Einflüsse der Alkaloide Noscapin, Paclitaxel, Phalloidin ... · •DNA Interkalation und Schädigung •Apoptotisch durch Aktivierung von nF-κB, Schädigung der Mitochondien, Zellzyklusarrest

RUPRECHT-KARLS UNIVERSITÄT HEIDELBERG FAKULTÄT FÜR BIOWISSENSCHAFTEN

BACHELORSTUDIENGANG MOLEKULARE BIOTECHNOLOGIE

Einflüsse der Alkaloide Noscapin, Paclitaxel,

Phalloidin, Sanguinarin und Vinblastin auf das Cytoskelett

von COS-7 Zellen Bachelorarbeit

Von Iris Hövel

Geboren in Bonn

Abgabe: Juli 2009

Einflüsse der Alkaloide Noscapin, Paclitaxel, Phalloidin, Sanguinarin und Vinblastin auf das Cytoskelett von COS-7 Zellen

Iris Hövel

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Die vorliegende Bachelorarbeit wurde im Institut für Pharmazie und Molekulare

Biotechnologie der Universität Heidelberg in der Abteilung für Biologie in der Zeit von

11.05.2009 bis 17.07.2009 angefertigt.

Gutachter der Arbeit: Prof. Dr. rer. nat. Michael Wink

Abteilung Biologie

Institut für Pharmazie und Molekulare Biotechnologie

Ich erkläre hiermit ehrenwörtlich, dass:

1. ich die vorliegende Bachelorarbeit selbständig unter Anleitung verfasst und keine

anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe;

2. die Übernahme wörtlicher Zitate aus der Literatur/Internet sowie die Verwendung der

Gedanken anderer Autoren an den entsprechenden Stellen innerhalb der Arbeit

gekennzeichnet wurde;

3. ich meine Bachelorarbeit bei keiner anderen Prüfung vorgelegt habe.

Ich bin mir bewusst, dass eine falsche Erklärung rechtliche Folgen haben wird.

Ort, Datum Unterschrift


Iris Hövel

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Inhalt Abstrakt ...................................................................................................................................... 4

Abstract ...................................................................................................................................... 5

Einleitung ................................................................................................................................... 6

Cytotoxizität ........................................................................................................................... 6

Cytoskelett .............................................................................................................................. 7

Alkaloide ................................................................................................................................ 9

Cytotoxozitäts-Assay ............................................................................................................ 11

Cytostaining .......................................................................................................................... 12

Material und Methoden ............................................................................................................ 14

Material ................................................................................................................................. 14

Lösungen ........................................................................................................................... 14

Medium ............................................................................................................................. 15

Chemikalien und Ausstattung ........................................................................................... 15

Methoden .............................................................................................................................. 18

Zellkultur ........................................................................................................................... 18

MTT-Assay ....................................................................................................................... 18

Zellen anfärben ..................................................................................................................... 21

Ergebnisse ................................................................................................................................ 24

Cytotoxizität ......................................................................................................................... 24

Noscapin ........................................................................................................................... 24

Paclitaxel ........................................................................................................................... 26

Phalloidin .......................................................................................................................... 27

Sanguinarin ....................................................................................................................... 28

Vinblastin .......................................................................................................................... 28

Zusammenfassung der IC50 Werte .................................................................................... 29

Cytostaining .......................................................................................................................... 30

Noscapin ........................................................................................................................... 34

Paclitaxel ........................................................................................................................... 35

Phalloidin .......................................................................................................................... 36

Sanguinarin ....................................................................................................................... 37

Vinblastin .......................................................................................................................... 38

Zusammenfassung der Zellvermessung ............................................................................ 39

Diskussion ................................................................................................................................ 40


Iris Hövel

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Cytotoxizität ......................................................................................................................... 40

Noscapin ........................................................................................................................... 40

Paclitaxel ........................................................................................................................... 41

Phalloidin .......................................................................................................................... 42

Sanguinarin ....................................................................................................................... 43

Vinblastin .......................................................................................................................... 43

Cytostaining .......................................................................................................................... 44

Noscapin ........................................................................................................................... 47

Paclitaxel ........................................................................................................................... 48

Phalloidin .......................................................................................................................... 49

Sanguinarin ....................................................................................................................... 50

Vinblastin .......................................................................................................................... 50

Fazit .......................................................................................................................................... 52

Literaturverzeichnis .................................................................................................................. 53

Anhang

Datenblätter zu den Mikroskopieaufnahmen

Rohbilder und Bachelorarbeit (CD-ROM)


Iris Hövel

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Abstrakt Naturstoffe dienen der Wirkstoffforschung als Quelle für neue Leitstrukturen. Durch den

evolutionären Selektionsprozess sind solche Substanzen sehr gut an ein Target angepasst.

Durch eine Derivatisierung kann gegebenenfalls die Wirkung für den medizinischen Nutzen

verbessert werden Ein Beispiel für Naturstoffe ist die vielfältige Gruppe der Alkaloide,

welche vorwiegend von Pflanzen zum Schutz vor Mikroorganismen und Fressfeinden

gebildet werden (Wink, 2007a).

Die Cytotoxizität der Alkaloide Noscapin, Paclitaxel, Phalloidin, Sanguinarin und Vinblastin

wurde hier durch einen colorimetrisches Assay mit MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyl Tetrazolium Bromid) in COS-7-Zellen untersucht. Dies diente zur Ermittlung der

entsprechenden IC50 Werte, welche die Substanzkonzentration angeben, die die Überlebens-

rate um 50% im Vergleich zu unbehandelten Zellen herabsetzen. Die IC50 Werte dienen zur

passenden Dosierung der Substanzen bei einem Cytostaining in der gleichen Zelllinie. Hier

sollte die Wirkung der Substanzen auf das Cytoskelett untersucht werden. Für die Färbung

des Aktinnetzwerks wurde fluoreszenzmarkiertes Phalloidin und für die Visualisierung der

Mikrotubuli wurde Immunofluoreszenz mit einem α-Tubulin Antikörper genutzt. Dabei

wurden verschiedene Schritte der vorliegenden Färbeprotokolle variiert, um die Methode den

gegebenen Verhältnisse anzupassen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Etablierung der

Methode allerdings nicht abgeschlossen werden. So können anhand der Ergebnisse auch keine

exakten Aussagen über die Interaktion der Alkaloide mit dem Cytoskelett getroffen werden,

doch diese Arbeit verdeutlicht einige Grundprinzipien der Interaktion von Alkaloiden mit dem

Cytoskelett.


Iris Hövel

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Abstract Bioactive substances from nature are often used to find new lead structures in drug research.

They are adapted very well to targets in other organisms because of selective processes in

evolution. The medical effect of the substances can be improved by the synthesis of

derivatives (Wink, 2007a). An example of bioactive natural substances is the varied group of

alkaloids that are mostly synthesised by plants to protect themselves from micro organisms

and herbivores.

Here, the cytotoxicity of the alkaloids noscapine, paclitaxel, phalloidine, sanguninarine and

vinblastine in COS-7 cells was analysed. The cytotoxicity was determined with a colorimetric

assay using the reagent MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bro-

mide). The IC50 value was calculated, which stands for the concentration that reduces the

viability to 50% compared to the untreated cells. With the correct alkaloid concentration a

significant influence on the cells’ cytoskeleton was aspired, which should be evidenced by a

cytostaining using immunofluorescence with a α-tubulin antibody for the microtubules or

fluorescence marked phalloidine for the actin network. Different parameters of the stainings

were varied to adjust the used protocols. In the period of this work a complete establishment

was not achieved. Thus no precise results about the effect of the alkaloids on the cytoskeleton

can be presented, but this study demonstrates some basic principles of the interaction of

alkaloids with the cytoskeleton.


Iris Hövel

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Einleitung

Cytotoxizität Cytotoxische Substanzen beeinflussen verschiedene überlebenswichtige Mechanismen sowie

Strukturen einer Zelle. Die Hemmung der Zellteilung, Proteinsynthese oder Energie-

gewinnung aber auch eine Störung des Ionenhaushalts führen zum Absterben der Zelle durch

Apoptose. Dieser programmierte Zelltod wird von der Zelle durch Signalkaskaden selbst

eingeleitet, wenn die Schäden durch die cytotoxische Substanz irreparabel sind. Cytostatische

Stoffe hemmen das Wachstum und die Vermehrung von Zellen. Langfristig wirken cyto-

statische Substanzen ebenfalls cytotoxisch, da der Stillstand des Zellzyklus ebenfalls über

bestimmte Signalkaskaden zum Zelltod durch Apoptose führt (Wink, 2004). In Abbildung 1

sind mögliche Wirkorte für cytotoxische Substanzen zu sehen und die in der vorliegenden

Arbeit verwendeten cytotoxischen Naturstoffe ihrem Target innerhalb des Cytoskelett

zugeordnet.

Chromatin

ER

Ribosomen

Mitochondrium

Kanal

Transporter

Rezeptor

Signalkaskade

Peroxisome Lysosome

Vesikel

Golgi-Apparat

Nucleulus

IntermediärfilamenteMikrotubuli Noscapin, Paclitaxel, Sanguinarin, Vinblastin

Aktinfilamente Phalloidin

Abbildung 1 Mögliche Targets für cytotoxische Substanzen in einer tierischen Zelle (nach Alberts et al., 2002). Die Störung von Strukturen und Mechanismen führt zum Absterben der Zellen. Unter anderem sind die Bestandteile des Cytoskeletts Aktin-, Intermediärfilamente und Mikrotubuli ein Angriffspunkt, wobei hier die jeweiligen getesteten cytotoxischen Substanzen angegeben sind.


Iris Hövel

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Die Cytotoxizität von Naturstoffen kann in der Medizin genutzt werden. So ist eine Hem-

mung des Wachstums von Tumoren durch den cytotoxischen oder cytostatischen Effekt

dieser Substanzen auf Tumorzellen ein Ansatz in der Krebstherapie.

Cytoskelett Ein Target von cytotoxischen oder cytostatischen Substanzen ist das Cytoskelett von euka-

ryotischen Zellen. Dies besteht aus einem dynamischen Proteinnetzwerk, bei dem zwischen

Aktinfilamenten, Intermediärfilameten und Mikrotubuli unterschieden wird.

Aktinfilamente sind Polymere des globulären Aktins. Im Zentrum des Monomers ist ein ATP-

Molekül gebunden, welches die Energie für die Polymerisation zu helikal aufgebauten Aktin-

filamenten bereitstellt (Abbildung 2, Seite 8). Die Filamente verfügen über ein Plusende, an

dem sie vorwiegend verlängert, und ein Minusende, an dem sie vorwiegend verkürzt werden

können. So kommt es auch zur Ausbildung von höheren Faserstrukturen und Netzwerken. Sie

bestimmen die Zellform und ermöglichen Zellbewegung.

Intermediärfilamente entstehen durch spezifische Zusammenlagerung eines kurzen Poly-

petids. Die mittigen α-Helices zweier Monomere sind verdrillt, zwei solche Dimere lagern

sich versetzt zu einem Tetramer zusammen und über die Interaktion der N- und C-terminalen

Regionen anderer Tetramere kommt es zur Ausbildung von Filamenten (Abbildung 3, Seite

8). Intermediärfilamente sind fest mit der Cytoplasmamembran verankert und dienen haupt-

sächlich der Stabilisierung der Zelle.

Mikrotubuli sind Polymere von Tubulindimeren aus α- und β-Tubulin. Unter Spaltung von

GTP lagern sich viele gleich orientiert Tubulinheterodimere zu Protofilamenten zusammen,

die jeweils mit einem α-Tubulin am Minusende und β-Tubulin am Plusende abschließen.

Wiederum 13 lineare Protofilamente bilden eines Mikrotubulus in Form einer hohlen Röhre

(Abbildung 4, Seite 8). Mikrotubuli sind in den intrazellulären Vesikeltransport involviert und

bilden während Mitose und Meiose den Spindelapparat aus, welcher an den Centromer der

kondensierten Chromosomen bindet und diese in die neuen Tochterzellen zieht (Alberts et al.,

2002; Wink, 2004).


Iris Hövel

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Abbildung 2 Sekundärstruktur des glo-bulären Aktins (links) und Modell eines Aktinfilaments (rechts). Im Zentrum des Aktinmonomers wird ein ATP Molekül gebunden, welches durch Spaltung zum ADP die Energie für eine Polymerisie-rung zu helikal strukturierten Aktinfilamenten bereitstellt. Die Filamente können dyna-misch verlängert (vorwiegend am Plus-Ende) bzw. verkürzt (vorwiegend am Minus-Ende) werden und auch höhere Faserstrukturen ausbilden (verändert nach Alberts et al., 2002).

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Abbildung 4 Sekundärstruktur des Tu-bulinheterodimer (links), Modell eines Protofilaments (mitte) und eines Mikrotu-bulus (rechts). Jeder α- und β-Tubulinmonomer bindet ein GTP-Molekül (rot darges-tellt). Viele gleich orientierte Tubulindimere bilden unter GTP-Verbrauch Protofila-mente. 13 Protofilamente bilden eine hohle Röhre, den sogenannten Mikrotubulus (verändert nach Alberts et al., 2002).

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Abbildung 3 Monomer, Dimer, Tetramer und 2 Tetramere (von oben nach unten) des Polypeptids zur Bildung der Intermedi-ärfilamente. Die mittigen α-Helices zweier Monomere sind beim Dimer verdrillt. Zwei Dimere lagern sich versetzt zu Tetrameren zu-sammen. Über Interaktionen der N- und C- terminalen Regionen anderer Tetramere kommt es zur Ausbildung von Intermediärfilamenten (verän-dert nach Alberts et al., 2002).

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Alkaloide In dieser Arbeit wurde die Cytotoxizität der Substanzen Noscapin, Paclitaxel (Taxol),

Phalloidin, Sanguinarin und Vinblastin untersucht, welche der vielfältigen Gruppe der

Alkaloide angehören und auf das Cytoskelett von eukaryotischen Zellen wirken. Die

qualitative Wirkung auf die Aktinfilamente und die Mikrotubuli sollte durch ein Cytostaining

nachgewiesen werden. In Abbildung 1 (Seite 6) sind die Substanzen den Teilen des Cyto-

skeletts zugeordnet, auf die sie eine wissenschaftlich nachgewiesene Wirkung haben. Ihre

Strukturformeln sind in Abbildung 5 zu sehen. Die wichtigsten Eigenschaften der Substanzen

wie Herkunftsorganismus, Wirkung und Anwendung sind in

Tabelle 1 (Seite 10) zusammen-gefasst.

Noscapin (31411)

Sanguinarin (5154)

Vinblastin (13342)

Phalloidin (4752)

Paclitaxel (36314)

Abbildung 5 Strukturformeln der verwendeten Alkaloi de Noscapin, Paclitaxel, Phalloidin, Sanguinarin und Vinblastin (URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pcsubstance). Die stickstoffhaltigen Naturstoffe zeichnen sich durch ihre hohe strukturelle Diversität aus. In Klammern sind die Compound ID Nummern zu PubChem Substances angegeben.

