This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

566 L. REIMER

Keimblätter in der Wanne betrug etwa 300 mg für die Dunkelversuche und 50 mg für die Hellversuche. — Der Gasraum enthielt außer der Kohlensäure wechselnde Ge­mische von Kohlenoxyd mit Sauerstoff oder von Argon mit Sauerstoff. Wurde der Stoffwechsel in Argon und Kohlenoxyd verglichen, so waren immer die Anfangs­drucke an Sauerstoff gleich, die sich im Lauf der Ver­suche nicht weit von den Anfangsdrucken entfernen soll­ten. — Die Gefäße wurden im Thermostaten bei 20 °C mit einer Frequenz von 200 pro Min. horizontal bewegt.— Belichtet wurde mit einer Metallfadenlampe, in der aus Abb. 1 ersichtlichen Weise, wobei die Filter 20 cm

Wasser, 1 cm 1 -proz. CuS04-5 H20 und 2 mm Rotglas II von Schott waren. Dieses rote Licht wird von dem 0 2

übertragenden Haemin nicht adsorbiert und konnte also die Kohlenoxydhemmungen nicht beeinflussen. Der auf die Keimblätter auftreffende Energiestrom betrug etwa 90 mm3 Quanten pro Minute. „Weißes“ Licht der glei­chen Intensität hob die CO-Hemmungen auf.

Versuchsbeispiel. Hemmung von Atmung und Photo­synthese durch ein Gemisch von 3 Vol.-% 0 2 in CO. Für beide Gefäße v = 22,5 cm3, ?/f = 3,2 cm3. Berechnung der Hemmungen aus den Druckänderungen dp /d t, Hellwerte korrigiert für Dunkelatmung. 20 °C.

Quantitative Untersuchung zur Massenabnahme von Einbettungsmitteln

(Methacrylat, Vestopal und Araldit) unter Elektronenbeschuß

Von L u d w i g R e i m e r

Aus dem Physikalischen Institut der Universität Münster i. W.(Z. Naturforschg. 14 b, 566— 575 [1959] ; eingegangen am 4. Juni 1959)

Mit einer Elektrometer-Anordnung zur Messung des Elektronenstromes in der Bildschirmebene werden aus dem elektronenmikroskopischen Kontrast vergleichende Ergebnisse zur Massenabnahme von Dünnschnitten aus Methacrylat, Vestopal und Araldit gewonnen. Bei Methacrylat-Schnitten ge­lingt eine Trennung des Massenverlustes in Beiträge durch Oberflächen-Verdampfung und innere Umwandlung infolge des Verlustes der Nichtkohlenstoff-Komponenten. Es kann ferner nachgewiesen werden, daß eine Bedeckung mit einer Kohleschicht die Verdampfung des Methacrylates verhindert.Der Substanzabbau der Methacrylat-Folien wird außerdem durch IR-Spektren quantitativ verfolgt.Oberflächen-Abdrücke bestrahlter Schnitte zeigen den Vorteil von Vestopal- oder Araldit-Schnitten mit relativ geringem Massenverlust gegenüber Methacrylat-Schnitten.

1. Problemstellung

Die im Jahre 1949 durch N e w m a n , B o r y s k o und S w e r d l o w 1 eingeführte Einbettung biologischer Ob­jekte in Methacrylat hat die Anwendung der Dünn- schnitt-Technik in der Elektronenmikroskopie sehr stark gefördert und die systematische Untersuchung der sublichtmikroskopischen Feinstruktur ermög­licht. Ein großer Nachteil des Methacrylates ist aber die starke Schrumpfung (10 — 15%) während der Polymerisation, die zu Objektschädigungen (z. B. Zerreißen von Membransystemen) führen kann oder Blasenbildung neben dem Objekt verursacht, welche die Stabilität des Blockes für den Schneidevorgang herabsetzt. Es sind daher in letzter Zeit Einbettungs­mittel erprobt worden, die vor allem diese starke Schrumpfung vermeiden. Von diesen haben insbe­sondere Vestopal W ( R y t e r und K e l l e n b e r g e r 2)

und Araldit ( G l a u e r t und Mitarbb. 3) größere Ver­breitung gefunden. Vestopal W erfährt bei der Po ly­merisation nur eine Schrumpfung von 7 — 10% und

1 B . N ew m an , E. B orysko u . M. S w e rd lo w , J. Res. nat. Bur.Standards 43, 183 [1949].

2 A. R yte r u . E. K ellenb erg er , J. Ultrastructure Res. 2, 200[1958]; Experientia [Basel] 12,421 [1956].

Araldit sogar nur um 2 Prozent. Leider haben diese Einbettungsmittel im monomeren Zustand Mol.-Gew. von 2000 — 3000 und dringen daher wesentlich schlechter in das Gewebe ein als monomeres Meth­acrylat mit einem Mol.-Gew. von etwa 140.

Neben der Schrumpfung während der Polym eri­sation zeigt Methacrylat aber auch einen großen Massenverlust unter Elektronenbeschuß (s. a. L i p -

p e r t 4) , der gemäß Abb. 1 zu einer Veränderung des Präparates führen kann, die sich z. B. in einer un­scharfen Abbildung von Membransystemen (insbe­sondere Doppel-Lamellen) äußert. Aber auch faden­förm ige oder globuläre Elemente können sich ver­lagern und die Deutung der elektronenmikroskopi­schen Aufnahmen bei sehr hohen Vergrößerungen erschweren. Demgegenüber zeigen in Vestopal oder Araldit eingebettete Gewebe in den Dünnschnitten wesentlich schärfere Membransysteme, weil der Mas­senverlust durch Elektronenbeschuß geringer ist und Artefakte nach Abb. 1 nicht in dem Maße auftreten können. Es soll ein Ziel der vorliegenden Arbeit

3 A. M. G la u e r t , G . E. R ogers u . R . H. G la u e r t , Nature [London] 178. 803 [1956] ; J. Biophys. Biochem. Cytol. 4, 191 [1958].

4 W. L ip p e r t , Optik 15. 293 [1958].

MASSENABNAHME VON EINBETTUNGSMITTELN UNTER ELEKTRONENBESCHUSS 567

unbesfrahlt

Abb. 1. Veränderung der Objektstruktur in einem Meth- acrylat-Schnitt (insbesondere Doppel-Lamellen) bei Massen­

verlust des Schnittes durch Elektronenbeschuß.

sein, die Massenverluste der drei Einbettungsmittel quantitativ miteinander zu vergleichen.

