Biochem. Physiol. Pflanzen 176, 744-752 (1981)

Regulation der Aktivitat granulumgebundener Starkesynthetase durch einwertige Kationen

ERHARD PREUSSER, FA WZY ANDRA WISS KHALIL und HORST GORING Humboldt-Universitat zu Berlin, Sektion Biologie, Bereiche Biochemie und Pflanzenphysiologie

Berlin, DDR

Regulation of Activtiy of the Granule-bound Starch Synthetase by Monovalent Cations

Key Term Index: granule-bound starch synthetase, monovalent cations; Zea mays, Solanum tuberosum, Yicia (aba.

Summary

Granule-bound starch synthetase was isolated from Zea mays seeds (mild-waxy stage), Solanum tuberosum tubers, and Vicia faba leaves. The activity of the enzyme system was studied in vitro under the influence of various cations applied over a large concentration range. Tlje activity of the granule­bound starch synthetase is considerably increased by relatively high K+ or Rb+ concentrations (50 to 100 mM). Other monovalent cations have a slightly activating effect at concentrations up to 20 mM only. Their effect is an additive one at both suboptimal K + concentrations and mutually low concen­trations of the other univalent cations concerned. At higher concentrations the K+ effect is substan­tually abolished. The results are discussed in relation to regulatory problems.

Einleitung

\Viederholt wurden Vorstellungell entwickelt, nach denen primare Licht- und Hor­monwirkungen eine Veranderung von Kationenbalancen in pflanzlichen Zellen bzw. Zellkompartimenten induzieren sollen (GORING und MARDANOV 1976; HAUPT 1980). 1m gleichen Zusammenhang ist die regulierende Wirkung von Kationen auf verschiedene Enzymsysteme beschrieben worden (EVANS und WILDE 1971; EVANS und SORGER 1966). Zu diesen kationenaktivierbaren Enzyrnen gehort die starkekorngebundene Starke­synthetase (ADP-Glucose: 1,4-tX-D-glucose-4-tX-glucosyltransferase, EC 2.4.1.b) der Chlo­roplasten ebenso, wie die Glycosyltransferase (EC 2.4.1.21), die vorwiegend in den Amylo­plasten der Speichergewebe lokalisiert ist(MEISEL 1974; NITSOS und EVANS 1969; HAW­KER et al. 1974; MURATA und AKAZAWA 1969).

Die granulumgebundene Starke synthetase ist fest in das Starkekorn integriert und relativ stabil. Bezuglich ihrer Aktivitat ist sie im starken MaI3e von der Wechselwirkung mit Kationen und einigen anderen Verbindungen abhangig.

Die starkekorngebundene Starke synthetase sollte in den vorliegenden Untersuchun­gen als Modell fur ein kationenaktivierbares Enzymsystem genutzt werden, urn den Einflu13 verschiedener monovalenter Kationen uber einen grofieren Konzentrations­bereich zu analysieren.

Regulation der Aktivitat von Starkesynthetase 745

Material und Methoden

Zur Durchfiihrung der nachfolgenden Versuche wurde Starke aus Blattern von Vicia taba minor (nach Belichtung), aus Knollen von Solanum tuberosum (Handelsware) und aus Karyopsen von Zea mays im Stadium der Milch-Wachs-Reife isoliert. Das Pflanzenmaterial wurde bei 0 bis 4 °C im Tris­Acetat-Puffer (0,1 M, pH 8,4) unter Zusatz von Dithioerythrol und Natriumthiosulfat als Stabilisato­ren sorgfaltig homogenisiert. Das Homogenat wurde unter Druck schnell durch Perlongewebe filtriert. Das Filtrat wurde dann sofort in vorgekuhlten Zentrifugenbechern 15 min bei etwa 1500 x g zentri­fugiert. Der resultierende Starkeniederschlag ist noch stark mit Ohloroplasten und anderen Zellbruch­stucken verunreinigt. Nach Entfernung der oberen gelblichen Schicht wurde die verbleibende Starke im gieichen Puffer bei 0 bis 4 °0 wiederholt zentrifugiert. AbschlieBend wurde die einheitliche, weiB­liehe Starkegranulafraktion bei -15 °0 3 x mit Aceton gewaschen. Die Acetonbehandlung dient nicht nur der Entfernung von Membranbruchstucken (Lipide), sondern auch der Inaktivierung der Phosphorylasen.