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Tabelle 1 Übersicht zu den Alkaloiden, welche zu ihrem Einfluss auf das Cytoskelett von COS-7 Zellen untersucht werden sollen.

Substanz Herkunft Übergruppe Wirkung Anwendung Quellen

Noscapin Papaver somniferum

Opiumalkaloide, Isoquinoline

• Tubulin-Bindung • Inhibition der Zusammenlagerung von

Mikrotubuli • Induktion von Polyploidie

• Antitussiv • Studien zu NSCLC

Landen, et al., 2002; Lüllmann et al., 2006; Roth et al., 1994

Paclitaxel Taxus brevifolia

Taxane • Aktivierung der Tubulin-Polymerisation bzw. Inhibition der Depolymerisation

• Ovarial-/ Mammakarzinome

• Maligne Melanome • NSCLC

Lüllmann et al., 2006; Rowinsky et al., 1990

Phalloidin Amanita phalloides

Phallotoxine • Stabilsierung von Aktinfilamenten • Inhibition der Aktindepolymerisation • Inhibition von Zellbewegung

• Aktinstabilisation und -Markierung

Cooper, 1987; Katsaros et al., 2006; Wink, 2007b

Sanguinarin Sanguinarius canadensis

Benzophenan-thridinalkaloide

• Mikrotubulidepolymerisation • DNA Interkalation und Schädigung • Apoptotisch durch Aktivierung von

nF-κB, Schädigung der Mitochondien, Zellzyklusarrest.

• Interaktion mit Na/K-ATPase

• Antimikrobiell in Zahnpflegeprodukten gegen Plaque und Zahnfleischentzündung

Eley, 1999; Hu et al., 2005; Malikova et al., 2006; Matkar et al., 2008; Wolff & Knipling, 1993

Vinblastin Vinca rosea Heterodimere Monoterpen-Indolalkaloide

• Inhibition der Sulfidbrücken zwischen Tubulin-Untereinheiten

• Bildung Spiralförmiger Filamente mit Tubulin

• Hemmung des Mikrotubuli-Aufbaus • DNA Interkalation

• Akute Leukämie • Maligne Lymphome • Bronchial-/

Mammakarzinome

Lobert et al., 2000; Lüllmann et al., 2006; Roth et al., 1994; Verdier-Pinard et al., 1999; Wink, 2007b


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Abbildung 6 Strukturformeln von MTT (Compound ID 90059, links) und MTT Formazan (Compound ID 16218671, rechts). In lebenden Zellen wird der Tetrazolium Ring von zugefügtem MTT von der mitochon-drialen Dehydrogenase gespalten. Das Reaktionsprodukt MTT Formazan ist dunkelblau gefärbt (URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ sites/entrez?db=pcsubstance).

Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Naturstoffe gehören der Gruppe der Alkaloide

an. Die strukturelle Gemeinsamkeit der Alkaloide ist ein meist heterocyclisch gebundenes

Stickstoffatom. Sie stellen mit 21000 bekannten Strukturen die größte Gruppe von Sekundär-

stoffen dar, welche von Pflanzen, aber auch von Pilzen, sessilen Tieren und Bakterien

gebildet werden. Diese Stoffe sind im Gegensatz zu Primärstoffen für den produzierenden

Organismus nicht überlebenswichtig, erhöhen aber ihre ökologische Fitness, was einen Vor-

teil gegenüber konkurrierenden Organismen darstellt. Sekundärstoffe dienen der Abwehr von

Herbivoren bzw. Räubern oder Bakterien, Pilzen oder Viren, aber auch zur Anziehung von

Insekten zur Bestäubung, als UV-Schutz und Stickstoffspeicher. Die biologische Aktivität

von Abwehrstoffen, wie den Alkaloiden, ist auf eine Interaktion mit molekularen Targets

zurückzuführend, welche toxisch oder teratogen wirkt. Innerhalb des Organismus ist die

Anreicherung der Alkaloide unterschiedlich. So sind zur Abwehr besonders Oberflächen und

Reproduktionsgewebe wie Samen oder Blüten geschützt (Roth et al., 1994; Wink, 2007a).

Auf den menschlichen Organismus wirken Alkaloide bereits in kleinen Dosen auf sehr unter-

schiedliche und auch gegensätzliche Weise wie zum Beispiel beruhigend und anregend,

gefäßverengend und –erweiternd, krampflösend, schmerzbetäubend und auch euphorisierend

und halluzinogen (Breitmaier, 2008).

Cytotoxizitäts-Assay Um die Cytotoxizität der Alkaloide Noscapin, Paclitaxel, Phalloidin, Sanguinarin und

Vinblastin quantitativ messbar zu machen, wird der Farbstoff MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-

2-yl)-2,5-diphenyl Tetrazolium Bromid) in einem Zellkultur-Assay eingesetzt. Die Tetrazo-

lium Ringe des in Lösung gelben MTT werden in lebenden Zellen von mitochondrialen

Dehydrogenasen gespalten. Dies führt zur Bildung von dunkelblauen Formazan-Kristallen,

welche sich in den lebenden Zellen anreichern (Abbildung 6). Die Zahl der lebenden Zellen

ist proportional zur Menge des produzierten Formazans. Die Bestimmung der Absorption

durch gebildetes Formazan macht die Cytotoxizität einer Substanz, welche auf die Zellen

gewirkt hat, messbar (Mosmann, 1983).


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Abs

orpt

ion E

mission

Schwingungs- relaxation

A

G

Abbildung 7 Jablonski-Diagramm zur Fluoreszenz. Die Energie von Photonen (dunkelblau) wird durch einen Fluo-rophor absorbiert. Dabei werden Elektronen vom Grundzu-stand G in einen angeregten Zustand A angehoben. Fallen die Elektronen wieder zurück in den Grundzustand, wird die frei werdende Energie wieder in Form von Photonen (dunkelgrün) abgegeben. Durch Schwingungsrelaxation im angeregten Zustand geht Energie verloren. So sind die emittierten Photonen energieärmer (langwelliger) als die absorbierten Photonen.

Cytostaining Zur Messung der qualitativen Wirkung der Alkaloide auf das Cytoskelett werden Cyto-

stainings durchgeführt. Dabei wird das mögliche Target des Alkaloids indirekt mit einem

Fluoreszenzfarbstoff markiert.

Bei Fluoreszenzfarbstoffen handelt es sich um

Moleküle mit konjugierten Doppelbindungen

wie zum Beispiel aromatischen Ringsystemen.

Bei Energiezufuhr durch Licht werden de-

lokalisierte π-Elektronen auf ein höheres

Energieniveau angeregt und fallen unmittelbar

in ihr Grundniveau zurück, wobei die dabei

frei-werdende Energie wieder als Licht ausge-

sendet wird (Abbildung 7). Durch Schwing-

ungsrelaxation im angeregten Zustand ist die

Energieportion, welche bei Einstellung des

Grundzustands frei wird, immer kleiner als die

zur Anregung eingesetzte Portion. So hat das

emittierte Licht eine längere Wellenlänge als

das absorbierte, was eine gezielte Detektion

der Emission möglich macht. Jeder Fluores-

zenzfarbstoff hat entsprechend seiner Molekül-

orbitale ein spezifisches Anregungs- und Emis-

sionsspektrum (Abbildung 8), wobei die

Wellenlängen der maximalen Anregung und

maximalen Emission um den so genannten

Stokesshift verschoben sind (Alberts et al.,

2002; Atkins & De Paula, 2008).

Bei der eingesetzten Fluoreszenzmikroskopie

wird ein Fluoreszenzfarbstoff durch einen Laser mittels spezifischer diskreter Wellenlänge

angeregt. So ist im Mikroskopiebild nicht die markierte Struktur, sondern das Licht sichtbar,

welches vom gleich lokalisierten Farbstoff ausgesendet wird.

Wellenlänge [nm]400

Inte

nsitä

t

500 600 700

Abbildung 8 Anregungs- (blau) und Emissionsspektrum (grün) eines Fluoreszenzfarbstoffes. Durch Energie-zufuhr in Form von Photonen mit einer Wellenlänge aus dem Anregungsspektrum werden Elektronen angeregt. Sie fallen wieder auf ihr Grundniveau zurück und emittieren die frei werdende Energie wieder in Form von Photonen. Durch Schwingungsrelaxation im angeregten Zustand geht Energie verloren, was zu einer Verschiebung der Wellenlänge von maximaler Absorption und Emission, dem so genannten Stokes Shift (rot), führt.


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Um eine spezifische Bildung des Farbstoffs an das Target zu gewährleisten, werden sie

indirekt über Adaptermoleküle gebunden.

Zur Markierung von Aktinfilamenten wird Phalloidin-Fluoresceinisothiocyanat (Phalloidin-

FITC) verwendet, wobei das „small molecule“ Phalloidin spezifisch an das Aktin bindet

(Wulf et al., 1979).

Mikrotubuli werden mit Hilfe von Immunofluoreszenz mar-

kiert. Ein Antikörper, ein Protein mit Antigenbindedomäne,

bindet spezifisch an ein gewünschtes Target / Oberflächen-

protein (α-Tubulin) und ein zweiter Antikörper wiederum

spezifisch an ersten Antikörper (Abbildung 9). Über die

Kopplung des zweiten Antikörpers mit einem Fluores-

zenzfarbstoffs wird die markierte Struktur, hier die Mikro-

tubuli, mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht

(Janeway et al., 2002). Zur Verstärkung des Signals sind

auch Systeme möglich, bei denen der erste Antikörper

durch mehrere Antikörper des zweiten Typs erkannt wird

(Alberts et al., 2002).

Zur Markierung von Nukleinsäuren kann das fluoreszierende Propidiumiodid genutzt werden,

welches in doppelsträngige DNA interkaliert (Hudson et al., 1969). Bei Zugabe von RNase A

wird einzelsträngige RNA abgebaut, so dass Propidiumiodid nicht in zufällig zu Doppel-

stängen zusammengelagerter RNA im Cytosol interkaliert. Durch die Transkription ist vor

dem Verdau auch im Zellkern RNA lokalisiert, was zu dunklen Flecken im fluoreszenz-

markierten Zellkern führt (Burrell, 1993). Das Anfärben des Zellkerns dient sowohl der

Lokalisierung und Unterscheidung einzelner Zellen, als auch der Erkennung von cyto-

toxischen Effekten und Apoptose.

Abbildung 9 Modell einer indirekten Immunofluoreszenz. Ein für das Target spezifisches Antigen (rot) bindet einen Antikörper (dunkelblau), der wiederum von einem zweiten Antikörper (hellblau) erkannt wird. Bei Markierung des zweiten Antikörpers mit einem Fluoreszenz-farbstoff (grün) kann das Target mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie visualisiert werden.


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Material und Methoden

Material

Lösungen 10x Phosphate buffer saline (PBS-Puffer)

80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4 und 2,4 g KH2PO4 wurden in 800 ml destilliertem H2O

gelöst. Die Lösung wurde mit HCl auf einen pH von 7,4 eingestellt, mit destilliertem H2O auf

1 l aufgefüllt und autoklaviert. Der Puffer wurde bei 4 °C gelagert und bei Bedarf 1:10 mit

destilliertem H2O verdünnt. Der 1x Puffer wurde ebenfalls autoklaviert und anschließend bei

4 °C gelagert.

0,2 M Tris-HCl Puffer

24,2 g Tris(hydroxymethyl)-aminomethan („Tris“) werden in 800 ml demineralisiertem H2O

gelöst. Die Lösung wird mit HCl auf einen pH von 8,5 eingestellt, mit destilliertem H2O auf 1

l aufgefüllt, autoklaviert und anschließend bei 4 °C gelagert.

Mowiol Lösung

2,4 g Mowiol werden unter Rühren bei Raumtemperatur für eine Stunde in 6 g Glycerin

gelöst. Es werden 6 ml destilliertes H2O zugebenen und es wird eine weitere Stunde gerührt,

bevor die Lösung mit 12 ml 0,2 M Tris-HCl (pH 8,5) vermischt wird. Während einer zwei-

stündigen Inkubation bei 50 °C wird alle 20 Minuten für 2 Minuten die Mischung gerührt.

Sollte sich das Mowiol nicht vollständig lösen, wird die Lösung für 15 Minuten bei 5000g

zentrifugiert und der Überstand weiterverwendet. Anschließend wird in einer Konzentration

von 25 mg/ml DABCO dazugegeben. Die klare Lösung wird in Mikrotubes aliquotiert und

bei -20 °C gelagert.


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Die zu untersuchenden Substanzen wurden gemäß den Herstellerangaben in Dimethylsulfoxid

(DMSO), Methanol oder destilliertem Wasser gelöst (Tabelle 2).

Tabelle 2 Zu untersuchende Substanzen mit Angaben zu Herstellers, Reinheit, Lösungsmittel, Molarität der Lösung und Lagerungstemperatur.

Substanzen (Reinheit) Hersteller Lösungsmittel Molarität

Lagerungs-temperatur

Noscapin (97%) Aldrich

H2O, pH 4 (eingestellt mit HCl)

121 mM + 4 °C

DMSO 178 mM

Paclitaxel ALEXIS Biochemicals

DMSO 59 mM - 20 °C

Phalloidin Sigma DMSO 13 mM + 4 °C

Sanguinarin Trans MIT Methanol 50 mM - 20 °C

Vinblastinsulfat ALEXIS Biochemicals

DMSO 55 mM - 20 °C

Medium Ergänztes Dulbecco’s Modified Eagle’s medium („DMEM+“)

500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s medium wurden mit 50 ml inaktiviertem fetalem

bovinen Serum (iFBS) und 5 ml Streptavidin/Penicillin versetzt und bei 4 °C gelagert. FBS

wird dafür für 30 Minuten auf 45 °C erhitzt und anschließend sterilfiltriert.

Ergänztes Dulbecco’s Modified Eagle’s medium für HeLa Zellen („DMEM+H“)

500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s medium wurden mit 50 ml inaktiviertem fetalem

bovinen Serum (iFBS), 5 ml Streptavidin/Penicillin und 5 ml NEAA (nicht essentielle

Aminosäuren) versetzt und bei 4 °C gelagert.

Chemikalien und Ausstattung

Chemikalien Hersteller Zusätzliche Beschreibung

DABCO Roth Dimethylsulfoxid (DMSO) J. T. Baker di-Natriumhydrogenphosphat, wasserfrei

Merck

Ethanol J. T. Baker Glycerin Sigma HiPerSolv Wasser VWR Kaliumchlorid Merck Kaliumhydrogenphosphat Merck


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Methanol Chemikalienlager Mowiol 4-88 (Polyvinyl-Alkohol)

Roth

MTT (98%) Sigma 5 mg/ml gelöst in PBS, sterilfiltriert

Natriumchlorid AppliChem Salzsäure (HCl) Carlo Erba Reagents 37% Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

Sigma

Geräte

Fluoreszenzmikroskop Leica Heizblock Thermolyne Corp.

