PIDD mediates Nf-κB activation in response to DNA damage

Sophie Janssens, Antoine Tinel, Saskia Lippens and Jürg Tschopp2005Department of Biochemistry , University of Lausanne, Switzerland

Ausgangsposition

Ausgangsposition

PIDD bildet zusammen mit RAIDD und Caspase 2 einen proapoptotischen Singalkomplex, das sogenannte PIDDosome

Nf-κB ermöglicht nach Aktivierung die Transkription von „survival genes“

ATM wird für die Ubiquitinierung von NEMO bei DNA-Schäden benötigt, wodurch NEMO die Spaltung von IκB vorantreiben kann

Das PIDDosome enthält Komponenten des Nf-κB Signalwegs.

- Caspase2 ist Teil des apoptotischen Wegs

- RIP1-Kinase ist Teil verschiedener NfκB- Signalwege (z.B. TNF-Weg)

- NEMO ist ein regulatorisches Gerüstprotein, das nach Modifizierung Nf-κB aktivieren kann. Teil des IKK-Komplexes

RIP1 und NEMO werden an das PIDDosome rekrutiert

gemessen: Nf-κB-Expression durch Luciferase-Aktivität

-Überexpression von PIDD erhöht die Nf-κB- Expression nicht

PIDD alleine reicht nicht aus für NF-κB-Aktivierung

Camptothecin, Etoposide, Doxorubicin: Verursachen Doppelstrangbrüche = genotoxischer Stress

PIDD-Zellen zeigen verstärkte Nf-κB-Aktivierung bei genotoxischem Stress

IκB-Phosphorylierung tritt in PIDD-Zellen schneller und stärker auf

siRNA gegen PIDD vermindert die Phosphorylierung von IκB

PIDD-Zellen zeigen verstärkte Sumoylierung von NEMO bei DNA-Schäden

SUMO = small ubiquitin-like modifier

Immunoprezipitation von NEMO nach Behandlung der Zellen mit TNF oder Etoposide

- mehr Sumoylierung

- mehr Ubiquitinierung

PIDD spielt eine Rolle bei der Modifizierung von NEMO

PIDD ist notwendig für die durch genotoxischen Stress induzierte SUMO-Modifizierung und Phosphorylierung von NEMO

Nach Behandlung mit siRNA gegen PIDD:

- keine NEMO Sumoylierung

- keine NEMO Phosphorylierung

Nach Behandlung mit siRNA gegen PIDD:

-weniger Ubiquitinierung von NEMO

PIDD spielt eine Rolle bei der durch genotoxischen Stress induzierten Ubiquitinierung von NEMO

Zusammenfassung bisher

PIDD ohne PIDD

- Bildet ein PIDDosome mit RIP1 und NEMO

- spielt eine Rolle bei der N-fκB- Aktivierung

- reicht alleine nicht aus, um Nf-κB zu aktivieren

- spielt eine Rolle bei der Modifizierung von NEMO

- Verminderte Phosphorylierung von IκB

- keine Sumoyilierung von NEMO

- keine Phosphorylierung von NEMO

- wenigerUbiquitinierung von NEMO

● Nur Zellen mit RIP1 und PIDD zeigen NEMO Sumoylierung und Ubiquitinierung

● NfκB-Aktivierung findet nur in Zellen mit RIP1 statt

● Nf-κB-Signalweg ist in Zellen mit RIP1 verstärkt aktiviert

● PIDDosome bildet sich nur in Zellen mit RIP1

● Vermutung: RIP1 steuert die Interaktion von PIDD mit NEMO

● ohne RIP1 mehr RAIDD ans PIDDosome rekrutiert und verstärkte Spaltung von Caspase 2

Apoptotischer PIDD-RAIDD-Caspase 2 Signalweg scheint in Abwesenheit von RIP1 verstärkt aktiv zu sein

in vitro:

in vivo:

PIDD-RIP1-NEMO Komplex bildet sich in PIDD-Zellen bei genotoxischem Stress

RIP1 wird für die Rekrutierung von NEMO an PIDD benötigt

Bei Behandlung mit LMB (Leptomycin B; Inhibitor des nukleären Export) Sammelt sich PIDD im Nukleus an

●Blau = Zellkern●Grün = PIDD

PIDD kann sich zwischen Cytosol und Nukleus bewegen

Genotoxische Stimuli führen zu Erhöhung der PIDD-Konzentration im Nukleus

Bei genotoxischem Stress nimmt Konzentration von PIDD im Kern zu

Konzentration von RIP1 und NEMO ändert sich nicht

Modifizierung von NEMO findet nur im Kern statt

Außerdem: modifiziertes RIP1 im Kern

Bei genotoxischem Stress wandert PIDD in den Kern, wo es zur Modifikation von RIP1 und NEMO kommt

Abschalten von RAIDD oder Caspase 2 hatt keinen Einfluss auf die Aktivierung von Nf-κB

Idee: PIDD stellt eine „docking platform“ dar, die Entweder mit einem „Überlebens-Komplex“ aus RIP1 und NEMO oder einem Apoptosekomplex aus RAIDD und Caspase 2 interagiert.

Frage: können RIP1 und RAIDD gleichzeitig mit PIDD interagieren?

Erhöhung der Konzentration von RAIDD führt zu einer Verringerung der Bindung von RIP1 an PIDD

Erhöhung der Konzentration von RIP1 führt zu einer Verringerung der Bindung von RAIDD an PIDD

RIP1 und RAIDD konkurieren um die Bindung an PIDD, Nf-κB- und Apoptosesignalweg sind unabhängig

RIP1 und NEMO werden sehr schnell an PIDD rekrutiert

RAIDD und Caspase bilden erst später ein PIDDosome

Ergebnisse:

- Das PIDDosome enthält Komponenten des Nf-κB-Signalwegs

- PIDD ist nowendig für die Aktivierung von Nf-κB bei DNA-Schäden

- PIDD alleine reicht dafür nicht aus

- PIDD ist an der Modifizierung von NEMO beteiligt

- RIP1 wird für die Rekrutierung von NEMO an PIDD benötigt

- PIDD wird bei genotoxischem Stress in den Zellkern transportiert

- PIDD-induzierte Nf-κB- oder Apoptosesignalwege sind unabhängig

Modell für die Zusammenhänge der verschiedenen Signalwege

PIDD wird bei genotoxischem Stress in den Nukleus transportiert.

Dort interagiert es mit RIP1 und NEMO

NEMO-sumoylierung und RIP1-Modifizierung folgen.

ATM kann NEMO phosphorylieren und ubiquitinieren.

NEMO wird ins Cytoplasma transportiert, wo es die IKKs aktiviert.

Spaltung von IκB und damit Aktivierung von Nf-κB sind die Folge

Offene Fragen:

Wie genau erhöht PIDD den Anteil von sumoylierten NEMO im Nucleus? (ist es selbst Ligase? Aktiviert es eine Ligase? Welche?)

Wie genau läuft die Bildung des PIDD-RIP1-NEMO-Komplexes in vivo ab?

Genauere Informationen über die RIP1-Modifikation im Nucleus? Erhöht PIDD etwa nur die Stabilität von sumoylierten NEMO?

Falls ja: Kann es das auch bei anderen Proteinen?

Bildet sich das PIDDosome auch unter anderen (z.B. oxidativen) Stressbedingungen?

Woher weiss PIDD, welchen Komplex es zu bilden hat?