Polizei sucht Täter

Polizei sucht einen Mann der Dienstag früh in einer Maske ein Laboratorium

ausgeraubt hat. Er hat einen Medizinstudenten getötet, der mehrmals ins

Gesicht und in den Rücken geschossen wurde.

Über die Waffe hat die Polizei keine Mitteilung gemacht. Die Polizei hat den

Täter als einen Mann in seiner frühen 20er Jahren beschrieben, der etwa 190

cm hoch ist und eine Make, graue Jeans und ein schwarzes Shirt getragen hat.

„Diese Tiere müssen von den Strassen verschwinden, sie sollten gehängt

werden," sagte der Sicherheitswachmann der die Leiche gefunden hat.

Detektive haben aus 5 Verdächtigen Blutproben genommen.

Ihre Aufgabe ist den Tatort unterzusuchen und die dort genommenen DNA-

Proben mit den Proben der Verdächtigen zu vergleichen.

MISSION:

FALL:

Polizei hat ein Photo des

Täters veröffentlicht

„Menschen lügen aber Beweise lügen

nicht”

Arten der Beweise:

- indirekt (z.B. Photo)

- direkt (z.B. Haare)

- „kalter Beweis” (Textilien)

- „heisser Beweis” (DNA)

Quellen der biologischen Beweise

• Blut

• Sperma

• Speichel

• Harn

• Haare

• Zähne

• Knochen

• Gewebe

Blut

Nur sehr wenig Blut

(3l) wird

gebraucht um das

DNA-Profil zu

bestimmen

ORGANIC Filter Paper

CHELEX-Methode Blood

stain

PUNCH

WASH Multiple Times with

extraction buffer

PERFORM PCR

PCR

Reagents

SDS, DTT, EDTA

and

proteinase K

INCUBATE (56 oC)

Phenol,

chloroform,

isoamyl alcohol

QUANTITATE

DNA

Apply blood to

paper and allow

stain to dry Blut

VORTEX

(NO DNA QUANTITATION

TYPICALLY PERFORMED WITH

UNIFORM SAMPLES)

Wasser

INKUBATION

5%

Chelex

INKUBATION (100 oC)

Überstand wegwerfen

INKUBATION (65oC)

Bestimmung der

DNA Konz.

PCR

PERFORM PCR

Centrifuge

Zentrifugieren

Centrifuge

Zentrifugieren

REMOVE supernatant TRANSFER aqueous (upper) phase

to new tube

CONCENTRATE sample (Centricon/Microcon-100 or ethanol

precipitation)

Centrifuge

TE buffer

Figure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

DNA-Extraktion aus Blut

Praktikumsaufgabe:

0. Probenahme am Tatort

1. DNA-Isolierung

2. DNA-Amplifikation (PCR)

3. Gelelektrophorese

4. Analyse der Proben

1. Aufgabe: DNA-Isolierung aus

Lymphozyten

• Probe: Blut auf einem Stück Textil – Schneiden Sie die Hälfte des Blutflecks

aus und legen Sie es in ein Eppendorf-Röhrchen

• Geben Sie 1000 l sterilem Wasser zur Probe

• Vortexen

• Inkubation bei Raumtemperatur für wenigen Minuten

• Vortexen

• Zentrifugieren für 2 min mit 1500 rpm

• Pipettieren Sie daraus 950 l

• Geben Sie 150 l 1% Chelex Lösung + 50 l ProtK Enzyme zu den Proben

• Inkubieren Sie das Röhrchen in Ihren Händen für wenigen Minuten

• Vortexen

• 65 Co 2 min, (ProtK Inaktivierung)

• Egen Sie die Probe auf Eis

2. Was für eine Komponenten brauchen wir zur

PCR?

Geben sie die folgenden Komponenten zu 5 l DNA-

Probe:

• 26,5 l destilliertes Wasser

• 5 l PCR Puffer Mix

• Primer 1 (forward) 2,5 l

• Primer 2 (reverse) 2,5 l

• 5 l dNTP Mix

• 2,5 l MgCl2

letztlich:

• 1 l Ultra Fast DNA Polymerase (auf Eis zu lagern)

LASSEN SIE DIE PCR REAKTION LAUFEN!

