassen sich neben der Genamplifikation auch Chro-mosom-17-Polysomien oder seltener Monosomien (in etwa 2 %) erfassen (s . Abb . 9 .7) . Ergibt sich weder nach Gencount noch mittels Ratio ein eindeutiges Ergebnis

(grenzwertiger Bereich), empfiehlt sich der Vergleich mit der Immunhistochemie, ggf . auch die Untersuchung eines weiteren Tumorblocks, da Grenzfälle häufig auch eine intratumorale Heterogenität zeigen [6] . Wird trotz aller Maßnahmen kein eindeutiges Ergebnis erzielt, sollte laut S3-Leitlinie zur Brustkrebsfrüherkennung in Deutschland (http://www .leitlinien .net/) für FISH der ursprünglich gebräuchliche „Cut-off “ von ≥2,0 benutzt werden . Wenn keine CEP-17-Kontrolle benutzt wird, wie z . B . bei Monocolor-CISH, sollte für die endgültige Bewertung der Cut-off von >5 Genkopien angewendet werden – dies abweichend von den ASCO/CAP-Emp-fehlungen, die den Cut-off bei >6 Genkopien ansetzen.

Abb.  9.6a–d Immunhistochemische (IHC) Her2-Befundkonstel-lationen . a Immuno-Score 3+ mit eindeutig bei niedriger (2,5–5×) und stärkerer (b) mikroskopischer Vergrößerung erkennbarer

ringförmiger Membranfärbung . c Immuno-Score 2+ mit erst bei mittlerer Vergrößerung (10–20×) sicher abgrenzbarer ringförmiger Membranfärbung (d)

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Qualitätssicherung

In der Diskussion um die Wertigkeit der beiden routi-nemäßig eingesetzten Her2-Testverfahren wird häufig eine angeblich gegenüber der ISH schlechtere Repro-duzierbarkeit der IHC (Intra- und Interlaborvarianz) aufgeführt, wobei bei IHC vor allem das Risiko für eine falsch-positive Beurteilung in bis zu 30 % der Fälle best-ehe [42, 54] . Dem entspricht auch die Formulierung der S3-Leitlinie zum Mammakarzinom, wonach die Her2-Testung vorzugsweise mittels In-situ-Hybridisierung durchgeführt werden soll .

Aktuellen Daten einer großen prospektiven multina-tionalen Therapiestudie (ALLTO; http://www .clinicaltri-

als .gov/ct/show/NCT00490139) zufolge mit über 8000 auf Her2 zentral nachgetesteten Mammakarzinomen erweist sich das Argument eines klaren Vorteils der ei-nen Methode gegenüber der jeweils anderen allerdings als nicht haltbar . So konnten z . B . in den USA 26 % der immunhistochemischen Her2-Befunde und 25 % der mittels ISH erhobenen Her2-Befunde in der zentralen Retestung nicht bestätigt werden [39] . Auch Daten aus anderen Ländern zeigen vergleichbare Probleme beim Vergleich verschiedener Labore [8] . Letztlich bestätigen diese Daten die ASCO/CAP-Empfehlung, IHC und ISH grundsätzlich als gleichwertig zu betrachten . Dabei sollte eine Diskrepanzrate zwischen IHC und FISH von etwa 3 % und eine Rate falsch-negativer Befunde von deutlich unter 5 % (möglichst 0 %) angestrebt werden [65] .

Abb.  9.7a–f Her2-Befundkonstellationen bei In-situ-Hybridisie-rung (ISH) . a Normaler, nicht amplifizierter FISH-Befund mit im Mittel pro 20  Tumorzellen jeweils zwei (grünen) Chromosom-17- und zwei (roten) Her2-Signalen (Ratio: 1,0, ISH-negativ) . b Deut-liche Vermehrung/Amplifikation der Her2-Gensignale, teils ein-zeln, teils in Clustern angeordnet (Ratio: 7,6; ISH-positiv) . c, d Vermehrte Chromsom-17-Signale werden bei im Mittel mindestens 3 pro 20 Tumorzellen als Polysomie (c) bezeichnet; sie können als

sog . Pseudopolysomie (e) in Form multipler kleiner Signale mit den Her2-Signalen infolge einer Koamplifikation perizentromerischer Chromsomenabschnitte vermischt sein; beide Befunde können bei ausschließlicher Betrachtung der Ratio zu falsch-negativem (F)ISH Befund führen . f Monsomie mit im Mittel nur einem zentromerspe-zifischem Signal; dieser Befund kann bei fehlender Her2-Genampli-fikation zu falsch-positivem (F)ISH-Befund führen

