TiHo Hannover · Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 13 2 LITERATURÜBERSICHT 15 2.1 DIE VERSCHIEDENEN ALLERGIEFORMEN 15 2.2 DAS SOMMEREKZEM – EINE TYP …

Aus der Arbeitsgruppe Immunologie

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Untersuchungen zum Einfluss von parasitären

Antigenen auf die Typ-I-Allergie beim

Sommerekzem des Pferdes

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Julia Elisabeth Heselhaus

aus Bonn

Hannover 2005

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. W. Leibold

Erster Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. W. Leibold

Zweiter Gutachter: Apl.-Prof. Dr. med. vet. A. Tenter

Tag der mündlichen Prüfung: 30. Mai 2005

Zur Erinnerung an Faxa, Snaelda, Jaka und Drottning

Für meinen Vater,

der mir ermöglichte, das zu werden,

was ich bin.

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 13

2 LITERATURÜBERSICHT 15

2.1 DIE VERSCHIEDENEN ALLERGIEFORMEN 15

2.2 DAS SOMMEREKZEM – EINE TYP-I-ALLERGIE DES PFERDES 17

2.3 DER MECHANISMUS DER TYP-I-REAKTION 20

2.4 DAS TH1-TH2-MODELL 22

2.5 TYP-I-IMMUNMECHANISMEN DER PARASIT-WIRT-INTERAKTION 24

2.5.1 TYP-I-HYPERSENSITIVITÄTSREAKTION 25

2.5.2 „SELBSTHEILUNGREAKTION“, „SELF CURE“ 26

2.5.3 ANDERE FORMEN DER ANTIPARASITÄREN TYP-I-REAKTION 27

2.6 BEDEUTUNG DER IMMUNGLOBULIN-ISOTYPEN BEI DER HELMINTHENABWEHR 28

2.7 IMMUNMODULATION DER ALLERGISCHEN TYP-I-REAKTION DURCH HELMINTHEN 31

3 MATERIAL UND METHODEN 34

3.1 PROBANDEN 34

3.1.1 PROBANDEN DER ARBEITSGRUPPE IMMUNOLOGIE 34

3.1.2 ZUSÄTZLICHE PROBANDEN 35

3.1.3 HALTUNGS- UND FÜTTERUNGSBEDINGUNGEN 36

3.2 GERÄTE 36

3.3 MATERIAL 37

3.3.1 VERBRAUCHSMATERIALIEN 37

3.3.2 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 38

3.3.3 ANTIKÖRPER UND SEREN 40

3.3.4 ALLERGENE 41

3.3.5 MEDIKAMENTE 42

3.3.6 PUFFER, GEBRAUCHSLÖSUNGEN UND NACHWEISREAGENZIEN 42

3.3.7 SOFTWARE ZUR DATENAUSWERTUNG 47

3.4 METHODEN 48

3.4.1 VERSUCHSAUFBAU 48

3.4.2 BLUTENTNAHME 50

3.4.3 FUNKTIONELLER IN-VITRO-TEST (FIT) ZUR BESTIMMUNG DER

SENSIBILISIERUNG BASOPHILER GRANULOCYTEN 50

3.4.4 IMMUNISIERUNG 56

3.4.5 ENTWURMUNG 56

3.4.6 ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) 56

3.4.7 CORTISONAPPLIKATION 60

3.4.8 NEMATODENNACHWEIS 60

3.4.9 ALLERGENPRÄPARATION (CYATHOSTOMINAE SPP.) 61

4 ERGEBNISSE 63

4.1 MODULATION DER SENSIBILISIERUNG DER BASOPHILEN GRANULOCYTEN DURCH

IMMUNISIERUNG MIT DEN REKOMBINANTEN PROTEINEN „TCA“ UND „TCB“ 63

4.1.1 PARADOXE REAKTION DER VERSUCHSPFERDE AUF DIE IMMUNISIERUNG MIT

DEN REKOMBINANTEN PROTEINEN TCA UND TCB 64

4.1.2 AUSWIRKUNGEN DES THERAPEUTISCHEN METHYLPREDNISOLONS NACH

IMMUNISIERUNG 67

4.2 VERLAUF DER ALLERGEN- UND ANTIGENSPEZIFISCHEN SENSIBILISIERUNG ÜBER

EINEN LÄNGEREN ZEITRAUM 76

4.2.1 IMMUNISIERTE PFERDE 77

4.2.2 KONTROLLGRUPPE 79

4.3 ZUR ENTWICKLUNG DER NEMATODENBELASTUNG 81

4.4 MODULATION DER SENSIBILISIERUNG DER BASOPHILEN GRANULOCYTEN DURCH

ANTHELMINTHISCHE BEHANDLUNG 85

4.4.1 GESAMTHISTAMIN IN DEN ERSTEN DREI WOCHEN NACH ANTHELMINTHISCHER

THERAPIE 86

4.4.2 VERÄNDERUNGEN IN DEN FUNKTIONELLEN SENSIBILISIERUNGEN NACH

ANTHELMINTHISCHER BEHANDLUNG (FIT) 88

4.4.3 VERÄNDERUNGEN BEI EINEM SCHWACH BELASTETEN PFERD OHNE HOHEN

INFEKTIONSDRUCK 94

4.4.4 VERÄNDERUNGEN IN DEN FUNKTIONELLEN SENSIBILISIERUNGEN NACH

ANTHELMINTHISCHER BEHANDLUNG UND FOLGEND METHYLPREDNISOLON 96

4.4.5 VERÄNDERUNGEN IN DEN SENSIBILISIERUNGEN NACH METHYLPREDNISOLON

OHNE VORHERGEHENDE ANTHELMINTHISCHE BEHANDLUNG 101

4.5 SENSIBILISIERUNG GEGEN CYATHOSTOMINAE SPP. 105

4.6 ZUM ISOTYPEN-ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) 107

4.6.1 ELISA ZUM NACHWEIS VON EQUINEN IMMUNGLOBULINEN GEGEN TCA UND

TCB 110

4.6.2 ELISA ZUM NACHWEIS VON EQUINEN IMMUNGLOBULINEN GEGEN

CYATHOSTOMINAE SPP. 112

4.6.3 ELISA ZUR UNTERSUCHUNG DES VERLAUFS DES GESAMT-IGE-TITERS BEI

AUSGEWÄHLTEN PFERDEN 117

4.6.4 VERHÄLTNIS VON SPEZIFISCHEM IGE ZU GESAMT-IGE 119

4.7 BEZIEHUNGEN ZWISCHEN SPEZIFISCHEN SENSIBILISIERUNGEN DER BASOPHILEN

GRANULOCYTEN UND ELISA-TITERN 120

4.7.1 BEEINFLUSSUNG DER FUNKTIONELLEN, SPEZIFISCHEN SENSIBILISIERUNG VON

BASOPHILEN DURCH IMMUNGLOBULINE BESTIMMTER SPEZIFITÄT 120

4.7.2 BEEINFLUSSUNG DER FUNKTIONELLEN SENSIBILISIERUNG VON BASOPHILEN

DURCH IGE-TITERVERHÄLTNISSE 122

5 DISKUSSION 124

5.1 ZUR PARADOXEN REAKTION DER PFERDE IM RAHMEN DER IMMUNISIERUNG MIT

DEN REKOMBINANTEN PARASITENPROTEINEN TCA UND TCB 124

5.2 ZUR MODULATION DER SENSIBILISIERUNG DER BASOPHILEN GRANULOCYTEN

DURCH ANTHELMINTHISCHE BEHANDLUNG DER PFERDE 126

5.3 ZUR MODULATION DER SENSIBILISIERUNG DER BASOPHILEN GRANULOCYTEN

DURCH METHYLPREDNISOLON 130

5.4 ZUM ISOTYPEN-ELISA 132

6 ZUSAMMENFASSUNG 136

7 SUMMARY 139

8 LITERATURVERZEICHNIS 142

Glossar und Verzeichnis der in Text und Abbildungen verwendeten Abkürzungen

+ Standardabweichung α anti- (gerichtet gegen) Abb. Abbildung Ag Antigen Allergen Ein Antigen, das in einem entsprechend sensibilisierten Individuum

eine Typ-I-Überempfindlichkeitsreaktion hervorruft Antigen Ein Fremdstoff, der eine Immunantwort induziert. Hier auch verwendet

als Synonym für TcA und TcB Ak Antikörper Aliquots aliquote Teile, gleiche Anteile einer Probe a. med. ante medicationem (vor Medikation) Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser) Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) B0 histaminfreie Probe im RIA; da es sich bei dem verwendeten System

um einen kompetitiven RIA handelt, wird hier durch den spezifischen Antikörper die maximal erfassbare Menge an 125J-markiertem Histamin bestimmt, ohne dass ein Probenhistamin konkurriert; dient als Bezugs-größe (100%) für die Probenwerte, in denen ggf. das zu bestimmende konkurrierende Histamin enthalten ist

Bq Becquerel, SI-Einheit für die Aktivität einer radioaktiven Substanz, 1 Bq = 1 Zerfall pro Sekunde; alte Einheit Curie, 1 Ci = 3,7 x 1010Bq

BSA Bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise ca. cirka °C Grad Celsius Challenge engl., Belastungsinfektion, Provokation, Konfrontation Cn Culicoides nubeculosus Coating Beschichtung, hier Beschichtung der Plastikoberfläche der

Mikrotiterplatte, erster Schritt im ELISA cpm counts per minute (Zählimpulse pro Minute) Cup Reaktionsgefäß D Dalton (1,66018 x 10-24g) d dies, lateinisch: Tag dl Deziliter (100 ml) DMSO Dimethylsulfoxid Dualmodus Messung der Extinktion von Flüssigkeiten im Photometer (ELISA) bei

zwei Wellenlängen (Testfilter und Referenzfilter). Ermöglicht die Elimination von Messfehlern durch Schmutz, Kratzer oder Feuchtigkeit auf der Mikrotiterplatte.

EDTA Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat “Ekzemer” an Sommerekzem erkrankte Pferde (auch außerhalb der klinisch

manifesten Periode) ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Enzym-gekoppelter

Immunadsorbtionstest) engl. englisch

Glossar

et al. et alii, lateinisch : und andere Eq/eq equines, equiner, equine evtl. eventuell Fa. Firma Fc fragment crystallizable; durch Disulfidbrücken verbundene C-terminale

Domänen (C2+C3 bzw. C2 - C4) der konstanten Immunglobulinkette, ein Teilbereich dieses Ig-Fragmentes kann an geeignete Fc-Zellrezeptoren binden.

FcεRI Fcε-Rezeptor I (Rezeptor, der den Fc-Teil von IgE mit hoher Affinität bindet, Bindungsaffinität 10-10 mol/l)

FcγRI Fcγ-Rezeptor I (Rezeptor, der den Fc-Teil von IgG mit hoher Affinität bindet, Bindungsaffinität 10-8 mol/l)

FcγRII Fcγ-Rezeptor II (Rezeptor, der den Fc-Teil von IgG bindet, Bindungsaffinität 10-7 bis 10-6 mol/l)

FcγRIII Fcγ-Rezeptor III (Rezeptor, der den Fc-Teil von IgG bindet, Bindungsaffinität 10-7 bis 10-6 mol/l)

FIT Funktioneller In-vitro-Test für Typ-I-Allergien g Gramm gαh, gah goat anti horse (Ziege-anti-Pferd)-Antikörper ggf. gegebenenfalls ggr. geringgradig h hora (Stunde) high responder Organismus, der auf ein bestimmtes Antigen mit einer starken

Immunantwort reagiert hgr. hochgradig H+L schwere (H=heavy) und leichte (L=light) Immunglobulinketten IFN Interferon Ig Immunglobulin IgA Immunglobulin A IgE Immunglobulin E IgG Immunglobulin G IL Interleukin i.v. intravenös kDa Kilodalton (103 Dalton) kg Kilogramm KGW Körpergewicht l Liter lfd. laufend log dekadischer Logarithmus low responder Organismus, der auf ein bestimmtes Antigen mit einer schwachen

Immunantwort reagiert µ mikro (x 10-6) µg Mikrogramm µl Mikroliter m milli (x 10-3) M mol/l mAk monoklonaler Antikörper mg Milligramm mgr. mittelgradig

Glossar

min Minuten ml Milliliter mmol Millimol Mo. Monate mOD milli optische Dichte, Einheit für im ELISA-Photometer gemessene

Extinktionen MW Mittelwert n Stichprobenumfang NHS-Biotin N-Hydroxysuccinimido-Biotin „Nichtekzemer“ nicht an Sommerekzem erkrankte Pferde NK-Zellen natürliche Killerzellen ng Nanogramm nm Nanometer (1x10-9m) Nr. Nummer NSB nicht spezifische Bindung; messbare Radioaktivität im RIA, die nicht

durch spezifische Bindung an Antiserum zustande kommt PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PEG Polyethylenglykol pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoff-Ionenkonzentration Pipes Piperazine-N,N´-bis[2-ethanesulfonic]acid (Piperazin-N,N’-bis[2-

ethansulfonsäure) pg Pikogramm (10-12 g) p. med. post medicationem (nach Medikation) post lateinisch: nach prae lateinisch: vor Pred. Prednisolon (hier für Methylprednisolon) Release Freisetzung, hier Histaminfreisetzung aus basophilen Granulozyten RIA Radioimmunoassay (Radioimmuntest) rpm rotation per minute (Umdrehungen pro Minute) RT Raumtemperatur s. siehe SE Sommerekzem sek. Sekunden spp. species (Arten) Tab. Tabelle TcA rekombinantes Protein „A“ aus dem Nematoden Trichostrongylus

colubriformis TcB rekombinantes Protein „B“ aus dem Nematoden Trichostrongylus

colubriformis TcA/TcB-Pferde mit TcA und TcB immunisierte Pferde TH-Zelle T-Helferzelle TH1-Zelle, TH2-Zelle Subpopulationen von T-Helfer-Zellen TMB Tetramethylbenzidin TNF Tumornekrosefaktor Tris Trishydroxymethylaminomethan U Unit (Einheit) u.a. unter anderem well Mikrotiterplattenvertiefung einer ELISA-Platte v.a. vor allem

Glossar

vergl. vergleiche Wo. Wochen Wk Wurmkur xg multipliziert mit der Erdbeschleunigung (9,81 m/sek2) z. B. zum Beispiel

Einleitung und Zielsetzung 13

1 Einleitung und Zielsetzung

Weltweit, jedoch insbesondere in den Industrieländern, nehmen Überempfindlich-

keitsreaktionen vom Soforttyp (Typ-I-Allergie) zu. Vielfältige Forschungen beschäftigen sich

mit dem Pathomechanismus, der einen oft harmlosen Fremdstoff als gefährlich einstuft und

überschießend darauf reagiert. Im Grunde handelt es sich um einen physiologischen

Schutzmechanismus des Körpers, der eine wichtige Rolle insbesondere in der Auslösung und

Koordination von Entzündungen, z. B. der Abwehr von Parasiten, spielt. Er ist einer – noch

weitgehend unbekannten – Regulation unterworfen. Diese Regulation scheint bei der Typ-I-

Allergie verändert oder entglitten zu sein. Dabei ist es kein „Entweder-oder-Prinzip“,

entweder Parasitenabwehr oder allergische Erkrankung, denn beide Formen können

gleichzeitig im selben Organismus vorkommen.

Auch beim Pferd treten Schutz und Pathologie der Typ-I-Immunreaktion nebeneinander auf.

Nahezu alle Pferde in Deutschland, insbesondere die auf der Weide und in einer Herde

gehaltenen Tiere, sind mit Magen-Darm-Parasiten befallen. Bei ihnen werden wie bei anderen

Tierarten und beim Menschen normalerweise Schutzmechanismen wirksam, die sich mit

diesen Parasiten ständig auseinandersetzen. Ein Teil dieser Pferde entwickelt aus bisher

unbekannten Gründen allergische Erkrankungen, z. B. das sog. „Sommerekzem“. Hierbei

handelt es sich zumeist um eine Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ I gegen Bestandteile

blutsaugender Insekten, wobei die Gnitzenart Culicoides nubeculosus neben anderen Insekten

in Deutschland eine besonders prägnante Rolle spielt. Die betroffenen Pferde scheuern sich

aufgrund des starken Juckreizes, der durch die allergische Reaktion ausgelöst wird, an Mähne,

Schweif und anderen Lokalisationen oft blutig. Neben der erheblichen Beeinträchtigung des

Allgemeinbefindens der Tiere kann die Erkrankung zur eingeschränkten Nutzung der Pferde

führen. In den schlimmsten Fällen muss ein Tier aus Tierschutzgründen euthanasiert werden.

Aus der Humanmedizin ist bekannt, dass bei endemischen Helminthosen die Inzidenz von

Allergien signifikant erniedrigt ist (so z. B. in Entwicklungsländern) (BELL, 1996, COOKSON,

1997), während einer anthelminthischen Behandlung oft ein Neuauftreten von allergischen

Erkrankungen folgt (STEIN, 1999). Diese Beobachtung machten auch Pferdebesitzer, die stark

verwurmte Pferde behandelten und kurze Zeit später allergische Erkrankungen bei ihren

Tieren feststellten.

Bisher gibt es keine überzeugende Erklärung, warum ein prinzipiell gleicher Typ-I-

Mechanismus eine schützende Immunabwehr organisiert, ohne in Anwesenheit des

auslösenden Parasiten in eine überschießende Allergie auszuarten, während er im selben

Einleitung und Zielsetzung 14

Individuum gegen andere Antigene (z. B. Insektenkomponenten) zum klinischen Bild einer

Typ-I-allergischen Dermatitis führt.

Ziel dieser Arbeit war es daher, diese Zusammenhänge und Unterschiede zwischen der

physiologischen Helminthenabwehr und der allergischen Typ-I-Reaktion am selben

Organismus näher zu untersuchen. Es stellten sich in diesem Projekt folgende Kernfragen:

o Welchen Einfluss haben die Helminthenbelastung und ihre Beseitigung auf die Allergie

und auf die an ihr beteiligten Effektorzellen?

o Kann die Reaktionsfähigkeit von Effektorzellen der Typ-I-Reaktion gegenüber Allergenen

durch rekombinante Helminthenproteine, eine natürliche Helminthenbelastung oder

anthelminthische Behandlung verändert werden? Wenn ja, wie lange kann der

Organismus diesen Zustand aufrechterhalten?

o Lassen sich aus der Humanmedizin und bei anderen Tierarten gewonnene Daten auch auf

das Pferd übertragen?

o Welche Rolle spielen die verschiedenen Antikörper-Isotypen, die möglicherweise am

Mechanismus der Typ-I-Reaktion beteiligt sind?

Zur Beantwortung eines Teils dieser Fragen standen durch Zusammenarbeit mit der

Forschungsgruppe um R. Shaw und W. Hein in Neuseeland rekombinante Proteine aus

Trichostrongylus colubriformis zur Verfügung. In Vorversuchen konnte bereits gezeigt

werden, dass einige Pferde trotz des nur seltenen Vorkommens dieses Wiederkäuerparasiten

beim Pferd Antikörper gegen diese Proteine hatten.

Literaturübersicht 15

2 Literaturübersicht

2.1 Die verschiedenen Allergieformen

CLEMENS VON PIRQUET (1906) definierte den Begriff „Allergie“ als „eine veränderte

Fähigkeit des Körpers, auf eine Fremdsubstanz zu reagieren“. Diese sehr allgemeine

Definition wird heute deutlich eingegrenzt als „eine Krankheit, die durch eine überschießende

Immunreaktion gegenüber einem Antigen ausgelöst wird“ (JANEWAY ET AL., 2002). Mit

Allergie, Hypersensibilität oder Überempfindlichkeit werden nachteilige Immunreaktionen

bezeichnet, die eigene Gewebe schädigen und schwerwiegende Erkrankungen auslösen

können. GELL und COOMBS (1968) teilten die verschiedenen Überempfindlichkeitsreaktionen

in vier Typen ein; inzwischen wird eine fünfte Form postuliert.

Die Typ-I-Reaktion oder Sofortreaktion ist allgemein die bekannteste. Hierbei kann es bereits

in kürzester Zeit (wenige Minuten) nach Kontakt mit dem allergieauslösenden Stoff

(Allergen) zu den Symptomen der Hypersensitivität kommen. Typische Symptomatiken

dieser Allergieform sind z. B. Urticaria, Asthma, Juckreiz oder Gewebsschwellung. Bei dieser

Reaktion spielen Antikörper des Immunglobulinisotypen E (IgE) eine zentrale Rolle, jedoch

nur, wenn sie über Fcε-Rezeptoren an gewebsständige Mastzellen und im Blut zirkulierende

basophile Granulocyten gebunden sind. Freie IgE-Antikörper können keine allergischen

Reaktionen auslösen. Werden mindestens zwei oder mehrere Fcε-Rezeptoren I über ihre

gebundenen IgE-Moleküle durch ein Allergen, welches diese spezifisch erkennen,

kreuzvernetzt, lösen sie durch ihre transmembranalen γ-Ketten Signale in der Zelle aus, die

u.a. zur Freisetzung von Mediatoren führen. Zu diesen Mediatoren zählen neben Histamin und

Proteasen als entzündungsfördernde Botenstoffe auch Heparin, die zusammen mit neu

gebildeten Leukotrienen und Cytokinen (z. B. IL-4) für eine Verstärkung und

Aufrechterhaltung der Reaktion sorgen. Es kommt durch die Mediatorenfreisetzung zu einer

Entzündungsreaktion mit gesteigerter Durchblutung und Gefäßdurchlässigkeit, Ödemen,

Rötung und – bei einigen Allergieformen – histamininduziertem Juckreiz sowie

Einwanderung von eosinophilen Granulocyten und anderen Entzündungszellen an den Ort der

allergischen Reaktion. Bekannte Krankheitsbilder z. B. sind beim Menschen der

Heuschnupfen (allergische Rhinitis) oder beim Pferd das Sommerekzem (allergische

Insektendermatitis). Eine dramatische Form der Typ-I-Überempfindlichkeitsreaktion ist die

bei Mensch und Tier auftretende Anaphylaxie, bei der diese Reaktion nicht lokal, sondern

systemisch stattfindet und lebensbedrohend sein kann. Die ursprüngliche physiologische


Funktion dieses Mechanismus ist die Warnung des Immunsystems vor „Gefahren“ und deren

Abwehr durch die Einleitung und Regulation von Entzündungsvorgängen. Dies ist

beispielsweise bei der Bekämpfung parasitärer Infektionen (z. B. Helminthosen) bekannt. Sie

ist prinzipiell auch gegenüber anderen „Fremdstrukturen“ und sogar gegen veränderte

körpereigene Strukturen möglich.

Bei der Typ-II-Reaktion stehen antikörpervermittelte Zytotoxizitätsmechanismen im

Mittelpunkt. Antikörper der Isotypen IgG und IgM binden spezifisch an zellgebundene

Antigene und aktivieren über ihren Fc-Teil Phagocyten, Natürliche-Killer-Zellen (NK-Zellen)

oder den klassischen Weg der Komplementkaskade. Diese führen zur Eliminierung

(hauptsächlich Phagocytose) der antigentragenden Zelle. Bekannte Beispiele für diese

Allergieform sind Penicillinunverträglichkeiten und Pemphigus vulgaris. Die

immunhämolytische Anämie oder die neonatale Isoerythrocytolyse beim Jungtier fallen

ebenfalls unter diesen Mechanismus. Dabei liegt eine Unverträglichkeit der Blutgruppen von

Blutspender und -empfänger bzw. Muttertier und Neugeborenen vor, bei der gegen andere

Blutgruppenantigene gerichtete Antikörper des Spenders bzw. des Kolostrums auf den

Erythrocyten binden und ihre Eliminierung einleiten.

Ebenso wie bei der vorhergehenden Reaktionsform spielen auch bei der Typ-III-

Immunreaktion Antikörper eine zentrale Rolle, jedoch binden sie hier primär an meist lösliche

Antigene und bilden initial lösliche Immunkomplexe. Diese Komplexe lagern sich in

Geweben und Gefäßwänden, insbesondere in den Basalmembranen kleinerer Gefäße, ab. Sie

binden an Zellen mit geeigneten Fc-Rezeptoren (hauptsächlich Granulocyten, Monocyten,

Makrophagen und Mastzellen) und aktivieren bei Beteiligung von komplementaktivierenden

Isotypen das Komplementsystem. Durch freigesetzte chemotaktische Peptide werden

neutrophile Granulocyten angezogen, die über freie Radikale, Enzyme und Cytokine

inflammatorisch wirken und das Gewebe schädigen. Es werden bei diesem Typ eine

systemische und eine lokale Form unterschieden. Die Serumkrankheit ist eine systemische

Typ-III-Reaktion, die mit Arthritiden und Glomerulonephritis einhergeht, während z. B. die

sog. Hay Sickness des Pferdes oder die Arthus-Reaktion lokale Ausprägungsformen

darstellen, bei der sich die Immunkomplexe lokal ablagern – im Falle der Hay sickness in der

Lunge, was zu einer Ansammlung von Flüssigkeit, Proteinen und Zellen in den

Alveolarwänden führt und den Gasaustausch behindert.

Immunreaktionen des Typs IV können Allergien vom verzögerten Typ bewirken. Hierbei sind

im Gegensatz zu den anderen Formen keine Antikörper beteiligt, sondern es handelt sich um


rein zellvermittelte Mechanismen, die aus den Interaktionen von Antigen,

antigenpräsentierenden Zellen (APC) und T-Zellen resultieren. Antigenspezifische

inflammatorische CD4-T-Zellen, die nach dem Erstkontakt mit dem Allergen entwickelt

werden, lösen bei erneutem Kontakt nach Erkennung der Allergene, die durch APC

präsentiert werden, eine überschießende infiltrative Entzündung des Gewebes aus, deren volle

Ausprägung 24 bis 48 h in Anspruch nimmt. Neben der klassischen Tuberkulin- oder auch der

Mallein-Probe, bei der ein Organismus nach Infektion bereits spezifische CD4-T-Zellen

gegen Mycobacterium tuberculosis bzw. Burkholderia mallei gebildet hat und auf subcutan

injizierte Antigene mit einer lokalen Typ-IV-Reaktion antwortet, zählen auch

Kontaktallergien (z. B. Nickel) zu diesem Typ. Bei den Kontaktüberempfindlichkeiten binden

Haptene, die an sich zu klein sind, um als Allergen wirksam werden zu können, an

körpereigene Proteine und verbinden sich mit ihnen zu allergenen Hapten-Carrier-Komplexen

(JANEWAY ET AL., 2002, TIZARD, 2004).

Bei der Typ-V-Reaktion ist das „allergische“ Geschehen auf die alleinige Bindung von

Antikörpern auf eine körpereigene Struktur beschränkt. Es sind keine sekundären

Immunmechanismen beteiligt. Dabei bildet der Organismus möglicherweise kreuzreagierende

Antikörper, die auch körpereigene Epitope erkennen und an sie binden. Durch die Bindung

eines Antikörpers z. B. an einen Rezeptor kann es zur Aktivierung oder Hemmung dieses

Rezeptors kommen. Im Falle der Myasthenia gravis werden so die Acetylcholin-Rezeptoren

blockiert, bei der Basedow’schen Krankheit die TSH-Rezeptoren überstimuliert (LEIBOLD,

2004).

2.2 Das Sommerekzem – eine Typ-I-Allergie des Pferdes

Das Krankheitsbild des Sommerekzems ist schon lange bekannt. Der früheste Bericht stammt

von LECOQ, Frankreich, aus dem Jahre 1842 (Ref. in: UNKEL, 1985), ein anderer von DATTA

aus Indien (1936) (Ref. in: UNKEL, 1985). Durch die weite Verbreitung dieser saisonal

auftretenden Dermatitis ist sie unter vielen Bezeichnungen beschrieben (z. B. „Kasen“,

„Queensland itch“, „Sweet itch“, „Insect bite dermal hypersensitivity“, „Summer seasonal

recurrent dermatitis“, „Ardeurs“ oder „Dermite estivale recidivante“). Prädispositionen in

Alter, Fellfarbe oder Geschlecht der betroffenen Pferde lassen sich nach UNKEL (1985) und

MARTI (1992) nicht feststellen, obwohl LANGE (2004) ein selteneres, dafür aber umso

stärkeres Auftreten bei Füchsen feststellte. Das Sommerkezem wird bei allen Rassen

beobachtet. So erkranken ebenso Islandpferde wie arabische Vollblüter, Friesen, deutsche


Warmblüter, Quarter Horses oder verschiedene Ponyrassen. Innerhalb einzelner

Pferdepopulationen tritt das Sommerekzem mit Prävalenzen von 11-60% auf (WILSON ET AL.,

2001). In Deutschland wird es insbesondere mit dem Islandpferd in Verbindung gebracht und

kommt hier mit unterschiedlich angegeben Prävalenzen vor. So berichtet RÜSBÜLDT (2001)

von 60-70 % der aus Island nach Deutschland importierten Tiere, andere Quellen von nur

25% (UNKEL, 1985), die nach dem Eintreffen in Deutschland an der saisonalen Dermatitis

erkranken. BROSTROM ET AL. (1987) geben an, dass aus Island exportierte Pferde signifikant

häufiger erkranken als nicht auf Island geborene Tiere (26,2% gegenüber 6,2% in Schweden).

Auch sollen die klinischen Symptome bei ihnen stärker ausgeprägt sein als bei den auf dem

Kontinent geborenen Tieren. Eine Rolle spielt neben den Umwelt- und Haltungsbedingungen

die Vererbung der Erkrankung, nach UNKEL (1985) und MARTI (1992) wird sie multifaktoriell

vererbt. LANGE (2004) gibt eine Heritabilität von 0,36 für das Auftreten und von 0,34 für den

Schweregrad des Ekzems an. Nach epidemiologischen Studien tritt die Dermatitis

insbesondere bei robust gehaltenen Rassen ab einem Alter von zwei Jahren auf. Die meisten

Tiere erkranken vor Erreichen des sechsten Lebensjahres, seltener in einem höheren Alter

(WILSON ET AL., 2001).

Die klinischen Symptome des Sommerekzems ergeben sich aus dem mehr oder weniger

starken Juckreiz, der durch Typ-I-Reaktionen verursacht wird, die wiederum von

Insektenstichen ausgelöst werden. Die entstehenden juckenden Pusteln werden von den

Pferden aufgescheuert, was zu Haarverlust, offenen Wunden und sekundären bakteriellen

Infektionen führen kann. Das Erkrankungsbild kann von Pferd zu Pferd variieren und tritt

bevorzugt an Mähne und Schweif auf. Aber auch an der Bauchnaht, am Kopf, am Rücken und

gelegentlich an den Beinen kann es zu schweren Veränderungen kommen. Bei nachlassendem

Juckreiz können sich Haut und Haar wieder regenerieren. Durch die sich wiederholenden

Entzündungsprozesse kommt es aber zu einer chronischen Pachydermie und Bildung großer

Hautfalten, in einigen Fällen zu chronischer Alopezie. Die Hautfalten sind auch außerhalb der

klinisch manifesten Periode vermehrt für bakterielle oder mykotische Infektionen anfällig

(RÜSBÜLDT, 2001, GEIBEN, 2003).

Die Symptomatik des Sommerekzems beginnt im allgemeinen jedes Jahr erneut im Frühjahr

mit dem Auftreten der ersten allergieauslösenden Insekten (s. u.) und heilt erst vollständig im

Herbst bzw. Winter aus, wenn die Insektenbelastung nicht mehr gegeben ist. Sie ist also auch

von Haltungs- und Witterungsbedingungen abhängig (z. B. Haltung in Stall oder auf der

Weide, für Insekten günstiges oder ungünstiges Klima etc.). Dabei unterliegt die Ausprägung


starken inter- und intraindividuellen Schwankungen. GEIBEN (2003) konnte zeigen, dass Tiere

in verschiedenen Jahren ein unterschiedlich starkes klinisches Erscheinungsbild an

unterschiedlichen Lokalisationen zeigten, und dass die Symptomatik zusätzlich

Schwankungen innerhalb der klinisch manifesten Periode zeigen kann. Eine besonders starke

Ausprägung des Ekzems kann in drei Hochphasen im Frühjahr, Hochsommer und Herbst

festgestellt werden. Dazwischen kann eine Mäßigung, teilweise sogar eine Abheilung der

Dermatitis erfolgen. Die Symptomatik folgt also eher einem wellenartigen Verlauf, zeigt aber

über die Jahre hinweg eine deutliche Tendenz zur Verschlechterung. Neben der erheblichen

Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens der Tiere kann die Erkrankung zur eingeschränkten

Nutzung der Pferde oder sogar zur Euthanasie aus Tierschutzgründen führen.

Als Auslöser des Sommerekzems sind in erster Linie blutsaugende Insekten der Gattung

Culicoides (Gnitzen) beschrieben (BRAVERMANN ET AL., 1983, HALLDORSDOTTIR ET AL.,

1989, ANDERSON ET AL., 1993, KAUL, 1998), die weltweit vorkommen, aber auch andere

Insekten, z. B. Stomoxys calcitrans, Simulidae spp. oder Tabanus spp. (BAKER und QUINN,

1978, GEIBEN, 2003). Durch ihren Stich bringen sie Stoffe, wahrscheinlich Speichelproteine,

in Kontakt mit Mastzellen in der Haut der Pferde und durch das Blutsaugen auch in den

Blutkreislauf. Auf diese Antigene reagieren einige Pferde mit einer Typ-I-Allergie (FADOK

und GREINER, 1990, KUROTAKI ET AL., 1994, KAUL, 1998, MARTI ET AL., 1992, BRUENNLEIN,

2001) und prägen das klinische Bild des Sommerekzems aus. Alle Pferde, die von Culicoides

spp. gestochen wurden, bilden Immunglobuline des Isotyps G (IgG) gegen

Speicheldrüsenbestandteile dieser Insekten. Bei Tieren mit Sommerekzem konnten jedoch

zusätzlich entsprechende Antikörper des Isotyps E (IgE) nachgewiesen werden (WILSON ET

AL., 2001).

Zur Diagnostik von Typ-I-Allergien und damit des Sommerekzems stehen derzeit neben

anderen indirekten Verfahren (z. B. dem allergenspezifischen IgE-Nachweis aus dem Serum)

als zuverlässigste Methoden der Intrakutantest und ein funktioneller In-vitro-Test zur

Verfügung (KAUL, 1998). Eine wirkungsvolle medikamentelle Therapie gibt es für das

Sommerekzem nicht. Symptomatisch kann kurzfristig mit Corticosteroiden behandelt werden,

die sich jedoch aufgrund der Nebenwirkungen nicht zur Dauertherapie eignen. Auch

Futterzusatzmittel, Insektenrepellentien oder alternative Heilverfahren zeigen in den meisten

Fällen keine zuverlässige Verbesserung (BRUENNLEIN, 2001, RÜSBÜLDT, 2001), so dass

zumeist nur das Eindecken oder Aufstallen der Pferde, also die Trennung von Allergen und

Tier, zu einer Besserung der Symptomatik führt.


