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1. „Die allgemeine Rede“

Der Schauplatz des Geschehens: Die glückliche Pfanze, Stren!riedeund die Gegen"ehr

Es gibt im Leben einer Pfanze so etwas wie den perfect day …. Genug Sonne,

aber nicht zu heiß, genug Wasser, aber nicht zu viel, eine !ngri"e durch#raß$eine oder Pathogene, eine angenehme %em&eratur, ausreichende'(hrsto"versorgung )ber den *oden, aber nicht zu viel Salz oder ein zu e+tremer&-Wert, eine ausreichende enge an /01 in der Lu$t bzw. eine der Pfanzeangenehme 2usammensetzung der !tmos&h(re ohne nennenswerte engen anSchadsto"en, und zu guter Letzt eine mechanischen 3erletzungen durch zustaren Wind oder andere Lebewesen.

!n einem solchen %ag wird in den 2ellen der Pfanzen 4gesch($tiges %reiben5herrschen, und was dann geschieht 6 !u$- und !bbau von Proteinen,S&eichersto"en und etaboliten, Photos7nthese, Wachstums&rozesse 6

betrachten wir gewissermaßen als den Grundzustand der &fanzlichen !tivit(t.Wie aber schon an dem langen ersten Satz erennbar, gibt es 8ede enge#atoren, die der Pfanze ihren &er$eten %ag vermiesen 9nnen. :n diesem Puntunterscheiden sich Pfanzen nicht von enschen und %ieren. W(hrend 8edoch einensch, der einen 4'(hrsto"mangel5 vers&)rt, zum ;)hlschran oderschlimmsten$alls n(chtlich zur n(chsten %anstelle &ilgert, w(hrend ein und inder ittagshitze die Sonne meidet oder ein 3ogel vor einer sich an&irschenden;atze in den n(chsten *aum f)chtet, ann die Pfanze all das nicht tun.

<abei ann die Pfanze durchaus einiges, was wir ihr lange 2eit nicht zugetrauthaben, z.*. von Pfanze zu Pfanze vor einer Ge$ahr warnen, und das zum %eil

sogar sehr s&ezi=sch. <abei werden f)chtige *otensto"e eingesetzt, dieWarnung er$olgt also gewissermaßen &er Lu$t&ost. <ennoch, die Pfanze annsehr viele <inge nicht, die wir 9nnen, und vor allen <ingen ann sie nichtweglau$en. Was sie ann und was sie daher, wann immer ihr >ngemacht droht, ingroßem Stil tut, ist das !n&assen ihres etabolismus?.

<iese !n&assung de=nieren wir ein$ach durch die beobachtete !bweichung vonbesagtem 4Grundzustand5. Wenn die Pfanze w(hrend dem !ngri" einesPathogens &l9tzlich eine @eihe von Genen e+&rimiert, die sonst nie verwendetwerden, nehmen wir an, dass diese Gene etwas mit dem Pathogenbe$all zu tunhaben.

#nsere $ragestellung: %as genau tut die Pfanze&

<as Problem mit dem *eobachten ist nat)rlich, dass die 2elle so lein ist und wirausschließlich au$ indirete 'achweise angewiesen sind. <as bedeutet, dass wirganz o$t nur au$ einer der vielen m9glichen Ebenen suchen und daraus dannSchl)sse ziehen, die zwar logisch und naheliegend sein m9gen, aber eventuelldoch nicht ganz der Wahrheit ents&rechen.

Die erste '(ene: D)*

<ie Ebene der genomischen <'S ist nicht sehr ergiebig. Aede 2elle beinhalten dasgesamte Erbgut eines 0rganismus?, obwohl eineswegs 8ede 2elle auch alle4Gen&rodute5 braucht. <ie #rage, ob ein Gen au$ einem /hromosom ein$ach

B

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codiert ist oder in 3erdo&&lungen vorliegt, gibt einerlei !u$schluss dar)ber, wiestar es e+&rimiert wird.

 %ats(chlich ann man theoretisch auch von der genomischen <'S gewisse@)cschl)sse ziehen, welche Gene e+&rimiert werden. Wenig gebrauchte <'Swird dichter ge&act und auch anhand von eth7lierungsmustern der <'S l(sstsich einsch(tzen, ob ein Gen h(u=g abgelesen werden soll oder nicht. <as istaber alles noch nicht wahnsinnig gut er$orscht, e+&erimentell sehr schlechtzug(nglich und letztlich sowieso eher etwas vage.

Die z"eite '(ene: R)*

4@'!5 bezeichnet eine Gru&&e ganz unterschiedlicher ole)le, die sich aus'uleotiden zusammensetzen. Sie sind normalerweise einzelstr(ngig und $ormendements&rechend gerne om&lizierte und h(u=g sehr stabile Seund(rstruturen.<er beannteste @'!-%7& ist sicherlich die m@'!, die direte !bschri$ten vonGenseCuenzen enth(lt und als 3orlage $)r die Proteinbios7nthese gebraucht wird.

@ein mengenm(ßig $(llt die m@'! neben den anderen Sorten nicht besonders insGewicht. <ennoch ist die m@'! ein ungeheuer wichtiges ole)l und 2ugang zu:n$ormation )ber das 3erhalten der 2elle.

Was macht ein *ibliothear, wenn D andwerer mit ihren großen, rauen(nden vor ihm stehen und allesamt ein bestimmtes wertvolles *uch ausleihenwollenF Er bittet sie, draußen zu warten, und macht von dem gew)nschten :nhaltD ;o&ien. <amit besch)tzt er sein *uch vor *esch(digung und sorgt zugleichda$)r, dass alle D andwerer so$ort mit der !rbeit beginnen 9nnen.