Inkubator New Brunswick Scientific

37 °C, 5% CO2

Magnetrührer Heidolph MR3001K Mikroskop Leica Microsystems DM IRE2 Mikroskop Nikon TMS

Pipettierhilfe Hirschmann Laborgeräte

Plate Reader BioTek ELx808 Rüttler IKA Sterilbank Holten LaminAir Sterilbank danLAF® VFR 1206 Trockenschrank Heraeus Instruments 55 °C, 180 °C

Vakuumpumpe Büchi Vakuum System

B168

Vakuumpumpe Vacuubrand GmbH Vortex Heidolph REAX top Wasserbad Julabo

Zentrifuge BHG Hermle

Zellkultur

8-Kanal-Pipette Gilson 200 µl 8-Kanal-Pipette Abimed ht 300 µl Deckgläschen Menzel Glas 20x26x0,4 mm Deep-Well-Platten Ritter riplate 96 wells (je 2,5 ml)

Fetales Bovines Serum (FBS) PAA Standard Quality EU approved inaktiviert bei 45 °C für 30 min, sterilfiltriert

Glaswaren Schott Laborflaschen (0,5 l, 1 l) Handschuhe Harmann Peha-soft satin Kulturflaschen Greiner BioOne 75 cm² Medium GIBCO DMEM + Glustax MEM NEAA (Non essential GIBCO


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amino acids) Mikrotitterplatten Greiner bio-one 96-Well-Platte Mikrotubes Eppendorf 1,5 ml, 2 ml Neubauer Zählkammer Optik Labor 0,100 mm Tiefe, 0,0025 mm² Pasteurpipetten Roth 230 mm Penicillin/Streptomycin GIBCO 10000 units/ml bzw. 10000 µg/ml Pipetten Greiner BioOne 5 ml, 10 ml Pipetten Sarstedt 25 ml Pipetten Gilson 10 µl, 200 µl, 1000µl Pipetten HTL 20 µl Pipettenspitzen Greiner 1 µl Pipettenspitzen Fisher Scientific 300 µl Pipettenspitzen Sarstedt 200 µl, 1000 µl Trypsin-EDTA GIBCO 0,05% Trypsin Tubes Greiner 15 ml, 50 ml

Cytostaining

Deckgläschen, quadratisch Menzel 15*15 mm, h=180 µmDeckgläschen, rund Menzel Ø 25 mm, h=150 µm Filterpapier Sartorius Paper Sheets 75 g/m² FITC (Fluorescein-isothiocyanat Isomer I)

Sigma

Goat anti-mouse IgM-FITC Santa Cruz Biotechnology

200 µg/0,5 ml

Immersionsöl Olympus n=1,516 bei 23 °C Mikrotiterplatten Greiner bio-one 6-Well-Platte Mouse anti-α-tubulin monoclonal IgG

Santa Cruz Biotechnology

200 µg/ml

Parafilm American National Can TM

M

Petrischalen Corning 100 * 10 mm PFA (Paraformaldehyd) Sigma 4% in PBS Phalloidin-Fluoresceinisothiocyanat

Sigma

Pinzette Fa. Roth Pinzette rubis Switzerland Propidiumiodid Sigma RNase A from bovine pancreas

Sigma

Triton X-100 Fluka Tween-20 ICN Biomedicals Inc.


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� �

Methoden

Zellkultur Die Untersuchungen zu den genutzten Alkaloide wurden an einer COS-7 Zelllinie (freund-

licherweise zur Verfügung gestellt durch Dorothea Kaufmann, AG Wink, IPMB, Universität

Heidelberg) durchgeführt. Dabei handelt es sich um eine Zelllinie von Fibroblasten aus der

Niere von grünen Meerkatzen (Cercopithecus aethiops) (Kit et al., 1967; Gluzman, 1981).

Die Zellen wurden in DMEM+ bei 37 °C und 5% CO2 in einer 75 cm² Kulturflasche kultiviert

und bei einer Konfluenz von ca. 80% geteilt. Dafür wurde das verbrauchte Medium abgesaugt

und die am Boden der Kulturflasche adhärierten Zellen nach einem Waschschritt mit 2 ml

PBS-Puffer mit 2,5 ml Trypsin-EDTA vom Boden gelöst. Beide Lösungen sind vor Gebrauch

im Wasserbad auf 37 °C erwärmt worden. Nach einer Inkubation von ca. 3 Minuten bei 37 °C

wurden 10 ml 37 °C warmes DMEM+ ergänzt. 2 ml der Suspension wurden mit 10 ml

DMEM+ gemischt und in die leere Kulturflasche zurückgeführt. Die Kulturflasche wurde bei

37 °C und 5% CO2 gelagert, bis wieder eine Konfluenz von ca. 80% erreicht wurde.

Für einzelne Versuche wurden andere Zelllinien verwendet. Die Fibroblasten Zelllinie C127

atcc (freundlicherweise zur Verfügung gestellt durch AG Müller, ATV, DKFZ Heidelberg)

stammt ursprünglich aus einem Mammakarzinom einer Maus (Lowy et al., 1978). Diese

C127 Zellen wurden wie COS-7 Zellen kultiviert.

Bei der HeLa-Zelllinie (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Florian Herrmann, AG

Wink, IPMB, Universität Heidelberg) handelt es sich um Zellen aus einem Cervixkarzinom

der 1951 verstorbenen Patientin Henrietta Lacks (Scherer et al., 1953). Diese Zelllinie wurde

in DMEM+H Medium kultiviert. Zur Lösung der adhärenten Zellen von der Kulturflasche

waren in diesem Fall 4 ml Trypsin-EDTA und eine Inkubation von fünf Minuten bei 37 °C

nötig.

MTT-Assay Bei Teilung der COS-7 Zellen wurde die ungenutzte Zellsupension in ein 15 ml Tube über-

führt und für 2 Minuten bei Raumtemperatur und 2800 rpm zentrifugiert. Der Flüssigkeits-

überstand wurde abgesaugt und die so von Trypsin getrennten Zellen wurden in 10 ml

Medium resuspendiert.

10 µl der Suspension wurden in eine Neubauerzählkammer eingefüllt und die Zellen inner-

halb mehrerer Quadrate mit Hilfe eines Lichtmikroskops ausgezählt. Über die mittlere


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� �

300 µl DMEM+

300 µl DMEM+

300 µl DMEM+

300 µl DMEM+

300 µl DMEM+

300 µl DMEM+

300 µl DMEM+

300 µl DMEM+

300 µl DMEM+

600 µl DMEM+

Sanguinarin-lösung (5

II 29 µM

III 14,5 µM

IV 7,25 µM

V 3,63 µM

VI 1,81 µM

VII 0,91 µM

VIII 0,45 µM

IX 0,23 µM

X 0,11 µM

I 58 µM

300 µl 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl

7 µl

Zellzahl �� konnte mit folgender Formel das benötigte Volumen der Zellsuspension VS für eine

Verdünnung mit einer Zellzahl von 105 pro ml berechnet werden: ��

�·

��·�� (1)

wobei das berechnete Volumen Zellsuspension mit Medium auf das Gesamtvolumen V aufge-

füllt wurde.

Pro zu untersuchende Substanz wurden in 10 Wells von vier Reihen (B-E) einer 96-Well-

Mikrotiterplatte je 100 µl der Zellsuspension pipettiert und einen Tag bei 37 °C und 5% CO2

inkubiert. Anhand von vorangegangenen Ergebnissen (Hövel, 2009) wurden die IC50 Werte

zur Hemmung des Zellwachstums durch die jeweilige Substanz eingeschätzt.

Pro Substanz wurden 10 Verdünnungen mit DMEM+ erstellt, welche 24 Stunden auf die

Zellen wirken sollten. Dabei entspricht die erste Verdünnungsstufe dem Zweifachen des

geschätzten IC50 Wert. Von dieser Verdünnung aus wurden in 1:1-Verdünnungsschritten mit

DMEM+ die weiteren neun Verdünnungen erstellt. Folgend ist ein entsprechendes Ver-

dünnungsschema (Abbildung 10) beispielhaft für Sanguinarin dargestellt.

Dabei wurde das aufgeführte Volumen DMEM+ Medium in einer Reihe einer Deep-Well-

Platte vorgelegt und in das erste Well wurde das Volumen einer Substanz-Verdünnung oder -

Stocklösung ergänzt, um die gewünschte Molarität zu erreichen. Anschließend wurde die

Substanz weiterverdünnt, indem schrittweise 300 µl einer Verdünnung in das nächste Well

überführt wurden. Im Laufe der Experimente wurden die Substanzkonzentrationen ent-

sprechend der jeweiligen Ergebnisse angepasst und gegebenenfalls auch das Verdünnungs-

schema modifiziert, um relevante Konzentrationsbereiche abzudecken. So wurden z.B. 1:1-

Verdünnungen durch 1:10-Verdünnungen ersetzt, um ein größeres Spektrum an Substanz-

konzentration zu erreichen.

Abbildung 10 Schema zur Erstellung der Substanzverdünnungen für die Überprüfung der Cytotoxizität mittels MTT-Assay. Die Lösung des jeweiligen Alkaloids (hier Sanguinarin) wird mit DMEM+ weiterverdünnt und jede Verdünnung wird in drei Wells einer 96-Well-Platte mit COS-7 Zellen pipettiert, um anhand eines Vergleichs mit unbeeinflussten Zellen den Grad der Wachtumshemmung durch die jeweilige Substanz-Molarität zu bestimmen.


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� �

A

B

C

D

E

F

G

H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Abbildung 11 Schema zur Belegung einer 96-Well-Platte für ein MTT-Assay. In vier Reihen mit je 10 Wells werden COS-7 Zellen gesät (hier schwarze Punkte). Nach 24 h Inkubation werden in die Reihen B-D und Reihe F ohne Zellen die erstellten Substanzverdünnungen pipettiert (pink). In Reihe E mit Zellen und Reihe G ohne Zellen wird Medium ohne Substanz pipettiert (rot).

A

B

C

D

E

F

G

H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Von den einen Tag zuvor gesäten Zellen wurde das verbrauchte Medium abgesaugt. In den

Reihen B, C und D mit Zellen wurden je 70 µl der zehn Substanzverdünnungen und in die

vierte Reihe E als Referenz 70 µl Medium pipettiert. Als Substanz- und Mediums-Kontrolle

wurde zusätzlich je eine Reihe mit zehn

Wells ohne Zellen à 70 µl Substanz-

verdünnungen (Reihe F) bzw. DMEM+

(Reihe G) angelegt (Abbildung 11).

In vorangegangenen Experimenten konnte

der minimale Volumenanteil des Lösungs-

mittels DMSO im DMEM+ Mediums

ermittelt werden, bei dem ein cytotoxischer

Effekt durch das Lösungsmittel auftritt.

Falls keine geeignete Substanzverdünnung

zur Verfügung stand, muss dieser Volumen-

anteil aber überschritten werden, um die

Cytotoxizität der Substanz zu ermitteln. In

diesem Fall musste eine Lösungsmittel-

kontrolle angelegt werden, um zwischen der

Toxizität der Substanz und des Lösungs-

mittels zu unterscheiden. Es wurden für ein

Assay fünf Reihen Zellen gesät. Am nächten

Tag wurden in Reihe B, C und D 70 µl der

Substanzverdünnungen, in Reihe E ent-

sprechende DMSO-Verdünnungen und in

Reihe F Medium als Referenz pipettiert. Die

Substanz- und Mediums-Kontrollen ver-

schoben sich auf Reihe G und H (Abbildung

12).

Nach weiteren 24 bzw. 48 Stunden der Inkubation bei 37 °C und 5% CO2 wurden Substanz-

verdünnungen bzw. Medium abgesaugt und pro Well 50 µl einer 1:1 Verdünnung der MTT-

Stammlösung mit DMEM+ Medium zugefügt. Die Platten wurden bei 37 °C und 5% CO2 für

drei Stunden inkubiert. Anschließend wurden pro Well 200 µl DMSO zugefügt, um das

Abbildung 12 Schema zur Belegung einer 96-Well-Platte für ein MTT-Assay. In fünf Reihen mit je 10 Wells werden COS-7 Zellen gesät (hier schwarze Punkte). Nach 24 h Inkubation werden in Reihe B-D und Reihe G ohne Zellen die erstellten Substanzverdünnungen pipettiert (pink). In Reihe E werden entsprechende Lösungs-mittelverdünnungen zur Kontrolle der eigenen Toxizität zugefügt (blau). In Reihe F und Reihe H ohne Zellen wird Medium ohne Substanz pipettiert (rot).


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gebildete Formazan zu lösen. Nach einer Inkubationszeit von ca. 15 Minuten bei Raumtempe-

ratur und 5 Minuten rütteln bei 600 rpm wurde die Absorption durch das Formazan bei 570

nm mit einem ELISA PlateReader unter Nutzung der Software Gen5TM gemessen. Mit Micro-

soft Excel wurden die Absorptionswerte ausgewertet und die Über-lebensrate gegen die

Konzentration der jeweiligen Substanz aufgetragen. Aus im Idealfall sigmodial verlaufenden

Kurven wurden mit SigmaPlot 10.0 die IC50 Werte zu den jeweiligen Substanzen ermittelt.

Für einzelne Versuche wurden HeLa Zellen auf gleiche Weise behandelt, wobei gegebenen-

falls DMEM+H Medium verwendet wird.

Zellen anfärben

In die Vertiefungen einer 6-Well-Platte wurden 0,18 mm hohe Deckgläschen platziert, bevor

2 ml COS-7 Zellsuspension in einer Konzentration von 105 Zellen/ml darauf pipettiert wur-

den. Nach einer Inkubation von 24 h bei 37 °C und 5% CO2 wurde das verbrauchte Medium

entfernt und gegen 1 ml einer geeigneten Substanzverdünnung in DMEM+ Medium oder

pures Medium als Referenz ersetzt. Nach weiteren 24 h Inkubation bei 37 °C und 5% CO2

wurden die Zellen zweimal in je 1 ml warmem PBS pro Well 5 Minuten bei Raumtemperatur

gewaschen. Mit 1 ml PFA (4 °C) oder Methanol (-20 °C) pro Well wurden die Zellen 20

Minuten fixiert. Anschließend wird erneut mit 1 ml PBS für 5 Minuten bei Raumtemperatur

und 100 rpm auf dem Rüttler gewaschen. In eine neue 6-Well-Platte wurden je 1 ml PBS vor-

gelegt und die Deckgläschen in diese Platte überführt, in der ebenfalls 5 Minuten bei 100 rpm

gewaschen wurde.