2.3 Der Mechanismus der Typ-I-Reaktion

Der Mechanismus der Typ-I-Reaktion ist am besten bei Mensch und Maus untersucht, jedoch

konnten Untersuchungen von KAUL (1998), BRUENNLEIN (2001), KOBELT (2001) und GEIBEN

(2003) deutliche Hinweise erbringen, dass dieselben Abläufe auch beim Pferd stattfinden.

Nach Erstkontakt mit Antigen können Th2-Zellen (siehe 2.4) bei B-Zellen durch Produktion

von IL-4, evtl. auch IL-13, sowie Bindung des Rezeptors CD-40 auf B-Zellen einen

Isotypklassenwechsel der daraufhin gebildeten, spezifischen Antikörper von IgM zu IgE und

IgG4 (beim Menschen) bzw. IgG1 (bei der Maus) bewirken. Diese Isotypen, insbesondere das

IgE, spielen in der Sensibilisierung von Basophilen und Mastzellen eine zentrale Rolle. Freie

IgE-Antikörper kommen im Serum und im Gewebe vor und werden schon in

nichtkomplexierter, nicht an Antigen gebundener Form über den hochaffinen Fcε-Rezeptor I

(FcεRI) an gewebsständige Mastzellen oder im Blut zirkulierende basophile Granulocyten

gebunden. Ungebunden hat es beim Menschen im Serum eine Halbwertszeit von zweieinhalb

Tagen und liegt nur in sehr geringen Mengen vor. Kommt es zu einem erneuten Kontakt mit

dem Antigen und wird dieses von den auf der Membran von Mastzellen und Basophilen

gebundenen spezifischen IgE-Antikörpern erkannt, führt die Bindung des Allergens zu einer

Zusammenlagerung der Fcε-Rezeptoren und dadurch zu einer zellaktivierenden

Kreuzvernetzung der an ihnen gebundenen Immunglobuline. Das setzt voraus, dass dieses

spezifische IgE in einer ausreichenden Dichte auf der Zelle vorhanden ist, um es und damit

seine Fcε-Rezeptoren durch ein Antigen zu vernetzen. Ein ausreichendes Vernetzen dieser

Rezeptoren, auch „bridging“ genannt, führt zu einer Aktivierung der Zelle und zu einer

Freisetzung von Mediatoren aus präformierten Granula. Zu diesen Mediatoren zählen u.a.

Histamin, Proteasen, Proteoglykane und Heparin. Weiterhin wird in den so aktivierten Zellen

die Produktion von Leukotrienen, Chemokinen und Cytokinen wie Interleukin-4 (IL-4) oder

IL-13 induziert. Diese freigesetzten Botenstoffe sorgen für Beginn und Steuerung einer

Entzündungsreaktion, deren Folgen im physiologischen Fall z. B. als Durchfall oder

Erbrechen (siehe 2.5), im pathologischen Fall als Symptome der Allergie wahrgenommen

werden. Der vasoaktive Mediator Histamin sorgt z. B. für eine gesteigerte

Kapillarpermeabilität und für eine Vasodilatation. Die Cytokine IL-4 und IL-13 sorgen für

eine Erhaltung der Th2-Reaktion (siehe auch 2.4), die Leukotriene für eine vermehrte

Kontraktilität der glatten Muskulatur (JANEWAY, 2002, TIZARD, 2004).

Reagiert ein Individuum auf ein Antigen mit einer überschießenden, pathologischen Typ-I-

Reaktion und entwickelt entsprechende allergische Symptome, wird das Antigen für dieses


Individuum zum „Allergen“ (LEIBOLD, 2004).

Erste Hinweise auf eine Beteiligung mindestens eines weiteren Ig-Isotyps an der Typ-I-

Reaktion erhielt FAGAN (1982), der mit Anti-IgG4-Antikörpern eine Mediatorenfreisetzung

aus humanen basophilen Granulocyten erreichen konnte. KATZ ET AL. (1992) wiesen eine

Aktivierung von Mastzellen nach Kreuzvernetzung von IgG-tragenden Fcγ-Rezeptoren III

(FcγRIII) nach, OKAYAMA ET AL. (2000) konnten dies für den FcγRI zeigen. Auch TKACZYK

(2002) erreichte eine Degranulation von Mastzellen nach Aggregation der hochaffinen FcγRI

durch anti-Rezeptor-Antikörper bzw. Antikörper gegen rezeptorgebundenes IgG, so dass eine

Aktivierung von Mastzellen und Basophilen und somit eine Beteiligung von IgG an der Typ-

I-Reaktion als gesichert angesehen werden kann (TKACZYK ET AL., 2004). Bei der Maus

konnte das IgG1 (DOMBROWICZ ET AL., 1997), beim Menschen das IgG4 (KIEKENS ET AL.,

2000) als Aktivator der Typ-I-Effektorzellen identifiziert werden. Bei IgE-defizienten

Mäusen, die also kein IgE auf der Oberfläche von Mastzellen und Basophilen gebunden

haben konnten, ließ sich dennoch eine Mediatorenfreisetzung aus Mastzellen und

anaphylaktische Reaktionen nachweisen (OETTGEN ET AL., 1994). Auch bei equinen

Basophilen kann über eine Kreuzvernetzung von membrangebundenen IgG durch Anti-IgG-

Antikörper eine Freisetzung von Histamin bewirkt werden (KAUL, 1998, KOBELT, 2001,

BRUENNLEIN, 2001 und GEIBEN, 2003).

Die basophilen Granulocyten erhalten ihre spezifische Sensibilisierung, ihre Fähigkeit,

spezifisch auf Antigene – und im überschießenden Fall auf Allergene – zu reagieren, durch

einen Besatz ihrer membranständigen, aktivierenden Fc-Rezeptoren mit antigenerkennenden

Antikörpern. Aus dem Knochenmark kommende, naive Basophile tragen noch keine

Antikörper auf ihren hochaffinen Fcε- und Fcγ-Rezeptoren. Sobald sie in das Blut gelangen,

besetzen sensibilisierende Immunglobuline des passenden Isotyps die freien Fc-Rezeptoren

sofort. Aufgrund der hohen Affinität der Fcγ/ε-Rezeptoren I lösen sich diese

sensibilisierenden Antikörper nur sehr langsam wieder. Daher ändert sich das

Sensibilisierungsspektrum der Basophilengesamtheit nur sehr langsam über Wochen und

Monate (BRUENNLEIN, 2001, KOBELT, 2001, GEIBEN, 2003). Eine Anwendung von

Corticosteroiden in vivo eliminiert die Basophilen aus dem Blut (TIZARD, 2004, BRUENNLEIN,

2001), so dass die innerhalb kurzer Zeit neu gebildeten Basophilen das aktuelle Spektrum

freier sensibilisierender Antikörper aus dem Serum aufnehmen, sobald sie in das Blut

gelangen (BRUENNLEIN, 2001). Dadurch kann eine Sensibilisierung basophiler Granulocyten

nach einer Corticosteroidapplikation gegenüber der Ausgangssituation völlig verändert sein.


Die aktuelle spezifische Sensibilisierung von equinen Basophilen kann in einem von KAUL

(1998) entwickelten Test (Funktioneller In-vitro-Test, FIT) erfasst werden.

2.4 Das Th1-Th2-Modell

MOSMANN ET AL. (1986) schlugen ein Modell von zwei verschiedenen Subpopulationen an T-

Helfer-Zellen (CD4-positive T-Zellen) vor. Je nach Art der produzierten Lymphokine

benannten sie die beiden Varianten als Th1- und Th2-Zellen. Diese beiden Unterpopulationen

werden durch verschiedene antigenpräsentierende Zellen aktiviert, die unterschiedliche

Costimulatoren besitzen. Th1-Zellen, die z. B. intrazelluläre Krankheitserreger bekämpfen,

werden optimal durch Antigen stimuliert, welches durch myeloide Dendritische Zellen und

durch B-Zellen unter Verwendung des Costimulators CD80 präsentiert wird (TIZARD, 2004).

Unter Einfluss von IL-12 und IL-18 produzieren aktivierte Th1-Zellen innerhalb weniger

Stunden IL-2, Interferon-γ (IFN-γ), Tumornekrosefaktor (TNF-β), IL-12 und IL-18 und

agieren primär als Helferzellen der zellvermittelten Immunantwort (T-Zell-Zytotoxizität,

Aktivierung von Makrophagen). Dadurch unterstützen sie die Abwehr intrazellulärer

Pathogene und Organismen wie z. B. Mykobakterien. Th2-Zellen hingegen, die bei der

Abwehr extrazellulärer Organismen eine wichtige Rolle spielen, reagieren optimal auf

Antigen, das durch lymphoide oder plasmacytoide Dendritische Zellen oder Makrophagen

präsentiert wird. Diese Dendritischen Zellen aktivieren die Th2-Zellen zusätzlich über das

Costimulatormolekül CD86 und durch die Sezernierung von IL-4, während Makrophagen

dazu IL-1 nutzen. Durch B-Zellen präsentierte Antigene hingegen aktivieren Th2-Zellen

deutlich schwächer. Aktivierte Th2-Zellen sezernieren IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13 über

mehrere Tage. Diese Cytokine regen B-Zellen zur Proliferation und Differenzierung sowie

zur Sekretion von Immunglobulinen an und haben keinen Effekt z. B. auf

Zytotoxizitätsmechanismen. Die freigesetzten Cytokine können eine Steigerung der IgG1-

und IgA-Produktion durch B-Zellen um das bis zu Zwanzigfache, die der IgE-Produktion

sogar um das bis zu Tausendfache bewirken (TIZARD, 2004). Eine dominierende Th2-Antwort

wird mit einer gesteigerten Immunität gegen extrazelluläre Parasiten in Verbindung gebracht,

aber durch die fehlende Unterstützung der Zytotoxizitätsmechanismen auch mit einer

verminderten Resistenz gegen Mykobakterien und andere intrazelluläre Pathogene.

Th1- und Th2-Zellen migrieren als Resultat einer unterschiedlichen Rezeptorexpression

vorrangig zu unterschiedlichen Formen entzündeten Gewebes und stellen so sicher, dass die

richtige T-Zell-Subpopulation auf die jeweilige Entzündungsursache reagiert (TIZARD, 2004).


Beide Formen kommen gleichzeitig in einem Organismus vor – auch für das Pferd konnten

inzwischen Th1- und Th2-Zellen nachgewiesen werden (AGGARWAL und HOLMES, 1999) –

und halten sich die Waage, jedoch sind in einigen Situationen die Verhältnisse zugunsten des

einen oder des anderen Typs verschoben, z. B. während der Schwangerschaft bzw.

Trächtigkeit (HERZ ET AL., 1998) oder auch in der Kindheit (ERB, 1999) liegt eine lokale oder

auch systemische Th2-Dominanz oder Polarisation vor. Auch eine starke Parasitenbelastung

oder eine allergische Erkrankung sind in ihrem Entzündungsmechanismus von einem Th2-

Cytokinprofil geprägt.

ERB (1999) ist der Ansicht, dass das Th2-dominierte Cytokinspektrum des Neugeborenen

bzw. des Kleinkindes und Jungtieres im Laufe der ersten Lebensjahre auf ein Th1-Spektrum

wechselt. Kinder, die später Atopiker werden, sollen diesem Wechsel nicht unterliegen. Die

Suche nach der Ursache für die anhaltende dominante Th2-Prägung versuchte STRACHAN

(1986) mit der sog. „Hygienetheorie“ zu begründen. Sie besagt, dass eine übertriebene

Hygiene in der Kindheit und der fehlende Kontakt zu „Trainingsmöglichkeiten“ für das

Immunsystem zu einer fehlerhaften Reaktion führten. Auch COOKSON und MOFFAT (1997)

sowie ROOK und STANFORD (1998) postulieren, dass ein Mangel an schweren

Kindheitsinfektionen die Entwicklung einer starken Th1-Antwort verringert, was dem Th2-

Arm des Immunsystems ermöglichen soll, dominant zu werden und gegen Umweltallergene

allergisch zu reagieren. ROOK und STANFORD (1998) führen das auf eine inkorrekte

Cytokinbalance aufgrund eines inadäquaten Primings von Th1-Zellen durch fehlende oder

verminderte Th1-induzierende Infektionen zurück. Nach PRESCOTT (1998) haben womöglich

IFN-α- und damit Th1-induzierende Infektionen den größten Einfluss auf die Hemmung einer

Allergieentwicklung in der postnatalen oder frühkindlichen Phase, während Infektionen im

späteren Leben keinen unterdrückenden Einfluss mehr haben. SHIRAKAWA ET AL. (1997)

konnten in diesem Zusammenhang zeigen, dass deutliche Th1-Cytokinprofile, niedrige IgE-

Spiegel und geringe Inzidenz allergischer Erkrankungen mit einer positiven Reaktion im

Tuberkulin-Test korreliert waren. Analog dazu berichteten HERZ ET AL. (1998), dass eine

nasale Applikation von Mykobakterium bovis die Entwicklung einer allergeninduzierten

Atemwegsüberempfindlichkeit bei Mäusen verhindert, jedoch ein starkes Th1-Milieu in den

Atemwegen nicht eine systemische allergische Reaktion unterdrücken kann. KLINE ET AL.

(1998) kamen nach der Applikation von Th1-induzierenden CpG-Motiven zu einem ähnlichen

Ergebnis.

Th2-Zellen sind jedoch unabdingbar für die Bekämpfung parasitärer Infektionen. So zeigten


ELSE ET AL. (1993) bei Mäusen eine starke negative Korrelation zwischen der Befallsstärke

mit Trichuris muris und Th2-Merkmalen wie Serum-Gesamt-IgE-Titer, In-vitro-Produktion

von IL-5 und IL-9 durch T-Zellen aus mesenterischen Lymphknoten, einer schnellen

parasitenspezifischen IgG1-Antwort und intestinaler Eosinophilie. Dagegen fanden sie eine

signifikante positive Korrelation zwischen der Wurmlast und parasitenspezifischen IgG2a-

Spiegeln, einem von dem Th1-Cytokin IFN-γ regulierten Ig-Isotyp bei der Maus. Ihre Daten

zeigen, dass ein Individuum in der Auseinandersetzung mit seiner Parasitenbürde entweder

eine protektive Th2-Antwort oder eine nur unzureichende, nicht protektive Th1-Antwort

aufbauen kann. Interessanterweise sind atopische Erkrankungen in Entwicklungsländern mit

hoher Helmintheninfektionsprävalenz lange nicht so verbreitet wie in den Industrieländern, in

denen die Rate der Allergien ständig steigt (BELL, 1996, COOKSON und MOFFAT, 1997).

Möglicherweise inhibieren Helminthen atopische Effektorfunktionen, obwohl beide von Th2

dominiert werden. KNOPF (2000) berichtet von einer hohen Asthmaprävalenz bei

schwarzhäutigen Kindern, deren Vorfahren aus parasitisch stark belasteten Regionen Afrikas

stammten. Ihre genetisch bedingte, stark Th2-lastige Immunantwort mit hohen IgE-Spiegeln

mochte ursprünglich ein wichtiger Schutz gegen eine erhebliche Parasitenlast sein. Ebenso

argumentieren SUTTON und GOULD (1993), dass aus der evolutionären Perspektive die

primäre Funktion der Th2-Antwort ein Teil der antiparasitären Schutzmechanismen war und

heute mit allergischen Erkrankungen in unerwünschter Weise gegen oft ungefährliche

Substanzen reagiert.

2.5 Typ-I-Immunmechanismen der Parasit-Wirt-Interaktion

Der Erfolg eines Parasiten wird nicht am Schaden gemessen, den er in seinem Wirt anrichtet,

sondern an seiner Fähigkeit, sich zu adaptieren und in den Wirt zu integrieren. Infektionen mit

Helminthen sind langfristige, chronische Infektionen, so dass manche Parasiten über lange

Zeit in einem Wirt persistieren. Idealerweise kann der erfolgreiche Parasit die

Immunantworten des Wirtes beeinflussen: auf der einen Seite unterdrückt er sie, um sein

eigenes Überleben sicher zu stellen, denn er braucht Zeit, um zu wachsen und seine

Zielorgane zu erreichen, andererseits darf die Unterdrückung nicht so weit gehen, dass andere

Infektionen seinen Wirt und damit auch ihn töten. Die Fähigkeiten, den Immunmechanismen

des Wirtes zu entgehen, sie zu manipulieren und metabolische Komponenten des Wirtes für

sich zu nutzen, spiegelt die lange Anpassungszeit wider (TIZARD, 2004, MAIZELS ET AL.,

1993). Für den Wirt stellt es sozusagen den „normalen“ Status dar, von Geburt an bis weit in


das Erwachsenenalter zumindest mit Helminthen infiziert zu sein (BELL, 1996). So hat sich

ein System aus Abwehr- und Evasionsmechanismen entwickelt, das ein Gleichgewicht

zwischen Wirt und Parasit ermöglicht.

Die Unterschiede zwischen Individuen einer Spezies, ihre Parasitenlasten zu kontrollieren und

abzustoßen, sind auf genetisch determinierte Varianten, z. B. MHC-Varianten oder

unterschiedliche Aktivierungsempfänglichkeiten von Mastzellenvorläufern im Knochenmark,

zurückzuführen, die in einer mehr oder weniger hohen Empfänglichkeit für helminthische

Infektionen resultieren und sich auch züchterisch festigen lassen. Resistente und empfängliche

Tiere unterscheiden sich u.a. zu Beginn der Infektion in der zeitlichen Abstimmung und der

Stärke ihrer Th-Zellen-Reaktion. So sezernieren Th2-Zellen von resistenten Mäusen in vitro z.

B. früher und vermehrt IL-3 und IL-4 gegenüber Zellen von empfänglicheren Tieren

(WAKELIN, 1992). Stärker belastete Tiere unterliegen u.a. leichter einer Immunsuppression

durch den Parasiten.

2.5.1 Typ-I-Hypersensitivitätsreaktion

Der bereits unter 2.3 beschriebene Mechanismus der Typ-I-Hypersensitivitätsreaktion dient

physiologischerweise u.a. zur Bekämpfung insbesondere von gastrointestinalen Parasiten.

Statt auf ein Allergen reagieren Mastzellen und Basophile in diesem Fall auf parasitäre

Antigene, die von membranständigen IgE- und einigen IgG-Antikörpern gebunden werden,

diese kreuzvernetzen und so eine Degranulation der Zelle auslösen. Die von

Darmmucosamastzellen freigesetzten Mediatoren, vasoaktiven Substanzen und Proteasen

lösen eine vermehrte Durchblutung, eine gesteigerte Gefäßpermeabilität und eine aktive

Sekretion von osmotisch aktiven Substanzen (MILLER ET AL., 1996) aus. Die Stimulation der

glatten Muskulatur des Darmes führt zu einer gesteigerten Motilität. Zusammen mit dem

Flüssigkeitsefflux aus den intestinalen Kapillaren („leaky gut“) kann sie zu einer Ablösung

und Austreibung vieler Parasiten führen (TIZARD, 2004). So können sich z. B. schwere

Infektionen mit großen und kleinen Strongyliden bei Fohlen und Absetzern durch

intermittierende Diarrhoe ohne Koliksymptome äußern (THAMSBORG ET AL., 1998).


2.5.2 „Selbstheilungreaktion“, „Self cure“

Dieses Phänomen der gesteuerten Typ-I-Reaktion ist auch unter dem Begriff

„Selbstheilungsreaktion“ oder „Self cure“ bekannt. HONG ET AL. (1989) beschrieben das

klinische Bild mit starkem Durchfall bei Schafen und brachten die Fähigkeit zur Selbstheilung

mit der durch Immunisierung induzierten Resistenz der Tiere in Verbindung. Dabei konnten

die Tiere sowohl durch wiederholte, mittels anthelminthischer Behandlung abgebrochene

Helmintheninfektionen als auch durch täglich verabreichte geringe Mengen infektiöser

Larven immunisiert werden. Die folgende Selbstheilungsreaktion bei Challenge mit einer

hohen Menge infektiöser Larven stößt auch nicht-verwandte Parasiten unspezifisch mit ab

(EMERY ET AL., 1993), nach HARRISON ET AL. (2002) jedoch nur, wenn kurz zuvor mit der zur

Immunisierung verwendeten Art oder einem entsprechenden Antigen geboostert wurde. UBER

ET AL. (1980) und MITCHELL ET AL. (1983) vermuteten, dass intestinale Mastzellen eine

wichtige Rolle bei der Selbstheilung spielen, denn sie stellten eine verminderte Fähigkeit zum

Ausstoß von Nematoden bei Mäusen mit Mastzelldefekten fest. MAYBERRY ET AL. (1993)

konnten diese Daten verifizieren. Bei immunisierten Schafen wird der Großteil einer

infektiösen Challenge-Dosis von Trichostrongylus-colubriformis-Larven bereits nach nur

zwei Stunden abgestoßen, der Rest innerhalb der nächsten drei bis vierzehn Tage (SHAW ET

AL., 1998). Appliziert man Schafen, bei denen gerade eine Selbstheilungsreaktion

stattgefunden hat, parasitäres Antigen, kann es zu einem anaphylaktischen Schock kommen

(TIZARD, 2004). Ein Anstieg im Gesamt-IgE sieben bis acht Tage nach Challenge und eine

Zunahme der Darmmucosamastzellen hat nach Ansicht von SHAW ET AL. (1998) den

Hintergrund, die Typ-I-Reaktion weiter zu steigern, um auch die letzten Parasiten abstoßen zu

können. Nach SHAW ET AL. (1998) sind die Faeces in dieser Phase auch ohne

Diarrhoesymptomatik deutlich weicher als normal. Auch ROTHWELL (1989) postulierte, dass

eine gesteigerte Anzahl von Mucosamastzellen und Eosinophilen mit der protektiven Antwort

auf intestinale Nematoden zusammenhängt. Dabei spielen sowohl IgE als auch IgG-Subtypen

eine Rolle bei Aktivierung der mucosaständigen Mastzellen, der Erzeugung der humoralen

(IgE, IgG, IgA, siehe 2.6) und der Cytokinantworten (z. B. IL-4) gegen Parasiten. So sind

IgE-defiziente Mäuse signifikant empfänglicher für eine Parasiteninfektion als nicht-

defiziente Kontrolltiere, entwickelten eine doppelt so große Wurmlast (KING ET AL., 1997)

und konnten diese weniger gut abstoßen. SHAW ET AL. (1998) konnten zeigen, dass eine

Infektion mit Trichostrongylus colubriformis zu einer Titererhöhung des gesamten als auch

des parasitenspezifischen IgE führte. MANJILI ET AL. (1999) beobachteten eine effektivere


Immunität bei Meerschweinchen gegen Trichostrongylus colubriformis, wenn die Tiere eine

starke IgG1-Antwort gegen Antigene dieses Parasiten aufwiesen und leiteten daraus ab, dass

IgG1-Antikörper möglicherweise die Degranulation von Mastzellen und Basophilen

vermitteln können und so zu einer gesteigerten Immunität beitragen.

Die unterschiedliche Fähigkeit der Individuen einer Art, ihre Parasitenlast zu bekämpfen, ist

bei vielen Tierarten nachgewiesen (u.a. DOUCH ET AL., 1984, ROTHWELL ET AL., 1994,

MANJILI ET AL., 1999). Neben unterschiedlichen Immunglobulinantworten („high responder“

und „low responder“) (MANJILI ET AL., 1999, ROTHWELL ET AL., 1994) zeigt sich diese

Fähigkeit auch in der Parasiteneizahl im Kot der Tiere. So erreichen z. B. Mäuse (ELSE ET AL.,

1993, TIZARD, 2004) und Schafe (DOUCH ET AL., 1984) mit hohen Eizahlen vor

anthelminthischer Behandlung auch danach wieder hohe Zahlen, während Individuen mit

wenigen Eiern auf diesem niedrigen Niveau bleiben. DOUCH ET AL. (1984) konnten keine

Unterschiede im Histaminspiegel in Blut und Ingesta zwischen den Gruppen finden. Der

Histaminspiegel war bei beiden Gruppen während einer experimentellen Larval-Challenge am

höchsten.

2.5.3 Andere Formen der antiparasitären Typ-I-Reaktion

Ein Hinweis für eine Typ-I-Reaktion auf der Schwelle von der Physiologie zur Pathologie

findet sich bei PASS und BOLTON (1982). Sie beschrieben vier Fälle einer chronischen

eosinophilen Gastroenteritis bei Pferden, die mit Durchfall, Abmagerung und Malabsorption

einhergingen. Es fand sich eine chronische inflammatorische Reaktion mit diffusen und

fokalen eosinophilen Infiltraten im gesamten Magen-Darm-Trakt, was die Autoren als

anhaltende Typ-I-Reaktion unbekannter Ursache interpretierten.

BERHE ET AL. (1999) beschrieben gastrointestinale Symptome sowie das Auftreten von

Urticaria und Ödemen bei Kindern, die einer anthelminthischen Behandlung unterzogen

wurden. Einen Tag nach der Applikation des Anthelmintikums traten mit Durchfall, Übelkeit,

Erbrechen und abdominalen Krämpfen Symptome auf, die sich auf den Mechanismus der

Typ-I-Reaktion nach Freisetzung einer großen Menge parasitischen Antigens zurückführen

lassen könnten.

Viele Helmintheninfektionen gehen mit weiteren typischen Anzeichen einer Typ-I-Reaktion

wie z. B. Eosinophilie, Urticaria und asthmaartigen Atembeschwerden einher. TIZARD (2004)

berichtete von akuten anaphylaktischen Schocks nach Ruptur von Bandwurmcysten während

chirurgischer Eingriffe.


Nach COLDITZ ET AL. (1994) hat die Typ-I-Reaktion nicht nur am Darm, sondern auch in der

Haut protektive Effekte. Schafe, die vermehrt IgE-positive Zellen in der Haut hatten, waren

resistenter gegen bakterielle Hautinfektionen und Belastung mit Ektoparasiten (Lucilia

cuprina).

2.6 Bedeutung unterschiedlicher Immunglobulin-Isotypen bei der Helminthenabwehr

Bei der primären Immunantwort gegen für das betreffende Individuum „neues“ Antigen wird

IgM als erster Immunglobulin-Isotyp produziert, da naive, bis dahin „antigenunerfahrene“ B-

Zellen mit ihrem membranständigen IgM als Antigenrezeptor dieses Antigen erkennen. Freies

IgM ist u.a. besonders effizient bei der Agglutination von Mikroorganismen und in der

Aktivierung des klassischen Weges des Komplementsystems, sobald ein IgM ein Antigen

gebunden hat und ein Immunkomplex vorliegt.

IgG stellt bei parasitären Infektionen die am stärksten vertretene Antikörperklasse dar und

wird insbesondere nach Zweitkontakt oder anhaltender Infektion mit diesen Parasiten stark

vermehrt. Wie IgM können einige IgG-Isotypen als Immunkomplexe das Komplementsystem

aktivieren und Mikroorganismen agglutinieren, jedoch weniger effizient als IgM. Außerdem

können IgG-Isotypen nach Antigenbindung über ihre Fc-Teile an geeignete Fcγ-Rezeptoren

von Makrophagen, Monocyten, Killerzellen sowie Granulocyten binden und so zur

Phagocytose opsonieren bzw. eine antikörperabhängigen, zellvermittelten Zytotoxizität

(ADCC) vermitteln.

IgA ist nicht nur im Serum, sondern auch in großen Mengen in der Darmmucosa und anderen

Schleimhäuten sowie in den entsprechenden Sekreten vorhanden. Neben seiner Funktion als

Opsonin im ADCC-System und Aktivator des Komplementsystems liegt der Schwerpunkt

dieses Immunglobulins auf der Adhärenzhemmung von Bakterien und Viren an

Epitheloberflächen. Können Bakterien und Viren aufgrund der Bindung von IgA nicht mehr

an Epithelzellen wie z. B. Enterocyten adhärieren, können sie auch keine Infektion

verursachen (ROMMEL ET AL., 2000, TIZARD 2004).

Antikörpervermittelte Reaktionen des Wirtes spielen eine große Rolle schon bei der

Verhinderung einer Neuetablierung parasitärer Larven (BAKER ET AL., 1994). Wie schon

erwähnt (2.3, 2.5.2 und 2.5.3), ist insbesondere das Th2-geförderte IgE als Vermittler von

Bedeutung. Da Helminthen sehr starke Induktoren der Th2-Antwort sind, haben

parasitenbelastete Tiere einen stark erhöhten Gesamt- und parasitenspezifischen IgE-Titer

(und erhöhte Eosinophilenzahlen). Die Induktion von IgE ist bei einer Erstinfektion


gegenüber anderen Isotypen verzögert (nachweisbar ab Tag 20 nach Infektion beim Schaf),

reagiert aber bei weiteren Infektionen deutlich schneller (SHAW ET. AL., 1998). Dieses

Immunglobulin kann nicht nur über eine Kreuzvernetzung auf Mastzellen und Basophilen

eine Degranulation auslösen, sondern auch z. B. eine zytotoxische Aktivität von Eosinophilen

gegen Nematodenlarven vermitteln. Es trägt sowohl zur Induktion der humoralen Immunität

gegen Parasiten durch Förderung der Bildung von weiterem IgE, IgA und Th2-spezifischen

IgG-Isotypen als auch zu einer Steuerung der spezifischen Th2-Cytokinantwort gegen

Parasiten bei (KING ET AL., 1997). Dabei ist das Th2-Cytokin IL-4 obligatorisch für die

Induktion von IgE. Die Resistenz gegen Parasiten ist ohne dieses Immunglobulin deutlich

vermindert (KING ET AL., 1997). Ponies mit einer niedrigen zellulären IL-4-Produktion sind

stärker verwurmt als solche mit viel IL-4 (EDMONDS ET AL., 2001). Freies IgE kommt bei

Menschen im Gegensatz zu anderen Isotypen im Serum nur in Spuren vor und hat dort eine

Halbwertszeit von zweieinhalb Tagen. WAGNER ET AL. (2003) beschreiben für das Pferd

deutlich höhere Serumgehalte an IgE. Der größte Teil des vorhandenen IgE ist normalerweise

auf Mastzellen und basophilen, teilweise auch auf eosinophilen Granulocyten gebunden

(JANEWAY ET AL., 2002).

Ebenfalls Th2-geförderte Isotypen sind das IgA, IgG1 (Maus) und IgG4 (Mensch)

(WAKELIN, 1992), obwohl gegen Helminthen auch Antikörper anderer Isotypen gebildet

werden, deren Produktion von Th1-Zellen gefördert wird. Die Th2-Cytokine IL-4 und IL-6

verstärken die Produktion von murinem IgG1 (VAN OMMEN ET AL., 1994). Schafe, Mäuse und

Meerschweinchen mit einer effektiven Immunität gegen Nematoden haben mehr IgG1 (high

responder) als Tiere mit einer schwächeren Abwehr (low responder), ihr Gesamt- und

parasitenspezifischer IgG1-Titer korreliert negativ mit der Eizahl in den Faeces (DAWKINS ET

AL., 1988, ELSE ET AL., 1993, GILL ET AL., 1993, MANJILI ET AL., 1998). Die high responder

waren gut durch eine Immunisierung vor einer experimentellen Infektion zu schützen,

während das bei den low respondern nur unzureichend gelang (ROTHWELL ET AL., 1994).

MANJILI ET AL. (1998) leiteten daraus Hinweise auf eine Beteiligung von IgG1 an der

Degranulationsvermittlung von Mastzellen ab. HARRISON ET AL. (2003) konnten nachweisen,

dass IgG1 und IgA an ein Oberflächenmolekül einer L3-Larve von Trichostrongylus

colubriformis binden und so das Anheften der Larven an bevorzugten Stellen im Darm

verhindern, worauf die Larven aufgrund von mangelhafter Adhäsion ausgestoßen werden. So

spielt IgA auch eine Rolle bei der natürlichen Resistenz von Schafen gegen Haemonchus

contortus im Vergleich zu weniger resistenten Tieren (GILL ET AL., 1993), auch hier besteht


ein deutlicher Zusammenhang zwischen hohen Serum-IgA-Titern auf Resistenz gezüchteter

Schafe und niedrigen Eiausscheidungszahlen. Bei in Filariose-Endemiegebieten lebenden

Menschen konnten deutlich IgE- und IgG4-Antikörper gegen ein rekombinates Protein aus

Brugia spp., mit dem das Immunsystem der untersuchten Personen fortlaufend Kontakt hatte,

nachgewiesen werden; die IgG1- und IgG3-Antwort auf dieses Protein ist geringer

(YAZDANBAKHSH ET AL., 1995). Beim Th1-geförderten Isotyp IgG2a der Maus konnte im

Gegensatz zu den Th2-unterstützten Isotypen eine deutlich positive Korrelation zwischen der

Anzahl der Nematoden im Intestinum und der Höhe des parasitenspezifischen Titer

festgestellt werden (ELSE ET AL., 1993). Unterschiede zwischen stark und schwach

verwurmten Schafen und Meerschweinchen konnten bei IgG2- und IgM-Titern nicht

ausgemacht werden (MANJILI ET AL., 1998, GILL ET AL., 1993).

Beim Pferd wurden bisher zumeist IgG(T)-Titer gegen Helminthen untersucht, allerdings ist

inzwischen bekannt, dass es bei dieser Spezies sieben verschiedene IgG-Subtypen gibt

(WAGNER ET AL., 1997 und 2004, WEGE, 2004). Dabei konnte ein deutlicher Anstieg des

IgG(T) bei experimentell mit Strongylus vulgaris infizierten Ponies festgestellt werden

(PATTON ET AL., 1978). Fohlen, die die erste Weidesaison draußen verbrachten, zeigten

ebenfalls einen IgG(T)-Anstieg auch auf kleine Strongyliden, während die erwachsenen

Stuten einen bereits hohen Titer unverändert hielten (WEILAND ET AL., 1991). Auch DOWDALL

ET AL. (2002 und 2004) konnten eine deutliche IgG(T)-Antwort nach Cyathostominae-

Infektionen auf intramucosale Larvenstadien und auf zwei spezifische parasitische Antigene

nachweisen. Ebenfalls besteht eine Korrelation zwischen dem spezifischen IgG(T)-Titer mit

der Infektionsschwere mit Anoplocephala (PROUDMAN ET AL., 1996). Hier sinkt der

spezifische IgG(T)-Gehalt nach Entwurmung. Er variiert auch je nach Alter des Pferdes und

IgG-Isotyp (IgG(a), IgG(b), IgG(c)) (PROUDMAN ET AL., 1997).

Die Nomenklatur der IgG-Subtypen des Pferdes wurde inzwischen den bei anderen Spezies

üblichen Bezeichnungen angeglichen (WEGE, 2004). IgG(a) wird jetzt mit IgG1, IgG(b) mit

IgG4 und das IgG(c) mit IgG6 bezeichnet. Das IgG(T) konnte als eine Mischung aus IgG3

und IgG5 identifiziert werden, während das neu exprimierte IgG2 noch nicht anderweitig

benannt war. Der genetisch angelegte Isotyp IgG7 konnte bisher weder aus dem Serum

isoliert noch exprimiert, jedoch auf mRNA-Ebene nachgewiesen werden (WAGNER ET AL.,

2004).