Nach Untersuchungen von W a ts o n 5 soll das Meth-

acrylat aus Schnitten durch Erhitzen im Vakuum

durch einen glühenden W o lfram drah t vollständig

verdam pft werden können. Auch bei der Elektronen­

bestrahlung von Dünnschnitten ist eine teilweise

V erdam p fung des M ethacrylates zu vermuten, vor

allem weil beim Elektronenbeschuß Depolym erisa-

tion auftreten kann. W a tso n 6 schlägt daher vor, die

Schnitte beidseitig m it Fo lien zu bedecken, indem

die der Form varfo lie abgekehrte Seite mit einer

zweiten Formvarschicht oder einer K oh le -A u f dam pf­

schicht bedeckt w ird . G leichartige Versuche von

W illia m s und K a l lm a n 7 zeigten jedoch nicht den

gewünschten E rfo lg . In der vorliegenden A rbe it

w urde der Versuch unternommen, auch diese D is ­

krepanz durch quantitative Untersuchungen des M as ­

senverlustes zu klären.

2. Meßverfahren

Die Erfassung des Massenverlustes erfolgte über die Messung der Abnahme des elektronenmikroskopischen Kontrastes. Dieser wurde durch Messung des Elektro­nenstromes in der Leuchtschirmebene mit einem ab­geschirmten F a r a d a y - Käfig (3 mm2 Öffnung) und einem Schwingkondensator-Elektrometer (Frieseke & Hoepfner) erhalten. Abb. 2 zeigt die schematische An­ordnung. Es kann entweder durch ein Loch im an­geklappten Leuchtschirm (wie in Abb. 2 gezeichnet) eine 0,3 mm2 große Fläche des Endbildes auf ihre

5 M. L. W atson , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 10,349 [1953].

6 M. L. W atson , J. Biophys. Biochem. Cytol. 3, 1021 [1957].7 R. C. W il l ia m s u . F. K a l l m a n , J. Biophys. Biochem. Cytol.

1, 301 [1955].

© ©

Methacrylat

7777777,Y yForm vary

Intensität abgetastet werden oder durch vollständiges Hochklappen des Leuchtschirmes die gesamten 3 mm2 der Öffnung des F a r a d a y - Käfigs ausgenutzt wer­den. Die Elektrometer-Anordnung läßt Strommessungen mit einer Empfindlichkeit von 10-17 A zu, wenn der Ableitwiderstand auf 1013 Ohm erhöht wird.

Um die Bestrahlungsdosis der Schnitte gering zu hal­ten und den zeitlichen Verlauf des Massenverlustes er­fassen zu können, wurde mit einer ca. 200-fachen Ver­größerung auf dem Endbildschirm des Elmiskop I ge-

Abb. 2. Prinzip der Meßanordnung zur Messung der Elek- tronenstrahl-Intensitäten mit F a r a d a y - Käfig und

Elektrometer.

arbeitet (nur Objektivlinse eingeschaltet) und abwech­selnd die Elektronen-Intensität an Stellen mit Träger­folie und Schnitt-+ Trägerfolie gemessen. Dadurch wird der Einfluß einer Bedeckung durch Kohleschichten, die sich aus den organischen Restgasanteilen durch Elektro­nenbeschuß niederschlagen und bei L i p p e r t 4 zu einer laufenden Zunahme des Kontrastes führen, eliminiert. Außerdem hat man die gleichen Bedingungen wie in der Praxis bei der Untersuchung der Dünnschnitte vorliegen. Das Schneiden und Auffischen der Schnitte erfolgte nach den bekannten Methoden. Damit Zellstrukturen bei den Kontrastmessungen nicht stören, wurde für diese Untersuchungen leerer Plast geschnitten.

3. Zusammenhang zwischen Streukontrast und Massendicke

Nach Untersuchungen von K ö n i g 8, B r o c k e s , K n o c h

und K ö n ig 9 und B r o c k e s 10 bestehen die Strahlenschädi­gungen organischer Objekte vornehmlich in einem Her­ausschießen aller Komponenten (H, N oder O-Atomen) mit Ausnahme des Kohlenstoffes. Wenn daher die Ab­nahme des Streukontrastes ausgenutzt werden soll, um Aussagen über den Massenverlust der Schnitte zu er­halten, setzt dies voraus, daß beim Verlust von H- oder O-Atomen eine im Verhältnis ihrer Gewichte gleiche Abnahme des Streukontrastes auftritt.

Nach theoretischen Abschätzungen (z. B. von Mo- l i e r e u) gilt für die Zahl A v der in einer Schicht der

8 H. K ö n ig , Z. Physik. 130, 483 [1951].9 A. B ro c k es , M . K noch u . H. K ö n ig , Z. wiss. Mikroskop.

mikroskop. Techn. 62, 450 [1955].10 A. B ro c k es , Z. Physik 149, 353 [1957].11 G. M o l ie r e , Z. Naturforschg. 2 a, 133 [1947].

568 L. REIMER

Dicke Ad gestreuten Elektronen, die in Winkel größer als die Objektivapertur a abgelenkt werden und daher nicht zur Bildaufhellung beitragen:

/!->> 74/3 l^ = - 5 • 1010 (1)

(Z = Ordnungszahl, A = Atomgewicht, y = Dichte, U = Strahlspannung, F * (a /a 0) eine Funktion, welche den Apertureinfluß des Streukontrastes enthält, näheres s. u .).

Diese Formel läßt sich durch Einführung eines Streu­querschnittes o (a ) abkürzen:

= — o (a ) y Ad . (2)r

Integration über die gesamte Schichtdicke d liefert

v = 7 = e - ° ( a) r d (3)V0 Io

wobei v0 die Zahl der Elektronen bedeutet, welche auf die Schicht auffallen und ohne streuende Schicht ge­messen werden können, v bedeutet entsprechend die Zahl der Elektronen, die nach Durchlaufen der Schicht­dicke d durch die Aperturblende hindurchgelassen wer­den, also in Winkel kleiner als a gestreut werden. Die Elektronenstrahl-Intensität I bzw. /„ in A/cm2 ist der Zahl v bzw. v0 der Elektronen proportional.