Genauso macht es die 2elle mit der :n$ormation au$ der <'S. ;ein @ibosomommt in die '(he der <'S, da$)r werden, wenn ein bestimmter *au&lan

ge$ordert ist, 8ede enge @'!-;o&ien davon ange$ertigt und aus dem 2ellerngeschleust. an ann ein #orscherleben damit verbringen, zu er$orschen, wiegenau diese Entscheidung getro"en wird, welches Gen nun abgelesen wird,welche Signal au$ welchem Weg letztlich welche Proteine im 2ellern an die <'Srerutieren. an ann eben$alls sein Leben mit den %rans&ort&rozessen durch die;ern&oren verbringen. an ann aber auch ein$ach anhand der !bschri$ten, dienach draußen zu den andwerern geschict werden, nachsehen, was die 2elle

 8etzt gerade &roduziert haben m9chte. <amit erhalten wir einen berblicdar)ber, was bereits e+istiert, und wissen auch nicht mit letzter Sicherheit, obdas 2eug so auch wirlich hergestellt wird. Wir wissen weiterhin nicht, ob es dannativiert wird, ob es innerhalb der 2elle trans&ortiert oder durch andere Proteine

gebunden wird oder wie lange es bestehen bleibt, bis es wieder abgebaut wird.Wir wissen genau dasH <ie 2elle m9chte 8etzt, dass davon diese engehergestellt wird.

+um *urischen: -pen /0n R)* (asierend au! %ikipedia2

• <ie mR)*, 30ten4R)* Iengl. messenger RNAJ stellt eine !bschri$t eines Gens dar,das in der <'S codiert ist. 2un(chst sind dabei auch noch nicht-codierende*ereiche I:ntronsJ enhalten, die werden aber herausgeschnitten Is&licingJ. <ie rei$em@'! enth(lt nur noch die codierende SeCuenz $)r das 8eweilige Proteine und

einige regulatorische Elemente, die ihre eigene 'utzung und Lebensdauerbeeinfussen, darunter den Pol7-!-Schwanz Ider )brigens nicht als % oder ! inGenom codiert ist, sondern e+tra ange$)gt wirdJ. <ie unges&leißte 3orstu$e der

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m@'! bezeichnet man auch als hnR)*, heter0gene 5ern4R)* Iengl.heterogeneous nuclear @'!J oder &r(-m@'! Ioder engl. &re-m@'! $)r &recursorm@'!J.

• <ie snR)*, small nuclear4R)*, im 2ellern von Euar7oten, ist verantwortlich $)rdas S&leißen der hn@'! am S&leißosom.

• <ie siR)*, small inter!ering R)*, entsteht bei einem Signalweg der 2elle, der als@'!i I@'! :nter$erenceJ zusammenge$asst wird. <abei wird ds@'! Ido&&elstr(ngige@'!K englisch double-stranded @'!J durch das Enz7m <icer in viele leinere#ragmente von ca. 11 'uleotiden L(nge zerteilt Idie si@'!sJ und in denEnz7mom&le+ @:S/ I@'!-induced silencing com&le+J eingebaut. ithil$e derinor&orierten @'!-#ragmente bindet @:S/ om&lement(r an <'!, z. *.Genbereiche, oder m@'! und ann diese damit 4abschalten5. si@'!s werdenatuell I1MJ intensiv au$ ihre *eteiligung an verschiedenen 2ellvorg(ngen und;ranheiten er$orscht.

• <ie miR)*s, micr0R)*s sind eng verwandt mit den si@'!s und dient der@egulation zellul(rer Prozesse wie z. *. Proli$eration und 2elltod. <ie circR)*,zirkul6re R)* ist daran durch *indung an mi@'! beteiligt

• <ie asR)*, antisense4R)*, dient der @egulation der Gene+&ression.

• <ie Ri(0s"itches dienen der Genregulation. Sie 9nnen entweder ativierend oderre&rimierend wiren.

• <ie Ri(0zme sind atal7tisch ative @'!-ole)le. Sie atal7sieren wie Enz7me chemische @eationen.

• <ie rR)*, ri(0s0male R)*, tr(gt, (hnlich wie die t@'!, eine genetische:n$ormation, sondern ist am !u$bau des @ibosoms beteiligt und ist bei der ;n)&$ungder Pe&tidbindung auch atal7tisch ativ.

• <ie sn0R)*, small nucle0lar4R)*, =nden sich im 'uleolus, und die engverwandten scaR)*s in den /a8al *odies.

• <ie tR)*, -rans!er4R)* codiert eine genetische :n$ormation, sondern dient alsil$smole)l bei der Proteinbios7nthese, indem sie eine einzelne !minos(ure ausdem /7to&lasma au$nimmt und zum @ibosom trans&ortiert. <ie t@'! wird durch einbestimmtes @'!-Gen codiert.

Die dritte '(ene: Pr0tein

<er 'ame Protein stammt ab vom griechischen Wort $)r 4den ersten Platzeinnehmen, am wichtigsten sein5. <ie Proteine sind die !rbeitstiere in 8ederlebenden 2elle. Es gibt nat)rlich auch andere *austo"e I/ellulose, Lignin, dermineralische !nteil der ;nochenJ, es gibt sogar mehr oder minder &rotein$reieEnz7me I@iboz7meJ, aber letztlich sind Proteine eine große, viel$(ltige,ungeheuer wichtige Gru&&e von ole)len, ohne die in der 2elle )berhau&tnichts l(u$t.