2.7 Immunmodulation der allergischen Typ-I-Reaktion durch Helminthen

In Entwicklungsländern mit hoher Helmintheninfektionsprävalenz sind allergische

Erkrankungen lange nicht so bekannt wie in den Industrieländern (BELL, 1996, COOKSON und

MOFFAT, 1997). Es stellt sich die Frage, ob Helminthen möglicherweise atopische

Effektorfunktionen inhibieren, wobei vermutlich genetische Faktoren des Wirtes ebenfalls

eine Rolle spielen. So konnte bei Kindern, deren Vorfahren aus parasitisch stark belasteten

Regionen Afrikas ausgewandert waren, eine hohe Prävalenz von Asthma festgestellt werden

(KNOPF, 2000). Möglicherweise war eine starke, genetisch bedingte Th2-Dominanz des

Immunsystems ursprünglich dort wichtig im Schutz gegen eine zu hohe Parasitenlast. BELL

(1996) vertritt dazu die Ansicht, dass endemische Helminthosen das Th2-System in einer Art

aktivieren, die zu einer anderen Ebene des immunologischen Gleichgewichtes führt, als sie

derzeit in den Gesellschaften der Industrieländer vorkommt. Allergische Reaktionen sind

demnach eine rein pathologische Konsequenz der Störung dieser Gleichgewichts-

mechanismen und haben keinen protektiven Sinn. Dabei könnte eine Rolle spielen, dass

Helminthosen eine chronische Antigenchallenge darstellen. Reagierte das Immunsystem

dauerhaft mit entzündlichen Reaktionen gegen zahlreiche Parasiten, könnte es den eigenen

Organismus schädigen. Folglich könnte eine Herunterregulierung der Immunantwort eine

natürliche Antwort des Immunsystems auf kontinuierliche Antigenexposition sein

(YAZDANBAKHSH ET AL., 2001). Individuen mit chronischen Helmintheninfektionen könnten

starke anti-inflammatorische Netzwerke aufbauen, um Gewebsschäden zu unterbinden, die

sonst aus der kontinuierlichen Challenge des Immunsystems durch die parasitären Antigene

resultieren können (ALLEN und MAIZELS, 1997). So zeigen hyporesponsive Patienten mit

Filariose und einer hohen Parasitenlast generell schwächere Symptome der Erkrankung als

solche mit nur wenigen Parasiten, die trotz einer energischen Immunantwort die Parasiten

nicht eliminieren können und ein schwereres Krankheitsbild zeigen (MAIZELS ET AL., 1991).

Dieses anti-inflammatorische Netzwerk während der chronischen Parasiteninfektion könnte

der Schlüssel zur geringeren Prävalenz von allergischen Erkrankungen in Th2-dominierten

Populationen sein, denn dieses Netzwerk hemmt auch allergische Mechanismen. Dazu passt

die Beobachtung von VAN DEN BIGGELAAR ET AL. (2000), dass anti-inflammatorisches IL-10

bei chronischer Schistosomose eine zentrale Rolle bei der Unterdrückung der Allergie zu

spielen scheint. Allergiker bzw. Asthmatiker exprimieren der Bronchoalveolären Lavage und

in peripheren mononukleären Zellen bis zu zehnmal weniger IL-10 als Nicht-Allergiker

(BORISH ET AL., 1996). T-Zell-Populationen von Patienten mit chronischer Filariose weisen


herabgesetzte proliferative Reaktionen auf Helminthenantigene, aber auch auf unverwandte

Antigene auf, so dass GALLIN ET AL. (1998) eine verminderte T-Zell-Antwort aufgrund von

Defekten in der T-Zell-Aktivierung postulieren.

Neben der Möglichkeit der Herabregulierung der Immunantwort gibt es noch weitere

Erklärungsansätze für das Phänomen der Modulation der allergischen Reaktion durch

Helminthen, die auf den Mechanismus der Typ-I-Reaktion abzielen. LYNCH ET AL. (1993a)

postulierten, dass polyclonale, hohe IgE-Spiegel aus der Helminthenbekämpfung die Fcε-

Rezeptoren auf Mastzellen und Basophilen absättigen und eine spezifische IgE-Produktion

unterdrücken. Eine Hemmung der Allergie trete auf, wenn eine inverse Beziehung zwischen

gesamtem und allergenspezifischem IgE bestehe. Die polyclonale IgE-Synthese anstelle einer

gezielten, parasitenspezifischen Synthese kann evtl. eine Verteidigungsstrategie des

Helminthen darstellen. Denn auch der Parasit löst seltener eine Typ-I-Abwehrreaktion aus,

wenn so viel Oberflächen-IgE auf Mastzellen und Basophilen gebunden ist, dass nicht mehr

ausreichend parasitenantigenspezifisches IgE kreuzvernetzt werden kann. Die polyclonale

Synthese von IgE reduziert so möglicherweise die Effektivität von spezifischem IgE (HAGEL

ET AL., 1993a). Eine anthelminthische Behandlung von Kindern mit Askarideninfektionen

resultierte in einem Absinken des IL-4 und damit auch des Gesamt-IgE-Titers im Serum

(HAGEL ET AL., 1993a, LYNCH ET AL., 1993b). Im Gegenzug stiegen die Reagibilität im

allergischen Hauttest und der allergenspezifische IgE-Spiegel gegen Umweltallergene. Mit

erneuten Parasiteninfektionen erhöhten sich die Gesamt-IgE-Titer wieder, während die

allergenspezifischen Spiegel und die Hauttestsensitivität sanken. KAUL (1998) berichtet von

zwei vorberichtlich an Sommerekzem erkrankten, aber im Allergietest (FIT) negativen

Pferden, die nach zweimaliger Entwurmung trotz Stallhaltung und wenig Kontakt zu

stechenden Insekten plötzlich eine deutliche Sensibilisierung der basophilen Granulocyten im

FIT gegen Culicoides nubeculosus zeigten. Äthiopische Emigranten in Israel zeigten nach

anthelminthischer Behandlung einen deutlichen Anstieg von allergischer Rhinitis und

Hauttestreaktionen (STEIN, 1999). FINKELMAN ET AL. (1991) vertraten die Theorie, dass einige

Helminthen die IL-4-abhängige polyclonale IgE-Produktion fördern, um über die Absättigung

der Fcε-Rezeptoren die spezifische Sensibilisierung der Mastzellen und Basophilen

herabzusetzen und so eine Auslösung des Typ-I-Mechanismus zu umgehen. Dagegen führen

YAMAGUCHI ET AL. (1997) als Gegenargumentation an, dass hohe IgE-Spiegel zu einer

drastischen, bis zu 32-fachen Heraufregulation von Fcε-Rezeptoren führen. Das löst

wiederum eine signifikante Steigerung der IL-4-Produktion bei Allergen- bzw.


Antigenkontakt aus, die eine weitere Erzeugung von noch mehr IgE zur Folge hat. Es stellt

sich also die Frage, ob Fcε-Rezeptoren überhaupt abzusättigen sind und ab wann

Regulationsmechanismen zum Tragen kommen, die diese Induktionsspirale unterbrechen.

Die starke Korrelation zwischen IL-4 und IgE im Serum konnten HAGEL ET AL. (1993b) in

ihren Untersuchungen bestätigen, jedoch fanden sie auch eine negative Korrelation zwischen

der Höhe des IgE-Titers und der Sensibilität im Hauttest. Dabei scheint die spezifische Anti-

Helminthen-Antwort bei atopischen Kindern stärker zu sein als bei Nichtatopikern (LYNCH ET

AL., 1998). Letztere scheinen eher zu vermehrter polyclonaler IgE-Bildung zu neigen. HAGEL

ET AL. (1993a) konnten Zusammenhänge zwischen einer schnellen Reinfektion mit

Helminthen nach Entwurmung und einem hohen, jedoch unspezifischen IgE-Titer

nachweisen. Als Resultat hatten allergische Kinder im Schnitt geringere

Helmintheninfektionen als Nichtallergiker (LYNCH ET AL., 1998). LYNCH ET AL. (1998) deuten

daraufhin an, dass es sich hierbei ursprünglich um einen Evolutionsvorteil gehandelt haben

könnte (siehe auch BELL, 1996, KNOPF, 2000, YAZDANBAKHSH ET AL., 2001). Dazu passen

auch die Ergebnisse von EDMONDS ET AL. (2001), die bei stark verwurmten Ponies geringere

IL-4-Spiegel fand. Diese Tiere reagierten auch allgemein deutlich vermindert in ihrer

Antikörperbildung und Lymphoproliferation auf experimentelle Immunisierungen.

Material und Methoden 34

3 Material und Methoden

3.1 Probanden

Alle in dieser Studie in den Jahren 2003 und 2004 untersuchten Pferde befanden sich in

Privatbesitz und wurden der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule

Hannover zu Forschungszwecken langfristig oder zeitweise zur Verfügung gestellt. Das Alter

der Tiere variierte zwischen drei Monaten und ca. siebzehn Jahren. Je nach Vorbericht und

Entwicklung während der Studie bezüglich der klinischen Ausprägung der Typ-I-Allergie

(Sommerekzem) wurden die Tiere als „Allergiker“ oder als „Nichtallergiker“ klassifiziert.

3.1.1 Probanden der Arbeitsgruppe Immunologie

Hier aufgeführt sind alle Pferde, die langfristig der AG Immunologie zur Verfügung standen.

Es handelte sich ausnahmslos um Islandpferde.

Probanden in den Untersuchungsjahren 2003 und 2004

Nr. Geschlecht Geburtsjahr

Klinisches

Sommerekzem,

„Ekzemer“

1 Stute 1992 positiv

2 Stute 1991 positiv 4 Stute 1992 positiv 5 Stute 1992 positiv 6 Stute 1988 positiv 7 Stute 1993 positiv 8 Stute 1993 positiv 9 Stute 1990 positiv 10 Stute 1990 positiv 11 Stute 1993 positiv 12 Stute 1993 positiv 16 Stute 1997 negativ

17 Stute 1997 negativ











28 Hengst 2000 negativ






Tabelle 1: Probanden in den Untersuchungsjahren 2003 und 2004 Es sind hier die im Versuch eingesetzten Pferde in den Jahren 2003 und 2004 aufgeführt. Die Spalten enthalten von links nach rechts die Versuchsnummer des Tieres (Nr.), das Geschlecht, das Geburtsjahr und den vorberichtlich erhobenen klinischen Allergiestatus (Sommerekzem (SE) positiv oder negativ). Die Pferde Nr. 2 und 19 schieden am 10. November 2003 nach einem Unfall aus dem Versuch aus, ebenso Nr. 17 am 22. Mai 2003. Pferd Nr. 5 verendete am 17. März 2003. Die Pferde Nr. 28, 29 und 32 wurden im August 2003 kastriert und im Folgenden als Wallache weitergeführt.

3.1.2 Zusätzlicher Proband

Hierbei handelte es sich um ein Vollblutpferd in Privatbesitz ohne Sommerekzem, das zur

Blutgewinnung und Untersuchung verwendet werden konnte.


3.1.3 Haltungs- und Fütterungsbedingungen

Die Pferde wurden auf Weiden eines landwirtschaftlichen Betriebes in der Nähe des

Steinhuder Meeres bei Hannover gehalten. In den Wintermonaten standen sie auf einer

Waldwiese eines Landschaftschutzgebietes, im Sommer auf Moorwiesen. Alle Pferde (mit

Ausnahme des separat untersuchten Privatpferdes) wurden zusammen in einer Herde in

Weidehaltung gehalten. Die Junghengste bildeten für die ersten sechs Monate des Jahres 2003

eine eigene Herde, wurden jedoch nach Kastration mit den Stuten zusammen gehalten.

Die Fütterung erfolgte außer mit Gras bei Bedarf mit Stroh, Heu und Silage. Zur

Mineralstoffsupplementation standen Lecksteine den Tieren zur freien Aufnahme zur

Verfügung. Weidehygienische Maßnahmen (z. B. regelmäßiges Abmisten der Weiden)

erfolgten bis auf regelmäßige oder versuchsbedingte Entwurmungen nicht.

Alle Weideflächen hatten natürliche und künstliche Wasserläufe in unmittelbarer Nähe oder

wurden von ihnen durchzogen.

3.2 Geräte

Absaugpipette, 12 ml Sarstedt, Nürnbrecht

Analysenwaage, Typ B6 Mettler-Toledo, Zürich

Eismaschine, Typ UBE 30-10 Ziegra, Isernhagen

IKA®-Mikrotiterplattenschüttler MTS 4 IKA Labortechnik, Janke und Kunkel

GmbH & Co. KG, Staufen

IKA®-Minishaker MS1 IKA Labortechnik, Janke und Kunkel


Kochtopf Einzelhandel

Kühlzentrifuge Varifuge K mit Tragringrotor Heraeus-Christ, Osterode, Kontakt:

Kendro, Osterode

Mörser und Pistill Roth, Karlsruhe

Labor-pH-Meter Typ 27 Knick, Berlin

Laborwaage L310 Sartorius, Göttingen

LKB Wallac 1272 Clinigamma (Gamma-Counter) Wallac Oy, Turku, Finnland,

Kontakt: Perkin Elmer Instruments,

Rodgau

Magnetrührer mit Heizplatte, Modell IKAMAG® RH IKA Labortechnik, Janke und Kunkel



Durchlichtmikroskop, Modell variant Jenamed Carl Zeiss, Jena

Mikrotiterplatten-Filterphotometer ELISA-Reader

Dynatech MR 5000

Dynatech, Denkendorf, Kontakt:

Dynex Technologies, USA

Multi-Reagenz-Waschgerät, Version 1.6 Dynatech, Denkendorf, Kontakt:

Dynex Technologies, USA

Pinzette, anatomisch Heiland, Hamburg

Pipetten, einstellbar von 1-20 µl, 20-100 µ, 20-200 µl

und 100-1.000 µl

Abimed, Langenfeld

Pipettierball Labor- und Analyse-Technik GmbH,

Hannover

SG Reinstwassersystem RS 90-4UF SG (Steudten & Gideon), Barsbüttel

Rührstäbe Größe Roth, Karlruhe

UmkehrosmoseanlageTyp RO 50/14SMB SG (Steudten & Gideon), Barsbüttel

Wärmeschrank Heraeus, Hanau, Kontakt: Kendro,

Osterode

Zentrifuge Varifuge GL mit Tragringrotor Heraeus-Christ, Osterode, Kontakt:

Kendro, Osterode

3.3 Material

3.3.1 Verbrauchsmaterialien

BD Vakutainer® CAT, 10 ml Becton Dickinson, Heidelberg

BD Vakutainer® K2E 18 mg,10 ml Becton Dickinson, Heidelberg

BD Vakutainer® K2E 18 mg, 5 ml Becton Dickinson, Heidelberg

BD Vakutainer® CAT, 5 ml Becton Dickinson, Heidelberg

Deckgläser Roth, Karlruhe

Einmalkanülen Terumo Neolus, 24 G / 0,55 x 25 mm,

pyrogenfrei

Terumo Corporation, Leuven,

Belgien

Einmalkanülen Terumo Neolus, 24 G / 0,9 x 25 mm,

pyrogenfrei

Terumo Corporation, Leuven,

Belgien

ELISA-Mikrotiterplatten Nunc-Immuno-Plate

Maxisorb, F 96

Nunc, Wiesbaden


Eppendorf-Reaktionsgefäße, 1,5 ml Greiner, Frickenhausen

Fecalyzer®, Fecal Analysis System EVSCO Pharmaceuticals, New

Jersey, USA

Flüssigkeitenfilter, 0,45µm, 0,2 µm Renner, Dannstadt

Injektionsspritzen, 2 ml, 5 ml, 10 ml Braun Melsungen AG, Melsungen

Klebefolie für Elisa-Platten: plate sealers Corning Inc., NY, USA

Objekträger Roth, Karlsruhe

Papier, saugfähig Einzelhandel

PD10-Säulen Amersham Biosciences, Freiburg

Pipettenspitzen, blau und gelb Sarstedt, Nürnbrecht

RS-Röhrchen (RIA), 5 ml Greiner, Frickenhausen

Vacutainer Systems Precision Glide, 0,9 x 38 mm Becton Dickinson, Heidelberg

Vacutainer Systems, Halter Becton Dickinson, Heidelberg

Zellkultur-Mikrotiterplatten, Flachboden, 96 well,

steril, mit Deckel

Greiner, Frickenhausen

Zentrifugenröhrchen, 50 ml, steril Corning Inc., NY, USA

3.3.2 Chemikalien und Reagenzien

Alle verwendeten Reagenzien hatten einen Reinheitsgrad von mindestens 99%. Ammoniumhydrogencarbonat Roth, Karlsruhe

Aluminiumhydroxid Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Aqua dest. Aus der Umkehrosmoseanlage (3.2)

der Arbeitsgruppe Immunologie der

TiHo Hannover

Aqua tridest. Aus dem SG Reinstwassersystem

(3.2) der Arbeitsgruppe Immunologie

der TiHo Hannover

BCA Protein Assay Kit Pierce / Peribo Science, Bonn

Calciumchlorid (CaCl2* 2 H2O) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# C-

3881

3-((3-Cholamidopropyl)diamethylammonio)-1- Omnilab, Bremen


propansulfat (CHAPS)

Citronensäure (x 1 H2O) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# C-

7129

Dimethylsulfoxid (DMSO) p.a. J.T. Baker, Groß-Gerau, Kat# 7033

Histamin, freie Base Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# H-

7125 125Iod-Histamin-Tracer LDN, Nordhorn

Kaliumchlorid (KCl), kristallin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# P-

4504

Magnesiumchlorid (MgCl2 * 6 H2O) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat#

M-0250

Natriumazid, (NaN3), 10%ig Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# S-

2002

Natriumchlorid (NaCl) Roth, Karlsruhe, Kat# 9265

Natriumhydroxid (NaOH), wasserfrei Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# S-

5881

Natriumcarbonat (Na2CO3 x 0 H2O) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# S-

2127

Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Merck, Darmstadt, Kat# 6329

Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4 x 2 H2O) Riedel-DeHaen AG, Seelze, Kat#

04269

Di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# S-

0876

N-Hydroxysuccinimido-Biotin (NHS-Biotin) LDN, Nordhorn

Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), ohne Ca²+

/ Mg²+ (Trockensubstanz)

Biochrom, Berlin, Kat# L182-10

Polyethylenglycol (PEG) 8000 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# P-

2139

Piperazine-N,N’bis[2-ethanesulfonic]acid (PIPES) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# P-

6757

Salzsäure (HCl), konzentriert (37%) J.T. Baker, Groß-Gerau, Kat# 6081

Streptavidin-Peroxidase Amersham Biosciences, Freiburg

Tris: Trisma® Base Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# T-


(Tris[hydroxymethyl]aminomethan) 1503

Triton X (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# X-

100

Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# P-

1379

Schwefelsäure (H2SO4), 96% Roth, Karlsruhe, Kat# 93162

Tetramethylbenzidin (TMB) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# T-

2885

Wasserstoffperoxid (H2O2), 30%-Lösung Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat#

21676-3

Wright-Lösung Sigma-Aldrich, Taufkirchen

3.3.3 Antikörper und Seren

Donkey-anti-goat (Esel-anti-Ziege) IgG,

Antiserum Grade

Scantibodies Lab., Santee, CA, USA, Ak-

Konzentration: 14,5 mg/ml, Kat# 3AD497

Goat-anti-histamine (Ziege-anti-

Acylhistamin Nativserum) (gαAch)

Arbeitsgruppe Immunologie der TiHo Hannover

Goat-anti-horse (Ziege-anti-Pferd) IgG

(H&L)-Ak

Fa: Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.,

Proteinkonzentration: 2,4 mg/ml, Kat# 108-005-

003

Goat-anti-mouse (Ziege-anti-Maus) IgG +

IgM (H+L)-Ak, Peroxidase-conjugated

AffiniPure

Fa: Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.,

Proteinkonzentration: 0,8 mg/ml, Kat# 115-035-

044

Mouse-anti-EqIgA (Maus-anti-EqIgA)-

Ak (KlonA)

freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Paul

Lunn, USA

Mouse-anti-EqIgE (Maus-anti-EqIgE)

(m(γ1)αEqIgE)-Ak, interne Labornr.

#134


Proteinkonzentration: 4200 µg/ml bzw. naiver

Zellkulturüberstand

Mouse-anti-EqIgE (Maus-anti-EqIgE)

(m(γ1)αEqIgE)-Ak, interne Labornr.

#176


Proteinkonzentration: 2200 µg/ml

Mouse-anti-EqIgG1 (Maus-anti-EqIgG1) Arbeitsgruppe Immunologie der TiHo Hannover


(mαEqG3-47)-Ak

Mouse-anti-EqIgG3-Ak (Maus-anti-

EqIgG5) (CVS 40)


Lunn, USA

Mouse-anti-EqIgG4 (Maus-anti-EqIgG4)-

Ak (CVS 39)


Lunn, USA

Mouse-anti-EqIgM (Maus-anti-EqIgM)-

Ak (mαEqM1-141)


Mouse-anti-EqIgE-Ak (Maus-anti-Eq-

IgE), biotinyliert

freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr.

R. E. Esch, Ph.D., USA

Ziegenserum, normal Arbeitsgruppe Immunologie der TiHo Hannover

3.3.4 Allergene

Culicoides nubeculosus (Gnitze) (Cn) Greer-Laboratories, USA, Aufreinigung über PD

10, Proteingehalt: 550 µg/ml

Culicidae spp. (Stechmücken) (Mosquito,

Mq)

Greer-Laboratories, USA, Aufreinigung über PD

10, Proteingehalt 2000 µg/ml

Tabanus spp. (Pferdebremse) (Horse fly,

HF)

Greer-Laboratories, USA, Aufreinigung über PD

10, Proteingehalt: 1100 µg/ml

Rekombinantes Protein „A“ aus Tricho-

strongylus colubriformis („Aspin“),

encoded Tco-API-1, Mol.Gew. 31 kDa,

hier benannt als „TcA“

freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Drs.

R. Shaw und W. Hein, Upper Hut, Neuseeland

Rekombinantes Protein „B“ aus Tricho-

strongylus colubriformis, encoded Tco-

gbp-2, Mol.Gew. 34,6 kDa, hier benannt

als „TcB“

freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Drs.

R. Shaw und W. Hein, Upper Hut, Neuseeland

Cyathostominae spp. (kleine Strongyli-

den, Arten nicht morphologisch weiter

bestimmbar)

Institut für Parasitologie der TiHo Hannover


3.3.5 Medikamente

Droncit® orales Gel 9%, Injektor zu 6,67 g,

Wirkstoff: Praziquantel

Bayer AG, Leverkusen, Ch.-B. KP00A0A

Equest® orales Gel, Injektor zu 11,5g,

Wirkstoff: Moxidectin

Fort Dodge, Würselen, Ch.-B.: 8404

Jernadex®, Injektor zu 24 ml, Wirkstoff:

Pyrantelpamoat

Virbac, Bad Oldesloe, Ch.-B. OD3Z

Urbason® solubile forte 250, Ampullen,

Wirkstoff: Methylprednisolon-21-

hydrogensuccinat

Euri-Pharm Arzneimittel, Piding, Ch.-B. A2001

3.3.6 Puffer, Gebrauchslösungen und Nachweisreagenzien

Alle Puffer und Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben, mit Aqua dest. oder Aqua

tridest. hergestellt und der angegebene pH-Wert bei Bedarf durch Zusatz von Salzsäure (HCl)

(3.3.2) oder Natriumhydroxid (NaOH) (3.3.2) eingestellt.

3.3.6.1 Für den Funktionellen In vitro-Test (FIT)

a) Puffer

Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS):

PBS-Trockensubstanz wird in Aqua tridest. gelöst. Die Konzentration der Bestandteile (3.3.2)

in der Lösung war:

NaCl 137,0 mmol/l

KC l2,7 mmol/l

Na2HPO4 8,1 mmol/l

KH2PO4 1,12 mmol/l

Der Puffer wurde auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt und bei einer Temperatur von 4°C

gelagert.


Pipes A:

Die Konzentration der Bestandteile (3.3.2) in der einfachen Lösung betrug:

NaCl 110 mmol/l

KCl 5 mmol/l

Pipes 25 mmol/l

NaOH 40 mmol/l

Die Pipes-A-Pufferlösung wurde als 10-faches Konzentrat angesetzt und bei einer Temperatur

von -20°C gelagert. Bei Bedarf wurde das Konzentrat aufgetaut und 1:10 mit Aqua dest.

verdünnt sowie die hergestellte Lösung auf einen pH von 7,2 eingestellt.

Pipes B:

MAASCH ET AL. (1984) entwickelte den Freisetzungspuffer (Pipes B), KAUL modifizierte ihn

1998. Ein Zusatz von Ca2+- und Mg2+-Ionen zum Puffer war für die Freisetzungsreaktion

notwendig, da bei der Gewinnung der Blutzellen die vorhandenen Calcium- und

Magnesiumionen durch den Gerinnungshemmer gebunden wurden. Diese Ionen sind aber für

die Zellaktivierung zur Histaminfreisetzung notwendig (MAASCH ET AL., 1984, MAGRO ET

AL., 1988). Die Bestandteile (3.3.2) waren:

Pipes A mit Zusatz von (final):

CaCl2 2 mmol/l

MgCl2 2 mmol/l

Der Puffer wurde bei einer Temperatur von 4°C aufbewahrt.

Tris-Puffer:

Der 0,5-molare Tris-Puffer diente der Pufferung der Acylierungsreaktion. Zur besseren Ver-

teilung der Acylierungslösungen wurde dem Puffer Tween 20 in einer Endkonzentration von

0,02 % zugesetzt.

Die Bestandteile (3.3.2) waren:

Aqua dest. 380 ml

Tris 30 g

Tween 20 0,1 ml

Die Pufferlösung wurde mit konz. HCL (3.3.2) auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und

dann mit Aqua dest auf 500 ml aufgefüllt.


b) Gebrauchslösungen

Antikörper:

Die Antikörper (3.3.4) gegen die equinen Isotypen IgG und IgE, goat-anti-horse IgG(H+L)

und mouse-anti-horse IgE, wurden bei -20°C und bei 4°C gelagert und in folgenden

Finalkonzentrationen und -verdünnungen in Pipes B (3.3.6.3a) eingesetzt:

Goat-anti-horse IgG(H+L): 60 und 20 µg/ml

Nativer Zellkulturüberstand eines mouse-anti-horse-IgE-Zellklons (3.3.3):

Finalverdünnung 1:4

Allergene:

Die aufgereinigten Aliquots (3.3.4) in Pipes B (3.3.6.3) wurden bei -20° C gelagert. Zur

Histaminfreisetzung wurden Lösungen folgender Stammkonzentrationen in Pipes B (3.3.6.3)

verwendet:

Culicoides nubeculosus (Cn): 30 µg/ml, 10 µg/ml, 1 µg/ml sowie 0,1 µg/ml

Tabanus spp. (HF): 100 µg/ml bis 0,1 µg/ml in Zehnerschritten

Culicidae spp. (Mq): 100 µg/ml bis 0,1 µg/ml in Zehnerschritten

Rekombinantes Protein „A“ aus Trichostrongylus colubriformis („TcA“):

80 µg/ml bis 0,0008 µg/ml in Zehnerschritten

Rekombinantes Protein „B“ aus Trichostrongylus colubriformis („TcB“):


Cyathostominae spp. („kleine Strongyliden“):


Histamin-Standards:

Zur Erstellung einer Histamin-Referenzkurve wurden Histamin-Standards in 0,1 N HCl

(3.3.2) in den Finalkonzentrationen 100, 30, 10, 3, 1 und 0,3 ng/ml eingesetzt.

Das Histamin wurde als freie Base in kristalliner Form auf der Analysenwaage abgewogen

und in 0,1 N HCl gelöst. Die hergestellten Lösungen wurden in Aliquots zu 1 ml bei einer

Temperatur von -35°C gelagert. Die jeweils in Gebrauch befindlichen Aliquots wurden bei

einer Temperatur von 4°C aufbewahrt.


NHS-Biotin ( Acylierungsreagenz):

Das NHS-Biotin (3.3.2) wurde in einer Konzentration von 50 mg/ml in DMSO (3.3.2)

angesetzt und in Aliquots zu 1 ml bei -35°C gelagert. Das NHS-Biotin wurde zur Umsetzung

des nativen Histamins in N-Acyl-Histamin eingesetzt, da der im RIA verwendete Antikörper

nur N-Acyl-Histamin erkennt.

Dazu wurde das NHS-Biotin direkt vor Gebrauch 1:25 mit Pipes A (3.3.6.3) verdünnt.

c) Nachweisreagenzien

Ziege-anti-Acylhistamin-Serum:

Das Ziege-anti-Acylhistamin-Serum diente dem Nachweis von N-Acyl-Histamin.

Das native Ziege-anti-Acylhistamin-Serum wurde in einer Verdünnung von 1:1000 in PBS

mit einem Zusatz von 1% Ziegennormalserum bei einer Temperatur von -30°C gelagert.

Im RIA wurde das Serum in einer Stammverdünnung von 1:100.000 in einem Reagenz mit

folgenden Bestandteilen (3.3.2) eingesetzt:

PBS 97,8 ml

Ziege-anti-Acylhistamin Nativserum (1 :1000) 1 ml

Ziegenserum, normal 1 ml

Natriumazid, 10% 0,2 ml

Präzipitationsserum:

Die im RIA gebildeten Immunkomplexe (3.4.3.2) aus N-Acyl-Histamin bzw. 125Jod

markiertem Tracer-Histamin und Histamin-Antikörpern des Ziegenserums wurden mit Hilfe

eines zweiten Antikörpers aus dem Esel (donkey-anti-goat IgG) präzipitiert.

Das Präzipitationsserum (donkey-anti-goat final 1:200) wurde aus folgenden Bestandteilen

(3.3.2) angesetzt:

PBS 1000 ml

Donkey-anti-goat Serum 5 ml

PEG 50 g

Triton X 100, 25% 2 ml

Natriumazid, 10% 2 ml

Bis zum Verbrauch wurden die Nachweisreagenzien bei einer Temperatur von 4°C gelagert.


3.3.6.2 Für den ELISA

1. Puffer

Coatingpuffer (A-Puffer):

Der Puffer setzte sich aus folgenden Bestandteilen (3.3.2) zusammen:

Na2CO3 15 mmol/l

NaHCO3 35 mmol/l

Der Puffer wurde auf einen pH-Wert von 9,6 eingestellt und bei einer Temperatur von 4°C bis

zum Gebrauch gelagert.

Wasch- und Verdünnungspuffer (B-Puffer):

Die Bestandteile (3.3.2) dieses Puffers waren:

NaH2PO4 2,5 mmol/l

Na2HPO4 7,5 mmol/l

NaCl 145 mmol/l

Tween 20 0,1%

Der Puffer wurde als 10-faches Konzentrat angesetzt und bei einer Temperatur von 4°C bis

zum Gebrauch gelagert. Bei Bedarf wurde er 1:10 mit Aqua dest. verdünnt und auf einen pH-

Wert von 7,2 eingestellt

Substratpuffer (C-Puffer):

Die Zusammensetzung dieses Puffers war (3.3.2):

Citrat 33,3 mmol/l

Na2HPO4 66,7 mmol/l

Der Puffer wurde auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und bei einer Temperatur von 4°C bis

zum Gebrauch gelagert.

2. Gebrauchslösungen

TMB in DMSO

Die Bestandteile der Lösung waren (3.3.2):

Tetramethylbenzidine (TMB) 150 mg

Dimethylsulfoxid (DMSO) 100 ml

Diese Lösung wurde in 1 ml-Aliquots bei -20°C bis zum Gebrauch gelagert.


Substratlösung:

Die Substratlösung wurde unmittelbar vor Gebrauch aus folgenden Substanzen hergestellt:

TMB in DMSO (s.o.) 1 ml

Substratpuffer (C-Puffer, 3.3.6.3) 10 ml

H2O2 (3%ig, 3.3.2) 40 µl

Schwefelsäure, 1 N (3.3.2)

3.3.6.3 Für den Nematodennachweis

Gesättigte Kochsalzlösung:

Zur Herstellung dieser Lösung (spezifisches Gewicht 1,2) wurden 360 g NaCl in 1000 ml

Aqua dest. gelöst.

3.3.6.4 Für die Allergenpräparation

Zur Herstellung der Allergenpräparation wurde ein 0,01 M Ammoniumhydrogen-

carbonatpuffer verwendet. Dazu wurden 0,395 g NH4HCO3 in 500 ml A. dest. gelöst und die

Lösung bei 4°C aufbewahrt.

3.3.7 Software zur Datenauswertung

Die Berechnung der ELISA-Units (3.4.6.3) wurde mit Microsoft® Excel 2002 durchgeführt,

die statistischen Berechnungen zur Signifikanz einer Gruppenbildung (4.5.2) mit Graph Pad

Prism 4® für Windows, Version 4.00, 2003.


3.4 Methoden

3.4.1 Versuchsaufbau

In den Versuchsjahren 2003 und 2004 wurden von allen Pferden regelmäßig Blut- und

Serumproben gewonnen, die zur Untersuchung des Gesamthistamingehaltes sowie des

Sensibilisierungsgrades von basophilen Granulocyten und von spezifischen Antikörpertitern

dienten.

3.4.1.1 Versuchsaufbau im Jahr 2003

Im Jahr 2003 sollte eine spezifische Sensibilisierung der equinen basophilen Granulocyten

gegen TcA und TcB induziert bzw. verstärkt werden. Zu diesem Zweck war eine gezielte

Immunisierung der Versuchsgruppe (n=14) mit je 100 µg dieser beiden Proteine pro Pferd

durch zweimalige intramuskuläre Applikation der Antigene in die Brustmuskulatur im

Abstand von 28 Tagen vorgesehen. Die Kontrollgruppe (n=10) erhielt nur das Lösungsmittel

mit Adjuvans ohne Antigene. Beide Gruppen sollten sechs Tage nach der zweiten

Immunisierung jeweils 1 mg Methylprednisolon (Urbason® solubile forte 250, 3.3.5) pro

Kilogramm Körpergewicht intravenös erhalten, da bekannt ist, dass eine ausreichende

intravenöse Applikation von Corticosteroiden zu einer Eliminierung basophiler Granulocyten

und dadurch zu einer drastischen Reduzierung des Gesamthistamins im Blut führt (siehe 2.3).

Neu aus dem Knochenmark auswandernde naive Basophile besetzen ihre Fc-Rezeptoren mit

im Serum frei verfügbaren Antikörpern, vornehmlich des Isotypes IgE, und erhalten so ein

dem aktuellen Antikörperverhältnis entsprechendes Antikörperspektrum auf ihren Fc-

Rezeptoren (sog. „Aktualisierungstest“). Durch die Immunisierung mit TcA und TcB sollte

der TcA- und TcB-spezifische Antikörpertiter angehoben werden, so dass die vermehrt im

Serum vorkommenden anti-TcA- und anti-TcB-Antikörper möglicherweise auch vermehrt

von den Fc-Rezeptoren der naiven Basophilen gebunden werden. Diese veränderte

Sensibilisierung kann im Funktionellen In-vitro-Test (FIT) (3.4.3) überprüft werden. Der

Versuchszeitpunkt wurde auf den Spätwinter gelegt, um einen relativen niedrigeren Titer der

gegen Insektenallergene gerichtete Antikörper im Pferd vorzufinden.