Als Kontrast K ist die Größe

K = log = 0 (a ) y d (4)

definiert, welche also proportional zur sogenannten „Massendicke“ ist, welche die Dimension g/cm2 besitzt oder in zweckmäßigeren Einheiten: ,«g/cm2.

Bei fester Strahlspannung U und konstanter Apertur a ist der Streuquerschnitt als Proportionalitätsfaktor zwischen Kontrast und Massendicke noch von der ato­maren Zusammensetzung der streuenden Schicht über den Faktor Z4,3/A abhängig. Außerdem hängt a0 und damit die Funktion F * (a /a 0) noch von dieser Größe ab. Wenn man dagegen von vornherein hinreichend kleine Objektivaperturen benutzt (etwa 20//-Blenden), so hat die Funktion F * für alle Elemente einen Zahlenwert nahe 1, so daß in der Abhängigkeit (4) des Kontrastes von der Massendicke die Stofleigensdiaft nur noch im Glied Z i,3/A eingeht. Experimentelle Ergebnisse von H a l l 12 ergaben jedoch Proportionalität mit Z/A . Nach Abb. 3 ist die Größe Z/A praktisch unabhängig von Z, während Zi!3/A nach schwereren Elementen zu stark ansteigt. Auch neuere theoretische Untersuchungen er­geben Proportionalität mit Z/A , wenn man die Elektro­nendichte-Verteilung im Atom genauer berücksichtigt ( L e n z 13) .

Um auch unter den hier benutzten Bedingungen diese Abhängigkeit des Streuquerschnittes von der atomaren Zusammensetzung der Schicht zu prüfen, wurde der Kontrast von Aufdampfschichten auf Formvarunterlage untersucht. Abb. 4 zeigt die Messung des Kontrastes

12 C. E. H a l l , Introduction to Electron Microscopy, NewYork 1953.

Ag•Sb

PtAu j

1•iU

Mij»Al

Ni—

.'CrTi

•Gej

VoPd

Z13/Za

•C

•Be

Z.,40 0 °o O 0 00 0 O O CD > 0

0 10 20 30 HO 50 60 70 80 90z ------►

Abb. 3. Abhängigkeit der Grüßen Z*l3/A und Z /A von der Ordnungszahl Z (A = Atomgewicht).

Massendicke [fj.gr/cm 2]

Abb. 4. Abhängigkeit des Kontrastes von der Massendicke für Aufdampfschichten aus verschiedenen Elementen und Ver­bindungen mit Ordnungszahlen zwischen 6 und 92 (Objektiv­apertur: a = 4,6-10-3 (20-^-Blende), Strahlspannung 60 kV).

bei 60 kV an Schichten aus Elementen und Verbindun­gen mit mehreren Ordnungszahlen zwischen Kohlenstoff und Uran. Die Massendicken dieser Schichten wurden direkt durch Wägung von Glasobjektträgern (ca.18 cm2) vor und nach der Bedampfung erhalten (Ge­nauigkeit der Wägung: ± 0,05/yg/cm2) . Es wurden dabei nur solche Substanzen verwendet, die eine amor­phe oder feinstkristalline Schichtstruktur zeigen. Nach­früheren Untersuchungen des Verfassers14 könnnen nämlich grobkristalline Schichten auf Grund B r a g g ­scher Reflexion an den Netzebenen und Oberflächen- Rauhigkeit Abweichungen vom Exponentialgesetz (3) aufweisen. Abb. 4 zeigt deutlich, daß der Kontrast nicht von Zil3/A abhängen kann, da dann beim Uran nach Abb. 3 der Kontrast bei gleicher Massendicke um einen Faktor 2 größer sein müßte als bei Kohlenstoffschich­ten. Die Gerade, durch welche alle Meßergebnisse in

13 F. L enz , Z. Naturforschg. 9 a, 185 [1954].14 L. R eim er , Z. angew. Physik 9, 34 [1957].

MASSENABNAHME VON EINBETTUNGSMITTELN UNTER ELEKTRONENBESCHUSS 569

Abb. 4 gut angenähert werden können, liefert daher eine Eichkurve zur Ermittlung der Massendicke aus dem Kontrast unabhängig von der atomaren Zusammen­setzung der Schicht. Da zwischen Kohlenstoff und Uran unter den Meßbedingungen kein wesentlicher Unter­schied im Streuverhalten gefunden wurde, wird auch Wasserstoff einen gleichen, seinem Massenanteil ent­sprechenden Beitrag zum Kontrast liefern.

4. Massenverlust von Methacrylat-Schnitten

Die zeitliche Abhängigkeit der Massendicke bei konstanter Bestrahlungs-Intensität zeigt für verschie­dene Schnittdicken den in Abb. 5 dargestellten Ver-

Abb. 5. Zeitlicher Verlauf der Massendicke von Methacrylat- Schnitten verschiedener Dicke (Methyl- : Butyl-Methacrylat

= 20 : 80) unter Beschuß mit 60 kV-Elektronen.

lauf. Man erhält größenordnungsmäßig einen An­halt für die Dicke der Schnitte in Ä , wenn man die Ausgangswerte der Massendicke in jug/cm2 mit 1 0 0

multipliziert. Sämtliche Bestrahlungen erfolgten bei einer Beschleunigungsspannung von 60 kVolt.

ls L. R e i m e r , Naturwissenschaften 44, 335 [1957].

Es sei bemerkt, daß unter normalen Aufnahme­bedingungen (10 000-fache Vergrößerung) diese Veränderung der Massendicke ca. 2000-mal so schnell verläuft, also im Bruchteil einer Sek. be­endet ist. In einer früheren Arbeit des Verfassers liJ

50

W

£ 30£

I Kohle

Methacrylaf 'M ethyl-: Butyl- =20-80

im

10 20 30 W 50 m0 Massendicke [[igr/cm2] vor Beschuß — ►

Abb. 6. Zusammenhang zwischen der Massendicke m e am Ende des Massenverlustes und m0 zu Beginn der Bestrahlung für (X ) Methacrylat-Schnitte (Methyl-: Butyl-Methacrylat = 20 : 80) auf Formvarfolie und (O ) desgleichen mit einer Kohle-Aufdampfschicht bedeckt (s. schematische Zeichnung).

zur Schnittdicken-Bestimmung von Methacrylat- Schnitten aus der Elektronen-Durchlässigkeit wurde die Eichkurve nach den jetzt vorliegenden Erfahrun­gen unter Bedingungen gewonnen (niedrige Bestrah­lungsdosis), bei denen der Massenverlust noch sehr gering war, so daß die damals erhaltene Eichkurve nicht auf bestrahlte Schnitte anwendbar ist, welche mit einer für eine Aufnahme erforderlichen Dosis bestrahlt sind und bei der schon der Massenverlust nach Abb. 5 seinen stationären Endwert erreicht hat.

