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Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zur Prävention von Asthma in einem ex vivo Lungenmodell unter Verwendung von
nicht-menschlichen Primaten
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Judy Wichmann Berlin
Hannover 2016
Wissenschaftliche Betreuung: 1. Univ.-Prof. Dr. med. vet. Franz-Josef Kaup
Abteilung Infektionspathologie
Deutsches Primatenzentrum GmbH
Leibniz-Institut für Primatenforschung
Göttingen
2. Prof. Dr. rer. nat. Armin Braun
Abteilung Atemwegsimmunologie
Fraunhofer Institut für Toxikologie und
Experimentelle Medizin (ITEM)
Hannover
1. Gutachterin(nen)/Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Franz-Josef Kaup
2. Gutachterin(nen)/Gutachter: Dr. med. vet. Anke Schnapper
Tag der mündlichen Prüfung: 08.11.2016
Das Projekt wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen
des Schwerpunktprogramms ‚Mast-cells – promoters of health and modulators of
disease‘ gefördert.
Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit wurden auf folgenden Kongressen präsentiert:
05/2013 Invasive lung function measurement in common marmosets (Callithrix
jacchus) (Poster) ATS 2013, Philadelphia, USA 08/2013 Allergen-induced early airway response of marmoset and human lung
tissue after passive sensitization with human blood plasma (Vortrag) International Mast Cell and Basophil Meeting 2013, Udine, Italien 10/2013 Frühe Phase der Allergen-induzierten Atemwegsreaktion beim
Weißbüschelaffen nach passiver Sensibilisierung von Lungengewebe mit humanem Blutplasma (Vortrag)
Herbsttagung der Sektion Zellbiologie und Tuberkulose in der Deutschen Gesellschaft für Pneumologie und Beatmungsmedizin e.V., Marburg, Deutschland
05/2014 Passively sensitized precision-cut lung slices from marmoset monkeys
as a preclinical assay to test novel IgE inhibitors (Poster-Diskussionsrunde)
ATS 2014, San Diego, USA 09/2015 Non-human primate precision-cut lung slices for IgE and histamine
dependent bronchoconstriction (Vortrag) 53. Wissenschaftliche Tagung der Gesellschaft für Versuchstierkunde
GV-SOLAS, Hannover, Deutschland 10/2015 Testing of a novel anti-IgE inhibitor in human and non-human primate
precision-cut lung slices (Vortrag) International Mast Cell and Basophil Meeting 2015, Marseille,
Frankreich 12/2015 Human and non-human primate precision-cut lung slices for testing a
new disruptive IgE inhibitor (Vortrag) Type 2 Immunity Meeting Bern, Bern, Switzerland
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG ........................................................................................................... 1 2. LITERATURÜBERSICHT ....................................................................................... 3
2.1. Allergische Atemwegserkrankungen ............................................................. 3
2.1.1. Pathogenese & Klinik ......................................................................... 3
2.1.2. Therapie ............................................................................................. 4
2.2. Mastzellen ..................................................................................................... 6
2.2.1. Entstehung & Differenzierung ............................................................ 7
2.2.2. Aktivierung in der Lunge ................................................................... 10
2.3. Tiermodelle ................................................................................................. 12
2.4. PCLS zur ex vivo Untersuchung von Atemwegsreaktionen ........................ 15
3. MATERIAL & METHODEN ................................................................................... 18
3.1. Lungengewebe von nicht-menschlichen Primaten ..................................... 18
3.2. Präparation der PCLS ................................................................................. 19
3.3. Passive Sensibilisierung der PCLS ............................................................. 23
3.4. Pharmakologische Behandlungen von passiv sensibilisierten PCLS ......... 24
3.4.1. Cetirizindihydrochlorid ...................................................................... 24
3.4.2. DARPins ........................................................................................... 24
3.5. Allergenprovokation der PCLS .................................................................... 25
3.6. Analyse der Atemwegsreaktion .................................................................. 25
3.7. Analyse der Histaminausschüttung ............................................................. 26
3.8. Vitalitätstests ............................................................................................... 27
3.9. Statistik ........................................................................................................ 27
4. ERGEBNISSE ....................................................................................................... 28 5. DISKUSSION ........................................................................................................ 54 6. ZUSAMMENFASSUNG ........................................................................................ 60 7. SUMMARY ............................................................................................................ 62 8. LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................. 64 9. ANHANG ............................................................................................................... 92
9.1. Frühe Atemwegsreaktion in PCLS von Weißbüschelaffen ......................... 92
9.2. Frühe Atemwegsreaktion in PCLS von Javaneraffen ................................. 94 9.3. Cetirizin-Behandlung von sensibilisierten Weißbüschelaffen-PCLS ........... 96 9.4. Behandlung von sensibilisierten Weißbüschelaffen-PCLS mit dem
Anti-IgE-DARPin ......................................................................................... 99
9.5. Behandlung von sensibilisierten Weißbüschelaffen-PCLS mit dem
Kontroll-DARPin ........................................................................................ 101
9.6. Behandlung von sensibilisierten Javaneraffen-PCLS mit dem
Anti-IgE-DARPin ....................................................................................... 103
9.7. Behandlung von sensibilisierten Javaneraffen-PCLS mit dem
Kontroll-DARPin ........................................................................................ 105
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
bFGF basic Fibroblast Growth Factor
BHR Bronchiale Hyperreagibilität
bi bispecific
bzw. beziehungsweise
C Celsius
COPD Chronic Obstructive Pulmonary Disease
DARPin Designed Ankyrin Repeat Protein
DFG Deutsche Forschungsgemeinschaft
DMEM/F-12 Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12
DPZ Deutsches Primatenzentrum
EBSS Earle’s Balanced Salt Solution
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
EU Europäische Union
FcεRI hoch affiner IgE-Rezeptor
H Histamin
HDM House Dust Mite
HEPES Hydroxyethylpiperazin-Ethansulfonsäure
IgE Immunglobulin E
IL Interleukin
i.p. intraperitoneal
ITEM Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin
i.v. intravenös
kU kilo-Units
l Liter
LABA Long-Acting ß2-Adrenoceptor Agonist
LDH Laktatdehydrogenase
LPS Lipopolysaccharid
MCBS Mast Cell Biology Section
MC Mast Cell
MEM Minimum Essential Medium Eagle
MPMC Murine Peritoneal Mast Cells
NGF Nerve Growth Factor
OVA Ovalbumin
PAF Platelet Activating Factor
PBS Phosphate-Buffered Saline
PCLS Precision-Cut Lung Slices
RBL Rat Basophilic Leukemia Cells
SABA Short-Acting ß2-Adrenoceptor Agonist
SCF Stem Cell Factor
SEM Standard Error of the Mean
sog. sogenannte/n
Tab. Tabelle
TH T-Helfer
TNF Tumornekrosefaktor
v. a. vor allem
z. B. zum Beispiel
µl Mikroliter
µm Mikrometer
µM Mikromolar
1
1. EINLEITUNG
Die vorliegende Dissertation ist Teil des Projekts „Charakterisierung der
Mastzellanatomie und -funktion in den Atemwegen von Primaten und ihre Interaktion
mit dem Nervensystem“, welches durch eine Kooperation zwischen dem DPZ und
dem Fraunhofer ITEM erarbeitet wird.
Mastzellen sind bei Mensch und Tier im Bindegewebe und im Bereich mukosaler
Oberflächen aufzufinden. In diesen Bereichen nehmen sie eine wichtige Rolle bei der
Aufrechterhaltung der Gewebsgesundheit ein und koordinieren sowohl
Entzündungsmechanismen als auch Reparaturvorgänge im Rahmen verschiedenster
Erkrankungen (VIRK et al. 2016). Ihre Aktivierung bei allergischen
Atemwegserkrankungen, insbesondere Asthma, ist Gegenstand vieler
Untersuchungen. Über das Mastzell-gebundene IgE können Allergene an die
Oberfläche binden und somit die Zelle aktivieren. Dies hat zur Folge, dass die in den
Granula gespeicherten Mediatoren freigesetzt werden und eine allergische Reaktion
hervorgerufen wird. Bei der Pathogenese und damit verbunden auch der
therapeutischen Intervention von allergischen Atemwegserkrankungen sind
Mastzellen daher von großer Bedeutung (REBER und FAHY 2016).
Nach Angaben des Global Asthma Network (2014) sind mittlerweile 334 Millionen
Menschen an Asthma erkrankt, wobei die Zahlen kontinuierlich weiter ansteigen. Die
medikamentöse Behandlung allergischer Atemwegserkrankungen basiert derweil im
Wesentlichen auf dem Einsatz entzündungshemmender und unspezifischer
Medikamente, wie den Glukokortikoiden, und Pharmaka zur Bronchodilatation, wie
ß2-Sympathomimetika. Neuartige Therapien sollen in die Pathogenese von
Mastzellsensibilisierung und -aktivierung eingreifen und damit präventiv eine
allergische Reaktion verhindern. Dazu gehört auch ein neu entwickeltes Protein, das
sog. DARPin (Designed Ankyrin Repeat Protein), welches freies IgE bindet und IgE-
Komplexe auflöst (KIM et al. 2012, EGGEL et al. 2014).
In der vorliegenden Dissertation wird untersucht, welche Auswirkungen diese neue
Substanz auf das Lungengewebe von nicht-menschlichen Primaten (Marmosetten
2
und Javaneraffen) hat. Ziel des Vorhabens ist es, herauszufinden, ob der IgE-
Inhibitor ex vivo eine allergische Atemwegsreaktion in passiv sensibilisierten und
Allergen-stimulierten Lungenschnitten verhindert.
3
2. LITERATURÜBERSICHT
2.1. Allergische Atemwegserkrankungen
Mastzellen sind an einer Vielzahl respiratorischer Erkrankungen beteiligt, darunter
COPD (ANDERSSON et al. 2010, BALLARIN et al. 2012), fibrotische
Lungenerkrankungen (CHA et al. 2012, OVERED-SAYER et al. 2013) und
Infektionen (ABRAHAM und ST JOHN 2010, GRAHAM et al. 2013). Am häufigsten
werden sie aber im Zusammenhang mit allergischen Atemwegsreaktionen, wie z. B.
dem allergischen Asthma, beschrieben und diskutiert (BISCHOFF 2007, GALLI und
TSAI 2012).
2.1.1. Pathogenese & Klinik
Grundlage für eine sog. Typ-1-Allergie ist eine überschießende Immunantwort gegen
ein harmloses Allergen. Nach einem initialen Kontakt findet im Körper eine
Sensibilisierung gegenüber diesem Antigen statt, indem das Antigen von
dendritischen Zellen gebunden und anschließend in regionalen Lymphknoten den
naiven T-Zellen präsentiert wird. Letztere entwickeln sich daraufhin zu einem TH2-
Phänotyp, welcher im Zusammenspiel mit Zytokinen die B-Zellen zu IgE
produzierenden Plasmazellen umwandelt (KLEINJAN et al. 2000, HOLGATE und
POLOSA 2008, CAMPILLO-NAVARRO et al. 2014).
Menschen, die genetisch bedingt auf eine Vielzahl von Allergenen reagieren, sog.
Atopiker, weisen einen erhöhten Spiegel an IgE auf. Diese Antikörper schwimmen
entweder frei im Blut oder sind im Gewebe über FcεRI fest an die Oberfläche von
Mastzellen gebunden. Diese erhöhten Level an IgE steigern nicht nur das Überleben
der Mastzellen, sondern auch die Expression von FcεRI (GALLI und TSAI 2012).
Dadurch kann die Zelle mehr IgE binden und sich zu einem Allergen-sensitiven
Phänotyp umwandeln. Dieses Phänomen kommt bei Patienten, deren Erkrankung
durch Medikamente stabilisiert werden kann, signifikant seltener vor (ANDERSSON
et al. 2011).
4
Durch die IgE:FcεRI-Komplexe sind Mastzellen zur Aktivierung bereit. Eine
Allergenbindung an diese Komplexe führt in der Folge zur Freisetzung mehrerer
Granula-assoziierter Mediatoren (ERJEFALT 2014). Es kommt zu einer
Hypersensitivität bzw. allergischen Reaktion vom Sofort-Typ (METCALFE et al.
1997). Diese frühe Phase einer allergischen Atemwegsreaktion ist gekennzeichnet
durch eine überschießende Reaktion mit Symptomen wie Rhinorrhoe, Niesen
und/oder Husten. Beim allergischen Asthma kann es gar zu lebensbedrohlichen
Situationen wie Atemnot kommen (DI LORENZO et al. 2001, HOLGATE und
POLOSA 2008, UNDEM und TAYLOR-CLARK 2014).
Dabei liegt die Problematik nicht nur in der unmittelbaren Antwort auf einen Stimulus.
Die Neusynthese weiterer Mediatoren verursacht eine Spätreaktion, die einige
Stunden nach dem Allergenkontakt auftritt. Eine anhaltende Aktivierung der
Mastzellen durch regelmäßig wiederkehrenden Antigenkontakt führt damit zu einer
fortwährenden Ausschüttung von Mediatoren. Somit ist der Anteil degranulierter
Mastzellen bei Asthmatikern beispielsweise höher als bei Nicht-Asthmatikern
(CARROLL et al. 2002). Dieser chronische Abwehrmechanismus führt zu einer
Verschlimmerung des Krankheitsbildes, der sog. Exazerbation (METCALFE et al.
1997, GALLI und TSAI 2012, SCHATZ et al. 2014). Es kommt zu einem komplexen
Reparaturprozess, der die Lunge strukturell umbaut. Bei diesem sog. Lungen-
Remodeling verdicken sich u. a. die Bronchialwände, wodurch die Lungenfunktion
stetig verschlechtert wird (BRIGHTLING et al. 2002, GALLI und TSAI 2008).
2.1.2. Therapie
In den vergangenen Jahrzehnten ist die Anzahl der Patienten mit allergischen
Symptomen stetig gestiegen. Allein von einer Hausstaubmilbenallergie sind 1 - 2 %
der Weltbevölkerung betroffen (CALDERON et al. 2015). Betrachtet man die
Behandlungssituation von Asthmatikern, ist diese dagegen eher unbefriedigend.
Insbesondere Patienten mit schwerem und nicht kontrollierbarem Asthma benötigen
wirksame Pharmaka (SCHATZ et al. 2014).
5
Bis heute basiert die medikamentöse Therapie im Wesentlichen auf inhalativen,
unspezifischen Glukokortikoiden und ß2-Adrenozeptor-Agonisten (HOLGATE und
POLOSA 2008). Glukokortikoide unterdrücken die TH2-Zell-gesteuerte
Atemwegsentzündung indem sie die Expression von Zytokinen, Chemokinen und
Adhäsionsmolekülen inhibieren (BARNES et al. 1998). Bei den ß2-Agonisten
unterscheidet man zwischen kurzzeitig (short-acting beta-2 agonist, SABA) und
länger (long-acting beta-2 agonist, LABA) wirksamen Formen.
Inhalative SABAs wie Salbutamol und Terbutalin sind die effektivsten
Bronchodilatatoren bei akuter Atemnot (HOLGATE und POLOSA 2008). Die
inhalativen LABAs Formoterol und Salmeterol können eine Relaxation der
Atemwegsmuskulatur über mindestens 12 Stunden herbeiführen (PALMQVIST et al.
1997). Sie werden ergänzend zur Asthmatherapie eingesetzt, wenn mit inhalativen
Kortikosteroiden der therapeutische Effekt nicht erreicht wird. Als alleinige Therapie
sind LABAs nicht geeignet, da sie eine Verschlechterung der Atemwegsentzündung
maskieren können (MCIVOR et al. 1998).
Da Patienten auf die gemeinsame Gabe von Kortikosteroiden und LABAs besser
ansprechen und sich die Wirksamkeit beider Medikamente positiv zu beeinflussen
scheint, enthalten heutige Inhalatoren beide Wirkstoffe (HOLGATE und POLOSA
2008). Allerdings besitzen beide Wirkstoffe nur eine palliative aber keine kurative
Wirkung und können somit nur die Symptome lindern aber nicht die Pathogenese
beeinflussen (HOLGATE 2013). Eine progressive Verschlechterung der
Lungenfunktion kann demnach nicht effizient abgewendet werden. Insbesondere
Glukokortikoide können über einen längeren Zeitraum nicht nur ihre Wirksamkeit
verlieren, sondern auch im erheblichen Ausmaß z. B. das Wachstum, die
Reproduktion, kardiovaskuläre Funktionen und das Immunsystem negativ
beeinflussen (RHEN und CIDLOWSKI 2005, BARNES 2011, HOLGATE 2013,
SCHATZ et al. 2014, ZAPPIA et al. 2015).
Die Therapie allergischer Atemwegserkrankungen ist auch mit H1-Antihistaminika
und Leukotrienrezeptorantagonisten möglich. Zu den Ersteren gehören z. B.
Chlorphenamin und Cetirizin. Das Antihistaminikum war der erste spezifische
6
Wirkstoff um allergische Reaktionen zu behandeln. Sie können zwar die Symptome
einer Allergie effektiv behandeln, besitzen jedoch erhebliche sedative und anti-
cholinergische Nebenwirkungen (HOLGATE und POLOSA 2008).
Ähnlich wie die LABAs können die Leukotrienrezeptorantagonisten Montelukast und
Zafirlikast auch als zusätzliche Therapiestütze zu inhalativen Glukokortikoidgaben
eingesetzt werden (POLOSA 2007). Phosphodiesterase-Hemmer wie Theophyllin
können zur Behandlung der asthmatischen Bronchokonstriktion genutzt werden.
Allerdings ist ihr Einsatz aufgrund von Nebenwirkungen auf Herz-Kreislauf- und
Nervensystem stark zurückgegangen (HOLGATE und POLOSA 2008).
Neue Entwicklungen in der Therapie fokussieren sich darauf, das IgE zu
neutralisieren und damit eine Sensibilisierung von Mastzellen zu verhindern. Der
Antikörper Omalizumab ist der erste kommerziell erhältliche Wirkstoff, der hoch
spezifisch freies IgE im Blut bindet (KLYUCHEVA et al. 2013, HENDELES et al.
2015). Leider ist dieser Inhibitor nur für Patienten mit mittelgradigem bis schwerem
allergischen Asthma vorgesehen und bei rund einem Drittel aller Patienten ineffektiv
(LAI et al. 2015, SULLIVAN et al. 2015). Zudem verursacht Omalizumab extrem
hohe Kosten (SULLIVAN et al. 2015). Auch deshalb ist dieser Antikörper nur den
Patienten vorbehalten, bei denen konventionelle Therapien versagen und mit
schweren bis lebensbedrohlichen Symptomen zu rechnen ist (SULLIVAN und TURK
2008, KLYUCHEVA et al. 2013, HENDELES et al. 2015).
2.2. Mastzellen
Seit die Mastzellen 1878 erstmals von Paul Ehrlich beschrieben wurden (RIBATTI
und CRIVELLATO 2014), ist ihr Einfluss innerhalb physiologischer und
pathologischer Prozesse vielfältig beschrieben worden. Mastzellen sind
Immuneffektorzellen, die sowohl die angeborene als auch die erworbene Immunität
beeinflussen. Ihre Vorläuferzellen entstehen im Knochenmark und differenzieren sich
zum entsprechenden Subtyp, nachdem sie in die Schleimhaut oder ins Bindegewebe
eingewandert sind. Sie werden v. a. in Geweben ansässig, deren Oberflächen an die
Außenwelt angrenzen und somit stetig verschiedenen Stimuli ausgesetzt sind. Dort
7
sind sie meist in der Nähe von Blutgefäßen, Nerven oder glatten Muskelzellen
vorzufinden. Ihre charakteristischen Granula sind mit einer Vielzahl an biologisch
aktiven Mediatoren ausgestattet, mit deren Freisetzung sie unmittelbar auf Reize
reagieren können. Abhängig von ihrem Standort können Mastzellen demnach an
chronischen Entzündungen, Gefäßerkrankungen, fibrotischen Veränderungen,
rheumatischen Erkrankungen, bösartigen Tumoren, der Abwehr bestimmter
Pathogene und anderen Krankheiten beteiligt sein. Traditionell werden sie jedoch mit
Allergien in Verbindung gebracht.