Der tatsächliche Versuchsablauf (4.1.1) jedoch bedingte mindestens eine Methyl-

prednisoloninjektion von 1-2 mg/kg KGW (Urbason® solubile) innerhalb der ersten zwölf

Stunden nach Immunisierung der Versuchsgruppe mit den rekombinanten Proteinen TcA und

TcB. Nur ein Pferd erhielt kein Corticosteroid.


Einteilung der Pferde in Versuchgruppen im Jahr 2003

Ekzemer Nichtekzemer

Versuchsgruppe (TcA/TcB-Pferde) #1, #2, #5, #12 #18, #20, #22, #27, #32

Kontrollgruppe #6, #8, #10, #11 #16, #17, #24, #25, #28#, #29

Tabelle 2: Einteilung der Pferde in Versuchgruppen im Jahr 2003 Dargestellt ist die Verteilung der Versuchspferde (3.1.1) nach Ekzemern und Nichtekzemern auf die in 3.4.1.1 vorgestellten Versuchsgruppen. 3.4.1.2 Versuchsaufbau im Januar 2004

Da eine erneute Immunisierung mit den rekombinanten Proteinen TcA und TcB nicht möglich

war (4.1.1), wurde der Antigenboost durch die massive Antigenfreisetzung im Zuge einer

Entwurmung der stark verwurmten Pferde zu induzieren versucht. Diese Antigenfreisetzung

sollte zu einer deutlichen Erhöhung der parasitenspezifischen (IgE) Antikörpertiter führen, um

dann einen erneuten Aktualisierungstest durch Applikation von Methylprednisolon

durchzuführen.

Es wurden drei etwa gleich große Gruppen gebildet. Gruppe I stellte die eigentliche

Versuchsgruppe dar. Sie wurde Ende Januar 2004 mit Moxidectin (Equest®) und Praziquantel

(Droncit®) entwurmt und sieben Tage später mit jeweils 1 mg Methlyprednisolon (Urbason®)

pro Kilogramm Körpergewicht behandelt.

Die erste Kontrollgruppe, Gruppe II, erhielt drei Wochen vor der Wurmkur das

Methylprednisolon, um die Effekte des Corticoides feststellen zu können. Gruppe III erhielt

kein Corticoid, nur die Anthelmintika. Tabelle 3 verdeutlicht den Versuchsaufbau.

Versuchsaufbau im Januar 2004

Gruppe I Gruppe II Gruppe III

05.01.04 Methylprednisolon

19.01.04 Entwurmung Entwurmung Entwurmung

26.01.04 Methylprednisolon

Tabelle 3: Versuchsaufbau im Januar 2004 Die Tabelle gibt den Versuchsaufbau zur Modulation durch anthelminthische Behandlung an. Es wurden drei Gruppen gebildet. Alle Gruppen wurden am 19.01.04 entwurmt. Gruppe II erhielt zur Untersuchung des reinen Cortisoneffektes am 5.01.04 1 mg/kg KGW Methylprednisolon, Gruppe I sieben Tage nach der Entwurmung dieselbe Dosierung. Gruppe III wurde entwurmt, aber weder vorher noch nachher mit Cortison behandelt.


Einteilung der Pferde in Versuchsgruppen im Jahr 2004

Ekzemer Nichtekzemer

Gruppe I #1, #6, #9, #11 #18, #23, #24, #25, #28

Gruppe II #7, #8, #12 #16, #20, #27, #29, #32

Gruppe III #4, #10 # 21, #22, #30, #31, #33

Tabelle 4: Einteilung der Pferde in Versuchsgruppen im Jahr 2004 Dargestellt ist die Verteilung der Versuchspferde (3.1.1) nach Ekzemern und Nichtekzemern auf die in Tabelle 3 vorgestellten Versuchsgruppen.

Jeweils vor den Cortisonapplikationen und der Entwurmung wurde ein Status des

Sensibilisierungsgrades (FIT) erhoben. Im 6-, 12-, 24-, 36-, 48-stündigem und danach

täglichem Abstand wurde über einen Zeitraum von jeweils zehn Tagen der

Gesamthistamingehalt der basophilen Granulocyten durch physikalische Freisetzung (3.4.3.1)

bestimmt. Gleichfalls wurden zu denselben Zeitpunkten Serumproben für eine

Antikörpertiterbestimmung gewonnen. Der Entwurmungserfolg wurde durch

Kotuntersuchungen vor und nach dem Versuch überprüft.

3.4.2 Blutentnahme

Für alle Blut- oder Serumuntersuchungen (FIT und ELISA) wurde den Versuchspferden bei

Bedarf wechselweise die rechte oder linke Vena jugularis unter Wahrung der medizinischen

Sorgfaltspflicht punktiert und eine Blutprobe mittels Vacutainer-System (3.3.1, FIT K2E, 10

ml oder 5ml, Serum CAT, 10 ml oder 5 ml) gewonnen.

3.4.3 Funktioneller In-vitro-Test (FIT) zur Bestimmung der Sensibilisierung

basophiler Granulocyten

Für diesen Test wurde den Versuchspferden steriles, mit EDTA gerinnungsgehemmtes Blut

entnommen und bei Raumtemperatur bis zur Bearbeitung gelagert. Die Verarbeitung der

Proben erfolgte innerhalb von drei bis vierundzwanzig Stunden nach der Entnahme. Die

Bestimmung des Sensibilisierungsgrades erfolgte nach dem von KAUL (1998) entwickelten

Verfahren. Dabei setzen basophile Granulocyten u.a. Histamin frei, wenn sie im Rahmen

einer Typ-I-Reaktion (2.3) durch Antikörper oder Allergene aktiviert werden. Histamin ist in

den anderen Zellen des Blutes nur in vernachlässigbaren Spuren vorhanden, so dass das in

diesem Test freigesetzte und gemessene Histamin aus aktivierten Basophilen stammen muss.


3.4.3.1 Histaminfreisetzung (Release)

Zur Entfernung von Serumbestandteilen wie freien Antikörpern und evtl. vorhandenem freien

Histamin wurden die Blutproben zunächst zweimal mit sterilem PBS (3.3.6.1) gewaschen.

Dazu wurde das EDTA-gerinnungsgehemmte Blut jedes Tieres in ein steriles 50-ml-

Zentrifugenröhrchen (3.3.1) übertragen und mit PBS auf 50 ml Gesamtvolumen aufgefüllt.

Die sorgfältig gemischte Probe wurde bei 10°C und 400 xg ohne Bremse zentrifugiert, der

Überstand abgenommen, abermals auf 50 ml mit PBS aufgefüllt, resuspendiert und wiederum

bei den vorgenannten Werten zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut bis auf das

Aufgangsvolumen der Blutprobe abgenommen und verworfen, die gewaschenen Blutzellen

vor der weiteren Verarbeitung gründlich resuspendiert.

Die eigentliche Histaminfreisetzung (Histaminrelease) erfolgte in mehreren Ansätzen:

a) Spontanfreisetzung:

Dieser Ansatz dient als Kontrolle einer unspezifischen Aktivierung oder Schädigung und

damit einer nicht-allergen- oder nicht-antikörpervermittelten Histaminfreisetzung durch die

basophilen Granulocyten.

Hierbei werden 250 µl der gewaschenen Blutzellsuspension mit 250 µl des Freisetzungspuffer

Pipes B (3.3.6.1) versetzt.

b) Physikalische Maximalfreisetzung:

Bei der Maximalfreisetzung werden die histaminhaltigen basophilen Granulocyten durch

Hitzeinwirkung zerstört und so das enthaltene Histamin in den Überstand abgegeben.

Dazu wurden 200 µl der Blutzellsuspension zu 800 µl des Freisetzungspuffers Pipes B

pipettiert und für zehn Minuten im Wasserbad gekocht. Um einen Überdruck im

Reaktionsgefäß zu verhindern, wurde der Deckel des zu kochenden Gefäßes mit einer Kanüle

perforiert. Die gekochte Probe wurde anschließend bei 3000 xg für drei Minuten zentrifugiert

und der partikelfreie Überstand gewonnen.

c) Antikörpervermittelte Freisetzung:

Bei dieser Freisetzung kamen verschiedene Antikörper gegen zwei unterschiedliche equine

Ig-Isotypen zum Einsatz. Der Antikörper goat-anti-eqIgG(H+L) (goat-anti-horse, gαh-IgG,

3.3.6.1) soll an Fcγ-Rezeptoren gebundene Antikörper des Isotypen G auf basophilen

Granulocyten miteinander kreuzvernetzen und so eine Fc-Rezeptorvermittelte


Histaminfreisetzung bewirken. Der aus einem Zellkulturüberstand gewonnene monoklonale

mouse-anti-eqIgE-Antikörper soll ebenfalls auf basophilen Granulocyten an Fcε-Rezeptoren

gebundene IgE-Moleküle unabhängig von ihrer Spezifität binden und so die Fcε-Rezeptoren

kreuzvernetzen. Auch diese Vernetzung bewirkt eine Freisetzung des in den Granula

gespeicherten Histamins aus diesen Zellen.

Dazu wurden 250 µl der gewaschenen Blutzellen und 250 µl der gαh-IgG-Lösung in den

Finalkonzentrationen 60 und 20 µg/ml bzw. 250 µl der mouse-anti-eqIgE 1:4 final in Pipes B

zusammengegeben.

d) Allergen- und Antigeninduzierte Freisetzung:

Statt der Bindung der FcR-gebundenen IgE oder IgG auf den basophilen Granulocyten durch

Antikörper findet hier die Erkennung von spezifischen Proteinen, die als Allergen wirken,

durch die Fc-gebundenen Antikörper statt. Die Kreuzvernetzung der Fc-Rezeptoren durch

Bindung von mindestens zwei IgE (ggf. auch IgG) an ein Antigen (bzw. Allergen) bewirkt

wieder eine Aktivierung der Zelle und eine Histaminausschüttung.

Folgende als Allergene wirksame Antigenpräparationen (3.3.6.1) kamen zum Einsatz:

Culicoides nubeculosus (Cn): 15 µg/ml, 5 µg/ml, 0,5 µg/ml sowie 0,05 µg/ml

Tabanus spp. (HF): 50 µg/ml, 5 µg/ml, 0,5 µg/ml sowie 0,05 µg/ml

Culicidae spp. (Mq): wie Tabanus spp.

TcA: 40 µg/ml – 0,0004 µg/ml in Zehnerschritten

TcB: 4 µg/ml – 0,00004 µg/ml in Zehnerschritten

Cyathostominae spp.: 1 µg/ml – 0,00001 µg/ml in Zehnerschritten

Alle Präparationen enthielten kein Histamin.

Wie schon bei der antikörpervermittelten Freisetzung wurden auch hier 250µl der

gewaschenen Blutzellen mit 250 µl der in Pipes B verdünnten Allergenpräparation versetzt.

Der Freisetzungspuffer Pipes B ersetzte die durch die Blutprobengewinnung in EDTA-

Röhrchen gebundenen Ca2+- und Mg2+-Ionen, die die Basophilen zur Degranulation brauchen.

Die Finalkonzentration dieser Ionen betrug jeweils 1 mmol/l Ca2+ und 1 mmol/l Mg2+.

Alle Puffer und Allergenpräparationen wurden in Eppendorf-Cups zu 1,5 ml (3.3.1) vorgelegt

und bei -30°C eingefroren, um bei Bedarf aufgetaut und mit der entsprechenden Menge der


gewaschenen Blutzellen vermischt zu werden. Nach der gründlichen Vermischung wurden die

Releaseansätze mit Ausnahme des Ansatzes für die Maximalfreisetzung 60 Minuten bei 37°C

inkubiert, um den basophilen Zellen eine Degranulation zu ermöglichen. Nach dieser Stunde

wurden die Cups auf Eis auf 4°C für mindestens zwanzig Minuten heruntergekühlt, um die

Freisetzungsreaktionen zu stoppen. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation bei 4°C und

400 xg für zehn Minuten. Die Überstände wurden vorsichtig abgenommen und bei -20°C bis

zur Weiterverarbeitung im RIA eingefroren. Die physikalische Maximalfreisetzung erfolgte

durch zehnminütiges Kochen im Wasserbad. Nach drei Minuten Zentrifugation bei 3000 xg

wurde auch hier der Überstand gewonnen und eingefroren.

3.4.3.2 Radio-Immuno-Assay (RIA)

Der Radio-Immuno-Assay diente zur Bestimmung des jeweiligen Gesamthistamingehaltes

des Probenüberstandes in Nanogramm pro Milliliter Vollblut. Der hier verwendete RIA war

ein kompetitiver Ansatz. Es konkurrierten hier das in der Probe enthaltene Histamin mit

einem mit Iod125-markierten Markerhistamin (Tracer, 3.3.2) um eine definierte Menge an

Histamin-erkennenden Antikörpern. Diese Antikörper erkannten jedoch kein natives

Histamin, da gegen dieses weitverbreitete Molekül keine Antikörper gebildet werden. Eine

Acylierung von Histamin führte zu Acylhistamin, gegen das in der Ziege Immunglobuline

erzeugt werden konnten (goat-anti-acylhistamine (gαAch), 3.3.3). Durch eine Acylierung des

Probenhistamins mittels NHS-Biotin (3.3.2) war es möglich, ein kompetitives System aus

dem durch die Markierung acylierten Iod125, dem Probenhistamin und dem gαAch-Antikörper

zu etablieren. Nach dem Massenwirkungsgesetz stellte sich ein dynamisches Gleichgewicht

zwischen den zwei Antigenen und dem Antikörper ein. Durch eine anschließende

Präzipitation der Antigen-Antikörper-Komplexe mittels eines gegen Ziegen gerichteten

Antikörpers aus dem Esel (donkey-anti-goat, 3.3.3) konnten die Komplexe abzentrifugiert,

der Überstand verworfen und die Radioaktivität im Präzipitat gemessen werden. Dabei

verhielt sich durch die Kompetition die gemessene Radioaktivität antiproportional zu dem in

der Probe vorhandenen Histamin. Eine Rückrechung der Messung auf den tatsächlichen

Histamingehalt war aufgrund einer in jedem RIA mitlaufenden Standardreihe möglich.

Ansatz und Acylierung des Probenhistamins:

Es wurden pro zu messender Probe in jeweils zwei Polystryrolröhrchen (3.3.1) je 100 µl des

Freisetzungsüberstandes vorgelegt sowie eine Standardreihe, ebenfalls in Doppelansätzen:


Standard: 100 ng/ml, 30 ng/ml, 10 ng/ml, 3 ng/ml, 1 ng/ml und 0,3 ng/ml

in 0,1 N HCl (3.3.6.3), jeweils 50 µl plus 50 µl Pipes B (3.3.6.3)

Für den Nullwert (B0, histaminfreie Probe) und die unspezifische Bindung (NSB):

50 µl 0,1 N HCl plus 50 µl Pipes B

Überstand aus der Releasereaktion: 100 µl

In zwei Röhrchen wurde nur Tracer pipettiert (Tracerkontrolle).

RIA:

Pro Röhrchen wurden nun jeweils 50 µl Tris-Puffer (3.3.6.1) und NHS-Biotin (3.3.6.1) als

Acylierungsreagenz hinzugegeben und bei Raumtemperatur für dreißig Minuten inkubiert.

Danach wurden 50 µl der goat-anti-Ach-Lösung (3.3.6.1) in jedes Röhrchen mit Ausnahme

der Tracerkontrolle und der NSB-Kontrolle pipettiert. Das radioaktiv markierte Iod125 wurde

mit einem Volumen von 25 µl zu jedem Röhrchen hinzugefügt. Es folgte eine Inkubationszeit

von sechzehn bis zwanzig Stunden bei 4°C.

Danach wurde jedes Röhrchen mit Ausnahme der Tracerkontrolle mit je 1 ml

Präzipitationsserum (donkey-anti-goat, 3.3.6.3) versetzt, 15 Minuten bei 4°C inkubiert und

weitere 15 Minuten bei 1500 xg zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen (nicht

jedoch die Tracerkontrolle) und die radioaktiven Präzipitate im Gamma-Counter (LKB

Wallac 1272 Clinigamma (3.2)) ausgewertet. Dieses Gerät zählte die Zerfallsimpulse pro

Minute und gab sie als counts per minute (cpm) an.

Auswertung:

Aus den gezählten Impulsen der Doppelansätze wurde zunächst ein Mittelwert gebildet, dann

diesem der Wert des NSB, der unspezifischen Bindung, abgezogen und das Resultat als

Prozentsatz der histaminfreien Probe (B0) ausgedrückt (B/B0%). Die bekannten

Histaminwerte der Standardlösungen wurden zur Erstellung einer Standardkurve

herangezogen und in einem Graphen auf der logarithmisch eingeteilten Abszisse aufgetragen.

Die entsprechenden B/B0%-Werte wurden auf der linearen Ordinate zugeordnet. Mittels einer

sigmoidalen Anpassungsfunktion konnten die B/B0% der Proben in Histaminkonzentrationen

umgerechnet werden.


Die Gleichung zur Erstellung der Anpassungsfunktion lautet:

2)0/(1

21 AxxAAy p +

+−

= mit:

A1 obere Asymptote

A2: untere Asymptote

x0: Wendepunkt

p: Potenz

x : Histaminkonzentration

y: B/B0%-Wert

Der Histamingehalt der maximalen Freisetzung einer jeden Blutprobe (physikalische

Freisetzung (Kochansatz) oder antikörpervermittelte Freisetzung (goat-anti-horse IgG (H+L)

(gαh) 60µl/ml) wurde gleich 100% gesetzt und die Histamingehalte der anderen Ansätze

derselben Blutprobe in Prozent der Maximalfreisetzung angegeben (nach KAUL, 1998).

Zur Auswertung kamen die Daten eines Tieres nur, wenn die Spontanfreisetzung unter 6% der

Maximalfreisetzung lag. Diese Grenze ergab sich aus den Untersuchungen von KAUL und

beruht auf dem Mittelwert aller gemessenen Spontanfreisetzungen zuzüglich der dreifachen

Standardabweichung. Ein Releaseansatz (antikörper- oder allergenvermittelt), in dem

mindestens 10% der Maximalfreisetzung oder mehr gemessen wurden, wurde als „positiv“

bewertet. Dieser Wert ergab sich aus den Mittelwerten aller gemessenen

Spontanfreisetzungen zuzüglich der sechsfachen Standardabweichung. War ein Ansatz nur in

der geringsten Verdünnungsstufe einer Allergenpräparation (3.3.6.1) positiv, wurde er mit

„1+“ (sensibilisiert) bewertet, war er in den ersten zwei Verdünnungstufen positiv, mit „2+“

(stark sensibilisiert), in den ersten drei mir „3+“ (hochgradig sensibilisiert), in vier mit „4+“

(höchstgradig sensibilisiert). Eine Ausnahme stellen die in sechs Verdünnungsstufen

eingesetzten Allergenpräparationen aus TcA, TcB und aus Cyathostominae (kleinen

Strongyliden) (3.3.6.3) dar, deren Sensibilisierungsgrad nur mit „1+“ bis „6+“ angegeben

wurde. Ein negatives Releaseergebnis (<10%) wurde mit „0“ bezeichnet.


3.4.4 Immunisierung

Im Versuch des Jahres 2003 (3.4.1) wurden neun Pferde mit den rekombinanten Proteinen

TcA und TcB (3.3.3) immunisiert. Dazu wurden jeweils pro Tier 100 µg TcA und TcB mit 5

mg Aluminiumhydroxid steril in PBS (3.3.2) verdünnt und mit PBS auf ein Volumen von 2

ml aufgefüllt.

Die Injektion erfolgte mit medizinischer Sorgfalt in die Brustmuskulatur der Pferde. Es

wurden zunächst zwei Tiere injiziert und für 30 Minuten beobachtet, ob sich möglicherweise

Unverträglichkeitsreaktionen zeigten. Danach wurden alle Tiere nach dem festgelegten

Versuchsplan immunisiert, jedoch erhielten nur neun von vierzehn Pferden die TcA/TcB-

Antigene (4.1.1).

3.4.5 Entwurmung

Neben den im Rahmen der Weidehygiene durchgeführten Entwurmungen wurde im Versuch

des Jahres 2004 (3.4.1.2) im Rahmen des Versuchs eine Entwurmung mit den Wirkstoffen

Moxidectin (Equest®, 3.3.5) (in der vorgeschriebenen Dosierung von 0,4 mg Moxidectin pro

Kilogramm Körpergewicht) und Praziquantel (Droncit® orales Gel, 3.3.5) (1 mg pro

Kilogramm Körpergewicht) durchgeführt.

In weiteren versuchsbeeinflussenden anthelminthischen Behandlungen der Tiere wurde

Pyrantelpamoat (Jernadex®, 3.3.5) in einer Dosierung von 19 mg pro Kilogramm

Körpergewicht eingesetzt.

Die Anthelmintika wurden oral verabreicht.

3.4.6 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Zur Bestimmung der Antikörpertiter der verschiedenen Immunglobulinisotypen der Pferde

gegen die verwendeten Versuchsproteine TcA, TcB (3.3.4) und gegen Cyathostominae als

Stellvertreter der Nematoden war es notwendig, einen Isotypen-ELISA für die Isotypen

eqIgE, eqIgG1, eqIgG2, eqIgG4, eqIgG5, eqIgA und eqIgM zu entwickeln. Für die anderen

Isotypen, eqIgG3, eqIgG6 und IgG7, konnte kein ELISA etabliert werden, da die

entsprechenden Anti-Isotypen nicht oder nicht ausreichend zur Verfügung standen.

Ebenfalls wurde ein ELISA zur Bestimmung des eqIgE-Gesamttiters entwickelt.


3.4.6.1 Aufbau des Isotypen-ELISA

Es konnte das im Prinzip gleiche ELISA-System für alle verwendeten Versuchsproteine und

-präparationen genutzt werden. Als Antigen wurden jeweils 5 µg TcA bzw. TcB, (3.3.4) oder

5 µg der Strongylidenpräparation (3.3.4, 3.4.9) pro ml A-Puffer (3.3.6.2) als Coating-Lösung

eingesetzt. Mit dieser Lösung wurde jeweils die Hälfte einer 96-well-Mikrotiterplatte (3.3.1)

mit 50 µl pro Vertiefung beschichtet, die andere Hälfte nur mit A-Puffer als Negativkontrolle.

Die so beschichteten Mikrotiterplatten wurden mit Klebefolie abgedeckt und entweder für

zwei Stunden bei Raumtemperatur bei 500 rpm auf dem Mikrotiterplattenrüttler (3.2)

geschüttelt oder nach einer halben Stunde auf dem Plattenrüttler (ebenfalls 500 rpm, RT) über

Nacht bei 4°C im Kühlschrank aufbewahrt und am nächsten Morgen weiterverwendet.

Während dieser Zeit konnte über eine durch den hohen pH des A-Puffers induzierte

Polarisierung der Antigene eine Bindung an die stark polare Plattenvertiefung erreicht werden

(Coating). Dann wurden die Platten mit jeweils 400 µl B-Puffer (3.3.6.2) pro well von einem

ELISA-Washer (3.2) fünfmal gewaschen und dann von Hand trocken geschlagen. Die zu

untersuchenden Seren wurden in Zehnerschritten von 1:10 bis 1: 10.000 verdünnt und jeweils

50 µl pro Vertiefung in die Mikrotiterplatte pipettiert. Das zuvor ausgewählte und auf jeder

Platte mitlaufende Referenzserum wurde dabei als Standard jeder Mikrotiterplatte

hinzugefügt, um die Platten miteinander vergleichen zu können. Wieder mit Klebefolie

abgedeckt wurde der Ansatz für eine Stunde bei Raumtemperatur auf dem Rüttler (500 rpm)

inkubiert. Nun konnten im Serum vorhandene Antikörper jeden Isotyps an die gecoateten

Antigene binden, sofern sie für diese spezifisch waren. Diese Bindung ist stark genug, um

während der Dauer des Tests bestehen zu bleiben. Danach wurde der Waschvorgang

wiederholt (fünfmal 400 µl B-Puffer pro well, trockenschlagen) und der dem zu

untersuchenden Isotypen entsprechende Anti-Isotyp (mouse-anti-horse IgG1, mouse-anti-

horse IgG2, mouse-anti-horse IgG4, mouse-anti-horse IgG5, mouse-anti-horse IgA, 3.3.3,

Zellkulturüberstände, polclonales mouse-anti-eqIgE) in den Verdünnungen 1:30, im Falle des

Isotypen IgG2 1:10 und in dem des IgE 1:500, jedem well mit 50 µl zugesetzt. Diese

Antiisotyp-Antikörper konnten nun an die Immunglobuline binden, gegen deren Isotyp sie

gerichtet waren und die zuvor die plattengebundenen Antigene erkannt hatten. Nach einer

weiteren Stunde Inkubation auf dem Rüttler wurden die Platten erneut fünfmal mit B-Puffer

gewaschen, getrocknet und mit einem Peroxidase-gekoppelten goat-anti-mouse-IgG+IgM

(H+L)-Antikörper (3.3.3) in einer Finalverdünnung von 1:20.000 (50 µl pro Vertiefung) bzw.

im Falle des IgE bei der Untersuchung von Antikörpern gegen TcA und TcB Peroxidase-


gekoppeltes Streptavidin (Finalverdünnung 1:3000) (3.3.3) versetzt. Bei Untersuchung auf

IgE-Antikörper gegen die Cyathostominaepräparation wurde der Peroxidase-gekoppelte goat-

anti-mouse-Ak in der Verdünnung 1:10.000 eingesetzt. Da es sich bei allen Antiisotyp-

Antikörpern um Mäuseimmunglobuline handelte, konnte ein gegen Mäuseantikörper

gerichteter Antikörper (hier goat-anti-mouse) an alle Antiisotyp-Antikörper binden. Im Falle

der Untersuchung auf IgE gegen TcA oder TcB konnte eine Biotinylierung des polyclonalen

Mouse-anti-eqIgE ausgenutzt werden. Streptavidin bindet mit sehr hoher Affinität an

Biotinmoleküle, so dass es hier zu einer Bindung von Peroxidase-gekoppeltem Streptavidin

an den Anti-IgE-Antikörper kommen konnte. Nach 45 Minuten auf dem Schüttler (500 rpm,

RT) wurden die Mikrotiterplatten ein letztes Mal wie beschrieben gewaschen und mit 100 µl

Substratlösung (TMB mit Wasserstoffperoxid, 3.3.6.4) pro well versetzt. Bis zum

ausreichenden Farbumschlag (ca. 10 bis 20 Minuten) wurden die Platten im Dunklen bei RT

inkubiert. Der Farbumschlag wurde durch Sauerstoffradikale vermittelt, die von der an die

Anti-mouse-Antikörper gekoppelten Peroxidase aus Wasserstoffperoxid katalysiert wurden.

Je mehr Peroxidase im System ist, umso mehr H2O2 wird gespalten und umso mehr Radikale

sorgen für eine Farbreaktion des Substrates von farblos nach blau. Um die Umsetzreaktion zu

stoppen, wurden jeweils 50 µl 1 N Schwefelsäure (3.3.6.4) hinzugefügt. Dieses bewirkte

zusätzlich eine Farbänderung von blau nach gelb. Die Extinktion eines jeden wells wurde im

Dualmodus (Wellenlänge 570 nm (Referenzfilter) und 450 nm (Testfilter)) mit einem ELISA-

Photometer (3.2) gemessen und in „Millieinheiten optischer Dichte“ (mOD) ausgedrückt.

3.4.6.2 Aufbau des Gesamt-eqIgE-ELISA

Bei diesem ELISA handelte es sich um einen IgE-Sandwich-ELISA. Ein mouse-anti-eqIgE-

Antikörper (interne Labornummer #176, 3.3.3) wurde in einer Konzentration von 10 µg/ml in

A-Puffer (3.3.6.2) verdünnt und in einem Volumen von 50µl pro Vertiefung in eine 96-well-

Mikrotiterplatte gegeben. Die Mikrotiterplatte wurde mit einer Klebefolie verschlossen. Nach

zweistündigem Rütteln bei Raumtemperatur (500 rpm) auf dem Mikrotiterplattenschüttler

(3.2) oder 30-minütigem Rütteln bei ebenfalls 500 rpm und anschließender Aufbewahrung bei

4°C über Nacht im Kühlschrank wurde die Platte fünfmal mit B-Puffer (3.3.6.2) von einem

ELISA-Washer (3.2) gewaschen und anschließend trockengeklopft. Dann wurde das zu

untersuchende Pferdeserum in den Verdünnungsstufen 1:10 bis 10-6 in B-Puffer in Volumina

von 50µl pro well auf die Platte gegeben (mit Ausnahme der Negativkontrolle, hier wurde nur

B-Puffer einpipettiert), wieder mit der Klebefolie verschlossen und für eine Stunde auf dem


Plattenschüttler bei 500 rpm und Raumtemperatur inkubiert. Die an die Platte gebundene

Anti-eqIgE-Antikörper waren nun als Fänger-Ak in der Lage, alle in den Serumverdünnungen

vorhandenen Immunglobuline des Isotypen E zu binden, soweit es ihre Bindungskapazität

zuließ. Nach dieser Stunde wurde die Mikrotiterplatte abermals fünfmal gewaschen und

getrocknet (wie oben). Ein mit Biotin gekoppelter, polyclonaler anti-eqIgE-Antikörper (3.3.3)

wurde in einer Finalverdünnung von 1:1.000 in B-Puffer in die Platte gegeben (50 µl) und für

weitere 60 Minuten inkubiert. Diese polyclonale Antikörperpräparation konnte in dieser Zeit

an alle bereits aus dem Serum herausgefangenen und an den Fänger-Antikörper gebundenen

eqIgE binden. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Mikrotiterplatte erneut wie oben

gewaschen. Danach wurden je 50 µl einer Streptavidin-Peroxidase-Lösung (3.3.2, 1:3000

finalverdünnt) in jede Vertiefung geben und für eine weitere Stunde inkubiert (500 rpm, RT).

Das Streptavidin band mit einer hohen Affinität an das mit dem anti-eqIgE-Antikörper

gekoppelten Biotin. Nach einem weiteren Waschgang nach Ablauf der Inkubationszeit

wurden je 100 µl Substratlösung (TMB mit H2O2, 3.3.6.4) pro well in die Mikrotiterplatte

pipettiert und das System bei Raumtemperatur im Dunklen bis zu einem ausreichenden

Farbumschlag inkubiert (ca. 20-30 Minuten). Die an das Streptavidin gebundene Peroxidase

setzte das in der Substratlösung vorhandene Wasserstoffperoxid zu freiem Sauerstoff und

Wasser um, der freie Sauerstoff bewirkte eine farbige Umsetzung des Indikators Tetramethyl-

Benzidin (TMB) von farblos zu unterschiedlich kräftigem Blau. Diese Umsetzung konnte

durch pH-Wert-Erniedrigung mittels Schwefelsäure (1 N, 50 µl pro well, 3.3.6.2) gestoppt

werden, zusätzlich bewirkte die Säure einen Farbumschlag von blau zu gelb. Die Intensität

dieser Farbgebung (Extinktionen) konnte mittels Dualmodusmessung (ELISA-

Plattenphotometer, 3.2) bei Wellenlängen von 450 nm (Testfilter) und 570 nm (Referenzfilter)

quantifiziert und in „millioptischen Dichten“ (mOD) angegeben werden.

3.4.6.3 Auswertung der ELISA

Die Auswertung der ELISA-Ergebnisse erfolgte nach der Referenz-Standard-Methode

(PETERMANN, 1994). Als Standard für die Serumproben diente auf jeder Mikrotiterplatte

eine ausgewählte Serumprobe mit hohem Titer des zu detektierende Isotyps gegen das zu

untersuchende Antigen. Jede Probe wurde in vier bzw. fünf (Gesamt-IgE) aufeinander

folgenden Verdünnungsstufen gemessen. Zur Auswertung wurden die Hintergrundreaktionen

(Konjugatkontrolle, Messung von B-Puffer anstatt Serumprobe in zwei wells pro Platte)


abgezogen. Die Ergebnisse wurden mit denen des Standardserums als Titrationskurven in

einem Diagramm doppelt logarithmisch (x-Achse: log Titer, y-Achse: log der gemessenen

Extinktionen) aufgetragen, um die Kurven hinsichtlich ihrer Linearität und Parallelität ver-

gleichen zu können. Für alle Kurven wurde mit Hilfe einer linearen Regression eine

Geradengleichung nach der Formel y = ax + b erstellt, wobei a den Steigungsfaktor und b den

Schnittpunkt mit der y-Achse darstellt. Diese beiden Werte gingen in die Formel zur

Berechnung der relativen Titerhöhe in ELISA-Einheiten (ELISA-Units) ein:

log Titer Probe x 100

ELISA-Einheiten Probe = log Extinkt. Probe – log bs

log as 10

Die Abkürzung Extinkt. steht für Extinktion in mOD, as und bs sind nichtvariable

Komponenten der Geradengleichung der Standardkurve (Steigungsfaktor und Schnittpunkt

mit der y-Achse). Im zur Standardkurve parallelen Bereich der Kurven ergaben sich für jede

Probe in jeder Verdünnungsstufe entsprechende Einzelwerten, aus denen der Mittelwert

berechnet wurde. So ergab sich von jeder untersuchten Probe ein ELISA-Einheiten-Wert

(ELISA-Units) für die weitere Auswertung.

3.4.7 Cortisonapplikation

Das verwendete, in Trockensubstanz vorliegende Medikament Urbason® solubile (3.3.5) mit

dem Wirkstoff Methylprednisolon-21-hydrogensuccinat (Methylprednisolon) wurde zunächst

in Aqua dest. gelöst und auf 1 mg pro kg Körpergewicht dosiert. Die Injektion erfolgte mit

medizinischer Sorgfalt in die linke Vena jugularis.

3.4.8 Nematodennachweis

Der Grad der individuellen Nematodenbelastung jedes Pferdes wurde mehrmals jährlich

durch Kotuntersuchungen bestimmt. Im Rahmen des Versuches des Jahres 2004 wurden

jeweils vor und nach der anthelmitischen Behandlung parallel zu den Untersuchungen zur

Sensibilisierung der basophilen Granulocyten (FIT) Kotproben mittels Flotationsverfahren

untersucht. Dazu wurde zunächst eine Probe jedem Pferd rektal entnommen, kühl gelagert

und innerhalb der nächsten zwölf Stunden untersucht. Insgesamt 2 g Kot wurden von


verschiedenen Stellen der Probe entnommen und im „Fecalyzer“-System (3.3.1) mit

gesättigter Kochsalzlösung (3.3.6.3) gründlich vermischt. Das zum System gehörende Sieb

wurde eingeschraubt, der Behälter mit gesättigter Kochsalzlösung aufgefüllt und ein Deckglas

aufgelegt. Nach zwanzig bis dreißig Minuten wurde das Deckglas mit einer Pinzette auf einen

Objektträger überführt und das Präparat bei 50-facher Vergrößerung ausgezählt. Da es sich

um ein Übersichtsscreening zur Parasitenbelastung handelte, wurden nur Eier von Magen-

Darm-Strongyliden gezählt. In die Bewertung ging die rechnerische Eizahl pro Gramm Kot

ein.