Neben der Bestrahlungszeit ist in Abb. 5 die auf das Objekt gefallene Strahlendosis in Asec/cm2 ver­merkt. Nach einer Dosis von ca. 10~ 2 Asec/cm2 wird bei allen Schnitten konstanter Kontrast erreicht. Die Messungen erstredeten sich z. T. bis zu 5-mal höhe­ren Strahlendosen, als in Abb. 5 dargestellt sind. Um die durch den Elektronenbeschuß verursachten durch­greifenden Änderungen der Struktur organischer Folien besser verstehen zu können, muß man sich darüber im klaren sein, daß nach Rechnungen von L i p p e r t 4 eine Bestrahlungsdosis von 1 0 ~ 2 Asec/cm2

einer Dosis von 7,5 • 109 Röntgen ( ! ) bei 60 kV ent­spricht.

570 L. REIMER

Es fällt in Abb. 5 auf, daß der prozentuale Massen­verlust (durch Pfeile markiert) mit abnehmender Schichtdicke größer wird. Wenn man die Endmassen­dicke ttie gegen die Anfangsmassendicke m0 aufträgt, lassen sich nach Abb. 6 die Meßpunkte (Kreuze) oberhalb m 0 = 10 //g/cm2 durch eine Gerade darstel­len, die aber nicht durch den Nullpunkt geht.

Dies Ergebnis läßt sich interpretieren, wenn man annimmt, daß der Massenverlust durch zwei Pro­zesse hervorgerufen w ird: 1. einen „inneren Massen­verlust“ als Volumeneffekt durch den Verlust der Nichtkohlenstoff-Komponenten und 2. einer Ver­dampfung von Methacrylat-Molekülen als Oberflä­cheneffekt. Von der gesamten Schnittdicke kann nur ein konstanter Beitrag verdampfen (m y — 2,3 //g pro cm2), weil schließlich der Rest der Methacrylat- Moleküle durch den Elektronenbeschuß derartig ver­ändert ist, daß der Dampfdrude wesentlich geringer wird. Bei sehr dünnen Schnitten muß dagegen Pro­portionalität zwischen m e und m 0 bestehen, da stets ein gleicher Bruchteil verdampft oder durch innere Umwandlung „fix iert“ wird. In einem Anhang wer­den diese Gesetzmäßigkeiten durch einen formalen Ansatz theoretisch abgeleitet.

Die Änderung der Massendicke nach Bestrahlung kann auch sehr gut mittels Interferenzfarben licht­optisch in einem Auflichtmikroskop verfolgt und nachgewiesen werden. Derartige Farbaufnahmen zu­sammen mit einer für die Praxis sehr nützlichen Farbskala der Interferenzfarben in Abhängigkeit von der Schnittdicke werden an anderer Stelle ver­öffentlicht 16.

Durch die gute Reproduzierbarkeit der Massen­abnahmen ist hiermit eine Trennung zwischen Ver­dampfung und innerer Umwandlung gelungen. Um den Einfluß einer doppelten Bedeckung der Schnitte nach W a t s o n 6 ( s . Abschnitt 1) zu erfassen, wurden auf Formvarfolien liegende Schnitte auf der anderen Seite mit Kohle (ca. 1 0 0 — 2 0 0 Ä ) bedeckt. Abb. 7 zeigt den zeitlichen Verlauf der Massenabnahme für einen „dicken“ und „dünnen“ Schnitt. Es ist bemer­kenswert, daß jetzt die prozentuale Massenabnahme weitgehend schichtdicken-unabhängig ist. Dies zeigen noch weitere Meßpunkte in Abb. 6 (K re ise ). Eine Gerade durch den Nullpunkt parallel zur Geraden für die unbedeckten Schnitte (Kreuze) bei großen Schnitt­dicken nähert diese Meßpunkte ausgezeichnet an. Das heißt aber, daß der verdampfte Anteil mv wegfällt und eine Doppelbedeckung der Schnitte einen günstigen Einfluß auf den Massenverlust von

Methacrylat-Schnitten hat. Ob sich dies in einer Ver­besserung der Strukturwiedergabe von angeschnit­tenen Zellbestandteilen äußert, hängt von der Schnitt­dicke und den speziellen Objektstrukturen ab. Man ersieht aus Abb. 7, daß der größte prozentuale Ein­fluß einer Doppelbedeckung auf den Massenverlust bei sehr dünnen Schnitten zu erwarten ist (dünner als 600 Ä ) .

Bestrahlungsdosis [Asec/cm2] -

Abb. 7. Zeitlicher Verlauf der Massendicke von Methacrylat- Schnitten (Methyl- : Butyl-Methacrylat=20 : 80) auf Form-

varfolie mit Kohlebedeckung.

In der Abb. 8 * soll ein Beispiel zum Einfluß der Doppelbedeckung auf die Schichtstruktur ge­zeigt werden. Es handelt sich um zwei Schnitte der gleichen Objektstelle aus einer Schnittserie, von denen die Aufnahme a unter normalen Be­dingungen gewonnen wurde und b mit einer Formvarfolie doppelt belegt war, so daß der Schnitt vollständig zwischen Formvarfilmen einge­bettet ist **. Man erkennt in Abb. 8 b deutlich die schärferen Membranstrukturen, wenn auch natür­lich die Kontraste mit doppelter Folie flauer er­scheinen. Neben der Verhinderung der Verdamp­fung, die natürlich den stärksten Einfluß auf eine Schnittdicken-Abnahme gemäß Abb. 1 verursacht, wird eine doppelte Folie außerdem wahrscheinlich die Membransysteme an ihrem anderen Ende fest- halten, so daß diese nicht nach Abb. 1 umknicken können.