Die auf diese Weise gewonnene Starke wurde bei -18 00 zum Teil uber einen langeren Zeitraum aufbewahrt. Dabei kommt es zu einem langsamen Aktivitatsverlust, der unter unseren Bedingungen bei 40-50 % im Verla ufe einer ein j ahrigen Lagerung lag.

Fur die Inkubationsversuche wurden 40 mg des Starkepraparats mit 4 mi Tris-Acetat-Puffer (0,1 M, pH 8,4) versetzt. Dem Ansatz wurden O,l,ttM Dithioerythrol und zuletzt 20,tt1 einer ADPG­Losung (Glucose uniform HO-markiert, Gesamtradioaktivitat 2 x 105 bzw. 2 X 106 Imp./min) zuge­setzt. Nach sorgfaltigem Durchmischen bei 0 °0 wurden je 0,2 mi dieses Ansatzes in kleine Glaschen gegeben, die bereits 0,2 ml der Ionenlosung enthielten (siehe Legende der Abbildungen). Diese Ansatze wurden bei 34°C 45 min inkubiert. Durch Uberfuhren in ein kochendes Wasserbad (3 min) und durch Zusatz von 0,4 ml Xthanol wurde der Versuch abgebrochen. In diesen Ansatzen wurde die Starke durch Zentrifugation (1500 x g, 5 min) abgetrennt und durch wiederholtes Waschen mit Xthanol so lange gereinigt, bis der Uberstand frei von Radioaktivitat war.

Die Messung der Radioaktivitat erfolgte im Packard-Tricarb-liquid-Scintillationsspektrometer. In allen Versuchen wurden zwei Kontrollen mitgefuhrt: eine "Kochprobe", die so fort nach Zugabe der markierten Verbindung in der beschriebenen Weise ina.ktiviert wurde und eine 0-Variante, die anstelle der TestlOsung 0,2 ml Tris-Acetat-Puffer enthielt.

In Vorbereitung <Luf die Proteinbestimmung wurde die Starkeprobe im kochenden Wasserbad 15 min mit 0,1 M KOH behandelt. Die anschlief3ende Proteinbestimmung erfolgte nach LOWRY et aJ. (1951). Der Na+-, K +- und Oa++~Gehalt wurde flammenphotometrisch nach feuchter Veras chung der Starkekorner bestimmt. Die Phosphatbestimmung erfolgte kolorimetrisch nach Mineralisierung der Starke (BARTLETT 1959). Zur Lipidbestimmung wurde die Starke nach einer Vorbehandlung mit Amyloglucosidase und Amylase 3 Std. mit Athanol gekoeht und anschlieBend eingeengt. Die Extraktion der "Roh"-Lipide erfolgte mit Ather.

Ergebnisse

Allgemeine Charakterisierung der granulumgebundenen Stiirkesynthetase

Starkegranula enthalten neben Amylopektin und Amylose immer geringe Mengen anderer Stoffe (Tabelle 1). Es ist ersichtlich, daB sich in quantitativer Hinsicht bei die­sen "Starkebegleitstoffen" erhebliche Schwankungen abzeichnen. Diese unterschiedli­chen Befunde sind im wesentlichen mit dem Objekt bzw. mit dem Reifegrad des Starke­korns und weniger mit der Isolierung und Reinigung der Starke selbst verbunden. Fur den Glucosetransfer von ADPG auf die Starkegranula wurde ein pH-Optimum von 8,2 bis 8,4 und ein Temperaturoptimum von 34°C ermittelt.

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Tabelle 1. Zusammensetzung enzymatisch aktiver Stiirkegranula (Angabeu in % vom Trockengewicht, n = 4-5)

Objekt

Protein Lipid Kalium Natrium Calcium Phosphat

Zea mays (Karyopsen, Milch-W achs-Reife)

0,35-0,72 0,82-0,92 0,037-0,043 0,12-0,18 0,1:23 0,16

Solanum tuberosum (Knollen)

° "') ,0 ...

0,60 0,026 0,10 0,02 0,10

Vicia faba (Blatter)

1,45-1,75 1,08-1,15 0,052 0,22 0,01 0,42

Der Glucosetransfer in die Starkegranula (gemessen am 14C-Einbau) ist in den ersten 30 bis 45 min annahernd der Versuchszeit proportional (Abb. 1). Ausgehend von diesen Befunden wurde in den nachfolgenden Versuchen eine Inkubationsdauer von 45 min gewahlt. Die geringere 14C-Einbaurate bei Blattstarke aus V. (aha ist wahrscheinlich auf den hoheren Verunreinigungsgrad dieser Starkepraparate zuruckzufiihren (siehe auch Tabelle 1).