3.4.9 Allergenpräparation (Cyathostominae spp.)

Fünfzig in Aqua dest. tiefgefrorene Nematoden (Cyathostominae spp.) wurden aus der

Flüssigkeit entfernt, getrocknet und in einem Mörser gründlich zerkleinert. 5 ml eines

Extraktionspuffers (0,01 M Ammoniumhydrogencarbonat, 3.3.6.4) wurden hinzugegeben und

die gründlich vermischte Suspension in ein Becherglas mit Rührstab überführt. Bei 4°C

wurden über Nacht unter ständigem Rühren Proteine aus den zerkleinerten Nematoden

extrahiert und in Lösung gebracht. Diese Lösung wurde am nächsten Tag bei ca. 5000 xg und

4°C abzentrifugiert. Das Pellet wurde abermals über Nacht in 5 ml 0,01 M

Ammoniumhydrogencarbonat extrahiert, diesmal mit einem Zusatz von 1 mM CHAPS

(3.3.2). Der Überstand beider Extraktionen wurde über eine PD10-Säule vom im FIT (3.4.3)

störenden Extraktionspuffer und evtl. vorhandenem, aus den Nematoden stammenden

Histamin gereinigt. Dazu wurde eine PD10-Säule zunächst mit 25 ml Freisetzungspuffer

(Pipes B, 3.3.6.1) gewaschen und 2,5 ml der Extraktionslösung über die Säule gegeben. Nach

Einsickern der Lösung in die Säule wurde mit 3,5 ml Pipes B nachgespült und die ablaufende

Flüssigkeit aufgefangen, die nun ca. 1:1,4 zur Ausgangspräparation verdünnt war. Nach

einem weiteren Spülen der Säule mit 15 ml Pipes B konnte der Vorgang so oft wiederholt

werden, bis das gesamte Volumen der Extraktionslösung aufgereinigt war. Jede

Extraktionsfraktion wurde separat aufgereinigt und anschließend über 0,45 µm- und 0,2 µm-

Sterilfilter filtriert. Über einen BCA-Assay (3.3.2) wurde der Proteingehalt beider

Extraktionslösungen bestimmt, die Lösungen aliquotiert und bei -30°C eingefroren.


3.4.10 BCA Protein Assay

Das Prinzip der Proteinbestimmung über einen BCA-Assay (vorgefertigt, 3.3.2) beruht auf

der sog. Biuret-Reaktion. Hierbei wird Cu2+ durch das Protein in einem alkalischen Medium

zu Cu1+ reduziert. Dieses Cu1+ reagiert unter Chelatbildung mit zwei Molekülen der BCA-

Lösung. Dieser Komplex ist farbig (violett) und kann je nach Menge der gebildeten

Komplexe über ein photometrisches System gemessen werden. Je höher der Proteingehalt der

zu testenden Lösung, umso schneller und intensiver erfolgt der Farbumschlag.

Die zu bestimmende Proteinlösung wird in Zweierschritten ebenso wie ein bekannter

Proteinstandard (BSA) bis 1:64 in PBS (3.3.2) verdünnt, dann 10 bis 25µl jeder Verdünnung

der zu bestimmenden Lösung und des BSA-Standards zu je 200µl einer vorgefertigten BCA-

Lösung (3.3.2) in Doppelansätzen in eine Mikrotiterplatte pipettiert und bis zu einem

ausreichenden Farbumschlag inkubiert. Die photometrische Auswertung erfolgt über ein

Photometer, z. B. einen ELISA-Reader (3.2), bei einer Wellenlänge von 562 nm.

Ergebnisse 63

4 Ergebnisse

4.1 Modulation der Sensibilisierung basophiler Granulocyten durch Immunisierung

mit den rekombinanten Proteinen TcA und TcB

Die basophilen Granulocyten sind mit einem heterogenen Antikörperspektrum besetzt, die

über Fc-Rezeptoren an die Membran gebunden sind. Für eine erfolgreiche Aktivierung dieser

Zellen ist eine Kreuzvernetzung rezeptorständiger, sensibilisierender Antikörper notwendig.

Dies setzt eine Mindestdichte von sensibilisierenden Antikörpern voraus, damit mindestens

zwei spezifische Antikörper „ihr“ Antigen erkennen und darüber kreuzvernetzt werden

können. Bei einem sehr vielfältigen Besatz aus einer Vielzahl von Antikörpern

unterschiedlicher Spezifitäten ist die Wahrscheinlichkeit einer Aktivierung des Basophilen

durch ein einzelnes Antigen aufgrund einer kompetitive „Ausverdünnung“ der spezifisch

erkennenden Antikörper geringer. Das Konzept, das in dieser Arbeit zugrunde lag, bestand in

einer selektiven Erhöhung der parasitenspezifischen Antikörper, insbesondere der gegen die

rekombinanten Proteine aus Trichostrongylus colubriformis „TcA“ und „TcB“, mittels einer

Immunisierung der Versuchspferde mit diesen Proteinen. Nach den Erfahrungen von

BRUENNLEIN (2001) ist es möglich, das Sensibilisierungsspektrum der Basophilen zu

„aktualisieren“, einer aktuellen Situation anzupassen. Nach der intramuskulären Injektion von

Methylprednisolon werden innerhalb weniger Stunden die Basophilen aus dem Blut eliminiert

und sind auch über ihren Histamingehalt (getestet in der physikalischen Freisetzung im

Funktionellen in-vitro-Test, FIT (3.4.3)) nicht mehr zu detektieren. Naive, neu aus dem

Knochenmark kommende Basophile besetzen ihre Fc-Rezeptoren mit passenden aktuellen

Antikörpern aus dem Serum, so dass alle dasselbe Sensibilisierungsmuster erhalten (sog.

„Aktualisierungstest“). In diesem Ansatz sollte eine Kompetition der TcA- und TcB-

spezifischen Antikörper mit allergen- bzw. insektenspezifischen Antikörpern auf den

Basophilen erreicht und so die Sensibilisierung moduliert werden. Der Antikörperbesatz sollte

also dahingehend verändert werden, dass hauptsächlich parasitenspezifische Antikörper (hier

Ak gegen die rekombinanten Proteine aus Trichostrongylus colubriformis, TcA und TcB) auf

den Fc-Rezeptoren der Basophilen binden und die Reaktionsbereitschaft gegen Allergene

(hier gegen Culicoides nubeculosus (Cn), Tabanus spp. (HF) und Culicidae spp. (Mq))

herabgesetzt, dagegen die gegen TcA und TcB induziert oder heraufreguliert werden.

In vorausgegangenen Tests konnte für einige Pferde eine vorhandene Sensibilisierung der

Basophilen gegen die rekombinanten Proteine beobachtet werden.

Ergebnisse 64

4.1.1 Paradoxe Reaktion der Versuchspferde auf die Immunisierung mit den

rekombinanten Proteinen TcA und TcB

Zur Erhöhung der Antikörpertiter gegen die rekombinanten Trichostrongylidenproteine TcA

und TcB (3.3.4) sollten vierzehn Pferde mit diesen Proteinen immunsiert werden (3.4.1.1). Es

wurden zunächst zwei Pferden, #22 und #32, Blutproben für FIT (3.4.3) und

Serumuntersuchungen (3.4.6) entnommen, die Pferde dann durch Injektion in die

Brustmuskulatur immunisiert und für mindestens dreißig Minuten beobachtet, ob sie

Unverträglichkeitsreaktionen zeigten. Da dies nicht der Fall war, wurden nach jeweiliger

Blutprobenentnahme sieben weitere Pferde daraufhin injiziert. Diese entwickelten in einem

Zeitrahmen von zehn Minuten bis zu sechs Stunden nach der Injektion unerwartet Symptome

einer Kolik mit hämorrhagischem Durchfall und sekundärem Schockgeschehen. Die beiden

Tiere, die zur Absicherung von Unverträglichkeitsreaktionen zuvor immunisiert worden

waren (# 22 und #32), blieben mit Ausnahme des Absatzes von wenig ungeformtem Kot bei

#22 sechs Stunden nach der Injektion völlig symptomlos. Tabelle 5 listet die Pferde mit ihren

individuellen Symptomen und Reaktionszeiten auf.

Individuelle Reaktionen der mit TcA und TcB immunisierten Pferde auf die Injektion

Pferd

Erste

Symptome

nach Symptome Erstversorgung Sonstiges

#1 60 min Durchfall, ruhige Brustlage Flunixin

#2 90 min ggr. Durchfall, ruhige

Brustlage

Flunixin

#5 20-30 min Wälzen, Schwitzen, Muskel-

tremor, hämorrhagischer

Durchfall, nach 2h Kreis-

laufschock, Herzfrequenz 90

Schläge /min, kapilläre

Füllungszeit ca. fünf Sek.,

bläuliche Schleimhäute,

kalte Hautoberfläche, Base

excess -11, Hämatokrit ca.

Keine Reaktion

auf Metamizol,

Scopolamin

oder Flunixin,

Infusion von 20

l Ringerlösung

Sektionsergebnis:

Hgr. akute nekro-

tisierende Typhlo-

colitis mit hgr.

Ödematisierung und

fokalen Blutungen in

Schleimhaut von

Colon und Caecum,

sekundäre Schock-

Ergebnisse 65

70% nach Infusion, Tod

nach ca. vierzig Stunden

trotz Intensivtherapie

symptome mit disse-

minierter intrava-

saler Gerinnung

#12 90 min Durchfall, Kolik,

Verschlechterung des

Kreislaufs innerhalb von drei

Stunden

Keine Reaktion

auf Metamizol

und Butyl-

scopolamin,

Besserung auf

Flunixin und

Infusion von 10

l Ringerlösung

#18 10 min Schubartige Koliksymptome

(Wälzen, Schwitzen),

hämorrhagischer Durchfall

Keine Reaktion

auf Metamizol

und Butyl-

scopolamin,

unter Flunixin

und Infusion (10

l Ringerlsg.)

Besserung ca.

drei Stunden

nach Beginn

#20 5-6 h starkes Schwitzen, flach auf

der Seite liegend, Durchfall

Keine Reaktion

auf Flunixin,

massive

Infusionstheapie

Langanhaltende

Schocksymptomatik,

intensivmedizinische

Betreuung

#22 (6h) (geringe Menge ungeformter

Kot), sonst keine Symptome

keine

Erstversorgung

#27 90 min Ggr.-mgr. Durchfall,

schwache Koliksymptome,

stabiler Kreislauf

Flunixin

#32 keine Symptome keine Therapie

Tabelle 5: Individuelle Reaktionen der mit TcA und TcB immunisierten Pferde auf die Injektion In dieser Tabelle sind die individuellen Reaktionen der erstmals mit den rekombinanten Proteinen TcA

Ergebnisse 66

und TcB (3.3.4) immunisierten Pferde bezüglich der Zeitdauer bis zum Einsetzen der ersten klinischen Symptome, der Art der Symptome sowie Informationen bezüglich der Erstversorgung und sonstiger Hinweise dargestellt.

Alle Pferde außer Tier #32 erhielten im Rahmen der klinischen Therapie u. a. einmalig

Methylprednisolon (Urbason® solubile, 1-2 mg/kg KGW intravenös) innerhalb von acht bis

zehn Stunden nach der Immunisierung.

Folgende Sensibilisierung gegen TcA oder TcB (getestet in Finalkonzentration von 40 und 4

µg/ml im FIT) war bei den immunisierten Pferden aus vorangegangenen Tests bekannt:

Bekannter Sensibilisierungsgrad der mit den rekombinanten Proteinen TcA und TcB

immunisierten Pferden

Pferd Nr. Sensibilisierung gegen TcA Sensibilisierung gegen TcB

#1 negativ negativ

#2 1+ unbekannt

#5 negativ negativ

#12 2+ unbekannt

#18 negativ negativ

#20 negativ negativ

#22 2+ unbekannt

#27 unbekannt 1+

#32 negativ negativ

Tabelle 6: Bekannter Sensibilisierungsgrad der mit den rekombinanten Proteinen TcA und TcB immunisierten Pferden

Die Tabelle gibt eine Übersicht über die Sensibilisierungsgrade (3.4.3) der Basophilen der mit TcA und TcB (3.3.4) immunisierten Pferde (4.1.1). Die dargestellten Sensibilisierungsgrade (3.4.3.2) beziehen sich auf im Reaktionsansatz im FIT (3.4.3) eingesetzte Proteinfinalkonzentrationen von 40 und 4 µg/ml. Negativ bedeutet keine nachweisbare Histaminfreisetzung im FIT bei Koinkubation mit den verwendeten rekombinanten Proteinen, 1+ bzw. 2+ die Verdünnungsstufe, bei der eine Histaminfreisetzung noch gemessen werden konnte (3.4.3.2).

Es war kein Zusammenhang zwischen der individuellen Reaktion der Pferde einer zuvor

bekannten Sensibilisierung gegen eines der beiden verwendeten rekombinanten Proteine TcA

oder TcB erkennbar.

Die generelle Symptomatik der klinischen Reaktionen auf die Applikation der rekombinanten

Proteine und das Ergebnis der Sektion deuten auf eine generalisierte Degranulation der

dickdarmständigen Mastzellen im Rahmen einer Typ-I-Hypersensitivitätsreaktion hin. Die

Ergebnisse 67

nach Bindung von TcA oder TcB freigesetzten Mediatoren führten zu einer Hypermotorik des

Darmes und zu einer verstärkten Gefäßdurchlässigkeit der Darmkapillaren, woraus der

Durchfall resultierte. Im Falle der Hämorrhagien war die Gefäßdurchlässigkeit so groß, dass

auch Blutbestandteile in das Darmlumen abgegeben wurden. Der Flüssigkeitsverlust in den

Darm und die Darmwand (Ödematisierung) führte zu einem Volumenverlust im Gefäßsystem

und somit zu einer Schocksymptomatik, die in einem Fall (Tier #5) nicht mehr zu

kompensieren war.

4.1.2 Auswirkungen des therapeutischen Methylprednisolons nach Immunisierung

Aufgrund der akuten allergischen Symptomatik im Darmbereich wurden alle betroffenen

Tiere (alle außer #32) mit 1-2 mg/ kg KGW Methylprednisolon behandelt. Es musste nun

überprüft werden, ob diese Applikation einen Einfluss auf die Basophilen und deren

Sensibilisierungsmuster gehabt hatte.

4.1.2.1 Veränderungen des Gesamthistamingehaltes

Die empfindlichste Form des quantitativen Nachweises der histaminhaltigen Basophilen im

Blut ist nach BRUENNLEIN (2001) die Bestimmung des zellulären Histamingehaltes nach

Zerstörung dieser Zellen (maximale bzw. physikalische Histaminfreisetzung, 3.4.3). Dies ist

möglich, da im Serum enthaltenes Histamin im Testverfahren entfernt wird und die

Basophilen die einzige Zellpopulation des Blutes sind, die gespeichertes Histamin enthalten.

Ein nicht mehr messbarer Histamingehalt des (gewaschenen, 3.4.3) Blutes (<0,3 ng

Histamin/ml Blut) ist daher ein Indikator für eine Basophilenpopulation unterhalb 300

Basophilen/ml Blut oder weniger als 0,01% der Leukocyten.

Es wurde daher die maximal aus dem Blut freisetzbare Histaminmenge durch eine

physikalische Freisetzung (3.4.3.1) bestimmt und so die Reduktion der Basophilen unter diese

Nachweisgrenze verifiziert. Zwölf Stunden nach Injektion des Methylprednisolons wurden

Blutproben von allen behandelten Pferden genommen und der Gesamthistamingehalt

bestimmt (3.4.3.1).

Tabelle 7 veranschaulicht den Gehalt vor und nach der Therapie im Vergleich mit #32, das als

einziges der immunisierten Pferde kein Methylprednisolon bekommen hatte.

Ergebnisse 68

Veränderung des maximal aus basophilen Granulocyten freisetzbaren Histamins vor

und 12h nach Methylprednisolon

Histamin ng/ml Histamin ng/ml Pferd prae Prednisolon post Prednisolon

#1 22,9 nicht nachweisbar #2 26,4 nicht nachweisbar #12 27,1 nicht nachweisbar #18 28,4 nicht nachweisbar #20 39,7 nicht nachweisbar #22 15,2 nicht nachweisbar #27 18,7 nicht nachweisbar #32 30,5 28,4

Tabelle 7: Veränderung des maximal aus basophilen Granulocyten freisetzbaren Histamins vor

und 12h nach Methylprednisolon Die Tabelle zeigt das nachweisbare Gesamthistamin aus Basophilen in ng/ml Blut aus der physikalischen Freisetzung (3.4.3.1) bei allen im TcA und TcB (3.3.4) immunisierten und im Rahmen der Notfalltherapie mit Methylprednisolon behandelten Pferden (4.1.1) vor und zwölf Stunden nach der Applikation. #32 wurde zwar immunisiert, erhielt aber kein Prednisolon. Die Nachweisgrenze liegt bei 0,3 ng Histamin (< 300 basophilen Granulocyten) / ml Vollblut.

Die Daten zeigen einen deutlichen Rückgang bis unter die Nachweisbarkeitsgrenze beim

Gesamthistamin an. Somit waren keine histaminhaltigen Basophilen mehr nachweisbar. Das

Pferd #32, dem kein Methylprednisolon injiziert wurde, veränderte sich in diesem Gehalt

kaum.

4.1.2.2 Veränderungen der spezifischen Sensibilisierungen der basophilen Granulocyten

Da die corticoidbedingte Eliminierung der basophilen Granulocyten aus dem Blut eine

Neurekrutierung von naiven Basophilen aus dem Knochenmark zur Folge hat, war nach der

Corticoidtherapie zu prüfen, ob die Sensibilisierung der neu eingewanderten Basophilen sich

von der der eliminierten Population unterschied. Dazu wurde mittels eines von KAUL (1998)

für das Pferd entwickelten Funktionellen In-vitro-Tests (FIT) die individuelle

Reaktionsbereitschaft jedes Pferdes gegen bestimmte Allergene bzw. Antigene (3.3.4) sowie

die „generelle“ Sensibilisierung durch IgG und IgE (3.3.3) bestimmt (3.4.3). Festzustellen

war, inwiefern sich das neue Sensibilisierungsmuster von dem ursprünglichen unterschied.

Blutproben wurden den Tieren vor und sieben Tage nach der Immunisierung entnommen und

auf die Reaktion der Basophilen gegen drei Allergene (Cn, Mq, HF, 3.3.4) und gegen die

Ergebnisse 69

beiden rekombinanten Antigene (TcA und TcB, 3.3.4) untersucht. Zur Erfassung der

„generellen“ Sensibilisierung, der Histaminfreisetzbarkeit aus Basophilen durch antigen-

unabhängige Kreuzvernetzung von IgG oder IgE, dienten Antiseren gegen eqIgG (goat-anti-

horse, gαh, 3.3.3) und eqIgE (3.3.3.).

Durch einen technischen Fehler waren die unmittelbar vor der Immunisierung und

Behandlung gewonnenen und bearbeiteten Proben nicht auswertbar. Daher wurden als

Vergleichswerte FIT-Ergebnisse eines ca. sechs Wochen älteren Tests verwendet. Dies war

zulässig und informativ, da sich die Sensibilisierungsmuster und -grade ohne (therapeutische)

Intervention nur über längere Zeiträume ändern (2.3). In diesem Testansatz waren nur zwei

hohe Konzentrationen der rekombinanten Proteine TcA und TcB getestet worden (40 und 4

µg/ml) statt vier (40-0,004 µg/ml). Es konnten deswegen keine Informationen über die

Ausgangssensibilisierungen der immunisierten Pferde in höheren Verdünnungsstufen erfasst

werden. Sie konnten nur aus den Daten der nicht immunisierten Kontrollgruppe extrapoliert

werden (Abbildung 8 und Abbildung 9).

Exemplarisch für die sieben überlebenden und mit Cortison behandelten Pferde sind in

Abbildung 1, Abbildung 3 und Abbildung 5 die Daten von dreien dieser Tiere vor und sieben

Tage nach Immunisierung und Methylprednisolon dargestellt.

Zu den Abbildungen 1-6: Allergenspezifische und „generelle“ Sensibilisierung vor und sieben

Tage nach Immunisierung mit TcA und TcB und Therapie mit Methylprednisolon bei den Pferden #1, #2 und #12

Dargestellt sind die Histaminfreisetzungen im FIT (3.4.3) auf drei Allergene (Cn, Mq und HF) in den Endkonzentrationen 50 µg/ml (bzw. 15 µg/ml bei Cn), 5 µg/ml und 0,05 µg/ml sowie auf zwei rekombinante Parasitenproteine (TcA und TcB) in den Endkonzentrationen 40, 4, 0,4 und 0,04 µg/ml vor. Weiterhin dargestellt sind die Freisetzungen auf die Anti-Isotyp-Antikörper anti-IgG (gαh 60) und anti-IgE. Die Freisetzungsraten sind in Prozent der physikalischen Histaminfreisetzung (maximale Freisetzung, 3.4.3.1) aus Basophilen dargestellt. Auf der jeweils linken Seite eines Allergens (vor Immun.) bzw. Antigens oder anti-Isotyps wurden die Ausgangswerte vor, auf der rechten Seite (nach Immun.) die Werte nach Immunisierung und Methylprednisolon abgebildet. Die eingezeichnete Linie markiert die Zehn-Prozent-Grenze, über der ein Releaseergebnis als positiv gilt (3.4.3.2). Alle drei Pferde sind klinische Ekzemer.

Ergebnisse 70

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

vorImmun.

nachImmun.

vorImmun.

nachImmun.

vorImmun.

nachImmun.

vorImmun.

nachImmun.

vorImmun.

nachImmun.

Cn Mq HF TcA TcB

% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g50 µg/ml 5 µg/ml 0,5 µg/ml 0,05 µg/ml

Abbildung 1: Sensibilisierung vor und sieben Tage nach Immunisierung und Methylprednisolon

bei Pferd #1 Legende siehe oben

0%

20%

40%

60%

gah 60 a Ig E

% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g

vor Immun. nach Immun.

Abbildung 2: „Generelle“ Sensibilisierung gegen anti-IgG (gαh 60) und anti-IgE vor und sieben Tage nach Immunisierung und Methylprednisolon bei Pferd #1

Legende siehe oben

Ergebnisse 71

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

vorImmun.

nachImmun.

vorImmun.

nachImmun.

vorImmun.

nachImmun.

vorImmun.

nachImmun.

vorImmun.

nachImmun.

Cn Mq HF TcA TcB

% d

er M

axim

alfr

eise

tzun




0%

20%

40%

60%

80%

gah 60 a Ig E

% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g


Abbildung 4: „Generelle“ Sensibilisierung gegen anti-IgG (gαh 60) und anti-IgE vor und sieben

Tage nach Immunisierung und Methylprednisolon bei Pferd #2 Legende siehe oben

Ergebnisse 72

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

140%

vorImmun.

nachImmun.

vorImmun.

nachImmun.

vorImmun.

nachImmun.

vorImmun.

nachImmun.

vorImmun.

nachImmun.

Cn Mq HF TcA TcB

% d

er M

axim

alfr

eise

tzun




0%

20%

40%

60%

80%

100%

gah 60 a Ig E

% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g


Abbildung 6: „Generelle“ Sensibilisierung gegen anti-IgG (gαh 60) und anti-IgE vor und sieben

Tage nach Immunisierung und Methylprednisolon bei Pferd #12 Legende siehe oben Sieben Tage nach der Cortisonapplikation waren die Basophilen im Blut wieder deutlich

nachweisbar (27-39 ng Histamin/ml gewaschenes Vollblut). Ihre allergenspezifische und

generelle Sensibilisierung hatte sich im Vergleich zu den Ausgangswerten verändert. Die

Histaminfreisetzung durch anti-IgG (gαh) und anti-IgE war deutlich reduziert oder nicht mehr

messbar (Abbildung 2, Abbildung 4 und Abbildung 6). Bei allen zuvor gegen Allergene

sensibilisierten Pferden war die Sensibilität um mindestens ein bis zwei

Sensibilisierungsgrade zurückgegangen (3.4.3) oder nicht mehr vorhanden (Abbildung 3 und

Ergebnisse 73

Abbildung 5). Im Falle des TcB war sieben Tage nach Methylprednisolongabe bei vier von

sieben Pferden eine teilweise deutliche Sensibilisierung zu beobachten (zwei davon

dargestellt in Abbildung 3 und Abbildung 5). Auffällig dabei ist der inverse Verlauf der

Histaminfreisetzung, insbesondere in Abbildung 3: TcB setzte in niedrigeren Konzentrationen

mehr Histamin aus den Basophilen frei als in hohen. Dies zeigte sich bei vier von sieben

Pferden. Bei dem rekombinanten Protein TcA ließ sich dieses Phänomen bei zwei von sieben

Fällen finden (Abbildung 7). Zwei andere Pferde waren auf niedrigem Niveau positiv (1+).

Die anderen drei Pferde zeigten keinen Release auf TcA. Die Histaminfreisetzung auf dieses

Protein vor und nach Immunisierung und Cortison verhielt sich dosisabhängig, hohe

Proteinkonzentrationen lösten eine höhere Freisetzung aus als niedrigere.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

#27 #22 #12 #2

% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g

40 µg/ml 4 µg/ml 0,4 µg/ml 0,04 µg/ml

Abbildung 7: Sensibilisierung gegen das rekombinante Protein TcA sieben Tage nach

Immunisierung und Methylprednisolonbehandlung bei vier Pferden, #22, #27, #12 und #2

Es sind die Histaminfreisetzungsraten der basophilen Granulocyten zweier Pferde im FIT (3.4.3) bei Kontakt mit vier verschiedenen Konzentrationen des rekombinanten Parasitenproteins TcA (3.3.4) dargestellt. Die Konzentrationen im Reaktionsansatz betrugen 40, 4, 0,4 und 0,04 mg/ml. Die Histaminfreisetzungen sind in Prozent der physikalischen Freisetzung angegeben (3.4.3). Die eingezeichnete Linie markiert die Zehn-Prozent-Grenze, über der ein Releaseergebnis als positiv gilt (3.4.3). Die Pferde wurden sieben Tage zuvor mit TcA und TcB immunisiert und innerhalb der nächsten zwölf Stunden danach mit Methylprednisolon behandelt (4.1.1).

Zwei der behandelten Pferde (#18 und #20) reagierten sieben Tage p. med. weder auf TcA

noch auf TcB. #32, das kein Corticoid erhalten hatte, veränderte seine Sensibilisierungen

nicht, es blieb in seiner Reagibilität gegen beide rekombinante Proteine negativ.

Der teilweise deutliche Rückgang der generellen und allergenspezifischen Sensibilisierung

der Pferde, die gegen TcA jedoch teilweise und gegen TcB deutlich vorhanden war, deutete

Ergebnisse 74

trotz der kurzen Zeit zwischen einmaliger Immunisierungsinjektion und

Methylprednisolonapplikation (die kaum zu einer Steigerung oder gar Induktion TcA- oder

TcB-spezifischer Antikörper ausreichen sollte) auf eine erfolgreiche Modulation der

Basophilenpopulation hin.

Ob jedoch von einem Erfolg auch in Bezug auf die Induktion einer spezifischen

Sensibilisierung gegen die rekombinanten Proteine TcA und TcB als Folge der

Immunisierung zu sprechen ist, sollte anhand der Kontrolltiere überprüft werden, die keine

Immunisierung erfahren hatten. Dazu wurden Ende März 2003 zehn Kontrollpferde (3.4.1.1)

ebenfalls gegen anti-IgG (gαh), anti-IgE, die Allergene Cn, Mq und HF sowie die zwei

rekombinanten Proteine TcA und TcB im FIT getestet wie die immunisierten Tiere (im

Folgenden „TcA-/TcB-Pferde“ genannt).

Eine Sensibilisierung gegen die rekombinanten Proteine TcA und TcB war auch bei fünf der

zehn unbehandelten Kontrollpferde zu erkennen. Vier dieser fünf TcB-positiven Pferde

reagierten auf TcA, drei davon in der allergentypischen, dosisabhängigen Abstufung

(Abbildung 8). Der inverse Verlauf der Histaminfreisetzungsreaktion auf TcB trat bei allen

fünf positiven Pferden auf, auf TcA nur bei einem Tier (#6, Abbildung 9). Die übrigen fünf

der zehn Kontrollpferde waren sowohl auf TcA als auch auf TcB negativ.

Alle Kontrollpferde veränderten ihre allergenspezifischen Sensibilisierungen in dem

Zeitraum, in dem die TcA/TcB-Pferde immunisiert und mit Methylprednisolon behandelt

wurden, nicht.

Exemplarisch für die fünf TcB-positiven Kontrolltiere sind in Abbildung 8 und Abbildung 9

die Sensibilisierungen der Kontrollpferde # 10 und #6 (beide klinische Ekzemer) gegen die

Allergene Cn, Mq, HF sowie gegen TcA und TcB dargestellt. Da die fünf anderen

Kontrolltiere sich bis auf die fehlende Sensibilisierung gegen TcA und TcB nicht von den

dargestellten Pferden unterschieden, werden ihre Daten hier nicht abgebildet.

Zu den Abbildungen 8 und 9: Allergen- und antigenspezifische Sensibilisierungen zweier Kontrollpferde (#10, #6) im März 2003

Die Abbildungen zeigen die Sensibilisierungen der basophilen Granulocyten der nicht mit TcA und TcB (3.3.4) immunisierten Pferde #6 und #10 im FIT (3.4.3) ohne den Einfluss durch Immunisierung mit TcA und TcB und durch Methylprednisolon (3.3.5) in Prozent der physikalischen Freisetzung (Maximalfreisetzung). Dabei sind jedem Allergen (Cn, Mq, HF) bzw. Antigen (TcA, TcB) vier Verdünnungsstufen zugeordnet (von links nach rechts 50 µg/ml (bzw. 15 µg/ml Cn), 5 µg/ml, 0,5µg/ml und 0,05 µg/ml. TcA und TcB lagen in den Endkonzentrationen 40, 4, 0,4 und 0,04 µg/ml vor.) (3.4.3). Die eingezeichnete Linie markiert die Zehn-Prozent-Grenze, über der ein Releaseergebnis als positiv gilt. Beide Tiere sind Sommerekzemer.

Ergebnisse 75

0%

10%

20%

30%

40%

50%

Cn Mq HF TcA TcB

% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g50/15 µg/ml 5 µg/ml 0,5 µg/ml 0,05 µg/ml

Abbildung 8: Sensibilisierung des Kontrollpferdes #10 im März 2003

Legende siehe oben

0%

10%

20%

30%

40%

Cn Mq HF TcA TcB

% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g

50/15 µg/ml 5 µg/ml 0,5 µg/ml 0,05 µg/ml

Abbildung 9: Sensibilisierung des Kontrollpferdes #6 im März 2003

Legende siehe oben Die Induktion der Sensibilisierung gegen TcA und TcB bei den behandelten Pferden war also

nicht auf die Immunisierung zurückzuführen, sondern auf ein entsprechend bereits

vorhandenes Antikörperspektrum im Serum der TcA-/TcB-Pferde, das einen Besatz der

neugebildeten basophilen Granulocyten zugunsten der sensibilisierenden TcA- und TcB-

spezifischen Antikörpern ermöglichte. Dies zeigten die natürlichen Sensibilisierungen der

unbehandelten Kontrollpferde.

Dennoch war eine Reduktion der allergenspezifischen Sensibilisierung sieben Tage nach

Methylprednisolon vorhanden. Möglicherweise war der allergenspezifische Antikörpertiter zu

diesem Zeitpunkt (noch keine neuen allergieauslösenden Insekten, Stallhaltung) niedrig, so

dass eine ausreichende Resensibilisierung nicht oder nur in einigen Fällen stattfand.

Ergebnisse 76

Entsprechend der Ausgangsfragestellung zur Modulation der basophilen Granulocyten konnte

zu diesem Zeitpunkt von einer erfolgreichen Modulation bezüglich der

Allergensensibilisierung gesprochen werden.

4.2 Verlauf der allergen- und antigenspezifischen Sensibilisierung über einen längeren

Zeitraum

Um auch von einem dauerhaften Erfolg der Modulation der Sensibilisierung gegen Allergene

sprechen zu können, musste sich diese allergenspezifische Sensibilisierung der TcA-/TcB-

Pferde auch über einen längeren Zeitraum als nur sieben Tage p. med. auf einem reduzierten

Niveau bewegen. Die Reagibilität der Basophilen gegenüber TcA und TcB konnte darüber

Auskunft geben, ob die andauernde Reduktion auf eine „Ausverdünnung“, auf einen

geringeren Besatz der Basophilen mit allergenspezifischen Antikörpern bei anteilsmäßig

hohem TcA- und TcB-spezifischen Besatz zurückzuführen war. Um diese Fragen zu

beantworten, wurden die TcA-/TcB-Pferde und die Kontrolltiere über das Jahr 2003 hinweg

wiederholt auf die verwendeten Allergene und Antigene (Cn, Mq, Hf, TcA, TcB, 3.3.4) im

FIT (3.4.3) getestet. Die folgenden Abbildungen stellen jeweils zwei immunisierte (TcA-

/TcB-Pferde, #2 und #12) und zwei nicht immunisierte Kontrollpferde (#8 und #10), alle

Ekzemer, bezüglich eines exemplarischen Allergens (Cn) und der zwei rekombinanten

Proteine (TcA und TcB) im Verlauf des Jahres 2003 dar.

Zu den Abbildungen 10-18: Sensibilisierungsverlauf zweier TcA-/TcB-Pferde (#2, #12) sowie

zweier Kontrollpferde (#8, #10) gegen Cn, TcA und TcB im Laufe des Jahres 2003

Die Abbildungen zeigen den zeitlichen Verlauf der Reaktionsbereitschaft der basophilen Granulocyten von vier Ekzemern, zwei TcA/TcB-Pferden (#2, #12, 4.1.1) und zwei Kontrollpferden (#8, #10, 3.4.1.1), auf ein Allergen (Cn) (3.3.4) und die rekombinanten Parasitenantigene TcA und TcB (3.3.4) im FIT (3.4.3). Dabei ist die Menge des freigesetzten Histamins in Prozent zur physikalischen Freisetzung angegeben (maximale Freisetzung). Die eingezeichnete Linie markiert die Zehn-Prozent-Grenze, über der ein Releaseergebnis als positiv gilt (3.4.3.2). Die vier Endverdünnungstufen der Cn-Präparation betrugen 15, 5, 0,5 und 0,05 µg/ml, die vier von TcA 40, 4, 0,4 und 0,04 µg/ml, während TcB in den acht Zehnerstufen 40 bis 4x10-6 µg/ml verdünnt waren (die Legendenbezeichnung z. B. 4-1 entspricht 4x10-1, 4-2 4x10-2 etc.). Von Pferd #2 lagen nur Daten bis Oktober 2003 vor, da das Tier im November 2003 aus der Beobachtung ausschied. Die dargestellten Daten für März 2003 der TcA-/TcB-Pferde wurden sieben Tage nach der therapeutischen Gabe von Methylprednisolon erhoben.

