Thrombingenerierung und … · 2.1 Das Zellbasierte Gerinnungsmodel: ... weiteren für die Gerinnung nötigen Faktoren ab. Es wird also kontinuierlich eine kleine Menge Thrombin generiert

Thrombingenerierung und

Rotationsthromboelastometrie bei

gesunden Erwachsenen

Publikationspromotion

zur Erlangung des akademischen Grades

Dr. med.

an der Medizinischen Fakultät

der Universität Leipzig

eingereicht von: Tobias Schneider

geb. 06.05.1981 in Ahlen Westf.

Angefertigt an: Universitätsklinikum Leipzig AöR

Department für Innere Medizin, Neurologie & Dermatologie

Interdisziplinäre Internistische Intensivmedizin und

Zentrum für Hämostaseologie

Leiter: PD Dr. med. Sirak Petros

Betreuer: PD Dr. med. Sirak Petros

Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom:

___________________________________________ 21.06.2016

Dissertationsschrift Tobias Schneider

1

Inhaltsverzeichnis:

Liste der Abkürzungen: .......................................................................................................... 3

Bibliographische Beschreibung: ............................................................................................ 5

1. Einleitung .......................................................................................................................... 6

1.1 Ausgangslage: ........................................................................................................ 6

2. Biochemische, physiologische und verfahrenstechnische Grundlagen: ............................ 9

2.1 Das Zellbasierte Gerinnungsmodel: ............................................................................. 9

2.2 Die Rolle des Thrombin im Rahmen der Thrombozytenaktiverung/ -vernetzung .........10

2.3 Gegenregulation des prokoagulatorischen Systems ...................................................11

2.4 Grundlagen und Funktionsweisen der verwendeten Gerinnungsanalysen ..................12

Trombingenerierungsassays und deren Entwicklung .....................................................12

Calibrated Automated Thrombography (CAT) ...............................................................12

Parameter der CAT- Analyse.........................................................................................13

Plasmapräparation für PPP und PRP-Ansätze .......................................................14

Einflussfaktoren auf die Thrombingenerierung durch unterschiedliche

experimentelle Ansätze ..........................................................................................15

Weitere Einflussfaktoren auf die Thrombingenerierung ..........................................16

Einsatz von CAT in der Forschung und in der klinischen Routine ...........................16

Die Rotationsthromboelastometrie (ROTEM): ...............................................................16

Messprinzip: ...........................................................................................................16

Parameter der ROTEM Analyse: ............................................................................17

Limitationen ............................................................................................................19

Einsatz von ROTEM in Forschung und in der klinischen Routine ...........................19

3. Ableitung der Rationale für diese Studie ...........................................................................20

4. Publikation: Thrombin generation and Rotational Thromboelastometry in the healthy

adult population ....................................................................................................................21

5. Zusammenfassung der Arbeit: ..........................................................................................28

Ergebnisse: .......................................................................................................................29

Diskussion, Schlussfolgerungen und Ausblick ..................................................................30

6. Literaturverzeichnis ..........................................................................................................32

7. Quellenverzeichnis Abbildungen: ......................................................................................39

8. Supplementäre Materialien ...............................................................................................40

Darstellung der Parameter der Thrombingenerierung stratifiziert nach Altersgruppen: ......40

Fragebogen zur Ermittlung Studien Ein-/Ausschluss: ........................................................42

9. Anhang: ............................................................................................................................44

Erklärung über die Eigenständige Abfassung der Arbeit: ..................................................44

Lebenslauf ........................................................................................................................45

Danksagung:.....................................................................................................................47


2


3

Liste der Abkürzungen:

α Alpha Winkel

α2M Alpha 2 Makroglobulin

ADP Adenosindiphosphat

APC aktiviertes Protein C

aPTT aktivierte partielle Thromboplastinzeit

AT Antithrombin

CaCl2 Calciumchlorid

CAT Calibrated Automated Thrombogram

CFT Clot formation time

CT Clotting time

CTI Corn trypsin inhibitor

ETP endogens Thrombinpotential

FII Faktor II (Prothrombin)

FIIa Faktor IIa (Thrombin)

FVII Faktor VII

FVIII Faktor VIII

FIX Faktor IX

FX Faktor X

FXI Faktor XI

FXII Faktor XII

FXIII Faktor XIII

GP-Rezeptor Glycoprotein Rezeptor

MCF Maximum clot firmness


4

ML Maximum lysis

Min Minute

nM nanomolar

PAI Plasminogen activator inhibitor

PDGF Platelet derived growth factor

pM picomolar

PPP plättchenarmes Plasma

PRP plättchenreiches Plasma

PT Prothrombinzeit

ROTEG Rotationsthrombelastographie

ROTEM Rotationathrombelastometrie

TAFI Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor

TF Tissue Factor

TFPI Tissue Factor Pathway Inhibitor

TEM Thromboelastometrie

TM Thrombomodulin

t-PA Gewebsplasminogen Aktivator

TTM-Komplex Thrombin-Thrombomodulin Komplex

TXA2 Thromboxan A2

vWF von Willebrand Faktor


5

Bibliographische Beschreibung:

Thrombingenerierung und Rotationsthromboelastometrie bei gesunden Erwachsenen

Universität Leipzig, Dissertation

47 Seiten, 62 Literaturangaben, 1 Publikation, 5 Abbildungen, 3 suppl. Materialien

Referat:

Die vorliegende Arbeit untersucht in einer Population von 132 gesunden Probanden

die Hämostase mittels Calibrated Automated Thrombogram (CAT) und

Rotationsthromboelastometrie (ROTEM). CAT wurde im plätchenarmen Plasma mit

einer tissue factor (TF) von 1 und 5 pM durchgeführt. Lag time, Thrombin peak, Time

to thrombin peak und das endogene Thrombin Potential (ETP) wurden ermittelt.

ROTEM wurde ohne Aktivator durchgeführt (NATEM) und die Daten für

Gerinnungszeit (clotting time, CT), Gerinnselbildungszeit, Alpha Winkel und

maximale Gerinnselfestigkeit (MCF) mit den Daten der Thrombingenerierung

korreliert. Es zeigte sich eine positive aber nicht lineare Korrelation bezüglich Alter

versus lag time und time to peak, sowie eine annähernd lineare Korrelation bezüglich

Alter versus thrombin peak und ETP. Für ROTEM konnte eine positive Korrelation

bezüglich Alter versus MCF und Alpha Winkel, aber eine negative Korrelation

bezüglich Alter versus CT dargestellt werden. In der Gegenüberstellung beider

Assays korrelierten Thrombin peak und ETP (aktiviert mit einer TF Konzentration von

5 pM) signifikant mit dem Alpha Winkel und der MCF. Alle signifikanten Korrelationen

zeigten lediglich eine moderate Regressionssteigung.


6

1. Einleitung

1.1 Ausgangslage:

Die in der klinischen Routine etablierten Tests zur Beurteilung der globalen

Hämostase sind Prothrombinzeit (PT) und die aktivierte partielle Thromboplastinzeit

(aPTT). Zudem ist die Bestimmung der Aktivität von an der Hämostase beteiligten

Einzelfaktoren möglich. Diese Messungen bilden das Modell der „klassischen“

Gerinnungskaskade ab (Abbildung 1).

Abbildung 1: Klasssische Gerinnungskaskade der plasmatischen Gerinnung. Rot

eingefärbt: Durch aPTT erfasste Faktoren. Blau eingefärbt: durch PT erfasste

Faktoren. Violett eingefärbt: überlappend durch aPTT und PT erfasste Faktoren

Abbildung 1: Klasssische Gerinnungskaskade der plasmatischen Gerinnung. Rot eingefärbt: Durch aPTT erfasste Faktoren; blau eingefärbt durch Thromboplastinzeit erfasste Faktoren.


7

Abbildung 2: Phasen der Thrombingenerierung, die von den Testmethoden,

aktivierte partielle Thromboplastin Zeit (aPTT), Prothrombinzeit (PT) und

Thrombelastometrie erfasst werden.

Das „klassische“ Gerinnungsmodell kann die in vivo ablaufenden Prozesse während

der Blutstillung allerdings nur unzureichend wiedergeben. So bilden die PT und aPTT

jeweils nur Teile der Initiationsphase der Gerinnung ab (Abbildung 2).

Die globalen Gerinnungstests beschreiben das Blutungsrisiko nur unzureichend (1,

2). Zudem sind sie zum Management der Hämostase nicht ausreichend geeignet (3,

4). Durch das komplexe Zusammenspiel der einzelnen Systeme der Hämostase wird

die Verwertbarkeit der gemessenen Einzelfaktoren oder Proteine schwierig. So

zeigen Patienten mit dem gleichen Faktorenmangel unterschiedlich starke

Blutungstendenzen und Patienten mit Faktor V-Leiden Mutation unterschiedliche

Risiken für thrombotische Komplikationen (5).