S j ö s t r a n d 17 schlägt für hohe Auflösungen sogar den umgekehrten Weg vor, die Schnitte freitragend auf Lochfolien aufzufangen. Gegen diese Methode muß

16 L. R eim er , Photogr. u. Wiss., Agfa Mitteil., im Druck.* Abb. 8, 9 u. 10 s. Tafel S. 572 a u. b.** Diese Aufnahme wurde freundlicherweise von Frl. Dr. R.

G ieseking (Pathol. Inst. d. Univ. München) zur Verfügunggestellt.

17 F. S. S jöstrand , Exp. Cell Res. 10, 657 [1956].

MASSENABNAHME VON EINBETTUNGSMITTELN UNTER ELEKTRONENBESCHUSS 571

jedoch insofern Bedenken erhoben werden, als dabei von beiden Schnittoberflächen Verdampfung erfolgen kann. Der Erfolg der einen oder der anderen Methode wird außerdem stark vom speziellen Objekt abhängen. Die quantitativen Messungen und die Aufnahme 8 soll­ten jedoch dazu anregen, die doppelte Bedeckung für Vergleichszwecke des öfteren anzuwenden, wenn man nicht überhaupt vom Methacrylat zu Vestopal W oder Araldit mit geringerem Massenverlust ohne Verdamp­fung (s. u.) übergeht.

Es muß in diesem Zusammenhang auch erwähnt wer­den, daß die im Einbettungsmittel eingeschlossenen Zellbestandteile ebenfalls je nach ihrer chemischen Zu­sammensetzung einen mehr oder weniger großen Mas­senverlust erleiden (Untersuchungen an Modellsubstan­zen sind in Vorbereitung). Es sei auch bemerkt, daß alle gemessenen Massen Verluste der Schnitte nicht un­bedingt eine gleich große Abnahme der Schnittdicke zur Folge haben, da durch den Massenverlust der ver­bleibende Kohlenstoff in einer auf gelockerten Form vorliegt, also die Dichte des bestrahlten Schnittes stets etwas geringer als die Ausgangsdichte ist. Derartige Messungen liegen z. B . von B r o c k e s 10 an Kollodium­schichten vor.

Der starke Massenverlust der Methacrylat-Schnitte (besonders der verdampfte Anteil m v) führt aber trotzdem zu einer so starken Schnittdicken-Änderung bei der Bestrahlung, daß z. B. Membranstrukturen gemäß Abb. 1 aus dem bestrahlten Schnitt heraus­

ragen. Die Ausbildung dieses Oberflächenprofils soll in Abb. 9 mit einem Pseudoabdruck demonstriert werden. Hierbei ist der bestrahlte Schnitt mit Platin so stark schräg beschattet (unter 30° zur Schnitt­ebene), daß die Gewebestrukturen unterdrückt wer­den und nur das Oberflächenrelief erscheint. Der Methacrylat-Schnitt ist also nicht unter der Platin­schicht weggelöst. Es handelt sich außerdem in Abb.9 um die Negativ-W iedergabe der Aufnahme, damit die Schatten dunkel erscheinen.

Bei den geringen Bestrahlungs-Intensitäten, die zur Messung des zeitlichen Verlaufs der Massen­abnahme angewandt wurden, beträgt die Erhöhung der Objekttemperatur nach den ungünstigsten A b ­schätzungen einige Grade. Bei höheren Bestrahlungs­dosen, wenn die Objekttemperatur-Erhöhung größer als 1 0 C wird, kann unter Umständen eine schnel­lere Verdampfung an der Oberfläche auftreten, weil der Dampfdruck des Methacrylates erhöht wird, so daß die verdampfte Masse m v etwas größer wird. Es empfiehlt sich daher auf jeden Fall das in der Praxis viel benutzte Verfahren der langsamen V or­bestrahlung der Schnitte bei niedrigen Strahlintensi­täten. Dies ist allein deshalb erforderlich, weil das Polymethacrylat bei geringen Temperaturerhöhun­

Wellenlänge ■

Abb. 11. IR-Spektrum von einer unbestrahlten und mit 4 ,10~3 Asec/cm2 (60 kV) bestrahlten Methacrylat-Folie.

572 L. REIMER

gen weicher wird und dann sehr große Verzerrungen in der Schnittebene möglich sind. Durch innere Umwandlung bei niedrigen Bestrahlungs-Intensitä- ten können die Schnitte dagegen „gehärtet“ werden.

5. Ab lau f des Massenverlustes

Um über die Art des Massenverlustes nähere Aus­sagen zu gewinnen, wurden analog zu Versuchen von B r o c x e s 10 an Kollodium und Polystyrol-Folien IR-Kur- ven von bestrahlten und unbestrahlten Methacrylat- Folien mit einem Leitz-IR-Spektrographen auf genom­men. Die Herstellung der Folien erfolgte durch Ein­trocknen einer Lösung von polymerisiertem Methacrylat (Methyl- : Butyl = 20 : 80) in Toluol in einer flachen Petrischale bei Temperaturen um 60 °C. Es ließen sich die Folien nach der Trocknung unter Wasser leicht mit einer Pinzette vom Glas abheben. Dünnere Filme mit durchstrahlbaren Dicken lassen sich auch nach der be­kannten Eintauchmethode, wie sie z. B. zur Herstellung von Formvarfolien benutzt wird, erzeugen und auf Was­seroberflächen von den Glasträgern abflotieren. Die ge­fundenen Massenverluste der so hergestellten Schichten sind in voller Übereinstimmung mit den oben mitgeteil­ten Ergebnissen an Schnitten.