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Um eine solche Qualität der Her2-Testung zu er-zielen, ist es erforderlich, bestimmte Maßnahmen der Qualitätssicherung zu treffen (s .  Übersicht) . Als zwei einfache, wirksame Qualitätsmaßnahmen haben sich die kontinuierlich (monatliche) Her2-Dokumentation, z . B . im webbasierten Her2-Monitor (http://webhost1 .mh-hannover .de/pat/Anmeldung1 .htm), und die Be-achtung der Vergrößerungsregel bei der immunhisto-chemischen Auswertung herausgestellt [53] .

Qualitätssicherung (QS). (Nach S3-Leitlinie Mammakarzinom, www.leitlinien.net/und [122])– Gewebe:

– Formalinfixierung: 4–10 %ig, gepuffert, unmittelbar nach Entnahme, Dauer: 6–48 h (nach Größe: Penetration bei Raum-temperatur: 2 mm/h)

– Schnitte zeitnah färben (<4–6 Wochen)– Testung:

– Standardisierte Tests: Kits > EigenMix; automatisiert > manuell

– Beurteilung nach internationalen Guidelines (Algorithmus)

– Interne QS:– 25–100 Proben IHC und (F)ISH

(Konkordanz ≥95 %)– bei Biopsien: Überprüfung der Konkordanz

mit Exzidat (≥95 %)– Kontrollgewebe (möglichst „on-slide“

wie diagnostische Probe prozessiert)– Arbeit nach SOPs– Dokumentation der eigenen Daten

(IHC/FISH-Konkordanz ≥95; mög-lichst regelmäßig, z . B . Her2-Monitor: http://webhost1 .mh- hannover .de/pat/Anmeldung1 .htm)

– Training der Mitarbeiter: Freitestung vor eigenständiger Befundung (z . B . 50 geblindete Fälle korrekt klassifiziert)

– Beurteilung nur durch qualifizierten Pa-thologen

– Externe QS:– erfolgreiche Teilnahme, z . B . an QuiP

(1-mal/Jahr) als Beleg für Befähigung von Labor und Befunder

– Akkreditierung (s . Gendiagnostikgesetz)– regelmäßige Audits (1-mal/Jahr intern;

alle 2 Jahre extern)– Mindesttestzahl/Labor empfohlen

(IHC > 250/Jahr; ISH > 100/Jahr)

Auch unter standardisierten Bedingungen sind Dis-krepanzen zwischen IHC- und ISH-basiertem Her2-Befund zu erwarten . Phänomene wie intratumorale He-terogenität, grenzwertige Amplifikation und Polysomie sind wesentliche Ursachen . Es hat sich bewährt, bei wi-dersprüchlichen oder grenzwertigen Befunden immer beide Methoden am selben Tumorblock durchzuführen und die Beurteilung von Her2-Expression und Ampli-fikation möglichst im Bereich identischer Tumorareale vorzunehmen . Ist dies nicht möglich, z . B . bei Konsi-liaruntersuchung, sollte möglichst der immunhisto-chemische Schnitt der Anforderung zur ISH beigefügt werden . Auf diese Weise wird ein Höchstmaß an Korre-lation zwischen IHC und ISH erreicht .

