Potenzialund Herausforderungen der … · University Division/Office Das äussere Segment von Photorezeptoren ist ein spezialisiertes primäres Zilium Zilienmutant ... -Immunsystem

University Division/Office

Potenzial und Herausforderungen der Genomchirurgie mit CRISPR

- in der biomedizinischen Grundlagenforschung- in der Medizin

R. Bachmann-Gagescu, Dr. Med.FMH Pädiatrie und FMH Medizinische Genetik

SNSF-Förderungsprofessorin

Institut für Medizinische Genetik und Institut für Molekularbiologie

University Division/OfficeInstitut für Medizinische Genetik und Institut für Molekularbiologie

Vielfalt von spezialisierten Zellarten


Der genetische Code

}Ser

ist universel!

A = adeninT = thymin

C = cytosinG = guanin

http://biosocialmethods.isr.umich.edu/

RNA

Aminosäuren-Kette (Peptid)


Konsequenzen einer Punktmutation


Phänotyp


}Leu

University Division/OfficeInstitut für Medizinische Genetik und Institute for Molecular Life Sciences


X X

Phänotyp

}STOP



>20’000 Gene (jeweils in 2 Kopien)23 Paare Chromosome

Das menschliche Genom


Prof Stylianos Antonarakis



XX Phänotyp/Erscheinungsbild

Gen




XX Phänotyp/Erscheinungsbild

Gen


Korrektur einer Punktmutation?


Prinzip der Genomchirurgie mit CRISPR





= Nuklease




= Nuklease

Leit-RNA =



präzis kontrollierte Veränderung der

Gensequenz


= Nuklease

Leit-RNA =

+ Schablone



«ungenaue» Störung der Genfunktion

präzis kontrollierte Veränderung der

Gensequenz


= Nuklease

Leit-RNA =

+ Schablone


Nukleasen sind schon seit langem benützt… Was ist anders?

Vorteile des CRISPR/Cas Systems

¾ Erkennung der Zielregion in der DNA durch spezifische RNA vermittelt und nicht durch einen Proteinteil

Æ viel einfacher, schneller und billiger

Æ sehr effiziente Nuklease


Kyoto Platform for Genetically Modified Rats


“Molecular biologists are riding a wave of new technologies made possible by CRISPR.” Nature, Views Forum March 2016



Anwendungen der Genomchirurgie



Krankheitsmodelle für Pathogeneseforschung1. Monogene Erkrankungen

NHEJHDR

Knock-outSpezifischeSequenzvariante



Ziliopathien

- Gruppe von genetischen Erkrankungen

- Kann +/- alle Organe betreffen

Goetz and Anderson, Nat reviews 2010



Ziliopathien

Goetz and Anderson, Nat reviews 2010


Joubert Syndrom

ÆKleinhirnmissbildung, zystische

Nierenerkrankung, Retinitis, Polydacytlie

Æ Verschiedene ursachliche Gene


Primäre Zilien - Auf der Oberfläche von allen Zellen- Dienen als “Antennae”: Signalübertragung

Bachmann-Gagescu et al., 2011



Modelle: Zebrafischwildtyp

Zilienmutant

- Zebrafische haben dieselben

Ziliengene

- Mutanten haben ähnliche

Symptome :

- Nierenzysten und

Netzhautdystrophie




Das äussere Segment von Photorezeptoren ist ein spezialisiertesprimäres Zilium Zilienmutant

Zilienmutant

wt

wt




CC2D2A führt zu Retinitis durch ein Defekt in Membrantransport in Photorezeptoren

wt Zilienmutant

Institut für Medizinische Genetik

Bachmann-Gagescu et al., 2011Ojeda Naharros et al., 2017



CC2D2A führt zu Retinitis durch ein Defekt in Membrantransport in Photorezeptoren

Institut für Medizinische Genetik

Ojeda Naharros et al., 2017



Krankheitsmodelle für Pathogeneseforschung1. Monogene Erkrankungen

NHEJHDR

Knock-outSpezifischeSequenzvariante



Krankheitsmodelle für Pathogeneseforschung2. Komplexe genetische Erkrankungen

X

X

X

XPhänotyp






Zellkultur/ iPSC- Induced pluripotent stem cells

differenzierte Zellen

pluripotente Zellen

pluripotenzielle Zellen


- Zur Pathogenese Forschung- Zur Therapie?







http://www.genome.gov/glossary/


Theoretische Anwendungen für Gentherapie

Institut für Medizinische Genetik und Institute for Molecular Life Sciences

Genomchirurgie «ex vivo»Genomchirurgie «in vivo»

Anwendungen der Genomchirurgie beigenetischen Erkrankungen


Praktische Einschränkungen und offene Fragen


1. «Off-target» Effekte?Spezifizität der Nuklease? Von der Zielregion abhängig?

2. Mosaik?Heterogene Zellpopulationen


3. Konsequenzen der geplanten Genveränderung?

4. Lebenszeit und Funktion der korrigierten Zellen imGewebe?



Theoretische Anwendungen für Gentherapie


Genomchirurgie «ex vivo»



Therapien mit CRISPR- Zukunft in der Klinik?Genomchirurgie «ex vivo»: Für monogene Erkrankungen

- Sichelzellanämie (HBB p.E6V)

2015

- Thalassemie (HBB)

2016


Wikipedia



Genomchirurgie «in vivo»: Für monogene Erkrankungen

- Mausmodell für TyrosinämieKorrektur des mutierten Genes “in situ”Æ gesundes Gen wird hergestellt.

(Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Yin et al, Nat Biotech 2014.)