2.2.1. Entstehung und Differenzierung
Mastzellen besitzen Vorläuferzellen, sog. pluripotente CD34+ Progenitorzellen, die
im Knochenmark aus hämatopoetischen Stammzellen entstehen (KIRSHENBAUM et
al. 1991). Diese Vorläuferzellen exprimieren bereits die Rezeptoren c-Kit und
FcεRI/II/III (METCALFE et al. 1997). Vom Knochenmark aus werden sie in die
Blutbahn entlassen. Erst im peripheren Gewebe nehmen sie unter dem Einfluss
vieler verschiedener Wachstumsfaktoren ihre vollendete Gestalt mit entsprechender
Granularität an (VALENT et al. 1991). Zu dieser Ausreifung tragen bei: Stem cell
factor (SCF), Interleukin (IL)-3, IL-4, IL-6, IL-9, IL-10, Eotaxin und nerve growth factor
(NGF) (KIRSHENBAUM et al. 1989, GHILDYAL et al. 1992, KIRSHENBAUM et al.
1992, VALENT 1995).
SCF steuert die Differenzierung und Lebensverlängerung, verursacht aber auch eine
Mastzellhyperplasie und verstärkt die Mediatorenproduktion (VLIAGOFTIS et al.
1997). Wird der Mastzelle das SCF entzogen, wird der programmierte Zelltod
eingeleitet (MEKORI et al. 1995). Im Vergleich dazu ist IL-3 beispielsweise für die
Entwicklung der Mastzelle entbehrlich, aber wiederum für die physiologische
Mastzellausbreitung als Antwort auf intestinale Pathogene notwendig (LANTZ et al.
1998).
Im Laufe ihrer weiteren Entwicklung entstehen zwei verschiedene Phänotypen
(METCALFE et al. 1997). Man unterscheidet die Zellen der Schleimhaut, sog.
mukosale Mastzellen, von den (Binde-)Gewebsmastzellen. Beide Subtypen haben
8
ihre strukturellen, biochemischen und funktionellen Eigenheiten. Ihre Merkmale sind
in Tabelle 1 aufgelistet. Je nach Proteasegehalt spricht man auch von MCT oder
MCTC (WELLE 1997). Die Entwicklung von tryptase-positiven Mastzellen zu denen,
die gleichermaßen tryptase- und chymase-positiv sind, wird durch IL-4 gefördert
(TORU et al. 1998).
Tab. 1: Vergleich von mukosalen Mastzellen und Gewebsmastzellen (BIENENSTOCK et al. 1982, CHURCH und LEVI-SCHAFFER 1997, METCALFE et al. 1997).
Auch wenn beide Formen in der Lunge koexistieren, stellen die mukosalen
Mastzellen den vorherrschenden Typ dar und sind v. a. in den Bronchien,
Bronchiolen und in den Alveolarsepten ansässig (Abb. 1). Gewebsmastzellen
befinden sich hingegen reichlich in pulmonalen Gefäßen und der Pleura.
Mukosale Mastzellen Gewebsmastzellen
Lokalisation - Schleimhautoberflächen
- Alveolen
- In der Nähe von T-
Lymphozyten
- Gastrointestinaltrakt
(Mukosa)
- Haut
- Peritoneum
- Synovia
- Subkutanes Gewebe
- Gastrointestinaltrakt
(Submukosa)
Protease(n) - Tryptase (MCT)
- Tryptase & Chymase
(MCTC)
- Carboxypeptidase
- Cathepsin G
Aktivierbar über... - FcεRI
- FcεRI
- Compound 48/80
- Substanz P
Anstieg im
Zusammenhang
mit...
- TH2-Zell-Aktivierung
- Allergien
- Parasitenbefall
- Fibrotischen
Erkrankungen
9
ANDERSSON et al. (2009) beschreibt darüber hinaus, wie sich beide Subtypen je
nach Lokalisation noch weiter verändern und so ihrer Umwelt besser angepassen.
Gewebsmastzellen an pulmonalen Gefäßen sind z. B. signifikant größer als
diejenigen der kleineren Atemwege. Genau das Gegenteil wurde bei mukosalen
Mastzellen beobachtet.
Am Ende ihrer Entwicklung sind die Mastzellen zwischen 5 und 20 µm groß und ihr
Zytoplasma beinhaltet annähernd 1000 charakteristische Granula (YONG 1997), die
mit einer Vielzahl von biologisch aktiven Mediatoren ausgestattet sind (GALLI und
TSAI 2008). Die Zellen überleben im Gewebe einige Monate (CAMPILLO-NAVARRO
et al. 2014).
Abb. 1: Zwei mukosale Mastzellen (Pfeil) im Bronchus eines Weißbüschelaffen (K2240). Immunhistochemie mit Anti-Tryptase-Antikörper (ABC Methode, DAB).
10
In der Lunge reicht die Anzahl von 500 bis 4000 pro mm3 (ABRAHAM und
MALAVIYA 1997). CARROLL et al. (2002) untersuchte die Atemwege von Menschen
und fand heraus, dass die knorpeligen Anteile eine Dichte von 27 ± 9 Mastzellen pro
mm2 aufweisen. In membranösen Anteilen ist deren Anzahl mit 155 ± 21 Zellen pro
mm2 dagegen um ein Vielfaches erhöht.
Im Allgemeinen bleibt die Anzahl annähernd konstant und ändert sich nur unter
pathologischen Bedingungen (METCALFE et al. 1997). So wurde beispielsweise in
den membranösen Bereichen der Atemwege von Menschen mit nicht fatalem (270 ±
51 Zellen pro mm2) und fatalem (219 ± 26 Zellen pro mm2) Asthma eine erhöhte
Dichte an Mastzellen nachgewiesen (CARROLL et al. 2002). Konzentriert man sich
auf den Bereich der glatten Muskulatur, ist hier ebenso festzustellen, dass die
Mastzelldichte bei Asthmatikern signifikant höher ist als bei gesunden Menschen
(AMMIT et al. 1997, BRIGHTLING et al. 2002).
2.2.2. Aktivierung in der Lunge
Sowohl immunologische als auch nicht-immunologische Stimuli können die Mastzelle
aktivieren (JOHNSON und KRENGER 1992, EMADI-KHIAV et al. 1995). Zu
Letzteren gehören Komplementproteine, Superoxide und Neuropeptide. Aber auch
IgG-FcγR-Verknüpfungen, einige Zytokine, Chemokine, endogene und exogene
Peptide, Chemikalien, physikalische Stimuli und biologische Substanzen, wie
bakterielle Produkte, Viren und Tiergifte, können Mastzellen beeinflussen (KINET
1999, BIEDERMANN et al. 2000, GALLI et al. 2005, GIMBORN et al. 2005, RIVERA
und GILFILLAN 2006, HEIB et al. 2007, WASKOW et al. 2007). Klassischerweise
werden diese Zellen jedoch mit Allergen-IgE-FcεRI-Verknüpfungen in Verbindung
gebracht (METCALFE et al. 1997).
Im Unterschied zu anderen IgE-Rezeptoren bindet FcεRI mit hoher Affinität das IgE.
Erfassen zwei, FcεRI gebundene IgE Moleküle ein Antigen, werden die Ca2+-Kanäle
und die Ca2+-sensitiven K+-Kanäle aktiviert und Ca2+ strömt in die Zelle ein (LANG
und SHUMILINA 2013). Dies leitet sowohl die Degranulation als auch die
Neusynthese von Mediatoren ein (ABRAHAM et al. 1997, MARONE et al. 1997).
Somit können fertig angelegte und in den Granula gespeicherte Mediatoren innerhalb
11
weniger Minuten nach Aktivierung freigesetzt werden und in der Lunge die frühe
Phase einer allergischen Reaktion einleiten (CHURCH und LEVI-SCHAFFER 1997).
Zu dem wohl wichtigsten Mediator gehört das vasoaktive Amin Histamin, welches z.
B. die Muskelkontraktion in den Atemwegen verstärkt, die vaskuläre Permeabilität
erhöht und die muköse Sekretion anregt (MAURER et al. 2003, HOLGATE und
POLOSA 2008). Zu den weiteren Mediatoren zählen Enzyme wie die Mastzell-
spezifischen Proteasen Chymase, Tryptase und Carboxypeptidase A sowie Mastzell-
unspezifischen Proteasen, z. B. Cathepsin G, ß-Glucuronidase und ß-D-
Galactosidase (CHURCH und LEVI-SCHAFFER 1997, HOHMAN und DRESKIN
2001, MAURER et al. 2003, BUHNER und SCHEMANN 2012, CAMPILLO-
NAVARRO et al. 2014). Auch Proteoglykane wie Heparin und Chondroitinsulfat E
gehören zu den fertig angelegten Mediatoren (BUHNER und SCHEMANN 2012).
Im Laufe einer Mastzellaktivierung kommt es zur Neusynthese bereits granulierter
aber auch neuer Mediatoren, wodurch die späte Phase der allergischen Reaktion
ermöglicht wird (METCALFE et al. 1997). Zu den neu synthetisierten Mediatoren
gehören Lipide wie Leukotriene, Prostaglandin D2 und platelet activating factor (PAF)
(BUHNER und SCHEMANN 2012). Sowohl die Leukotriene als auch das
Prostaglandin D2 stimulieren die vaskuläre Permeabilität (BISGAARD et al. 1986)
und üben einen starken Einfluss auf den Bronchospasmus und die Mukussekretion
aus. Weitere Mediatoren sind Thromboxan, Zytokine wie TNF-α, IL-1, IL-3, IL-4, IL-5
und IL-13 aber auch Chemokine, die die Leukozyteninvasion fördern und
gewebsmodulierende Faktoren wie basic fibroblast growth factor (bFGF) (MAURER
et al. 2003, BUHNER und SCHEMANN 2012, CAMPILLO-NAVARRO et al. 2014).
Durch die Ausschüttung dieser Mediatoren kann sich die Mastzelle selbst
wiederholend stimulieren und damit aktiv bleiben (THURMOND et al. 2008) aber
auch weitere Zellen wie die eosinophilen Granulozyten und TH2-Zellen anlocken
(HOLGATE und POLOSA 2008). Ein anhaltender Antigenkontakt sorgt demnach für
einen fortwährenden Abwehrmechanismus und eine Chronifizierung des
Erkrankungsbildes (METCALFE et al. 1997). Mediatoren, wie z. B. Histamin und
Tryptase, fördern die Fibroblastenproliferation, die Kollagensynthese und die
12
Aktivierung dendritischer Zellen (ABE et al. 2000). Es kommt zu einem fehlgeleiteten
Reparaturprozess, der das Gewebe strukturell umbaut (BRIGHTLING et al. 2002,
GALLI und TSAI 2008).
2.3. Tiermodelle
Mit der Zeit haben sich unterschiedliche Modelle zur Untersuchung von Mastzellen
etabliert. Darunter gehören Nager seit Jahrzehnten zu den meist genutzten Tieren
um entsprechende Studien durchzuführen. Um Mastzellen separat zu untersuchen,
hat sich z. B. das Peritoneum von Nagern als leichte Quelle herausgestellt. Die
geringe Ausbeute an Zellen ist aufgrund der Größe der Tiere jedoch oft ein
limitierender Faktor (SIEBENHAAR et al. 2015). Eine höhere Anzahl an Zellen, die
zugleich eine Reproduzierbarkeit und Homogenität garantiert, kann dagegen aus
entsprechenden Kultivierungen gewonnen werden. Aus diesem Grund sind
mittlerweile verschiedenste Zellkulturen aus Nagern erhältlich, z. B. MPMC (KIM et
al. 1998, GRUBA et al. 2014), MCBS1 (SMRZ et al. 2013) und RBL-2H3
(PASSANTE et al. 2009).
Um die Funktionen der Mastzelle zu untersuchen wurden darüber hinaus bereits
verschiedene Mauslinien mit einem Mangel an Mastzellen etabliert, z. B. KitW/KitW-v,
KitW-sh/KitW-sh und Cre-Master (GRIMBALDESTON et al. 2005, FEYERABEND et al.
2011, FUCHS et al. 2012, SIEBENHAAR et al. 2015). Bei einigen dieser Modelle ist
der Kit-Rezeptor mutiert, sodass die Tiere keine ausgereiften Mastzellen besitzen
(KITAMURA et al. 1978). Folglich entstehen Defizite, die aus einem Fehlen von
reifen Mastzellen resultieren. Diese Modelle erlauben demnach einen Einblick darin,
wofür Mastzellen notwendig und unabdingbar sind. Diese Mauslinien haben jedoch
auch ihre Schwächen, da entsprechende Defizite häufig von anderen Zellen
kompensiert werden können. Gerade in der Untersuchung komplexer Reaktionen
sind diese Modelle oft unzureichend. Außerdem kann eine Mutation auch andere
Funktionen beeinträchtigen. Durch die bereits erwähnte Mutation am Kit-Rezeptor
zeigen die Tiere z. B. auch Unregelmäßigkeiten anderer Zellen, da dieser Rezeptor
im Organismus weit verbreitet ist (KITAMURA et al. 1978). Um Mastzell-unabhängige
13
Reaktionen auszuschließen, müssen dem Modell fehlende Strukturen hinzugefügt
werden (TSAI et al. 2005).
Die Rolle von Mastzellen in allergischen Atemwegsreaktionen wird häufig in sog.
OVA-Mausmodellen untersucht (KUNG et al. 1995, HOYMANN 2007, REUTER et al.
2010, MARTIN et al. 2014, SAGAR et al. 2015). Bis heute ist Ovalbumin (OVA) das
bedeutendste Allergen in Asthmamodellen (MULLANE und WILLIAMS 2014). Wenn
die Tiere diesem Allergen ausgesetzt werden, entwickeln sie eine
Atemwegsentzündung mit asthma-ähnlichen Symptomen. Es kommt zu zellulären
und pathophysiologischen Veränderungen. Durch die steigende Anzahl von
Entzündungszellen und inflammatorischen Zytokinen entwickelt sich somit eine
bronchiale Hyperreagibilität (BHR) (NIALS und UDDIN 2008).
Allerdings hat dieses Modell seine Schwächen. So wurde beobachtet, dass eine
längere OVA-Exposition zu einer Toleranz im Nager führt. Diese ist je nach Mauslinie
unterschiedlich stark ausgebildet (SHINAGAWA und KOJIMA 2003) und führt in der
Konsequenz zu einer herabgesetzten Atemwegsentzündung (YIAMOUYIANNIS et al.
1999). OVA wird meist intraperitoneal verabreicht, was nicht der natürlichen
Sensibilisierungsroute des Menschen über die Atemwege entspricht (CHAPMAN et
al. 2014). Außerdem gehört es nicht zu den relevanten Allergenen, die beim
allergischen Asthma des Menschen eine Rolle spielen. Aus diesem Grund werden
immer häufiger Allergene mit mehr klinischer Relevanz eingesetzt. Dazu gehört v. a.
das Extrakt von Hausstaubmilben (house dust mites, HDM). 50 - 85 % der
Asthmatiker sind allergisch auf HDM und weisen ein erhöhtes Level an spezifischem
IgE auf (NELSON et al. 1996).
HDM-Extrakt enthält viele Komponenten, die eine Allergie begünstigen können. Dazu
zählen der Kot der Milben, LPS, Chitin und Proteine wie Dermatophagoides
pteronyssinus. Jedem dieser Partikel wird ein Einfluss in die Entwicklung einer
Allergie zugeschrieben (CHAPMAN et al. 2014). Wiederholte Gaben des Allergens
rufen im Tiermodell eine Atemwegsentzündung und Eosinophilie hervor (SAGAR et
al. 2015) und führen schließlich zum Atemwegsremodeling mit einem Anstieg von
mukösen Zellen und verstärkter BHR (JOHNSON et al. 2004). Ein signifikant
14
erhöhter Nachweis von spezifischem HDM-IgE konnte im Nagermodell allerdings
bisher nicht reproduziert werden (BIRRELL et al. 2010).
Die Bedenken über die Aussagekraft dieser Nager-Modelle häufen sich mittlerweile,
da die Tiere nicht die genetische und immunologische Antwort bieten können wie der
Mensch (MESTAS und HUGHES 2004, SEOK et al. 2013, CHAPMAN et al. 2014).
Die Unterschiede zwischen den Spezies sind vielfältig. So entwickeln Nager z. B. in
Gegenwart von Serotonin eine starke Bronchokonstriktion während beim Menschen
das Histamin der Hauptbronchokonstriktor ist (SEEHASE et al. 2011). Nager weisen
zudem nicht nur eine andere anatomische Struktur der Lunge auf (SZELENYI 2000),
sondern besitzen auch viel weniger Mastzellen in den Luftwegen (SAGAR et al.
2015). Gerade im Lungenparenchym weist die menschliche Lunge dagegen eine
Vielzahl von Mastzellen auf (FOX et al. 1981, WARTON et al. 1986, ANDERSSON et
al. 2009).
Darüber hinaus variiert die Atemwegsempfindlichkeit bereits unter den
Mausstämmen erheblich (METCALFE et al. 1997, ISENBERG-FEIG et al. 2003,
SHIN et al. 2009, DE BOER et al. 2014), was mit dem unterschiedlich starken
Mastzellmangel innerhalb verschiedener, genetisch veränderter Mauslinien in
Zusammenhang stehen könnte. Außerdem muss bedacht werden, dass die Mutation
einer jeden Linie anders ist und dementsprechend jeder Mausstamm seine eigenen
physiologischen bzw. pathologischen Eigenheiten aufweist. Dies erschwert die
Aussagekraft, Reproduzierbarkeit aber auch die Vergleichbarkeit der Ergebnisse
erheblich (METCALFE et al. 1997, SIEBENHAAR et al. 2015). Ergebnisse aus
Nager-Modellen lassen sich demnach nicht einfach auf den menschlichen
Organismus übertragen. Damit bleibt es nach wie vor schwierig, die bisher erahnten
Mastzellfunktionen durch entsprechende, experimentelle Beweise zu sichern
(MAURER et al. 2003).
Genetisch modifizierte Tiere gelten als wichtige Modelle für das Aufzeigen einzelner
Reaktionswege. Für komplexe Krankheitsmodelle mit verschiedenen molekularen
und zellulären Reaktionswegen, ist ihr Einsatz kritisch zu hinterfragen (HOLMES et
al. 2011). Da es aber auch weiterhin schwer ist, an geeignetes humanes Zellmaterial
15
zu gelangen, sind dringend neue translationelle Ansätze und Modelle erforderlich
(HOLMES et al. 2011).
Weißbüschelaffen gehören neben den Makaken zu den am besten charakterisierten
nicht-menschlichen Primaten in der biomedizinischen Grundlagenforschung
(MANSFIELD 2003, ORSI et al. 2011). Sie gehören zur Gruppe der Neuweltaffen
und sind im Vergleich zu den Altweltaffen leicht zu halten und zu handhaben.
Darüber hinaus verfügen sie über eine höhere Reproduktionsrate. In ihrer Anatomie,
Physiologie und Immunologie weisen Weißbüschelaffen eine hohe Homologie zum
Menschen auf (SHEARER et al. 1999, KOHU et al. 2008, ORSI et al. 2011,
MORGAN et al. 2013, SHEN et al. 2013).