Zur Untersuchung der Starkesynthese wurden unterschiedliche Puffersysteme einge­setzt (NITSOS und EVANS 1969). Unter Verwendung von Starkegranula aus Maiskaryop­sen und ADPG als Glucosedonator wurde der Glucoseeinbau in die Starke unter dem Ein­fluB einiger Puffersysteme untersucht (Tabelle 2). Ausgehend von diesen Befunden wurde in den folgenden Versuchen ausschlieBlich das Tris-Puffer-System eingesetzt. Das Arbei­ten mit pflanzlichen Extrakten macht den Einsatz von Stabilisatoren notwendig. Nach unseren Befunden ergeben Natriumthiosulfat (im Extraktionspuffer) und Dithioerythrol

n=3 30 r--------_____

m

c20 E I ~ .,...

II • d .510 oCI

10 30 50 110 ,

130 ,

150 min

Abb. 1. Zeitabhiingigkeit des Glucoseeinbaues in Starke. Inkubation von 2 mg Starkgranula aus Maiskaryopsen (I), aus Vicia-faba-Blattern (II) und aus der Kartoffel (III) mit ADPG-14C bei einem pH. Wert von 8,4 und einer Temperatur von 34 °C.

Regulation der Aktivitat von Starkesynthetase 747

Tabelle 2. Ghwoseeinbau in Starke mit ADPG als Donator wIter Verwendung unterschiedlicher Puffer. systeme (Inkubationsbedingungen: 2 mg Starke, ADPG [Glucose uniform He, 2 x 105 Imp.jminl, 45 min bei 34 °e, n = 3)

Puffersystem

Tris-Acetat (0,1 M) pH 8,4 pH 7,6

Glycylglycin (0,1 M) pH 8,4 pH 7,6

~a-Phosphat (0,1 M) pH 8,4 pH 7,6

HEPES (0,1 M) pH 8,4 pH 7,6

Radioaktivitat der Starke (Imp./min)

3200 (2775) 1861 (1742)

3282 (3625) 2441 (2992)

1785 1543

3116 2603

In Klammern Werte, die unter Verwendung eines Starkepraparates aus jiingeren Maiskaryopsen (frfthe Milcbreife) erzielt wurden.

0--0 K"; l.m. ...-... Rb:Z.m. _K~Vf.

50 o---D K~ S.t.

40

. ci. 20 E <I

10

10 30

ill

50 75 100 mM

Abb. 2. EinflufJ der Kationenkonzentration auf die in-vitro-Aktivitiit der Starkesynthetase. Inkubationsbedingungen: 2 mg Starke aus Maiskaryopsen (Z. m.j, V1:cia-faba-Blattem (V. (.) oder KartoffelknoHen (S. t.), ADPG14C, pH 8,4, 45 min bei 34 °e.

(inl Inkubationsmedium) eine geringe Erhohung der Glucoseeinbaurate. Andere Stabili­satoren (RSA, p-Mercaptoathanol, Cystein, ADTA) ergaben keinen zusatzlichen Effekt.

Wirkung einwertiger Kationen auf die Aktivitiit der granulumgebundenen Stiirkesynthetase Die Aktivitat def granulumgebundenen Starkesynthetase laJ3t sich unter in-vitro ..

Bedingungen durch Kalium und auch durch Rubidium erheblich steigern (Abb. 2). Die in Abb. 2 angegebene Kationenaktivierung wurde wie folgt berechnet:

748

Kationenaktivierung (Imp.jmin)

E. PREUSSER U. a.

Radioaktivitat der Probe (Imp.jmin)

Radioaktivitat der O-Variante (Imp.jmin)

Die optimale Aktivierung der Starkesynthetase erfordert also eine relativ hohe Kalium­konzentration, wobei das Kalium durch Rubidium weitgehend ersetzt werden kann. Eine iiberoptimale Kaliumkonzentration bewirkt nur eine geringe Forderung der Trans­feraseaktivitat bzw. hemmt sie bei Konzentrationen von mehr als 350 bis 450 mM K + (Abb.3).

50

40

.£ 30 E

;;-

'~ 20 • ci E ~ 10

50 100 200

0--0 K; Z.m. 4---6 K~ '1.1. n=3

300

Abb.3. EinflufJ hOherer K+-Konzenirationen auf d'ie in-vitro-Aktivitiit der granulumgebundenen Starke­synthetase. Inkubationsbedingungen siehe Abb. 2.