Ergebnisse 77

4.2.1 Immunisierte Pferde

0%

20%

40%

60%

80%

100%

März 03 Juni 03 Juli 03 Okt. 03

% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g

Cn 15 µg/ml Cn 5 µg/mlCn 0,5 µg/ml Cn 0,05 µg/ml

Abbildung 10: Sensibilisierungsverlauf gegen Cn bei Pferd #2 im Jahr 2003 (TcA/TcB-Gruppe)

0%

10%

20%

30%

40%

März 03 Juli 03 Okt. 03

% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g

TcA 40 µg/ml TcA 4 µg/mlTcA 0,4 µg/ml TcA 0,04 µg/ml

Abbildung 11: Sensibilisierungsverlauf gegen TcA bei Pferd #2 im Jahr 2003 (TcA/TcB-Gruppe)

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

140%

März 03 Juni 03 Juli 03 Okt. 03

% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g

TcB 4 TcB 4-1 TcB 4-2 TcB 4-3 TcB 4-4

Abbildung 12: Sensibilisierungsverlauf gegen TcB bei Pferd #2 im Jahr 2003 (TcA/TcB-Gruppe)

Ergebnisse 78

0%

20%

40%

60%

80%

100%

März Juli Oktober Dezember

% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

gCn 15 µg/ml Cn 5 µg/mlCn 0,5 µg/ml Cn 0,05 µg/ml

Abbildung 13: Sensibilisierungsverlauf gegen Cn bei Pferd #12 im Jahr 2003 (TcA/TcB-Gruppe)

0%

10%

20%

30%

40%

50%


% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g

TcA 40 µg/ml TcA 4 µg/ml TcA 0,4 µg/ml TcA 0,04 µg/ml

Abbildung 14: Sensibilisierungsverlauf gegen TcA bei Pferd #12 im Jahr 2003 (TcA/TcB-

Gruppe)

0%

10%

20%

30%

40%


% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g

TcB 40 µg/ml TcB 4 µg/ml TcB 0,4 µg/ml TcB 0,04 µg/ml

Abbildung 15: Sensibilisierungsverlauf gegen TcB bei Pferd #12 im Jahr 2003 (TcA/TcB-

Gruppe)

Ergebnisse 79

4.2.2 Kontrollgruppe

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

140%

März 03 Juli 03 Okt. 03 Dez. 03

% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g


Abbildung 16: Sensibilisierungsverlauf gegen Cn bei Pferd #8 im Jahr 2003 (Kontrollgruppe)

0%

5%

10%

15%

20%


% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g


Abbildung 17: Sensibilisierungsverlauf gegen TcA bei Pferd #8 im Jahr 2003 (Kontrollgruppe)

0%

5%

10%

15%

20%


% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g

40 µg/ml 4 µg/ml TcB 4-1 TcB 4-2 TcB 4-3 TcB 4-4

Abbildung 18: Sensibilisierungsverlauf gegen TcB bei Pferd #8 im Jahr 2003 (Kontrollgruppe)

Ergebnisse 80

0%

20%

40%

60%

80%

100%

März 03 Juli 03 Okt. 03 Dez 03

% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

gCn 15 µg/ml Cn 5 µg/mlCn 0,5 µg/ml Cn 0,05 µg/ml

Abbildung 19: Sensibilisierungsverlauf gegen Cn bei Pferd #10 im Jahr 2003 (Kontrollgruppe)

0%

20%

40%

60%

80%


% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g

TcA 40 µg/ml TcA 4 µg/mlTcA 0,4 µg/ml TcA 0,04 µg/ml

Abbildung 20: Sensibilisierungsverlauf gegen TcA bei Pferd #10 im Jahr 2003 (Kontrollgruppe)

0%

10%

20%

30%

40%

50%


% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g

TcB 4 TcB 4-1 TcB 4-2 TcB 4-3 TcB 4-4 TcB 4-5 TcB 4-6

Abbildung 21: Sensibilisierungsverlauf gegen TcB bei Pferd #10 im Jahr 2003 (Kontrollgruppe)

Ergebnisse 81

Anhand dieser Daten ist ersichtlich, dass die Reduktion der allergenspezifischen

Sensibilisierung gegen Cn nicht dauerhaft war, sondern spätestens im Juni bzw. Juli 2003

wieder stark ausgeprägt war. Alle Pferde zeigten zum Sommer hin einen deutlichen Anstieg

in der Reagibilität gegen Cn, möglicherweise eine Folge der vermehrten Exposition der Tiere

gegenüber den allergieauslösenden Insekten (hier Culicoides). Zum Oktober hin war bei den

meisten Ekzemern bzw. FIT-positiven, aber klinisch negativen Pferden, unabhängig von einer

zuvor erfolgten Immunisierung, ein Rückgang in der allergenspezifischen Sensibilisierung zu

beobachten. GEIBEN (2003) und KOBELT (2001) vermuteten dazu, dass über den Sommer

hinweg auch eine vermehrte helminthenspezifische Antikörperproduktion erfolgt, da durch

die Sommersaison der Helmintheninfektionsdruck steigt. Diese Antikörper könnten zu einer

Ausverdünnung der allergenspezifischen Antikörper auf den Basophilen und so zu einem

Rückgang der Sensibilisierung geführt haben (4.7).

Die Sensibilisierung gegen TcA und TcB blieb jedoch ebenfalls nicht erhalten, sondern

verschwand im Laufe des Sommers bei den Pferden. Von den neun im März 2003

sensibilisierten Pferden (vier TcA-/TcB-Pferde, fünf Kontrollpferde) waren im Juli nur noch

vier positiv (z. B.

Abbildung 12 und Abbildung 21). Möglich ist auch hier eine Verdrängung oder

Ausverdünnung durch allergenspezifische Antikörper, im Herbst auch durch vielfältige

andere parasitenspezifische Antikörper (4.6.2). In einigen Fällen ist eine Rückkehr der

Sensibilisierung gegen TcA und TcB zum Winter hin festzustellen (Abbildung 14, Abbildung

18 und Abbildung 21).

Warum sowohl z. B. bei dem im März 2003 immunisierten TcA-/TcB-Pferd #12 (Abbildung

14) als auch bei nicht immunisierten Kontrollpferden (z. B. #8, Abbildung 18, #10, Abbildung

21) im Dezember 2003 ein deutlicher Wiederanstieg der Sensibilisierung gegen TcA und TcB

zu sehen war, bliebe zu untersuchen. Möglicherweise könnte die individuelle

Auseinandersetzung der Pferde mit Helminthen über den Sommer und Herbst eine Rolle

spielen.

4.3 Zur Entwicklung der Nematodenbelastung

Um die Frage zu klären, ob ein Zusammenhang zwischen der individuellen

Helminthenbelastung und dem Reaktionsstatus gegen die Allergene und die rekombinanten

Proteine bestand, wurde der Verlauf der Verwurmung jedes Pferdes anhand der

Eiausscheidung über einen längeren Zeitraum beobachtet (3.4.8). Tabelle 8 und Tabelle 9

Ergebnisse 82

stellen die Eiausscheidung jedes Pferdes von Juli 2003 bis Mai 2004 dar. Es stand kein

anderes Readout-System für die Nematodeninfektionen der Tiere zur Verfügung.

Untersuchungen anderer Gruppen waren mit diesem System in den hier bearbeiteten

Fragestellungen bereits erfolgreich (siehe auch 2.4 - 2.7).

Zu Tabelle 8 und 9: Entwicklung der Ausscheidung von Strongylideneiern bei den einzelnen Pferden im Untersuchungszeitraum Juli 2003 bis Mai 2004 In dieser Tabelle ist die Entwicklung der Eiausscheidung für jedes der sieben- bzw. vierundzwanzig Versuchspferde abzulesen. Dabei ist die rechnerische Anzahl der zum Untersuchungszeitpunkt ausgezählten Magen-Darm-Strongylideneier pro Gramm Kot angegeben (3.4.8). Ist zu einem Zeitpunkt kein Eintrag vorhanden, lag keine Probe vor. Anthelminthische Behandlungen erfolgten nach Probennahme im Juli 2003 (mit Pyrantel) und im Januar 2004 (mit Moxidectin und Praziquantel) (3.3.5). Anhand der Eizahlen wurden die Pferde grob in zwei Gruppen eingeteilt, in „stark verwurmt“ und „schwach verwurmt“. Die Spalte „TcA-/TcB-immunisiert“ bezeichnet die Pferde, die mit den rekombinanten Proteinen immunisiert wurden (4.1.1). In der Spalte „Ekzemer“ sind die Tiere, die klinische Symptome des Sommerekzems zeigen (3.1.1), mit „ja“ bezeichnet, während die klinisch gesunden unabhängig von ihrem Sensibilisierungsstatus (3.4.3) mit „nein“ gekennzeichnet sind.

Ergebnisse 83

Entwicklung der Eiausscheidung bei Pferden mit geringer und hoher Ausscheidungsrate

im Versuchszeitraum

Schwach belastete Pferde

Pferd Nr.: Ekzemer TcA/TcB-

immunisiert Jul 03 Okt 03 Dez 03 Jan 04 Feb 04 Mai 04 #1 ja TcA/TcB 0 0 0 0 0 0 #2 ja TcA/TcB 0 0,5 #6 ja 1,5 0,5 2,5 1,5 0 0 #7 ja 0 0 0 0 0 #8 ja 0 0,5 1 0,5 0 0

#12 ja TcA/TcB 0 1 2,5 1 0 0 #19 nein 0 #20 nein TcA/TcB 0 0,5 1,5 0 0 #22 nein TcA/TcB 0 0 0,5 0 0 0 #23 nein 0 0,5 0 0 0 #24 nein 0 2 0 0,5 0 0 #25 nein 0 0 1 0 0 0 #27 nein TcA/TcB 0,5 0 0 0,5 0,5 0 #30 nein 0 0,5 2,5 0 0

Tabelle 8: Entwicklung der Eiausscheidung bei Pferden mit geringer Ausscheidungsrate im

Versuchszeitraum

Stark belastete Pferde

Pferd Nr.: Ekzemer TcA/TcB-

immunisiert Jul 03 Okt 03 Dez 03 Jan 04 Feb 04 Mai 04 #4 ja 8,5 14 8,5 0 0 #9 ja 21,5 22,5 23,5 0 0

#10 ja 17 3,5 10,5 7 0 0 #11 ja 20 8,5 12 14 0 0 #16 nein 7,5 1 6,5 4 0 0 #18 nein TcA/TcB 6,5 1,5 17,5 1 0 0 #21 nein 0 21,5 47,5 0 0 #28 nein 5 0,5 7 35,5 0 0 #29 nein 2,5 2 8 32,5 0 0 #31 nein 3 8 0 0 0 #32 nein TcA/TcB 4 1 17 42 0,5 0 #33 nein 14,5

Tabelle 9: Entwicklung der Eiausscheidung bei Pferden mit hoher Ausscheidungsrate im Versuchszeitraum

Ergebnisse 84

Ein direkter Zusammenhang zwischen der allergischen Erkrankung und der individuellen

Verwurmung ist aus den Daten der siebenundzwanzig- bzw. vierundzwanzigköpfigen Herde

in Tabelle 8 und Tabelle 9 nicht ersichtlich. Von vierzehn schwach verwurmten Pferden

waren sechs Ekzemer (Tabelle 8). Bei elf stärker belasteten Pferden gab es vier Ekzemer

(Tabelle 9). Pferd #33 sollte aufgrund seines geringen Alters (geboren Juni 2003) noch keine

Symptome des Sommerekzems zeigen (2.2) und somit noch nicht als klinischer Ekzemer oder

Nichtekzemer klassifiziert werden.

Die mit TcA und TcB immunisierten Pferde gehörten mit Ausnahme der #18 und #32 im

dargestellten Beobachtungszeitraum zur Gruppe der Geringbelasteten, zwei davon (#1 und

#12) hatten zuvor (außerhalb des hier dargestellten Zeitraumes) höhere Wurmbürden gehabt.

#18 hatte innerhalb der kürzesten Zeit heftig auf die rekombinanten Parasitenproteine TcA

und TcB (3.3.4) reagiert, #32 überhaupt nicht. Dieses Pferd erhielt auch kein Cortison (4.1.1).

Es ist denkbar, dass die Immunisierung einen Einfluss auf den Eiausscheidungsgrad hatte, da

die immunisierten Pferde deutlich weniger von einer schwereren Wurmlast betroffen waren

(Tabelle 8 und Tabelle 9). Bei den Kontrollpferden ließ sich aber kein Zusammenhang

zwischen einer Sensibilisierung im FIT gegen TcA oder TcB mit dem „Verwurmungsgrad“ in

Beziehung setzen. Auch stand die Rückkehr der Sensibilisierung nicht mit der individuellen

Nematodenlast in Beziehung (z. B. Abbildung 14, Abbildung 18, Abbildung 21, Tabelle 8

und Tabelle 9).

Das Ausschleichen der allergenspezifischen Antwort im Herbst und die Rückkehr der TcA-

und TcB-spezifischen Sensibilisierung im Winter legen jedoch den Schluss nahe, dass ein

steigender Infektionsdruck und ggf. eine steigende Verwurmung einen Anstieg der

helminthenspezifischen Antikörper induziert (4.6).

Die zum Winter hin deutlich ansteigende Eiausscheidungsrate der Pferde (Tabelle 8 und

Tabelle 9) ermöglichte einen erneuten Ansatz zur Modulation der spezifischen

Sensibilisierung der basophilen Granulocyten der Pferde.

Ergebnisse 85

4.4 Modulation der Sensibilisierung basophiler Granulocyten durch anthelminthische

Behandlung

Bei einer geeigneten anthelminthischen Behandlung werden Helminthen abgetötet und ihre

Antigene durch Verdauungs- und Zersetzungsprozesse freigesetzt. Dabei sollte umso mehr

Antigen frei werden, je mehr Parasiten sich im Wirt befanden. Das Immunsystem wird durch

den vermehrten Anfall an Antigenen zu einer Reaktion veranlasst, möglicherweise auch zu

einem Anstieg der spezifischen Antikörpertiter. Dieser Effekt sollte ausgenutzt werden, um

statt einer spezifischen Anhebung des TcA-/TcB-Antikörpertiters den gesamten

helminthenspezifischen Titer (und damit auch den gegen die rekombinanten Proteine) zu

boostern. Das Verhältnis zwischen den allergen- und den helminthenspezifischen

Immunglobulinen im Winter könnte eine ähnliche Modulation der Basophilen bewirken, wie

sie schon unter 4.1.2.2 festzustellen war – ein Absinken der allergenspezifischen Sensibilität

bei erhaltener TcA- bzw. TcB-Sensibilisierung.

Aber es gibt auch immer wieder Berichte von Pferdebesitzern, deren Tiere kurz nach einer

Entwurmung Allergien entwickelten oder eine Verschlimmerung der Symptomatik zeigten.

Dies könnte zusätzlich auf einen immunmodulatorischen Einfluss der anthelminthischen

Therapie auf die equinen basophilen Granulocyten hinweisen.

Daher stellten sich bezüglich der Modulation der Basophilen durch parasitäre Antigene die

Fragen, welchen Einfluss eine Entwurmung teilweise stark verwurmter Tiere auf die

Sensibilisierungen der Basophilen hat und ob man die Induktion starker anthelminthischer

Reaktionen des Organismus zu einer Beeinflussung der Basophilensensibilisierung nutzen

kann (3.4.1.2).

Um eine möglichst hohe und starke Antigenanflutung zu induzieren, wurden alle

vierundzwanzig Pferde mit hoher und niedriger Eiausscheidungsrate (Tabelle 8 und Tabelle 9)

gleichzeitig mit einem gegen ein breites Helminthenspektrum hochwirksamen

Anthelmintikum (Moxidectin (Equest® Gel), Praziquantel (Droncit® orales Gel), 3.3.5) oral

behandelt. Zudem wurde als Behandlungszeitpunkt der Monat Januar gewählt, in dem der

letzte Kontakt zu den meisten sensibilisierungsinduzierenden bzw. allergieauslösenden

Insekten bereits drei Monate und länger zurück lag, der gegen sie gerichtete Antikörpertiter

der freien Immunglobuline also möglicherweise einen Jahrestiefsstand erreicht hatte

(insbesondere für das kurzlebige IgE). Dazu wurde bei allen Pferden vor der

anthelminthischen Therapie ein Status der aktuellen Sensibilisierung im FIT (3.4.3) erhoben,

und es wurden die gleichen Allergene und Antigene wie in den Testansätzen zuvor (4.1, 4.2)

Ergebnisse 86

getestet: zur Prüfung der generellen Sensibilisierung die Antikörper anti-eqIgG (gαh) und

anti-IgE, zu der der spezifischen Sensibilisierung die Allergene Cn, Mq und HF und die

beiden rekombinanten Parasitenproteine TcA und TcB (3.3.4). Um eine mögliche Reaktion

der Pferde bezüglich der Basophilenzahl oder Histamingehalt erfassen zu können, wurde das

Verhalten des Gesamthistamins 6, 12, 24, 36, 48 h und danach im 24 h-Abstand nach

Entwurmung durch Blutentnahme und Bestimmung der physikalischen Freisetzungsmenge

bestimmt (3.4.3). Nach sieben Tagen sowie nach drei Wochen wurde ein erneuter

Sensibilisierungstest (FIT, 3.4.3) durchgeführt, um mögliche Veränderungen im

Reaktionsverhalten der Basophilen zu erheben.

4.4.1 Zellulärer Histamingehalt im Blut von Pferden vor und in den ersten drei

Wochen nach anthelminthischer Behandlung

Um einen direkten Einfluss der anthelminthischen Behandlung auf die Basophilen zu

untersuchen, wurde der Gesamthistamingehalt der Basophilenpopulation über drei Wochen

verfolgt. Exemplarisch für alle Pferde im Versuch sind in Abbildung 22 drei Pferde mit

unterschiedlich hohen Eiausscheidungszahlen (4.3) dargestellt.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

0 h 6 h 12 h 24 h 36 h 48 h 7 d 21 d

ng H

ista

min

/ml

#1 #7 #9

Abbildung 22: Änderungen im zellulären Histamingehalt des Blutes vor und 6-48 h, 7 d und 21 d

nach Moxidectin und Praziquantel

Diese Grafik verdeutlicht den Verlauf des Histamingehaltes der Basophilen dreier Pferde in ng/ml Blut, bestimmt durch physikalische Freisetzung (3.4.3.1), vor sowie über einen Zeitraum von 6–48 h, 7 d und 21 d nach anthelminthischer Behandlung mit Moxidectin und Praziquantel (3.3.5). #1 und #7 schieden 2003 nur wenige Nematodeneier aus, #9 galt als stark verwurmt (4.3).

Innerhalb der ersten 48 h war bei keinem der Pferde eine signifikante Veränderung des

Ergebnisse 87

Gesamthistamingehaltes festzustellen (Abbildung 22). In den folgenden fünf Tagen konnte

(bis sieben Tage nach Entwurmung) bei neun von 23 Pferden ein Anstieg des

Histamingehaltes in den physikalischen Freisetzungen beobachtet werden. Dabei handelte es

sich bei drei Tieren um schwach verwurmte Pferde (von zwölf) und bei sechs um stark

belastete Tiere (von elf, #33 ging aufgrund seines geringen Alters zur Schonung nicht in die

Reihenuntersuchung mit ein) (4.3).

Die Histaminkinetiken innerhalb der drei Wochen unterschieden sich je nach Ausgangsstatus

der Pferde (Abbildung 23).

0

20

40

60

80

100

120

stark verw. Ekzemer stark verw.Nichtekz.

schwach verw.Ekzemer

schwach verw.Nichtekz.

His

tam

in in

ng/

ml

prae Wk post Wk

Abbildung 23: Veränderung des Gesamthistamingehaltes der Basophilenpopulation vor und

drei Wochen nach anthelminthischer Behandlung mit Moxidectin und Praziquantel.

Dargestellt sind die Mittelwerte der physikalischen Histaminfreisetzungen (3.4.3) in ng/ml Blut aller mit Moxidectin und Praziquantel (3.3.5) entwurmten Pferde (n=24) in Gruppen nach hoher oder niedriger Eiausscheidung (4.3) und nach allergischer Erkrankung (3.1) geordnet. Die linke Säule bezeichnet den Wert und seine Standardabweichung vor der Entwurmung, die rechte den drei Wochen nachher. Es bedeuten: verw.: verwurmt; Nichtekz.: Nichtekzemer, Wk: Wurmkur. Die Gruppengröße betrug bei den stark verwurmten Ekzemern n=4, bei den stark verwurmten Nichtekzemern n=7, die schwach verwurmten Ekzemer n=5 und die schwach verwurmten Nichtekzemer n=7. Eine Signifikanz konnte nicht festgestellt werden.

Vor der Entwurmung (schwarze Säule in Abbildung 23) unterschieden sich allein die stark

verwurmten Pferde mit klinischem Sommerekzem (n=4) mit durchschnittlich 70 ng Histamin

/ml gewaschenem Vollblut (3.4.3) deutlich von allen anderen Pferden mit 30 ng/ml ± 9 ng.

Drei Wochen nach der anthelminthischen Behandlung (graue Säulen in Abbildung 23) konnte

bei einem Teil der Tiere (stark verwurmte Tiere und schwach verwurmte Ekzemer) ein

Rückgang in der maximalen Histaminfreisetzung gegenüber den Ausgangswerten beobachtet

werden. Die Basophilen der schwach verwurmten Ekzemer enthielten nur noch 18,2 ng/ml

Ergebnisse 88

Blut ± 4,8 ng Histamin, die der schwach verwurmten Nichtekzemer 27,6 ± 9 ng, sie zeigten

also im Gegensatz zu den anderen Pferden zumeist keinen Rückgang. Die stärker belasteten

Isländer erschienen stark schwankend, sanken aber insgesamt auch deutlich ab. Nur drei (alle

Nichtallergiker) zeigten keinen Einbruch. Ihr Mittelwert lag bei 32 ng/ml, allerdings bei einer

Standardabweichung von 18 ng (inkl. der drei im Histaminwert nicht abgesunkenen Tiere,

exkl. 20,6 ng ± 4,5 ng).

Es konnte innerhalb der ersten zwei Tage keine Veränderung des Gesamthistaminspiegels

nachgewiesen werden, die Hinweise z. B. auf eine Aktivierung der Basophilen durch

freigesetztes und durch oberflächenständige Antikörper gebundenes parasitäres Antigen

ergeben hätte. Der Anstieg bei neun von 23 Pferden (Abbildung 22, #9) in den ersten sieben

Tagen deutet auf eine funktionelle Neusynthese von Histamin hin. Das Absinken des

Gesamthistaminspiegels bis drei Wochen p. med. (Abbildung 22 und Abbildung 23) weist auf

einen Rückgang der Helminthenbelastung und auf eine Reduktion der Basophilen auf ein

ausreichendes Abwehrniveau hin. Ein Zusammenhang mit dem allergischen Status (Ekzemer

oder Nichtekzemer) konnte nicht nachgewiesen werden.

4.4.2 Einfluss anthelminthischer Behandlung auf die funktionellen Sensibilisierungen

basophiler Granulocyten

Um zu prüfen, welchen Einfluss eine anthelminthische Behandlung auf die funktionelle

Sensibilisierung hat, wurde der Reaktionsstatus der Basophilen gegen die eingesetzten

Allergene, Antigene und Antikörper (3.3.4) im FIT (3.4.3) vor, sieben Tage und 21 Tage nach

der Entwurmung erfasst.

Alle Pferde wurden gleichzeitig entwurmt. Eine Negativkontrolle in Form einer nicht

behandelten Kontrollgruppe entfiel einerseits aus weidehygienischen Gründen und

andererseits wegen ausreichenden, zuvor in anderen Versuchen (z. B. GEIBEN, 2003)

erhobenen Verlaufsuntersuchungen, aus denen die Konstanz der FIT-Ergebnisse bekannt war.

Sieben Tage nach der Behandlung fiel eine deutliche Reduktion der

Histaminfreisetzungsraten gegenüber allen eingesetzten Antikörper-, Allergen- und

Antigenpräparationen bei fast allen Pferden auf.

In den folgenden Abbildungen sind die Ergebnisse der generellen Sensibilisierung (3.4.3) vor

der Entwurmung für jedes Tier auf 100% normiert und mit den Ergebnissen sieben Tage nach

der anthelminthischen Therapie verglichen (Abbildung 24 und Abbildung 25).

Ergebnisse 89

0%

20%

40%

60%

80%

Ekzemer, starkverwurmt

Nicht-Ekzemer,stark verwurmt

Ekzemer, schwachverwurmt

Nicht-Ekzemer,schwach

verwurmt

% d

es A

usga

ngsw

erte

s gah

60

*****

Abbildung 24: Abfall der gαh 60-vermittelten Histaminfreisetzung sieben Tage nach

Entwurmung Die Grafik stellt die Mittelwerte der Freisetzungen auf gαh 60 (3.4.3.1) der vier Gruppen stark verwurmte Ekzemer, stark verwurmte Nichtekzemer, schwach verwurmte Ekzemer und schwach verwurmte Nichtekzemer (4.3) in Prozent des individuellen Ausgangswertes vor der anthelminthischen Behandlung dar. Die Standardabweichung ist entsprechend angegeben, die Sternchen geben die Signifikanz an (* p< 0.05, ** p< 0.01, One-way-ANOVA, 3.3.7). Die Gruppengröße betrug bei den stark verwurmten Ekzemern n=4, bei den stark verwurmten Nichtekzemern n=7, die schwach verwurmten Ekzemer n=5 und die schwach verwurmten Nichtekzemer n=7.

0%

20%

40%

60%

80%

Ekzemer, starkverwurmt

Nicht-Ekzemer,stark verwurmt

Ekzemer, schwachverwurmt

Nicht-Ekzemer,schwach verwurmt

% d

es A

usga

ngsw

erte

s ant

i-IgE **

******

Abbildung 25: Abfall der anti-IgE-vermittelten Histaminfreisetzung sieben Tage nach

Entwurmung Die Grafik stellt die Mittelwerte der Freisetzungen auf anti-IgE (3.4.3.1) der vier Gruppen stark verwurmte Ekzemer, stark verwurmte Nichtekzemer, schwach verwurmte Ekzemer und schwach verwurmte Nichtekzemer (4.3) in Prozent des individuellen Ausgangswertes vor der anthelminthischen Behandlung dar. Die Standardabweichung ist entsprechend angegeben, die Sternchen geben die Signifikanz an (** p< 0,01, *** p< 0,001, One-way-ANOVA, 3.3.7). Die Gruppengröße betrug bei den stark verwurmten Ekzemern n=4, bei den stark verwurmten Nichtekzemern n=7, die schwach verwurmten Ekzemer n=5 und die schwach verwurmten Nichtekzemer n=7.

Ergebnisse 90

Diese vier Gruppen können anhand ihrer individuellen Reaktion auf gαh 60 und anti-IgE

unterschieden werden. Stark helminthenbelastete Ekzemer reagierten sowohl mit einem

deutlich verminderten anti-IgE- als auch gαh 60-Release, verwurmte Nichtekzemer mit einem

ähnlichen Einbruch in der anti-IgE-, aber mit einem deutlich geringeren in der gαh 60-

Freisetzung. Schwach verwurmte Ekzemer waren in der nur wenig zurückgehenden Reaktion

auf gαh 60 nicht von den wenig belasteten Nichtekzemern zu unterscheiden, waren aber dafür

in der Antwort auf anti-IgE gegenüber den Nichtekzemern signifikant reduziert.

Insgesamt ist die Reduktion der generellen IgE-spezifischen Sensibilisierung sieben Tage

nach Entwurmung deutlicher ausgeprägt als die generelle IgG-spezifísche Sensibilisierung.

Die statistische Auswertung (one-way-ANOVA, 3.3.7) ergab signifikante bis

höchstsignifikante Unterschiede zwischen den Gruppen für gαh 60 und anti-IgE (Abbildung

24 und Abbildung 25).

21 Tage nach der Entwurmung hatte die generelle Sensibilisierung gegen gαh 60 (anti-IgG)

und anti-IgE wieder ihre Ausgangswerte erreicht.

Die funktionellen Reagibilitäten gegen die Allergene (Cn, Mq, HF) und gegen TcA und TcB

verschwanden teilweise vollkommen oder waren nach der Entwurmung stark reduziert.

Exemplarisch für den Verlauf der Sensibilisierungsgrade gegen die eingesetzten Allergene

Cn, Mq und HF vor und nach anthelminthischer Behandlung für zwölf der fünfzehn Pferde

der Gruppen II und III (3.4.1.2) ist in Abbildung 26 die Reaktion eines Pferdes, #12 (Gruppe

II, 3.4.1.2), veranschaulicht.

0

1

2

3

4

vor Wk 7 d post Wk 3 Wo post Wk 3 Mo post Wk 6 Mo post Wk

Sens

ibili

sier

ungs

grad

Cn Mq HF

Abbildung 26: Verlauf der allergenspezifischen Sensibilisierung vor und nach Entwurmung bei Pferd #12 (Ekzemer)

In dieser Abbildung ist der Cn-, Mq- und HF-vermittelte Histaminrelease (3.4.3.1) des Pferdes #12

Ergebnisse 91

(Gruppe II, 3.4.1.2) in Sensibilisierungsgraden (3.4.3.2) vor, sieben Tage, drei Wochen sowie drei und sechs Monate nach einmaliger anthelminthischer Behandlung (3.4.5) mit Moxidectin und Praziquantel (3.3.5) aufgezeigt.

Die spezifischen (Cn, Mq, HF, TcA, TcB) Sensibilisierungen der Gruppen II und III (3.4.1.2)

waren in einigen Fällen noch drei Wochen nach der Wurmkur reduziert (Abbildung 26, Cn),

hatten sich aber bis zum nächsten Status drei Monate nach der Entwurmung wieder auf dem

Ausgangsniveau eingependelt.

In wenigen Fällen blieb die Reaktion unverändert (und dann auf nur eine

Allergenpräparation). Bei nur drei Tieren stieg die allergen- und antigenbegründete

Freisetzung um bis zu zwei Stufen an. Hierbei handelte es sich einerseits um Pferd #33, das

mit sieben Monaten jüngste Tier. Seine gαh- und anti-IgE-Antwort war unverändert. Die

Sensibilisierungsgrade gingen jedoch bis zum nächsten Status zwei Wochen später wieder auf

die Ausgangswerte zurück (Abbildung 27).

Zu den Abbildungen 27-29: Induktion bzw. Verstärkung einer funktionellen Sensibilisierung

gegen Cn, HF oder Mq bei drei Pferden nach anthelminthischer Behandlung

Die Abbildungen zeigen die Veränderungen in den allergenspezifischen (gegen Cn, Mq oder HF) (3.3.4) Sensibilisierungen (3.4.3) bei drei Pferden, #33, #22 und #27, vor und im Laufe von drei Monaten nach anthelminthischer Behandlung (3.4.5). Dargestellt ist jeweils der Sensibilisierungsgrad der basophilen Granulocyten (3.4.3). Bei den Tieren #22 und #27 handelte es sich um Pferde mit geringer Eiausscheidung und ohne allergische Symptome, #33 schied eine hohe Zahl an Strongylideneiern aus (4.3) und war mit sieben Monaten das jüngste Tier.

0

1

2

3

4

vor Wk 7 d post Wk 3 Wo post Wk 3 Mo post Wk

Sens

ibili

sier

ungs

grad

Cn Mq HF

Abbildung 27: Verstärkung von funktionellen Sensibilisierungen gegen Cn und HF bei Pferd #33 nach anthelminthischer Behandlung

Ergebnisse 92

Bei dem Tier, das seine induzierte Sensibilisierung auch nach drei Monaten nicht verloren

hatte, handelte es sich um Pferd #22. #22 blieb auf Cn und HF 2+ positiv (Abbildung 28),

zeigte aber einen deutlichen Einbruch der Reagibiliät gegen anti-IgE.

0

1

2

3


Sens

ibili

sier

ungs

grad

Cn HF und Mq

Abbildung 28: Induktion bzw. Verstärkung einer funktionellen Sensibilisierung gegen Cn, HF und Mq bei Pferd #22 nach anthelminthischer Behandlung

#27 erhöhte die Reagibilität gegen Cn von 1+ auf 4+ und von Mq und HF jeweils von null auf

1+ (Abbildung 29). Eine Veränderung der Antwort auf anti-IgE oder gαh 60 fand nicht statt.

Drei Monate nach der Behandlung war die vermehrte Sensibilisierung verschwunden und auf

das ursprüngliche Niveau zurückgegangen.

0

1

2

3

4


Sens

ibili

sier

ungs

grad

Cn Mq und HF

Abbildung 29: Induktion bzw. Verstärkung einer funktionellen Sensibilisierung gegen Cn, Mq

und HF bei Pferd #27 nach anthelminthischer Behandlung

Ergebnisse 93

Die Hemmung der Aktivierbarkeit der basophilen Granulocyten sieben Tage nach

Entwurmung bezog sich auch auf die TcA- und TcB- vermittelten Freisetzungen (z. B.

Abbildung 35) und folgte damit der Kinetik der allergenspezifischen und generellen

Sensibilisierung (z. B. Abbildung 26). Drei Wochen nach anthelminthischer Therapie zeigten

mit Ausnahme von sechs Pferden alle Tiere eine wiederkehrende oder neu induzierte

Sensibilisierung gegen TcA oder TcB (bis 2+ positiv, 3.4.3) (ähnlich wie in Abbildung 29 und

Abbildung 35). Dabei konnten eine TcA- und eine TcB-Sensibilisierung sowohl allein als

auch zusammen auftreten. Das inverse TcB-Phänomen, das unter 4.1 beobachtet werden

konnte (geringere TcB-Konzentrationen setzten im FIT höhere Histaminmengen frei als

stärker konzentrierte Antigenpräparationen), trat nicht mehr auf, die Histaminfreisetzung

verhielt sich dosisabhängig. Die Langzeitbeobachtung ergab, dass sechs Monate nach der

Wurmkur (Juli 2004) nur noch die Hälfte aller Pferde (sechs von zwölf untersuchten Tieren)

positiv auf TcA und TcB reagierte (jeweils 1+, nur ein Tier TcB 2+). Dabei erwiesen sich nun

durchgehend diejenigen als TcA-positiv, die auch TcB-positiv waren.

Die erhobenen Daten dieses Kapitels weisen auf eine funktionelle Hemmung der basophilen

Granulocyten eine Woche nach der Entwurmung hin. Der Nachweis des Gesamthistamins

(4.1.1) beweist, dass zu jedem Zeitpunkt ab sechs Stunden bis sieben Tage nach Entwurmung

Basophile vorhanden waren. Ihre herabgesetzte Reagibilität auf alle eingesetzten

Freisetzungsstimulantien aber zeigt die verminderte Fähigkeit der Basophilen, auf Antikörper

(anti-IgG (gαh), anti-IgE), Antigene (TcA, TcB) oder Allergene (Cn, Mq, HF) (3.3.4) zu

reagieren.