So konnte bereits gezeigt werden, dass Histamin in der Lunge des Weißbüschelaffen
ein genauso potenter Bronchokonstriktor ist wie beim Menschen (SEEHASE et al.
2011). Auch eine Studie zum nervalen Einfluss auf die Kontraktion der glatten
Atemwegsmuskulatur in verschiedenen Spezies zeigte, dass der Weißbüschelaffe
sich ähnlich verhält wie der Mensch (SPINA et al. 1998). Ein anderer Vergleich von
verschiedenen Tiermodellen für allergisches Asthma, darunter Maus,
Meerschweinchen, Ratte, Kaninchen, Javaneraffe, Stummelschwanzmakake und
Rhesusaffe, ergab außerdem, dass nur die nicht-menschlichen Primaten die
verschiedenen Symptome des menschlichen Asthmas in seiner Gesamtheit imitieren
können (ISENBERG-FEIG et al. 2003). Solche Homologien steigern die
Übertragbarkeit von Ergebnissen auf den menschlichen Organismus erheblich.
Eine Studie zu Mastzellvorläufern bei Weißbüschelaffen (NUNOMURA et al. 2012)
fand heraus, dass die in vitro Kultivierung von CD34+CD117+ Zellen mit SCF Zellen
hervorbringt, die den FcεRI exprimieren und die für Mastzellen typische Granularität
ausbilden.
2.4. PCLS zur ex vivo Untersuchung von Atemwegsreaktionen
Precision-cut lung slices (PCLS) sind vitale Lungenschnitte, die über einen drei-
dimensionalen Zellverband verfügen und eine einheitliche Dicke von etwa 250 µm
besitzen (ROTHEN-RUTISHAUSER et al. 2008, LAMBERMONT et al. 2014). Sie
16
werden aus ganzen Lungen oder Lungenlappen generiert. Dadurch geben sie bereits
den in vivo Status wieder und müssen nicht erst, wie andere Zellkulturen, zum
Zellwachstum angeregt werden (SANDERSON 2011).
PCLS werden mit Hilfe eines Krumdieck Tissue Slicers präpariert (KRUMDIECK et
al. 1980) und wurden bereits für eine Vielzahl verschiedener Spezies etabliert,
darunter Ratte, Maus, Meerschweinchen, Schaf, Weißbüschelaffe, Javaneraffe,
Rhesusaffe, Anubispavian und Mensch (MARTIN et al. 1996, HELD et al. 1999,
WOHLSEN et al. 2001, WOHLSEN et al. 2003, RESSMEYER et al. 2006, SEEHASE
et al. 2011, SCHLEPUTZ et al. 2012, LAMBERMONT et al. 2014). Mit Hilfe von
PCLS können Interaktionen zwischen Zellen studiert und organtypische
physiologische und pathologische Reaktionen untersucht werden (ROTHEN-
RUTISHAUSER et al. 2008).
Die Mehrheit dieser Studien untersucht dabei die funktionelle Atemwegsreaktion.
Neben der Bronchokonstriktion befinden sich aber auch andere Parameter im Fokus
der Messungen, z. B. vaskuläre Reaktionen und mukoziliäre Funktionen
(KUROSAWA et al. 1995, HELD et al. 1999, MORENO et al. 2006, PADDENBERG
et al. 2006). Darüber hinaus werden sie für pharmakologische und toxikologische
Studien verwendet (FISHER et al. 1994, PARRISH et al. 1995, STURTON et al.
2008, NASSIMI et al. 2009). Außerdem dienten PCLS bereits als Infektionsmodelle
für Viren, Bakterien und Pilze (EBSEN et al. 2002, ERPENBECK et al. 2006,
CHAKRABARTY et al. 2007, GORIS et al. 2009, WU et al. 2010).
Je nach Behandlung können die Zellen im Gewebeverband ungefähr eine Woche
lang überleben, wobei jedoch anzunehmen ist, dass in den ersten ein bis drei Tagen
die Funktionalität der Zellen am höchsten ist (SANDERSON 2011). Einer der größten
Vorteile dieser Methode ist die hohe Ausbeute an Schnitten. Mit Hilfe einer einzigen
Lunge können somit verschiedene Behandlungen parallel durchgeführt werden
(SEWALD und BRAUN 2013). PCLS von nur einem Individuum können mit
verschiedenen Substanzen stimuliert und/oder unterschiedlichen Konzentrationen
eines Wirkstoffes behandelt werden. Dadurch bietet diese Methode eine große
Anzahl reproduzierbarer Daten, einen hohen Durchsatz an Untersuchungen und
17
erhöht die Standardisierung durch Reduktion interindividueller Varianzen (ROTHEN-
RUTISHAUSER et al. 2008, SWITALLA et al. 2010).
PCLS schließen damit die Lücke zwischen in vitro und in vivo (HENJAKOVIC et al.
2008 b, HOLMES et al. 2011) und haben einen hohen, voraussagenden Wert für die
Situation im lebenden Organismus (SEWALD und BRAUN 2013). Gemäß dem 3R-
Prinzip verbessern sie damit nicht nur die Qualität von in vivo Studien, sondern
reduzieren auch die Anzahl von Versuchstieren (HENJAKOVIC et al. 2008 a).
18
3. MATERIAL UND METHODEN
3.1. Lungengewebe von nicht-menschlichen Primaten
Für diese Doktorarbeit wurde Lungengewebe von fünf Weißbüschelaffen (Callithrix
jacchus) und vier Javaneraffen (Macaca fascicularis) kultiviert. Alter, Geschlecht und
Nummer der Tiere werden in Tabelle 2 aufgelistet. Die Tiere wurden im Deutschen
Primatenzentrum (DPZ) in Göttingen geboren. Sowohl ihre Betreuung und
Haltungsbedingungen als auch die Eingriffe (Euthanasie) erfüllten deutsche und
europäische Rechtsnormen, darunter die Vorschriften des Tierschutzgesetzes, der
Tierschutzversuchstierverordnung und die Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen
Parlaments und des Rates zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke
verwendeten Tiere. Die Räumlichkeiten der Tiere waren nur über Hygieneschleusen
zu erreichen.
Tab. 2: Auflistung von Tiernummer, Geschlecht und Alter der Tiere. Lungen-gesunde Tiere wurden aufgrund von nicht-infektiösen, tierschutzrelevanten
Aspekten (z. B. Trauma) euthanasiert. Die Weißbüschelaffen wurden zunächst in
eine tiefe Narkose (Ketamin (100 mg/kg), Xylazin (10%ig) und Atropin (1%ig) in Aqua
ad injectionem) gelegt und anschließend durch i.p.-Injektion von Pentobarbital (100
mg/kg; Narcoren®, Merial GmbH, Hallbergmoos, Deutschland) euthanasiert. Die
Euthanasie der Javaneraffen erfolgte durch eine i.v.-Überdosis von Pentobarbital.
Die Organentnahme fand ausschließlich während der post mortem Untersuchung
statt.
Spezies Tiernummer Geschlecht Alter (Jahre) Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus)
12765 12002 14460 15320 15394
männlich weiblich männlich männlich weiblich
8 9 3 2 1
Javaneraffe (Macaca fascicularis)
12400 12466 13376 14173
männlich männlich männlich männlich
8 8 6 4
19
3.2. Präparation der PCLS
Die Lungen wurden steril aus der Körperhöhle entnommen und mit einer
vorgewärmten Agarose-Medium-Mischung gefüllt solange das Gewebe noch
Körpertemperatur hatte. Dafür wurde über die Trachea eine Knopfkanüle bis zur
Bifurcatio tracheae eingeführt (Abb. 2) und mit einem Faden fixiert. Im Verhältnis 1:1
wurden jeweils 37°C warme Agarose (Low gelling agarose; Sigma-Aldrich, München,
Deutschland) und Minimum Essential Medium Eagle (MEM, angereichert mit 25 mM
HEPES; Sigma-Aldrich, München, Deutschland) vermischt. Die Flüssigkeit wurde mit
Hilfe einer sterilen 50 ml Luer-Lock Einmalspritze (Sarstedt AG & Co., Nümbrecht,
Deutschland) aufgezogen. Die Spritze wurde dann über ihren Luer-Lock-Verschluss
am Ansatz der Kanüle befestigt. Um das Lungengewebe nicht durch zu hohen Druck
zu schädigen, wurde die Flüssigkeit behutsam über die Trachea in die Atemwege
injiziert (Abb. 3, 4). Ein Volumen von ungefähr 50 ml der Agarose-Medium-Mischung
passte in die Lunge eines Weißbüschelaffen. Je nach Geschlecht und Alter des
Javaneraffen fasste dessen Lunge ein Flüssigkeitsvolumen von 600 bis 1000 ml. Die
Lunge war ausreichend gut gefüllt, wenn sie eine pralle und feste Konsistenz
angenommen hatte. Das Gewebe wurde dann auf Eis gelegt. Bis die Agarose
ausgehärtet war, verblieb die Kanüle mit aufgesetzter Spritze in der Trachea um den
Druck aufrechtzuerhalten und ein Zurücklaufen der noch flüssigen Agarose zu
verhindern. Je nach Menge des applizierten Volumens dauerte es 20 bis 60 Minuten
bis die Flüssigkeit zum Gel ausgehärtet war. Danach wurden die Lungenlappen
separiert und mit einem Skalpell in jeweils 1 cm dicke Scheiben geschnitten. Die
Schnittrichtung war dabei so zu wählen, dass die Atemwege im Querschnitt getroffen
wurden (Abb. 5). Mit Hilfe des Akku-Schraubers IXO (Robert Bosch GmbH,
Gerlingen-Schillerhöhe, Deutschland) und einer zylindrischen Metallröhre (Ø 0,8 cm)
als Aufsatz wurden die Bronchien der Länge nach ausgestanzt. Die entstandenen
Gewebestücke wurden in die zylindrische Vorrichtung eines Krumdieck Tissue
Slicers (Alabama Research and Development, Munford, USA) verbracht. Durch
einen Aufsatz wurde das Gewebe von oben beschwert, während darunter
gleichzeitig eine schneidene Klinge hin und her wanderte. So entstanden 250 µm
dünne Lungenschnitte, die sog. PCLS (Abb. 6).
20
Abb. 2: Das Einführen einer Knopfkanüle in die Luftröhre einer Weißbüschelaffenlunge bis zur Bifurcatio tracheae.
Abb. 3: Lungenfüllung mit einer warmen Agarose-Medium-Mischung.
21
Abb. 4. Eine mit Agarose und Medium vollständig gefüllte Lunge eines Weißbüschelaffen.
Abb. 5. Lunge mit Bronchien (Pfeil) eines Weißbüschelaffen im Queranschnitt.
22
Der Slicer war mit 4°C kalter Salzlösung (EBSS; Sigma-Aldrich, München,
Deutschland) gefüllt, wodurch angefertigte PCLS frei im Gerät schwimmen konnten.
Das Einsammeln der PCLS geschah entweder durch Ablassen und Sieben (Zellsieb;
VWR International GmbH, Hannover, Deutschland) der Flüssigkeit oder durch
separates Einfangen der Schnitte mit Hilfe einer Öse (VWR International GmbH,
Hannover, Deutschland). Unter Verwendung der Öse wurden die PCLS in eine 6-
Well-Platte (VWR International GmbH, Hannover, Deutschland) verbracht. Die Platte
war gefüllt mit Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12
mit L-Glutamin und 15 mM HEPES; Life Technologies GmbH, Darmstadt,
Deutschland), welche mit einer 1%-igen Penicillin-Streptomycin-Mischung (Biozym,
Hessisch Oldendorf, Deutschland) angereichert war. Diese Platte ruhte dann für 30
Minuten unter Zellkulturbedingungen (37°C, 5% CO2, 100% Luftfeuchtigkeit) im
Inkubator. Um die Agarose vollständig aus den Atemwegen zu entfernen, wurden im
Abstand von jeweils 30 Minuten die Schnitte dreimal gewaschen. Dafür wurde
bestehendes Medium entfernt und neues DMEM/F-12 (37°C) hinzugefügt. Für die
folgenden Behandlungen wurden jeweils PCLS-Duplikate verwendet.
Abb. 6: Vier Weißbüschelaffen-PCLS mit quer angeschnittenen Atemwegen.
23
3.3. Passive Sensibilisierung der PCLS
Für die passive Sensibilisierung wurden nur PCLS verwendet, die intakt waren, einen
einheitlichen Durchmesser von 8 mm besaßen, mit vollständig erhaltenen, quer
angeschnittenen Atemwegen ausgestattet waren und einen sichtbaren Zilienschlag
zeigten. Auf einer 24-Well-Platte (VWR International GmbH, Hannover, Deutschland)
wurde jede Vertiefung mit 495 µl DMEM/F-12 (37°C) aufgefüllt. Die Lungenschnitte
wurden mit Hilfe einer Öse auf der Platte separiert (1 PCLS/ Well). Anschließend
wurde zu den PCLS entweder 5 µl menschliches Allergikerplasma (= passiv
sensibilsierte PCLS) oder 5 µl menschliches Nicht-Allergikerplasma (= passiv nicht-
sensibilsierte PCLS) hinzupipettiert (PlasmaLab International, Everett, USA). Das
Allergikerplasma enthielt spezifisches Hausstaubmilben (HDM)-IgE der CAP-Klasse
6, wohingegen das Nicht-Allergikerplasma mit weniger als 0,1 kU/l HDM-IgE zur
Klasse 0 gehörte (Tab. 2). Die PCLS wurden unter Zellkulturbedingungen für 10
Stunden inkubiert. Danach wurde jeder Schnitt erneut mit 37°C warmen DMEM/F-12
gewaschen.
Tab. 2: Einteilung der Plasmen nach CAP-Klassen nach der Allergiediagnostik mit ImmunoCAP® durch das PlasmaLab International, Everett, USA.
Spezifische IgE-Klasse
Konzentration an spezifischem HDM-IgE [kU/l]
Beurteilung
6 > 100 Sehr stark positiv
5 50 – 100 Sehr stark positiv
4 17,5 – 50 Stark positiv
3 3,5 – 17,5 Positiv
2 0,7 – 3,5 Schwach positiv
1 0,35 – 0,7 Grenzwertig positiv
0 < 0,35 Negativ
24
3.4. Pharmakologische Behandlungen von passiv sensibilisierten PCLS
3.4.1. Cetirizindihydrochlorid Passiv sensibilisierte PCLS Duplikate von zwei Weißbüschelaffen wurden in neue
Vertiefungen einer 24-Well-Platte, die jeweils mit 1000 µl DMEM/F-12 (37°C) gefüllt
waren, überführt. Zu jedem Lungenschnitt wurde 1 µl des H1-Rezeptor Antagonisten
Cetirizindihydrochlorid (0,1 mol/l; Sigma-Aldrich, München, Deutschland)
dazupipettiert. Die PCLS wurden daraufhin für 20 Minuten in den Inkubator gestellt
und final mit 37°C warmen DMEM/F-12 gewaschen.
3.4.2. DARPins
Für die Behandlung mit den DARPins (Tab. 3) (mit bestem Dank an Dr. A. Eggel,
Universitätsspital Bern, Schweiz) wurden jeweils sechs passiv sensibilsierte PCLS-
Duplikate von drei Weißbüschelaffen und den vier Javaneraffen selektiert.
Tab. 3: Eigenschaften des DARPin bi53_79 und des DARPin bi53_86.
Das erste PCLS-Duplikat einer jeden Spezies wurde mit 0,05 µM des anti-IgE
DARPins behandelt. Dafür wurden 0,6 µl des bi53_79 in 4000 µl DMEM/F-12 gelöst
und in gleichen Teilen auf die beiden PCLS verteilt. Für das zweite Duplikat wurden
1,5 µl bi53_79 in 1000 µl DMEM/F-12 (= 0,5 µM) angesetzt und anschließend auf die
PCLS verteilt. Für die dritte Konzentration von 5 µM wurden 7,5 µl bi53_79 in 500 µl
DMEM/F-12 gemischt und in gleichen Teilen auf die Schnitte pipettiert.
Die jeweils verbleibenden drei Duplikate wurden im Kontroll-DARPin inkubiert. Für
eine Konzentration von 0,05 µM wurden 0,6 µl bi53_86 in 1000 µl DMEM/F-12 gelöst
und auf die PCLS des vierten Duplikats verteilt. 6,4 µl bi53_86 wurden zu 1000 µl
DMEM/F-12 hinzupipettiert (= 0,5 µM) und anschließend gleichermaßen auf die
DARPin Anti-IgE Verhalten Konzentration [mg/ml]
Molare Masse [Da]
bi53_79 Disruptiver anti-IgE DARPin 10,6 32000
bi53_86 Nicht-disruptiver anti-IgE DARPin (Kontroll-DARPin) 2,5 32000
25
PCLS des fünften Duplikats gegeben. Auf das sechste PCLS-Duplikat wurden
insgesamt 500 µl DMEM/F-12 mit 32 µl bi53_86 verteilt, was einer Konzentration von
5 µM Kontroll-DARPin entspricht.
Die PCLS wurden für zwei Stunden in den Inkubator gestellt. Danach wurde der
Überstand abpipettiert und durch neues, 37°C warmes DMEM/F-12 ersetzt.
3.5. Allergenprovokation der PCLS
Eine neue 24-Well-Platte wurde unter dem Stereomikroskop SteREO Discovery.V8
(Zeiss, Jena, Deutschland) positioniert. Dessen Unterlage wurde über das
Temperaturregelgerät Tempcontrol 37-2 digital (Pecon, Erbach, Deutschland) auf
37°C erwärmt. Für jede Messung wurde eine neue Vertiefung der Well-Platte mit 495
µl DMEM/F-12 gefüllt. Darin wurde mit einem dünnen Netz aus Nylondraht ein PCLS
am Boden fixiert. Der Atemweg wurde durch das Stereomikroskop fokussiert und mit
Hilfe der AxioCam Kamera (Zeiss, Jena, Deutschland) und der bildgebenden
Software AxioVision (Zeiss, Jena, Deutschland) auf dem Computerbildschirm
visualisiert (Abb. 7).
Vor der Allergenstimulation wurde ein initiales Foto des Bronchus geschossen.
Anschließend wurden 5 µl standartisiertes HDM-Extrakt (Dermatophagoides
pteronyssinus) (Greer, Lenoir, USA) in den Überstand pipettiert und über einen
Zeitraum von 20 Minuten in 20-Sekunden-Intervallen weitere Fotos aufgenommen.
Diese Messung soll die Reaktion des Bronchus auf die Allergengabe dokumentieren.
Durch die Nutzung von Bronchienquerschnitten können somit je nach Inkubations-
und Behandlungssituation Bronchokonstriktionen aufgezeichnet werden oder nicht.
Das Ausmaß dieser Kontraktion wird über die seriellen Photoaufnahmen erfasst und
kann daraufhin quantitativ ausgewertet werden.
3.6. Analyse der Atemwegsreaktion
Die Fotos einer 20-minütigen Aufnahme wurden mit der Software ImageJ (National
Institute of Health, Bethesda, USA) ausgewertet. Die innere Atemwegsfläche wurde
jeweils markiert und berechnet. Die Fläche im ersten Foto entsprach der initialen
26
Atemwegsfläche (=100 %) und diente den Atemwegsflächen der folgenden
Aufnahmen als Referenz.
Abb. 7: Atemweg eines Weißbüschelaffen, fokussiert durch ein Stereomikroskop.
3.7. Analyse der Histaminausschüttung
Nach jeder 20-minütigen Messung wurde der PCLS-Überstand in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und zunächst bei -80°C aufbewahrt. Um das Histamin in den
Überständen anschließend zu detektieren, wurden diese wieder aufgetaut und mit
Hilfe eines Histamin ELISAs für Zellkulturen (Demeditec Diagnostics GmbH, Kiel,
Deutschland) untersucht. Der ELISA wurde nach der Anleitung des Herstellers
durchgeführt.