Eine zielgerichtete Anamnese ist den “Standard“ Gerinnungstests in der Identifikation


8

von Gerinnungsstörungen überlegen (6).

Die klassische Blutgerinnungskaskade wurde als Modell für die ablaufenden

Prozesse der Hämostase durch das Zellbasierte Gerinnungsmodel verdrängt (7).

Dieses berücksichtigt die hämostatischen Prozesse auf unterschiedlichen

Zelloberflächen, um so das gesamte System besser abbilden zu können.

Das Ziel neuerer Assays zur Beurteilung der Hämostase sollte daher sein, die

physiologischen Abläufe besser abzubilden, die mit dem klinischen Phänotyp des

Patienten möglichst eng korrelieren (Abbildung 2 und 3).

Abbildung 3: Das zellbasierte Gerinnungsmodel nach Hoffman


9

2. Biochemische, physiologische und verfahrenstechnische Grundlagen:

2.1 Das Zellbasierte Gerinnungsmodel: Im Zellbasierten Gerinnungsmodel wird zwischen drei Phasen unterschieden:

Initiation – Amplifikation – Propagation

1. Initiation

Über einen Gewebsdefekt kommt es zum Kontakt zwischen TF- exprimierendem

Subendothel und dem in geringer Menge im Blutstrom zirkulierenden aktivierten

Faktor VII (FVIIa). Durch diesen Komplex (TF-FVIIa) werden anschließend die

Faktoren IX (FIX) und X (FX) aktiviert (FIXa; FXa). Calcium-abhängig bildet FXa

zusammen mit FVa und Phospholipiden den Prothrombinase-Komplex auf der

TF- exprimierenden Zelle. Dieser überführt Prothrombin (FII) in Thrombin (FIIa).

Die Thrombingenerierung bleibt während der Initiation weitestgehend auf die TF-

exprimierende Zelle beschränkt, da im Plasma FXa umgehend durch Tissue

Factor Pathway Inhibitor (TFPI) und Antithromin (AT) deaktiviert wird. Die Phase

der Initiierung läuft im gesunden Individuum durchgehend aber getrennt von den

weiteren für die Gerinnung nötigen Faktoren ab. Es wird also kontinuierlich eine

kleine Menge Thrombin generiert.

2. Amplifikation

Dem während der Initiation an der Läsionsstelle generierten Thrombin kommt

während der Amplifikation eine zentrale Rolle zu: Es bedingt die Lösung des von

Willlebrand Faktor (vWF)-Faktor-VIII(FVIII)-Komplexes sowie die anschließende

Aktivierung des FVIII. Zudem wird eine Konformationsänderung und Aktivierung

von Thrombozyten bewirkt. Faktor XI (FXI) und der von den aktivierten

Thrombozyten freigesetzte Faktor V (FV) werden ebenfalls durch Thrombin

aktiviert.

3. Propagation

Während der Propagation bilden FVIIIa und FIXa auf der Oberfläche aktivierter

Thrombozyten die intrinsische Tenase (FVIIIa-FIXa-Komplex). Der benötigte FIXa


10

wird auf der Oberfläche der TF-exprimierenden Zelle gebildet. Von dieser kann er

zum aktivierten Thrombozyten diffundieren. Er wird durch TFPI gar nicht und

durch AT dabei nur gering inhibiert. FIXa wird zum großen Teil durch FXIa auf der

Oberfläche aktivierter Thrombozyten gebildet. Durch die intrinsische Tenase wird

wiederum FX aktiviert. Anschließend kommt es durch den Prothrombinase-

Komplex zur Aktivierung großer Mengen Prothrombin zu Thrombin („ Thrombin

burst“). Das Thrombin katalysiert nun die Aufspaltung von Fibrinogen zu Fibrin

und ermöglicht somit die Fibrinpolymerisation (8).

Zusätzlich wird der Faktor XIII (FXIII) durch das Thrombin aktiviert. Dies geschieht

durch eine hydrolytische Abspaltung vom N-terminalen Ende der A-Untereinheit.

Unter Anwesenheit von Ca2+ erfolgt die Abspaltung der B- Untereinheit mit

anschließender Bindung an die αC Region des Fibrinmoleküls. Als

Transglutaminase bewirkt der FXIIIa so die Quervernetzung des Fibrins und

stabilisiert das Gerinnsel (9).

2.2 Die Rolle des Thrombin im Rahmen der Thrombozytenaktiverung/

-vernetzung

Die durch die Endothelverletzung freigelegten Kollagenfibrillen werden durch den

vWF markiert. So wird eine Bindung zwischen dem Endothel und Glycoprotein Ib-

Rezeptor (GPIb) der Thrombozyten vermittelt. Die Aktivierung der Thrombozyten

geschieht ebenfalls durch Thrombin über Protease aktivierende Rezeptoren.

Durch Degranulation der α-Granula kommt es anschließend zur Ausschüttung

der Gerinnungsfaktoren FVIII, FV, Fibrinogen sowie von Fibronectin und dem

Platelet-derived growth factor (PDGF). Aus den δ-Granula werden zudem ADP,

Thromboxan-A2 sowie Calcium und Serotonin freigesetzt. Die Bindung von ADP

und TXA2 an thrombozytären Rezeptoren führt im Rahmen eines positiven

feedback Loops zu einer weiteren Aktivierungsverstärkung mit

Konformationsänderung des membranständigen Fibrinogen-Rezeptors (αII ß3).

Die nun hohe Affinität für Fibrin stellt die Basis für die spätere Aggregation der

Thrombozyten dar. Außerdem führt sie zu einer Orientierungsänderung der

Thrombozytenmembran („Flip-Flop-Mechanismus“). An die dadurch nach außen


11

gerichteten negativ geladenen Phospholipide lagern sich Calcium-abhängig

Gerinnungsfaktoren an. Dies bildet die Grundlage für den auf der

Thrombozytenoberfläche stattfindenden Thrombin burst (10, 11).

2.3 Gegenregulation des prokoagulatorischen Systems

Das Antithrombin -Heparan System

Das AT hemmt nach der Aktivierung durch Heparansulfate (Proteoglycane) an

der Endotheloberfläche die Aktivität der Faktoren IIa, Xa, IXa, XIa, XIIa. Durch

Bindung von AT an Heparan wird eine Konformationsänderung induziert und die

Aktivität z.B. gegen Thrombin um das 750-Fache gesteigert (10, 12).

Das Protein C - Thrombomodulin-System

Trombomodulin ist ein Thrombin-bindendes Protein, welches an der Oberfläche

von Endothelzellen lokalisiert ist. Durch die Bindung an Thrombomodulin wird das

Thrombin vom prokoagulanten zum antikoagulanten Eiweiß umgewandelt. Weiter

wird über den Thrombin-Thrombomodulin Komplex (TTM-Komplex) der Thrombin

activatable fibrinolysis inhibior (TAFI) aktiviert. Dieser verhindert die Auflösung

des bereits gebildeten Gerinnsels. Der TTM-Komplex aktiviert zudem die

Serinprotease Protein C (Prot.C), welche die Gerinnungsfaktoren FVa und FVIIIa

inaktiviert. Zudem hemmt Prot. C den Plasminogen-Aktivator- Inhibitor (PAI), was

die Firbinolyse begünstigt (10, 12).

Fibrinolyse

Die Fibrinolyse beschreibt den Abbau des gebildeten Gerinnsels.

Gewebsplasminogenaktivator (t-PA) ist an Endothelzellen gebunden und wird

durch Thrombin freigesetzt. Aufgrund seiner hohen Affinität zu Fibrin wird t-PA

selektiv dort aus dem Endothel freigesetzt, wo sich Thromben gebildet haben. In

Anwesenheit von Fibrin binden t-PA und Plasminogen an den Thrombus. Durch


12

die Komplexbildung kommt es zur Plasminogenaktivierung und damit zur

Fibrinolyse (10, 11).

2.4 Grundlagen und Funktionsweisen der verwendeten

Gerinnungsanalysen

Trombingenerierungsassays und deren Entwicklung

Methoden zur Bestimmung der Thrombingenerierung messen die Fähigkeit einer

Plasmaprobe, nach in vitro Aktivierung, Thrombin zu generieren. Die

Thrombingenerierungskurve reflektiert und integriert alle pro- und

antikoagulatorischen Reaktionen, welche die Thrombinformation und Hemmung

regulieren.

Da Thrombin das zentrale Enzym des Koagulationsprozesses darstellt, haben

Analysen der Thrombingenerierung grundsätzlich das Potential, die plasmatische

Gerinnung zu charakterisieren.