Die Folien (etwas dicker als 10 /j) wurden über ring­förmige Halterungen mit einer freien Öffnung von 1 cm Durchmesser gespant und in der Endbildschirm-Ebene mit ca. 2 * 10- 7 A/cm2 bestrahlt. Bei größeren Intensitä­ten zerrissen die Folien. Daher waren sehr lange Be­strahlungszeiten erforderlich (mehrere Stdn.). Abb. 11 zeigt IR-Kurven von unbestrahlten und mit 4 • 10- 3

Asec/cm2 bestrahlten Methacrylat-Folien. Im Gebiete der Valenzschwingungen bei kleinen Wellenlängen sind die C — H-Bindungen und die Estergruppe-COOR gut zu erkennen (vgl. Strukturformel des Methacrylates in Tab. 1). Für die bei größeren Wellenlängen liegenden Deformations-Schwingungen ist die Zuordnung der Absorptionsmaxima zu den einzelnen Molekülgruppen schwieriger. Nach der Bestrahlung verschwinden diese zahlreichen kleineren Maxima und auch die Absorptions-

Foliendicke

Abb. 12. Eichkurven zur quantitativen Auswertung der Ab­sorptionsbanden der CH3-, —CH2- und — COOR-Gruppen

(als Parameter ist die zugehörige Wellenzahl angegeben).

banden der CH3- und — CH2-Gruppen bei 3,5 /u und der Estergruppe — COOR bei 5,8 ju werden schwächer. Um aus den Intensitäten der Absorptionsbanden quan­titative Rückschlüsse ziehen zu können, wurden Metha­crylat-Folien verschiedener Dicke untersucht und die Extinktion

E = log ^ (D = Durchlässigkeit in %) (5)

gegen die Foliendicke aufgetragen (Abb. 12). Nach dem exponentiellen B e e r sehen Absorptionsgesetz lie-

Abb. 13. Abnahme der C —H- und —COOR-Gruppen von Methacrylat-Folien unter Elektronenbeschuß in Abhängigkeit

von der Bestrahlungsdosis.

gen die Meßpunkte dann auf einer Geraden durch den Nullpunkt. Diese Geraden liefern Eichkurven, um aus der Extinktion in bestrahlten Schnitten auf den Bruch­teil der noch vorhandenen und intakten Molekülgrup­pen zu schließen.

Das Ergebnis ist in Abb. 13 wiedergegeben. Wenn man den Abfall der Estergruppe bei einer Bestrah­lungsdosis von 4 • 10~ 3 Asec/cm2 mit der Massen­abnahme in Abb. 5 vergleicht, so liegt 'eine gute Übereinstimmung vor, insbesondere weil der Ver­lust der O-Atome aus der Estergruppe den stärksten Beitrag zum Massenverlust liefert. Der schwächere Abfall der C — H-Bindungen in Abb. 13 ist vielleicht auf eine höhere Beständigkeit gegen Elektronen­beschuß zurückzuführen oder es überlagert sich noch eine Absorption aus Doppelbindungen, deren Lage der Resonanzstellen in Abb. 11 vermerkt ist. Das bei den bestrahlten Schnitten bei 5.6 ju deutlich auf­tretende neue Absorptionsmaximum ist vermutlich auch auf Doppelbindungen zurückzuführen. Diese treten natürlich bei einer Depolymerisation auf, aber auch jede Entfernung eines H-Atoms hat die Bildung einer C = C-Doppelbindung zur Folge.

Diese Versuche stehen also im Einklang mit der Hypothese, daß alle Molekülbausteine mit Ausnahme der Kohlenstoffatome durch Elektronenbeschuß ent­fernt werden. Da der Aufbau der Polymethacrylat- Ketten chemisch sehr einfach zu übersehen ist (Tab.

L. R e im e r , Quantitative Untersuchung zur Massenabnahm e von Einbettungsm itteln (M eth acry la t, Vestopal und A ra ld it ) unter Elektronenbeschuß (S . 566)

Abb. 8. Aufnahme der gleichen Objektstelle aus zwei verschiedenen Methacrylat-Schnitten einer Schnittserie: a) auf Form-varfolie aufgefischt und b) mit Formvarfolie beidseitig belegt.

Abb. 9. Pseudoabdruck mit Platin (30°) von einem bestrahlten Methacrylat-Schnitt (Negativkopie).

Z e itsch rift fü r Natu rforschung ] 1 b, S e ite 572 a.

Abb. 10. a) Aufnahme und b) Pseudoabdruck (Pt) der gleichen Objektstelle eines Vestopal-Schnittes nach Elektronenbeschuß (im Gegensatz zu Abb. 9 ist der Pseudoabdruck in normaler Positivtechnik wiedergegeben).

Z e itsch rift fü r N aturforschung 14 b, S e ite 572 b.

MASSENABNAHME VON EINBETTUNGSMITTELN UNTER ELEKTRONENBESCHUSS 573

1 ), läßt sich der Kohlenstoffgehalt berechnen und ergibt für das Gemisch Methyl-:Butyl-Methacrylat 2 0 : 8 0 das Verhältnis C /M = 0,661. Der Beitrag des Polymerisations-Initiators (Benzoylperoxyd)

ho

£ 306

*20

✓✓

M ethyl-

^5

I_ 5* ____

t 700% //

/kSs

*/

//

/

\X\

<?

XX *X

20 30 HOm0 Massendicke [igr/crn2] vor Beschuß -

50

Abb. 14. Zusammenhang zwischen der Massendicke am Ende des Massenverlustes und m0 zu Beginn der Bestrahlung

für Folien aus reinem Methyl-Methacrylat.

zum Massenverlust ist zu vernachläsigen. Dieser W ert ist in sehr guter Übereinstimmung mit der Steigung der Geraden in Abb. 6 (0 ,66 ). Um dies Ergebnis weiter zu prüfen, wurden reine Methyl- Methacrylat-Folien (hergestellt aus Lösungen in Toluol s. o.) auf ihren Massenverlust untersucht.

5C8H20

60

32

M = 100

M

M e th y l-M e th a c ry la t

OS

C - O - C H jI

- c h 2- c - I c h 3

B u ty l-M e t h a c r y la t

Oy

C - 0 - C H 2- C H 2- C H 2- C H 3 I

- C H ä - C - I c h 3

8C14H20

961432

M - - 142

M = 67’6%

M e t h y l - : B u t y l- = 20 : 80

C 20.60 + 80.67,6

M ~ 10066,1 Prozent.

Tab. 1. Strukturformel eines Kettengliedes und Kohlenstoff­gehalt von Methacrylaten.