27
3.8. Vitalitätstests
Um die Funktionalität der PCLS sicherzustellen, wurde nach 10-stündiger
Plasmainkubation (siehe 3.3.) der Gehalt an Laktatdehydrogenase (LDH) im
Überstand gemessen. Dieses Enzym hat sich für den Vitalitätsnachweis in PCLS von
nicht-menschlichen Primaten bereits als zuverlässig erwiesen (SEEHASE et al.
2011). Es wurden 100 µl von jedem PCLS-Überstand abpipettiert und für den
Cytotoxicity Detection Kit (Roche, Mannheim, Deutschland) verwendet. Der Test
wurde nach Gebrauchsanleitung durchgeführt. Als Referenz für die höchstmögliche
LDH-Ausschüttung (=100 % tote Zellen) wurde Triton X-100 (Sigma-Aldrich,
München, Deutschland) zu 1 % in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS; Lonza,
Verviers, Belgium) verdünnt und auf einen Lungenschnitt pipettiert.
Als weiterer Vitalitätsnachweis diente ein sichtbarer Zilienschlag der PCLS.
3.9. Statistik
Die statistische und grafische Auswertung wurde mit Hilfe von GraphPad Prism 6
(GraphPad Software, Inc., La Jolla, USA) durchgeführt. Der Shapiro-Wilk-Test wurde
angewandt, um die Normalverteilung der Werte zu überprüfen. Wenn die Daten
normalverteilt waren, wurden sensibilisierte und nicht-sensibilisierte PCLS einer
Spezies mit Hilfe des gepaarten t Tests verglichen. Ansonsten wurden die beiden
Gruppen über den Wilcoxon-Test analysiert. P-Werte ≤ 0,05 galten als signifikant.
Wenn möglich, wurden individuelle Dosis-Wirkungs-Kurven durch nichtlineare
Regressionsanalysen (drei Parameter) erstellt. Die Daten wurden als mean ± SEM
oder median ± range angegeben.
28
4. ERGEBNISSE
Die Ergebnisse der durchgeführten Untersuchungen werden im folgenden
Manuskript ausführlich dargestellt. Das Manuskript entspricht in dieser Form nicht
der Endfassung, wird jedoch noch fertiggestellt und anschließend publiziert.
Anti-IgE DARPin prevents EAR and histamine release in non-human primate and human lung tissue
Judy Wichmann2, Sharon Jiménez Delgado1, Elaine Cabral Serrão1,2, Christoph
Curths1,2, Anne Schmitt2, Sarah Dunker1, Danny Jonigk3, Peter Braubach3, Armin
Braun1, Franz-Josef Kaup2, **, Franziska Dahlmann1,2, Alexander Eggel4, Katherina
Sewald1,*, Sascha Knauf2,*
1 Fraunhofer Institute for Toxicology and Experimental Medicine; Member of the
German Center for Lung Research (DZL), Biomedical Research in Endstage and
Obstructive Lung Disease (BREATH) research network, Member of the Cluster of
Excellence Regenerative Biology to Reconstructive Therapy (REBIRTH), Hannover,
Germany, 2 German Primate Center, Leibniz-Institute for Primate Research,
Goettingen, Germany, 3 Hannover Medical School, Hannover, Germany, 4 Department
of Rheumatology, Immunology and Allergology, University Hospital Bern, Bern,
Switzerland, * Contributed equally
** Corresponding author: Prof. Dr. F.-J. Kaup, Pathology Unit, German Primate
Center, Kellnerweg 4, 37077 Goettingen, Germany. Phone: +49 551 3851 241, Fax:
+49 551 3851 442, E-mail: [email protected]
Abstract
Increasing amounts of asthma patients and their unsatisfying medical care
emphasize the urgent need of new pharmaceuticals. The new disruptive anti-IgE
Designed Ankyrin Repeat Protein (DARPin) bi53_79 was designed to dissociate
existing IgE:FcεRI complexes.
29
To test efficacy of the novel anti-IgE compound we used an allergen-sensitive ex vivo
lung model of humans and non-human primates (NHP) that mimics early airway
reaction (EAR). The efficacy was analyzed by concentration-dependent changes in
allergen-mediated histamine release and bronchoconstriction. Treatment with
cetirizine, an antihistamine, was included as an additional control.
Precision-cut lung slices (PCLS) of humans (H. sapiens), common marmosets (C.
jacchus) as well as cynomolgus macaques (M. fascicularis) were passively sensitized
with human plasma containing IgE directed against house dust mite (HDM) allergen.
Controls were incubated in non-allergic human plasma. Subsequently, PCLS
incubated in allergic plasma were treated with different concentrations of the anti-IgE
DARPin bi53_79, the ineffective DARPin bi53_86 or cetirizine dihydrochloride.
Subsequently, PCLS were challenged with HDM, whereupon cross airway sections
were recorded for 20 minutes and supernatants were analyzed for histamine content.
EAR was exclusively present in HDM challenged PCLS that were incubated in non-
allergic plasma and in passively sensitized PCLS when treated with the control
DARPin. A treatment with DARPin bi53_79 prevented EAR at a concentration of
0.5 µM in marmosets and 5 µM in cynomolgus macaques and humans. Rising
concentrations of DARPin bi53_79 caused stepwise decrease in histamine release
and bronchoconstriction in cynomolgus and human PCLS. Cetirizine dihydrochloride
did not influence histamine release, but inhibited bronchoconstriction in sensitized
and allergen challenged marmoset PCLS.
In this study, we describe a functional 3D lung tissue model imitating human allergic
asthma conditions. Due to the usage of human IgE, the inhibitory effect of bi53_79
could be shown in each species (human, marmoset, and cynomolgus monkey),
though the human situation was best reflected in cynomolgus macaque PCLS.
Key words
Asthma, PCLS, DARPin, IgE, non-human primates, human, mast cells, efficacy
testing
30
Introduction
The amount of patients with allergic diseases has increased constantly over the past
decades worldwide. According to The Global Asthma Report 2014, 334 million
people suffer from asthma (1). The atopic type of this obstructive lung disease is
characterized by the predisposition to develop an excessive immune response
against an allergen. Briefly, increased levels of allergen specific immunoglobulin E
(IgE) attach to the high-affinity receptor FcεRI on lung resident mast cells.
Subsequently, activation of mast cells is induced by allergen dependent cross-
linkage of bound IgE, followed by degranulation and release of histamine (H).
Histamine binds to the H1-receptor on smooth muscle cells, which induces
immediate bronchoconstriction defined as early airway reaction (EAR) (2, 3).
In particular, patients with severe and uncontrolled types of asthma need effective
treatment options (4). Current therapy is mainly based on inhaled ß2-adrenoceptor
agonists and the use of unspecific glucocorticoids that mostly alleviate the symptoms
of an allergic reaction instead of targeting the underlying pathogenic mechanism (5).
New therapeutic approaches seek to prevent allergen-induced mast cell stimulation
through inactivation of IgE. Omalizumab (Xolair®) is the only approved and
commercially available anti-IgE drug, but it targets only non receptor-bound IgE and
is associated with high costs (6, 7). Its use is furthermore restricted to the treatment
of moderate-to-severe extrinsic asthma and ineffective to approximately one third of
patients (8, 9). In contrast, the novel disruptive IgE inhibitor E2_79, a designed
ankyrin repeat protein (DARPin), was found to bind with high specificity to free
human IgE and dissociates existing IgE:FcεRI complexes on basophils (10). In a
humanized FcεRI transgenic mice model, both DARPin E2_79 as well as the more
potent biparatopic DARPin bi53_79 were able to inhibit allergic skin reaction after
stimulation of passively sensitized cutaneous mast cells in vivo (11).
Precision-Cut Lung Slices (PCLS) are a well-established method with a high
predictive value for the in vivo situation (12). Lung tissue stays viable and maintains
functionality for up to three days (12, 13). In addition, standardization is increased
through reduction of inter-individual variance and it allows direct comparison of
31
multiple species within one study (14). Seehase et al. showed for example the
efficacy of bronchoconstrictors in a multi-species PCLS study and that histamine
induces airway constriction in lung tissue of humans and non-human primates (NHP),
while serotonin lead to airway constriction merely in rodents (15). In this study, we
tested the efficacy of the anti-IgE inhibitor DARPin bi53_79 to prevent EAR in
passively sensitized PCLS. Therefore, we performed a multi-species ex vivo study
with the objective to establish a highly predictive translational preclinical model to test
human specific therapeutics and to reduce animal numbers that are used for in vivo
experiments. It was hypothesized that DARPin bi53_79 is able to bind free and
receptor-bound human IgE in PCLS of human and different NHP species.
Materials and Methods
Humans
The study involved human lung tissue from six donors. The tissue was obtained from
cancer patients that passed through lung tumor resection. Approval for the use of
human lung tissue was obtained from the ethics committee of the Hannover Medical
School, Germany. Experiments comply with The Code of Ethics of the World Medical
Association (Declaration of Helsinki) for experiments involving humans. The privacy
rights of human subjects were observed and written consent was obtained from all
patients. Personal data were not recorded to protect anonymity.
Human allergic plasma consisted of ImmunoCAP specific HDM-IgE > 100 kU/L and
was graded into the specific IgE class 6. Human plasma of a non-allergic donor was
classified into specific IgE class 0 because of an ImmunoCAP specific HDM-IgE <
0.10 kU/L (PlasmaLab International, Everett, USA).
Animals
NHP lungs were obtained from the German Primate Center (Goettingen, Germany).
Marmoset (Callithrix jacchus) tissue originated from three male and two female, aged
between one and nine years. The four male cynomolgus monkeys (Macaca
fascicularis) were four, six or eight years old. Care and housing conditions fulfilled
32
national and European guidelines of the German Animal Welfare Act (§§7-
9/TierSchG/7833-3) and the European Parliament and European Council Directive
on the protection of animals used for scientific purposes (2010/63/EU). According to
the EU guideline 2010/63/EU, NHP were euthanized by an anesthetic overdose with
pentobarbital sodium (Narcoren®, Merial GmbH, Hallbergmoos, Germany). Prior to
this, marmosets were anesthetized deeply with Ketamine (Ketavet®, Zoetis
Deutschland GmbH, Berlin, Deutschland).
The selection of animals was randomized and not subjected to specific conditions
with the exception of excluded lung diseases.
Preparation of PCLS
NHP lungs were exsomatized under sterile conditions and inflated with a pre-warmed
agarose-medium-mixture. This procedure was performed as long as tissue had body
temperature to avoid premature gelling in the upper airways before distribution into
distal regions. A buttoned cannula was inserted into trachea till bifurcation and fixed
with sterile thread (marmoset) or vascular clamps (cynomolgus) (Henry Schein VET
GmbH, Hamburg, Germany). 37°C warm Minimum Essential Medium Eagle (MEM)
with 25 mM HEPES and 37°C warm low gelling agarose (diluted in distilled water to
3%) were mixed in a ratio 1:1 (Sigma-Aldrich, Munich, Germany). The liquid was
filled into a 50 ml luer lock disposable syringe (Sarstedt AG & Co., Nümbrecht,
Germany) that was subsequently fixed on the cannula over its lock. To avoid tissue
damage, liquid was injected with gentle pressure. A marmoset lung took a volume of
almost 50 ml. Depending on sex and age, the amount of liquid filled into a
cynomolgus lung ranged between 600 and 1000 ml. Lungs were put on ice. To
maintain the pressure used for injection, syringe as well as cannula remained fixed
until the agarose was stiffened. Otherwise, the liquid agarose-medium-mixture would
flow out backwards and lung rigidity that is necessary for slicing would be reduced.
As human lung tissue was obtained as surgical resection, the partial lobe did not
possess a trachea. Therefore, agarose was segmentally entered into human tumor-
free lung tissue via cannulation of various bronchi.
33
Dependent on the quantity of injected liquid, the time needed for gelling varied from
20 to 60 minutes. Soon after the agarose had solidified, lung tissue was sliced into
equal parts perpendicularly to the airways. Respiratory ducts were punched out
lengthwise utilizing a cylindrical metal tube (diameter 0.8 mm). Tissue sections were
than used to generate approximately 250 µm thin PCLS using the Krumdieck tissue
slicer (Alabama Research and Development, Munford, AL, USA) according to the
manufacture’s guidance. The device’s collection chamber was filled with Earle’s
Balanced Salts (Sigma-Aldrich, Munich, Germany). PCLS were then stored under
cell culture conditions (37°C, 5% CO2 and 100% air humidity). As the study involved
watching cilia activity and airway modifications, agarose would be a resistance to
bronchoconstriction or cilia movement. Therefore, PCLS were washed three times in
30 min intervals with 37°C warm Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture
F-12 with L-glutamine and 15 mM HEPES (DMEM/F-12) (Life Technologies GmbH,
Darmstadt, Germany) supplemented with 1% penicillin-streptomycin mixture
(Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany). For each kind of treatment, PCLS
duplicates were used.
Passive sensitization of PCLS
Only PCLS with intact cross airway sections and visible beating cilia movement were
selected for further experiments. Each lung slice was separated in a 24-well plate
(VWR International GmbH, Hannover, Germany) filled with 495 µl DMEM/F-12 per
well and supplemented with 5 µl human plasma of an allergic donor (= sensitized
PCLS). One human, marmoset as well as cynomolgus PCLS duplicate was
designated as non-sensitized PCLS and therefore incubated in 5 µl human plasma of
a non-allergic donor. PCLS were stored under cell culture conditions for ten hours.
After this incubation phase, each slice was put into new 37°C warm 500 µl DMEM/F-
12.
DARPin treatment of passively sensitized PCLS
Six sensitized PCLS duplicates of each species were chosen for the treatment with
anti-IgE DARPin bi53_79 and negative control DARPin bi53_86. PCLS were put
34
separately into new 37°C warm DMEM/F-12. Marmoset and cynomolgus PCLS were
treated with 0.05 µM of the anti-IgE DARPin as well as two more duplicates were
treated with 0.5 µM and 5 µM of bi53_79, respectively. The remaining three
duplicates were supplemented with 0.05 µM, 0.5 µM, or 5 µM of the control DARPin
bi53_86. The procedure was repeated with human PCLS using the concentrations
0.5 µM, 5 µM, and 50 µM. After an incubation of two hours, PCLS were washed once
again with new 37°C warm 500 µl DMEM/F-12.
Antihistamine treatment of passively sensitized PCLS
Sensitized marmoset (n=2) PCLS placed in pre-warmed DMEM/F-12 were incubated
in 100 µM of the H1-receptor antagonist cetirizine dihydrochloride (Sigma-Aldrich,
Munich, Germany) for 20 minutes. After this treatment, the liquid was replaced with
new 37°C warm DMEM/F-12.
Allergen challenge of PCLS
Single PCLS were placed into a cavity of a new 24-well plate filled with 495 µl of
DMEM/F-12. In order to keep PCLS from floating, tissue material was fixed on the
ground with a mesh of fine nylon threads attached to a platinum wire (SHD-42/15
with Ø 10.5 mm, Warner Instruments, Hamden, USA). The airway was focused
utilizing a stereo microscope (SteREO Discovery.V8) connected to a camera
(AxioCam) that enabled visualization on screen via an imaging software (AxioVision;
Carl Zeiss). To define the initial airway area, a photo of the airway was taken. After
addition of 5 µl standardized HDM extract (D. pteronyssinus) (Greer, Lenoir, USA),
the measurement was started by continuous photo shooting of the airway area in 20-
second-intervalls for 20 minutes.
Analysis of airway response
Recorded pictures were analyzed using the open source ImageJ software (National
Institute of Health, Bethesda, USA) that enabled assessment of the inner airway
surface. Airway area before addition of the allergen was defined as 100%.
35
Bronchoconstriction was expressed as percentage decrease in airway area in
comparison to initial airway area.
Analysis of histamine release
After each measurement, supernatants were frozen in liquid nitrogen and stored at
-80°C until further analysis. For histamine detection, samples were thawed and a
Histamine Cell culture ELISA (Demeditec Diagnostics GmbH, Kiel, Germany) was
carried out according to the manufacturer’s instructions. The ELISA is intended to
determine quantities of histamine in urine, cell cultures and whole blood samples
independent of which species is chosen.
Viability of PCLS
PCLS viability was assessed utilizing the Cytotoxicity Detection Kit (Roche,
Mannheim, Germany). The assay quantified cell death by measuring lactate
dehydrogenase (LDH) released from the cytosol of damaged cells into the
supernatants of 10 hours plasma incubated tissue slices. According to the
manufacturer, the kit is designed for many different in vitro cell systems when
damage to the plasma membrane occurs and is not restricted to specific species. In
this study, the assay was executed according to the manufacturer’s instructions
including the use of DMEM/F-12 as background control and DMEM/F-12
supplemented with HDM as low control. For high control, Triton X-100 (Sigma-
Aldrich, Munich, Germany) was diluted to 1% with Phosphate Buffered Saline
(Lonza, Verviers, Belgium) containing 0.1 M sodium phosphate and 0.15 M NaCl,
without Ca2+ and Mg2+ and used for PCLS (n=1/species) incubation. LDH activity
measured in the supernatant was the reference for maximum LDH release.
PCLS were visually assessed for cilia movement shortly before passive sensitization
and a second time before allergen challenge.
36
Statistics
Differently treated groups were analyzed with GraphPad Prism 6 (GraphPad
Software, Inc., La Jolla, USA). A Shapiro-Wilk test was used to examine normal
distribution. When data were normally distributed, intraspecies sensitized and non-
sensitized PCLS were compared by paired t test. Otherwise, differences were
analyzed via Wilcoxon test. P-values ≤ 0.05 were defined as significant. If possible,
individual dose-response curves were generated by non-linear three-parameter
regression. Data were expressed as means ± SEM or medians as indicated.
Results
Allergen challenge of passively sensitized PCLS induces EAR
PCLS incubated in human allergic plasma showed bronchoconstriction after HDM
challenge. The loss of initial airway area accounted for 68.1±8.0% in human [Fig. 2a],
29.3±7.9% in cynomolgus [Fig. 2b], and 31.1±6.2% in marmoset [Figs. 1+2c] PCLS
(mean±SEM). Human PCLS remain contracted until the end of the 20-min-
measurement [Fig. 2a]. The airway smooth muscle in cynomolgus PCLS also
remained constricted for about seven minutes but recovered slowly to initial airway
area [Fig. 2b]. Following fast airway constriction, bronchi of marmoset PCLS rapidly
reached baseline airway area within the 20 minutes record [Fig. 2c].
Allergen challenged PCLS incubated in human non-allergic plasma did not show
bronchoconstriction [Fig. 2]. After HDM treatment, reduction of airway area in
sensitized PCLS was significantly higher when compared to non-sensitized PCLS of
the same species (P=0.0041 for human (n=3); P=0.0087 for cynomolgus macaque
(n=4); P=0.0012 for common marmoset (n=5); Paired t test) [Fig. 2]. Furthermore, 20
min after HDM exposure, supernatants of passively sensitized PCLS contained
higher histamine levels (human: 30.8±18.0 ng/ml; cynomolgus: 22.4±5.6 ng/ml;
marmoset: 5.2±1.5 ng/ml) compared to their non-sensitized counterparts (human:
2.2±0.6 ng/ml; cynomolgus: 4.5±1.7 ng/mL, P=0.0236; marmoset: 1.9±0.4 ng/mL;
mean±SEM; human: n=3; cynomolgus: n=4; marmoset: n=5) [Fig. 3].
37
Cetirizine dihydrochloride prevents bronchoconstriction
Marmoset PCLS that were incubated in allergic human plasma and then treated with
cetirizine showed histamine levels of 6.7 [3.9 to 9.4] ng/mL (median [range]; n=2)
[Fig. 4b]. However, no bronchoconstriction was observed [Fig. 4a].