Eine wichtige Quelle für grenzwertige und diskre-pante Her2-Befunde ist die sog . Polysomie . Da es keine allgemein akzeptierte Definition gibt (zumeist werden ≥3 Chromosom-17-Signale/Zelle angesetzt), schwan-ken Häufigkeitsangaben zwischen 10 % und 40 % [51, 63, 65] . In etwa jedem zweiten Fall besteht hierbei keine Her2-Gen-Amplifikation, d . h ., die Ratio liegt unter 2,2 . Diese Tumoren zeigen auch in der Regel keine Her2-Überexpression und gelten somit als Her2-negativ . Eine Ausnahme stellen die Fälle mit meist hochgradiger Po-lysomie dar, bei denen der absolute Gencount deutlich über 6 liegt; bei diesen wurde eine Her2-Überexpression (IHC3+) und ein Ansprechen auf Trastuzumab beobach-tet [23] . Somit ist in Fällen mit Polysomie- und Ratio-werten <2,2 die absolute Genzahl als Entscheidungskri-terium für den Her2-Status zu betrachten; ggf . ist die Immunhistochemie hinzuzuziehen . Dieses Vorgehen wird auch durch molekulare Daten gestützt, nach denen die Erhöhung der CEP-17-Signale häufig nicht Ausdruck einer echten Polysomie (mit Vermehrung des Chrom-somensatzes einer Zelle), sondern lediglich auf einer Koam plifikation von Zentromer- und Her2-Gen-Region auf Chromosom 17 beruht [64] . Dies konnte durch Ar-ray-CGH-Daten belegt werden, nach denen gerade Fälle mit grenzwertigem FISH-Befund (Ratio 1,8–2,2, n = 15), aber auch solche mit Diskordanz zwischen IHC und FISH (n = 4) oder Monosomie (n = 1) nahezu alle Anomalien im Zentromerbereich von Chromosom  17 aufweisen (n = 18/20) . Eine echte Chrosomom-17-Polysomie mit Vervielfältigung des gesamten Chromosoms fand sich nur in einem dieser Fälle [18] . Ergibt sich im Zweifar-ben-ISH ein Polysomieverdacht, können Ratiowerte zu falsch-negativen Befunden und bei Monosomieverdacht (Chromosom-17-Zahl/20 Zellen <1,25) zu falsch-posi-tiven ISH-Befunden führen . Hier empfiehlt es sich, den Her2-Status bevorzugt nach der absoluten Genzahl und/oder dem immunhistochemischen Expressions-Score festzulegen . Dies verdeutlicht, dass Ratio und Gencount nicht immer zur identischen Aussage bezüglich des Her2-Status führen, was vor allem bei grenzwertigen Be-funden der Fall ist [10] . Es empfiehlt sich somit, beide Parameter im Einzelfall getrennt zu betrachten .

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Plausibilitätsprüfung

Vor einer abschließenden Befundausgabe empfiehlt es sich, den Her2-Status auch mit weiteren Tumorbefun-den abzustimmen:– Her2, Tumortyp und Grading: In Grad-1-Karzinomen,

medullären und klassischen lobulären Karzinomen wird praktisch keine Her2-Positivität angetroffen, ggf . sind der Her2-Status und/oder der histologische Befund nochmals kritisch zu überprüfen .

– Korrelation Her2- und Hormonrezeptorstatus: Be-kanntermaßen besteht eine inverse Beziehung zwi-schen Her2- und Hormonrezeptorstatus . Dennoch sind bis zur Hälfte der Her2-positiven Mammakarzi-nome auch hormonrezeptorpositiv [66, 67] und zei-gen eine den hormonrezeptornegativen Karzinomen vergleichbares Ansprechen auf anti-Her2-gerichtete Therapien . Allerdings gibt es in vitro Hinweise da-rauf, dass Tamoxifen bei Her2-Überexpression eine intrinsische ER-Stimulation ausüben kann, so dass Aromatasehemmer dem Tamoxifen bei Her2+-/ER+-Karzinomen vorgezogen werden [43] .