Es sind Proteine, die Signale von außerhalb der 2elle wahrnehmen undweiterleiten und die den %rans&ort von leinen ole)len innerhalb und zwischen

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den 2ellen regulieren. Es sind Proteine, die das !blesen der <'! regulieren, und,gemeinsam mit einigen @'!-ole)len, aus$)hren. <as wahrscheinlichWichtigste ist aber, dass &ratische alle S7nthesen und sonstigen enz7matischen@eationen Sache der Proteine sind. 0hne Proteine 9nnte eine 2elle mit ihrenLi&idmembranen und ihrer <'S im 2ellern zwar bestehen, es w(re aber ein

v9llig statischer 0rt, gewissermaßen eine Geisterstadt.<ements&rechend verlocend ist es nat)rlich, 3org(nge in der 2elle diret au$Proteine zu untersuchen. <abei stoßen wir 8edoch au$ eine @eihe großerSchwierigeitenH

*llgemeinesB. Es gibt ein !u$reinigungs&rotooll, mit dem man alle Proteine

gleichermaßen gut au$reinigen 9nnte. >nterschiede in Gr9ße, L9slicheitund &-0&timum machen das unm9glich. Somit reinigt man grunds(tzlichnur eine %eilmenge au$ und weiß nicht genau, wen oder was man dabeieigentlich verloren hat.

1. Seund(r-, %erti(r und nat)rlich Ouart(rstrutur von Proteinen sindteilweise recht em&=ndlich gegen brachiale chemische ethoden der2ell9"nung und des !u$reinigens. <as ist unter >mst(nden nicht schlimm,wenn man ein Protein nur nachweisen will, macht aber h(u=g dieanschließende !nwendung des Proteins z.*. zur sicheren :denti=zierungoder $)r !tivit(tstest erst nach umst(ndlichen @enaturierungsver$ahrenm9glich. %eilweise sorgt es aber auch da$)r, dass genau 8enes em&=ndlicheProtein, $)r das man sich interessiert, schon w(hrend der !u$reinigungzerst9rt wird.

N. <ie Proteine in einer 2elle ommen in sehr unterschiedlichenengenverh(ltnissen vor. (u=g masiert damit ein star e+&rimiertes

Protein Iwie z.*. in Pfanzen die @ubiscoJ die anderen Proteine. an anngewissermaßen ein ;ilo Protein au$reinigen und trotzdem aum was vondem =nden, was man eigentlich m9chte, weil $ast alles @ubisco ist.

. W(hrend man 'uleotidseCuenzen mit einem s&ezi=schen Primer bindenund 4heraus=schen5 ann, gibt es $)r Proteine aum solche 9glicheiten.

 %eilweise ann man sie sich an Substraten $estbeißen lassen, aber das istziemlich om&liziert und er$ordert große engen an Protein, da man sehrviel 3erlust hat.

D. <as Elegante an der !rbeit mit @'!Q<'S ist nat)rlich, dass man sich ausleinen Probenmengen die $)r die E+&erimente ben9tigten engen4herausam&li=zieren5 ann, und das, wie gesagt, auch noch hochs&ezi=sch

$)r leinste 'uleotidmengen in einem Wust von anderen <ingen, die unsnicht interessieren. *ei Proteinen hingegen haben wir immer nur e+at das,was wir au$gereinigt haben. <aher sieht man in Proteinlabors die Leuteteilweise mit W(gen voller großer Erlenme7erolben herumlau$en, in denensie ihre ;ulturen von *aterien haben, die ihr gew)nschtes Protein)bere+&rimieren. Wieviele Pfanzen man dann braucht, um ein nicht-)bere+&rimiertes, eventuell sogar schwach e+&rimiertes Proteinau$zureinigen, will man sich gar nicht vorstellen. Es ist teilweise schlichtnicht m9glich.

*u!reinigung eines einzelnen Pr0teins

M. Proteine sind, von außen betrachtet, chemisch o$t nicht besondersunterschiedlich. Sie haben unterschiedliche Gr9ßen und sie haben einegewisse Ladung und 7dro-QLi&o&hilie. Somit ann man

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:onenaustauschchromatogra&hie oder size exclusion anwenden und istauch eine !u$trennung anhand der Li&o&hilie Iz.*. reversed phase /hromatogra&hieJ m9glich. !lle diese ethoden bringen z.*. durchWaschschritte deutliche 3erluste mit sich. :m #alle eines negativ geladenenProteins bringt der :onenaustauscher ohnehin &ratisch einen Gewinn,

denn die allermeisten Proteine sind negativ geladen. 3or allem Sizeexclusion $)hrt grunds(tzlich zu einer 3erd)nnung der Proteinl9sung, waszeitau$wendige und h(u=g auch verlustreiche ;onzentrationsschritte n9tigmacht.#ast alle >ntersuchungen einzelner Proteine beginnen daher mit derbere+&ression des Proteins in einem reombinanten S7stem Imeist in E.

coliJ mit einem is-tag o.(., womit sich das Protein dann leicht au$reinigenl(sst. Ein tag ist ein )nstlich ange$)gter 2usatz an einem Protein, derstar und s&ezi=sch an etwas bindet. -M istidin-@este binden z.*. sehrgut an 'icelionen, so dass das Protein in einem einzigen Schritt )ber eine'icels(ule au$gereinigt werden ann.

<er 'achteil am reombinanten S7stem ist 8edoch, dass manche om&le+eProteine aus Euar7oten in *aterien nicht richtig e+&rimiert werden. <asann an ungew9hnlichen /odons liegen, die das *aterium selten nutzt, anSchwierigeiten beim S&leißen, beim #alten des Proteins oder bei&osttranslationalen odi=ationen. <ann sind om&liziertere S7steme wiee$en, :nseten- oder S(ugetierzellulturen n9tig, was das ganze erheblichau$wendiger, niRiger und weniger ergiebig macht, aber immer noch vielleichter ist als das !u$reinigen des nativen Proteins.