The anti-IgE DARPin bi53_79 inhibits both histamine release and bronchoconstriction
Passively sensitized human PCLS treated with rising concentrations of bi53_79
showed a remarkable decrease in histamine release. The detection of 30.8±18.0 ng
histamine per ml in sensitized and allergen-challenged human PCLS [Fig. 3a] was
reduced to 2.3±0.9 ng/ml with an anti-IgE DARPin concentration of 0.5 µM
(mean±SEM; n=3) [Fig. 5a]. With further increasing concentrations the histamine
level decreased to 1.7±0.9 ng/ml at 5 µM and to 0.5±0.3 ng/ml at 50 µM of bi53_79
(mean±SEM; n=3) [Fig. 5a]. Allergen-dependent bronchoconstriction in passively
sensitized human PCLS [Fig. 2a] was extenuated by an inhibitor dose of 0.5 µM
DARPin bi53_79 [Fig. 5b] and was completely prevented at concentrations ≥5 µM
[Fig. 5c+d]. Differences in airway response were significant between the treatment
groups of bi53_79 and bi53_86 (P=0.0465 at 5 µM; P=0.0232 at 50 µM; Paired t test;
n=3) [Fig. 5b-d].
A concentration of 0.05 µM anti-IgE DARPin did not influence HDM-induced
histamine release (19.6±3.9 ng/mL; mean±SEM; n=4) [Fig. 6a] and
bronchoconstriction [Fig. 6b] in sensitized cynomolgus PCLS. 0.5 µM of the anti-IgE
inhibitor reduced histamine release to 6.5±0.6 ng/mL (mean±SEM; n=4) [Fig. 6a] and
attenuated bronchoconstriction by half [Fig. 6c]. A complete prevention of
bronchoconstriction [Fig. 6d] was achieved by a dose of 5 µM bi53_79. Compared
with data of sensitized and allergen-challenged cynomolgus PCLS being treated with
the control DARPin bi53_86, the concentration of 5 µM anti-IgE DARPin bi53_79
caused a significant decrease in histamine release (DARPin bi53_86: 21.4±4.0
ng/mL; DARPin bi53_79: 4.4±0.9 ng/mL; P=0.014; Paired t test; mean±SEM; n=4)
[Fig. 6a]. Thus, cynomolgus monkey PCLS being passively sensitized and incubated
with increasing concentration of the anti-IgE inhibitor DARPin bi53_79 showed
38
recessive histamine release as well as stepwise decrease of bronchoconstriction
after allergen challenge.
An anti-IgE DARPin treatment of passively sensitized marmoset PCLS lowered
allergen-induced histamine release to 2.5±0.5 ng/ml when using a concentration of
0.05 µM (mean±SEM; n=3) [Fig. 7a]. Treatment with 0.5 µM of the anti-IgE DARPin
resulted in a maximal histamine reduction of 1.7±0.1 ng/ml (mean±SEM; n=3) [Fig.
7a] that also prevented bronchoconstriction [Fig. 7c].
DARPin bi53_86 could not prevent EAR in any species tested in this study [Figs. 4-
6].
Discussion
NHP PCLS as translational model for EAR
Many human antibodies react with analog antigens of NHPs. For example, studies
proofed cross-reactivity between human antibodies and surface receptors on
leucocytes of common marmosets (16, 17). More than 300 anti-human monoclonal
antibodies were tested in regard to their cross-reactivity with different antigens of
cynomolgus monkeys. About 68% of these antibodies directed against human
antigens of CD-defined molecules, chemokine receptors, and T cell receptors bound
to corresponding NHP antigens (18). Furthermore, cynomolgus IgE proofed a similar
affinity of binding humanized anti-human IgE antibody and human FcεRI-IgG as
human IgE did (19). Based on these findings, we assumed that FcεRI on NHP PCLS-
resident mast cells linked human IgE originated from allergic human plasma.
After allergen challenge, passively sensitized PCLS showed bronchoconstriction
within the first ten minutes. These findings correlate with IgE-dependent histamine
release, which is described to reach its maximum 5 – 7 minutes post-allergen
challenge (20, 21). Like bronchoalveolar lavage of patients with allergic asthma
consists of increased histamine levels (22, 23), we detected higher histamine
quantities in supernatants of sensitized and HDM-provoked PCLS. This indicates a
successful passive sensitization through plasma incubation and an effective allergen
depended mast cell activation. Intraspecies release of histamine corresponded with
39
intensity of bronchoconstriction. That means, the lowest release of histamine found in
marmoset PCLS supernatants was confirmed through the weakest
bronchoconstriction. A stronger constriction was seen in cynomolgus PCLS whose
supernatants contained increased levels of histamine. The highest histamine
amounts were detected in supernatants of human sensitized and HDM-challenged
PCLS initiating the most intense loss of initial airway area.
Like human PCLS, NHP PCLS mimicked allergen-provoked EAR after 10 hours
incubation in human allergic plasma. Therefore, this ex vivo lung model represents a
considerable, timesaving alternative compared to in vivo experiments that need
several weeks to sensitize animals (24, 25). To date, PCLS studies that imitate EAR
require a sensitization of animals before their PCLS are generated. Other methods
use naïve PCLS that are incubated in allogeneic, IgE-containing plasma (13, 14, 26-
28). Therefore, both techniques demanded an additional in vivo study. Our study
bypassed this procedure because it did not use animal plasma but standardized,
commercially available allergic plasma with pre-defined IgE level instead.
Furthermore, using human plasma and lung tissue of non-human primate species
helps to increase the translation of results. With this model, we bridged the gap from
genetically modified inbred rodent models to genetically diverse outbred natures. An
outbred model imitates human heterogeneity due to high polymorphism at immune
response loci (29). While in principle this contributes to the translational aspect of an
animal model, it again increases variance. Therefore, this PCLS ex vivo study was
suitable to generate valuable data reducing the amount of animals and improving the
study design in vivo.
Instead of NHP, studies could be performed using human PCLS. But one must
consider that human lung tissue is usually obtained in connection with surgery of life-
threatening diseases like lung cancer (30-32). A lot of these patients are older than
50 years and 80% of lung cancer patients are smokers in addition (12). Thus, their
lung-resident mast cells could be inappropriately and chronically activated (33).
Furthermore, most patients receive pharmaceuticals that could affect the results of
investigations made with human PCLS (12).
40
Interspecies differences in histamine release and bronchoconstriction
Compared to their non-sensitized counterparts, sensitized and HDM challenged
PCLS showed bronchoconstriction and an increase in histamine release. But
histamine release was lowered as well as bronchoconstriction was weaker in NHP
PCLS when compared with human PCLS. In particular, sensitized and allergen-
challenged marmoset PCLS released six times less histamine than human PCLS. As
a consequence, marmoset PCLS contracted to a maximum within the first two
minutes and dilated almost to its initial airway area within the next eight minutes.
These results are similar to those made in rat PCLS (26). Kunitomo et al. analyzed 6
mg of intranasal mucosa that originated from HDM-allergic persons. These cells were
stimulated with HDM-extract whereupon they released 19.7±3.2 ng histamine (21). In
another study, histamine levels in nasal fluids of patients being sensitized against
HDM ranged between 17.9 and 27.3 ng/mL (34). Whereas our data from human
sensitized and HDM-challenged PCLS accounted for 30.8±18.0 ng/ml, analog
cynomolgus PCLS reproduced these clinical findings (22.4±5.6 ng/ml).
The similarity of EAR in human and cynomolgus PCLS could be explained by a
genetic comparison. The cynomolgus macaque is phylogenetically closer to men with
a FcεRIα chain similarity of 93.8%. In contrast, the marmoset FcεRIα chain shows
only 84.7% similarity to the human sequence (35). These differences could be
responsible for a weaker binding of human IgE to marmoset FcεRI resulting in an
easier dissolution of IgE:FcεRI complexes due to allergen challenge. In
consequence, mast cell activation is abbreviated followed by lower histamine
release, which results in less severe bronchoconstriction in our ex vivo experiments.
Furthermore, differences in EAR could result from variations in mast cell numbers.
107-108 mast cells were identified in a cynomolgus monkey lung. Around 83% of
them were counted around airways and nearly 17% in the parenchyma. The density
of these mast cells increased from central to peripheral airways (36). Another study
revealed around 10 cells per mm2 (37). Unfortunately, these data cannot be
compared with marmosets because there are no reports about mast cell numbers in
this species to date. Interpretation of studies that investigated mast cell distribution in
41
human lungs remains difficult as the tissue usually originated from smokers
undergoing lung resection for primary lung cancer. Examinations are limited to
circumscribed cancer-free sections and results are not homogeneous. For example,
Battaglia et al. counted 133.7 cells/mm2 in large airways and 313.3 cells/mm2 in small
airways (38). In contrast, Nussbaumer-Ochsner et al. differentiated between mucosal
(MCT) and connective tissue mast cells (MCTC) and identified 27.4 MCTC/mm2 and
35.4 MCT/mm2 in large airways. 49 MCTC/mm2 and 162.5 MCT/mm2 were quantified
in small airways (39).
The antihistamine cetirizine inhibited allergen-triggered bronchoconstriction
Sensitized PCLS of common marmosets were treated with cetirizine before HDM
challenge. Results indicate that this pharmacological intervention blocked the H1-
receptor on NHP smooth muscle cells successfully. Bronchoconstriction was
prevented while increased histamine levels were still detectable. Thus, mast cells
kept their ability to get activated through allergen cross-linkage to IgE. Histamine was
released but was not able to bind the H1-receptor that initiates airway constriction.
These data confirm the comparative results of bronchoconstrictors investigated in
different species (15) and accentuate the histamine-dependent bronchoconstriction
known from humans (23).
Concentration dependent prevention of EAR by anti-IgE DARPin bi53_79
In general, a treatment of sensitized PCLS with the anti-IgE inhibitor reduced
histamine release and prevented bronchoconstriction effectively after allergen
challenge. However, there were concentration- and species-dependent differences.
The genetic receptor sequence of NHP FcεRIα chain is not 100% identical to the
human sequence what might result in functional differences (35). It was expected
that the linkage of human IgE would be stronger to human FcεRI than to NHP FcεRI.
As a consequence, sensitized human PCLS would need higher anti-IgE DARPin
concentrations to dissociate IgE:FcεRI units. Therefore, sensitized NHP PCLS were
treated with DARPin concentrations of 0.05 µM, 0.5 µM or 5 µM while human PCLS
were incubated in 0.5 µM, 5 µM, and 50 µM, respectively.
42
EAR in human PCLS was lowered through an anti-IgE DARPin dose of 0.5 µM and
successfully prohibited at 5 µM. Interestingly, the concentrations 0.5 and 5 µM of the
control DARPin bi53_86 reduced histamine release, too, but did not prevent
bronchoconstriction after allergen challenge. Similar to human, sensitized
cynomolgus PCLS showed a gradual decrease in histamine release and
bronchoconstriction with increasing anti-IgE DARPin concentrations ending up in
completely prevented EAR at 5 µM. EAR in sensitized marmoset PCLS was
circumvented with concentrations ≥0.5 µM. These results emphasize the
phylogenetically close relationship of human and cynomolgus monkeys.
Previous studies demonstrated that the novel anti-IgE inhibitor not only binds free
human IgE with high specificity but also dissociates existing IgE:FcεRI complexes on
basophils (10). In a transgenic mouse model, the inhibitor prevented allergic skin
reaction in vivo by removing human IgE from cutaneous mast cells (11). In our ex
vivo lung model, the anti-IgE DARPin bi53_79 dissociated human IgE from lung
resident mast cells of NHPs and prevented EAR for the first time effectively. This
demonstrates its inhibitory potency on pathophysiology of human allergic airway
diseases and emphasizes the therapeutic benefit for medical conditions like allergic
asthma.
Acknowledgments
We thank all colleagues of the Pathology Unit and the Primate Husbandry of the
German Primate Center and the staff members of the Department of Airway
Immunology of the Fraunhofer ITEM for their cooperative assistance during the
experiments. We also like to thank them for their technical support and exchange of
experiences.
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Figures a b
Figure 1 – Exemplary bronchoconstriction of sensitized and allergen challenged marmoset PCLS. Both pictures originate from a measurement of one sensitized marmoset lung slice and show initial airway area (a) as well as the same airway area 5 min after allergen challenge (b).
47
0 5 10 15 20
Time [min]
Cynomolgus (n=4); P=0.0087b
0 5 10 15 20
Time [min]
Marmoset (n=5); P=0.0012c
1% human allergic plasma1% human non-allergic plasma
+ 1% HDM
mean±SEM
PCLS +
0 5 10 15 20
Time [min]
Marmoset (n=5); P=0.0012c
1% human allergic plasma1% human non-allergic plasma
+ 1% HDM
mean±SEM
PCLS +
0 5 10 15 20
Time [min]
Marmoset (n=5); P=0.0012c
1% human allergic plasma1% human non-allergic plasma
+ 1% HDM
mean±SEM
PCLS +
Figure 2 – Airway response of sensitized and non-sensitized PCLS after allergen challenge. Graphs illustrate the 20-min-recordings of airway areas after allergen addition at the time 0. Results are displayed for human [a], cynomolgus [b], and marmoset [c] as well as sensitized [red] and non-sensitized [grey] PCLS. Error bars indicate standard error of the mean (SEM).
0 5 10 15 200
102030405060708090
100110120130
Time [min]
Airw
ay a
rea
[% o
f ini
tial a
rea]
a Human (n=3); P=0.0041
48
Figure 3 – Histamine release after allergen challenge of sensitized and non-sensitized PCLS. Columns indicate the measured histamine content in supernatants of passively sensitized [red] vs. non-sensitized [grey] human [a], cynomolgus [b], and marmoset [c] PCLS 20 min after HDM exposure. Standard error of the mean (SEM) is demonstrated by error bars.
05
101520253035404550
His
tam
ine
rele
ase
[ng/
mL] 1% human allergic
plasma
1% human non-allergic plasma
mean±SEM
+ 1% HDM
PCLS +
Human (n=3) Cynomolgus (n=4) Marmoset (n=5)
a b cP=0.0236
49
0
2
4
6
8
10
12
1% human non-allergic plasma1% human allergic plasma1% human allergic plasma + 100 µM cetirizine
n=2median±range
+ 1% HDM
Marmoset PCLS +Histam
ine release [ng/mL]
Figure 4 – Treatment of passively sensitized marmoset PCLS with cetirizine dihydrochloride. The figure illustrates changes in airway area [a] as well as histamine release [b] after HDM addition. Passively non-sensitized [grey] and sensitized [red] PCLS are compared with those that were sensitized and subsequently treated with the antihistamine cetirizine [yellow]. Error bars indicate range of median.
0 5 10 15 200
20
40
60
80
100
120
Time [min]
Airw
ay a
rea
[% o
f ini
tial a
rea]
a b
50
0 5 10 15 20Time [min]
5 µM; P=0.0465c
DARPin79_5µMDARPin86_5µM
0 5 10 15 20Time [min]
50 µM; P=0.0232d
0 5 10 15 200
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Time [min]
Airw
ay a
rea
[% o
f ini
tial a
rea]
0.5 µMb
0
10
20
30
40
50
His
tam
ine
rele
ase
[ng/
mL]
0.5
n=3 mean±SEM
+ 1% HDM
Human PCLS +
1% human allergic plasma + DARPin bi53_791% human allergic plasma + DARPin bi53_86
a
DARPin [µM]5 50
Figure 5 – Treatment of passively sensitized human PCLS with anti-IgE DARPin bi53_79 and control DARPin bi53_86. Results for measured histamine release (a) and recorded airway reaction (b-d) are illustrated. Data of sensitized PCLS being treated with either the anti-IgE (light blue) or the control DARPin (dark blue) are shown separately for each used concentration. Standard error of the mean (SEM) is displayed as error bars.
51
-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.00
5
10
15
20
25
30
His
tam
ine
rele
ase
[ng/
mL]
log DARPin [µM]
1% human allergic plasma + DARPin bi53_861% human allergic plasma + DARPin bi53_79
Cynomolgus PCLS +
+ 1% HDM
n=4 mean±SEM
a
*
0 5 10 15 20Time [min]
0.5 µMc
0 5 10 15 20Time [min]
5 µMd
0 5 10 15 200
102030405060708090
100110
Time [min]
Airw
ay a
rea
[% o
f ini
tial a
rea]
0.05 µMb
Figure 6 – Treatment of passively sensitized cynomolgus PCLS with DARPin bi53_79 and DARPin bi53_86. Pictures demonstrate histamine release (a) and airway response (b-d) of sensitized, DARPin treated, and HDM challenged cynomolgus PCLS. Results are shown for different anti-IgE (light blue) and control (dark blue) DARPin concentrations, respectively. Standard error of the mean (SEM) is displayed with error bars. Asterisk indicates significance (P=0.014).
52
0 5 10 15 20
Time [min]
0.5 µMc
0 5 10 15 20
Time [min]
5 µMd
0 5 10 15 200
102030405060708090
100110
Time [min]
Airw
ay a
rea
[% o
f ini
tial a
rea]
0.05 µMb
0
1
2
3
4
5
His
tam
ine
rele
ase
[ng/
mL]
0.05
n=3 mean±SEM
+ 1% HDM
Marmoset PCLS +
1% human allergic plasma + DARPin bi53_791% human allergic plasma + DARPin bi53_86
a
DARPin [µM]0.5 5
Figure 7 – Treatment of passively sensitized marmoset PCLS with DARPin bi53_79 and DARPin bi53_86. Graphs represent histamine release (a) and airway response (b-d) after allergen exposure of sensitized and DARPin treated marmoset PCLS. These readouts are separately shown for different concentrations of the anti-IgE (light blue) and the control DARPin (dark blue). Standard error of the mean (SEM) is illustrated by error bars.
53
54
5. DISKUSSION
PCLS von nicht-menschlichen Primaten als translationale Modelle für BHR
Viele humane Antikörper, die gegen bestimmte Epitope auf menschlichen Zellen
gerichtet sind, reagieren auch mit analogen Antigenen nicht-menschlicher Primaten.
So konnte z. B. eine Kreuzreaktivität zwischen humanen Antikörpern und
Oberflächenrezeptoren der Leukozyten von Weißbüschelaffen belegt werden
(NEUBERT et al. 1996, KIRETA et al. 2005). Mit verschiedenen Antigenen des
Javaneraffen wurden mehr als 300 anti-humane, monoklonale Antikörper auf ihre
Kreuzreaktivität untersucht. Dabei haben rund 68 % der Antikörper gegen humane
Antigene von CD-Molekülen, Chemokin- und T-Zell-Rezeptoren an entsprechende
Antigene der nicht-menschlichen Primaten gebunden (YOSHINO et al. 2000). In
einem Javaneraffenmodell wurde bereits ein humanisierter, anti-human IgE-
Antikörper getestet. Das IgE des Javaneraffen konnte nicht nur diesen Antikörper
sondern auch eine humane FcεRI-IgG-Verbindung mit ähnlicher Affinität binden wie
das humane IgE (MENG et al. 1996). Aufgrund dieser Tatsachen wurde in dieser
Studie angenommen, dass der FcεRI auf Mastzellen in PCLS nicht-menschlicher
Primaten das humane IgE im Allergikerplasma binden kann.