Für die Aktin-Färbung wurde ein Parafilm auf ebenem Untergrund fixiert und pro Deckgläs-

chen wurden 50 µl der FITC-Lösung oder FITC-Phalloidin-Lösung auf den Film pipettiert.

Die Deckgläschen wurden mit der Zellschicht auf den Tropfen gelegt und lichtgeschützt für

30 Minuten bei Raumtemperatur verwahrt. Ab diesem Schritt wurden die Präparate möglichst

durchgehend vor Licht geschützt, um ein Ausbleichen des Fluoreszenzfarbstoffes zu vermei-

den. Anschließend wurden die Deckgläschen mehrmals in PBS getaucht, mit der Zellschicht

nach oben wieder in die 6-Well-Platte überführt und zwei mal für 5 Minuten bei 100 rpm in

PBS gewaschen. Auf einen zweiten Parafilm wurden pro Deckgläschen 50 µl der 1:100 Ver-

dünnung der PI-RNase A Mischung pipettiert, die Deckgläschen wurden mit der Zellschicht

nach unten auf die Tropfen gelegt und es wurde erneut für 30 Minuten bei Raumtemperatur

unter Lichtausschluss inkubiert. Die Deckgläschen wurden wieder in PBS getaucht, mit der

Zellschicht nach oben in die Wells zurück gelegt und erneut zwei mal für 5 Minuten und 100


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rpm in PBS gewaschen. Auf runde Deckgläschen wurde Mowiol pipettiert und die Deckgläs-

chen mit der Zellschicht nach unten auf das Mowiol gelegt. Bei Raumtemperatur und unter

Lichtausschluss wurden die Präparate für mindestens 48 Stunden getrocknet.

Für die Mikrotubuli-Färbung wurden die Zellen nach der Fixierung durch PFA ebenfalls

zweimal mit PBS bei 100 rpm 5 Minuten gewaschen und anschließend 10 Minuten mit je 1

ml 0,3% Triton X in PBS permeabilisiert. Danach wurde dreimal mit PBS gewaschen und mit

je 1 ml 5% iFBS in PBS für 1 Stunde unter Lichtausschluss bei Raumtemperatur blockiert.

Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden die Deckgläschen auf Tropfen einer 1:200

Verdünnung des 1. Antikörpers (Mouse anti-α-tubulin monoclonal IgG) für eine Stunde in

einer Feuchtkammer unter Lichtausschluss inkubiert. Nach erneutem dreimaligen Waschen

mit PBS in der 6-Well-Platte wurden die Deckgläschen auf Tropfen einer 1:200 Verdünnung

des 2. Antikörpers (Goat anti-mouse IgM-FITC) für 1 Stunde in einer Feuchtkammer unter

Lichtausschluss inkubiert. Anschließend wurden die Deckgläschen wieder in die 6-Well-

Platte überführt und dreimal mit PBS für fünf Minuten bei 100 rpm gewaschen. Auch hier

wurde unnötiger Lichtkontakt vermieden, welcher zum Ausbleichen des Farbstoffes führen

würde. Auf einen Parafilm wurden je 50 µl 1:100 Verdünnung Propidiumiodid-RNAse pipet-

tiert und unter Lichtausschluss wurden die Deckgläschen für 30 Minuten auf dem Farbstoff

inkubiert. Nach mehrmaligem Tauchen in PBS und zweimaligem Waschen in PBS bei 100

rpm wurden die Deckgläschen auf mit Mowiol versehene runde Deckgläschen gelegt und bei

Raumtemperatur und unter Lichtausschluss für mindestens 48 Stunden getrocknet.

Während der Arbeit wurden an der Methode einige Veränderungen vorgenommen, die in

Tabelle 3 und 4 (Seite 23) zusammengefasst sind. Für einzelne Versuche wurden C127 Zellen

auf die gleiche Weise für eine Markierung der Aktinfilamente oder der Mikrotubuli behandelt.

Nach der Trocknung wurden mit dem Konfokal Mikroskop Leica DM IRE2 und der Leica

Confocal Software von den gefärbten Zellen fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen erstellt,

wobei die Auflösung des Bildes erhöht wurde, indem Immersionsöl auf das verwendete HCX

PL APO 63x1,32oil Objektiv getropft wurde.


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Tabelle 3 Zusammenfassung der Variationen im Ablauf der Aktinfärbung. Die jeweils gewählte Variante ist mit +, nicht gewählte Varianten mit - markiert.

Zellfixierung Permeabilisierung Aktinfärbung

Mounting FITC 1 mg/ml in DMSO

Phalloidin-FITC 1 mg/ml in DMSO

4% PFA in PBS (4 °C)

reines Methanol (-20 °C)

4% Tween in PBS der Waschgänge

vor und nach Fixierung

0,1% Triton X-100 in FITC-Lösung

1:100 1:50 1:100 1:50 15 µl

Mowiol 70 µl

Mowiol

Methode A1 + - + - + - - - - +

Methode A2 + - - + - + - - + -

Methode A3 - + - + - + - - + -

Methode A4 + - - + - - + - + -

Methode A5 + - - + - - - + + -

Tabelle 4 Zusammenfassung der Variationen im Ablauf der Mikrotubulifärbung. Die jeweils gewählte Variante ist mit +, nicht gewählte mit - markiert. Beim 1. Antikörper handelt es sich um Mouse anti-α-tubulin monoclonal IgG, beim 2. Antikörper um Goat anti-mouse IgM-FITC.

Zellfixierung Permeabilisierun

g Blockierung Mikrotubulifärbung

Mounting

Feucht-kammer

1. Antikörper 0,5% in H2O

2. Antikörper 0,5% in H2O

4% PFA in PBS (4 °C)

reines Methanol (-20 °C)

0,3% Triton X-100 in PBS

5% iFBS in PBS

20 µl 50 µl 20 µl 50 µl 15 µl

Mowiol70 µl

Mowiol

Methode M0 + - + + - + - + - + -

Methode M1 + - + + + + - + - + -

Methode M2 + - + + + - + - + + -

Methode M3 + - + + + - - - + + -

Methode M4 + - - - + - - - - + -


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Ergebnisse

Cytotoxizität In den folgenden Abbildungen sind die Ergebnisse zur Untersuchung der Cytotoxizität der

eingesetzten Substanzen zusammengefasst. Es wurde die Überlebensrate der Zellen gegen die

Molarität der eingesetzten Substanz aufgetragen. Das Assay zur Bestimmung der Überlebens-

rate wurde jeweils dreimal durchgeführt. Bei den angegebenen Überlebensraten handelt es

sich um Mittelwerte zu allen entsprechenden Absorptionswerten. Die Standardabweichung ist

als Fehlerbalken angegeben. Für die Substanzen Noscapin, Paclitaxel, Phalloidin und

Vinblastin kann auch bei der höchsten eingesetzten Konzentration keine Überlebensrate von

0% erreicht werden.

Bei einer notwendigen Überschreitung der zu einem früheren Zeitpunkt ebenfalls als cyto-

toxisch eingeschätzten Lösungsmittelkonzentration wird die Überlebensrate von Zellen, auf

die die Substanz in Lösungsmittel oder reines Lösungsmittel gewirkt hat, gegen den entspre-

chenden Volumenanteil in der Verdünnung mit DMEM+ Medium aufgetragen.

Noscapin Bei einer Versuchsdurchführung mit Noscapin gelöst in H2O pH 4 in COS-7 Zellen fällt

Noscapin im DMEM+ Medium mit neutralem pH Wert bei allen eingesetzten Molaritäten

zwischen 5 mM und 0,5 mM aus. So ist eine Durchführung des MTT-Assays für diese

Noscapinlösung nicht möglich.

Für Noscapin gelöst in DMSO (Abbildung 13, Seite 25) ergibt sich aus dem Kurvenverlauf zu

drei gleich durchgeführten Assays ein IC50 Wert von 369 ≤ 39 µM. Ab einer Molarität von ca.

500 µM fällt das in DMSO gelöste Noscapin im DMEM+ Medium aus. Eine Cytotoxizität des

eingesetzten Lösungsmittelvolumens ist auszuschließen (Abbildung 14, Seite 25). Eine

Versuchsdurchführung mit Noscapin gelöst in DMSO in HeLa Zellen führen zu einem

ähnlich starken cytotoxischen Effekt (Ergebnisse nicht gezeigt).


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Abbildung 14 Auftragung der Überlebensrate von COS-7 Zellen gegen den Volumenanteil an Noscapin gelöst in DMSO und reinem DMSO. COS-7 Zellen werden mit dem Alkaloid oder dem entsprechenden Volumenanteil DMSO in DMEM+ Medium behandelt. Anschließend werden die Zellen mit MTT behandelt, wobei es proportional zur Anzahl der lebenden Zellen zur Bildung von blau gefärbtem Formazan kommt. Über die Messung der Absorption durch das Formazan wird die Überlebensrate ermittelt. Der Vergleich der Kurven ermöglicht die Unterscheidung der Cytotoxizität des in DMSO gelösten Noscapin und dem ebenfalls toxisch wirkenden Lösungsmittels.

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%110%120%

1 10 100 1000 10000

Übe

rlebe

nsra

te

Molarität [log µM]

�

�

�

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%110%120%130%

0,001% 0,010% 0,100% 1,000% 10,000%

Übe

rlebe

nsra

te

Volumenanteil

178 mM Noscapin in DMSODMSO

�

�

�

Abbildung 13 Auftragung der Überlebensrate von COS-7 Zellen gegen die Molarität von Noscapin. COS-7 Zellen werden mit dem Alkaloid behandelt. Anschließend werden die Zellen mit MTT behandelt, wobei es proportional zur Anzahl der lebenden Zellen zur Bildung von blau gefärbtem Formazan kommt. Über die Messung der Absorption durch das Formazan wird die Überlebensrate ermittelt.


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Abbildung 15 Auftragung der Überlebensrate von COS-7 Zellen gegen die Molarität von Paclitaxel. COS-7 Zellen werden mit dem Alkaloid behandelt. Anschließend werden die Zellen mit MTT behandelt, wobei es proportional zur Anzahl der lebenden Zellen zur Bildung von blau gefärbtem Formazan kommt. Über die Messung der Absorption durch das Formazan wird die Überlebensrate ermittelt.

Paclitaxel Bei eintägiger Inkubation von COS-7 und HeLa Zellen mit bis zu 100 µM Paclitaxel wird

keine Überlebensrate unter 50% erreicht (Ergebnisse nicht gezeigt), so dass eine Berechnung

des entsprechenden IC50 Werts nicht möglich ist. Bei einer Inkubationszeit von zwei Tagen

wird durch 100 µM Paclitaxel hingegen eine Überlebensrate von ca. 5% erreicht und aus dem

Kurvenverlauf kann ein IC50 (48h) Wert von 144 ≤ 54 nM ermittelt werden (Abbildung 15).

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

110%

0,001 0,010 0,100 1,000 10,000 100,000

Übe

rlebe

nsra

te


��

��

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Phalloidin Für Phalloidin ergibt sich aus einer einmaligen Versuchsdurchführung der in Abbildung 16 zu

sehende Kurvenverlauf. Daraus kann der IC50 Wert 12,3 ≤ 1,3 µM bestimmt werden.

Bis zu einem Volumenanteil von 1% kann ein signifikanter cytotoxischer Effekt des Lösungs-

mittels DMSO ausgeschlossen werden (Abbildung 17).

Abbildung 16 Auftragung der Überlebensrate von COS-7 Zellen gegen die Molarität von Noscapin. COS-7 Zellen werden mit dem Alkaloid behandelt. Anschließend werden die Zellen mit MTT behandelt, wobei es proportional zur Anzahl der lebenden Zellen zur Bildung von blau gefärbtem Formazan kommt. Über die Messung der Absorption durch das Forma-zan wird die Überlebensrate ermittelt.

Abbildung 17 Auftragung der Überlebensrate von COS-7 Zellen gegen den Volumenanteil an Phalloidin gelöst in DMSO und reinem DMSO. COS-7 Zellen werden mit dem Alkaloid oder dem entsprechenden Volumeanteil DMSO in DMEM+ Medium behandelt. Anschließend werden die Zellen mit MTT behandelt, wobei es proportional zur Anzahl der lebenden Zellen zur Bildung von blau gefärbtem Formazan kommt. Über die Messung der Absorption durch das Formazan wird die Überlebensrate ermittelt. Der Vergleich der Kurven ermöglicht die Unterscheidung der Cytotoxizität des in DMSO gelösten Phalloidin und dem ebenfalls toxisch wirkenden Lösungsmittels.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0 1 10 100 1000

Übe

relb

ensr

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0%

10%

20%

30%

40%

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60%

70%

80%

90%

100%

110%

0,001% 0,010% 0,100% 1,000% 10,000%

Übe

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te

Volumenanteil

12,7 mM Phalloidin in DMSODMSO


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Abbildung 19 Auftragung der Überlebensrate von COS-7 Zellen gegen die Molarität von Vinblastin . COS-7 Zellen werden 24 oder 48 Stunden mit dem Alkaloid behandelt. Anschließend werden die Zellen mit MTT behandelt, wobei es proportional zur Anzahl der lebenden Zellen zur Bildung von blau gefärbtem Formazan kommt. Über die Messung der Absorption durch das Formazan wird die Überlebensrate ermittelt.

Sanguinarin Für Sanguinarin ergibt sich aus dem sigmodialen Kurvenverlauf (Abbildung 18) zum

Cytotoxizitäts-Assay ein IC50 Wert von 1,80 ≤ 0,13 µM.

Vinblastin Vinblastin wurde sowohl 24 Stunden, als auch 48 Stunden mit den Zellen inkubiert. Aus den

Kurvenverläufen (Abbildung 19) können die IC50 Werte 7,31 ≤ 4,71 µM für 24 Stunden

Inkubation und 63,2 ≤ 29,2 nM für 48 Stunden Wirkungszeit ermittelt werden.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0 1 10 100

Übe

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0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%110%120%

0,01 0,10 1,00 10,00 100,00 1000,00 10000,00

Übe

rlebe

nsra

te

Molarität [log nM]

48 h

24 h

��

��

��

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Abbildung 18 Auftragung der Überlebensrate von COS-7 Zellen gegen die Molarität von Sanguinarin. COS-7 Zellen werden mit dem Alkaloid behandelt. Anschließend werden die Zellen mit MTT behandelt, wobei es proportional zur Anzahl der lebenden Zellen zur Bildung von blau gefärbtem Formazan kommt. Über die Messung der Absorption durch das Formazan wird die Überlebensrate ermittelt.

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Zusammenfassung der IC50 Werte Die ermittelten IC50 Werte der Alkaloide für COS-7 Zellen sind in Tabelle 5 zusammen-

gefasst.