Pr0te0mics. Proteomics-!ns(tze, also die >ntersuchung der Gesamtheit der Proteine

einer Probe anstelle eines einzelnen Proteins, umgehen nat)rlich dasl(stige !u$reinigen eines einzelnen Proteins, aber ganz ohne !u$reinigungommt man auch $)r Proteomuntersuchungen nicht aus. Ein ein$acherProteinrohe+trat ist schnell hergestellt, aber l(sst sich im Gegensatz zue+trahierter @'! oder <'! nur urz lagern, wenn man es nicht risierenm9chte, manche em&=ndlichen Proteine zu verlieren. Sobald man nur dieProteine einer bestimmten 0rganelle Iz.*. ;ern $)r regulatorische Proteineoder /hloro&last $)r Proteine der Photos7ntheseJ untersuchen m9chte,werden die Protoolle zur E+trahierung schnell noch viel au$wendiger alsz.*. eine @'!-E+tration. <ar)ber hinaus stellen uns auch die Proteomics-!ns(tze immer noch vor das Problem der :denti=zierung der ge$undenen

Proteine.#r)her waren 4Proteomics5 au$ 1<-Gele beschr(nt. Proteine wurden dabeiin der einen <imension nach ihrer Gr9ße, in der anderen )ber einen &-Gradienten nach ihrer Ladung au$getrennt. <ie @e&roduzierbareit und4!uswertbareit5 der Gele war beschr(nt. <ie %echni er$orderteEr$ahrung und sehr gute Laborarbeit.eute sind massens&etrometrische !ns(tze die @egel. *ei derassens&etrometrie wird die asse eines ole)ls anhand seiner#lugbahn in einem eletrischen #eld bestimmt. <a$)r muss das ole)lzum einen ionisiert, zum anderen zum 4#liegen5 gebracht werden. EinProtein ann dazu nicht wie ein leines organisches ole)l mit einem

Laser beschossen werden, es w)rde sich zersetzen. Stattdessen ann es ineine atri+ eingebettet werden, die dann zerschossen wird, so dass dasProtein 4in die Lu$t geschleudert5 wird. !nhand der #lugdauer wird dann

D

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au$ die Gr9ße des Proteins zur)cgerechnet I!L<:-%0#H matrix-assisted

laser desorption ionization – time of ight J. %echnische Schwierigeitenentstehen, wenn ein Protein $)r dieses Prozedere zu groß ist. !bhil$escha"t das so genannte ngerprintingH <er Proteine+trat wird mits&ezi=schen Proteinasen verdaut, so dass &rotein-s&ezi=sch

wiedererennbare Pe&tide entstehen, die dann anstelle des om&lettenProteins eingesetzt werden.:nzwischen ist 8edoch das so genannte L/-SQS Iliuid chromatography -

!x mass spectrometry J die StandardmethodeH <ie Probe Idie da$)rgr)ndlich von Li&iden und vor allem ;ohlenh7draten gereinigt sein muss,die die ;a&illaren versto&$en w)rdenJ wird durch eine PL/chromatogra&hisch au$getrennt I)blicherweise also anhand der Li&o&hilieder ProteineJ, und dann 4online5, also im selben Ger(t, in einassens&etrometer weitergeleitet. <abei wird die Probe durch eine;a&illare ge&resst und in einem eletrischen #eld so $ein zerst(ubtIhtt&sHQQde.wii&edia.orgQwiiQEletros&ra7-:onisationJ, dass die enthaltenen

ole)le ionisiert werden und 4gas$9rmig5 von einem %r(gergasmitgerissen werden 9nnen. Es $olgt dann eine erste !u$trennung derProteine nach Gr9ße, dann l(sst man sie gegen eine Gaswand fiegen, sodass sie zer$allen, so dass die *estandteile ein zweites al gemessenwerden 9nnen 6 daher die do&&elte *ezeichnung 4SQS5.Letztlich ist L/-SQS der moderne und elegante 'ach$olger des 1<-Gels,weil die Proteine in einem einzigen E+&eriment anhand zweierEigenscha$ten Iasse und eine chemische Eigenscha$tJ au$getrenntwerden.#)r derartige !ns(tze braucht man nat)rlich große engen Protein, vorallem, wenn man wieder gerade die gering e+&rimierten s&annend =ndet

Iz.*. %ransri&tions$atorenJ. <as bedeutet, dass man große engenaterial au$reinigen muss, und das bedeutet, dass sich an vielen Stellen#ehler in die essung einschleichen 9nnen durch unterschiedliche*ehandlung der Proben. Wenn ich z.*. meine ;ontroll&robe zwischendurchurz antauen lasse, so dass bestimmte Proteine zerst9rt werden, werde ichnat)rlich =nden, dass in meinen anderen Proben von diesem Protein vielmehr vorhanden ist. <ieses Problem ann man umgehen, indem man die;ontroll&fanzen mit schwerem Sticsto" mariert und dann die Probenmischt, so dass man sie automatisch gleich behandelt. <ass das die!uswertung wieder ents&rechend om&lizierter macht, liegt au$ der and.:n 8edem #all erh(lt man bei Proteomics-E+&erimenten enorme <atens(tze,

deren !uswertung einiges Statistiverst(ndnis voraussetzt und die onatedauern ann.

<ie /haraterisierung eines Proteins, das man reombinant mit einem tag Iwiez.*. is- oder GS%-tag" herstellt, ist eine 3orgehensweise, die heutzutagestandardm(ßig angewendet wird und nicht &er se eine große eraus$orderungdarstellt. <as !u$reinigen eines schwach e+&rimierten nativen Proteins istdagegen immer noch eine ;unst und eine Oual, die man sich nach 9glicheitnicht antut.