(2014: <1% der Hepatozyten konnten das korrigierte Gen exprimieren2016: 6% der Hepatozyten konnten das korrigierte Gen exprimieren)

- Mausmodell für Duchenne muskuläre DystrophieAusschneiden des Exons, das die Mutation enthältÆ inkomplettes Gen wird hergestellt.

(Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Long et al, Science 2016.)


Therapien mit CRISPR- Zukunft in der Klinik?












X











X




InfektiologieOnkologie

Anwendungen der Genomchirurgie beiNICHT primär genetischen Erkrankungen



� Für nicht primär genetische Erkrankungen : Onkologie









Checkpoints

Zellzyklus

Checkpoints Checkpoints








Zellzyklus




- Pro-Krebs Gene im Tumor still legen



Zellzyklus





- Immunsystem gegen Krebszellen stärken




XX

X




- Immunsystem gegen Krebszellen stärken




XX

X



� Für nicht primär genetische Erkrankungen: Inketiologie




HIV Lymphozyten













CCR5




















Klinische Studien mit CRISPR Nukleasen-Voraussetzungen

1. Safety first: - Off-target Effekte erläutern und vermindern

2. Effizienz: Technische Aspekte (von der genauen Situation abhängig…)

- Ex-vivo Anwendungen: Zellentnahme und Einführung, Selektion der optimalen korrigierten Zelllinie und Qualitätskontrolle, …

- In-Vivo Anwendungen: Einführungsmethode des CRISPR/Cas9 Systems und Effizienz, Mosaik, Lebensdauer der korrigierten Zellen/der Korrektur,…

3. Ethische Aspekte




Erste klinische StudienInstitut für Medizinische Genetik und Institut für Molekularbiologie


Erste klinische Studien



Somatische Zellen

Ethische Aspekte

Nature, March 2015

Theoretische Möglichkeit, das Genom jedes Lebewesens auf Wunsch zu ändern


Keimbahn


Ethische Aspekte

Mögliche Anwendungen� Auf somatischen Zellen:- Gentherapie bei monogenen

Erkrankungen- Therapien für Krebs, virale

oder parasitäre Erkrankungen

Ethische Fragen- Sicherheit- Effizienz- Wirtschaftlichkeit- Finanzielle Ungerechtigkeit


Nature, March 2015




Ethische Aspekte

Mögliche Anwendungen� Auf Keimzellen:- Korrektur vererbarer

Mutationen pränatal- Wunschbabies und «Enhanced

humans»???

Ethische Fragen- Sicherheit- Effizienz- Wirtschaftlichkeit- Finanzielle Ungerechtigkeit- Gesellschaftlicher Druck- Einfluss auf die Integration für

Menschen mit Behinderungen in der Gesellschaft

- Unser Verständnis des Genoms ist noch begrenzt

- Sind wir nur die Summe unserer Gene?


Nature, March 2015




Ethische Aspekte

Nature, March 2015



Rechtliche Aspekte- Dezember 2015:

Internationale Konferenz der amerikanischen, englischen und chinesischenwissenschaftlichen Akademien:

“Gene-editing technology should not be used to modify human embryos that are intended for use in establishing a pregnancy”

- ESHG public and professional policy group article (Howard et al, 2017):

Nature News feature, October 2015



Gesellschaftliche Entscheidungen

«Generation game»: today’s decisionsshape tomorrow’s world

Nature editorial 2016



Genomchirurgie mit CRISPR/Cas

- Hoch effiziente und “einfache” Technologie, die es erlaubt das Erbgut zuverändern

- Gezielte präzise Veränderungen sind bisher noch schwierig zu erreichen; Genfunktionstörung ist sehr effizient erreichbar

- Mögliche Anwendungen zur Behandlung von genetischen Erkrankungen:

- “ex vivo” vs “in vivo”

- erste Erfolge in präklinischen Studien bei ex vivo Studien(Hämatologie)

- Mögliche Anwendungen zur Behandlung anderer Erkrankungen:

- Onkologie/ Infektiologie

- Klinische Studien schon im Gange

- Ethische Debate hauptsächlich über den Eingriff auf die Keimbahn



University Division/OfficeInstitut für Medizinische Genetik und Institute for Molecular Life Sciences


Klinische Studien mit Nukleasen



Sangamo BioSciences Presents Phase 2 Clinical Data From Two SB-728-T HIV StudiesPreliminary Data Suggest Adenoviral Delivery Method Superior for Immune Stimulation and Control of Viral Load in the Absence of Antiretroviral Therapy (ART)Two of Three Subjects Remain Off ART for More Than One YearRICHMOND, Calif., Dec. 11, 2015 /PRNewswire/ -- Sangamo BioSciences, Inc. (Nasdaq: SGMO), the leader in therapeutic genome editing, announced the presentation of Phase 2 data from two of the Company's ongoing clinical trials (SB-728-1101 Cohort 3* and SB-728-mR-1401) of SB-728-T, which is being developed for the functional control of HIV/AIDS. The preliminary comparative data suggest that adenoviral delivery of zinc finger nucleases (ZFNs) to T-cells may be uniquely immune-stimulatory for both acute control of infection, and importantly, HIV reservoir reduction.


Zellkultur/ iPSC



Study diseasemechanism

modified from Robinton and Daily, Nature 2012





Wie kann man die für die Erkrankung relevanten Zellen entnehmen und wieder einführen?






Wie effizient ist die Differenzierung und die Funktion der modifizierten Zellen?






Welche Effizienz braucht man für eine klinische Besserung/ Heilung?Was sind die Konsequenzen einer Mosaik?


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Potenzialund Herausforderungen der … · University Division/Office Das äussere Segment von Photorezeptoren ist ein spezialisiertes primäres Zilium Zilienmutant ... -Immunsystem