Es konnte also gezeigt werden, dass eine anthelminthische Behandlung zu einer Modulation

der generellen und der spezifischen Sensibilisierung beitragen kann. Diese Modulation ist

aber nicht von Dauer, sondern erlischt meistens innerhalb von drei Wochen (Abbildung 26).

In einigen, wenigen Fällen bleibt die Veränderung der Sensibilisierung bestehen und kann so

zu einer Entstehung (Abbildung 28 und Abbildung 29) als auch zu einem Verschwinden

(Abbildung 27) einer spezifischen funktionellen Sensibilisierung gegen bestimmte Antigene

führen. Der Anstieg im Gesamthistamin bei einem Drittel der Pferde (Abbildung 22) könnte

ein Hinweis auf einen erhöhten Umsatz und damit auf eine Neurekrutierung von basophilen

Granulocyten sein.

Das die beobachteten Effekte nicht auf eine direkte Medikamentenwirkung zurückzuführen

sind, lässt sich dadurch belegen, dass nicht alle Pferde trotz der gleichen Dosis gleich reagiert

Ergebnisse 94

haben, sondern eine deutliche Abhängigkeit von dem vorhergehenden Verwurmungsgrad

bestand (Abbildung 24 und Abbildung 25).

Ob die Induktion der Sensibilität gegen TcA und TcB auf eine erhöhte Antikörperbildung

gegen freigesetzte kreuzreaktive Proteine aus den bekämpften Helminthen zurückzuführen

sein könnte, muss noch untersucht werden (4.6). Das nicht mehr auftretende inverse Verhalten

der Histaminfreisetzung auf TcB könnte mit einem anteilsmäßig verschobenen

Antikörperbesatz der Basophilen gegen TcB oder mit einem anders gearteten

Rezeptorexpression begründet werden.

4.4.3 Einfluss anthelminthischer Behandlung auf die funktionellen Sensibilisierungen

basophiler Granulocyten bei einem schwach belasteten Pferd ohne hohen

Infektionsdruck

Im Versuch der Modulation der Basophilenreaktion durch anthelminthische Behandlung

(4.4.1, 4.4.2) konnte nicht erfasst werden, wann die Hemmung der Basophilen einsetzt, da

relativ große Untersuchungsabstände gewählt wurden (sieben und 21 Tage).

Zur näheren Bestimmung des genauen Zeitpunktes der Reduktion der generellen Reagibilität

gegen anti-IgG (gαh) und anti-IgE nach Behandlung mit Moxidectin und Praziquantel wurde

ein weiteres Pferd (3.1.2) untersucht. Ein Privatpferd (englisches Vollblut, 3.1.2), das nicht

mit den Versuchspferden zusammen gehalten wurde, sondern in einem Boxenstall mit

Weidegang in einer Herde, wurde mit den gleichen Anthelmintika (3.3.5) wie die Islandpferde

(4.4) behandelt und über sieben Tage hinweg täglich im FIT untersucht. Dabei wurden nur die

physikalische und die antikörpervermittelten Freisetzungen (anti-IgG (gαh) und anti-IgE)

bestimmt.

Ergebnisse 95

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

d0 d1 d2 d3 d4 d5 d6

% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g

gah 60 anti-IgE

Abbildung 30: Anti-IgE- und gαh 60-vermittelte Freisetzungen nach Entwurmung eines Pferdes

mit niedrigem Infektionsdruck und geringer Eiausscheidung Gezeigt ist der Verlauf der Reagibilität der Basophilen eines Kontrollpferdes (3.1.2) über sieben Tage hinweg. Das Pferd wurde wie die Isländer mit Moxidectin und Praziquantel behandelt. Im 24h-Abstand wurden Blutproben entnommen und im FIT (3.4.3) die Basophilen auf ihre generelle Sensibilisierung gegen anti-IgE und anti-IgG (gαh 60) getestet. Die Freisetzungsraten sind in Prozent der physikalischen Freisetzung angegeben.

Ganz im Gegensatz zu den unter hohem Infektionsdruck stehenden Isländern (hoher

Tierbesatz einer Standweide) zeigte dieses Tier weder eine Veränderung der anti-IgE- noch

der gαh-vermittelten Freisetzungen über den gesamten Untersuchungszeitraum, sondern blieb

in allen Werten, auch im Gesamthistamin, konstant (Abbildung 30). Die leichten

Schwankungen der Freisetzungskurven lagen innerhalb der möglichen physiologischen

Variationsbreite.

Möglicherweise hat diese anders geartete Reaktion ihre Ursache in der schon vor der

Wurmkur schwachen Belastung und einem niedrigen Infektionsdruck aufgrund einer

sorgfältigen Weide- und Stallhygiene und regelmäßiger anthelminthischer Therapie.

Da das Pferd zwar mit den gleichen Medikamenten (Moxidectin und Praziquantel (3.3.5))

behandelt wurde, aber kein suppressiver Effekt beobachtet wurde, ist dies als weiterer

Hinweis auf eine nicht durch die Anthelmintika bedingte Hemmung bei den Islandpferden zu

betrachten.

Ergebnisse 96

4.4.4 Einfluss anthelminthischer Behandlung und nachfolgender Methyl-

prednisolongabe auf die funktionellen Sensibilisierungen basophiler

Granulocyten

Es hatte sich in den vorausgehendenen Versuchen gezeigt (4.4.1 - 4.4.3), wie sich die reine

anthelminthische Behandlung auf die generelle und spezifische Sensibilisierung der

Basophilen auswirken kann, ohne ihre Anzahl oder ihren Histamingehalt zu verringern. Nun

wurde vor dem Hintergrund der Modulation der basophilen Granulocyten die Fragestellung

aufgeworfen, ob man das durch die vermehrte Freisetzung des parasitären Antigens

möglicherweise veränderte Antikörperspektrum zu einer Neuprägung der Basophilen nutzen

kann, so, wie es ursprünglich für die Immunisierung mit TcA und TcB beabsichtigt war (4.1).

Zu diesem Zweck wurde einem Teil der Pferde, der Versuchsgruppe I (3.4.1.2, neun Pferde,

davon vier Ekzemer), sieben Tage nach der Behandlung mit Moxidectin und Praziquantel 1

mg Methylprednisolon pro kg KGW intravenös injiziert, um eine Eliminierung der basophilen

Granulocyten zu erreichen. Dieses wurde durch Verfolgung der physikalisch aus den

Basophilen freisetzbaren Histaminmenge überprüft (3.4.3).

0

10

20

30

40

50

60

70

0 h 6 h 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 96 h 120 h

His

tam

in in

ng/

ml

Abbildung 31: Änderungen im Gesamthistamingehalt des Blutes nach Methylprednisolon Die Abbildung zeigt den zeitlichen Verlauf der Mittelwerte des Histamingehaltes in ng/ml Blut, bestimmt durch physikalische Freisetzung (3.4.3.1), nach Injektion von Methylprednisolon bei den Pferden der Gruppe I (3.4.1.2, n=9) zu den Zeitpunkten 0, 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96 und 120 h p. med. Die Standardabweichung ist entsprechend angegeben.

Ein deutlicher Rückgang des nachweisbaren Histamins war bereits sechs Stunden nach der

Injektion zu beobachten, nach weiteren sechs Stunden konnte je nach Pferd kein oder nur

noch sehr geringe Mengen Histamin nachgewiesen werden. Diese geringen Unterschiede

Ergebnisse 97

waren wahrscheinlich auf Dosierungsunterschiede bei geschätztem Körpergewicht oder

individuell unterschiedliche Reaktionen auf das Methylprednisolon zurückzuführen. Bei

dieser Dosierung stieg der Gehalt an Gesamthistamin im Blut (und damit die Zahl der

histaminhaltigen Basophilen) bereits 24 h nach der Applikation wieder an und übertraf 36 h

bis 48 h p. med. den Ausgangswert (Reboundeffekt). In einem Zeitraum von 72 bis spätestens

96 h p. med. hatte sich der Spiegel wieder dem Ausgangsniveau angeglichen.

Die Erfassung der generellen und der spezifischen Sensibilisierungen erfolgte vor der

Injektion des Methylprednisolons (sieben Tage nach der Entwurmung) und vierzehn Tage

danach. Exemplarisch für die Pferde der Versuchsgruppe sind die Sensibilisierungen gegen

anti-IgG (gαh) und anti-IgE in Abbildung 32 und Abbildung 33 der Tiere #11 (Ekzemer) und

#18 (Nichtekzemer) dargestellt.

0%

20%

40%

60%

80%

100%


% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g

gah 60 IgE

Pred.

Wk.

Abbildung 32: Verlauf der generellen Sensibilisierung vor und nach Entwurmung sowie

Methylprednisolongabe bei Pferd #11 (Ekzemer, stark verwurmt) In dieser Abbildung ist der anti-IgG (gαh 60) und anti-IgE-vermittelte Histaminrelease des Pferdes #11 (Gruppe I, 3.4.1.2) in Prozent der Maximalfreisetzung (3.4.3.2) vor, sieben Tage, drei Wochen und drei Monate nach anthelminthischer Behandlung mit Moxidectin und Praziquantel (Wk, 3.3.5) aufgezeigt. Am Tag 7 nach der Entwurmung wurde Methylprednisolon (3.3.5) intravenös injiziert (Pred.) und der Sensibilisierungsverlauf (3.4.3) durch wiederholte Untersuchungen im FIT (3.4.3) verfolgt.

Ergebnisse 98

0%

20%

40%

60%

80%

100%


% d

er M

axim

alfre

iset

zung

gah 60 IgE

Abbildung 33: Verlauf der generellen Sensibilisierung vor und nach Entwurmung sowie

Methylprednisolongabe bei Pferd #18 (Nichtekzemer, stark verwurmt) In dieser Abbildung ist der anti-IgG (gαh 60) und anti-IgE-vermittelte Histaminrelease des Pferdes #18 (Gruppe I, 3.4.1.2) in Prozent der Maximalfreisetzung (3.4.3.2) vor, sieben Tage, drei Wochen und drei Monate nach anthelminthischer Behandlung mit Moxidectin und Praziquantel (Wk, 3.3.5) aufgezeigt. Am Tag 7 nach der Entwurmung wurde Methylprednisolon (3.3.5) intravenös injiziert (Pred.) und der Sensibilisierungsverlauf (3.4.3) durch wiederholte Untersuchungen im FIT (3.4.3) verfolgt.

Die generellen Sensibilisierungen (anti-IgG (gαh) und anti-IgE) waren nach der

anthelminthischen Therapie vermindert (siehe auch Abbildung 24 und Abbildung 25) und

stiegen entweder innerhalb von zwei Wochen nach der Applikation von Methylprednisolon

(drei Wochen nach Entwurmung) wieder auf in die Bereiche der Ausgangswerte oder blieben

vermindert (Abbildung 32 und Abbildung 33). Sie stiegen nicht über das Ausgangsniveau

hinaus (siehe vergleichsweise 4.4.5, Abbildung 36 und Abbildung 37). Nach drei Monaten

war keine signifikante Veränderung zu den Sensibilisierungen vor der Entwurmung mehr zu

beobachten.

Auch die spezifischen Sensibilisierungen wurden vor der Injektion des Methylprednisolons

(sieben Tage nach der Entwurmung) und vierzehn Tage danach erhoben. Als Beispiel für den

allergenspezifischen Sensibilisierungsverlauf in diesem Versuchsansatz ist in Abbildung 34

Pferd #11, ein Ekzemer, aufgeführt.

Wk.

Pred.

Ergebnisse 99

0

1

2

3

4

vor Wk 7 d post Wk 3 Wo post Wk 3 Mo post Wk 6 Mo post Wk

Sens

ibili

sier

ungs

grad

Cn Mq HF

Abbildung 34: Verlauf der allergenspezifischen Sensibilisierung vor und nach Entwurmung

sowie Methylprednisolongabe bei Pferd #11 (Ekzemer, stark verwurmt) In dieser Abbildung ist der Cn-, Mq- und HF-vermittelte Histaminrelease des Pferdes #11 (Gruppe I, 3.4.1.2) in Sensibilisierungsgraden (3.4.3.2) vor, sieben Tage, drei Wochen, drei Monate und sechs Monate nach anthelminthischer Behandlung mit Moxidectin und Praziquantel (Wk, 3.3.5) aufgezeigt. Am Tag 7 nach der Entwurmung wurde Methylprednisolon (3.3.5) intravenös injiziert (Pred.) und der Sensibilisierungsverlauf (3.4.3) durch wiederholte Untersuchungen im FIT (3.4.3) verfolgt.

Mit einer Ausnahme (ein Allergen bei einem Pferd) blieben alle allergenvermittelten

Histaminfreisetzungen bis zwei Wochen nach Methylprednisolon reduziert oder ereichten nur

ihr Ausgangsniveau (Abbildung 34). Damit hielt die Reduktion deutlich länger an als bei den

Kontrollgruppen II und III (Abbildung 26). Nach drei Monaten war der Effekt der

Entwurmung und des Cortisons nicht mehr zu verzeichnen. Bei keinem Pferd wurde eine

Langzeitwirkung festgestellt, in der eine Reduktion der vorher vorhandenen

allergenspezifischen Sensibilisierung zu erkennen gewesen wäre. Während aber die

allergenbezogene Suppression der Basophilen zwei Wochen nach dem Corticoid noch

vorhanden war, ließ sich für die rekombinanten Proteine TcA und TcB keine Hemmung mehr

feststellen. Die Sensibilisierungsgrade stiegen in einigen Fällen sogar an oder ließen sich

induzieren (Abbildung 35).

Pred.

Wk

Ergebnisse 100

0

1

2

3

vor Wk 7 d post Wk, Pred. 3 Wo post Wk 3 Mo post Wk

Sens

ibili

sier

ungs

grad

#23 #25 #18

Abbildung 35: Verlauf der TcB-spezifischen Sensibilisierung vor und nach Entwurmung bei

drei Pferden der Gruppe I Die Grafik gibt die Entwicklung der TcB-spezifischen Sensibilisierung (3.4.3) der Basophilen im FIT (3.4.39 dreier Pferde vor der Entwurmung (Wk), sieben Tage danach (zu diesem Zeitpunkt wurden die Pferde mit Methylprednisolon behandelt (Pred.)) (3.4.1.2), drei Wochen nach der Entwurmung bzw. zwei Wochen nach Corticoid und drei Monate später wieder. Die Reagibilität ist in Sensibilisierungsgraden angegeben (3.4.3.2). Bei #23 und #25 handelt es sich um schwach parasitär belastete Pferde, bei #18 um ein stärker verwurmtes Pferd (4.3).

Die Induktion einer dauerhaften Sensibilisierung (länger als drei bis sechs Monate) gegen

TcA oder TcB gelang nicht. Von den Pferden der Gruppe I waren im Juli 2004 noch die

Hälfte TcA- und TcB-positiv und erreichten damit das gleiche Verhältnis wie die Tiere der

Kontrollgruppen II und III (3.4.1.2). Die für die rekombinanten Proteine positiven Pferden

waren im Sommer 2004 sowohl TcA als auch TcB-positiv (1+, ein Tier TcB 2+).

Die Eliminierung der basophilen Granulocyten konnte durch den beobachteten

Histamineinbruch, die Neurekrutiereung durch den Reboundeffekt nachgewiesen werden

(Abbildung 31). Nach einem Reboundeffekt etwa 36h nach der Injektion des Corticoides hat

sich der Gesamthistamingehalt nach spätestens 96h wieder auf dem Ausgangsniveau

eingependelt. Es wurden also neue Basophile aus dem Knochenmark rekrutiert, die

möglicherweise ein verändertes Sensibilisierungsspektrum aufwiesen.

Die Sensibilisierungen der Basophilen (Abbildung 34) nach Methylprednisolon stellten sich

im Vergleich mit den nur entwurmten Gruppen II und III (3.2.1.4) (Abbildung 26) als auch

noch drei Wochen nach der Entwurmung (zwei Wochen nach Cortisonapplikation) bezüglich

der Allergene deutlich reduziert dar. Bezüglich der rekombinanten Parasitenproteine TcA und

TcB konnte jedoch im Gegensatz zu den Allergenen keine anhaltende Hemmung, sondern

eine Rückkehr auf das Ausgangsniveau oder sogar eine Steigerung oder Induktion der

Wk Pred.

Ergebnisse 101

Sensibilität beobachtet werden (Abbildung 35). Dieses konnte von den Basophilen aber nicht

dauerhaft aufrechterhalten werden. Möglicherweise spielen hier wieder der zunehmende

Kontakt mit allergieauslösenden Insekten und ein entsprechend veränderter Antikörpertiter

eine Rolle. Dennoch kann für den Beobachtungszeitraum von zwei Wochen nach

Methylprednisolon (drei Wochen nach Entwurmung) bis teilweise drei Monate danach (April

2004) von einer Modulation der Sensibilisierungen gesprochen werden. Ein ähnliches Bild

(allergenspezifische Sensibilisierung ist supprimiert, TcA-/TcB-spezifische ist vorhanden

bzw. erhöht) konnte bereits bei der therapeutischen Anwendung von Methylprednisolon

beobachtet werden (4.1.2.2).

Es war aber in beiden Versuchansätzen (4.1 - 4.2, 4.4) keine grundsätzliche Änderung des

allergenspezifischen Sensibilisierungsspektrums zu beobachten.

4.4.5 Einfluss der Corticosteroidgabe auf die funktionellen Sensibilisierungen

basophiler Granulocyten ohne vorhergehende anthelminthische Behandlung

Es musste geklärt werden, welchen Einfluss das Corticoid alleine ohne zusätzlichen Effekt

durch Entwurmung oder Immunisierung hatte und ob die beobachteten Veränderungen in den

Sensibilisierungen der Basophilen (4.1.2 und 4.4.4) nicht nur auf das Methylprednisolon

zurückzuführen waren.

Dazu wurde im Rahmen des Modulationsversuchs durch anthelminthische Behandlung eine

Kontrollgruppe, Gruppe II (3.4.1.2), zwei Wochen vor der Entwurmung nach Entnahme einer

Blutprobe für die Bestimmung des Ausgangsstatus (FIT) der Sensibilisierungen mit 1 mg/kg

KGW Methylprednisolon behandelt. Der Erfolg der Basophileneliminierung wurde wie bei

der Gruppe I im sechs-, zwölf- und danach vierundzwanzigstündigen Abstand überprüft.

Da der Verlauf des Gesamthistamins nach Methylprednisolon der gleichen Kinetik folgte wie

bei Gruppe I (Abbildung 31), ist sie hier nicht erneut dargestellt. Auch bei dieser Gruppe war

zwölf Stunden nach Injektion kein oder nur noch wenig Histamin nach physikalischer

Freisetzung zu detektieren. Anderthalb bis zwei Tage später befanden sich die Tiere im

Rebound, nach vier Tagen waren die Histaminwerte auf das Ausgangsniveau

zurückgegangen. Die Kinetik belegte die Eliminierung und Neurekrutierung der basophilen

Granulocyten im Blut der Pferde.

Zwei Wochen nach der Corticosteriodinjektion (am Tag der anthelminthischen Behandlung)

wurde ein weiterer Sensibilisierungsstatus bezüglich der generellen und der spezifischen

Sensibilisierung erhoben.

Ergebnisse 102

Bei Betrachtung der generellen Sensibilisierung zeigten jeweils vier von acht Pferden zwei

Wochen nach Cortisonapplikation eine erhöhte Histaminfreisetzung gegen anti-IgE oder anti-

IgG (gαh) (Abbildung 36 und Abbildung 37), die anderen veränderten sich diesbezüglich

nicht. Mit Ausnahme von #27 reagierten aber alle Pferde der Gruppe II mit erhöhten

Sensibilitäten gegen entweder Antikörper, Antigene oder Allergene, auch die klinisch

gesunden Nichtallergiker. Dabei zeigten sich individuell unterschiedliche Bilder der

Veränderungen, dargestellt für die generellen Sensibilisierungen der basophilen Granulocyten

gegen anti-IgG (gαh) und anti-IgE (Abbildung 36 und Abbildung 37). So wies z. B. Tier #12

sowohl einen Anstieg in der anti-IgG- als auch in der anti-IgE-vermittelten

Histaminfreisetzung auf, Tier #29 veränderte sich nur bezüglich des gαh-vermittelten Release.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

#12 #27 #29

% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

g

prae Pred. post Pred.

Abbildung 36: gαh-vermittelte Histaminfreisetzung vor und 14 Tage nach Methylprednislon Die Darstellung zeigt die durch anti-IgG-Ak (gαh 60 (3.4.3.1)) induzierte Histaminfreisetzung aus basophilen Granulocyten (FIT, 3.4.3) in Prozent der physikalischen Freisetzung bei drei Pferden der Gruppe II (#12, #27, #29, 3.4.1.2) vor (linke Säule) und vierzehn Tage (rechte Säule) nach einmaliger Behandlung der Tiere mit 1 mg/k KGW Methylprednisolon i.v.

Ergebnisse 103

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

#12 #27 #29

% d

er M

axim

alfr

eise

tzun

gprae Pred. post Pred.

Abbildung 37: anti-IgE-vermittelte Histaminfreisetzung vor und nach Methylprednisolon Gezeigt werden die Freisetzungen (FIT, 3.4.3) der Basophilen dreier Pferde der Gruppe II (#12, #27, #29, 3.4.1.2) nach Aktivierung durch anti-eqIgE-Antikörper (3.4.3) in Prozent der physikalischen Freisetzung vor (linke Säule) und vierzehn Tage (rechte Säule) nach einmaliger Injektion von 1 mg/kg KGW Methylprednisolon i.v. (3.3.5).

Im Gegensatz zur Gruppe I, die keine Steigerung oder eine Reduktion der generellen

Sensibilisierungen gegen anti-IgE oder anti-IgG (gαh) nach 14 Tage Cortisoninjektion

beobachten ließ (Abbildung 32 und Abbildung 33), war bei Gruppe II eine teilweise deutliche

Steigerung zu erkennen (Abbildung 36 und Abbildung 37).

Im allergenspezifischen Sensibilisierungsstatus hatten sich in Abbildung 38 für die Gruppe II

exemplarisch dargestellte Veränderungen ergeben.

0

1

2

3

prae Pred. 14 Tage post Pred.

Sens

ibili

sier

ungs

grad

Cn Mq HF

Abbildung 38: Veränderungen in den funktionellen Sensibilisierungen bezüglich Cn, Mq und HF bei Pferd #7 vor und 14 Tage nach Methylprednisolon

Die Grafik zeigt die Sensibilisierungsgrade (3.4.3.2) für drei im FIT (3.4.3) getestete Allergene (Cn,

Ergebnisse 104

Mq und HF, 3.3.4) bei Pferd #7 vor und 14 Tage nach Injektion von 1 mg/kg KGW Methylprednisolon. Das gezeigte Pferd ist ein Sommerekzemer, dessen Eiausscheidungsrate im Beobachtungszeitraum niedrig war („schwach verwurmt“, 4.3). Zwei Wochen p. med. erhöhte sich bei sechs von acht Pferden die allergenspezifische

Sensibilisierung um ein bis zwei Grade oder wurde bei vorher negativen Pferden induziert.

Eine Reduktion oder gar ein Erlöschen der Reagibilität gegen Allergene wurde bei keinem

Tier festgestellt (vergl. 4.4.4). Die Reaktionsbereitschaft gegen der rekombinanten Proteine

TcA und TcB stieg bei drei Pferden von null auf bis zu 3+ positiv. Das inverse

Reaktionsmuster auf TcB (4.1, 4.2) war auch hier nicht mehr festzustellen. Alle drei Pferde,

die auf TcA Histamin freisetzten, reagierten auch auf TcB. Fünf von acht Tieren blieben

negativ für TcA und TcB.

Zwei der acht Pferde (#27 und #29) in Gruppe II zeigten weder vor noch 14 Tage nach der

Injektion von Methylprednisolon eine funktionelle Sensibilisierung gegen die getesteten

Allergene Cn, Mq und HF.

Sieben Tage nach folgender anthelminthischer Therapie (3.4.1.2) (also insgesamt drei

Wochen nach Methylprednisolon) waren diese Muster der individuell erhöhten

Sensibilisierungen nicht mehr zu erkennen. Die vorhergehende Sensibilisierungssteigerung

hatte auch keinen Einfluss auf die Stärke der Veränderungen nach Entwurmung (4.4.2).

Diese Daten der Gruppe II weisen auf eine deutlich erhöhte generelle und spezifische

Sensibilisierung der basophilen Granulocyten bei sechs von acht Pferden zwei Wochen nach

der Behandlung mit Methylprednisolon ohne vorhergehende anthelminthische Behandlung

oder Immunisierung hin. Sie stehen damit im Kontrast zu den bisher erhobenen Daten

(TcA/B-Pferde, 4.1–4.2; Gruppe I, 4.4.4) nach Anwendung dieses Corticoides. Zwar ist bei

Vergleich mit den Beobachtungen nach therapeutischer Anwendung des Methylprednisolons

(4.1.2.2) zu bedenken, dass diese eine Woche post med. erfasst wurden, doch stellen die in

diesem Abschnitt dargestellten Sensibilisierungen einen deutlichen Unterschied zu den

ebenfalls nach vierzehn Tagen erhobenen Daten nach Entwurmung dar (4.4.4). Statt einen

hemmend-modulierenden Einfluss auf die Effektorzellen aufrecht zu erhalten, wie er in 4.4.4

festgestellt wurde, wurden die funktionellen Sensibilisierungen noch verstärkt („Rebound“).

Es waren also trotz des Winters noch ausreichend allergenspezifische Antikörper im Serum

der Pferde, um eine Sensibilisierung der neuen Basophilen nicht nur auf dem Ausgangsniveau

Ergebnisse 105

zu erhalten, sondern auch zu verstärken (vergl. z. B. Abbildung 34 mit Abbildung 38). Im

Falle der rekombinanten Parasitenproteine wird der hohe Infektionsdruck und die dadurch

teilweise große Antigenpräsenz ebenfalls zu einer Bereitstellung einer ausreichenden Anzahl

an sensibilisierenden Antikörpern geführt haben.

Die erhobenen Daten aus 4.4.4 und 4.4.5 lassen den Schluss zu, dass die durch die

Antigenanflutung nach anthelminthischer Therapie aktivierten Hemmmechanismen den

Reboundeffekt bei Gruppe I verhindern konnten (Abbildung 34) oder dass der Austausch der

sensibilisierenden Antikörper auf der Basophilenoberfläche und damit die allergen- und TcA-

/TcB-spezifische Modulation tatsächlich (zumindest für den Beobachtungszeitpunkt drei

Wochen nach der Entwurmung und zwei Wochen nach Prednisolon) erfolgreich war

(Abbildung 34 und Abbildung 35).

4.5 Sensibilisierung gegen Cyathostominae spp.

Da im Modulationsversuch durch anthelminthische Therapie vermutlich eine Vielzahl

unterschiedlicher parasitärer Antigene freigesetzt wurde, aber nur die Sensibilisierung gegen

zwei sehr spezifische, rekombinante Antigene (TcA und TcB) getestet werden konnte – die

einem ähnlichen Verdünnungseffekt wie andere sensibilisierende Antikörper unterworfen sein

konnten – hätte eine Mischung aus vielen verschiedenen Antigenen möglicherweise in diesem

Ansatz informativ sein können. Damit wäre die Erfassung der Reaktionsbereitschaft gegen die

Summe der Parasitenantigene bzw. eine Prüfung des breiten Spektrums von parasitären

Antigenen, die eine Typ-I-Reaktion auslösen können, möglich gewesen. Es ergab sich aber

erst im Frühjahr 2004 die Möglichkeit, aus kleinen Strongyliden (Cyathostominae spp.) eine

Antigenpräparation herzustellen (3.4.9) und diese im FIT (3.4.3) zu testen.

Es erwiesen sich ohne Ausnahme alle mit dieser Antigenpräparation getesteten Pferde als

positiv. Um eine unspezifische Degranulation der Basophilen durch Bestandteile der

Präparation auszuschließen, wurden humane Basophile dreier Freiwilliger im FIT mit der

Cyathostominenpräparation in den gleichen Endkonzentrationen wie die Pferde konfrontiert

(1µg/ml-1x10-5 µg/ml). In diesem Ansatz wurde kein Histamin freigesetzt. Eine

Degranulation der Basophilen dürfte also im Falle einer positiven Reaktion durch spezifische

Antikörper vermittelt sein.

Eine Ausverdünnung der Präparation verursachte bei einigen Pferden noch in einer

Konzentration von 1 ng/ml einen positiven Release. Konzentrationen von 1 und 0,1 µg/ml

erreichten in mehreren Fällen die gleiche oder höhere Histaminfreisetzung als die

Ergebnisse 106

physikalische Freisetzung. Daher wurde für die Untersuchungen im FIT als höchste

Konzentration 1µg/ml eingesetzt und in Zehnerschritten sechsmal weiter verdünnt (bis

0,00001 µg/ml oder 10pg/ml).

Die untersuchten Pferde waren im Schnitt 2+ bis 3+ positiv (0,1-0,01 µg/ml oder 100-10

ng/ml Strongylidenprotein). Dabei fiel bei zwölf getesteten Pferden im Juli 2004 auf, dass die

vier Pferde, die auch auf 10 ng/ml noch reagierten (3+), alle auch TcA- und TcB-positiv

waren. Zwei weitere TcA- und TcB-positive Tiere setzten ebenso wie die anderen, TcA- und

TcB-negativen Pferde, nur bis 100 ng oder 0,1 µg/ml der Präparation Histamin frei (2+).

Es ließen sich keine eindeutigen Zusammenhänge zwischen der Eiausscheidung (4.3, Tabelle

8 und Tabelle 9) der Tiere und dem individuellen Sensibilisierungsgrad gegen

Cyathostominae spp. feststellen (Tabelle 10).

Verhältnis der spezifischen Sensibilisierung gegen Cyathostominae spp. im FIT und individueller Ausscheidung von Strongylideneiern bei zwölf untersuchten Pferden

Pferd Nr.

Sensibilisierung gegen

Cyathostominae spp. Eiauscheidungsrate (4.3)

#4 2+ hoch

#7 2+ niedrig

#9 2+ hoch

#10 2+ hoch

#11 2+ hoch

#12 3+ niedrig

#23 2+ niedrig

#24 2+ niedrig

#25 3+ niedrig

#27 3+ niedrig

#28 1+ hoch

#32 2+ hoch

Tabelle 10: Verhältnis der spezifischen Sensibilisierung gegen Cyathostominae spp. im FIT und individueller Ausscheidung von Strongylideneiern bei zwölf untersuchten Pferden

Die Tabelle zeigt zwölf Pferde (mit und ohne Sommerekzem) und die spezifischen Sensibilisierungen ihrer basophilen Granulocyten gegen einen Extrakt aus kleinen Strongyliden (3.4.3) sowie die Höhe der individuellen Ausscheidung von Strongylideneiern (4.3). Die Bezeichnung „hoch“ bzw. „niedrig“ für die Eiausscheidungsrate wurde aufgrund der individuellen Eizahl in den Tabelle 8 und Tabelle 9 festgelegt. Die Pferde #4 bis #12 sind klinische Ekzemer, die Pferde #23 bis #32 klinisch gesund.

Ergebnisse 107

4.6 Zum Isotypen-ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Immunglobuline sind an der Vermittlung und der Hemmung der Typ-I-Reaktion und an der

Bekämpfung von Helminthenstadien zentral beteiligt (2.3, 2.6). Das Vorhandensein von

Antikörpern einer bestimmten Spezifität (z. B. Ak-anti-TcA oder -TcB) zu einem bestimmten

Zeitpunkt im Serum hat möglicherweise Auswirkungen auf den Antikörperbesatz der

basophilen Granulocyten (2.3). Es musste daher festgestellt werden, zu welchem Zeitpunkt

des Beobachtungszeitraumes Antikörper welchen Isotyps gegen die (sehr spezifischen)

rekombinanten Parasitenproteine TcA und TcB sowie, als Vertreter der Vielfalt der

endoparasitären Antigene, gegen einen Extrakt aus Cyathostominae spp. (3.3.4, 4.6)

vorhanden waren. Eine Untersuchung der allergenspezifischen Antikörper konnte trotz des

hohen Informationsgehaltes nicht durchgeführt werden, da derzeit noch keine isolierten

Allergene aus Culicoides nubeculosus, Tabanus spp. und Culicidae spp. zur Verfügung

stehen. Ein Nachweissystem gegen die Extrakte erbringt keine verwertbaren Daten, da alle

Pferde, die bereits Kontakt mit diesen Insekten hatten, IgG-Antikörper gegen die Bestandteile

des Speichels entwickelt haben (2.2). Die potentiellen Allergene sind in den verwendeten

Insektenextrakten nur in Spuren vorhanden, so dass die möglicherweise sensibilisierenden

Immunglobuline des Isotyps E nicht sensitiv genug nachgewiesen werden konnten (persönl.

Mitteilung T. GEIBEN, J. ROHWER).

Bei Betrachtung der im ELISA erhobenen Daten ist zu bedenken, dass in diesem System nur

Antikörper in ihrer Spezifität, jedoch nicht in ihrer Funktionalität erfasst werden können, da

die freien Serumantikörper nicht repräsentativ für die auf Zelloberflächen gebunden

Immunglobuline sein können. Es ist nicht möglich, über einen ELISA Informationen über die

tatsächlichen Bindungen von Antikörpern auf Effektorzellen zu erhalten. Es kann also keine

Aussage bezüglich einer basophilenaktivierenden Fähigkeit nach Bindung auf einen Fc-

Rezeptor getroffen werden.

Es wurden ELISA-Systeme entwickelt, die von zehn möglichen Isotypen (IgG1-IgG7, IgA,

IgE, IgM) gegen TcA, TcB und Cyathostominae spp. sechs detektieren konnten (IgG1, IgG2,

IgG4, IgG5, IgE und IgA) (3.4.6). Ein Nachweis der vier anderen gelang im Falle des IgM

aufgrund einer zu großen unspezifischen Bindung des Detektionsantikörpers nicht, im Falle

der Isotypen IgG3, IgG6 und IgG7 standen keine oder nicht ausreichende

Nachweisreagenzien zur Verfügung (2.6).

Um einen ausreichenden Überblick über die Titerverläufe zu erhalten, wurden neun

Zeitpunkte verteilt über den Beobachtungszeitraum ausgewählt:

Ergebnisse 108

Auswahl der im ELISA zu untersuchenden Seren nach Zeitpunkten des

Beobachtungszeitraumes

Datum

lfd.