PCR Program: CSI

1. 95 Co 2 min

2. 95 Co 10 sec

3. 55 Co 15 sec

4. 72 Co 20 sec

• 30x: Schritt2-Schritt4

• 1 min 72 Co

• 4 Co (Gesamtzeit: ca. 30 min)

Was sind die Schritte der PCR?

Speed of Analysis

(Technology)

Statistischer Kraft

der genetischen

Diskrimination

Langsam

Hoch

Langsam Schnell

Die verschiedene Methoden die in

Gerichtsmedizin bekannt sind

RFLP

Single Locus Probes

RFLP

Multi-Locus Probes

ABO

Blut Gruppe

Multiplex PCR

of STRs

DQ

single STR

D1S80

mtDNA PCR: HV1,

HV2

PolyMarker

Figure 1.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

Was bedeutet Multiplex PCR? Was bedeutet RFLP?

Minisatellite Marker (D1S80)

GAGGACCACCAGGAAG

Repeat Region

Flanking Regione

16 bp repeat unit

STR Marker (TH01)

TCAT

Repeat Region

Flanking Regione

4 bp Repeat

Untereinheit

Figure 5.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

2 Repeats

3 Repeats

--------AGACTAGACATT-------

--------AGATTAGGCATT-------

---------(AATG)(AATG)(AATG)----------

---------(AATG)(AATG)----------

(A) Length polymorphism: VNTR oder STR – Technik: (VNTR-PCR)

(B) Sequence polymorphism: SNP – Technik: (AS-PCR)

Figure 2.5, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

Polymorphismen auf den homologen Chromosomen

Erste Fälle der DNA-Identifizierung

Kurze Geschichte der

gerichtsmedizinischen DNA-Methoden

1900s: Landsteiner: Entdeckte die ABO Blutgruppen: Revolution in der

gerichtsmedizinischen Methodologie. Kraft der Methode: 103

1980s: RFLP+DNA detektiert durch Southern blotting. Alec Jeffreys

entwichelte das erste “DNA Profiling” für Krankheitsmarker. Kraft der

Methode: 106

Mitte der 1980er: Der Colin Pitchfork Fall in England: der erste DNA-Beweis

benutzt vom Gericht. Zwei junge Frauen vergewaltigt und ermordet in

Narborough, England. 5,000 lokale Menschen wurden nach

Blu/Speichelproben gefragt. Erster Freispruch und Verurteilung an

Hand vom DNA-Beweis von Jeffreys

Probleme mit RFLP: relativ viel DNA wird gebraucht (50 ng = tausende

von Zellen). Nicht ideal für Gerichtsmedizin, da oft nur wenige,

degradierte Proben zur Verfügung stehen

Sir Alec

Jeffreys

1984: Entwicklung der PCR von Karry Mullis

Funktioniert mit kleineren Mengen (1-2ng), mit Proben schlechter Qualität

1986: PCR von STR: Nicht-kodierende, 4-7 Nukleotid-langee Sequenzen,

welche hoch variabel in der Anzahl der Wiederholungen zwischen

Menschen ist! Braucht <1ng of DNA um 13-15 STR Loci zu untersuchen.

Kraft der Methode: 1014 - 1023

1987 FBI mit NIH hat kollaborative Forschung begonnen um Techniken der

DNA-Identifizierung auszuarbeiten: der „Combined DNA Index System

(CoDIS)” ist ein Datenbank von DNA-Profilen aus Verbrechern und

Tatortproben.

1990er: DNA Analyse wurde als unfehlbar gesprochen beim Strafverfahren.

Kurze Geschichte der

gerichtsmedizinischen DNA-Methoden

Der O.J. Simpson Fall

Prozess des Jahrhunderts: “Dollars gegen DNA” oder

California vs OJ Simpson.