Tabelle 5 Zusammenfassung der ermittelten IC50 Werte. Mit Hilfe eines colorimetrischen Assays wurde die Überle-bensrate von COS-7 Zellen gegen die Konzentration der Substanz, die 24 bzw. 48 Stunden auf die Zellen gewirkt hat, aufgetragen. Aus der Kurve wird die Konzentration ermittelt, bei der eine Überlebensrate von 50% erreicht wird.

Substanz Inkubationszeit IC50 Wert

Noscapin 24 h 368,76 ≤ 38,76 µM

Paclitaxel 48 h 144,40 ≤ 54,10 nM

Phalloidin 24 h 12,32 ≤ 1,32 µM

Sanguinarin 24 h 1,80 ≤ 0,13 µM

Vinblastin 24 h 7,31 ≤ 4,71 µM

48 h 63,15 ≤ 29,20 nM


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Cytostaining Die folgenden Abbildungen zeigen die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen von Zellen,

die mit einer der beschriebenen Methoden angefärbt wurden. Das jeweils eingesetzte FITC

emittiert grünes Licht und das Propidiumiodid rotes Licht. Mit Hilfe der Leica Confocal Soft-

ware sind die einzelnen Bilder übereinander gelegt worden. Abbildung 20 zeigt COS-7

Zellen, die nach Methode A1, A2 und A3 angefärbt wurden.

Abbildung 20 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von COS-7 Zellen. Die Zellen wurden zuvor nach denen im Bild angegebenen Methoden (siehe Tabelle 3) angefärbt. Bild A1, A2 und A3 sind Überlagerungen von grün fluoreszierendem FITC und rot fluoreszierendem PI. Die jeweiligen Mikroskop-Einstellungen sind den entsprechenden Datenblättern im Anhang zu entnehmen. (A1: “referenz2”, A2: „FITC_PI_TRITON_PFA“, A3: “FITC-PI-TRITON-MEOH”)


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Abbildung 21 zeigt COS-7 Zellen, die nach Methode A5 angefärbt wurden. Zur Methode A4

sind keine Abbildungen vorhanden, da in diesem Fall das Fluoreszenzsignal zu schwach für

eine Aufnahme ist.

Abbildung 21 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von COS-7 Zellen. Die Zellen wurden zuvor nach denen im Bild angegebenen Methoden (siehe Tabelle 3) angefärbt. Bild A5a ist eine Überlagerung von grün fluoreszierendem FITC und rot fluoreszierendem PI. Bild A5b ist der 4,02fache Zoom von Bild A5a. Die jeweiligen Mikroskop-Einstellungen sind den entsprechenden Datenblättern im Anhang zu entnehmen. (A5a: “Actin_U1”, A5b: “Actin_U2”)


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Abbildung 22 zeigt COS-7 Zellen, die nach Methode M2, M3 und M4 angefärbt wurden. Zur

Methode M0 und M1 ist keine Abbildung vorhanden. da in diesen Fällen das jeweilige

Fluoreszenzsignal zu schwach für eine Aufnahme ist.

Abbildung 22 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von COS-7 Zellen. Die Zellen wurden zuvor nach denen im Bild angegebenen Methoden (siehe Tabelle 4) angefärbt. Bild M2a, M3 und M4 sind Überlagerungen von grün fluoreszierendem FITC und rot fluoreszierendem PI. Bild M2b ist der 2,34fache Zoom von Bild M2a. Die jeweiligen Mikroskop-Einstellungen sind den entsprechenden Datenblättern im Anhang zu entnehmen. (M2a: „Mikro1“, M2b: „Mikro2“, M3: „M_2AK2“, M4: „c ell.ohne.2“)


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Abbildung 23 zeigt C127 Zellen, die nach Methode A5 oder M2 angefärbt wurden.

Abbildung 23 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von C127 Zellen. Die Zellen wurden zuvor nach denen im Bild angegebenen Methoden (siehe Tabelle 3 und 4) angefärbt. Bild A5 und M2a sind Überlagerungen von grün fluoreszierendem FITC und rot fluoreszierendem PI. Bild M2b ist der 2,22fache Zoom von Bild M2a. Die jeweiligen Mikroskop-Einstellungen sind den entsprechenden Datenblättern im Anhang zu entnehmen. (A5: „Actin_U_C127“, M2a: „Micro_C127_1“, M2b: „Micro_C127_2“)


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Die Zellen in den folgenden Abbildungen 23-27 sind vor der jeweiligen Färbung für 24 Stun-

den mit einem der zu untersuchenden Alkaloide behandelt worden, dessen Konzentration sich

am zuvor ermittelten IC50 Wert orientiert.

Noscapin In Abbildung 24 sind COS-7 Zellen zu sehen, die 24 Stunden mit 350 µM Noscapin inkubiert

und anschließend mit Methode A5 bzw. M2 angefärbt wurden.

Abbildung 24 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von COS-7 Zellen, die 24 Stunden mit 350 µM Noscapin behandelt wurden. Die Zellen wurden anschließend nach denen im Bild angegebenen Methoden (siehe Tabelle 3 und 4) angefärbt. Bild A5a und M2a sind Überlagerungen von grün fluoreszierendem FITC und rot fluoreszierendem PI. Bild A5b ist der 2,05fache Zoom von Bild A5a. Bild M2b zeigt nur rot fluoreszierendes PI. Die jeweiligen Mikroskop-Einstellungen sind den entsprechenden Datenblättern im Anhang zu entnehmen. (A5a: „Noscapin_Actin1“, A5b: „Noscapin_Actin2“, M2a und b: „M_Nosca1“)


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Paclitaxel Abbildung 25 zeigt COS-7 Zellen, die 24 Stunden mit 150 nM Paclitaxel inkubiert und

anschließend nach Methode A5 bzw. M2 angefärbt wurden.

Abbildung 25 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von COS-7 Zellen, die 24 Stunden mit 150 nM Paclitaxel behandelt wurden. Die Zellen wurden anschließend nach denen im Bild angegebenen Methoden (siehe Tabelle 3 und 4) angefärbt. Bild A5a und M2a sind Überlagerungen von grün fluoreszierendem FITC und rot fluoreszierendem PI. Bild A5b ist der 4,30fache Zoom von Bild A5a, Bild M2b der 3,11fache Zoom von Bild M2a. Die jeweiligen Mikroskop-Einstellungen sind den entsprechenden Datenblättern im Anhang zu entnehmen. (A5a: „A_Pacli_1“, A5b: „A_Pacli_2“, M2a: „M_Pacli1“, M2b: „M_Pacli2“)


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Phalloidin In Abbildung 26 sieht man COS-7 Zellen, die 24 Stunden mit 12 µM Phalloidin inkubiert und

danach mit Methode A5 bzw. M2 angefärbt wurden.

Abbildung 26 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von COS-7 Zellen, die 24 Stunden mit 12 µM Phalloidin behandelt wurden. Die Zellen wurden anschließend nach denen im Bild angegebenen Methoden (siehe Tabelle 3 und 4) angefärbt. Bild A5 und M2a sind Überlagerungen von grün fluoreszierendem FITC und rot fluoreszierendem PI. Bild M2b ist der 2,7fache Zoom von Bild M2a. Die jeweiligen Mikroskop-Einstellungen sind den entsprechenden Datenblättern im Anhang zu entnehmen. (A5: „A_Phallo_2“, M2a: „M_Phallo1“, M2b: „M_Phallo2“)


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Sanguinarin Abbildung 27 zeigt COS-7 Zellen, die 24 Stunden mit 1,8 µM Sanguinarin behandelt und

anschließend nach Methode A5 bzw. M2 angefärbt wurden.

Abbildung 27 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von COS-7 Zellen, die 24 Stunden mit 1,8 µM Sanguinarin behandelt wurden. Die Zellen wurden anschließend nach denen im Bild angegebenen Methoden (siehe Tabelle 3 und 4) angefärbt. Bild A5a und M2a sind Überlagerungen von grün fluoreszierendem FITC und rot fluoreszierendem PI. Bild A5b und M2b zeigen nur rot fluoreszierendes PI. Die jeweiligen Mikroskop-Einstellungen sind den entsprechenden Datenblättern im Anhang zu entnehmen. (A5a und b: „A_Sang_1,8“, M2a und b: „M_Sang1,8“)


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Vinblastin In Abbildung 28 sind COS-7 Zellen zu sehen, welche 24 Stunden mit 5 µM Vinblastin behan-

delt und danach mit Methode A5 bzw. M2 angefärbt wurden.

Abbildung 28 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von COS-7 Zellen, die 24 Stunden mit 5 µM Vinblastin behan-delt wurden. Die Zellen wurden anschließend nach denen im Bild angegebenen Methoden (siehe Tabelle 3 und 4) angefärbt. Bild A2, A3 und A5a sind Überlagerungen von grün fluoreszierendem FITC und rot fluoreszierendem PI. Bei Bild A5b handelt es sich um einen 2,46fachen Zoom von A5a. Bild M2b zeigt nur rot fluoreszierendes PI. Die jeweiligen Mikroskop-Einstellungen sind den entsprechenden Datenblättern im Anhang zu entnehmen. (A5a: „Vinblastin_Actin1“, A5b: „Vinblastin_Actin2“, M2a und b: „M_Vinblast“)


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Zusammenfassung der Zellvermessung Die COS-7 Zellen, die nach Methode A5 oder M2 gefärbt wurden (Abbildung 21.A5a, Seite

31, 22.M2a, Seite 32 und Abbildung 24-28, Seite 34-38), werden mit der Software Adobe

Photoshop CS vermessen. Dabei wird die Länge und Breite gemessen und über die mittlere

Fläche des Zellkörpers und des Zellkerns deren Verhältnis berechnet. Die Ergebnisse sind in

Tabelle 6 und Tabelle 7 zusammengefasst.

Tabelle 6 Zusammenfassung der Vermessung von Zellen der Aktinfärbung nach Methode A5 (siehe Tabelle 3, Seite 23). Zur Länge und Breite der Zellen sind die Standardabweichung angegeben. Zur Berechnung des Verhältnisses von Zellkörper zu Zellkern wird eine elliptische Fläche angenommen.

ohne Alkaloid

Noscapin (350 µM)

Paclitaxel (150 nM)

Phalloidin (12 µM)

Sanguinarin (1,8 µM)

Vinblastin (5 µM)

Anzahl der vermessenen Zellen

20 14 14 20 4 20

Länge [µm] 30,8 ± 9,9

19,4 ± 4,7

34,7 ± 13,5

28,6 ± 14,7

18,7 ± 6,6

13,9 ± 2,9

Breite [µm] 11,1 ± 3,1

13,9 ± 1,9

18,7 ± 7,5

10,2 ± 2,8

13,3 ± 2,3

11,7 ± 1,7

Verhältnis von Zellkörper zu Zellkern

3,0 : 1 2,6 : 1 3,6 : 1 2,6 : 1 / 1,9 : 1

Tabelle 7 Zusammenfassung der Vermessung von Zellen der Mikrotubulifärbung nach Methode M2 (siehe Tabelle 4, Seite 23). Zur Länge und Breite der Zellen sind die Standardabweichung angegeben. Zur Berechnung des Verhältnisses von Zellkörper zu Zellkern wird eine elliptische Fläche angenommen.

ohne Alkaloid

Noscapin (350 µM)

Paclitaxel (150 nM)

Phalloidin (12 µM)

Sanguinarin (1,8 µM)

Vinblastin (5 µM)

Anzahl der vermessenen Zellen

20 9 20 20 6 5

Länge [µm] 32,3 ± 8,9

31,2 ± 9,8

23,6 ± 10,0

21,5 ± 9,7

18,7 ± 5,4

16,7 ± 3,5

Breite [µm] 10,7 ± 2,9

17,4 ± 6,2

10,4 ± 3,3

11,0 ± 3,6

9,8 ± 1,5

12,3 ± 4,5

Verhältnis von Zellkörper zu Zellkern

2,9 : 1 / 2,1 : 1 3,1 : 1 / /


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Diskussion

Cytotoxizität

Noscapin Der ermittelte IC50 Wert 369 ≤ 39 µM von Noscapin bestätigt nicht den Wert von 1,98 ≤ 0,95

mM vorangegangener Durchführungen (Hövel, 2009). In den vorigen Versuchen musste von

der in DMSO gelösten Substanz ein Volumenanteil von bis zu 4% eingesetzt werden,

wodurch ein zusätzlicher cytotoxischer Effekt des Lösungsmittels nicht mehr auszuschließen

war. Zudem fiel das Noscapin bei höheren Konzentrationen im wässrigen Milieu des

DMEM+ Mediums aus, wodurch wahrscheinlich die am Boden adhärenten Zellen vom über-

lebenswichtigen Medium abgeschirmt wurden. Durch Ansäuern eines Noscapin-Wasser-

gemischs auf einen pH Wert von 4 geht das basische Noscapin in eine polare Form über und

somit in Lösung. Eine Verdünnung der Lösung in DMEM+ Medium mit einem neutralen pH

Wert führt allerdings ebenfalls zum Ausfallen des Noscapins. Dabei fällt das angesäuerte

Noscapin weitaus mehr aus, als das in DMSO gelöste. So überwiegen die Vorteile einer

Lösung in DMSO dessen Nachteil der Cytotoxizität des Lösungsmittels DMSO. Um diesen

Faktor zu minimieren wird eine neue, höher konzentrierte Noscapinlösung in DMSO erstellt

und die Cytotoxizität des Lösungsmittels durch eine zusätzliche Kontrolle überprüft. Das ein-

gesetzte Volumen DMSO zeigt keinen cytotoxischen Effekt. Somit ist die Beeinflussung der

Überlebensrate nur auf das eingesetzte Noscapin zurückzuführen. Ab einer Molarität von über

500 µM fällt das Noscapin allerdings erneut in der Verdünnung mit DMEM+ aus. Die

Kristalle schirmen die adhärenten Zellen vom Medium ab und beeinflussen somit vermutlich

die Überlebensrate. Dies betrifft zwar nur Konzentrationen über dem ermittelten IC50 Wert,

allerdings wird dadurch der Verlauf einer Ausgleichskurve verfälscht, welche zur Ermittlung

des IC50 Werts dient. Die starke Abweichung des ermittelten Werts 369 ≤ 39 µM von voran-

gegangenen Ergebnissen kann durch die neue Noscapinlösung und anhand der geringeren

Standardabweichung vor allem durch die Etablierung der Methode erklärt werden.