!uch Proteomics sind in gewisser Weise normal geworden, aber sie sind bei

weitem nicht so eine Standardmethode wie z.*. CP/@. Sie sind auch immer nocharbeitsintensiver, an$(lliger und teurer als z.*. %ranslatomics wie @'! SeC.

M

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*eim 3ergleichen von Proteomics und %ranslatomics-<aten $(llt au$, dass manh(u=g au$ Proteinebene viel weniger Ergebnisse beommt. Leider zeigen diemeisten 3er9"entlichungen entweder %ranslatomics oder Proteomics, aber ineinem Pa&er hab ich mal ein 3erh(ltnis gesehen von ca. 1 ver(nderttransribierten Genen zu ca. D ver(ndert e+&rimierten Proteinen. <as hat

nat)rlich mit den oben genannten Gr)nden zu tun, aber eventuell auch damit,dass die Tnderung au$ @'!-Ebene tats(chlich gar nicht au$ der Proteinebeneanommt. an ann es daher auch &ositiv sehenH Ein ;ollege von mir, derProteomics macht, meinte dazuH 4Wir =nden halt nur das, was auch wirlichwichtig istU5

Die /ierte '(ene: 7eta(0lite 0der: „*lles, "as nicht D)*, R)* 0der

Pr0tein ist“2

4etabolite5 ist ein schwammiges Wort, es ann allgemein 4leine ole)le5

bezeichnen wie Glucose oder Glutamat Ida w)rde man dann 4etabolite desPrim(rsto"wechsels5 sagenJ oder s&ezieller $)r om&liziertere ole)leverwendet werden, in unserem #all zumeist seund(re Pfanzensto"e, also4Seund(rmetabolite5. Schon bei der sehr uneinheitlichen Gru&&e der Li&ides&alten sich die Geister, ob diese Ioder welche davonJ nun etabolite zu nennenseien.

2u den &fanzlichen Seund(rmetaboliten z(hlen z.*. die !nthoc7ane, hellrote bislila *latt$arbsto"e, die der Pfanze als 4Sonnencreme5 bei zu viel >3-Strahlungdienen und auch sonst h(u=g im 2uge einer Stressantwort hergestellt werden.Weitere wichtige Seund(rmetabolite sind 8ene Sto"e wie z.*. die Ph7toale+ine,die als !bwehr gegen #raß$einde oder Pathogene zum Einsatz ommen. 2u diesergroßen und wichtigen Sto"gru&&e z(hlen auch die /amale+ine. !uch !ntiobiotiasind letztlich Seund(rmetabolite.

etabolit-!nal7sen stellen uns vor ein &aar eraus$orderungen, die wir schon vonden Proteinen ennenH Eine heterogene Gru&&e an ole)len, die wir anhandeines bestimmten Protoolls niemals alle gleich gut e+trahieren 9nnen. %eilweiseinstabile ole)le, die bei der E+tration verlorengehen. >nd eine /hance, einbestimmtes davon 4&ers9nlich anzus&rechen5 oder gar zu am&li=zieren.

<ennoch gibt es nat)rlich ein &aar grundlegende >nterschiede zu denProteomics. Wenn man sich z.*. ohnehin nur $)r eine bestimmte Li&idgru&&e

interessiert, die zudem einigermaßen stabil ist Iz.*. die %ri-!c7l-Gl7ceride, alsoS&eicherli&ideJ, ist die E+tration anhand des da$)r etablierten Protoolls gar einProblem. <ass man dann ein &aar andere Substanzen verliert, interessiert nichtweiter, und E"ete wie w(rme- oder enz7matisch bedingte <egradation wie beieiner Proteinau$reinigung braucht man nicht zu $)rchten. Li&asen und (hnlicheEnz7me 9nnen &roblemlos am !n$ang der !u$reinigung denaturiert werden,ohne dass diese Li&ide dadurch beeintr(chtigt w)rden.

<as Gegenteil ist der #all bei instabilen etaboliten wie z.*. Pero+iden, E&o+idenund star o+idationsan$(lligen Substanzen. %eilweise ann man die gar nichtau$reinigen, sondern versucht, sie z.*. diret mit #arbsto"en in einer Probelebenden Gewebes nachzuweisen, oder sucht ersatzweise nach !bbau&rodutenQ<erivaten dieser Sto"e.

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:st die !u$reinigung einer bestimmten etabolit-#ration gelungen, ommenh(u=g PL/ Ichromatogra&hische !u$trennung zumeist anhand der Li&o&hilieJund, daran geo&&elt, assens&etrometrie zum Einsatz. assens&etrometrieist hier ein viel leineres Problem, da die meisten 4leinen ole)le5 mit weniger!u$wand Iund ohne vorherigen 3erdauJ zum #liegen )berredet werden 9nnen.

Eine direte :denti=ation wie anhand der s&ezi=schen Pe&tid$ragmente ist dannallerdings auch nicht m9glich. Es gibt ein$ach wahnsinnig viele leine ole)le,sie 9nnen alle m9glichen eteroatome enthalten, und sie haben, im Gegensatzzu einem Pe&tid, einerlei vorgegebene chemische Strutur. inter einer sim&lenSummen$ormel 9nnen sich hunderte verschiedener Substanzen verstecen.<aher hil$t hier h(u=g nur, eine Substanz, die man hinter einem bestimmtenSignal vermutet, einzuau$en und als 3ergleichs&robe einzusetzen. Selbst dannaber bleiben manche stereochemischen #einheiten noch ungewiss.