Der erste Thrombingenerierungstest wurde 1935 durch Harry Eagle beschrieben (13)

und durch Macfarlane und Biggs 1953 weiterentwickelt. Hier wurde die Fähigkeit der

Gerinnselbildung aus Fibrinogen in Teilproben einer zuvor aktivierten Plasmaprobe

untersucht. Daraus wurde dann die Thrombingenerierung abgeleitet (14). Dies war

zum einen eine aufwendige, zum anderen sehr ungenaue Methode.

Calibrated Automated Thrombography (CAT)

Die von Hemker et. al. entwickelte Methode arbeitet mit einem fluorogenen Substrat

(Z-Gly-Gly-Arg-AMC) mit niedriger Affinität zu Thrombin. Der Test wird auf einer

Microtiterplatte durchgeführt und die Floureszenzwerte werden von einer speziellen

Software direkt in Thrombingenerierungskurven konvertiert (15, 16). Um die

Koagulation zu starten, werden der Plasmaprobe TF und synthetische Phospholipide

sowie das fluorogene Substrat mit CaCl2 gemischt zugesetzt. Im Gegensatz zu

chromogenen Methoden stört die bei der Gerinnselbildung entstehende Trübung im

Plasma das Floureszenzsignal nicht. Die Untersuchung kann daher in nicht


13

defibriniertem, plättchenarmem oder plättchenreichem Plasma durchgeführt werden

(17). Zur Korrektur “innerer“ Filtereffekte (z.B.: Auslöschung des Floureszenzsignals

durch bereits umgesetzte Substratmoleküle; Ausgleich der individuell

unterschiedlichen Plasmafärbung) muss immer eine adäquate Kalibrierung erfolgen.

Jeder CAT-Test benötigt demnach zwei Floureszenz- Messungen der gleichen

Plasmaprobe. Der zur Kalibrierung benutzten Plasmaprobe wird dabei ein

Thrombinkalibrator zugesetzt, ohne die Gerinnung zu aktivieren. Der Kalibrator

besteht aus einer bekannten Menge Thrombin, gebunden an α2-Makroglobulin (α2M-

Thrombin). In dieser Form kann Thrombin nicht durch Plasma Protease-Inhibitoren

inhibiert werden. Im Kalibrationsansatz wird das Substrat konstant vom Thrombin

umgewandelt. Der Anstieg der Kurve liefert somit den Kalibrationsfaktor, welcher für

die Umrechnung von Flouroszenzeinheiten in die Thrombinkonzentration notwendig

ist (18).

Aufgrund innerer Filtereffekte und zunehmendem Substratverbrauch weicht das

Flouroszenzsignal zunehmend von einem linearen Verlauf ab. Die Abweichung von

der linearen Kurve im Kalibrationsansatz wird durch die Software erfasst und im

Messansatz dementsprechend korrigiert. Das durch α2M-Thrombin generierte

Flouroszenzsignal wird mithilfe eines mathematischen Algorithmus herausgerechnet

(16).

Die Thrombingenerierungskurve erhält man durch die 1. Ableitung des korrigiert

aufgezeichneten Floureszenzsignals (Abb. 4).

Parameter der CAT- Analyse

Lag Time (min): definiert als Zeit vom Start der Reaktion bis 1/6 der Peak Thrombin

Konzentration erreicht ist.

Time to Peak (min): Zeit vom Start der Reaktion bis zum Zeitpunkt der maximalen

Thrombingenerierung.

Thrombin Peak (nM): Maximale Thrombinkonzentration


14

Endogenes Thrombin Potential (nM·min): Fläche unterhalb der Kurve. Es

repräsentiert die gesamte vom Thrombin geleistete enzymatische Arbeit, von seiner

Aktivierung bis zur kompletten Deaktivierung.

Grundsätzlich zeigen eine verlängerte lag Time sowie ein erniedrigter Thrombin Peak

und ETP einen hypokoagualtorischen Status an. Im Gegensatz dazu repräsentieren

verkürzte Lag time sowie hoher Peak und ETP einen hyperkoagulatorischen Status.

Plasmapräparation für PPP und PRP-Ansätze

PPP wird durch Zentrifugation einer Vollblutprobe hergestellt. Dabei ist das

zweimalige Zentrifugieren von entscheidender Bedeutung, da nach nur einmaliger

Zentrifugierung Plättchen und Mikropartikel zurückbleiben und die

Thrombingenerierung beeinflussen (19). Bei der Herstellung von PRP muss zur

Vergleichbarkeit die Plättchenzahl justiert werden. In der Praxis wird das PRP auf

100x103 bzw. 150x103 Plättchen pro µl eingestellt (20–22). Dies wird durch die

Abbildung 4: Typische Thrombin Generierungskurve einer Messung mit Flouroskan

Ascent


15

Zugabe von autologem, Hitze-inaktiviertem PPP, welches somit ohne Aktivität von

Gerinnungsfaktoren ist, erreicht.

Einflussfaktoren auf die Thrombingenerierung durch unterschiedliche

experimentelle Ansätze

TF-Konzentration

Die Menge des zur Aktivierung zugesetzten TF bedingt z.B. den Anteil der

intrinsischen Kaskade an der Thrombingenerierung. Je niedriger die TF

Konzentration gewählt wird, desto höher ist der Einfluss der Kontaktaktivierung (5).

Die Zugabe von Corn Trypsin Inhibitor (CTI) als Inhibitor des FXIIa sollte daher die

Kontaktaktivierung inhibieren. Es konnte allerdings gezeigt werden, dass dies für TF

Konzentrationen >1pM nicht notwendig ist (23).

Des Weiteren ändern sich durch die Konzentration des TF die Determinanten der

Thrombingenerierung. So sind bei einer niedrigen TF Konzentration (1 pM) die

stärksten Determinanten des ETP Fibrinogen und der TFPI. Bei hoher Konzentration

(13 pM) sind dies jedoch Prothrombin und AT (24).

Ab TF-Konzentrationen von 10 pM kann durch eine weitere Erhöhung keine

Zunahme des ETP erreicht werden. Auch eine Differenzierung zwischen Hämophilie-

Patienten und gesunden Kontrollen ist hier nicht mehr sicher möglich (25, 26). In

Studien konnte bei TF-Konzentrationen von 5 pM eine gute Sensitivität in der

Unterscheidung zwischen Blutern und Gesunden gezeigt werden. In anderen

Untersuchungen zeigten niedrige TF-Konzentrationen unter Zusatz von

Thrombomodulin die beste Differenzierung zwischen gesunden Probanden und

Patienten nach einer Thrombose (27).

Thrombomodulin (TM) und aktiviertes Protein C

TM oder aktiviertes Protein C (APC) können dem Ansatz hinzugefügt werden, um die

Sensitivität des Verfahrens gegenüber dem physiologischen antikoagualtorischen

Protein C-System zu erhöhen. Dies ist besonders bei Zuständen mit gestörter


16

physiologischer Antikoagulation, wie Sepsis, Leberinsuffizienz oder Thrombophilie

nützlich (28, 29).

Weitere Einflussfaktoren auf die Thrombingenerierung

Die Thrombingenerierung, gemessen mittels CAT, kann auch durch biologische

Variablen wie Alter (30, 31), Geschlecht (24), körperliche Konstitution (32),

genetische Faktoren (33, 34) sowie erworbene Faktoren (Schwangerschaft, orale

Antikonzeptiva) (35, 36) beeinflusst werden.

Einsatz von CAT in der Forschung und in der klinischen Routine

CAT wurde und wird in einer Reihe von Fragestellungen eingesetzt. So wurde es

beispielsweise zur Charakterisierung der Hämostase nach einer tiefen

Venenthrombose angewandt (27). Es wurde außerdem zur Detektion von

Faktorenmangel (16) und Hyperkoagulabilität (25) eingesetzt.

Thrombingenerierungsassays spielen zunehmend eine Rolle in der Diagnose,

Verlaufsbeobachtung und im Management von Hämophilie-Patienten (37). Sie

unterstützen zudem bei der Erklärung verschiedener Blutungsphänotypen bei

Hämophilie A (38). Weiter konnte gezeigt werden, dass CAT im perioperativen

Management von Patienten mit Blutungsdiathesen sowohl für das Monitoring sowie

für die Überwachung von Effekten von Blutprodukten geeignet sein kann (39).

Die Rotationsthromboelastometrie (ROTEM):

Die Grundlagen der Rotationsthromboelastometrie wurden bereits 1948 durch Hartert

gelegt (40). In den 90er Jahren wurde das System weiterentwickelt und schließlich

unter dem Namen ROTEM patentiert.