1995: OJ Simpson Urteil: ‘unschuldig'

CODIS Combined DNA Index System (FBI und NIH)

Geschlechts-

spezifisches Marker

13 CODIS STR Loci mit

chromosomalen Positionen

FBI’s STR LOCI

Neue, erweiterte STR Loci verwendet von FBI, InterPol, usw.

Im Fall von 13 Markern ist die Wahrscheinlichkeit dass zwei

Proben identisch sind :

ca.1:1000 000 000

In welchen Fällen ist diese Wahrscheinlichkeit grösser?

Laser

Inlet

Buffer

Capillary filled with

polymer solution

5-20

kV

- +

Outlet

Buffer

Sample

tray

Detecti

on

window

(cathode) (anode)

Data

Acquisition

Sample tray moves automatically

beneath the cathode end of the

capillary to deliver each sample in

succession

Kapillarrohr

Elektrode für Probeinjektion

Kapillar Elektrophorese

Was sind die technische Grundlagen der STR produkt- Analyse?

Primers sind markiert mit Fluoreszenzstoff

(A) Simultane Amplifikationen der drei Allelen auf dem homologen Chromosomenpaar

Locus A Locus C Locus B

(B) Multiplex PCR Produkte werden mit Kapillar Elektrophorese separiert

A C B

small large

Modified Figure 4.3 J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

Locus A Locus C

(t)

(RF

U)

RFU: relative fluorescence unit

t: time

50 bp 70 bp

10min 15 min

Deletion of Locus B

Wie liegen die Produkte

auf dem Chromatogram

D3S1358 (8 alleles)

VWA (14 alleles)

D16S539 (9 alleles)

D2S1338 (14 alleles)

Blue panel

Green panel

Yellow panel

Orange panel

D21S11 (24 alleles)

D8S1179 (12 alleles)

D18S51 (23 alleles)

TH01 (10 alleles)

FGA low (19 alleles)

FGA high (9 alleles)

250 bp* 139bp 200 bp 160 bp

300 bp 340 bp 350 bp

150 bp

LIZ-labeled GS500 DNA sizing standard

100 bp

Red panel

D19S433 (15 alleles)

D5S818 (10 alleles)

TPOX (8 alleles)

D13S317 (8 alleles)

D7S820 (10 alleles)

CSF1PO (10 alleles)

AMEL (2 alleles)

Figure 5.6, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

11,14 8,12

12,14 11,12 8,14 12,14 8,11

Väterliche Allele 14 14 11 14 11

C,D A,B

B,C

Mutter Vater

Kind

(B) Beispiel

(A) Mendelsche Vererbung

Figure 23.2, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

Vaterschaftsteste mit STRs

Was sind die Genotypen der

Kinder?

DNA Profil

Des Opfers

DNA Profil

Von dem

Direkten Evidenz (zB eine Zahnbürste)

(A) Direct comparison of STRs with related objects

(B) Indirect comparison: kinship analysis

D5S818 D13S317

D7S820 D16S539

CSF1PO

Penta D

?

Sohn

Frau

Betroffener D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 CSF1PO Penta D

10,10 9,10 9,13 8,9 8,14 11,13 Sohn

Frau 10,12 8,10 8,9 8,12 8,12 11,13

10,10 9,12 11,13 9,9 11,14 12,13

?,10 9,? ?,13 9,? ?,14 11,? or

?,13

Vater Vorausgesgtes

Profil

Profil des

Betroffenes

Figure 24.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

D1 = Biologische Tochter von den beiden Eltern

D2 = Kind der Mutter und ihr voriges Mann

Einfache Vaterschaftsteste

S1 = Biologisher Sohn des

Ehepaars

S2 = adoptierter Sohn Alle Menschen haben VNTRs

VNTRs kommen aus der genetischen Information von den Eltern. Kinder haben

– VNTRs der Mutter, des Vaters oder eine Kombination der beiden

– keine VNTRs die nicht von einem der beiden Eltern stammen

3. Gelelektrophorese

• Geben Sie 5 l PCR Probe zur

vorbereiteten blauen Laufpuffer

• Tragen sie die ganze Probe (10 l) auf das

Gel gefärbt mit GelRed auf

• Lassen sie das Gel für 30 min

bei 100V laufen!