Die !ün!te '(ene: der Ph6n0tp

<ie @eation einer Pfanze au$ einen bestimmten @eiz, eine bestimmte St9rungihres 4&er$eten %ages5, ist h(u=g auch mit bloßem !uge sichtbar. ;eimlinge, dieim <uneln gehalten werden, bleiben bleich und schießen in die 9he. <urch4sauren @egen5 gesch(digte %annen verlieren 'adeln und bilden an den!stoberseiten 4!ngsttriebe5, um den 3erlust an &hotos7nthese$(higem Gewebeauszugleichen. *(ume, die an windigen *ergh(ngen stehen, bleiben viel leinerund 4norriger5 als ihre Geschwister an gesch)tzteren Stellen.

!uch iroso&ie hil$t beim #inden von Ph(not7&enH 3er(nderte 2ahl und Gr9ßevon Stomata durch bere+&ression eines %ransri&tions$ators. !blagerungen von/allose in den Wurzeln von ;eimlingen, die au$ einem edium mit einembestimmten Seund(rmetaboliten wachsen. 3er(nderte !nzahl und Gr9ße von*latthaaren in$olge von utationen.

Ein Ph(not7& ist immer die 4;rone5 einer genetischen #orschung, schließlich istauch der sch9nste moleulare echanismus langweilig, wenn er anscheinendnicht den geringsten E"et hat. Leider ommt man selten diret vom Ph(not7& zuden beteiligten Genen, weil der Ph(not7& h(u=g etwas sehr uns&ezi=sches ist,etwa wie ein ensch, der zum !rzt geht und )ber ;o&$schmerzen lagt. <erPatient hat eventuell ein$ach )ber den %ag zu wenig getrunen, er beommtvielleicht eine Gri&&e oder aber er hat einen ge$(hrlichen irntumor. <er4Ph(not7&5 allein gibt hier)ber noch einen !u$schluss.

St9rt man durch ;0 oder bere+&ression das Gleichgewicht der &fanzlichenGene+&ression, so erh(lt man h(u=g 42werge5, die winzig lein bleiben, an$(llige,langsam wachsende Pfanzen oder gar letale utationen. <ie Erenntnis, dass diebetro"enen Gene $olglich 4irgendwie $)r Wachstum und Entwiclung5 wichtig seinm)ssen, ist dann eher trivial. !uch St9rungen der *l)tenbildung und #ertilit(t9nnen au$ eine ganze @eihe teils noch nicht endg)ltig verstandener Signalwegezur)cgehen und $)hren somit selten au$ diretem Weg zu einem bestimmtenGen.

Sehr h(u=g sehen die Pfanzen auch zun(chst ganz normal aus und zeigen erstunter einem s&ezi=schen Stress eine besondere @eation. anchmal bleibt einPh(not7& auch unentdect, weil man ihn nicht erwartet hat… z.*. eine Tnderung

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der !nzahl der Stomata, die ein au$wendiges !usz(hlen miroso&ischer!u$nahmen n9tig machen w)rde, um es )berhau&t zu bemeren.

#)r das 4Erz(hlen einer zusammenh(ngenden Geschichte5, wie #orschung es)blicherweise tun sollte, ist der Ph(not7& dennoch au$ 8eden #all wichtig.

+usammen!ügen der '(enen zu einer „St0r“

<er :deal$all w(re, dass man au$ allen Ebenen bescheid weißH Ein bestimmtesGen codiert $)r eine bestimmte Iso oder anders ges&leißteJ m@'!, diese codiertz.*. $)r ein Protein der !nthoc7an-*ios7nthese, dieses s7nthetisiert einenbestimmten etaboliten Ihier also ein !nthoc7anJ und sorgt somit beibere+&ression $)r einen >3-Licht-resistenten Ph(not7& oder sogar schon ohneStress $)r eine r9tliche #arbe der Pfanzen.

eist ist es 8edoch weder m9glich noch n9tig, wirlich au$ allen EbenennachzusehenH 'achweise au$ @'!- und etabolit-Ebene lassen es z.*. h(u=g zu,die Protein-Ebene zu )bers&ringen.

acht euch bewusst, dass 8e nach dem, au$ welcher Ebene man au$ eine 4Stor75au$mersam wird, die anderen Ebenen unterschiedlich leicht oder schwer zuerreichen sind.

8. -eil: %as "ir gemacht ha(en

Pfanzenmaterial zerkleinern

Es gibt in moleularbiologischen Labors viele Standardmethoden zum

!u$schließen von 2ellen, die au$ chemischen ethoden oder au$ dem !nwendenvon Scherr($ten basieren, und eine davon $untioniert $)r Pfanzenzellen. Grundda$)r ist nat)rlich die dice starre 2ellwand, die die Pfanzen&h7siologen zurabiaten ethoden zwingtH 2ermahlen der in Sticsto" ge$rorenen Probe mithil$eder ;ugelm)hle, mit Seesand oder mit dem 9rser.

it der ;ugelm)hle 9nnen viele Proben gleichzeitig bearbeitet werden und dieProbe verl(sst nicht mehr das sch)tzende E&&i, wird also weniger als beim9rsern Sauersto" oder m9glichen 3erunreinigungen ausgesetzt und geht auchnicht so leicht verloren. #)r ;eimlinge oder Wurzeln ist das damit die ethode derWahl.

*ei adulten Pfanzen, von denen man zum 2ermahlen mit der ;ugelm)hle nur 1-N*l(tter verwenden ann, ist die ;ugelm)hle dann nicht geeignet, wenn eseventuell zu große >nterschiede zwischen den *l(ttern gibt, so dass deren!uswahl das Ergebnis massiv beeinfusst. <ann m)ssen die Proben einzelngem9rsert werden.