Messprinzip:

Die zu analysierende Probe (Plasma oder Vollblut) und das jeweilige Startreagenz

werden in eine vorgewärmte Küvette (37°C) pipettiert. Dann wird ein zylindrischer

Stempel in die Küvette eingetaucht. Es verbleibt ein Spalt von 1 mm zwischen


17

Stempel und Küvette. Dieser wird durch die Probe oder das sich bildende Gerinnsel

überbrückt. Mittels einer Feder wird der Stempel abwechselnd nach rechts und links

gedreht (4,75°). Bei flüssigem Blut ist diese Bewegung ungehindert. Sobald das Blut

gerinnt, hemmt das Gerinnsel die Drehung des Stempels. Somit ist die Drehung des

Stempels umgekehrt proportional zur Gerinnselfestigkeit. Eine Lichtquelle nimmt die

Änderung der Stempelauslenkung auf und über einen an das Messsystem

angeschlossenen Computer wird das Signal digital umgewandelt. Mit Hilfe einer

entsprechenden Software wird das digitale Signal dann graphisch umgesetzt. Eine

Heizung hält die Temperatur während der Messung konstant bei 37°C (Abb. 5).

Parameter der ROTEM Analyse:

Cloting time (CT= Gerinnungszeit): Zeit vom Beginn der Messung bis die

Gerinnung einsetzt-> Gerinnungsaktivierung, Thrombinbildung, Beginn der

Gerinnselpolymerisation.

A

A

B

B

Abbildung 5: A: Prinzip der ROTEM Messung B: typische Kurve einer ROTEM

Analyse mit abgeleiteten Parametern


18

Clot formation time (CFT = Gerinnselbildungszeit): Zeit ab dem Beginn der

Gerinnung bis eine Gerinnselfestigkeit von 20 mm erreicht ist. ->

Fibrinpolymerisation, Verfestigung des Gerinnsels durch Thrombozyten und FXIII.

Maximum clot firmness (MCF = Gerinnselfestigkeit): Maximale mechanische

Ausprägung des Gerinnsels -> Zunehmende Verfestigung des Gerinnsels durch

polymerisiertes Fibrin, Thrombozyten sowie durch FXIII.

Alpha angle (α): ergibt sich durch den Winkel zwischen Mittellinie und einer

Tangente an die ROTEM Kurve durch den 2 mm Amplituden Punkt. -> Beschreibt die

Kinetik der Gerinnselbildung, reflekitert die Phase der Thrombingenerierung.

Maxiumum lysis (ML = Maximale Lyse): Ausprägung der Gerinnsellyse in % vom

MCF

Unterschiedliche Testansätze der ROTEM Analyse

NATEM (Not acitvated-TEM): Zur Messung erfolgt lediglich die Recalcifizierung von

Citratblut oder Plasma. Der Aktivator ist der Kontakt der Probe mit der Küvette oder

dem Stempel. Die Probe bleibt damit gegenüber nahezu allen

Gleichgewichtsänderungen des Gerinnungssystems sensitiv. Da die Gerinnung über

Kontakt aktiviert wird ist sie etwa 10x zeitaufwendiger als z.B. die EXTEM Analyse.

EXTEM (Extrinsische Gerinnungskaskade- TEM): Die Gerinnung wird mittels TF

aktiviert. Dies führt innerhalb 70 sec. zum Beginn der Gerinnselbildung. Somit kann

innerhalb von 10 Minuten die Gerinnselbildung beurteilt werden. Erfasst werden FVII,

FX, FV, FII, FI, Thrombozyten, Fibrinolyse.

INTEM (Intrinsische Gerinnungskaskade- TEM): Die Gerinnung wird über die

Kontaktphase aktiviert. (wie aPTT und CT). Das INTEM ist damit empfindlich auf

Faktorenmängel, die dem Intrinsischen System zugeordnet werden. Zudem ist der

Testansatz sensibel auf die Heparin-Wirkung. Erfasst werden FXII, FXI, FIX, FVIII,

FX, FV, FII, FI, Thrombozyten, Fibrinolyse.


19

FIBTEM: Die Aktivierung ist gleich der im EXTEM. Durch die Zugabe von

Cytochalasin D werden Thrombozyten blockiert. Das entstehende Gerinnsel ist nur

von der Fibrinbildung und Polymerisation abhängig.

APTEM: Aktivierung wie EXTEM. Durch Zugabe von Aprotinin werden fibrinolytische

Prozesse in vitro gehemmt. Ein Vergleich zum EXTEM erlaubt eine schnellere

Detektion der Fibrinolyse.

HEPTEM: Aktivierung wie INTEM. Durch Heparinase wird in der Probe vorhandenes

Heparin abgebaut und somit die ROTEM Analyse bei voll heparinisierten Patienten

ermöglicht. (41, 42)

Limitationen

Das ROTEM wird standardmäßig bei 37°C durchgeführt. Gerinnungsstörungen, die

durch Hypothermie entstehen, können daher nicht optimal erfasst werden.

Thrombozytenhemmende Medikamente werden zudem nur in supratherapeutischen

Dosen erfasst, da durch die Zugabe von Thrombin die plätchenhemmende Wirkung

überlagert wird (43). Eine ROTEM-Analyse kann, trotz vorhandener Antikoagulation

mit Vitamin K Antagonisten, oder niedermolekularen Heparinen, eine normwertige

Kurve annehmen. Zudem wird ein Mangel an vWF nicht erfasst. Für diese

Fragestellungen sind zusätzliche Tests notwendig (41).

Einsatz von ROTEM in Forschung und in der klinischen Routine

ROTEM wird bei chirurgischen Eingriffen mit zu erwartendem hohen Blutverlust oder

Gerinnungsproblemen sowie notwendiger Antikoagulation unterschiedlich eingesetzt

(43). Einige Autoren berichten über ein effektives Management von Blutprodukten (3,

44) und damit verbunden ein effektives Kostenmanagement (45, 46). Weiter wird

durch einige Arbeitsgruppen versucht, ROTEM im Management von Hämophilie-

Patienten zu implementieren (47). Als präoperativer Screening-Test findet bisher

keine routinemäßige Anwendung statt.


20

3. Ableitung der Rationale für diese Studie

CAT ist ein Thrombingenerierungsassay, der das koagulatorische Potential einer

Person abbildet. Viele Arbeiten haben gezeigt, dass dieses Verfahren zur

Beurteilung von Blutungsdiathesen (26, 37, 48–50), thrombophilen Zuständen (27,

51) und zum Monitoring einer Antikoagulation (52, 53) geeignet sein kann. Eine

breite Indikation zur klinischen Anwendung erfolgte bisher jedoch noch nicht.

Die Rotationsthromboelastometrie beurteilt das koagulatorische Potential im Vollblut.

Bisher findet diese Methode vor allem in der Kardiochirurgie, Traumatologie und

Lebertransplantation ihren Einsatz. Hier konnte bereits gezeigt werden, dass durch

den Einsatz von ROTEM Blutprodukte gezielt eingesetzt werden können und so zu

einem effektiveren Gerinnungsmanagement führen (44).

Bis zum jetzigen Zeitpunkt gibt es in der Literatur keine Gegenüberstellung der

beiden oben beschriebenen Testverfahren und somit keine Information, ob ein

kombinierter Einsatz einen zusätzlichen Erkenntnisgewinn in der Beurteilung des

koagulatorischen Potentials eines Patienten liefern könnte.

Zudem liegen bis zum Zeitpunkt der Veröffentlichung kaum Daten über die

altersabhängige Entwicklung der Thrombingenerierung gemessen via CAT in

höheren Altersgruppen >65 Jahren vor. Eine Studie untersuchte vornehmlich Kinder

und junge Erwachsene (30), eine zweite untersuchte nur eine sehr kleine Zahl

gesunder erwachsener Probanden (31). Die ältere Population ist aber gerade im

klinischen Alltag die wohl am größten wachsende Patientengruppe in den

Industrienationen. Anders als bei CAT konnten für ROTEM im Rahmen einer

multizentrische Studie Referenzwerte für die in der Klinik häufig angewendeten

Testansätze (EXTEM, INTEM, APTEM, FIBTEM) festgelegt werden (54). Für den

verwendeten NATEM Ansatz liegt zum Zeitpunkt der Veröffentlichung keine Analyse

an gesunden Probanden vor. In der Literatur finden sich nur wenige, kleine,

bezüglich Alter und Geschlecht nicht homogen verteilte Patientenkollektive (55). Da

der nicht aktivierte Testansatz (NATEM) gegenüber möglichst vielen

Gleichgewichtsstörungen des Gerinnungssystems sensitiv bleibt (42), sind

Normalwerte auch für diesen Ansatz von klinischen und akademischen Interesse.

.


21

Die vorliegende Arbeit ist Teil eines Projektes, in dem beide oben genannte

Testverfahren auf ihre Aussagekraft bezüglich präoperativer

Gerinnungscharakterisierung bei elektiven chirurgischen Eingriffen untersucht

werden sollen. In dieser Arbeit werden CAT und ROTEM auf ggf. gegebene

Zusammenhänge an gesunden Erwachsenen mit einer breiter Altersverteilung

untersucht, um eine erste Aussage über die Güte anschließender Vergleiche dieser

globalen Tests in Bezug auf den Gerinnungsstatus des Einzelnen zu erhalten.

