194 Fresenius Z. Anal. Chem., Band 301 (1980)

Fig. 1. Typical protein spots (see text)

exclusively due to the genetic defects. At the present stage of our investigation we have found specific qualitative differ- ences in the protein spots from cell lines cultured from two unrelated patients with muscular dystrophy type Duchenne [one additional spot along with some spots of increased stain density (Fig. l b) as compared to typical normal control patterns (Fig. la)]. Also in trisomy 21 and 18 some spot differences have been observed. No differences have been found in the pattern from 4patients with Maries dominant ataxia. Other groups of genetic defects selected by us are under study. We still have to check if the difference shown in Fig. I b is specific for Duchenne muscular dystrophy or if it is also present in other muscle diseases. In order to compare the spot staining density differences, we are engaged in the development of a video aided computer analysis technique.

Acknowledgements. We thank the Stiftung Volkswagenwerk for the financial support and acknowledge the expert techni- cal assistance of Mrs. I. Gerner, Miss G. Knaack, and Mrs. B. Ressler.

References

1. Klose, J. : Humangenetik 26, 231-243 (1975) 2. O'Farrel, P.: J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975) 3. Singh, S., Klose, J., Willers, I., Goedde, H. W.:

Electrophoresis 1978, Elsevier North Holland Inc., Catsimpoolas, N., ed., pp. 297-304

4. Willers, I., Singh, S., Klose, J., Goedde, H. W. : Abstract, Electrophoresis 1979

B38

Fresenius Z. Anal. Chem. 301, 194-195 (1980) - �9 by Springer-Verlag 1980

Studien zum Reaktionsmechanismus Kohlenhydrat-spezifischer Rezeptorproteine (Lectine)

E. K6ttgen, Ch. Bauer 1, S, Schmitt, W. M6ssner und W. Gerok

Med. Klinik (Biochem. Inst. 1) der Univ., Hugstetter Str. 55, D-7800 Freiburg

Investigation of the Reaction Mechanism of Carbohydrate Specific Receptor Proteins (Lectins)

Key words: Untersuchung von Lectinen; Reaktionsmechanis- mus; Laser-Nephelometrie

Lectine k6nnen nach den heutigen Kenntnissen als Rezeptor- proteine definiert werden, die bestimmte Kohlenhydratreste

oder -sequenzen von Glykokonjugaten binden [4]. Zusfitzlich besitzen einige Lectine Bindungsstellen ftir hydrophobe Re- ste. Die Affinit/it zur Mono- oder Oligosaccharid-Einheit variiert nach Herkunftsort des Lectins. Zum Nachweis von Lectinen bedient man sich heute meist der Hfimagglutination. Wir setzten ffir unsere Untersuchungen erstmals die Laser- Nephelometrie ein und konnten damit zum einen die Nach- weisempfindlichkeit so steigern, dab Lectine und Glykopro- teine im pico-Mol-Bereich exakt zu erfassen sind [2]. Zusfitz- lich k6nnen wir mit dieser Methode neue Aussagen zum Reaktionsmechanismus zwischen Lectinen und Glykopro- teinen machen.

Material und Methoden. Die Untersuchungen erfolgten mit einem Hyland Laser Nephelometer PDQ oder einem entspre- chenden Gerfit von Behring. ConcanavalinA wurde von Pharmacia (Uppsala), Medac (Hamburg) und Boehringer (Mannheim) bezogen; hochgereinigte Glykoproteine von Behring, alle weiteren Reagentien von Merck (Darmstadt).

Alle im Test verwendeten L6sungen werden vor Gebrauch fiber ein Millipore Filter (0,45 gm Porengr613e) filtriert. Die

Isolierte Zellen 195

Analysen werden in 0,1 Mol/l Tris, 0,005 Mol/1 CaC12, 50 g/l Polyethylenglykol, pH 7,0 bei 25~ durchgeffihrt. Die In- kubationszeit betrfigt 4 h.

Der Grad der Komplexbildung zwischen den Reaktions- partnern wird in RLS (relative light scattering) gemessen, wobei vom Ergebnis jeweils der Reagentien- und Probenleer- wert subtrahiert werden mug.

E~ebnisse und Diskussion. Aus der Enzymologie ist bekannt, dab die Dissoziationskonstante eines Systems im sogen. Lineweaver Burk plot ermittelt werden kann. Dies haben wir auf das Lectin-Glykoprotein System tibertragen. Bei Reak- tion yon ConcanavalinA (Con A) - einem pflanzlichen Lectin - und Glykogen bildet sich bei konstanter Lectin- Konzentration (0,083gMol/1) und steigenden Glykogen- Konzentrationen ein makromolekularer Komplex. Aus dem Schnittpunkt der hieraus bei doppelt reziproker Auftragung resultierenden Gerade mit der Abscisse kann die Dissozia- tionskonstante zwischen den beiden Reaktionspartnern be- rechnet werden. Bei Zugabe von Methylmannosid wird dieser Komplex zwischen ConA und Glykogen aufgel6st: das Monosaccharid zeigt das typische Bild eines kompetitiven Inhibitors.