Nach Zugabe des Allergens reagierten die sensibilisierten PCLS mit einer
Bronchokonstriktion. Genauso wie das Histamin in der bronchoalveolären Lavage
von Patienten mit allergischem Asthma erhöht ist (WENZEL et al. 1988, JARJOUR et
al. 1991), detektierten auch wir deutlich höhere Mengen an Histamin in den
Überständen der sensibilisierten und allergen-stimulierten PCLS von nicht-
menschlichen Primaten. Dass die Bronchokonstriktion innerhalb der ersten 10
Minuten nach Antigenkontakt ihr Maximum erreicht, passt mit der Beobachtung
zusammen, dass die IgE-abhängige Histaminfreisetzung nach 5 - 7 Minuten am
höchsten ist (BENYON et al. 1987, KUNITOMO und OTSUKA 2005). Dies beweist,
dass die passive Sensibilisierung naiver Mastzellen mit menschlichem, IgE-haltigem
Plasma in PCLS von nicht-menschlichen Primaten erfolgreich war und die Bindung
des Allergens an die IgE:FcεRI-Komplexe die Mastzellen aktiviert hat. Die Menge
des freigesetzten Histamins korrespondierte dabei mit der Intensität der
55
Bronchokonstriktion. Das heißt, dass die niedrigere Menge an Histamin in den
Überständen von sensibilisierten und HDM-provozierten Weißbüschelaffen-PCLS
eine schwächere Bronchokonstriktion auslöste. In PCLS von Javaneraffen war die
Konstriktion stärker, was mit den höheren Mengen an Histamin im Überstand
korreliert.
Damit imitiert dieses ex vivo Lungenmodell bereits nach zehnstündiger Inkubation
mit menschlichem Plasma von Allergikern die frühe Phase einer allergischen
Atemwegsreaktion. Gegenüber in vivo Modellen stellt das eine erhebliche
Zeitersparnis dar, weil eine wochenlange Sensibilsierungsphase vermieden werden
kann (JOHNSON et al. 2004, BIRRELL et al. 2010). Auch andere PCLS-Modelle, die
eine allergische Atemwegsreaktion nachahmen, existieren bereits. Allerdings setzen
diese voraus, dass die Tiere, von denen die PCLS angefertigt werden, zuvor in vivo
sensibilisiert werden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, naive PCLS mit
allogenem, IgE-haltigem Plasma sensibilisierter Tiere zu inkubieren (WOHLSEN et
al. 2001, RESSMEYER et al. 2006, HENJAKOVIC et al. 2008 a, SANDERSON 2011,
LAMBERMONT et al. 2014). Beide Methoden erfordern demnach eine zusätzliche in
vivo Studie. Die vorliegende Arbeit umgeht dieses Prozedere, da sie kein tierisches
Plasma benötigt und stattdessen standardisiertes und käuflich zu erwerbendes
Allergikerplasma mit definiertem IgE-Gehalt nutzt. Der Einsatz von menschlichem
Plasma sowie zweier Spezies – Weißbüschelaffe und Javaneraffe – mit großen
Homologien zum Menschen (KOHU et al. 2008) eröffnet darüber hinaus bessere
Möglichkeiten, die Ergebnisse in die Klinik zu übertragen. Die Modelle schlagen eine
Brücke von genetisch modifizierten Inzuchtstämmen aus Nagermodellen zu einer
genetisch vielfältigen Primatenzucht, wodurch die menschliche Heterogenität besser
imitiert wird (SHEN et al. 2013). Während dies den translationalen Aspekt eines
Modells unterstreicht, erhöht es allerdings auch die Varianz. Deshalb sind die ex vivo
Studien mit PCLS von besonderer Bedeutung um nützliche Daten zu generieren, die
die Tieranzahl in vivo nicht nur reduzieren, sondern auch das Studiendesign
verbessern.
Statt nicht-menschlicher Primaten wäre auch der Einsatz von menschlichem
Lungengewebe denkbar. Allerdings muss dabei beachtet werden, dass dieses
56
Zellmaterial meist nur in Zusammenhang mit einem operativen Eingriff aufgrund
lebensbedrohlicher Erkrankungen wie Lungenkrebs gewonnen werden kann
(WOHLSEN et al. 2003, RESSMEYER et al. 2010, LAUENSTEIN et al. 2014). Die
Patienten sind meistens älter als 50 Jahre und 80 % der Lungenkrebspatienten sind
zusätzlich Raucher (SEWALD und BRAUN 2013), wodurch z. B. Mastzellen
unangemessen und chronisch aktiviert sein können (VIRK et al. 2016). Die meisten
Patienten werden zudem medikamentös therapiert. Diese Umstände können die
Ergebnisse von Studien mit menschlichen PCLS erheblich verfälschen (SEWALD
und BRAUN 2013).
Speziesunterschiede in der Histaminfreisetzung und der Bronchokonstriktion
Die Daten weisen darauf hin, dass es zwischen den Spezies Unterschiede im
Ausmaß der Histaminfreisetzung und der Stärke der Bronchokonstriktion gab. Nach
Allergenstimulation wurde im Überstand sensibilisierter PCLS von Weißbüschelaffen
über 4x weniger Histamin detektiert als in den Überständen analoger PCLS von
Javaneraffen. Der Bronchus in sensibilisierten und HDM-stimulierten
Weißbüschelaffen-PCLS kontrahierte insgesamt schwächer und war nach zehn
Minuten fast vollständig wieder relaxiert. Damit entspricht dieses Ergebnis den
Daten, die mit PCLS von Ratten generiert wurden (WOHLSEN et al. 2001). In einer
Studie wurde Patienten, die gegen HDM sensibilisiert waren, intranasal 6 mg
Schleimhaut entnommen. Diese Zellen wurden mit dem Milbenextrakt stimuliert und
setzten daraufhin 19,7 ± 3,2 ng Histamin frei (KUNITOMO und OTSUKA 2005). In
einem anderen Experiment, das den Histamingehalt in Nasenspülungen von HDM-
Allergikern untersuchte, konnten Werte von 17,9 bis 27,3 ng Histamin pro ml
nachgewiesen werden (DI LORENZO et al. 2001). Im Gegensatz zum
Weißbüschelaffen (3,0 ± 0,7 ng/ml) entsprechen damit die Ergebnisse von
sensibilisierten und Allergen-stimulierten Javaneraffen-PCLS mit Daten von 22,4 ±
5,6 ng/ml dem Menschen.
Ein genetischer Vergleich beider nicht-menschlicher Primatenspezies mit dem
Menschen liefert eine mögliche Erklärung für die Unterschiede. Der Javaneraffe
gehört zu den Makaken, welche dem Menschen phylogenetisch näher stehen. Ihre
57
FcεRIα-Ketten ähneln sich zu 93,8 %, während die FcεRIα-Kette des
Weißbüschelaffen der menschlichen Sequenz nur zu 84,7 % entspricht. Diese Daten
sind höchstwahrscheinlich der Grund für entsprechende funktionelle Unterschiede
(SAUL et al. 2014). Somit wäre es möglich, dass die Bindung von humanem IgE an
Weißbüschelaffen-FcεRI schwächer ist und leichter durch eine Allergenstimulation
wieder aufgehoben werden kann. Als Konsequenz ist die Mastzellaktivierung
verkürzt, sodass weniger Histamin ausgestoßen wird und die Bronchokonstriktion
schwächer ausfällt. Die Unterschiede der frühen Atemwegsreaktion könnten auch
darauf basieren, dass der Javaneraffe mehr Mastzellen besitzt als der
Weißbüschelaffe. Untersuchungen mit Lungen von Javaneraffen haben ergeben,
dass 107-108 Mastzellen im gesamten Organ verteilt sind. Davon befinden sich etwa
83 % an den Atemwegen und rund 17 % im Parenchym. Generell nimmt die
Mastzelldichte von zentralen zu peripheren Atemwegen zu (GUERZON et al. 1979).
Andere Studien kommen zu einem Ergebnis von rund 10 Zellen pro mm2 (GALLI et
al. 1993). Leider gibt es zu diesem Zeitpunkt noch keine Daten zur Mastzelldichte in
der Lunge von Weißbüschelaffen, sodass ein Vergleich nicht möglich ist.
Prävention einer Allergen-induzierten Bronchokonstriktion durch das
Antihistaminikum Cetirizin
Sensibilisierte PCLS von Weißbüschelaffen, die vor der HDM-Stimulation mit
Cetirizindihydrochlorid behandelt wurden, zeigten weiterhin einen Histaminausstoß
nach Allergenkontakt, jedoch keine Bronchokonstriktion. Dies spricht dafür, dass die
bestehenden IgE:FcεRI-Komplexe mit dem Allergen eine Verbindung eingingen und
die Mastzellen aktiviert wurden. Das ausgeschüttete Histamin konnte somit im
Überstand nachgewiesen werden aber nicht mehr an den H1-Rezeptor der glatten
Muskulatur binden, weil dieser durch den Antagonisten blockiert wurde. Somit war
eine Kontraktion der Bronchialmuskulatur nicht mehr möglich. SEEHASE et al.
(2011) zeigte mit Hilfe von PCLS bereits, dass das Histamin ein potenter
Bronchkonstriktor sowohl im Menschen als auch im nicht-menschlichen Primaten ist.
Diese Studie beweist nun, dass dieser Mediator bei der frühen Phase einer
58
allergischen Atemwegsreaktion der alleinige Hauptbronchokonstriktor im nicht-
menschlichen Primaten ist – genau wie beim Menschen (JARJOUR et al. 1991).
Prävention der BHR durch Anti-IgE DARPin bi53_79
Basierend auf Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins) wurde ein anti-IgE
Inhibitor entwickelt, der freies IgE im Blut binden aber auch bereits bestehende IgE-
Komplexe mit hoch affinen Fc-Epsilon-Rezeptoren auflösen kann. Die Behandlung
sensibilisierter PCLS mit dem anti-IgE DARPin bi53_79 führte nach Allergengabe in
beiden nicht-menschlichen Primatenspezies zu einer reduzierten Histaminfreisetzung
und verhinderte die Bronchokonstriktion. Jedoch gab es spezies- und
konzentrationsabhängige Unterschiede. Da die genetische Grundlage der FcεR-
Sequenz von Mensch und Javaneraffe sehr ähnlich sind (SAUL et al. 2014), ist
anzunehmen, dass die Verbindung von menschlichem IgE und dem Mastzell-FcεRI
des Javaneraffen sehr stark ist. Dadurch kann die Konzentration von 0,05 µM des
Anti-IgE-Inhibitors die Allergen-abhängige Histaminausschüttung und
Bronchokonstriktion noch nicht beeinflussen. Erst weiter steigende Konzentrationen
des Anti-IgE-DARPins lösten die IgE:FcεRI-Komplexe auf und schwächten sukzessiv
den Histaminausstoß und die Bronchokonstriktion. Die vollständige Prävention der
allergischen Atemwegsreaktion war mit 5 µM des DARPin bi53_79 erreicht. Der
Allergen-vermittelte Histaminausstoß in sensibilisierten PCLS von Weißbüschelaffen
war hingegen schon bei einer Anti-IgE-DARPin Konzentration von 0,05 µM
vermindert. Die Menge von 0,5 µM führte bereits zu einer Prävention der
Bronchokonstriktion. Diese Ergebnisse bestätigen die Annahme über eine
schwächere Bindung zwischen menschlichem IgE und Weißbüschelaffen-FcεRI, was
zu einer vereinfachten Ablösung des IgEs vom Rezeptor durch das Anti-IgE-DARPin
führte.
Vorangegangene Studien haben bereits belegt, dass der neuartige Anti-IgE-Inhibitor
mit hoher Spezifität nicht nur freies humanes IgE bindet, sondern auch bestehende
IgE:FcεRI-Komplexe auf basophilen Granulozyten dissoziiert (KIM et al. 2012). In
einem transgenen Mausmodell verhinderte der Inhibitor in vivo eine allergische
Hautreaktion, indem er humanes IgE von kutanen Mastzellen wieder ablöste
59
(EGGEL et al. 2014). In dieser Studie konnte erstmals im ex vivo Modell gezeigt
werden, dass das DARPin bi53_79 humanes IgE von lungenresidenten Mastzellen
nicht-menschlicher Primaten ablösen und eine frühe Atemwegsreaktion wirksam
abwenden kann.
Durch die Behandlung passiv sensibilisierter PCLS nicht-menschlicher Primaten mit
dem humanen anti-IgE Inhibitor DARPin bi53_79 konnte erfolgreich der Allergen-
vermittelte Histaminausstoß aus Mastzellen und die Bronchokonstriktion verhindert
werden. Damit hat dieser anti-IgE Inhibitor seinen therapeutischen Nutzen nun auch
für die Behandlung allergischer Atemwegserkrankungen hervorgehoben.
60
6. ZUSAMMENFASSUNG
Judy Wichmann
Untersuchungen zur Prävention von Asthma in einem ex vivo Lungenmodell unter Verwendung von nicht-menschlichen Primaten Allergisches Asthma ist eine chronisch entzündliche Erkrankung, die durch
Hyperreagibilität der Atemwege und Atemwegsobstruktion gekennzeichnet ist.
Obwohl es eine der häufigsten chronischen Erkrankungen des Menschen ist, besteht
ein großer Bedarf an wirksamen Medikamenten, da die derzeit eingesetzten
Langzeittherapeutika im Wesentlichen nur symptomatische Wirksamkeit besitzen.
Vor diesem Hintergrund war das Ziel der vorliegenden Arbeit, einen neuartigen anti-
human IgE-Inhibitor zu testen. Dazu wurde ein ex vivo Modell genutzt, welches die
frühe Phase einer allergischen Atemwegsreaktion mit Hilfe von Precision-Cut Lung
Slices (PCLS) imitiert. Von Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus; n=5) und
Javaneraffen (Macaca fascicularis; n=4) wurden Lungen gewonnen und
entsprechende Schnitte generiert. Die PCLS wurden mit menschlichem Plasma,
welches IgE gegen Hausstaubmilben (House Dust Mite, HDM) beinhaltete,
sensibilisiert. Zur Kontrolle wurden weitere PCLS in Plasma von gesunden Spendern
inkubiert.
Sensibilisierte PCLS wurden entweder mit dem Antihistaminikum Cetirizin, dem anti-
IgE DARPin bi53_79 oder dem Kontroll-DARPin bi53_86 behandelt. Um die frühe
Phase einer Allergen-induzierten Atemwegsreaktion einzuleiten, wurden die PCLS
schließlich mit HDM stimuliert. Die Atemwegsreaktion und Histaminfreisetzung
wurden gemessen und zwischen den unterschiedlich behandelten Gruppen
miteinander verglichen. Eine Bronchokonstriktion und erhöhte Histaminfreisetzung
dienten als Indikatoren für die frühe Phase einer allergischen Atemwegsreaktion.
Die Symptome traten bei PCLS auf, die passiv sensibilisiert und mit HDM stimuliert
wurden. Auch PCLS, die zusätzlich mit dem Kontroll-DARPin behandelt wurden,
zeigten eine Frühe-Phase-Reaktion. In sensibilisierten und Cetirizin-behandelten
61
PCLS wurde noch ein Allergen-induzierter Histaminausstoß nachgewiesen, jedoch
keine Kontraktion der Atemwege. Im Gegensatz dazu konnte der anti-IgE DARPin
bi53_79 beides, die Histaminfreisetzung senken und die Bronchokonstriktion
verhindern. In sensibilisierten PCLS von Weißbüschelaffen war dafür eine
Konzentration von 0,5 µM anti-IgE-Inhibitor notwendig. In Javaneraffen-PCLS wurde
die Frühe-Phase-Reaktion bei einer Konzentration von 5 µM vollständig unterdrückt.
Die vorgelegten Untersuchungen zeigen in einem menschennahen ex vivo Modell,
dass der human-spezifische anti-IgE-Inhibitor DARPin bi53_79 durchaus geeignet
ist, bei allergischen Atemwegserkrankungen therapeutisch eingesetzt zu werden.
Angesichts der steigenden Anzahl von Patienten mit allergischem Asthma könnte
dieser anti-IgE DARPin dem hohen Bedarf an neuen Medikamenten gerecht werden.
62
7. SUMMARY
Judy Wichmann
Investigating asthma prevention in an ex vivo lung model of non-human primates Allergic asthma is a chronic inflammatory disorder characterized by airway hyper-
responsiveness and bronchoconstriction. It is one of the most common chronic
diseases of mankind and there is still an urgent need of curative therapies because
existing long acting pharmaceuticals do only alleviate the symptoms. Therefore, the
aim of this study was to test a new anti-human IgE inhibitor. We used an ex vivo lung
model that imitates the early phase of an allergic airway reaction. Precision-Cut Lung
Slices (PCLS) of common marmosets (Callithrix jacchus; n=5) and cynomolgus
macaques (Macaca fascicularis; n=4) were prepared and passively sensitized with
human plasma containing anti-House Dust Mite (HDM) IgE. Control PCLS were
incubated in plasma of healthy donors.
Passively sensitized PCLS were treated with the antihistamine cetirizine, the anti-IgE
DARPin bi53_79 and the control DARPin bi53_86 respectively. To initiate the early
phase of an allergen-induced airway reaction, PCLS were finally challenged with
HDM. Airway response as well as histamine levels were measured and used to
compare the groups. Bronchoconstriction and increased histamine release were
chosen as indicators for the early phase of an allergic airway reaction.
The symptoms were observed in PCLS that were passively sensitized and
challenged with HDM. PCLS additionally incubated with the control DARPin also
showed this early airway reaction. Sensitized and cetirizine-treated PCLS showed
allergen-induced histamine release as well, but no bronchoconstriction. In contrast,
the anti-IgE DARPin bi53_79 prevented both histamine release and
bronchoconstriction. An inhibitor concentration of 0.5 µM was sufficient in sensitized
marmoset PCLS whereas the early airway reaction in sensitized cynomolgus PCLS
was prevented at a dose of 5 µM.
63
Results of the human-like ex vivo model shown in this study indicate that the human
specific anti-IgE inhibitor DARPin bi53_79 is suitable for therapy of allergic airway
diseases. In regard to growing amounts of patients with allergic asthma, this anti-IgE
DARPin could satisfy the demand of new treatment options.
64
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9. ANHANG 9.1. Frühe Atemwegsreaktion in PCLS von Weißbüschelaffen
Minuten Atemwegsfläche [% der initialen Fläche]
Sensibilisierte PCLS Nicht-sensibilisierte PCLS Mittelwert SEM Mittelwert SEM
0 100,00 0,00 100,00 0,00 0:20 102,20 1,31 100,78 0,49 0:40 100,09 0,82 101,42 0,98 1:00 95,90 2,51 102,56 1,05 1:20 89,31 4,69 103,00 1,40 1:40 83,54 5,85 103,84 1,60 2:00 78,60 5,79 104,53 1,76 2:20 74,20 4,84 104,16 2,04 2:40 71,31 4,61 105,13 2,06 3:00 69,49 5,31 105,49 2,23 3:20 68,92 6,19 105,95 2,46 3:40 69,13 6,89 105,74 2,62 4:00 69,89 7,37 106,03 2,84 4:20 70,85 7,72 106,52 2,82 4:40 71,96 7,88 106,18 3,07 5:00 73,16 7,99 106,32 3,19 5:20 74,44 8,01 106,68 3,16 5:40 75,39 7,68 106,93 3,14 6:00 76,17 7,18 107,46 3,29 6:20 77,22 6,92 106,86 3,33 6:40 78,36 6,84 107,40 3,38 7:00 79,60 6,73 107,31 3,30 7:20 80,64 6,47 107,15 3,43 7:40 81,65 6,42 107,56 3,40 8:00 82,79 6,39 107,68 3,45 8:20 83,60 6,37 107,99 3,68 8:40 84,33 6,27 108,00 3,69 9:00 85,06 6,33 107,62 3,51 9:20 85,64 6,27 107,91 3,76 9:40 86,22 6,10 107,94 3,88
10:00 86,90 6,09 107,89 3,89 10:20 87,41 6,07 107,93 3,97 10:40 87,78 6,04 107,96 3,98 11:00 88,05 5,96 107,96 4,02
93
11:20 88,59 5,90 107,99 4,00 11:40 88,90 5,93 107,93 3,98 12:00 89,27 5,86 107,88 4,01 12:20 89,65 5,88 107,91 4,02 12:40 89,91 5,84 107,81 4,01 13:00 90,27 5,87 107,96 4,04 13:20 90,57 5,98 107,93 4,02 13:40 90,90 5,90 107,95 4,02 14:00 91,03 5,88 108,03 4,05 14:20 91,23 5,95 108,10 4,06 14:40 91,30 6,03 107,94 4,12 15:00 91,21 5,94 108,08 4,07 15:20 91,32 5,86 108,07 4,08 15:40 91,40 5,90 107,96 4,12 16:00 91,37 5,95 107,79 4,11 16:20 91,38 6,00 107,99 4,13 16:40 91,36 6,04 107,89 4,13 17:00 91,38 6,09 107,96 4,14 17:20 91,44 6,09 108,00 4,14 17:40 91,44 6,13 107,33 4,12 18:00 91,50 6,15 107,46 4,10 18:20 91,64 6,12 107,16 4,08 18:40 91,64 6,06 107,27 4,10 19:00 91,71 6,04 107,43 4,11 19:20 91,68 6,06 107,37 4,10 19:40 91,66 6,13 107,37 4,10 20:00 91,71 6,18 107,00 4,14
Anhang, Tab. 1: Innere Atemwegsfläche nach Allergenprovokation passiv (nicht-) sensibilisierter PCLS von Weißbüschelaffen (n=5). Zeitpunkt 0 repräsentiert die initiale Atemwegsfläche.