4. Publikation: Thrombin generation and Rotational Thromboelastometry in the

healthy adult population


22


23


24


25


26


27


28

5. Zusammenfassung der Arbeit:

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades

Dr. med.

Thrombingenerierung und Rotationsthromboelastometrie bei gesunden

Erwachsenen

Eingereicht von:

Tobias Schneider 06.05.1981 Ahlen Westf.

Angefertigt in der Abteilung für Interdisziplinäre Internistische Intensivmedizin und

Zentrum für Hämostaseologie des Universitätsklinikum Leipzig AöR

Betreut von:

PD Dr. med. Sirak Petros (Leiter Interdisziplinäre Internistische Intensivmedizin und

Zentrum für Hämostaseologie, Universitätsklinikum Leipzig)

Die beiden in der Studie untersuchten Verfahren CAT und ROTEM bieten durch die

Abbildung der Gerinnungsphasen Initiation, Amplifikation und Propagation ein

umfassendes Bild der Gerinnung. Die Tests im Einzelnen oder deren Kombination

könnten daher in der Ermittlung des koagulatorischen Phänotypen eines Patienten

ihren Beitrag leisten. Es gibt bisher allerdings nur wenige Studien zur Korrelation

zwischen den Parametern der Thrombingenerierung und der Thrombelastometrie am

Gesunden. Zudem wurde die Thrombingenerierung bisher nur in kleinen Gruppen


29

untersucht, wobei gesunde ältere Probanden meist in kleiner Zahl eingeschlossen

wurden.

Ziel der Studie war es daher die Thrombingenerierung in plätchenarmen Plasma an

gesunden Erwachsenen zu untersuchen, und die Daten mit der klassischen

Rotationsthromboelastometrie zu vergleichen. Die Probanden wurden dafür mit Hilfe

eines bezüglich Vorerkrankungen, Medikamentenanamnese und Blutungsdiathese

detaillierten Fragebogens ausgewählt.

Die Thrombingenerierung wurde in plätchenarmen Plasma mittels Calibrated

Automated Thrombogram (CAT) mit 1 und 5 pM Gewebsfaktorkonzentration

durchgeführt. Die Parameter lag time, thrombin peak, time to thrombin peak und

endogenes Thrombinpotential (ETP) wurden ausgewertet. ROTEM wurde ohne

Aktivator (NATEM) durchgeführt und die Daten für Gerinnungszeit, Alpha Winkel,

Gerinnselbildungszeit und maximale Gerinnselfestigkeit dokumentiert und mit den

CAT-Werten korreliert.

Ergebnisse:

Die Ergebnisse der Studie wurden bereits veröffentlicht. Im folgenden Abschnitt

sollen diese nochmals zusammenfassend dargestellt werden.

Insgesamt wurden 132 Personen (72 Männer und 60 Frauen) mit einem medianen

Alter von 48 Jahren eingeschlossen. Eine signifikante positive nicht lineare

Korrelation für Alter versus lag time (p>0.001) und time to peak (p=0.001) und

nahezu lineare Korrelation für Alter versus thrombin peak (p=0.024) und ETP

(p=0.001) wurde beobachtet, allerdings mit einer moderaten Regressionssteigung. In

Bezug auf ROTEM gab es eine positive Korrelation zwischen Alter und maximaler

Gerinnselfestigkeit und Alpha-Winkel (p=0.001), jedoch eine negative Korrelation

zwischen Alter und Gerinnselzeit (p=0.039). Thrombin peak und ETP gemessen mit

5 pM TF-Konzentration zeigten eine signifikante Korrelation gegenüber maximaler

Gerinnselfestigkeit und Alpha-Winkel, allerdings ebenfalls mit einer moderaten

Regressionssteigung.


30

Diskussion, Schlussfolgerungen und Ausblick

CAT Assays geben ein globales Bild über die Hämostase wieder. Spronk et. al

sowie Gerotziafas et al. konnten zwar eine gute intra- und interassay Variabilität von

<10% innerhalb ihres Labors nachweisen (20, 23), doch zeigt sich bis heute

zwischen einzelnen Laboren eine große Variabilität in den determinierenden

Parametern (56, 57). Diese große Variabilität verhinderte bisher auch große

multizentrische Studien. Zudem ist die Messmethode zwar benutzerfreundlich,

jedoch sehr störanfällig gegenüber Verunreinigung (z.B. Luftblasen beim Pipettieren)

sowie technischen und personellen Fehlern im Bereich der Präanalytik

(Probengewinnung und Verarbeitung). Durch Standardisierung der Präanalytik (58)

sowie der Messdurchführung, des Referenzplasmas und der verwendeten

Chemikalien (19) soll eine Vergleichbarkeit in Zukunft gegeben sein.

Die Messung im PRP geht noch immer mit einem erheblichen Arbeits- und

Zeitaufwand einher. Es ist anzunehmen, dass zwischen PRP und ROTEM eine

stärkere Korrelation zu erwarten wäre, da die Plättchenfunktion hier mit erfasst wird.

Dies legen die Ergebnisse von Johannson et al. nahe. Diese Autoren verglichen die

Thrombingenerierung gemessen mittels CAT mit ROTEG (dem ROTEM sehr

ähnliche Methode) in PRP bei einer kleinen Probenzahl. Die korrelierten Parameter

zeigten Regressionssteigungen zwischen 0.51 und 0.68 (59). Dennoch ist CAT in

PRP nach derzeitigem Stand in der Routine schwer umsetzbar.

Obwohl ein Vergleich zwischen CAT und EXTEM aufgrund des vordergründig

gleichen Aktivierungsweges und der häufigeren Verwendung von EXTEM gegenüber

NATEM in der Routine logisch erscheint, ist jedoch EXTEM ausschlich sensibel für

Störungen der extrinsischen Hämostase Komponenten (43). NATEM ist zudem

empfindlich auf Hämostasekomponenten außerhalb der extrinischen

Gerinnungskaskade (60).

Eine Korrelation zwischen Alter und Paramatern von CAT und ROTEM wurde bereits

in anderen Arbeiten beschrieben (30, 31, 54). In den bisherigen Arbeiten wurde

dieser Zusammenhang als linear dargestellt. Unsere Daten können einen solchen

linearen Verlauf jedoch nicht für alle Parameter bestätigen. Auch wenn die klinische


31

Relevanz aufgrund der moderaten Entwicklung fraglich ist, hilft die neue Erkenntnis

beim Verständnis der Entwicklung der Hämostase im Alter. Die Gerinnungszeit

gemessen mit ROTEM zeigte in unseren Messungen eine leicht negative Korrelation

mit dem Alter. Eine Erklärung hierfür könnte sein, dass unsere Messungen über

Kontaktaktivierung durchgeführt wurden. So könnte ein im Alter ansteigender FVIII

(61) für die verkürzte Gerinnungszeit verantwortlich sein. Der Testansatz NATEM

wurde unseres Wissens bisher nicht bei einem derart großen Patientenkollektiv mit

entsprechender Altersverteilung untersucht. So kann durch unsere Arbeit ein Beitrag

zur Erstellung von Referenzwerten erreicht werden. Hier wären multizentrische

Studien in der Zukunft wünschenswert.

Dass eine Korrelation zwischen den CAT und ROTEM Parametern nur bei TF

Konzentration von 5 pM im CAT besteht, zeigt das die Manipulationen von Variablen

der Hämostase in vitro die Vergleichbarkeit verschiedener Testverfahren schwierig,

wenn nicht sogar unmöglich, macht.

Auch wenn signifikante Korrelationen zwischen den beiden Verfahren bestehen, ist

die Regressionssteigung sehr moderat. Dies muss bei der Interpretation von

gewonnenen Daten berücksichtigt werden. Ob sie sich gegenseitig ergänzendes

Potential besitzen, muss in weiteren Studien mit speziellen Fragestellungen

bezüglich Blutungen oder thrombotischen Ereignissen beantwortet werden.

Zwar schließt unsere Arbeit zum ersten Mal ältere Probanden höheren Alters in die

Untersuchung der Testverfahren ein, jedoch ist auch unsere Studie durch ihr

vergleichsweise kleines Patientenkollektiv in ihrer Aussagekraft limitiert.

Es benötigt weitere Forschung bezüglich der klinischen Konsequenzen, welche sich

aus von der Norm abweichenden Parametern in beiden Methoden ergeben. Dafür

wären multizentrische Studien mit entsprechend großen Patientenzahlen erforderlich.