Wichtig ist in allen #(llen, dass die Proben eines$alls au$tauen. !ngetaute Probenver(ndern ihre 2usammensetzung durch w(rmebedingte <egradation undenz7matische !tivit(ten ganz erheblich.

R)*4'9trakti0nGerade $)r @'!-E+tration ist es wichtig, dass die Proben nie antauen. @'! ansich ist recht stabil, aber die Welt ist voller @'!sen, die rasend schnell arbeiten

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und sich durch nichts ablenen lassen. @'!sen )berstehen es, geocht oder garautolaviert zu werden, und zeigen zum %eil sogar in organischen L9sungsmittelnnoch eine gewisse !tivit(t.

>m nicht om&lett @'!se-$rei arbeiten zu m)ssen, verwendet man $)r alleL9sungen und Pu"er mit <EP/ angereichertes Wasser. <EP/ hemmt @'!senirreversibel durch das !usbilden einer ovalenten *indung im ativen 2entrumdes Enz7ms.

<er 4%ric5 an der von uns verwendeten %rizol-E+tration ist, dass man aus einerProbe sowohl @'! als auch <'! und Protein e+trahieren ann. Wenn man mitwenig ergiebigem aterial wie ;eimlingen, Wurzeln oder gar Embr7os arbeitet,ist man $roh an 8edem bisschen Probe, das man gewinnbringend einsetzen ann.

<er erste Schritt der %rizol-E+tration ist das !ussch)tteln der Probe in einemw(ssrigen, &henolhaltigen Pu"er gegen /hloro$orm. /hloro$orm bildet au$grunddes hohen 4Gewichts5 der /hloratome die untere Phase, der w(ssrige Pu"er die

obere Phase. Phenol ann sich au$grund seiner 0-Gru&&e, die durch esomerie-E"ete sogar leicht sauer ist, gut in Wasser l9sen, wird sich aber auch zum %eil inder /hloro$orm-Phase wieder=nden. Es bildet sich eine :nter&hase aus unl9slichenaromole)len und 2ellbruchst)cen.

@'! ist h7dro&hil und bildet eine gar zu großen ole)le, damit be=ndet es sichin der w(ssrigen Phase. Proteine wurden durch die 2ugabe der organischenL9sungsmittel weitestgehend denaturiert, so dass auch die urs&r)nglichwasserl9slichen Proteine nun unstruturiert ihre li&o&hilen *ereiche &r(sentieren.Gemeinsam mit den zwar h7dro&hilen, aber großen und un$9rmigen*ruchst)cen der genomischen <'! be=nden sie sich zum %eil in der :nter&hase,zum %eil in der /hloro$orm-Phase.

<ie genaue !u$trennung von <'! und Protein er$olgt im n(chsten Schritt des %rizol-Protoolls, der $)r uns aber nicht wichtig ist, weil uns nur die @'! in deroberen w(ssrigen Phase interessiert.

:m n(chsten Schritt $(llen wir die @'! in einer ischung aus :so&ro&onal und#(llungs&u"er. <er #(llungs&u"er ist wichtig, um der @'! die Gegenionen $)r ihrPhos&hatr)cgrat anzubieten, ohne die sie auch in :so&ro&onal nicht gutaus$allen ann, weil sich sonst die ganzen negativen Ladungen zu sehr abstoßen.2uletzt wird das Pellet in Xigem Ethanol Iin <EP/-WasserJ von )bersch)ssigen:onen und von :so&ro&anolresten gereinigt.

#)r die weitere 3erwendung der @'! ist es wichtig, dass die @'! $rei vonProteinen und organischen L9sungsmitteln ist. *ei der essung der @'! am'anodro& zeigt sich ein a+imum bei ca. 1M nm, was von den deloalisiertenEletronens7stemen der @'!-*asen herr)hrt. an berechnet dann das 3erh(ltnisder !bsor&tion bei 1M nm im 3ergleich zur !bsor&tion 1N nm IorganischeL9sungsmittelJ und 1V nm I:ndolring des %r7&to&hans als :ndiz $)r das3orhandensein von ProteinJ. Liegen die Werte )ber 1, gilt die Probe aus 4sauber5.

#)r die $olgende c<'!-S7nthese wird die ;onzentration au$ ca. 1- ngQYLeingestellt.

cD)*4Snthese

*eim 3orte+ten der Proben im 2uge der @'!-:solierung 9nnen *ruchst)cegenomischer <'! entstanden sein, die lein genug sind, um wasserl9slich zu

B

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sein, und die somit mit der @'! au$gereinigt worden sind. >m eine3erunreinigung durch genomische <'! zu risieren, ist der erste Schritt derc<'!-S7nthse ein <'!se-3erdau.

<a s&(ter c<'! hergestellt werden soll, muss die <'!se im !nschluss inativiertwerden. <ies geschieht durch 2ugabe von E<%! I;om&le+bildnerK die von unsverwendete <'!se ben9tigt /a1Z als ;o$ator, der ihr damit entzogen wirdJ und<enaturierung der <'!se bei MD[/.

:m n(chsten Schritt wird die Probe mit Primern versehen. <a die @'! m9glichstum$assend in c<'! umgeschrieben werden soll, m)ssen 4degenerierte5 Primerverwendet werden, die $)r alle m9glichen SeCuenzen verwendet werden. Primervon ca. *asen L(nge binden noch gut genug, sind aber zugleich schon souns&ezi=sch, dass sie $)r die verschiedensten Gene als Primer in #rage ommen.'eben den random nonamer  Primern werden Pol7-d%-Primer eingesetzt, die alsGegen&art zum Pol7-!-Schwanz der m@'! als Primer binden 9nnen. <a mehrererandom nonamer  Primer an verschiedenen Stellen binden 9nnen, werden

verschiedene #ragmente der SeCuenzen am&li=ziert. :n der CP/@ werden meistnur #ragmente von ca. B b& am&li=ziert, somit ist die vollst(ndige bertragungder om&letten m@'! in c<'! auch nicht n9tig, solange nur alle *ereiche derSeCuenz durch ausreichend große #ragmente abgedect sind.