10

8 ..- NH~ f>---.6 Cs·

+

c ().--...C Na

E L '+ 6

\ G--~ I

;;-.. b .... ti. 4

-i E <l

2

5 10 2025 .......... _~ __ ....,:,.",~o mM

Abb.4. EinflufJ einweriiger Kaiionen auf die in-v'iiro-Aktivitiit der'(granulumgebundenen Stiirkesynthe­lase. Inkubationsbedingungen siehe Abb. 2.

Regulation der Aktivitat von Starkesynthetase 749

Die Aktivitat der granulumgebundenen Starkesynthetase wird unter in-vitro-Bedin­gungen auch durch andere einwertige Kationen beeinfluJ3t. Aktivierende Effekte erge­ben sich hier allerdings in wesentlich niedrigeren Konzentrationsbereichen, wobei die fordernde Wirkung jedoch betrachtlich unter derjenigen der K +-Aktivierung bleibt (Abb.4).

Aktivitiit der granulumgebundenen Stiirkesynthetase bei gleichzeitiger Einwirkung von meh­reren eiriwertigen Kationen

Die Wirkung von Kationengemischen auf den Glucosetransfer von ADPG auf Starke ist von der Gesamtkonzentration der Kationen abhangig. Liegt diese unterhalb von 20

8 0----<) 10mM NH;'" Na· --- 5mM Na ...... NH4 ~ 20mM Na· ... U'" ._ 20mM N H; +Cs'"

n=2 c 6 !

E -----.... 4 I

0 .-

0.2 E <I

. , 2,55 10 ~OmM

Abb. o. Aktivitiit der granulumgebundenen Stlirkesynthetase unter dem Einfluf3 von Gemischen einwerti­ger Kationen. Inkubationsbedingungen siehe Abb. 2.

50

40

30

~10 <I

5 101520

-10

-20

-10

.-e 50mM K·· Na+

A-A25mMK+· NH.;: _-_lOmMRb·+NH;

n=3

200mM

Abb.6. Einflu/3 von Na+ und NH4+ in Verbindung In'it K+ bzw. Rb+ auf die Aktivitdt der granulum­gebundenen Stlirkesynthetase. : ..... Inkubationsbedingungen siehe Abb. 2, die Negativwerte sind auf den Abzug der 0-Variante zuriick­zufiihren.

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mM, SO ergeben sich im wesentlichen additive Aktivierungseffekte. Ubersteigt die Ge­samtkonzentration der einwertigen Kationen aber diesen Wert, so ergeben sich Hemm­effekte (Abb. 5). Prinzipiell die gleichen GesetzmaEigkeiten zeigen sich auch, wenn mehr als zwei unterschiedliche einwertige Kationen gleichzeitig im Inkubationsmedium vor­liegen. Auf eine Darstellung wurde deshalb verzichtet.

In Verbindung mit K+ oder Rb+ heben Na+, NH4+, Cs+ und Li+ den aktivierenden Effekt dieser beiden Kationen wieder auf, sobald der optimale Konzentrationsbereich (etwa 20 mM) iiberschritten wird. Bei suboptimalen Kalium- oder Rubidiumkonzell­trationenfuhren diese Kationen im Konzentrationsbereich bis zu 20 mM zu einer geringen zusatzlichen Aktivierung der granulumgebundenen Starke synthetase (Abb. 6).

Diskussion

Das Starkekorn ist als ein dynamisches Gebilde aufzufassen, bei dem quantitative Veranderungen der Zusammensetzung neben dem Amylose-Amylopektinverhaltnis auch andere "Inhaltsstoffe" betreffen. Neben pflanzen- und oganspezifischen Unterschieden kommt z. B. dem Reifezustand bzw. der Endospermentwicklung groEe Bedeutung zu (BAUN et al. 1970). Assirnilationsstarke besitzt einen hoheren Proteingehalt als Reserve­starke. Verunreinigungen durch Chloroplastenbruchstucke o. a. sind durch mikroskopi­sche Kontrolle weitgehend auszuschlieEen (vgl. auch MURATA und AKAZAWA 1964). Auch der Proteingehalt von Reservestarken unterliegt erheblichen Schwankungen. So wurde fiir die Starke aus Kartoffelknollen nur ein Proteinwert von 0,08 % ermittelt (W ASHUTTL et al. 1966).