Hier wäre eine präoperative Testung von Patienten von großem Interesse, um die

Parameter mit postoperativem Ausgang (Blutung oder Thromboembolierisiko) zu

vergleichen. Erste Arbeiten aus der Traumatologie zeigen, dass CAT hier ein

Potential haben könnte (62). Ähnliches gilt für das Gerinnungsmanagment von

Sepsispatienten. Bisherige Arbeiten zu diesem Thema sind durch ihre kleine

Probandenzahl in ihrer Aussage limitiert (29).


32

Basierend auf unseren Ergebnissen ist die Implementierung der beiden Methoden in

die klinische Routine Diagnostik weiter fraglich. Unbestritten bleibt ihre Wertigkeit als

Behandlungs- und Behandlugskontrollmöglichkeit, bei der jeder Patient seine eigene

Kontrolle bildet.

6. Literaturverzeichnis

1. Chowdary P, Chowdhury P, Saayman AG, Paulus U, Findlay GP, Collins PW.

Efficacy of standard dose and 30 ml/kg fresh frozen plasma in correcting

laboratory parameters of haemostasis in critically ill patients. Br J Haematol

2004; 125(1):69–73.

2. Ewe K. Bleeding after liver biopsy does not correlate with indices of peripheral

coagulation. Dig Dis Sci 1981; 26(5):388–93.

3. Johansson PI, Stissing T, Bochsen L, Ostrowski SR. Thrombelastography and

tromboelastometry in assessing coagulopathy in trauma. Scand J Trauma

Resusc Emerg Med. 2009; 23:17–45.

4. Kozek-Langenecker SA. Perioperative coagulation monitoring. Best Pract Res

Clin Anaesthesiol. 2010; 24(1):27–40.

5. Castoldi E, Rosing J. Thrombin generation tests. Thromb Res 2011; 127 Suppl

3:21–5.

6. Koscielny J, Ziemer S, Radtke H, Schmutzler M, Pruss A, Sinha P et al. A

practical concept for preoperative identification of patients with impaired

primary hemostasis. Clin Appl Thromb Hemost 2004; 10(3):195–204.

7. Hoffman M, Monroe DM. A cell-based model of hemostasis. Thromb Haemost

2001; 85(6):958–65.


33

8. Hoffman M. A cell-based model of coagulation and the role of factor VIIa.

Blood Rev 2003; 17 Suppl 1:S1-5.

9. Smith KA, Pease RJ, Avery CA, Brown JM, Adamson PJ, Cooke EJ et al. The

activation peptide cleft exposed by thrombin cleavage of FXIII-A(2) contains a

recognition site for the fibrinogen α chain. Blood 2013; 121(11):2117–26.

10. Petrides PE, Heinrich PC, Löffler G, Petro W. Biochemie und Pathobiochemie.

8th ed. Berlin: Springer; 2007.

11. Pötzsch B, Müller-Berghaus G, Gawaz M, Hämostaseologie. 2nd ed. Berlin:

Springer Medizin; 2010.

12. Lehnert H, Aulitzky WE, Innere Medizin - essentials. 4th ed. Stuttgart: Thieme;

2006.

13. Eagle H. Studies on blood coagulation: II. The formation of fibrin from thrombin

and fibrinogen. J Gen Physiol 1935; 18(4):547–55.

14. Macfarlane RG, Biggs R. A thrombin generation test; the application in

haemophilia and thrombocytopenia. J Clin Pathol 1953; 6(1):3–8.

15. Hemker HC, Béguin S. Thrombin generation in plasma: its assessment via the

endogenous thrombin potential. Thromb Haemost 1995; 74(1):134–8.

16. Hemker HC, Giesen PL, Al Dieri R, Regnault V, de Smedt E, Wagenvoord R

et al. The calibrated automated thrombogram (CAT): a universal routine test

for hyper- and hypocoagulability. Pathophysiol Haemost Thromb 2002; 32(5-

6):249–53.

17. Hemker HC, Giesen PL, Ramjee M, Wagenvoord R, Béguin S. The

thrombogram: monitoring thrombin generation in platelet-rich plasma. Thromb

Haemost 2000; 83(4):589–91.


34

18. de Smedt E, Al Dieri R, Spronk HM, Hamulyak K, ten Cate H, Hemker HC.

The technique of measuring thrombin generation with fluorogenic substrates:

1. Necessity of adequate calibration. Thromb Haemost 2008; 100(2):343–9.

19. Dargaud Y, Wolberg AS, Luddington R, Regnault V, Spronk H, Baglin T et al.

Evaluation of a standardized protocol for thrombin generation measurement

using the calibrated automated thrombogram: an international multicentre

study. Thromb Res 2012; 130(6):929–34.

20. Gerotziafas GT, Depasse F, Busson J, Leflem L, Elalamy I, Samama MM.

Towards a standardization of thrombin generation assessment: the influence

of tissue factor, platelets and phospholipids concentration on the normal

values of Thrombogram-Thrombinoscope assay. Thromb J 2005; 3:16.

21. Pike GN, Cumming AM, Hay CR, Bolton-Maggs PH, Burthem J. Sample

conditions determine the ability of thrombin generation parameters to identify

bleeding phenotype in FXI deficiency. Blood 2015; 126(3):397–405.

22. Andreasen JB, Ravn HB, Hvas AM. Changes in thrombin generation in

children after cardiac surgery and ex-vivo response to blood products and

haemostatic agents. Blood Coagul Fibrinolysis 2015; Epub.

23. Spronk HM, Dielis AW, de Smedt E, van Oerle R, Fens D, Prins MH et al.

Assessment of thrombin generation II: Validation of the Calibrated Automated

Thrombogram in platelet-poor plasma in a clinical laboratory. Thromb

Haemost 2008; 100(2):362–4.

24. Dielis AW, Castoldi E, Spronk HM, van Oerle R, Hamulyák K, ten Cate H et al.

Coagulation factors and the protein C system as determinants of thrombin

generation in a normal population. J Thromb Haemost 2008; 6(1):125–31.

25. Chantarangkul V, Clerici M, Bressi C, Giesen PL, Tripodi A. Thrombin

generation assessed as endogenous thrombin potential in patients with hyper-

or hypo-coagulability. Haematologica 2003; 88(5):547–54.


35

26. Lewis SJ, Stephens E, Florou G, Macartney NJ, Hathaway LS, Knipping J et

al. Measurement of global haemostasis in severe haemophilia A following

factor VIII infusion. Br J Haematol 2007; 138(6):775–82.

27. ten Cate-Hoek, AJ, Dielis AW, Spronk HM, van Oerle R, Hamulyák K, Prins

MH et al. Thrombin generation in patients after acute deep-vein thrombosis.

Thromb Haemost 2008; 100(2):240–5.

28. Dargaud Y, Trzeciak MC, Bordet JC, Ninet J, Negrier C. Use of calibrated

automated thrombinography +/- thrombomodulin to recognise the

prothrombotic phenotype. Thromb Haemost 2006; 96(5):562–7.

29. Petros S, Kliem P, Siegemund T, Siegemund R. Thrombin generation in

severe sepsis. Thromb Res 2012; 129(6):797–800.

30. Haidl H, Cimenti C, Leschnik B, Zach D, Muntean W. Age-dependency of

thrombin generation measured by means of calibrated automated

thrombography (CAT). Thromb Haemost 2006; 95(5):772–5.

31. Filippin L, Debaugnies F, Noubouossié D, Lê PQ, Ferster A, Demulder A.

Thrombin generation Test: establishment of reference values according to age

and tissue factor concentration is essential before implementation into the

laboratory. Rev Med Brux 2011; 32(2):69–73.

32. Beijers HJ, Ferreira I, Spronk HM, Bravenboer B, Dekker JM, Nijpels G et al.

Body composition as determinant of thrombin generation in plasma: the Hoorn

study. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2010; 30(12):2639–47.

33. Lincz LF, Lonergan A, Scorgie FE, Rowlings P, Gibson R, Lawrie A et al.

Endogenous thrombin potential for predicting risk of venous thromboembolism

in carriers of factor V Leiden. Pathophysiol Haemost Thromb 2006; 35(6):435–

9.


36

34. Eichinger S, Hron G, Kollars M, Kyrle PA. Prediction of recurrent venous

thromboembolism by endogenous thrombin potential and D-dimer. Clin Chem

2008; 54(12):2042–8.

35. Rosenkranz A, Hiden M, Leschnik B, Weiss EC, Schlembach D, Lang U et al.

Calibrated automated thrombin generation in normal uncomplicated

pregnancy. Thromb Haemost 2008; 99(2):331–7.

36. Tchaikovski SN, van Vliet HA, Thomassen MC, Bertina RM, Rosendaal FR,

Sandset PM et al. Effect of oral contraceptives on thrombin generation

measured via calibrated automated thrombography. Thromb Haemost 2007;

98(6):1350–6.