2um *inden der Primer wird die Probe au$ [/ erhitzt. <adurch werden dieSeund(rstruturen der einzelstr(ngigen m@'! Iund gg$. der PrimerJ au$gehobenund die Primer 9nnen sich lose anlagern.

:m n(chsten Schritt werden @everse %ransri&tase I@%J, d'%Ps und der Pu"er der@% hinzugegeben. @everse %ransri&tase ist ein Enz7m aus @etroviren, das @'! in<'! umschreibt. <ass es auch einen :n$ormationsfuss von @'! nach <'! gibt,war bei der Entdecung dieses Enz7ms $)r viele enschen )berraschend. anging davon aus, dass der :n$ormationsfuss grunds(tzlich nach dem Schema <'!-\ @'! -\ Protein verl(u$t und nicht umgeehrt werden ann.

<ie @everse %ransri&tase verwendet $)r ihre energieau$wendige @eation'uleotidtri&hos&hate, wobei ein P7ro&hos&hat und somit zwei 4energiereiche*indungen5 geo&$ert werden $)r 8edes eingebaute 'uleotid. Sie verwendetnat)rlich deso+7-'uleotide, weil es 8a <'! werden soll. <ieGesamt&robenmenge wird dabei nicht wie bei einer 4normalen P/@5 vermehrt,denn die @% aze&tiert nur @'! als atrize und baut diese atrize nach dem>mschreiben ab. 2uletzt vervollst(ndigt sie die einzelstr(ngige c<'! zum

<o&&elstrang. <as Enz7m hat somit drei verschiedene #untionenH Es ist zugleicheine @'!-abh(ngige <'!-Pol7merase, eine 'ulease zum !bbau der @'! Idieanscheinend auch nicht durch <EP/ gehemmt wird - sollte das doch der #all sein,h(tten wir m9glicherweise eine Wiederverwendbareit der @'! und somit eine!m&li=ation der ProbeJ und eine <'!-abh(ngige <'!-Pol7merase. Was dasEnz7m 8edoch nicht ann, ist das ;orreturlesen au$ eigene #ehler. <aher r)hrtauch die hohe utationsrate der @etroviren.

P;R

*ei der CP/@ werden auch leinste engen einer c<'! durch s&ezi=sche Primererannt und in einer recht hohen 2ahl an 27len Ica. J am&li=ziert. !nhandeines #arbsto"es, der in do&&elstr(ngiger <'! interaliert und dann fuoresziert,wird die Entwiclung der Gesamtmenge an <'! ver$olgt. 'ach 8edem

BB

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!m&li=ationsschritt )hlt das Ger(t die Probe soweit, dass die <'!do&&elstr(ngig wird und eine #luoreszenzmessung m9glich ist.

Entscheidend ist, ab welchem 27lus die #luoreszenz einer Probe einen gewissenSchwellenwert I)ber dem intergrundrauschenJ erreicht. <araus wird im3ergleich zu einem anderen Gen&rodut, das man als *ezugss7stem verwendet,berechnet, wie star ein bestimmtes Gen induziert ist. <ieses *ezugss7stem istbei uns >biCuitin D. Es handelt sich also nicht um eine absolute Ouanti=zierung,sondern um eine relative bez)glich >biCuitin D. <aher ist es auch so wichtig, dassman s(mtliche Proben sauber &i&ettiert, so dass nicht unterschiedlich großeengen eingesetzter c<'! das Ergebnis ver$(lschen. Setzt man z.*. zu wenigProbe bei der >*:D-essung ein, wiren danach alle anderen Gene st(rere+&rimiert, als sie es eigentlich sind.

<a es nicht um das 3erwenden des Produts geht, sondern nur um dass&ezi=sche !u]nden und Ouanti=zieren einer SeCuenz, werden die Primer sogew(hlt, dass nicht die volle SeCuenz am&li=ziert wird, sondern ein ca. B b&

langes Produt entsteht. Somit 9nnen die !m&li=ationsschritte relativ gehaltengew(hlt werden, damit die essung insgesamt nicht zu lange dauert, und mussdie <auer auch nicht $)r verschiedene Primer&aare ange&asst werden.

CP/@-Primer werden )blicherweise 4intron-)bers&annend5 gew(hlt, also so, dasssie in der $ertig ges&leißten m@'! ein urzes, au$ der genomischen <'! 8edochein ungleich l(ngeres SeCuenzst)c um$assen. <amit soll verhindert werden,dass eventuell durch das 3orte+en zerbrochene und l9slich gewordene, somit mitder @'! au$gereinigte genomische <'! das Ergebnis ver$(lscht. <urch den<'!se-Schritt in der c<'!-S7nthese wird diese Ge$ahr aber sowieso sehr geringgehalten.

:m !nschluss an eine CP/@ betrachtet man h(u=g auch die Schmelz&unte derentstandenen Produte. <adurch ann z.*. eine niedrige '%/ I#non-template

control$, also astermi+ ohne c<'!J, die au$ einen sehr hohen intergrundhindeuten w)rde, entr($tet werden, wenn in diesen %ells ein Produt mit v9lliganderem Schmelz&unt entstanden ist.

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