Noscapin zeigt in Studien zur Chemotherapie geringe Nebenwirkungen, was den vergleichs-

weise hohen IC50 Wert zu den COS-7 Zellen erklären könnte. Noscapin bewirkt bei Bindung

an Mikrotubuli einen Stillstand der Mitose an Zellzyklus-Checkpoints, ohne das Verhältnis

von Mikrotubuli zu Monomeren zu beeinflussen. Die Bindung ist reversibel, was den ge-

ringen Effekt auf normal proliferierende Zellen wie COS-7 Zellen erklärt. In Tumorzellen,


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deren Checkpoints inaktiviert sind, kommt es bei Noscapin-Wirkung nicht zu einem Arrest

der Mitose, sondern zu einer unnatürlichen Anreicherung von DNA, bis der Zelltod eintritt

(Landen et al., 2002; Jackson et al., 2008). Dieser erhöhte cytotoxische Effekt auf

Krebszellen kann hier in HeLa Zellen aber nicht bestätigt werden, da diese Zelllinie aufgrund

ihrer hohen Robustheit für diese Zwecke nicht geeignet scheint.

Paclitaxel Vorangegangene Versuche zeigen, dass bei 24 Stunden Wirkungszeit, welche im MTT-Assay

eingeplant sind, durch das eingesetzte Paclitaxel keine genügend niedrigen Überlebensraten

für die Bestimmung eines IC50 Werts erreicht werden. So wird die Wirkungszeit in diesem

Fall auf 48 Stunden ausgedehnt, was bei vergleichbaren Studien zu einem starken cyto-

toxischen Effekt führt (Giannakakou et al., 2000). Eine Beobachtung der Referenzzellen,

welche nicht durch cytotoxische Substanzen beeinflusst sind, zeigt in diesem Zeitraum ein

Wachstum bis zu einer nahezu vollständigen Konfluenz. Ein Absterben der Referenzzellen

kann aber nicht nachgewiesen werden. Es können also die durch Paclitaxel beeinflussten Zel-

len auch nach 48 Stunden Einwirkzeit ohne einen Austausch von Medium mit den Referenz-

zellen verglichen werden. So ergibt sich für eine verdoppelte Einwirkzeit ein IC50 Wert von

144 ≤ 54 nM. Die große Standardabweichung von ca. 37% kann wahrscheinlich auf die

natürliche Varianz des Zellwachstums zurückgeführt werden. Bei 24 stündiger Inkubation

wird durch diese Konzentration lediglich eine Überlebensrate von ca. 70% erreicht. Eine 24-

stündige Behandlung von HeLa Zellen mit dem Cytostatikum nach der gleichen Methode

zeigt ähnliche Ergebnisse und somit ebenfalls keinen deutlichen cytotoxischen Effekt.

Paclitaxel bindet an eine spezifische von hydrophilen Resten gesäumte Bindetasche an der

luminalen Seite des Mikrotubulus, und bewirkt im Gegensatz zu Vinca-Alkaloiden eine

Stabilisierung der Mikrotubuli (Downing, 2000; Rowinsky et al., 1990). Die Bindung wird

durch die Phenylisoserin-Seitenkette und das Ring-System (Baccatin-Struktur) bestimmt

(Fang & Liang, 2005). Paclitaxel ist zwar lipophil aber wird durch seine Größe an einer pas-

siven Diffusion durch die Zellmembran gehindert. Stattdessen wird es durch einen ABC-

Transporter aufgenommen, was die Verfügbarkeit am Target stark verzögert (Ehrlichova et

al., 2005). Durch seine zunächst cytostatische, aber nicht cytotoxische Wirkung werden die

vorhandenen Zellen nicht zerstört, sondern lediglich an der Zellteilung gehindert. Durch die

vergleichsweise geringe Teilungsrate von zwei pro Tag der COS-7 Zellen könnte der geringe

Effekt innerhalb von 24 Stunden erkärt werden. Die Teilungsrate agressiver Tumorzellen,


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gegen die Paclitaxel eingesetzt wird, ist deutlich höher und somit der cytostatische Effekt

größer. Die dazu zusätzlich untersuchten HeLa Zellen eignen sich allerdings nicht zur

Bestätigung, da sie eine ähnlich niedrige Teilungsrate wie COS-7 Zellen aufweisen und sich

durch eine sehr starke Unempfindlichkeit auszeichnen.

Phalloidin Da nicht genügend Substanz vorhanden war, wurde der MTT-Assay mit Phalloidin nur ein-

mal als Triplikat durchgeführt. Dies entspricht zwar nicht dem gängigen Protokoll, jedoch

war dies im zeitlichen Rahmen die einzige Möglichkeit, noch genügend Phalloidin für das

Cytostaining zur Verfügung zu haben. Die nur einmalige Durchführung erklärt die relativ

geringe Standardabweichung des IC50 Wertes 12,3 ≤ 1,3 µM. Durch eine Wiederholung der

Durchführung könnte die Aussagekraft des IC50 Wertes erhöht werden, da durch die so

zunehmende Standardabweichung die natürliche Varianz des Zellwachstums besser berück-

sichtigt wird.

Die Kontrolle des Lösungsmittels DMSO zeigt keinen signifikanten cytotoxischen Effekt bis

zu einem Volumenanteil von ca. 1%. Der ermittelte cytotoxische Effekt bei einem geringeren

Volumenanteil ist auf die natürliche Varianz des Zellwachstums zurückzuführen (Abbildung

17, Seite 27). Rückschließend kann für die Kurve zu Phalloidin (Abbildung 16, Seite 27) ein

Effekt des Lösungsmittels bis zu einer Phalloidin-Molarität von ca. 150 µM ausgeschlossen

werden. So ist der ermittelte IC50 Wert von 12,3 ≤ 1,3 µM nicht direkt durch die Cytotoxizität

von DMSO betroffen. Allerdings ist dadurch der gesamte Verlauf einer sigmodialen Aus-

gleichskurve verfälscht, was sich auf die Berechnung des IC50 Wertes mit Sigma Plot auswir-

ken kann. Fällt die Kurve zu früh, wird der IC50 Wert überschätzt.

Phalloidin ist ein bicyclisches Heptapeptid, welches vermutlich durch Pinocytose in Zellen

gelangt (Cooper, 1987). Ein Molekül verursacht über die Bindung von mehreren Aktinmono-

meren eine Stabilisierung von Aktinfilamenten (Drubin et al., 1993), wobei die Effektivität

der Bindung durch die starre Konformation des Moleküls in wässrigem Milieu bedingt ist

(Kobayashi et al., 1995). Phalloidin kann nicht von tierischen Peptidasen oder Proteasen

abgebaut werden, was seinen cytotoxischen Effekt erhöht (Lu et al., 2008).


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Sanguinarin Sanguinarin hat in der Zelle vielfältige Angriffspunkte für einen cytotoxischen Effekt. Neben

der Depolimerisation von Mikrotubuli und Interkalation von DNA, ist auch zum Beispiel die

Einleitung der Apoptose über nF-κB und die Hemmung der Na/K-ATPase belegt (Hu et al.,

2005 ; Malikova et al., 2006; Vavrekovâ et al., 1996; Wolff & Knipling, 1993).

Für Sanguinarin wird ein IC50 Wert von 1,80 ≤ 0,13 µM ermittelt. Dieser Wert ist mit einer

Standardabweichung von ca. 7% vergleichsweise exakt, was unter anderem auf den idealen

sigmodialen Kurvenverlauf der Überlebensrate (Abbildung 18, Seite 28) zurückzuführen ist.

Das Benzophenanthridin-Alkaloid Sanguinarin zeigt nicht die stärkste Cytotoxizität, aber den

deutlichste Effekt nach bereits 24 Stunden Inkubation. Das Molekül ist im Vergleich zu den

anderen Substanzen relativ klein und lipophil (Abbildung 5, Seite 9), was den Transfer in die

Zelle vereinfacht. Im Gegensatz zum strukturell verwandten Chelidonin ist das Molekül

planar, was eine Targetbindung beeinflussen kann. Ein Austausch einer Iminiumgruppe gegen

eine Alkanoamingruppe bei Chelidonin vermindert die DNA-Inkalation (Vavrekovâ et al.,

1996). Die unterschiedliche Cytotoxizität konnte bestätigt werden. So wird der gleiche Effekt

auf die Zellzahl für Chelidonin erst bei ca. zehnfachen Molarität erreicht (Roider, 2009).

Vinblastin Für Vinblastin wird bereits bei einer Molarität von 63,2 ≤ 29,2 nM eine Sterberate von 50%

erreicht, wobei die behandelten Zellen allerdings 48 Stunden mit der Substanz inkubiert wur-

den. Nach 24-stündiger Behandlung wurde der gleiche Effekt mit 7,31 ≤ 4,71 µM erst bei der

100fachen Konzentration erreicht. Die hohen Standardabweichungen sind wahrscheinlich auf

die Wirkungsweise von Vinblastin zurückzuführen. Wegen seiner cytostatischen Wirkung ist

der Effekt auf die Überlebensrate eng mit der Teilungsrate der untersuchten Zellen verbunden.

Durch Schwankung der eingesetzten Zellzahl und der Zellvermehrung ist auch der Effekt auf

die Überlebensrate nicht konstant.

Studien mit Hela Zellen zeigten eine Depolymerisation der Mikrotubuli bei vergleichbaren

Vinblastinkonzentrationen. Das β-Tubulin am Plusende von Mikrotubuli weist eine spezi-

fische Bindestelle für Vinca-Alkaloide auf, wobei oft nur ein oder zwei Vinblastin-Moleküle

an ein Mikrotubuli Plusende binden. Eine doppelt bis dreifach so starke Akkumulation von

Vinblastin wie Colchicin bestätigt die hohe Cytotoxizität des Vincaalkaloids (Jordan &

Kamath, 2007; Downing, 2000). Bei gleicher Behandlung der COS-7 Zellen mit Colchicin


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wurde erst bei ca. 1000facher Molarität der gleiche cytotoxische Effekt erreicht (Roider,

2009).

Der Zusammenhang zwischen cytotoxischem Effekt von Vinblastin und Inkubationszeit ist

auf Charakteristika des Moleküls und seine Wirkungsweise zurückzuführen. Das relativ große

Molekül, das zudem in wässrigem Milieu positiv geladen und somit wenig lipophil ist,

gelangt nur langsam in die Zellen hinein. So tritt der cytotoxische Effekt verzögert auf.

Außerdem bewirkt die Depolymerisation der Mikrotubuli zunächst einen cytostatischen

Effekt. Je länger das Vinblastin auf die Zellen wirkt, desto niedriger ist demnach die Zellzahl

im Vergleich zu einer Referenz, bei der sich die Zellen ungehindert teilten können. Zudem

tritt bei langfristigem Zellzyklusarrest Apoptose auf, was die Überlebensrate weiter absenkt.

Cytostaining Zur Etablierung der Färbemethode werden verschiedene Schritte der Durchführung variiert.

So werden die Reagenzien Tween und Triton X-100 zur Permeabilisierung der Zellen vergli-

chen. Die nicht-ionischen Detergenzien erleichten den Durchgang der Farbstoffe durch die

Zellmembranen. Für den Vergleich werden COS-7 Zellen mit PFA fixiert und entweder beim

Waschen in PBS mit Tween (Methode A1 siehe Tabelle 3, Seite 23) oder während der Fär-

bung mit Triton X (Methode A2 siehe Tabelle 4, Seite 23) permeablilsiert, wie es zwei vorlie-

gende Protokolle vorschreiben. Es ist zu beachten, dass bei Methode A1 eine 1:100 FITC-

Verdünnung und bei Methode A2 eine 1:50 FITC-Verdünnung genutzt wurde. Die Aufnah-

men (Abbildung 20.A1 und A2, Seite 30) zu den zwei Permeabilisierungsmethoden ist in

ihrer Qualität trotzdem ähnlich. Der Zellkörper ist durch die Einlagerung von FITC flächig

grün gefärbt, wobei die mit Tween permeabilisierten Zellen etwas stärker leuchten, die mit

Triton X-100 permeabilisierten Zellen aber schärfer abgegrenzt sind. Eine meist ovale Rot-

färbung in der Mittel der Zelle deutet auf den Zellkern hin. Unregelmäßigkeiten in der

Färbung könnten auf die RNase A Behandlung während der Inkubation mit Propidiumiodid

erklärt werden. Die in Form von mRNA und Ribosomen im Zellkern lokalisierte RNA wird

abgebaut und hinterlässt aufgrund der Zellfixierung DNA-freie Löcher. In Form von intensiv

leuchtenden roten Fäden kann auch kondensiertes Chromatin erkannt werden. So ist auch die

Trennung der Chromatiden während einer Zellteilung zu beobachten. Die Zelle selbst

erscheint dabei abgerundet und weicht damit von der typischen langgestreckten Zellform der

Fibroblasten ab.


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Die beiden Permeabilisierungsmethoden liefern ähnliche Ergbnisse. Die Unterschiede der

Aufnahmen können zum Teil den unterschiedlich gewählten Scanparametern (siehe Anhang)

zugeschrieben werden. So kann Anhand der Aufnahmen keine Methode als die bessere iden-

tifiziert werden. Für weitere Versuche wird daher die Permeabilisierung mit Triton X-100

genutzt. Der Vorteil dieser Methode liegt in der Verwendung nur eines Waschpuffers, was

den Verlauf der Durchführung vereinfacht.

Des Weiteren wird eine Fixierung der COS-7 Zellen mit 4% PFA und mit reinem Methanol

verglichen. Das Ziel ist eine flächige Fixierung der Zellen, wobei die Strukturen der Zellen

möglichst erhalten bleiben sollten. Der Vergleich einer Färbung der Zellen mit FITC nach der

Fixierung mit einer der beiden Methoden zeigt einige Unterschiede. Die mit PFA fixierten

Zellen (Abbildung 20.A2, Seite 30) fluoreszieren vergleichsweise schwach und scheinen nur

undeutlich abgegrenzt. Die mit Methanol fixierten Zellen (Abbildung 20.A3, Seite 30)

fluoreszieren vergleichsweise stark und sind deutlich vom Hintergrund abgegrenzt. Auch sind

in diesen Zellen deutlich erkennbare Ansammlungen von grün fluoreszierendem FITC in der

Mitte der Zelle sichtbar, was eventuell auf einen Verlust von zellinneren Strukturen und Ver-

klumpung in Folge der Quervernetzung der Makromoleküle hinweist (Alberts et al., 2002).

Eine Beschädigung der Zellen würde auch den vergleichsweise hohen FITC-Gehalt in den

Zellen trotz gleicher Permeabilisierung erklären. Die Vermutung, dass diese Fixiermethode

nicht sensitiv genug ist, wird durch die Beobachtung von großflächigen Zellablösungen vom

Glasuntergrund während der Zellfixierung gestützt. Die Fixierung mit Methanol scheint somit

zu aggressiv zu sein. So wird diese Fixiermethode für weitere Versuche zu Gunsten des sen-

sitiveren PFAs verworfen und für die Färbung des Aktinnetzwerkes mit Phalloidin-FITC eine

Fixierung mit PFA und eine Permeabilisierung mit Triton X-100 verwendet.