37. Luna-Záizar H, Beltrán-Miranda CP, Esparza-Flores MA, Soto-Padilla J,

Bergés-García A, Rodríguez-Zepeda M, et al. Thrombin generation as

objective parameter of treatment response in patients with severe haemophilia

A and high-titre inhibitors. Haemophilia 2014; 20(1):7–14.

38. Trossaërt M, Regnault V, Sigaud M, Boisseau P, Fressinaud E, Lecompte T.

Mild hemophilia A with factor VIII assay discrepancy: using thrombin

generation assay to assess the bleeding phenotype. J Thromb Haemost 2008;

6(3):486–93.

39. Petros S, Siegemund T, Stolzenburg J, Siegemund A, Engelmann L.

Coagulation monitoring with thrombin generation test during endoscopic

extraperitoneal radical prostatectomy for prostate cancer in a patient with

severe haemophilia B. Haemophilia 2007; 13(5):677–9.

40. Hartert H. Blutgerinnugsstudien mit der Thrombelastometrie, einem neuen

Untersuchungsverfahren. Klin Wochenschr. 1948; (16):257–60.

41. Calatzis A, Spannagl M, Vorweg M. Leitfaden ROTEM® Analyse. München:

Tem Innovations GmbH; 2013.


37

42. Ebinger T, de Pijper Chris. rotem.de: Tem International GmbH; 2014.

Available from: URL: http://www.rotem.de/. Download: 03.02.2015

43. Bolliger D, Seeberger MD, Tanaka KA. Principles and practice of

thromboelastography in clinical coagulation management and transfusion

practice. Transfus Med Rev 2012; 26(1):1–13.

44. Lier H, Vorweg M, Hanke A, Görlinger K. Thromboelastometry guided therapy

of severe bleeding. Hamostaseologie 2013; 33(1):51–61.

45. Spalding GJ, Hartrumpf M, Sierig T, Oesberg N, Kirschke CG, Albes JM. Cost

reduction of perioperative coagulation management in cardiac surgery: value

of "bedside" thrombelastography (ROTEM). Eur J Cardiothorac Surg 2007;

31(6):1052–7.

46. Weber CF, Görlinger K, Meininger D, Herrmann E, Bingold T, Moritz A et al.

Point-of-care testing: a prospective, randomized clinical trial of efficacy in

coagulopathic cardiac surgery patients. Anesthesiology 2012; 117(3):531–47.

47. Young G, Sørensen B, Dargaud Y, Negrier C, Brummel-Ziedins K, Key NS.

Thrombin generation and whole blood viscoelastic assays in the management

of hemophilia: current state of art and future perspectives. Blood 2013;

121(11):1944–50.

48. Al Dieri R, Peyvandi F, Santagostino E, Giansily M, Mannucci PM, Schved JF

et al. The thrombogram in rare inherited coagulation disorders: its relation to

clinical bleeding. Thromb Haemost 2002; 88(4):576–82.

49. Dargaud Y, Béguin S, Lienhart A, Al Dieri R, Trzeciak C, Bordet JC et al.

Evaluation of thrombin generating capacity in plasma from patients with

haemophilia A and B. Thromb Haemost 2005; 93(3):475–80.

50. Livnat T, Zivelin A, Tamarin I, Guetta V, Salomon O. Thrombin generation

assay as a possible tool for assessment of reduced activity of clotting factors


38

induced by antiphospholipid antibodies and in-vitro evaluation of treatment

options. Blood Coagul Fibrinolysis 2009; 20(8):661–6.

51. Tripodi A, Branchi A, Chantarangkul V, Clerici M, Merati G, Artoni A et al.

Hypercoagulability in patients with type 2 diabetes mellitus detected by a

thrombin generation assay. J. Thromb Thrombolysis 2011; 31(2):165–72.

52. al Dieri R, Alban S, Béguin S, Hemker HC. Thrombin generation for the control

of heparin treatment, comparison with the activated partial thromboplastin

time. J. Thromb Haemost 2004; 2(8):1395–401.

53. Gatt A, van Veen, JJ, Woolley AM, Kitchen S, Cooper P, Makris M. Thrombin

generation assays are superior to traditional tests in assessing anticoagulation

reversal in vitro. Thromb Haemost 2008; 100(2):350–5.

54. Lang T, Bauters A, Braun SL, Pötzsch B, von Pape KW, Kolde HJ et al. Multi-

centre investigation on reference ranges for ROTEM thromboelastometry.

Blood Coagul Fibrinolysis 2005; 16(4):301–10.

55. Daraktchiev AT. Evaluation eines neuen Thrombelastographie-Verfahrens-

ROTEM (Rotationsthrombelastometrie) [Univ., Diss.]. Marburg: Philipps-

Universität 2009.

56. Dargaud Y, Luddington R, Gray E, Negrier C, Lecompte T, Petros S et al.

Effect of standardization and normalization on imprecision of calibrated

automated thrombography: an international multicentre study. Br J Haematol

2007; 139(2):303–9.

57. Dargaud Y, Luddington R, Gray E, Lecompte T, Siegemund T, Baglin T et al.

Standardisation of thrombin generation test--which reference plasma for TGT?

An international multicentre study. Thromb Res 2010; 125(4):353–6.


39

58. Loeffen R, Kleinegris MC, Loubele ST, Pluijmen PH, Fens D, van Oerle R et

al. Preanalytic variables of thrombin generation: towards a standard procedure

and validation of the method. J. Thromb Haemost 2012; 10(12):2544–54.

59. Johansson PI, Svendsen MS, Salado J, Bochsen L, Kristensen AT.

Investigation of the thrombin-generating capacity, evaluated by thrombogram,

and clot formation evaluated by thrombelastography of platelets stored in the

blood bank for up to 7 days. Vox Sang 2008; 94(2):113–8.

60. Livnat T, Shenkman B, Martinowitz U, Zivelin A. The impact of thrombin

generation and rotation thromboelastometry on assessment of severity of

factor XI deficiency. Thromb Res 2015; 136:465–73.

61. Mari D, Coppola R, Provenzano R. Hemostasis factors and aging. Exp

Gerontol 2008; 43(2):66–73.

62. Cardenas JC, Rahbar E, Pommerening MJ, Baer LA, Matijevic N, Cotton BA

et al. Measuring thrombin generation as a tool for predicting hemostatic

potential and transfusion requirements following trauma. J Trauma Acute Care

Surg 2014; 77(6):839–45.

7. Quellenverzeichnis Abbildungen:

Abbildung 1: eigene Darstellung

Abbildung 2: Vortragsreihe Moderne Sicht der Hämostase, J. Kienast; IPS

Symposium St. Gallen 15.01. 2008

Abbildung 3: reproduziert aus INTECH open science: Infammation and acute phase

proteins in Haemostasis; 2013; Download intechopen.com: 03.04.2015; Dateiformat:

.jpg

Abbildung 4: Darstellung aus eigener Messreihe

Abbildung 5: rotem.de; Download: 01.07.2014 Dateiformat: .jpg


40

8. Supplementäre Materialien

Darstellung der Parameter der Thrombingenerierung stratifiziert nach Altersgruppen:

Abbildung S1: Box plots für ETP und thrombin peak stratifiziert nach Altersgruppen (1=20-34 Jahre;

2=35-49 Jahre; 3=50-64 Jahre; 4=≥65 Jahre) und Geschlecht. A-C: ETP (gesamte Studienpopulation,

nur männliche Probanden, nur weibliche Probenden) D-F: thrombin peak (gesamte Studienpopulation,

nur männliche Probanden, nur weibliche Probenden). Signifikante Unterschiede sind durch Linien mit

den korrespondierenden p- Werten gekennzeichnet. p. Ø = kein signifikanter Unterschied


41

Abbildung S2: Box plots für lag time und time to thrombin peak stratifiziert nach Altersgruppen (1=20-34 Jahre; 2=35-49

Jahre; 3=50-64 Jahre; 4=≥65 Jahre) und Geschlecht. A-C: lag time (gesamte Studienpopulation, nur männliche Probanden,

nur weibliche Probenden) D-F: time to thrombin peak (gesamte Studienpopulation, nur männliche Probanden, nur weibliche

Probenden). Signifikante Unterschiede sind durch Linien mit den korrespondierenden p- Werten gekennzeichnet. p. Ø = kein

signifikanter Unterschied


42

Fragebogen zur Ermittlung Studien Ein-/Ausschluss:

Ein/Ausschluss:

1. Ist bei ihnen eine Gerinnungsstörung, Blutungsdiathese bekannt?

JA: NEIN:

2. Ist bei ihnen eine Thrombophilie diagnostiziert?

JA: NEIN:

3. Erhalten sie momentan eine Antikoagulationstherapie (blutverdünnende Medikamente), und

wenn ja, wurden diese für den bevorstehenden Eingriff abgesetzt?