Die Messungen in Abb. 14 ergeben gute Überein­stimmung des Massenverlustes mit theoretischen Be­rechnungen in Tab. 1 (C / M = 0 ,60 ). Bemerkenswert ist auch, daß die Methyl-Methacrylat-Folien offenbar keinen Verdampfungseffekt an der Oberfläche zei­gen, weil die Gerade durch die Meßpunkte und durch den Nullpunkt geht.

6. Vestopal- und Araldit-Schnitte

Der zeitliche Verlauf der Massenabnahme von Vestopal W- oder Araldit-Schnitten (Abb. 15) er­folgt bei gleicher Bestrahlungsdosis wie beim Metha-

Bestrahlungsdosis [A sec/cm.*] -

Abb. 15. Zeitlicher Verlauf der Massendicke von Vestopal W- und Araldit-Schnitten unter Beschuß mit 60 kV-Elektronen.

crylat. Auch hier ist nach einer Bestrahlung mit etwa 10~ 2 Asec/cm2 der Massenverlust beendet. Bei Araldit wurde bei mittleren Bestrahlungsdosen stets ein etwas steilerer Teil der Kurve gefunden, wäh­rend Vestopal-Schnitte wieder einen annähernd ex­ponentiellen Abfall der Massendicke zeigen. Aus Abb. 15 und 16 ist zu entnehmen, daß der Massen­verlust bei diesen Einbettungsmitteln wesentlich ge­ringer ist (13% bei Vestopal W und 20% bei A ra l­dit) als bei den Methacrylat-Schnitten mit 34%, wenn bei diesen durch Doppelbedeckung die Ver­dampfung verhindert wurde. D ie Proportionalität zwischen m e und m0 in Abb. 16 zeigt, daß Vesto­pal W und Araldit keine Verdampfungsverluste an der Oberfläche erleiden.

Die Zusammensetzung des Vestopal W (Polyester mit Styrol-Zusatz) oder des Araldits (Epoxy-Resin mit Weichmacher) ist sehr komplex, so daß einfache Berechnungen des Kohlenstoffgehaltes wie in Tab. 1 nicht möglich sind. Da aber für einen quantitativen

574 MASSENABNAHME VON EINBETTUNGSMITTELN UNTER ELEKTRONENBESCHUSS

I J0

I1! »

0 10 20 30 W 50 m0 Massendicke [tg r /c m ] vor Beschuß — ►

Abb. 16. Zusammenhang zwischen der Massendicke tue am Ende des Massenverlustes und m 0 zu Beginn der Bestrahlung für Vestopal W- und Araldit-Schnitte (zum Vergleich ist der

Verlauf der Kurve für Methacrylat-Schnitte aus Abb. 6 gestrichelt eingezeichnet).

Vergleich nur der Kohlenstoffgehalt interessiert, wurde von diesen Kunststoffen eine Verbrennungs­analyse durchgeführt (Tab. 2 ). Zur Kontrolle wurde auch ein Methacrylat untersucht (2 0 :8 0 ) , dessen C- und H-Gehalt sich auch nach Tab. 1 berechnen läßt und gut mit dem Analysenergebnis überein­stimmt. Die Hypothese, daß alle Nichtkohlenstoff- Komponenten durch Elektronenbeschuß verloren ge­hen, welche für Methacrylat-Schnitte überraschend gute Resultate lieferte, läßt sich auf Vestopal und Araldit also nicht verallgemeinern. Der Massenver­lust durch Entweichen der H- und O-Atome wird

Stoff C[% ]

H[% ]

mE/fflo[% ]

Methacrylat (20: 80) 66,3 9,3 66Vestopal W 68,8 5,8 87Araldit 69,7 8,4 80

Tab. 2. C- und H-Gehalt der Kunststoffe nach Verbrennungs­analysen und der experimentell gefundene Massenverlust

mjz,/m0 .

also vermutlich noch von der chemischen Konstitu­tion des betreffenden Stoffes abhängen, indem z. B. Sauerstoff in Ester-, Aldehyd- oder Hydroxylgrup­pen verschieden leicht abgespalten werden kann. Es ist durchaus möglich, daß man bei noch höheren Bestrahlungsdosen eine vollständige Verkohlung des Objektes erreichen kann. Für das in dieser Arbeit angeschnittene Problem des Massenverlustes von Dünnschnitten interessieren aber in erster Linie die schnell ablaufenden Veränderungen, da diese unter den normalen Arbeitsbedingungen so schnell ablau­

fen, daß ihr Einfluß auf die Bildstrukturen nicht erfaßt werden kann. Zur Klärung dieser offen ste­henden Fragen zum Massenverlust organischer Sub­stanzen sind weitere Untersuchungen vorgesehen, in denen der Massenverlust verschiedener organischer Folien auch unter höheren Dosen untersucht wird.

Abb. 10 soll mit einem Pseudoabdruck eines Ve- stopal-Schnittes demonstrieren, daß die Lamellen­systeme nicht wie bei den Methacrylat-Schnitten (Abb. 9) nach der Bestrahlung aus dem Schnitt herausragen. Es ist derselbe Schnitt vor und nach der Schrägbeschattung gezeigt. Die Schrägbeschat­tung erfolgte hier so dünn, daß die osmium-kon- trastierten Gewebestrukturen noch gut zu erkennen sind, um die Orientierung im Objekt an Hand der Vergleichsaufnahme ohne Beschattung zu erleich­tern *. Nur die kreisförmig angeschnittenen Kollagen- fasern zeigen einen schwadien Schattenwurf. Man muß berücksichtigen, daß die Gewebestrukturen auch Massenverluste erleiden, die natürlich von deren chemischer Konstitution abhängen.

Anhang

Um den Massenverlust von Methacrylat-Schichten in der Form von mE = f (m 0) nach der ausgezogenen Kurve in Abb. 6 auf Grund einfacher Modellvorstellungen theo­retisch abzuleiten, soll eine Näherung für dünne Schnitte (nach Abb. 6 dünner als 6 — 8 ^g/cm2) und für sehr dicke Schnitte (dicker als 1 0 jug/cm2) durchgeführt wer­den.