Bei einer Konzentration von 20 µg/ml Phalloidin-FITC (Methode A5) können fluoreszenz-

mikroskopische Aufnahmen erstellt werden, während bei halber Konzentration (Methode A4)

das emittierte Licht für eine Aufnahme zu schwach ist. Im Vergleich der Aktinfärbung durch

Phalloidin-FITC (Abbildung 21.A5a, Seite 31) mit der unspezifischen FITC-Einlagerung

(Abbildung 20.A2, Seite 30) sind keine deutlichen Unterschiede zu erkennen. Auch bei der

Phalloidin-FITC-Färbung ist eine flächige Grünfärbung zu sehen. Die Erwartung, filament-

artige, fädige Strukturen zu erkennen, konnte auch bei einer Vergrößerung des Bildes (Ab-

bildung 21.A5b, Seite 31) nicht erfüllt werden. Allerdings sind die Aufnahmen der mit spezi-

fisch gefärbten Zellen weniger körnig, als die mit unspezifischer Färbung. Auch fällt auf, dass


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bei den mit FITC gefärbten Zellen der Zellkern weniger scharf abgegrenzt erscheint, als bei

den mit Phalloidin-FITC gefärbten Zellen. Durch eine mögliche unspezifische Einlagerung

des FITC im Cytosol, aber auch im Zellkern wird das Rot des PI durch das Grün des FITC im

überlagerten Bild teilweise gemischt und verdeckt. Durch die ausschließlich spezifische Ein-

lagerung des Phalloidin-FITC ins Aktinnetz könnte eine Verringerung dieses Effektes bei den

entsprechenden Aufnahmen erklärt werden. Die flächige Färbung durch Phalloidin-FITC

könnte durch das bei den genutzten Fibroblasten stark ausgeprägte Aktinnetzwerks zurückge-

führt werden. Durch die Dichtheit der Filamente und deren Bündelung durch die Fixierung

(Alberts et al., 2002) könnte es möglich sein, dass keine Aufnahmen von einzelnen Fila-

menten mit der Auflösung des Fluoreszenzmikroskops erstellt werden können.

Bei der Färbung der Mikrotubuli mittels Immunofluoreszenz kann bei einem Volumen von 20

µl einer 1:200 Verdünnung der Antikörperlösungen pro Deckgläschen (Methode M0 und M1)

keine für Aufnahmen ausreichende Fluoreszenz erreicht werden. Dabei fällt aber auf, dass bei

einer Verwendung der Feuchtkammer während der Färbung ein besseres Ergebnis mit stärke-

rer Fluoreszenz erreicht wird. Bei Verwendung der Feuchtkammer und einem Volumen von

50 µl Antikörperlösung können Aufnahmen erstellt werden (Abbildung 22.M2a, Seite 32).

Die Aufnahme ähnelt sehr der zur Aktinfärbung. Charakteristika wie die längliche Zellform

und die RNase-bedingten Löcher im Zellkern sind auch hier zu sehen. Ähnlich wie bei der

Färbung des Aktinnetzwerkes sind hier ebenfalls keine Filament-artigen Strukturen zur

erkennen, sondern eine flächige Färbung der gesamten Zelle. Auch in der Vergrößerung (Ab-

bildung 22.M2b, Seite 32) sind keine abgegrenzten Strukturen in der Zelle zu erkennen. Zur

Kontrolle werden nach Methode M3 und M4 COS-7 Zellen nur mit dem zweiten Antikörper,

der spezifisch an den ersten Antikörper binden soll und den Fluoreszenzfarbstoff trägt, oder

gar nicht mit Antikörpern gehandelt. Die Aufnahme von Zellen ohne Färbung (Abbildung

22.M4, Seite 32) zeigt eine geringe Fluoreszenz, die vermutlich auf Kontamination mit Farb-

stoff zurückgeführt werden kann. Die Aufnahme von Zellen, die nur mit dem zweiten Anti-

körper behandelt werden, zeigt stärker fluoreszierende Zellen (Abbildung 22.M3, Seite 32).

Dies weist auf eine unspezifische Bindung des Antikörpers an Strukturen in den Zellen hin.

So könnte auch die flächige Grünfärbung bei Methode M2 erklärt werden. Das Fluoreszenz-

signal wäre danach sowohl über den ersten Antikörper spezifisch an das Tubulin, aber auch

unspezifisch an andere Strukturen in der Zelle gebunden.


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Zum Vergleich der verwendeten COS-7 Zellen mit anderen Zellen werden an C127 Zellen

eine Aktinfärbung mit der Methode A5 bzw. eine Mikrotubuli-Färbung mit der Methode M2

vorgenommen. Die jeweiligen Aufnahmen (Abbildung 23, Seite 33) sehen denen zu COS-7

Zellen sehr ähnlich. Auch hier sind keine der anzufärbenden Strukturen deutlich sichtbar. Die

Aufnahmen zur Mikrotubulifärbung (Abbildung 23.M2a und b, Seite 33) erscheinen aber

weniger körnig, als die entsprechenden Bilder zu COS-7 Zellen (Abbildung 22.M2a und b,

Seite 33) Für eine weitere Etablierung der Färbemethode sind somit eventuell weitere Unter-

suchungen an dieser Zelllinie ratsam.

Die nach Methode A5 bzw. M2 angefärbten COS-7 Zellen (Abbildung 21.A5a, Seite 31 und

22.M2a, Seite 32) werden mit COS-7 Zellen verglichen, welche vor der Färbung mit einem

der Alkaloide behandelt werden. Zum Vergleich werden 20 Zellen vermessen. Die Zellen der

Aktinfärbung sind 30,8 ≤ 9,9 µm lang und 11,1 ≤ 3,1 µm breit. Das Verhältnis der gesamten

Zellfläche (elliptisch) zum Zellkern beträgt 3:1. Die Zellen der Mikrotubulifärbung haben

eine sehr ähnliche Größe. Sie sind 32,3 ≤ 8,9 µm lang, 10,7 ≤ 2,9 µm breit und stehen in

einem Verhältnis von 2,9:1 zum Zellkern.

Noscapin Die Zellen, die vor der Aktinfärbung mit 350 µm Noscapin behandelt wurden (Abbildung

24.A5a, Seite 34), haben eine Länge von 19,4 ≤ 4,7 µm und Breite von 13,9 ≤ 1,9 µm. Im

Vergleich zu den unbehandelten Zellen sind diese Zellen deutlich abgerundet. Die typischen

Ausläufer der Fibroblasten sind kaum noch vorhanden. Das Verhältnis der gesamten Zelle

zum Zellkern weicht mit 2,6 nicht sehr von unbehandelten Zellen ab. Allerdings scheint der

Zellkern einiger Zellen nicht mehr intakt zu sein. Anstatt eines roten Ovals sind mehrere

größere Flecken in der Zelle und viele kleinere am Rand der Zelle zu sehen (Abbildung

24.A5b, Seite 34). Die deutet auf einen selbst eingeleiteten Zelltod, die Apoptose, hin. Dabei

wird unter anderem die DNA fragmentiert und in Vesikeln verpackt, die in den extra-

zellulären Raum entlassen werden (Wlodkowic et al., 2008). Dies könnte die kleinen punkt-

förmigen Rotfärbungen erklären. Wie schon in der Diskussion der Cytotoxizität von Noscapin

beschrieben, kann Noscapin über die Bindung an Mikrotubuli zu einem Stillstand der Mitose

an Zellzyklus-Checkpoints führen. Bei dauerhaftem Stillstand des Zellzyklus wird die Apop-

tose eingeleitet (Landen et al., 2002; Jackson et al., 2008).


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Die Zellen, die vor der Mikrotubulifärbung mit 350 µm Noscapin behandelt wurden, haben

sind 31,2 ≤ 9,8 µm lang und 17,4 ≤ 6,2 µm breit (Abbildung 24.M2a, Seite 34). Die Zell-

formen sind sehr vielfältig, wobei ein Teil der Zellen verklumpt vorliegt. Die Rotfärbung füllt

die gleiche Fläche aus, wie die Grünfärbung (Abbildung 24M2b, Seite 34). Ein abgegrenzter

Zellkern ist somit nicht mehr zu erkennen. Nur im Inneren einiger Zellen sind kleine Punkte

zu erkennen, die eventuell auf Überreste denaturierter DNA hinweisen. Ein möglicher Zell-

zyklusarrest durch das eingesetzte Noscapin kann zur Apoptose führen (Landen et al., 2002;

Jackson et al., 2008). Dies könnte die vollständige Auflösung des Zellkerns erklären. Direkte

Folgen der Interaktion des Noscapin mit Tubulin in Form einer Behinderung der Mikrotubuli-

Zusammenlagerung können nicht beobachtet werden. Dies liegt einerseits an der unausge-

reiften Färbemethode, andererseits an der zu weit fortgeschrittenen Zelldegeneration. Die ein-

gesetzte Noscapinkonzentration orientiert sich am IC50 Wert für 24 Stunden der Substanz in

COS-7 Zellen. Die Zellen für Aktin- und Mikrotubulifärbung wurden an unterschiedlichen

Tagen mit dem Alkaloid behandelt. So kann der unterschiedlich starke cytotoxische Effekt auf

die natürliche Varianz des Zellwachtums zurückgeführt werden.

Für weitere Untersuchungen der Interaktion des Noscapin mit den Mikrotubuli ist neben einer

weiteren Verbesserung der Färbemethode auch eine Variation von Alkaloidkonzentration und

Inkubationsdauer ratsam.

Paclitaxel Die Zellen, die vor der Aktinfärbung mit 150 nM Paclitaxel behandelt wurden, sind 34,7 ≤

13,5 µm lang und 18,7 ≤ 7,5 µm breit (Abbildung 25.A5a, Seite 35). Sie sind sehr vielfältig

geformt, was auch an der großen Standardabweichung der Länge und Breite abzulesen ist.

Manche Zellen sind in ihrer Form und ihrem Verhältnis zum Zellkern (3,6:1) unbehandelten

Zellen sehr ähnlich. Andere sind wiederum klein und abgerundet (Abbildung 25.A5b, Seite

35). Die Rotfärbung ist hierbei aber nicht oval, sondern in mehrere Flecken innerhalb und

außerhalb der Grünfärbung aufgeteilt. Diese Fragmentierung deutet, wie schon für Noscapin

beschrieben, auf eine Apoptose hin.

Die Zellen, die vor der Mikrotubulifärbung mit 150 nM Paclitaxel behandelt wurden, sind

23,6 ≤ 10,0 µm lang und 10,4 ≤ 3,3 µm breit (Abbildung 25.M2a, Seite 35). Sie sind teil-

weise wie unbehandelte Zellen geformt, teilweise aber auch abgerundet. Das Verhältnis zum

Zellkern ist mit 2,1:1 relativ klein. Im Vergleich zu nicht mit einem Alkaloid behandelten


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aber gleich gefärbten Zellen (Abbildung 22.M2a und b, Seite 32) scheint hier der Zellkern

vergrößert zu sein. Paclitaxel bindet an Tubulin und bewirkt eine Stabilisierung der Mikro-

tubuli und somit eine Inflexibilität des Spindelapparats, wodurch die Substanz einen cytosta-

tischen Effekt hat (Downing, 2000; Rowinsky et al., 1990). Die Propidiumiodid-Färbung

zeigt neben intakten Zellkernen auch vergleichsweise vergrößerte Zellkerne und auch ver-

dichtete Strukturen, welche auf kondensierte Chromosomen hinweisen. Besonders in der Ver-

größerung wird sichtbar, dass diese Chromosomen nicht, wie bei der Zellteilung üblich, in

einer Äquatorialebene arrangiert sind (Abbildung 22.M2b, Seite 32). Diese Anordnung wird

bei einer normalen Zellteilung durch das Angreifen des Spindelapparates am Zentromer von

Chromosomen bewerkstelligt. Durch das Fehlen eines korrekt ausgeprägten Spindelapparates

könnte die ungeordnete Orientierung des Chromatins erklärt werden. Die vergrößerten Zell-

kerne könnten ebenfalls auf den cytostatischen Effekt des Paclitaxels zurückzuführen sein.

Für eine bevorstehende Zellteilung wird die DNA verdoppelt, was sich in einer Volumenver-

größerung des Chromatins äußert. Wird der Zellzyklus nach der DNA Verdopplung und vor

der Zellteilung angehalten, bleibt das verdoppelte Volumen an DNA vorerst erhalten.

Phalloidin Die Zellen, die vor der Aktinfärbung mit 12 µM Phalloidin behandelt wurden, sind 28,6 ≤

14,7 µm lang und 10,2 ≤ 2,8 µm breit (Abbildung 26.A5, Seite 36). Das durchschnittliche

Verhältnis zum Zellkern ist mit 2,6:1 dem zu unbehandelten Zellen ähnlich. Einzelne Zellen

sind im Vergleich zu unbehandelten Zellen sehr langgestreckt. Wie schon in der Diskussion

zur Cytotoxizität von Phalloidin beschrieben interagiert dieses Alkaloid mit dem Aktinnetz-

werk. Dabei bindet das Phalloidin an mehrere Aktinmonomere und stabilisiert die Aktin-

filamente (Drubin et al., 1993). Diese Stabilisierung verhindert den Abbau von Aktinfila-

menten, was die vergleichsweise langen Zellformen erklären könnte.

Die Zellen, die vor der Mirkotubulifärbung mit 12 µM Phalloidin behandelt wurden, sind 21,5

≤ 9,7 µm lang und 11,0 ≤ 3,6 µm breit, wobei viele Zellen sehr lange dünne Ausläufer auf-

weisen (Abbildung 26.M2a, Seite 36). Die Rotfärbung ist über die ganze Fläche der Grün-

färbung verteilt, wobei Intensitätsabstufungen zu erkennen sind (Abbildung 26.M2b, Seite

36). Die leichte Rotfärbung über die gesamte Fläche wird durch die Helligkeit des Zellkörpers

im Vergleich zur Aktinfärbung deutlich. Eine intensivere Färbung in ovaler Form im Zell-

inneren deutet auf einen Zellkern hin, der zum Zellkörper im durchschnittlichen Verhältnis

von 1:3,1 steht. Außerdem sind im Zellkern zusätzlich intensivere punktförmige Ansamm-


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lungen zu erkennen, die sowohl rot, als auch grün fluoreszieren. Da Phalloidin nicht mit den

Mikrotubuli interagiert, sondern Aktinfilamente stabilisiert, können diese Punkte nicht durch

eine spezifische Interaktion erklärt werden. Ähnliche Punkte können bei der bereits bespro-

chenen Variante einer Zellfixierung mit Methanol beobachtet werden. Wie in diesem Fall

könnten die Ansammlungen auf eine Denaturierung und Verklumpung zellinnerer Strukturen

hinweisen. In diese könnte sich sowohl das Propidiumiodid als auch der FITC-markierte

Antikörper unspezifisch anlagern.