Histamin [ng/ml] Sensibilisierte PCLS Nicht-sensibilisierte PCLS
Mittelwert SEM Mittelwert SEM 5,21 1,46 1,90 0,43
Anhang, Tab. 2: Histamingehalt der Überstände von passiv (nicht-)sensibilisierten und Allergen-stimulierten PCLS von Weißbüschelaffen (n=5).
94
9.2. Frühe Atemwegsreaktion in PCLS von Javaneraffen
Minuten Atemwegsfläche [% der initialen Fläche]
Sensibilisierte PCLS Nicht-sensibilisierte PCLS Mittelwert SEM Mittelwert SEM
0 100,00 0,00 100,00 0,00 0:20 99,22 0,85 99,71 0,71 0:40 92,37 9,41 99,59 0,96 1:00 89,96 11,49 99,46 1,25 1:20 89,13 11,96 99,29 1,45 1:40 89,35 12,20 99,09 1,58 2:00 88,45 11,82 98,74 1,64 2:20 88,18 11,48 98,56 1,77 2:40 87,71 11,01 98,40 1,94 3:00 86,73 10,54 98,18 2,09 3:20 84,95 10,01 98,08 2,24 3:40 81,41 9,41 97,90 2,36 4:00 78,27 9,19 97,83 2,38 4:20 75,87 9,20 97,71 2,45 4:40 74,34 9,55 97,65 2,54 5:00 73,86 9,87 97,52 2,69 5:20 73,63 10,44 97,56 2,72 5:40 73,37 10,48 97,44 2,80 6:00 73,39 10,38 97,37 2,92 6:20 73,75 10,10 97,27 2,98 6:40 73,48 10,00 97,18 3,09 7:00 73,31 10,10 97,16 3,09 7:20 72,38 10,03 97,13 3,17 7:40 71,68 9,41 97,01 3,27 8:00 72,36 9,89 96,84 3,40 8:20 73,05 9,88 96,85 3,43 8:40 72,97 9,54 96,66 3,54 9:00 73,54 9,52 96,60 3,61 9:20 72,65 8,90 96,50 3,70 9:40 72,37 8,58 96,30 3,76
10:00 71,34 8,05 96,34 3,81 10:20 71,41 8,15 96,20 3,93 10:40 70,94 7,98 96,12 3,94 11:00 70,70 7,94 96,10 4,00 11:20 70,78 7,98 95,95 4,10 11:40 70,86 8,01 95,95 4,13
95
12:00 71,25 8,10 95,74 4,29 12:20 71,36 8,13 95,71 4,30 12:40 72,11 8,40 95,73 4,28 13:00 72,69 8,48 95,65 4,34 13:20 73,26 8,65 95,66 4,35 13:40 74,17 8,91 95,50 4,44 14:00 75,13 9,22 95,47 4,47 14:20 75,82 9,38 95,48 4,51 14:40 76,16 9,40 95,41 4,55 15:00 76,46 9,42 95,51 4,53 15:20 76,95 9,46 95,48 4,49 15:40 77,27 9,50 95,34 4,60 16:00 77,78 9,55 95,22 4,68 16:20 78,10 9,69 95,23 4,72 16:40 78,42 9,77 95,31 4,67 17:00 78,84 9,83 95,22 4,73 17:20 80,16 10,34 95,17 4,81 17:40 80,55 10,40 95,03 4,83 18:00 80,82 10,51 95,24 4,77 18:20 81,10 10,55 95,22 4,72 18:40 81,40 10,57 95,11 4,92 19:00 81,64 10,53 94,97 5,02 19:20 81,82 10,50 95,05 4,93 19:40 81,84 10,57 95,24 4,83 20:00 82,04 10,54 95,23 4,84
Anhang, Tab. 3: Innere Atemwegsfläche nach Allergenprovokation passiv (nicht-) sensibilisierter PCLS von Javaneraffen (n=4). Zeitpunkt 0 repräsentiert die initiale Atemwegsfläche.
Histamin [ng/ml] Sensibilisierte PCLS Nicht-sensibilisierte PCLS
Mittelwert SEM Mittelwert SEM 22,35 5,60 4,54 1,67
Anhang, Tab. 4: Histamingehalt der Überstände von passiv (nicht-)sensibilisierten und Allergen-stimulierten PCLS von Javaneraffen (n=4).
96
9.3. Cetirizin-Behandlung von sensibilisierten Weißbüschelaffen-PCLS
Minuten
Atemwegsfläche [% der initialen Fläche]
Sensibilisierte PCLS Nicht-sensibilisierte PCLS
Sensibilisierte und Cetirizin-behandelte
PCLS Median Range Median Range Median Range
0 100,00 100,00 – 100,00 100,00 100,00 –
100,00 100,00 100,00 – 100,00
0:20 104,71 107,21 – 102,20 101,74 102,67 –
100,80 102,32 102,87 – 101,77
0:40 99,86 102,23 – 97, 49 103,05 105,03 –
101,07 103,11 104,08 – 102,14
1:00 96,11 102,20 – 90,02 103,61 105,81 –
101,42 102,78 103,90 – 101,66
1:20 91,06 102,23 – 79,90 104,72 107,87 –
101,58 102,01 103,58 – 100,45
1:40 86,06 99,37 – 72,76 105,20 108,67 –
101,73 99,47 101,50 – 97,44
2:00 80,97 93,11 – 68,84 105,79 109,61 –
101,97 98,41 101,04 – 95,78
2:20 73,50 80,44 – 66,57 106,04 109,95 –
102,13 94,75 95,83 – 93,67
2:40 67,36 69,13 – 65,58 106,46 110,73 –
102,19 97,18 99,18 – 95,19
3:00 62,25 65,33 – 59,16 106,70 111,13 –
102,28 97,19 99,79 – 94,60
3:20 59,24 65,56 – 52,92 106,79 111,26 –
102,33 97,30 100,57 – 94,03
3:40 57,58 66,00 – 49,16 107,11 111,84 –
102,38 97,88 101,81 – 93,96
4:00 57,08 66,94 – 47,23 107,29 112,08 –
102,49 98,30 102,33 – 94,27
4:20 57,01 67,58 – 46,45 107,32 112,15 –
102,49 98,84 103,41 – 94,27
4:40 57,31 68,08 – 46,54 107,42 112,36 –
102,48 98,51 103,70 – 93,31
5:00 57,91 68,89 – 46,93 107,43 112,41 –
102,45 100,51 104,29 – 96,73
5:20 58,72 69,33 – 48,11 107,56 112,62 –
102,49 100,76 104,37 – 97,16
5:40 59,81 69,70 – 49,92 107,50 112,43 –
102,57 101,60 104,61 – 98,60
6:00 61,10 70,36 – 51,83 107,78 112,99 –
102,57 102,21 104,73 – 99,70
97
6:20 62,34 71,16 – 53,52 107,50 112,45 –
102,55 102,63 104,92 – 100,33
6:40 63,26 71,29 – 55,23 107,69 112,84 –
102,53 102,87 105,14 – 100,59
7:00 64,51 71,45 – 57,56 107,42 112,28 –
102,56 103,15 105,38 – 100,91
7:20 65,88 71,93 – 59,84 107,55 112,60 –
102,49 103,38 105,62 – 101,14
7:40 66,82 72,11 – 61,53 107,48 112,49 –
102,48 103,56 105,86 – 101,27
8:00 67,92 72,42 – 63,43 107,46 112,57 –
102,36 103,78 106,11 – 101,46
8:20 68,70 72,63 – 64,76 107,41 112,61 –
102,21 103,94 106,32 – 101,56
8:40 69,52 72,57 – 66,46 107,11 112,15 –
102,07 104,05 106,54 – 101,57
9:00 70,06 72,58 – 67,54 106,89 112,01 –
101,76 104,23 106,72 – 101,74
9:20 70,76 72,74 – 68,78 106,84 112,20 –
101,47 104,31 106,86 – 101,75
9:40 71,73 72,90 – 70,56 106,68 112,11 –
101,25 104,48 107,14 – 101,81
10:00 72,41 72,46 – 72,35 106,35 111,75 –
100,94 104,62 107,36 – 101,88
10:20 72,94 72,94 – 72,94 106,32 111,96 –
100,69 104,69 107,56 – 101,83
10:40 73,44 74,40 – 72,49 106,17 111,66 –
100,68 104,86 107,88 – 101,84
11:00 73,92 75,35 – 72,50 106,16 111,68 –
100,64 104,97 108,04 – 101,91
11:20 74,67 77,02 – 72,32 106,12 111,57 –
100,66 105,09 108,27 – 101,91
11:40 75,01 78,15 – 71,88 105,88 110,98 –
100,77 105,32 108,61 – 102,04
12:00 75,64 79,26 – 72,01 105,73 110,72 –
100,73 105,44 108,80 – 102,07
12:20 76,01 80,31 – 71,70 105,77 110,72 –
100,83 105,57 109,05 – 102,08
12:40 76,55 81,37 – 71,73 105,55 110,22 –
100,88 105,63 109,14 – 102,12
13:00 76,99 82,56 – 71,41 105,74 110,58 –
100,90 105,71 109,29 – 102,13
13:20 77,13 83,36 – 70,90 105,63 110,17 –
101,08 105,87 109,58 – 102,15
13:40 77,76 84,32 – 71,21 105,73 110,38 –
101,08 105,97 109,75 – 102,20
98
14:00 78,14 85,21 – 71,08 105,86 110,75 –
100,98 106,05 109,91 – 102,19
14:20 78,48 86,45 – 70,51 105,95 110,82 –
101,09 106,12 110,05 – 102,19
14:40 78,60 87,26 – 69,94 105,90 110,86 –
100,94 106,18 110,19 – 102,17
15:00 78,86 87,76 – 69,96 105,91 110,81 –
101,01 106,31 110,41 – 102,21
15:20 79,24 88,21 – 70,26 105,89 110,73 –
101,04 106,29 110,40 – 102,17
15:40 79,39 88,80 – 69,98 105,84 110,61 –
101,08 106,32 110,55 – 102,10
16:00 79,38 89,18 – 69,58 105,47 109,78 –
101,17 106,30 110,49 – 102,11
16:20 79,43 89,60 – 69,26 105,83 110,59 –
101,08 106,39 110,67 – 102,10
16:40 79,50 90,01 – 68,99 105,60 110,22 –
100,99 106,41 110,75 – 102,08
17:00 79,54 90,34 – 68,73 105,75 110,53 –
100,96 106,43 110,77 – 102,09
17:20 79,71 90,72 – 68,70 105,86 110,66 –
101,06 106,42 110,82 – 102,01
17:40 79,75 91,07 – 68,43 104,19 107,50 –
100,87 106,46 110,84 – 102,08
18:00 79,90 91,45 – 68,35 104,60 108,17 –
101,02 106,42 110,77 – 102,08
18:20 80,11 91,65 – 68,57 103,70 106,29 –
101,11 106,47 110,81 – 102,14
18:40 80,31 91,82 – 68,79 104,05 107,02 –
101,08 106,54 110,92 – 102,16
19:00 80,46 92,00 – 68,92 104,44 107,71 –
101,17 106,46 110,83 – 102,09
19:20 80,48 92,20 – 68,77 104,25 107,34 –
101,16 106,52 110,89 – 102,14
19:40 80,43 92,44 – 68,42 104,32 107,35 –
101,29 106,52 110,94 – 102,10
20:00 80,49 92,78 – 68,21 103,34 105,71 –
100,96 106,48 110,87 – 102,08
Anhang, Tab. 5: Innere Atemwegsfläche nach Allergenprovokation passiv (nicht-) sensibilisierter PCLS im Vergleich mit sensibilisierten und Cetirizin-behandelten PCLS von Weißbüschelaffen (n=2). Zeitpunkt 0 steht für die initiale Atemwegsfläche.
99
Histamin [ng/ml]
Sensibilisierte PCLS Nicht-sensibilisierte PCLS
Sensibilisierte und Cetirizin-behandelte
PCLS Median Range Median Range Median Range
8,53 7,38 – 9,69 1,99 0,64 – 3,33 6,65 3,89 – 9,41
Anhang, Tab. 6: Histamingehalt der PCLS-Überstände von Weißbüschelaffen (n=2) nach Allergenprovokation. Im Vergleich stehen passiv (nicht-)sensibilisierte PCLS mit Cetirizin-behandelten PCLS.
9.4. Behandlung von sensibilisierten Weißbüschelaffen-PCLS mit dem Anti- IgE-DARPin
Minuten
Atemwegsfläche [% der initialen Fläche] Sensibilisierte und DARPin bi53_79-behandelte PCLS
0,05 µM 0,5 µM 5 µM Mittelwert SEM Mittelwert SEM Mittelwert SEM
0 100,00 0,00 100,00 0,00 100,00 0,00 0:20 100,91 0,49 100,02 1,39 100,42 0,12 0:40 102,23 1,34 100,11 1,78 100,33 0,13 1:00 102,53 1,75 100,67 2,05 100,59 0,22 1:20 102,89 2,06 101,22 2,39 100,96 0,27 1:40 103,11 2,25 101,80 2,74 100,76 0,50 2:00 103,17 2,39 102,43 3,12 101,14 0,41 2:20 103,27 2,27 102,79 3,46 101,16 0,57 2:40 103,18 2,19 103,23 3,71 101,37 0,59 3:00 103,08 2,12 103,55 3,93 101,51 0,63 3:20 101,35 0,62 103,78 4,08 101,90 0,56 3:40 101,42 0,63 103,91 4,15 101,88 0,63 4:00 100,87 0,44 104,01 4,24 102,01 0,63 4:20 100,22 0,90 104,13 4,25 102,10 0,64 4:40 100,63 0,60 104,15 4,30 102,13 0,63 5:00 100,03 1,06 104,22 4,31 102,23 0,64 5:20 99,93 1,10 104,26 4,32 102,30 0,66 5:40 99,39 1,57 104,27 4,36 102,34 0,67 6:00 99,31 1,60 104,31 4,36 102,39 0,69 6:20 99,48 1,43 104,30 4,40 102,43 0,67 6:40 99,73 1,21 104,32 4,34 102,47 0,68 7:00 99,09 1,66 104,33 4,34 102,47 0,67 7:20 99,40 1,42 104,28 4,37 102,45 0,70
100
7:40 100,27 0,66 104,31 4,39 102,22 0,90 8:00 100,87 0,47 104,31 4,37 102,17 0,91 8:20 101,31 0,70 104,33 4,36 102,04 0,94 8:40 101,48 0,84 104,20 4,46 102,16 0,88 9:00 101,63 1,15 104,33 4,35 102,07 0,95 9:20 101,95 1,27 104,18 4,44 101,94 1,03 9:40 102,18 1,49 104,30 4,38 101,88 1,08
10:00 102,18 1,72 104,32 4,38 101,88 1,10 10:20 101,98 1,43 104,13 4,51 101,91 1,11 10:40 102,36 1,83 104,17 4,52 101,93 1,09 11:00 102,64 2,05 104,15 4,53 101,96 1,07 11:20 102,85 2,25 104,23 4,50 101,99 1,07 11:40 102,78 2,48 104,33 4,44 102,11 1,01 12:00 102,74 2,56 104,19 4,55 102,12 1,03 12:20 102,78 2,56 104,18 4,58 101,93 1,13 12:40 102,91 2,49 104,22 4,57 102,17 1,01 13:00 103,06 2,42 104,23 4,60 102,20 1,00 13:20 103,00 2,57 104,18 4,64 102,28 0,98 13:40 102,91 2,44 104,27 4,66 102,50 0,87 14:00 102,82 2,61 104,23 4,68 102,57 0,89 14:20 102,93 2,58 104,29 4,65 102,27 1,10 14:40 102,78 2,76 104,31 4,64 102,48 0,94 15:00 102,96 2,69 104,21 4,72 102,55 0,93 15:20 103,01 2,45 104,22 4,73 102,54 0,91 15:40 102,76 2,70 104,28 4,73 102,21 1,05 16:00 102,74 2,51 104,28 4,74 101,99 1,18 16:20 102,58 2,64 104,28 4,77 102,20 1,10 16:40 101,98 2,07 104,26 4,79 102,26 1,07 17:00 101,95 2,04 104,28 4,82 102,06 1,18 17:20 102,19 2,17 104,34 4,77 102,07 1,19 17:40 102,01 2,05 104,30 4,82 101,96 1,27 18:00 102,32 2,32 104,33 4,78 101,91 1,30 18:20 102,55 2,49 104,37 4,77 101,90 1,31 18:40 102,74 2,60 104,32 4,83 102,07 1,20 19:00 102,69 2,72 104,32 4,81 101,99 1,24 19:20 102,60 2,77 104,37 4,80 102,07 1,21 19:40 102,69 2,81 104,32 4,83 101,97 1,29 20:00 102,67 2,79 104,25 4,88 102,00 1,27
Anhang, Tab. 7: Innere Atemwegsfläche nach Allergenprovokation passiv sensibilisierter und Anti-IgE-behandelter PCLS von Weißbüschelaffen (n=3). Zeitpunkt 0 repräsentiert die initiale Atemwegsfläche.
101
Histamin [ng/ml] Sensibilisierte und Anti-IgE-behandelte PCLS
0,05 µM 0,5 µM 5 µM Mittelwert SEM Mittelwert SEM Mittelwert SEM
2,45 0,53 1,73 0,11 2,15 0,43
Anhang, Tab. 8: Histamingehalt der Überstände von passiv sensibilisierten, Anti-IgE-behandelten und Allergen-stimulierten PCLS von Weißbüschelaffen (n=3).