Bei Reaktion yon ConA mit einem Glykoprotein, z, B. Human-Apotransferrin, haben wir dagegen bei doppelt rezi- proker Auftragung entsprechend dem Lineweaver Burk plot nicht mehr eine Gerade sondern einen exponentiellen Kur- venverlauf, der durch Auftragung yon 1/S ~ linearisiert wer- den kann. Dies ist in der Enzymologie typisch ffir allosterische oder cooperative Bindungsmechanismen. Auch die Auftra- gung nach dem Hill plot unterstfitzt diese Vorstellung.

Verschiedene Glykoproteine werden von Con A in unter- schiedlichem AusmaB cooperativ gebunden und weitere Un- tersuchungen weisen darauf hin, dab die in ihrer funktionellen Bedeutung bisher ungeklS.rte Bindungsstelle ffir hydrophobe Reste ffir die Ausl6sung der allosterischen Bindung verant- wortlich ist. Gleichzeitig besteht nach diesen Untersuchungen je nach Grad der allosterischen Bindung zwischen Lectin und Glykokonjugat eine unterschiedliche Ca2+-Abh~ingigkeit. Dies unterstfitzt frfihere Untersuchungen , nach denen Ca 2 +- Ionen ftir die Konformation des Con A mitbestimmend sind [11.

Entsprechend wird die Lectin-Bindungsfiihigkeit nicht nur durch die Kohlenhydrat-Sequenz des Glykokonjugats festge- legt, sondern auch durch Konformationsfinderungen des Proteinanteils des Liganden mitbestimmt. Die Fe 3§ Anlagerung an Apotransferrin hat beispielsweise eine Ande- rung der Tertifirstruktur des Proteinanteils zur Folge. Werden die Con A-Bindungsstudien mit Transferrin wiederholt, das in steigenden Mengen mit Fe a + beladen ist, ver/indert sich die sigmoidale Bindungskurve in eine hyperbole Kurve, d.h. die Allosterie ist aufgehoben. Dies bedeutet, dab im niedrigen Konzentrationsbereich Fe 3 +-Transferrin sehr viel besser als Apotransferrin an Con A gebunden wird. Durch die Ein- oder Ausschaltung der cooperativen Bindung besitzen damit Lec- tine als Plasmamembran-gebundene Rezeptorproteine die besondere F~ihigkeit, zwischen dem biologisch wichtigen und ~>unbrauchbaren<< Status eines einzelnen Liganden zu unter- scheiden.

Im weiteren wird am Beispiel des Asialo-Apotransferrin demonstriert, dab die Desialylierung von Glykoproteinen,

Tabellel. Kohlenhydrat-spezifische Rezeptorproteine aus Vogel- und Sfiugetiergeweben (mammalian lectins). GlcNAc = N-Acetyl-Glucosamin; GalNAc = N-Acetylgalactos- amin; NANA = N-Acetylneuramins~iure. (Literatur-Nach- weis in [3])

Zelltyp Bevorzugte Zucker- spezifitfit

Hepatocyt Kaninchen) Hepatocyt (Maus) Hepatocyt (Vogel)

Sinusoidal-Epithelien, Leber (Ratte)

Kupffer-Zellen (Ratte) Alveolar-Macrophagen (Ratte)

Thymus-Lymphocyten (Maus) Milz-Lymphocyten (Maus) Gehirn (Ratte) Herzmuskel (Kalb) Niere, glomeruI. Basalmembran (Mensch)

Thrombocyten (Mensch) Costal-Knorpel (Maus)

Galaktose Fucose GlcNAc, Man- n o s e

GlcNAc, Man- n o s e

GalNAc Mannose, Glc- NAc, Glucose Lactose Mannose Galaktosamin Gal ~ GIcNAc GlcNAc, GalNAc, NANA Mannosamin Glucosamin

wie sie beispielsweise ffir bestimmte Lebererkrankungen typisch ist, ebenfalls zu einer Reduktion des allosterischen Bindungsverhaltens gegenfiber Con A ffihrt. Gleichzeitig ist ConA gegenfiber diesem Asialo-Transferrin nur noch sehr begrenzt in der Lage, zwischen Fe3+-freiem und Fe 3+- beladenem Status zu unterscheiden.

Auch auf S~iugetierzellen sind Lectine fiir die intercellulfire Kommunikation und die Wechselwirkung mit im Plasma zirkulierenden Glykoproteinen mitverantwortlich (Obersicht in [3]). Gleichzeitig k6nnen verschiedene Erkrankungen als Ergebnis einer St6rung dieses Kommunikationssystems inter- pretiert werden. Diese sogen. >>mammalian lectins<< ({3ber- sicht fiber die bisher bekannten Formen in Tabelle 1) k6nnen ebenfalls mit der hier beschriebenen Methodik charakterisiert werden, wodurch dieses Verfahren dank der Sensibilit~it und Spezifit~it ffir Fragen der Pathobiochemie kohlenhydratspezi- fischer Erkennungsprozesse wesentliche Bedeutung erlangen kann.

Literatur

l. Koenig, S. H., Brewer, F., Brown, R. D. : Biochemistry 17, 425l (1978)

2. K6ttgen, E., Bauer, Ch., Gerok, W. : Anal. Biochem. 96, 391 (1979)

3. K6ttgen, E., Bauer, Ch., Reutter, W., Gerok, W. : Klin. Wschr. 57, 151, 191 (1979)

4. Lis, H., Sharon, N.: In: The antigens, Vol. 4 (Ed.: M. Sela), New York: Acad. Press 1977