Sanguinarin Die Zellen, die vor der Färbung mit 1,8 µM Sanguinarin behandelt wurden, sind größtenteils

abgestorben. Die Zellen der Aktinfärbung sind 18,7 ≤ 6,6 µm lang und 13,3 ≤ 2,3 µm breit

(Abbildung 27.A5a, Seite 37). Die Zellen der Mikrotubulifärbung zeigen mit 18,7 ≤ 5,4 µm

Länge und 9,8 ≤ 1,5 µm Breite eine ähnliche Größe (Abbildung 27.M2a, Seite 37). In beiden

Fällen ist die lange Fibroblastenform nicht vorhanden und kein klar abgetrennter Zellkern

mehr zu erkennen. Die Rotfärbung der DNA hat dieselbe Fläche wie die Grünfärbung des

Cytosols (Abbildung 27.A5b und M2b, Seite 37). Um Aussagen über die Beeinflussung des

Cytoskeletts zu treffen, ist der Zustand der wenigen Zellen grundsätzlich zu schlecht. Die ein-

gesetzte Konzentration des Alkaloids entspricht dem IC50 Wert, der anhand des Cytotoxi-

zitätsassays bestimmt wurde. Um die vielfältigen cytotoxischen Effekte des Sanguinarin auf

zellulärer Ebene mit einem Cytostaining zu betrachten, ist eine höhere Überlebensrate not-

wendig. Dies kann durch eine geringere Substanzkonzentration oder eine kürzere Inkuba-

tionszeit mit der Substanz als 24 Stunden erreicht werden.

Bei einer erfolgreichen Färbung wäre eine Depolymerisation der Interphase-Mikrotubuli und

somit einer Verkleinerung des Zellkörpers zu erwarten, wie sie schon beobachtet wurde. Bei

zunehmender Sanguinarinkonzentration nimmt die Depolymerisation zu und es kommt zu

einer Mikrotubuli-Desorganisation zu dicken Bündeln um den Zellkern (Lopus & Panda,

2006).

Vinblastin Die Zellen, die vor der Aktinfärbung mit 5 µM Vinblastin behandelt wurden, sind 13,9 ≤ 2,9

µm lang und 11,7 ≤ 1,7 µm breit (Abbildung 28.A5a, Seite 38). Sie sind kleiner und abge-

rundeter als die unbehandelten Zellen, wodurch auch das Verhältnis zum Zellkern mit 1,9:1

geringer ist. Vinblastin bewirkt, wie bereits in der Diskussion zur Cytotoxizität des Vinca-


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Alkaloids erwähnt, eine Depolymeristation der Mikrotubuli und somit auch des Spindel-

apparats (Verdier-Pinard et al., 1999). Dadurch wird eine korrekte Zellteilung mit Aufteilung

der Chromatiden auf die Tochterzellen gestört. Der cytostatische Effekt des Vinca-Alkaloids

könnte die vorwiegend abgerundete Zellform erklären. In anderen Abbildungen von unbe-

handelten Zellen (z.B. Abbildung 20.A2, Seite 30), die sich in der Zellteilung befinden,

zeigen diese eine abgerundete Form. Eine runde Form könnte somit auf eine bevorstehende

Zellteilung hinweisen. Bei Wirkung einer cytostatischen Substanz käme es aber in dieser

Zellzyklusphase zu einem Mitosearrest. So könnte der große Anteil an runden Zellen in der

Aufnahme erklärt werden.

Die Zellen, die vor der Mikrotubulifärbung mit 5 µM Vinblastin behandelt wurden, sind

größtenteils abgestorben. Die noch vorhandenen Zellen sind 16,7 ≤ 3,5 µm lang und 12,3 ≤

4,5 µm breit. Sie sind klein und abgerundet (Abbildung 28.M2a, Seite 38). Die Rotfärbung

erstreckt sich über die gleiche Fläche wie die Grünfärbung (Abbildung 28.M2b, Seite 38).

Somit scheint kein klar abgetrennter Zellkern mehr vorhanden zu sein. Direkte Folgen der

Interaktion von Vinblastin mit den Mikrotubuli in Form einer Depolymerisation können nicht

beobachtet werden, da die vorhandenen Zellen in einem zu schlechten Zustand sind. Die

Möglichkeit, dass die Zellen allein durch die Mirkotubuli-Depolymerisation so klein er-

scheinen, ist durch die geringe Zellzahl unwahrscheinlich. Die eingesetzte Vinblastin-

konzentration zeigt einen zu starken cytotoxischen Effekt.

Die beiden Färbungen wurden an verschiedenen Tagen durchgeführt, wobei sich die einge-

setzte Konzentration von Vinblastin am ermittelten IC50 Wert für 24 Stunden Inkubation von

7,31 ≤ 4,71 µM orientiert. Die sehr unterschiedliche Überlebensrate nach Behandlung mit 5

µM Vinblastin könnte somit auf die natürliche Varianz des Zellwachstums zurückgeführt

werden. Für weitere Versuche wäre es ratsam, verschiedene Verdünnungen von Vinblastin zu

testen und unter Umständen auch die Inkubationszeit zu verkürzen.


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Fazit Die angewandten Methoden, um das Cytoskelett der verwendeten COS-7 und C127 Zellen

anzufärben, konnten im Rahmen dieser Arbeit nicht vollständig angepasst werden. So konnten

keine klar abgegrenzten Filamente sichtbar gemacht werden. Um die Methoden weiter zu

etablieren müssten weitere Variationen der Färbung an COS-7 Zellen durchgeführt werden.

Um einen Vergleich zu ermöglichen, wäre es sinnvoll, zusätzlich zu den COS-7 Zellen auch

die Fibroblasten-Zelllinie C127 näher zu untersuchen. Zusätzlich wäre der Vergleich der Auf-

nahmen mit dem verwendeten Mikroskop Leica DM IRE2 (AG Weiß, Klinische Pharma-

kologie und Pharmakoepidemiologie, Medizinische Klinik Heidelberg) mit Aufnahmen an

einem neueren Mikroskop sinnvoll. Das Objektiv des verwendeten Mikroskops ist durch lang-

fristigen Gebrauch höchstwahrscheinlich verunreinigt und verkratzt. Dies bewirkt ein starkes

Hintergrundrauschen, welches die Aufnahmen negativ beeinflusst und bei neueren Mikros-

kopen nicht auftreten sollte.

Zur Untersuchung der Wirkung der untersuchten Alkaloide auf das Cytoskelett der Zellen

sind Variationen der Parameter Substanzkonzentration und Inkubationszeit ratsam. So könnte

anhand der Aufnahmen die beste Variante gewählt werden, bei der eine Beeinflussung des

Targets gesichert ist, aber das Absterben der beeinflussten Zellen noch nicht zu weit fortge-

schritten ist, um Aussagen über die Effekte auf das Cytoskelett zu treffen.


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Z 1 Pixel 0.00 0.00

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 464.46 nm

Voxel Y 464.46 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 1.00

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings




PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00





Z Position 20.35 nm

Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung22\COS-7_Mikrotubuli.xml

Image: Mikro2 Scan Mode: xyz Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 101.73 µm 50.30 µm

Y 512 Pixel 101.73 µm 53.56 µm

Z 1 Pixel 0.00 0.00

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 198.68 nm

Voxel Y 198.68 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 2.34

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings




PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00





Z Position 20.35 nm

Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung22\COS-7_Mirkotubuli_zoom.xml

Image: M_2AK2 Scan Mode: xyz Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 238.04 µm 0.00 m

Y 512 Pixel 238.04 µm 0.00 m

Z 1 Pixel 0.00 0.00

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 464.92 nm

Voxel Y 464.92 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 1.00

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings




PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung22\COS-7_nur 2. Antikörper.xml

Image: cell.ohne.2 Scan Mode: xyz Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 238.04 µm 0.00 m

Y 512 Pixel 238.04 µm 0.00 m

Z 1 Pixel 0.00 0.00

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 464.92 nm

Voxel Y 464.92 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 1.00

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings




PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung22\COS-7_ohne Färbung.xml

Image: Actin_U_C127 Scan Mode: xyz Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 238.10 µm -77.50 nm

Y 512 Pixel 238.10 µm -77.50 nm

Z 1 Pixel 0.00 0.00

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 465.03 nm

Voxel Y 465.03 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 1.00

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings




PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung23\C127_Aktin.xml

Image: Mikro_C127_1 Scan Mode: xyz Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 238.10 µm -77.50 nm

Y 512 Pixel 238.10 µm -77.50 nm

Z 1 Pixel 0.00 0.00

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 465.03 nm

Voxel Y 465.03 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 1.00

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings




PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung23\C127_Mikrotubuli.xml

Image: Mikro_C127_2 Scan Mode: xyz Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 107.42 µm -65.34 µm

Y 512 Pixel 107.42 µm -65.34 µm

Z 1 Pixel 0.00 0.00

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 209.81 nm

Voxel Y 209.81 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 2.22

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings




PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung23\C127_Mikrotubuli_zoom.xml

Image: Noscapin_Actin1 Scan Mode: xy Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 238.10 µm 0.00 m

Y 512 Pixel 238.10 µm 0.00 m

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 465.03 nm

Voxel Y 465.03 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 1.00

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings



PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung24\COS-7_Noscapin_Aktin.xml

Image: Noscapin_Actin2 Scan Mode: xy Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 116.14 µm -57.51 µm

Y 512 Pixel 116.14 µm 27.44 µm

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 226.84 nm

Voxel Y 226.84 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 2.05

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings



PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung24\COS-7_Noscapin_Aktin_zoom.xml

Image: M_Nosca1 Scan Mode: xyz Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 237.86 µm 0.00 m

Y 512 Pixel 237.86 µm 0.00 m

Z 1 Pixel 0.00 0.00

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 464.58 nm

Voxel Y 464.58 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 1.00

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings




PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung24\COS-7_Noscpain_Mikrotubuli.xml

Image: A_Pacli_1 Scan Mode: xyz Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 238.10 µm -77.50 nm

Y 512 Pixel 238.10 µm -77.50 nm

Z 1 Pixel 0.00 0.00

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 465.03 nm

Voxel Y 465.03 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 1.00

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings




PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung25\COS-7_Paclitaxel_Aktin.xml

Image: A_Pacli_2 Scan Mode: xyz Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 55.40 µm 68.98 µm

Y 512 Pixel 55.40 µm 23.48 µm

Z 1 Pixel 0.00 0.00

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 108.20 nm

Voxel Y 108.20 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 4.30

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings




PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung25\COS-7_Paclitaxel_Aktin_zoom.xml

Image: M_Pacli1 Scan Mode: xyz Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 238.10 µm -77.50 nm

Y 512 Pixel 238.10 µm -77.50 nm

Z 1 Pixel 0.00 0.00

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 465.03 nm

Voxel Y 465.03 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 1.00

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings




PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung25\COS-7_Paclitaxel_Mikrotubuli.xml

Image: M_Pacli2 Scan Mode: xyz Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 76.67 µm 18.37 µm

Y 512 Pixel 76.67 µm -25.65 µm

Z 1 Pixel 0.00 0.00

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 149.75 nm

Voxel Y 149.75 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 3.11

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings




PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung25\COS-7_Paclitaxel_Mikrotubuli_zoom.xml

Image: A_Phallo_2 Scan Mode: xyz Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 238.10 µm -77.50 nm

Y 512 Pixel 238.10 µm -77.50 nm

Z 1 Pixel 0.00 0.00

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 465.03 nm

Voxel Y 465.03 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 1.00

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings




PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung26\COS-7_Phalloidin_Aktin.xml

Image: M_Phallo1 Scan Mode: xyz Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 238.10 µm -77.50 nm

Y 512 Pixel 238.10 µm 0.00 m

Z 1 Pixel 0.00 0.00

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 465.03 nm

Voxel Y 465.03 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 1.00

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings




PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung26\COS-7_Phalloidin_Mikrotubuli.xml

Image: M_Phallo2 Scan Mode: xyz Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 88.30 µm 67.66 µm

Y 512 Pixel 88.30 µm -33.33 µm

Z 1 Pixel 0.00 0.00

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 172.46 nm

Voxel Y 172.46 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 2.70

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings




PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung26\COS-7_Phalloidin_Mikrotubuli_zoom.xml

Image: A_Sang_1,8 Scan Mode: xyz Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 238.10 µm -77.50 nm

Y 512 Pixel 238.10 µm -77.50 nm

Z 1 Pixel 0.00 0.00

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 465.03 nm

Voxel Y 465.03 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 1.00

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings




PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung27\COS-7_Sanguinarin_Aktin.xml

Image: M_Sang1,8 Scan Mode: xyz Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 238.10 µm -77.50 nm

Y 512 Pixel 238.10 µm -77.50 nm

Z 1 Pixel 0.00 0.00

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 465.03 nm

Voxel Y 465.03 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 1.00

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings




PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung27\COS-7_Sanguinarin_Mikrotubuli.xml

Image: Vinblastin_Actin1 Scan Mode: xy Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 238.10 µm -77.50 nm

Y 512 Pixel 238.10 µm 0.00 m

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 465.03 nm

Voxel Y 465.03 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 1.00

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings



PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung28\COS-7_Vinblastinsulfat_Aktin.xml

Image: Vinblastin_Actin2 Scan Mode: xy Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 96.78 µm 2.33 µm

Y 512 Pixel 96.78 µm 35.65 µm

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 189.03 nm

Voxel Y 189.03 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 2.46

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings



PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung28\COS-7_Vinblastinsulfat_Aktin_zoom.xml

Image: M_Vinblast Scan Mode: xyz Size: 512 KB

Dimensions


X 512 Pixel 238.10 µm -77.50 nm

Y 512 Pixel 238.10 µm -77.50 nm

Z 1 Pixel 0.00 0.00

Voxel Information


Range Begin 0.00

Range End 255.00

Type Intensity

Scanner Settings

ScanMode xyz



StepSize 0.00 m

Voxel X 465.03 nm

Voxel Y 465.03 nm

Voxel Z 0.00 m

Zoom 1.00

Scan-Direction Uni




Frame-Average 4

Line-Average 4

Section Z 1

Hardware Settings




PMT 1 (Offset) 0.00


PMT 2 (Offset) 0.00






Scan Speed 400 Hz










Refraction index 1

Seite 1 von 1

10.07.2009file://D:\Abbildung28\COS-7_Vinblastinsulfat_Mikrotubuli.xml


Iris Hövel �

��CD-ROM

�

� �

Rohbilder und Bachelorarbeit Die gesamte Arbeit sowie die Abbildungen 20 bis 28 samt Originaldateien sind in Form einer

CD-ROM beigefügt.

Documents

Einflüsse der Alkaloide Noscapin, Paclitaxel, Phalloidin ... · •DNA Interkalation und Schädigung •Apoptotisch durch Aktivierung von nF-κB, Schädigung der Mitochondien, Zellzyklusarrest