Der K +-Gehalt unterschiedlicher Starken differiert ebenfalls betrachtlich: in Sarnen von Vicia (aba 1,350/0' in Karyopsen von Oryza sativa etwa 0,3 % (MURATA und AKA­ZA WA 1969). Diese Werte liegen weit iiber den von uns ermittelten. Ais Ursache miissen auch unterschiedliche Reinigungsverfahren in Betracht gezogen werden. Diese "Restge­halte" an Kationen sind sicherlich von Bedeutung fiir die Aktivitat der starkekornge­bUlldenen Synthetase, die ohne Zusatz von Kationen zum Inkubationsmedium gemes­sen werden kann (Abb. 1). Allerdings ist die Glucosetransferreaktion dann nur in den ersten 30 min linear mit der Zeit. Die darauf folgende Abnahme der 14C-Einbaurate diirfte auf hydrolytische Reaktionen (Amylasen?) zuriickzufiihren sein. K + (50 bis 100 mM) ver hindert diesen A bfall der 14C-Mar kierung (vgl. auch N ITSOS und EVANS 1969).

Die vorliegenden Ergebnisse bestatigen die Notwendigkeit des K+ fiir die Starke­synthese und die regulatorische Funktion dieses Kations. In Dbereinstimmung mit den Befunden von AKATSUKA und NELSON (1966); GREENBERG und PREISS (1965); MURATA und AKAZAWA (1968) sowie NITSOS und EVANS (1969) ist die aktivierende Wirkung des Kaliums auf mehrere Erscheinungen zuruckzufiihren. HAWKER et al. (1974) nehmen Kon­formationsanderungen im Enzymmolekiil bedingt durch Ionenanlagerung an. Damit wiirde sich eine Dbereinstirnrnung mit anderen Enzymen, 80 z. B. mit der Pyruvat­kinase, ergeben (NOWAK 1976). Nicht auszuschlieEen ist auch die Annahme, daE die Ka­liumaktivierung auf eine festere Bindung des Enzyms an die Starke und damit auf eine Enzymstabilisierung zuruckzufiihren sei. Der Schutzeffekt des Kaliums gegen Hitzedena-

Regulation der Aktivitiit von Starkesynthetase 751

turierung konnte cine solche Annahme stutzen. Da Kalium die Quellung der Starkekor" ncr erhoht, ist naturlich auch die Substratzuganglichkeit erhoht. In diesem Zusammen­hang sind moglicherweise auch die Befunde mit iso-Propanol einzuordnen, das eine ka­liumahnliche Aktivierung der granulumgebundenen Starke synthetase bewirkt (JUDE­WICZ et al. 1972).

Andere einwertige Kationen beeinflussen die granulumgebundene Starke synthetase in unterschiedlichem Ma13e. Die von uns gefundene Reihenfolge der Aktivierung (Li+, Na+, Cs+, NH,+, Rb+, K+) ist mit geringen Abweichungen auch bei anderen Objekten gefunden worden (MURATA und AKAZAWA 1968; NITSOS und EVANS 1969). Unterschiede ergeben sich vor aHem in den optimal en Konzentrationen dieser Kationen. So haben nach NITSOS und EVANS (1969) auch hohere Konzentrationen dieser Kationen (bis zu 50 mM) noch cine stimulierende Wirkung.

Zur Wirkungsweise dieser einwertigen Kationen lassen sieh noch keine endgiiltigen Aussagen treffen. Sieher ist davon auszugehen, daI3 eine sekundare Wirkung - mogli~

cherweise uber eine Freisetzung von unspezifisch gebundenem Kalium - vorliegt. Die vorliegenden Ergebnisse machen deutlich, daI3 die Aktivitat der granulumgebun­

denen Starkesynthetase in starkem MaI3e durch einwertige Kationen beeinflu13t wird. Fur eine Aktivierung des Enzyms unter in-vivo-Bedingungen diirfte jedoch nur K + rele­vant sein, dessen Konzentration in cytoplasmatischen Kompartimenten sich durchaus im Bereich einer maximalen Aktivierung des Enzyms bewegen diirfte (vgl. BESFORD und MAw 1976).

Enzyme des Typs der granulumgebundenen Starkesynthetase konntcn somit dureh­aus durch Veranderungen der K+-Aktivitat im gegebenen Kompartiment reguliert wer" den. Die Relevanz eines solchen Regulationsmechanismus soIl weiteren Untersuchungen vorbehalten bleiben.

Literatur

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Eingegangen am 5. Ma·i 1981.

Anschrift der Verfasser: Dozent Dr. E. PREUSSER, FAWZY ANDRAWISS KHALIL und HORST Go­RING, Sektion Biologie der Humboldt-Universitat Berlin, DDR - 1040 Berlin, InvalidenstraBe 43.