– Her2-Testung am Biopsiematerial: Angesichts des zunehmenden Einsatzes der Anti-Her2-Therapie in der neoadjuvanten Situation ergibt sich die Notwen-digkeit zur Testung an präoperativ gewonnenen Tu-morstanzen . Die diagnostische Gleichwertigkeit der Her2-Bestimmung an Stanzbiopsien und Tumorex-zidaten ist nicht von vornherein gegeben . Entspre-chend der S3-Leitlinie für das Mammakarzinom in Deutschland sollte bei routinemäßiger Bestimmung von Her2 am Stanzgewebe die Übereinstimmung der negativen und positiven Ergebnisse mit dem Exzidat geprüft werden (Konkordanz ≥95 %) . Tatsächlich konnte in neueren Studien [2] bei qualitätsgesi-cherter Her2-Testung eine hohe Übereinstimmung zwischen Her2-Status an der Stanzbiopsie und dem anschließenden Tumorexzidat gezeigt werden (Dia-kordanzrate 1,2 %) . Es muss aber darauf hingewiesen werden, dass bei zu kurzer Fixierung im Formalin (<6 h, Schnelleinbettung) es de facto zur Alkoholfi-xierung (Entwässerung) der Biopsie kommt, die eine zu starke, falsch-positive Immunreaktion zur Folge haben kann (Abb .  9 .6d,e); Überfixierungen (>48  h) können dagegen zu falsch-negativen IHC-Befunden führen . Bei ISH kann eine Überfixierung (>72  h) auch zu negativen Resultaten führen, was aber z . B . durch Verlängerung der Verdauzeit meistens zu kor-rigieren ist .

– Änderung des Her2-Status im Verlauf und unter The-rapie: In mehreren Studien konnte gezeigt werden, dass sich der Her2-Status in Fernmetastasen in der Regel kaum von dem im Primarius unterscheidet . In einer eigenen Studie mit 90 Patientinnen zeigte sich nur in 3/90 Fällen (3,3 %) ein diskordanter Befund

mit in 2 von 3 Fällen positivem Primarius und ne-gativer Metastase . Dagegen fand sich eine wesentlich höhere Diskordanz für den Hormonrezeptorstatus (ER 18,8 %, PR 28,8 %) [67] . Demgegenüber ist nach neoadjuvanter Chemotherapie häufiger mit Ände-rungen des Her2-Status zu rechnen und zwar sowohl von positiv zu negativ (ca . 30 %) wie auch seltener von negativ zu positiv (ca . 5 %) [7] .

Neue Entwicklungen

– ErbB2-Testung im Blut: Für die Therapieentscheidung ist der Nachweis von Her2-Fragmenten im Blut mit-tels ELISA nicht geeignet . Eine gewisse Bedeutung kommt diesem Bluttest für das Therapiemonitoring zu; ansteigende ELISA-Werte unter Herceptin-The-rapie zeigen offenbar ein Therapieversagen und da-mit eine ungünstige Prognose an [30] .

– Quantitative Messverfahren: Zur Standardisierung der Her2-Bestimmung stehen z . B . automatisierte Bildanalyseverfahren zur Verfügung, die teilweise auch von der FDA zugelassen worden sind (Tab . 9 .3) . Daneben werden zunehmend auch PCR-basierte Testverfahren eingesetzt, die auch eine Mehr-Gen-Analyse (z . B . 21-Gen-RT-PCR-Assay [Oncotype DX]) erlauben . Vergleiche mit der klassischen IHC- und/oder ISH-basierten Her2-Bestimmung ergeben eine hohe Konkordanz mit allerdings zum 21-Gen-Assay deutlich besserer Preis-Leistungs-Relation [33] . Eine besonders präzise Analyse von Her2-Gen- und Chromosom-17-Status ermöglicht die Array-basierte komparative genomische Hybridisierung (Array-CGH), die möglicherweise der Abklärung von mittels IHC und ISH nicht aufzuklärenden Me-thoden vorbehalten ist [18] . Schließlich konnte auch für die Her2-Expressionsanalyse mittels quantita-tiver mRNA eine enge Korrelation zum IHC-Scoring nachgewiesen werden [36] . Allerdings sind derzeitig nur die IHC- und ISH-basierte Her2-Testung von der FDA als validierte Untersuchungsverfahren an-erkannt .

In Zukunft dürfte darüber hinaus die Kombination von Her2-Testung mit weiteren Biomarkern, die den nach-geschalteten intrazellulären Signalweg („downstream signaling“) erfassen, an Bedeutung gewinnen (vgl . Abb . 9 .4) . Auf diese Weise wird sich der Vorhersagewert des Her2-Status bezüglich des Therapieerfolgs auf anti-Her2 gerichtete Therapien noch deutlich verbessern las-sen .

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