Bei dünnen Schnitten (einige Moleküllagen) kann man von der Annahme ausgehen, daß alle depolymeri- sierten monomeren Methacrylat-Moleküle die Möglich­keit haben, zur Oberfläche zu gelangen und dort zu ver­dampfen, wenn sie nicht vorher durch Elektronen-Bom- bardement in ihrer Struktur so verändert worden sind, daß sie dadurch „fixiert“ werden und nicht mehr ver­dampfen können. Die Zahl der Moleküle dn i , welche durch einen solchen Mechanismus im Zeitintervall dt fixiert werden kann, ist proportional zur Zahl der Mole­küle, die noch nicht verdampft oder fixiert ist:

= Ä:; (n0 - n\ - nx) (6 )CU

(rc0 = Zahl der zu Anfang in der Schicht vorhandenen Moleküle, ni Zahl der durch innere Umwandlung fixier­ten und nv Zahl der verdampften Moleküle). Analog ergibt sich eine zweite Differentialgleichung für die Zahl der verdampfenden Moleküle mit einem anderen Pro­portionalitätsfaktor ky

^ = ky (n0 n\ riy). (7)

* Herrn Dr. H. T h e m a n n (Inst. f. med. Elektr.-mikr. d. Univ.Münster) danke ich für die Überlassung dieses Vestopal-Schnittes und für wertvolle Diskussionen.

POLARISATIONSMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN AN SPORODERMEN 575

Es interessiert für unser Problem nur die Lösung dieses Systems von 2 linearen Differentialgleichungen für die Zahl der fixierten Atome n\ in Abhängigkeit von der Zeit t :

ni = n * T ~ t i r (*‘+*v)0/Cj “i Ky (8)

Die Anfangsmasse m0 ist proportional zur Zahl n0 und die Endmasse hie zur Zahl rii für großes t ( t —*■ ° o ) , wobei aber noch mit einem Reduktionsfaktor r zu multi­plizieren ist, der den Massenverlust der fixierten Mole­küle durch Verlust der Nichtkohlenstoff-Komponenten berücksichtigen soll.

mE“ r I + M S m»(9)

Es folgt also für kleine Schnittdicken die in Abb. 6 beob­achtete Proportionalität zwischen me und m0. Mit r = 0 , 6 6 ergibt sich das Verhältnis k v /k i-\ -0 ,4 3 aus der Anfangssteigung in Abb. 6 .

Wenn man die Massendicke der Schicht nach (8 ) als Funktion der Zeit aufstellen würde, ergäbe sich ein Ab­fall nach einer e-Funktion, der durch die Kurvenformen in dieser Arbeit recht gut bestätigt wird und auch von L ip p e r t 4 angesetzt wurde, um den Massenverlust von Methacrylat-Schnitten in ihrem zeitlichen Verlauf ana­lytisch darzustellen.

Bei dicken Schnitten sei von der Annahme ausgegan­gen, daß im Innern des Schnittes nur innere Umwand­lung erfolgt.

rti = n0( l — e * ‘ *) . (10)

Die Verdampfung wird noch aus einer gewissen Tiefe unterhalb der Oberfläche erfolgen können, in der n 0' Moleküle liegen sollen. Die Verdampfung ist dann in erster Näherung proportional zur Zahl der noch nicht durch innere Umwandlung fixierten und damit noch ver­dampfbaren Moleküle:

d «vd£

k v (n 0’ — n { ) mit n i = n 0' (1 — e k lt ) . (11)

Die Lösung lautet:

n y = n 0 (1 (12)

Da nach hinreichend langer Zeit ni = n0 — n v gilt, folgt:

m£ = r |m0 — m0' ̂ = r (m 0 — mv) , mv = const.

(13)

und liefert damit den in Abb. 6 dargestellten linearen Verlauf für große Schnittdicken. Der Ansatz (11) stellt insofern aber nur eine erste Näherung dar, als durch die Verdampfung der Moleküle die obersten Molekül­lagen nahe der Oberfläche gegenüber dem Innern an fixierten Molekülen angereichert werden, so daß der Ansatz für n\ nicht ganz korrekt ist. Eine Verbesserung in dieser Richtung liefert aber keine Änderung in der Gesetzmäßigkeit (13), nach der bei dicken Schichten die verdampfte Menge m y unabhängig von der Aus­gangsmasse m0 ist.

Polarisationsmikroskopische Untersuchungen an Sporodermen*

Von P. S i t t e

Aus dem Botanischen Institut der Universität Heidelberg(Z. Naturforschg. 14 b, 575— 582 [1959] ; eingegangen am 22. Mai 1959)

Both fresh and acetolysed exines of some species (of Lycopodium , Dryopteris, Stylites, and B etula ) have been investigated with the polarizing microscope. The following results were obtained:

1. Sporopollenine is isotropic, as far as investigated.2. The exine does not show any intrinsic birefringence; it contains therefore neither cellulose nor

wax in any considerable amount.3. The exines of all investigated spores and pollen grains show a birefringence of form (textural

bir.), due to a very finely layered structure. This indicates, that not only exines, which are found to be layered in the electron microscope (e. g. Lycopodium ) , but also “amorphous” ones (e.g. B etu la ) have the character of a layered composite body.

Von den häufiger vorkommenden und physiolo­gisch bedeutenden Zellwandstoffen der höheren Pflanze (Cellulose, Pektin, Lignin, Suberin, Cutin,Sporopollenin) sind zur Zeit lediglich die Sporo­pollenine (Spp.) noch nicht polarisationsoptisch un­tersucht 1; es gilt also, soweit bekannt, immer noch F r e y - W y s s l i n g s Feststellung von 1935 2: „E ine op-

1 Vgl. A. F r e y -W yssling , Die pflanzliche Zellwand. Sprin­ger, Berlin 1959.

* Herrn Prof. Dr. A. S perlic h zum 80. Geburtstag gewidmet.

tische Untersuchung des Sporopollenins steht noch aus.“ Das ist z .T . verständlich, weil an Sporodermen kein technisches Interesse besteht und ihre Doppel­brechung — wo überhaupt vorhanden — schwach ist, und die polarisationsoptische Untersuchung nicht aussichtsreich erscheinen ließ 3 (ganz im Gegensatz zu den anderen nach dem Accrustations-Prinzip ge-

2 A . F r e y-W yssling , Die Stoffausscheidung der höheren Pflanzen. Springer, Berlin 1935, S. 83.

3 B. M. A fzeliu s , Grana palynolog. (N.S.) 1/2, S. 24 [1956].