9.5. Behandlung von sensibilisierten Weißbüschelaffen-PCLS mit dem Kontroll-DARPin
Minuten
Atemwegsfläche [% der initialen Fläche] Sensibilisierte und DARPin bi53_86-behandelte PCLS
0,05 µM 0,5 µM 5 µM Mittelwert SEM Mittelwert SEM Mittelwert SEM
0 100,00 0,00 100,00 0,00 100,00 0,00 0:20 101,42 1,75 101,34 1,26 100,31 0,37 0:40 101,37 1,58 101,93 1,52 100,53 0,43 1:00 99,21 0,28 102,12 1,90 100,02 1,28 1:20 95,16 2,98 99,66 2,15 97,09 3,61 1:40 91,76 5,46 97,27 2,50 95,13 5,72 2:00 89,01 7,43 93,14 4,87 92,75 7,31 2:20 87,57 8,61 89,00 7,40 91,40 7,86 2:40 86,79 9,15 86,89 8,74 90,97 9,23 3:00 86,74 9,33 84,75 9,88 89,64 9,82 3:20 86,74 9,07 83,18 10,52 89,45 9,85 3:40 87,02 8,44 81,76 11,17 89,02 10,13 4:00 87,55 7,78 80,53 11,33 88,49 10,25 4:20 88,64 6,94 80,18 11,49 88,24 10,45 4:40 89,47 5,94 79,45 11,51 88,71 10,44 5:00 90,46 5,03 79,10 11,09 88,34 10,46 5:20 91,21 4,17 79,02 10,99 88,40 10,51 5:40 92,00 3,35 79,29 10,87 88,12 10,58 6:00 92,94 2,53 79,80 10,47 88,03 10,22 6:20 93,74 1,88 80,47 10,01 87,35 9,67 6:40 94,27 1,33 81,13 9,69 86,84 9,05 7:00 94,91 0,80 81,85 9,43 86,07 8,69 7:20 95,45 0,36 82,40 9,09 85,33 7,97 7:40 95,93 0,38 83,13 8,85 84,67 7,46 8:00 96,14 0,42 83,74 9,13 84,05 7,36
102
8:20 96,34 0,83 84,80 8,85 84,39 7,02 8:40 96,96 0,90 85,88 8,50 84,20 6,98 9:00 97,42 1,06 86,46 8,56 84,22 7,41 9:20 97,75 1,23 87,02 8,64 84,32 7,50 9:40 98,05 1,26 87,70 8,47 84,81 7,58
10:00 98,54 1,37 88,23 8,50 84,48 8,81 10:20 98,59 1,48 88,80 8,40 86,06 7,96 10:40 98,03 1,94 89,27 8,33 85,41 9,44 11:00 98,36 2,16 89,34 8,27 85,67 9,37 11:20 98,50 2,20 89,90 8,03 86,21 9,31 11:40 98,69 2,16 90,41 7,87 86,49 9,40 12:00 99,02 2,32 90,79 7,88 86,91 9,22 12:20 99,18 2,16 91,25 7,72 87,23 9,59 12:40 99,11 2,13 91,62 7,63 87,70 9,46 13:00 99,37 2,21 91,56 7,97 87,63 9,86 13:20 99,53 2,07 92,32 7,66 87,95 9,75 13:40 99,39 2,33 92,51 7,55 87,84 10,05 14:00 99,41 2,32 93,02 7,44 87,97 10,13 14:20 99,69 2,12 93,38 7,36 88,29 9,98 14:40 99,63 2,43 93,37 7,29 88,60 9,79 15:00 99,79 2,36 93,81 7,19 89,31 9,58 15:20 99,73 1,99 94,16 7,10 88,53 10,38 15:40 100,14 2,11 94,26 7,06 89,55 9,46 16:00 99,80 2,28 94,40 7,02 88,57 10,48 16:20 99,90 2,07 94,72 6,85 89,45 9,86 16:40 99,53 2,31 94,91 6,72 89,65 9,58 17:00 99,76 2,18 94,99 6,81 89,78 9,85 17:20 99,92 2,01 95,19 6,76 89,68 9,87 17:40 99,44 2,11 95,52 6,66 90,26 9,55 18:00 99,50 2,28 95,57 6,69 89,59 9,97 18:20 100,03 1,97 95,62 6,68 89,63 10,21 18:40 99,74 2,08 95,92 6,44 89,54 10,30 19:00 99,73 2,17 96,49 6,01 90,08 9,88 19:20 99,97 2,04 96,19 6,22 89,45 10,27 19:40 99,40 2,32 96,03 6,36 90,03 10,06 20:00 99,38 2,34 96,36 6,13 89,39 10,22
Anhang, Tab. 9: Innere Atemwegsfläche nach Allergenprovokation passiv sensibilisierter und kontrollbehandelter PCLS von Weißbüschelaffen (n=3). Zeitpunkt 0 repräsentiert die initiale Atemwegsfläche.
103
Histamin [ng/ml] Sensibilisierte und DARPin bi53_86-behandelte PCLS 0,05 µM 0,5 µM 5 µM
Mittelwert SEM Mittelwert SEM Mittelwert SEM 3,67 0,41 3,51 0,73 2,42 0,41
Anhang, Tab. 10: Histamingehalt der Überstände von passiv sensibilisierten, kontrollbehandelten und Allergen-stimulierten PCLS von Weißbüschelaffen (n=3).
9.6. Behandlung von sensibilisierten Javaneraffen-PCLS mit dem Anti-IgE- DARPin
Minuten
Atemwegsfläche [% der initialen Fläche] Sensibilisierte und DARPin bi53_79-behandelte PCLS
0,05 µM 0,5 µM 5 µM Mittelwert SEM Mittelwert SEM Mittelwert SEM
0 100,00 0,00 100,00 0,00 100,00 0,00 0:20 100,34 0,20 99,66 0,35 99,86 0,35 0:40 98,08 2,12 97,04 2,26 99,68 0,62 1:00 96,54 2,30 95,06 4,28 99,63 0,80 1:20 92,88 5,04 96,15 3,20 99,54 0,98 1:40 92,50 5,92 94,73 4,54 99,23 1,38 2:00 92,15 5,89 93,23 5,94 98,86 1,77 2:20 87,63 5,62 91,30 7,65 98,45 2,20 2:40 81,03 7,63 90,51 8,28 98,00 2,66 3:00 77,49 9,75 90,19 8,41 97,74 2,93 3:20 75,04 11,13 90,25 8,18 97,61 3,04 3:40 73,09 12,41 89,79 8,27 97,52 3,17 4:00 71,00 13,74 88,55 9,07 97,39 3,32 4:20 69,39 14,97 88,02 9,21 97,26 3,49 4:40 67,78 16,21 87,40 9,30 97,25 3,49 5:00 66,81 16,90 86,05 9,86 97,17 3,59 5:20 66,36 17,10 85,33 9,97 97,20 3,49 5:40 66,54 17,04 85,30 9,69 97,23 3,52 6:00 66,56 16,83 85,09 9,69 97,27 3,51 6:20 66,80 16,69 84,60 10,53 97,18 3,55 6:40 66,90 16,50 84,73 10,55 96,99 3,74 7:00 66,91 16,19 84,56 10,33 96,61 4,10 7:20 67,03 16,00 84,66 9,90 96,59 4,04 7:40 67,25 15,91 84,09 10,01 96,20 4,47 8:00 67,42 15,81 83,69 10,13 96,07 4,53
104
8:20 67,49 15,69 83,55 9,92 95,96 4,69 8:40 66,92 15,19 83,99 9,70 95,80 4,84 9:00 66,80 15,00 83,89 9,68 95,65 4,91 9:20 66,81 14,76 83,67 9,72 95,43 5,05 9:40 67,06 14,70 83,68 9,84 95,41 5,20
10:00 67,54 14,77 83,42 9,93 95,28 5,30 10:20 68,13 14,82 83,72 9,60 95,30 5,28 10:40 68,09 14,63 83,94 9,26 95,11 5,52 11:00 68,09 14,54 84,16 9,09 95,16 5,45 11:20 68,69 14,62 84,13 9,10 95,19 5,43 11:40 68,80 14,51 84,40 8,69 95,35 5,31 12:00 69,13 14,43 85,04 8,45 95,33 5,39 12:20 69,82 14,64 85,44 8,11 95,43 5,29 12:40 69,97 14,66 85,55 7,64 95,48 5,30 13:00 70,25 14,72 85,93 7,47 95,52 5,31 13:20 70,18 14,83 86,22 7,26 95,56 5,28 13:40 71,08 14,97 86,76 6,98 95,70 5,21 14:00 71,43 15,07 87,44 6,59 95,74 5,20 14:20 71,78 15,16 88,18 5,89 95,83 5,11 14:40 72,24 15,25 88,49 5,65 95,81 5,09 15:00 72,14 15,29 89,35 5,20 95,93 4,90 15:20 72,07 15,22 89,15 4,89 96,02 4,83 15:40 72,48 15,28 89,07 4,78 95,97 4,81 16:00 72,54 15,33 90,24 4,17 96,05 4,67 16:20 72,79 15,27 91,04 3,87 96,19 4,50 16:40 73,24 15,24 91,39 3,94 96,30 4,32 17:00 73,44 15,17 91,35 4,38 96,64 4,11 17:20 73,81 15,14 91,79 4,86 96,67 4,08 17:40 74,00 15,14 92,58 4,61 96,78 3,88 18:00 74,59 15,10 93,60 4,25 96,75 3,86 18:20 74,78 14,91 94,70 3,76 96,80 3,82 18:40 74,66 14,94 94,99 4,08 96,99 3,83 19:00 75,09 14,83 95,53 4,20 97,07 3,70 19:20 75,34 14,86 95,91 4,47 97,19 3,61 19:40 75,92 14,70 95,85 4,95 97,09 3,74 20:00 76,43 14,40 95,96 5,12 97,22 3,58
Anhang, Tab. 11: Innere Atemwegsfläche nach Allergenprovokation passiv sensibilisierter und Anti-IgE-behandelter PCLS von Javaneraffen (n=4). Zeitpunkt 0 repräsentiert die initiale Atemwegsfläche.
105
Histamin [ng/ml] Sensibilisierte und Anti-IgE-behandelte PCLS
0,05 µM 0,5 µM 5 µM Mittelwert SEM Mittelwert SEM Mittelwert SEM
19,63 3,88 6,45 0,57 4,36 0,89
Anhang, Tab. 12: Histamingehalt der Überstände von passiv sensibilisierten, Anti-IgE-behandelten und Allergen-stimulierten PCLS von Javaneraffen (n=4).
9.7. Behandlung von sensibilisierten Javaneraffen-PCLS mit dem Kontroll-DARPin
Minuten
Atemwegsfläche [% der initialen Fläche] Sensibilisierte und DARPin bi53_86-behandelte PCLS
0,05 µM 0,5 µM 5 µM Mittelwert SEM Mittelwert SEM Mittelwert SEM
0 100,00 0,00 100,00 0,00 100,00 0,00 0:20 98,31 1,69 95,21 4,88 98,27 1,86 0:40 92,75 6,61 88,95 10,21 93,04 3,85 1:00 88,48 9,38 86,70 12,24 86,02 5,51 1:20 86,15 10,59 85,42 12,26 81,65 4,74 1:40 82,08 11,81 83,83 11,88 77,97 4,73 2:00 79,75 12,90 80,28 11,49 75,77 5,80 2:20 77,25 13,56 75,32 11,06 73,51 7,03 2:40 75,19 13,50 71,25 11,69 71,70 8,37 3:00 73,07 13,61 69,16 12,01 71,50 8,81 3:20 70,26 13,72 64,99 11,66 71,55 9,04 3:40 67,62 13,87 63,23 11,82 72,06 9,31 4:00 65,65 13,94 62,71 12,15 70,82 10,33 4:20 64,41 13,66 61,62 12,43 71,10 10,41 4:40 63,39 13,82 60,82 12,59 71,33 10,44 5:00 62,13 13,47 60,74 12,59 70,77 10,99 5:20 61,29 13,33 60,91 12,62 70,50 10,94 5:40 60,91 13,24 60,91 12,68 69,99 11,50 6:00 60,74 13,02 61,10 12,70 70,01 11,53 6:20 61,32 13,39 60,62 12,73 69,13 12,20 6:40 61,94 13,64 60,18 12,73 69,02 12,39 7:00 62,66 13,77 59,87 12,78 66,84 13,53 7:20 62,77 13,58 59,62 12,54 67,36 13,47 7:40 62,64 13,46 59,58 12,47 67,97 13,44 8:00 63,70 13,63 59,74 12,35 68,48 13,60
106
8:20 63,69 13,22 59,78 11,82 69,09 13,77 8:40 63,96 13,04 59,90 11,14 69,84 14,06 9:00 64,13 12,84 60,17 10,53 70,26 14,15 9:20 65,22 13,21 61,02 10,49 70,91 14,18 9:40 66,11 13,32 61,44 10,06 72,01 14,37
10:00 66,80 13,33 61,10 8,94 72,05 14,64 10:20 67,63 13,53 60,31 7,99 74,99 14,88 10:40 68,04 14,01 61,51 8,32 76,49 15,45 11:00 68,69 14,13 62,09 8,29 77,42 15,97 11:20 69,31 14,12 62,01 7,96 77,91 16,43 11:40 70,26 14,17 62,44 8,02 78,48 16,80 12:00 70,88 14,10 63,84 8,56 78,84 17,10 12:20 71,04 13,98 65,08 9,07 79,31 17,40 12:40 71,40 13,92 66,00 9,44 79,73 17,69 13:00 72,88 14,25 66,89 9,71 79,96 17,84 13:20 73,24 14,36 67,80 10,00 80,45 18,05 13:40 73,92 14,30 68,66 10,27 80,65 18,15 14:00 74,52 14,24 69,20 10,51 80,76 18,22 14:20 74,69 14,76 69,43 10,65 80,92 18,23 14:40 75,39 14,80 69,95 10,80 81,11 18,30 15:00 75,90 14,85 70,36 10,94 81,20 18,31 15:20 76,07 14,91 70,91 11,17 81,55 18,39 15:40 76,42 15,06 71,40 11,38 81,65 18,43 16:00 76,68 15,14 71,75 11,57 81,78 18,43 16:20 76,99 15,13 72,26 11,82 81,93 18,44 16:40 77,24 15,00 72,71 12,00 81,94 18,41 17:00 77,59 14,97 73,10 12,23 82,25 18,50 17:20 77,71 15,01 73,47 12,37 82,49 18,49 17:40 77,92 15,02 73,91 12,64 82,56 18,50 18:00 77,99 15,13 74,32 12,71 82,42 18,41 18:20 78,05 15,19 74,75 12,95 82,58 18,42 18:40 78,27 15,16 75,12 13,13 82,65 18,42 19:00 78,49 15,08 75,55 13,29 82,63 18,31 19:20 78,49 15,25 75,84 13,38 82,86 18,33 19:40 78,40 15,47 76,02 13,48 82,70 18,30 20:00 78,39 15,67 76,31 13,56 82,79 18,32
Anhang, Tab. 13: Innere Atemwegsfläche nach Allergenprovokation passiv sensibilisierter und kontrollbehandelter PCLS von Javaneraffen (n=4). Zeitpunkt 0 repräsentiert die initiale Atemwegsfläche.
107
Histamin [ng/ml] Sensibilisierte und bi53_86-behandelte PCLS
0,05 µM 0,5 µM 5 µM Mittelwert SEM Mittelwert SEM Mittelwert SEM
17,92 4,03 20,64 7,61 21,41 3,98
Anhang, Tab. 14: Histamingehalt der Überstände von passiv sensibilisierten, kontrollbehandelten und Allergen-stimulierten PCLS von Javaneraffen (n=4).
Danksagung
Es war der 1.9.2012, als ich Teil einer sehr gut aufgestellten Arbeitsgruppe wurde.
Sascha und Christoph – dass man sich so schnell blind versteht, ist keine
Selbstverständlichkeit! Jeder brachte seinen individuellen Erfahrungs- und
Wissensschatz (aber natürlich auch Charme) in die Gruppe ein, wodurch wir uns
prima ergänzten. Deshalb werde ich immer gern an unsere starke und motivierte
Teamarbeit denken. Auch wenn ich eurem Schritttempo nicht immer folgen konnte...
Der Spaß kam dabei definitiv nie zu kurz. Erst recht nicht, wenn ahnungslose
Putzfrauen für Teammitglieder gehalten wurden!
Sascha – ich danke dir für deine stets aufrichtige und kompetente Betreuung. Du
warst zu jeder Zeit in allen Fragen und Sorgen ein wunderbarer Ansprechpartner.
Ein großes Dankeschön auch an Herrn Kaup, Armin und Katherina für ihre
unkomplizierte, fachkundige und stets zielführende Beratung.
Und danke dir – Franzi – für die reibungslose Übernahme unseres Teams und
deinen uneigennützigen Einsatz in allen Belangen.
Christoph – die (verbale) Kommunikation war manchmal schwierig. Der eine
nuschelt, der andere hört schwer – das konnte nur lustig enden. Ob das Fenster auf
oder zu bleiben soll... wir werden es wohl nie klären. Ich werde immer daran denken,
dass du mir vor wichtigen Ereignissen stets viel Glück gewünscht hast.
Danke auch an alle anderen Kollegen, ohne die meine Arbeit niemals so beständig
hätte vorangetrieben werden können. Da denke ich vor allem an Tamara und das
gesamte Schleusen- bzw. Sektionsteam, aber auch an alle anderen Mitarbeiter der
Tierhaltung und Infektionspathologie des DPZs und der Abteilung
Atemwegsimmunologie des Fraunhofer ITEMs.
Sarah – sowohl dein Einsatz, als ich gezwungenermaßen pausieren musste, als
auch all deine unzähligen Mails waren unbezahlbar!
Danke Sharon für die gemeinsame und produktive Projektarbeit.
Ich werde auch noch oft an die unendlichen Abende denken, die ich mit euch –
Emma & Susann – an den Bronchokonstriktionsmessplätzen verbracht habe.
Mit einem Schmunzeln im Gesicht sehe ich die Mittagsrunde vor mir, wie sie
geduldig auf mich wartet.
Yvonne, Anne, Karen, Simone & Simone, Luisa, Christiane, Corinna und Daniel –
auch euch großen Dank für den ein oder anderen fachlichen Austausch, aber auch
den gemütlichen und lustigen Pausenplausch.
Natürlich wurden uns auch allen gelegentlich Steine in den Weg gelegt – dem Einen
Kleinere, dem Anderen Größere. Aber wir sind an unseren Herausforderungen
gewachsen. Und wer weiß das besser als ich... Deshalb möchte ich an dieser Stelle
noch einmal allen dafür danken, dass ihr an mich gedacht und mir die Daumen
gedrückt habt, als ich schwer krank wurde.
Dass ich überhaupt so viel Kraft in die Doktorarbeit stecken konnte, verdanke ich vor
allem meinen Eltern, die mir stets den Rücken frei hielten und jede meiner
Entscheidungen bedingungslos unterstützt haben.
Und Sven... Du bist wirklich mein Held.
Macht’s gut Nachbarn! Passt auf euch auf!
Eure Judy
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Untersuchungen zur Prävention von
Asthma in einem ex vivo Lungenmodell unter Verwendung von nicht-menschlichen
Primaten“ selbstständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen
Dritter in Anspruch genommen:
• Technisch-methodische Einweisung durch technische AssistentInnen der
Abteilung Infektionspathologie des Deutschen Primatenzentrums in Göttingen
und des Bereichs Präklinische Prüfung des Fraunhofer ITEMs in Hannover.
• Redaktionelle Überarbeitung durch wissenschaftliche Mitarbeiter und Leiter
der Abteilung Infektionspathologie des Deutschen Primatenzentrums in
Göttingen und des Bereichs Präklinische Prüfung des Fraunhofer ITEMs in
Hannover.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten
(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat
von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die
im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt:
• Abteilung Infektionspathologie des Deutschen Primatenzentrums in Göttingen
unter der Leitung von Univ.-Prof. Dr. F.-J. Kaup
• Bereich Präklinische Prüfung des Fraunhofer ITEMs in Hannover unter der
Leitung von Prof. Dr. A. Braun
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen
ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig
und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.
Judy Wichmann