PRAKTIKUMSAUFGABE - VNTR ANALYSE UNTERSUCHUNG VON EINEM, AUCH VON FBI BENUTZTEN VNTR LOCUS (FGA)

IN 5 MITARBEITERN DES BIOLOGISCHEN INSTITUTS

Die PCR-Primers haben wir auf die Konsensussequenzen an den beiden Seiten der

wiederholenden Region geplant:

P1: gctagtaacggcattaccag

P2: catcgcataagaatttcacg

LÄNGE DER WIEDERHOLENDEN EINHEIT: 4 bp, SEQUENZ: TTTC

ANZAHL DER WIEDERHOLUNGEN: 5-250, ALSO WIR ERWARTEN PRODUKTE

ZWISCHEN:

60-1040 bp

(die Länge der beiden Primer sind natürlich eingerechnet).

BESTIMMEN SIE, WIEVIELE WIEDERHOLUNGEN DIE AMPLIFIZIERTEN ALLELE

ENTHALTEN!

PRAKTIKUMSAUFGABE - VNTR ANALYSE

75 180 58 74 75

75 80 28 20 15

1 2 3 4 5

420

620

90

140

180

270

340

770

1900 Lösung:

Nach dem

Abziehen von der

Länge der beiden

Primern (40bp),

teilen wir die

DNA-Fragment-

längen mit 4, so

bekommen wir die

Anzahl der

Wiederholungen

340

100

120

152

272

336

360 340

760

Anzahl der tandemartigen Wieder-

holungen in den beiden Allelen

1. AUFGABE

VNTR Ella Linda Thomas Johann Peter Uwe Franz

A 7 & 8 2 & 7 3 & 7 2 & 7 2 & 8 3 & 7 3 & 2

B 4 & 5 6 & 4 4 7 6 4 6

C 11 & 8

11 & 9 9 & 10 13 & 8 10 9 & 12 9 & 13

D 7 & 19

21 & 7 21 & 7 7 & 9 21 & 7 15 & 8 21 & 15

E 10 & 6 12 & 6 6 & 9 12 & 9 17 & 10

6 & 12 17 & 12

Ella SUCHT Sie mit ihrer Tochter, Linda auf. Ella erzählt, das der Vater von Linda ist einer der

Mitglieder der Beatgruppe „Freude”. Basierend auf die DNA-Proben entnommen von den

Mitgliedern der Gruppe machen Sie eine VNTR-Analyse.

Wer ist der Vater von Linda? Warum?

Warum ist B-Mikrosatellit speziell?

1. AUFGABE

VNTR Ella Linda Thomas Johann Peter Uwe Franz

A 7 & 8 2 & 7 3 & 7 2 & 7 2 & 8 3 & 7 3 & 2

B 4 & 5 6 & 4 4 7 6 4 6

C 11 & 8 11 & 9 9 & 10 13 & 8 10 9 & 12 9 & 13

D 7 & 19 21 & 7 21 & 7 7 & 9 21 & 7 15 & 8 21 & 15

E 10 & 6 12 & 6 6 & 9 12 & 9 17 & 10 6 & 12 17 & 12

Ella SUCHT Sie mit ihrer Tochter, Linda auf. Ella erzählt, das der Vater von Linda ist einer der

Mitglieder der Beatgruppe „Freude”. Basierend auf die DNA-Proben entnommen von den

Mitgliedern der Gruppe machen Sie eine VNTR-Analyse.

Wer ist der Vater von Linda? Warum? FRANZ

Warum ist B-Mikrosatellit speziell? ES IST X-CHROMOSOM GEKOPPELT

(+) CCT GAC TTT AGC ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAT.................. CTA GCG CCA TCC CTT CTA ACT

(-) CCT GAC TTT AGC ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAA..................... CTA GCG CCA TCC CTT CTA ACT

2. AUFGABE Die Sequenz oben ist Wildtyp (+), die Sequenz unten ist mutant (-).

Suchen sie die Mutation!