JA: Nein: Abgesetzt: JA:

Nein:

Sind bei ihnen schon maligne Erkrankungen diagnostiziert worden / besteht aktuell eine maligne Erkrankung?

JA: Nein:

Blutungsrisiko:

1. Haben Sie bei sich selbst vermehrt Nasenbluten, auch ohne erkennbaren Grund, festgestellt?

JA: NEIN:

2. Treten oder traten bei Ihnen vermehrt - ohne sich anzustoßen - „blaue Flecke“ oder kleine,

punktförmige Blutungen auf ?

JA: NEIN:

Wenn „Ja“, geben Sie bitte an, ob diese Symptome

auch am Körperrumpf oder anderen, für Sie ungewöhnlichen Stellen aufgetreten sind?


43

JA: NEIN:

3. Haben Sie bei sich selbst Zahnfleischbluten ohne erkennbaren Grund festgestellt?

JA: NEIN:

4. Treten Blutungen oder blaue Flecke

mehr als 1 bis 2 mal pro Woche,

JA: NEIN:

oder 1 bis 2 mal pro Woche,

JA: NEIN:

oder 1 bis 2 mal pro Monat auf?

JA: NEIN:

5. Haben Sie den Eindruck, dass es bei Schnitt- oder Schürfwunden (z.B. Rasieren)

länger nachblutet?

JA: NEIN:

6. Traten bei Ihnen bereits einmal längere und verstärkte Nachblutungen nach oder während

Operationen (z.B. Mandeloperationen, Blinddarmoperationen, Geburten) auf?

JA: NEIN:

7. Traten bei Ihnen längere und verstärkte Nachblutungen nach oder

während dem Ziehen von Zähnen auf?

JA: NEIN:

8. Wurden Ihnen bei einer Operation bereits einmal Blutkonserven oder Blutprodukte gegeben?

JA: NEIN:

Bitte geben Sie die Art der Operation(en) an: .............................................................................................

.............................................................................................

9. Gab oder gibt es in der Familie Fälle von Blutungsneigungen?


44

JA: NEIN:

10. Nehmen Sie Schmerz- oder Rheumamittel ein?

JA: NEIN:

Wenn ja, bitte Namen der Medikamente eintragen:

.............................................................................................

.............................................................................................

11. Nehmen Sie weitere Medikamente oder Vitaminpräparate ein?

JA: NEIN:

Wenn ja, bitte Namen der Medikamente eintragen

.............................................................................................

.............................................................................................

12. Ist bei ihnen einmal eine Lungenembolie/Thrombose diagnostiziert worden?

JA: Nein:

Wenn ja bitte eintragen:

.............................................................................................

.............................................................................................

Folgende Frage ist nur von Frauen / Mädchen zu beantworten:

13. Haben Sie den Eindruck, dass Ihre Monatsblutungen verlängert (> 7 Tage)

und / oder verstärkt (häufiger Tampon Wechsel) sind?

JA: NEIN:

.............................................................................................

(Unterschrift, Datum)

9. Anhang:

Erklärung über die Eigenständige Abfassung der Arbeit:


45

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne

unzulässige Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel

angefertigt habe. Ich versichere, dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar

geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem

Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen, und dass die vorgelegte Arbeit weder im

Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen

Prüfungsbehörde zum Zweck einer Promotion oder eines anderen

Prüfungsvefahrens vorgelegt wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen

Personen übernommene Material, das verwendet wurde, oder auf das direkt Bezug

genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle

Personen genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt

waren.

_____________ _________________

Datum Unterschrift

LEBENSLAUF

TOBIAS SCHNEIDER

Neudorferstraße 3, 79541 Lörrach | +4917975348 / +4976215104841 | [email protected] Geboren: 06.05.1981 Familienstand: verheiratet (seit 25.05.2013)

27.11.2015 T. Schneider


46

BILDUNGSWEG

Paul Gerhardt Grundschule Ahlen

Qualifikation für das Gymnasium 1987 - 1991

St. Michael Gymnasium Ahlen

Abitur 1987 - 2000

Abiturfächer: Leistungskurse: Musik, Biologie

Grundkurse: Soziologie, Deutsch

St. Franziskus Hospital Ahlen 2000-2001

Zivildienst

Allgemein internistische Station

DRK Rettungsschule Münster / Berufsfeuerwehr Oelde 2001 - 2003

Ausbildung zum Rettungsassistent

Universität Leipzig 2003 -2010

Studium der Humanmedizin

BERUFLICHE TÄTIGKEITEN NEBEN DEM STUDIUM

Universität Leipzig

Studentische Hilfskraft in der Abteilung für Gastroenterologie Jan. 05 – Jan. 07

Universität Leipzig

Studentische Hilfskraft/ Wissenschaftlicher Mitarbeiter im Labor für Hämostase Jan. 07 – Jan. 09

BISHERIGE ASSISTENZÄRZLICHE TÄTIGKEIT

Kantonspital Laufen 2011 - 2012

01.01.2011- 28.02.2012 Assistenzarzt Klinik für Innere Medizin

Kantonspital Basel Land Standort Bruderholz und Liestal 2012 - 2015

01.04.2012- 31.03.2015 Assistenzarzt Klinik für Anästhesiologie

Universitätsspital Basel 2015 – offen

seit 01.05.2015 Assistenzarzt Anästhesie

FORTBILDUNGEN /FÄHIGKEITSNACHWEISE

NOTARZTKURS BERN 2013

FACHARZTPRÜFUNG ANÄSTHESIE 2015

SGNOR FACHKUNDE AUSWEISS NOTARZT 2015


47

VERÖFFENTLICHUNGEN UND VORTRÄGE

CALIBRATED AUTOMATED THROMBOGRAPHY (CAT) IN PLATELET POOR PLASMA IN ADULTS

Poster Presentation, International Society on Thrombosis and

Hemostasis, Boston 2009

THROMBIN GENERATION AND ROTATIONAL THROMBELASTOMETRY IN

THE HEALTHY ADULT POPULATION

Original Artikel: Hämostasiologie Mai 2015 2015

SEVERE OPIOID WITHDRAWL SYNDROME AFTER A SINGLE DOSE OF NALMEFENE

Letter: European Journal of clinical pharmacology Mai 2015 2015

IT-KENTNISSE:

Microsoft Word/ Powerpoint: sicheres Arbeiten

Microsoft Excel/ Acces: sicheres Arbeiten

SPSS: selbstständiges Auswerten von Daten/ erstellen von Grafiken.

Sigma Plot: selbstständiges erstellen von Grafiken, statistischen

Auswertungen

SPRACHEN

Englisch – sprechen fließend, Lesen /Schreiben sicher

Französisch – sprechen Grundfertigkeiten

Latein – lesen (Latinum)

EHRENAMTLICHE TÄTIGKEITEN

Ehrenamtliche Arbeit als Rettungsassistent bei der Feuerwehr Oelde 2002-2005

HOBBYS / BESONDERE INTERESSEN

Musik: aktiv Gitarre und Klavier

Sport: Mountainbike, Fußball ( nicht mehr im Verein aktiv), Laufen, Fitness

Danksagung:

Mein Dank gilt denen, die mich bei dieser Arbeit betreut und unterstützt haben.

Zuerst meinem Betreuer PD Dr. Sirak Petros, der mir die Möglichkeit gegeben hat,

mich intensiv mit der spannenden Thematik der Hämostase auseinanderzusetzen.


48

Besonderer Dank gebührt auch der Familie Siegemund (Annelie, Roland und

Thomas). Zum einen für die Unterstützung im Labor und zum anderen für ihren Input

beim Verfassen der Veröffentlichung sowie der Dissertation.

Ihnen allen sei besonders für die Geduld gedankt, die sie mit ihrem Doktoranden

aufgebracht haben. Trotz räumlicher Trennung, nach Beendigung meines Studiums

in Leipzig, wurde der Kontakt gehalten und das Projekt konnte abgeschlossen

werden.

Ich weiß, dass dies keine Selbstverständlichkeit ist.

Bedanken möchte ich mich bei allen Probanden, die an der Studie teilgenommen

haben, mir bereitwillig meinen Fragebogen beantwortet haben, mir ihr Blut geschenkt

und dabei die ein oder andere zusätzliche Punktion erduldet haben.

Großer Dank gebührt meinen Eltern, die mir ermöglicht haben ein Medizinstudium

aufzunehmen. Liebe Eltern, es war nicht ganz umsonst.

Zuletzt bedanke ich mich bei meiner lieben Frau Madeleine für ihre geduldige und

liebevolle Unterstützung.

Documents

Thrombingenerierung und … · 2.1 Das Zellbasierte Gerinnungsmodel: ... weiteren für die Gerinnung nötigen Faktoren ab. Es wird also kontinuierlich eine kleine Menge Thrombin generiert