Zu welchem Typ gehört diese Mutation?

(+) CCT GAC TTT AGC ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAT.................. CTA GCG CCA TCC CTT CTA ACT

(-) CCT GAC TTT AGC ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAA..................... CTA GCG CCA TCC CTT CTA ACT

Die Sequenz oben ist Wildtyp (+), die Sequenz unten ist mutant (-).

Suchen sie die Mutation!

Zu welchem Typ gehört diese Mutation?

Punktmutation, eine andere Aminosäure wird eingebaut, ”Missense”

Was für eine Methode kennen Sie für die Identifizierung von Punktmutationen/SNPs?

(+) 5’ ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAT........... CTA GCG CCA TCC CTT CTA ACT 3’

3’ TAC GGC CCT AGC CAA GAA TTA GAT CGC GGT AGG GAA GAT TGA 5’

(-) 5’ CCT GAC TTT AGC ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAA........... CTA GCG CCA TCC CTT CTA ACT 3’

3’ GGA CTG AAA TCG TAC GGC CCT AGC CAA GAA TTT GAT CGC GGT AGG GAA GAT TGA 5’

5’ ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAT 3’

5’ CCT GAC TTT AGC ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAA3’ 5’ AGT TAG AAG GGA TGG CGC TAG 3’

ASA (Allelspezyfische Amplifikation)

PCR PRODUKTE

5’ AGT TAG AAG GGA TGG CGC TAG 3’

GELELEKTROPHORESE DER PCR-PRODUKTE

+/+ -/- +/-

Gerichtsmedizin in der Zukunft?

Eine Assoziationsforschung identifizierte fünf Loci

(PRDM16, PAX3, TP63, C5orf50 und COL17A1), welche die

Gesichtmorphologie bei Europäern beeinflussen:

z.B.: PAX3 beeinflusst die Position des Nasions.

Citation: Liu F, van der Lijn F, Schurmann C, Zhu G, Chakravarty MM, et al. (2012) A Genome-Wide Association Study Identifies Five Loci Influencing Facial Morphology in Europeans. PLoS Genet 8(9): e1002932.

Bestimmen Sie bitte die Augen- und Haarefarbe der Täter,

wenn sein DNA-Profil aus den folgenden SNPs besteht:

Blue/green Brown Blond/red Brown

HERC2

Rs12913832 GG/CC

AA/TT GG/CC AA/TT

Oca2

rs1800407 AA/TT GG/CC AA/TT GG/CC

Tyr

Rs1393350 AA/TT GG/CC AA/TT GG/CC

IRF4

rs12203592 TT/AA CC/GG TT/AA CC/GG

SLC24A5

rrs16891982 GG/CC CC/GG GG/CC CC/GG

ExoC2

rs49592270 AA/TT CC/GG AA/TT CC/GG

Augen HAAR Gen/SNP Ergebnisse der Sequenzierung: Rs12913832: AA Rs1800407: GG Rs1393350: GG Rs12203592: CT Rrs16891982: CC Rs49592270: AC

The HIrisPlex system for simultaneous prediction of hair and eye colour from DNA Forensic Science International: Genetics

Volume 7, Issue 1, January 2013, Pages 98–115

IrisPlex: A Sensitive DNA Tool for Accurate Prediction of Blue and Brown Eye Colour in the Absence of Ancestry Information Journal:

420

620

90

140

180

270

340

1900

272

152

120

336

100

340 360

Opfer 3 2 1

Verdächtigen

Marker

Referenzgel

Vergleichen Sie die Proben der Verdächtigen mit den

amplifizierten Proben und bestimmen Sie die Anzahl

der Wiederholungen in den amplifizierten Proben!

Wer ist der Täter vermutlich?

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Wichtige Begriffe

• Die Schritten der PCR

• Identifizierungstechniken der Personen:

• RFLP, VNTR, STR, SNP, ASA, Kapillar

Gelelektrophorese, CODIS, DNA

Fingerabdruck