Nr. Begründung für die Auswahl des Zeitpunktes

17.02.03 1

Vor der Immunisierung der TcA-/TcB-Pferde, Status der Eiausscheidung

und FIT vorhanden,

01.04.03 2 Zwei Wochen nach der Immunisierung mit TcA und TcB

24.07.03 3

Vor anthelminthischer Behandlung mit Pyrantel, Status der

Eiausscheidung und FIT vorhanden

05.08.03 4 Nach Entwurmung mit Pyrantel

06.10.03 5 Status der Eiausscheidung und FIT vorhanden


19.01.04 7

Vor anthelminthischer Behandlung mit Moxidectin und Praziquantel,

Status der Eiausscheidung und FIT vorhanden

20.02.04 8

Nach Entwurmung mit Moxidectin und Praziquantel, Status der

Eiausscheidung und FIT vorhanden


Tabelle 11: Auswahl der im ELISA zu untersuchenden Seren nach Zeitpunkten des Beobachtungszeitraumes

Die Tabelle gibt die neun Zeitpunkte wieder, an denen die Seren gewonnen wurden, die im ELISA (3.4.6) gegen TcA, TcB und eine Präparation aus kleinen Strongyliden (3.3.4 bzw. 3.4.9) getestet wurden, und die inhaltliche Begründung für die Auswahl dieser Zeitpunkte. Der Auswahlzeitraum erstreckt sich vom 17.02.03 bis zum 19.04.04. Den einzelnen Zeitpunkten sind zusätzlich die laufenden Nummern 1-9 zugeordnet.

Für die Untersuchungen wurden die Seren von sechs Pferden nach den Kriterien stark oder

schwach verwurmt (4.3) und TcA/TcB-immunisiert oder Kontrollpferd (3.4.1.1) ausgewählt,

für die Untersuchungen des Gesamt-IgE-Spiegels (4.6.3) elf Pferde nach Ekzem- und

Eiausscheidungsstatus.

Ergebnisse 109

Die im Isotypen-ELISA gegen TcA, TcB und Cyathostominae spp. untersuchten Pferde

Pferd # TcA-/TcB-immunisiert Eiausscheidungsstatus #1 ja gering #8 nein gering #10 nein hoch #16 nein hoch #20 ja gering #32 ja hoch

Tabelle 12: Die im Isotypen-ELISA gegen TcA, TcB und Cyathostominae spp. untersuchten Pferde

In dieser Tabelle sind die Pferde dargestellt, deren Seren (Tabelle 11) im ELISA (4.6.1 bzw. 4.6.2) gegen die rekombinanten Proteine TcA, TcB und gegen einen Extrakt aus kleinen Strongyliden (3.3.4 bzw. 3.4.9) auf die Isotypen IgE, IgA, IgG1, IgG2, IgG4 und IgG5 untersucht wurden. Zudem sind ihr Immunisierungsstatus gegen TcA und TcB (4.1.1) sowie ihr Grad der Eiausscheidung (4.3) angegeben. Bei den Tieren #1, #8 und #10 handelt es sich um klinische Ekzemer, bei #16, #20 und #32 um klinisch gesunde Tiere (3.1.1).

Auswahl von elf Pferden mit unterschiedlichem Ekzem- und Eiausscheidungsstatus

Pferd # Ekzemer/ gesund Eiausscheidungsstatus #1 Ekzemer gering #8 Ekzemer gering #10 Ekzemer hoch #11 Ekzemer hoch #12 Ekzemer gering #16 gesund hoch #20 gesund gering #24 gesund gering #27 gesund gering #28 gesund hoch #32 gesund hoch

Tabelle 13: Auswahl von elf Pferden mit unterschiedlichem Ekzem- und Eiausscheidungsstatus Die Tabelle zeigt die elf Pferde an, deren Seren im Gesamt-IgE-ELISA (3.4.6.2) über einen Zeitraum von vierzehn Monaten (Tabelle 11) untersucht wurden (4.6.3), zusammen mit Angaben zu ihrem allergischen (3.1.1) und parasitologischen (4.3) Status.

Ergebnisse 110

4.6.1 ELISA zum Nachweis von equinen Immunglobulinen gegen TcA und TcB

Die Seren der in Tabelle 12 angegebenen Pferde wurden nach dem in 3.4.6.1 angeführten

ELISA auf Antikörper gegen TcA und TcB (3.3.4) untersucht.

Es konnten bei allen immunisierten Pferden (#1, #20, #32) zwei Wochen nach der

Applikation Antikörper aller Isotypen gegen TcA mit Ausnahme des IgE nachgewiesen

werden, ebenso bei einem nicht immunisierten Kontrollpferd (#16) (Abbildung 39 und

Abbildung 40). Vor der Immunisierung hatten nur Kontrollpferd #16 geringe Mengen aller

untersuchten IgG-Isotypen und TcA-/TcB-Pferd #1 nur IgG5 gegen TcA. Exemplarisch für

den Titerverlauf aller Isotypen sind in Abbildung 39 und Abbildung 40 alle Pferde zum Isotyp

IgG1 dargestellt.

0

20

40

60

80

100

120

17.02.03 01.04.03 24.07.03 05.08.03 06.10.03 01.12.03 19.01.04 20.02.04 19.04.04

ELIS

A-U

nits

#1 #20 #32

Abbildung 39: IgG1-Antikörper gegen TcA bei immunisierten Pferden (TcA-/TcB-Pferde) im

Beobachtungszeitraum In dieser Grafik ist der Antikörpertiterverlauf des Isotyps IgG1 gegen das rekombinante Protein TcA (3.3.4) bei mit TcA immunisierten Pferden (3.4.1.1) über den Beobachtungszeitraum hinweg in ELISA-Units (3.4.6.3) dargestellt. Die Immunisierung (Pfeil) erfolgte zwei Wochen vor dem 01.04.03 (am 16.03.03).

Immunisierung

Ergebnisse 111

0

5

10

15

20

25

30

35

17.02.03 01.04.03 24.07.03 05.08.03 06.10.03 01.12.03 19.01.04 20.02.04 19.04.04

ELIS

A-U

nits

#8 #10 #16

Abbildung 40: IgG1-Antikörper gegen TcA bei nicht immunisierten Pferden (Kontrollpferden)

im Beobachtungszeitraum Diese Grafik zeigt den Antikörperspiegel des Isotyps IgG1 gegen das rekombinante Protein TcA (3.3.4) bei nicht immunisierten Pferden (Kontrollpferden) (3.4.1.1) über den Beobachtungszeitraum hinweg in ELISA-Units (3.4.6.3) dargestellt.

Die Induktion bzw. die Verstärkung der TcA-spezifischen Antikörper bei den am 16.03.03

immunisierten Tieren ist am 01.04.03 deutlich erkennbar. #32 konnte den Titer am längsten

halten (Abbildung 39), dieses Pferd hatte kein therapeutisches Cortison erhalten. Bei den

anderen zwei Pferden (#1, #20, Abbildung 39), die therapeutisch Methylprednisolon erhalten

hatten (4.1), fiel der Titer bis zum nächsten Untersuchungszeitpunkt (24.07.03) wieder ab.

Dieses Verhalten der Antikörperspiegel gegen TcA ließ sich bei den drei Pferden bei allen

Isotypen mit Ausnahme des IgE beobachten, da IgE gegen TcA im ELISA nicht nachweisbar

war. #20 zeigte zudem eine deutlich verzögerte Reaktion mit IgA und erreichte einen

gesteigerten Spiegel erst Ende Juli (24.07.03), der sich schnell wieder verlor. Die bei allen

drei Pferden schwächste Reaktion zeigten IgG5-Antikörper, die stärkste IgG4-Antikörper.

Bei den Kontrollpferden zeigte sich, dass ein TcA-Titer nicht durch Immunisierung bedingt

sein musste, sondern bereits vorher bestehen konnte (#16). Bei diesem Pferd waren – mit

Ausnahme von IgE – Antikörper aller untersuchten Isotypen gegen TcA nachweisbar. Die

beiden nicht immunisierten Kontrollpferde (#8 & #10) anderen wiesen keine bis (im Verlaufe

des Sommers) nur sehr wenige TcA-spezifische Immunglobuline auf.

Bei allen Tieren ist auffällig, dass sich der Serumtiter, unabhängig von einer durch

Immunisierung induzierten oder einer natürlichen Antikörperbildung, im Zeitablauf

ausschlich und auch weder durch eine Behandlung mit Pyrantel (zwischen dem 24.07. und

05.08.03) noch durch eine mit Moxidectin und Praziquantel (am 19.01.04) beeinflussen ließ.

Ergebnisse 112

Einzige Ausnahme stellte IgG4 bei dem Kontrollpferd #16 dar, das sich über den Sommer

verstärkte und gegen Herbst 2003 auf sein Ausgangsniveau reduzierte, sich aber nicht verlor.

#32 blieb auf einem niedrigen Niveau (20 Units) ebenfalls bis in das Frühjahr 2004 IgG4-

positiv. Es gab keinen Zusammenhang mit der individuellen Reaktionslage der Pferde gegen

Nematoden (4.3).

Gegen TcB ließen sich bei keinem der Pferde Antikörper der sechs untersuchten Isotypen

nachweisen, auch nicht zwei Wochen (01.04.03) nach der Immunisierung. Da die ELISA-

Ergebnisse durchweg negativ ausfielen, sind sie hier nicht grafisch dargestellt.

Es lässt sich also feststellen, dass ein Nachweis einer Induktion bzw. einer Verstärkung der

freien Antikörperantwort im Serum gegen TcA nach der Immunisierung erbracht werden

konnte, soweit die Isotypen IgA, IgG1, IgG2, IgG4 und IgG5 betroffen waren (Abbildung

39). IgE ließ sich zu keinem hier untersuchten Zeitpunkt nachweisen. Weiter kann gesagt

werden, dass eine Antikörperantwort gegen dieses rekombinante Protein auch

natürlicherweise entstehen konnte.

Freie Antikörper gegen TcB ließen sich für keinen der hier betrachteten Isotypen im Serum

nachweisen.

4.6.2 ELISA zum Nachweis von equinen Immunglobulinen gegen Cyathostominae spp.

Zur Bestimmung der nematodenspezifischen Antikörperverhältnisse und der

Isotypenverteilung wurde ein ELISA nach 3.4.6.1 mit den Seren der in Tabelle 12

aufgelisteten Pferde zu neun Zeitpunkten (Tabelle 11) durchgeführt.

Es konnten Antikörper jeden Isotyps gegen die Strongylidenpräparation nachgewiesen

werden, jedoch nicht bei jedem Pferd. Bis auf IgG1 und IgG4 verliefen die Titer individuell

uneinheitlich.

Ergebnisse 113

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

17.02.03 01.04.03 24.07.03 05.08.03 06.10.03 01.12.03 19.01.04 20.02.04 19.04.04

ELIS

A-U

nits

#1 #8 #20

Abbildung 41: IgG1-Titerverlauf gegen Cyathostominae spp. im Beobachtungszeitraum bei drei

Pferden mit geringer Eiausscheidung Dargestellt sind die Titer des Isotyps IgG1 spezifisch gegen kleine Strongyliden (3.3.4) bei drei Pferden (#1, #8, #20) mit geringer Eiausscheidung (4.3) über den Beobachtungszeitraum, angegeben in ELISA-Units (3.4.6.3). Anthelminthische Behandlungen (Pfeile) erfolgten am 24.07.03 (Pyrantel, 3.3.5) und am 19.01.04 (Moxidectin und Praziquantel, 3.3.5), jeweils nach der Blutentnahme.

0

20

40

60

80

100

120

140

17.02.03 01.04.03 24.07.03 05.08.03 06.10.03 01.12.03 19.01.04 20.02.04 19.04.04

ELIS

A-U

nits

#10 #16 #32


Pferden mit hoher Eiausscheidung Dargestellt sind die Titer des Isotyps IgG1 spezifisch gegen kleine Strongyliden (3.3.4) bei drei Pferden (#10, #16, #32) mit hoher Eiausscheidung (4.3) über den Beobachtungszeitraum, angegeben in ELISA-Units (3.4.6.3). Anthelminthische Behandlungen (Pfeile) erfolgten am 24.07.03 (Pyrantel, 3.3.5) und am 19.01.04 (Moxidectin und Praziquantel, 3.3.5), jeweils nach der Blutentnahme.

Im Falle des IgG1 zeigten zwei (#1 und #8) von drei Pferden mit geringer Eiausscheidung

vergleichsweise niedrige Antikörpertiter (Abbildung 41), dagegen zwei von drei Tieren (#10

und #16) mit hoher Eiausscheidung höhere Spiegel (Abbildung 42).

Bei fünf von sechs Pferden (mit Ausnahme des Tieres #1) konnte nach Behandlung mit

Moxidectin und Praziquantel ein Rückgang des Serum-IgG1-Titers festgestellt werden

Pyrantel

Mox./Praz.

Pyrantel Mox./Praz.

Ergebnisse 114

(Abbildung 41 und Abbildung 42).

0

50

100

150

200

250

17.02.03 01.04.03 24.07.03 05.08.03 06.10.03 01.12.03 19.01.04 20.02.04 19.04.04

ELIS

A-U

nits

#1 #8 #20


Pferden mit geringer Eiausscheidung Dargestellt sind die Titer des Isotyps IgG4 spezifisch gegen kleine Strongyliden (3.3.4) bei drei Pferden (#1, #8, #20) mit geringer Eiausscheidung (4.3) über den Beobachtungszeitraum, angegeben in ELISA-Units (3.4.6.3). Anthelminthische Behandlungen (Pfeile) erfolgten am 24.07.03 (Pyrantel, 3.3.5) und am 19.01.04 (Moxidectin und Praziquantel, 3.3.5), jeweils nach der Blutentnahme.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

17.02.03 01.04.03 24.07.03 05.08.03 06.10.03 01.12.03 19.01.04 20.02.04 19.04.04

ELIS

A-U

nits

#10 #16 #32


Pferden mit hoher Eiausscheidung Dargestellt sind die Titer des Isotyps IgG4 spezifisch gegen kleine Strongyliden (3.3.4) bei drei Pferden (#10, #16, #32) mit hoher Eiausscheidung (4.3) über den Beobachtungszeitraum, angegeben in ELISA-Units (3.4.6.3). Anthelminthische Behandlungen (Pfeile) erfolgten am 24.07.03 (Pyrantel, 3.3.5) und am 19.01.04 (Moxidectin und Praziquantel, 3.3.5), jeweils nach der Blutentnahme. Das IgG4 gegen kleine Strongyliden, das bei allen untersuchten Tieren nachgewiesen werden

konnte, verhielt sich bei mit Magen-Darm-Strongyliden stark und schwach belasteten Pferden

Pyrantel Mox./Praz.

Pyrantel

Mox./Praz.

Ergebnisse 115

(4.3) ähnlich. Zum Sommer hin stieg der Titer deutlich an, um im Herbst wieder abzufallen

und im Winter den Tiefstpunkt zu erreichen (um die Monate Dezember und Januar). Im

folgenden Frühjahr war ein erneuter Anstieg zu verzeichnen.

Ein Zusammenhang zwischen der Höhe der Eiausscheidung oder einem Einfluss durch

anthelminthische Behandlung und der ELISA-Unit-Zahl für IgG4 konnte nicht festgestellt

werden.

Für das uneinheitlich verlaufende IgG2 ließ sich als einzige Gemeinsamkeit bei vier von sechs

Pferden ein Anstieg zum Winter (Zunahme der parasitären Belastung) erkennen, gefolgt von

einem Absinken nach Behandlung mit Moxidectin und Praziquantel.

Dieser Rückgang im Titer nach anthelminthischer Behandlung mit den vorgenannten

Präparaten konnte auch bei fünf der sechs untersuchten Pferde im Fall des IgG5 beobachtet

werden. Dem war bei vier Tieren ein Anstieg zum Januar 2004 (stärkste parasitische

Belastung des Beobachtungszeitraumes) vorausgegangen. Bei allen Pferden mit Ausnahme

des Tieres #32, das mit drei bis dreieinhalb Jahren jüngste Pferd, konnte IgG5 gegen kleine

Strongyliden nachgewiesen werden. #32 entwickelte erst zum Dezember 2003 einen dann

jedoch sehr hohen IgG5-Titer. Zwischen dem individuellen Eiausscheidungsstatus und der

ELISA-Unit-Zahl ließ sich keine Beziehung erkennen.

Beim strongylidenspezifischen IgE (Abbildung 45 und Abbildung 46) zeigten vier von sechs

Pferden einen Anstieg zum Januar 2004, drei sanken nach der zu diesem Zeitpunkt erfolgten

Entwurmung mit Moxidectin und Praziquantel (3.3.5) wieder ab. Die anthelminthische

Behandlung mit Pyrantel (3.3.5) im Juli 2003 hatte diesen Effekt nicht (Abbildung 45 und

Abbildung 46).

Ergebnisse 116

05

101520253035404550

17.02.03 01.04.03 24.07.03 05.08.03 06.10.03 01.12.03 19.01.04 20.02.04 19.04.04

ELIS

A-U

nits

#1 #8 #20

Abbildung 45: Cyathostominae-spezifischer IgE-Titer bei drei Pferden mit geringer

Eiausscheidung Dieser Grafik sind die Titer des gegen kleine Strongyliden (3.3.4) spezifischen IgE bei drei Pferden (#1, #8, #20) mit geringer Eiausscheidung (4.3) über den Beobachtungszeitraum zu entnehmen, sie sind in ELISA-Units angegeben (3.4.6.3). Es wurden Seren von neun Zeitpunkten untersucht (Tabelle 11). Anthelminthische Behandlungen (Pfeile) erfolgten am 24.07.03 (Pyrantel) und am 19.01.04 (Moxidectin und Praziquantel) (3.4.5), jeweils nach der Blutentnahme.

0

20

40

60

80

100

120

140

17.02.03 01.04.03 24.07.03 05.08.03 06.10.03 01.12.03 19.01.04 20.02.04 19.04.04

ELIS

A-U

nits

#10 #16 #32

Abbildung 46: Cyathostominae-spezifischer IgE-Titer bei drei Pferden mit hoher

Eiausscheidung Dieser Grafik sind die Titer des gegen kleine Strongyliden (3.3.4) spezifischen IgE bei drei Pferden (#10, #16, #32) mit hoher Eiausscheidung (4.3) über den Beobachtungszeitraum zu entnehmen, sie sind in ELISA-Units angegeben (3.4.6.3). Es wurden Seren von neun Zeitpunkten untersucht (Tabelle 11). Anthelminthische Behandlungen (Pfeile) erfolgten am 24.07.03 (Pyrantel) und am 19.01.04 (Moxidectin und Praziquantel) (3.4.5), jeweils nach der Blutentnahme.

Zwei Pferde wiesen einen zusätzlichen Anstieg im Sommer 2003 auf (#10 und #20,

Abbildung 45 und Abbildung 46).

Die Höhe des in ELISA-Units angegebenen Titers korrelierte nach den erhobenen Daten nicht

direkt mit dem Eiausscheidungsstatus (4.3).

Pyrantel Mox./Praz

Pyrantel Mox./Praz.

Ergebnisse 117

Bei Pferd #32 ist auffällig, dass es bis zum Winter 2004, zum Zeitraum der höchsten

Eiausscheidungen, kein oder nur an der Nachweisgrenze vorhandenes, strongyliden-

spezifisches IgE hatte, dann aber einen sehr hohen Spiegel entwickelte (vor der

anthelminthischen Behandlung) (Abbildung 46).

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass sich Antikörper aller untersuchten Isotypen

gegen kleine Strongyliden nachweisen ließen. Die Pferde zeigten teilweise sehr

unterschiedliche Antikörperantworten gegen die Nematoden. Eine deutliche jahreszeitliche

Abhängigkeit konnte beim IgG4 erkannt werden, eine partielle Abhängigkeit von dem

individuellen parasitologischen Status beim IgG1. IgG2 und IgG5 waren bei vier von sechs

Pferden zum Zeitpunkt der höchsten Eiausscheidung (Januar 2004) erhöht und sanken nach

anthelminthischer Behandlung.

Zum Termin der Methylprednisoloninjektionen (4.1.1, 16.03.2003; 4.4, 05.01. bzw.

26.01.2004) waren bei allen mit dem Medikament behandelten Pferden Immunglobuline aller

Isotypen – auch IgE – gegen Cyathostominae spp. nachweisbar (vergl. Abbildung 41 bis

Abbildung 46).

Das in 4.3 mit einem steigenden parasitenspezifischen Antikörpertiter und somit mit einem

entsprechend veränderten Basophilenbesatz begründete Ausschleichen der TcA-/TcB-

Antwort im Sommer 2003 (4.2) lässt sich mit den im ELISA erhobenen Daten nicht

bestätigen.

4.6.3 ELISA zur Untersuchung des Verlaufs des Gesamt-IgE-Titers bei ausgewählten

Pferden

In der Literatur wird beschrieben, dass sich der IgE-Titer bei allergischen oder stark

verwurmten gegenüber nicht verwurmten und gesunden Individuuen erhöht. Zudem spielt

zumindest beim Menschen (HAGEL ET AL, 1993a) das Verhältnis zwischen dem

parasitenspezifischem und dem Gesamt-IgE-Spiegel eine Rolle bei der individuellen

Fähigkeit, die Parasitenlast zu bekämpfen (2.7). Es wurden daher elf Pferde (Tabelle 13) auf

den IgE-Gehalt ihrer Seren im Beobachtungszeitraum (Tabelle 11) im ELISA (3.4.6.2)

untersucht.

Exemplarisch sind in den zwei folgenden Abbildungen jeweils drei stark (Abbildung 47) und

drei schwach (Abbildung 48) verwurmte Pferde dargestellt.

Ergebnisse 118

0

100

200

300

400

500

600

17.02.03 01.04.03 24.07.03 05.08.03 06.10.03 01.12.03 19.01.04 20.02.04 19.04.04

ELIS

A-U

nits

#10 #11 #28

Abbildung 47: Gesamt-IgE-Titer bei drei stark verwurmten Pferden Dargestellt sind die Total-IgE-Titerverläufe dreier Pferde (#10, #11, #28) mit hoher Eiausscheidung (4.3) im Beobachtungszeitraum über vierzehn Monate hinweg. Die Antikörperspiegel sind in ELISA-Units (3.4.6.3) angegeben. Bei den Pferden #10 und #11 handelte es sich um Sommerekzemer, #28 war klinisch gesund. Anthelminthische Behandlungen (Pfeile, 3.4.5) fanden am 24.07.03 (Pyrantel) und am 19.01.04 (Moxidectin und Praziquantel) statt, jeweils nach der Blutentnahme.

0

20

40

60

80

100

120

140

17.02.03 01.04.03 24.07.03 05.08.03 06.10.03 01.12.03 19.01.04 20.02.04 19.04.04

ELIS

A-U

nits

#8 #20 #24

Abbildung 48: Gesamt-IgE-Titer bei drei schwach verwurmten Pferden Dargestellt sind die Total-IgE-Titerverläufe dreier Pferde (#8, #20, #24) mit niedriger Eiausscheidung (4.3) im Beobachtungszeitraum über vierzehn Monate hinweg. Die Antikörperspiegel sind in ELISA-Units (3.4.6.3) angegeben. Bei Tier #8 handelte es sich um einen Sommerekzemer, #20 und #24 waren klinisch gesund. Anthelminthische Behandlungen (Pfeile, 3.4.5) fanden am 24.07.03 (Pyrantel) und am 19.01.04 (Moxidectin und Praziquantel) statt, jeweils nach der Blutentnahme.

Es lässt sich anhand der Abbildungen feststellen, dass die Höhe des Total-IgE-Spiegels nicht

mit dem allergischen Status der Pferde, sondern vielmehr mit der Eiausscheidungsrate

korrelierte und die schwach belasteten Tiere deutlich geringere Titer hatten als die stärker

belasteten. Eine Ausnahme stellte dabei Pferd #12 dar, das trotz einer geringen Eizahl (4.3)

Pyrantel Mox./Praz.

Pyrantel Mox./Praz.

Ergebnisse 119

Titerwerte zwischen 103 und 240 ELISA-Units (3.4.6.3) aufwies. Dabei war bei acht von elf

Pferden ein Anstieg im Sommer festzustellen, bei fünf der elf zusätzlich ein Anstieg oder ein

hohes Niveau im Herbst (Oktober) (z. B. #28, Abbildung 47). Bei zehn von elf Tieren (außer

#11, Abbildung 47) konnte nach Entwurmung mit Moxidectin und Praziquantel (Januar 2004)

ein Rückgang im Gesamt-IgE beobachtet werden (Abbildung 47 und Abbildung 48).

Der Total-IgE-Spiegel der Pferde zeigte in dieser Untersuchung keinen Zusammenhang mit

dem Status als Ekzemer oder Nichtekzemer, sondern mit der individuellen Fähigkeit der

Tiere, ihre Nematodenlast zu bekämpfen (ausgedrückt in der Eiausscheidungszahl im

Beobachtungszeitraum).

4.6.4 Verhältnis von spezifischem IgE zu Gesamt-IgE

Aus der Literatur ist für den Menschen bekannt, dass der Quotient aus Gesamt-IgE und

parasitenspezifischen IgE bei Individuen mit unterschiedlichen Reaktionslagen gegen eine

Helminthenlast zusammenhängt (2.7). Dies wurde anhand der vorliegenden Daten für die hier

untersuchten Pferde überprüft.

Folgende dargestellte Quotienten wurden ermittelt: Verhältnis von Gesamt-IgE zu strongylidenspezifischem IgE

Pferd Nr. Eiausscheidungsgrad Quotient aus spezifischem und Gesamt- IgE

#1 niedrig 1 : 4,8

#8 niedrig 1 : 4,5

#20 niedrig 1 : 2,6

#10 hoch 1 : 11

#16 hoch 1 : 11

Tabelle 14: Verhältnis von strongylidenspezifischem IgE zu Gesamt-IgE Die Tabelle zeigt die Quotienten aus dem dem spezifischen IgE-Titer gegen Cyathostominae spp. (in ELISA-Units, 3.4.6.3) und dem Gesamt-IgE-Titer (ebenfalls in ELISA-Units) bei fünf Pferden über den Untersuchungszeitraum (Spezifischer Titer:Gesamt-Titer). Bei #1, #8 und #20 handelt es sich um Tiere mit geringer Eiausscheidung (4.3), bei #10 und #16 um solche mit hoher Eiausscheidung. Für #32 konnte kein Quotient ermittelt werden, da sich die IgE-Titerverhältnisse während des Beobachtungszeitraumes stark veränderten (Abbildung 45).

Es deutet sich für die Pferde mit einer geringeren Eiausscheidung ein deutlich engeres

Verhältnis aus Gesamt-IgE und strongylidenspezifischem IgE an als für Tiere mit einer hohen

Ergebnisse 120

Ausscheidungsrate.

Die Daten aus der Literatur für den Menschen konnten somit für die hier untersuchten Pferde

bestätigt werden.

4.7 Beziehungen zwischen spezifischen Sensibilisierungen der basophilen

Granulocyten und ELISA-Titern

Die ursprünglichen Fragestellungen nach einer Modulationsmöglichkeit der Basophilen durch

helminthenspezifische Antikörper erforderten eine Gegenüberstellung der funktionellen

Sensibilisierungen, ihrer Veränderungen und den entsprechenden Antikörperverhältnissen.

Dabei musste einerseits die Beeinflussung der allergen- und antigenspezifischen

Sensibilisierung durch die allergen- und antigenspezifischen Antikörpertiter untersucht

werden, andererseits eine mögliche Beeinflussung der Sensibilisierungsverhältnisse durch

nicht-antigenspezifische Immungobulinverhältnisse.

4.7.1 Beeinflussung der funktionellen, spezifischen Sensibilisierung basophiler

Granulocyten durch Immunglobuline bestimmter Spezifität

Die Modulation der Basophilen wurde durch eine Veränderung des spezifischen

Antikörpertiters angestrebt – einmal durch die Induktion oder Steigerung der

Immunglobulinproduktion gegen TcA und TcB (4.1), andererseits durch Freisetzung einer

großen Menge parasitären Antigens durch eine anthelminthische Behandlung stark

verwurmter oder unter hohem Infektionsdruck stehender Pferde (4.4). Die

Basophilenpopulation wurde durch Methylprednisolon ausgetauscht (4.1.1, 4.4.4), die

Immunglobulinrezeptoren der neuen Basophilen mit den aktuellen Antikörpern besetzt und

die neuen Sensibilisierungen (generell und spezifisch) im FIT geprüft (4.1.2, 4.2, 4.4)). Das

Antikörperspektrum wurde im ELISA auf die Titer gegen die Spezifitäten TcA, TcB und

Cyathostominae spp. (kleine Strongyliden) untersucht (4.6).

Tabelle 15 gibt fünf Pferde wieder, deren Immunglobulintiter gegen TcA und TcB zum

Zeitpunkt einer Prednisolonapplikation bekannt war.

Ergebnisse 121

Übersicht über die individuellen Sensibilisierungs- und Antikörpertiterverhältnisse bei fünf Pferden

Pferd Nr. Serumantikörper

gegen TcA Serumantikörper

gegen TcB

TcA-spezifische Sensibilisierung

nach Methylpredn.

TcB-spezifische Sensibilisierung

nach Methylpredn.

#1 IgG5: 24 U nicht nachweisbar TcA 3+ TcB 1+

#8 IgG5: 81 U nicht nachweisbar TcA 1+ TcB 1+

#16 IgG4: 17U, IgG1:14U, IgA: 37U

nicht nachweisbar TcA 3+ TcB 1+

#20 IgG4: 7U, IgG1: 9U nicht nachweisbar TcA 2+ TcB 1+

#32 IgG4: 20 U, IgG2: 12U, IgG1: 7U

nicht nachweisbar

keine spez. Sensibilisierung

keine spez. Sensibilisierung

Tabelle 15: Übersicht über die individuellen Sensibilisierungs- und Antikörpertiterverhältnisse bei fünf Pferden

Die Tabelle gibt Aufschluss über die vorherrschenden Titerverhältnisse gegen TcA und TcB (3.3.4) vor Injektion von Methylprednisolon (3.3.5, 19.01.04) und die folgende spezifische Sensibilisierung der equinen Basophilen gegen diese rekombinanten Nematodenproteine bei fünf Pferden (FIT (3.4.3) vom 09.02.04). U steht für Unit, ELISA-Einheit (3.4.6.3). Die Daten stammen aus dem Modulationsversuch durch anthelminthische Behandlung (4.4). Dabei sind nur Anti-TcA-Ak-Titer dargestellt, die eindeutig positiv – höher als 3 Units – waren.

Die Tabelle 15 zeigt, dass eine funktionelle Sensibilisierung der basophilen Granulocyten

auch möglich war, wenn die Titer der sensibilisierenden Antikörper unterhalb der

Nachweisgrenze lagen (z. B. für TcB bei den Tieren #1, #8, #16 und #20). Ein Nachweis von

freiem Serum-IgG4αTcA wie bei Pferd #32 musste nicht zu einer funktionellen

Sensibilisierung führen. Im Falle des TcB konnten zu keinem Zeitpunkt Antikörper

unabhängig welchen Isotyps nachgewiesen werden, trotzdem lagen sowohl nach der

therapeutischen (4.1.2.2) als auch nach der versuchsbedingten Prednisolongabe (4.4.4)

teilweise deutliche funktionelle TcB-Sensibilisierungen der Basophilen vor.

Aus der Höhe des in diesem System nachweisbaren Titers gegen TcA und TcB kann kein

Rückschluss auf die funktionelle Sensibilisierung gezogen werden.

Da zu den Modulationsuntersuchungen noch keine Histaminfreisetzungstests mit

Cyathostominae spp. durchgeführt worden waren, kann keine Aussage zu einer Veränderung

der diesbezüglichen spezifischen Sensibilisierung nach einer anthelminthischen Behandlung

und gegebenenfalls Methylprednisolon getroffen werden.

Ergebnisse 122

Da ein hoher strongylidenspezifischer Titer eines bestimmten Immunglobulinisotyps nach

Eliminierung und Neurekrutierung der Basophilen nicht zu einer anderen Kinetik der

funktionellen Sensibilisierungen führte als bei Tieren der gleichen Gruppe mit geringeren

Titern (4.4), wurde das Sensibilisierungsverhalten der Basophilen der in 4.4 mit

Methylprednisolon behandelten Pferde (Gruppe I und Gruppe II) nicht durch die Titerhöhe

der untersuchten Isotypen beeinflusst. Stattdessen war die Sensibilisierung von der

Vorbehandlung (vorhergehende Entwurmung oder nicht) abhängig. Dies trifft auch auf die

Sensibilisierungen nach therapeutischem Einsatz des Methylprednisolons nach der

Immunisierung zu (#1, #20) (4.1.2.2). Dass die spezifische Titerhöhe bei einer

Basophilensensibilisierung keinen entscheidenden Einfluss hat, zeigt sich ebenfalls in Tabelle

15.

Das Ausschleichen der TcA-/TcB-Antwort, das noch in 4.3 mit einer möglichen Steigerung

der parasitenspezifischen Antikörpertiter und so einer Ausverdünnung auf den Basophilen

begründet wurde, kann in dieser Form durch die im ELISA gewonnen Daten nicht bestätigt

werden, da ein Ig-Titeranstieg gegen die Cyathostominae-Antigenpräparation nach

anthelminthischer Behandlung bei den untersuchten Isotypen nicht beobachtet werden konnte.

Eine Steigerung des Titers der hier nicht untersuchten Isotypen und damit ihr Einfluss kann

jedoch nicht ausgeschlossen werden

4.7.2 Beeinflussung der funktionellen Sensibilisierungen basophiler Granulocyten

durch IgE-Titerverhältnisse

GEIBEN (2003) und KOBELT (2001) konnten jeweils im Herbst einen Rückgang der

funktionellen Sensibilisierungen gegen Cn feststellen; dieses konnte in den unter 4.3

dargestellten Untersuchungen für einige Pferde bestätigt werden. Beide Autoren vermuteten

einen über die Weideperiode parasiteninduzierten Anstieg des nicht-allergenspezifischen

Immunglobulinanteils (insbesondere IgE) auf den Basophilen und so eine Ausverdünnung der

allergenspezifischen Antikörper trotz andauerndem Kontakt mit den allergieauslösenden

Insekten.

Im Gesamt-IgE-ELISA (4.6.3) zeigten fünf von elf untersuchten Pferden im Oktober 2003

einen Anstieg oder einen erhöhten IgE-Titer (#10, #16, #24, #28, #32, Abbildung 47 und

Abbildung 48). Alle fünf waren zu diesem Zeitpunkt geringer oder nicht mehr gegen Cn

sensibilisiert als noch im Juli 2003. Pferde, die diesen Anstieg nicht aufwiesen, blieben in

ihrer Sensibilisierung unverändert (Tabelle 16).

Ergebnisse 123

Veränderungen in der funktionellen Sensibilisierung gegen Culicoides nubeculosus (Cn) von Juli bis Oktober 2003 bei sieben Pferden mit unterschiedlichen Gesamt-IgE-Titerverhältnissen

Pferd Nr.

Serum-

IgE in

Units im

Juli 2003

Cn-spezifische

Sensibilisierung

im Juli 2003

Serum-

IgE in

Units im

Okt. 2003

Cn-spezifische

Sensibilisierung

im Oktober

2003

#10 548 3+ 550 2+

#16 83 2+ 133 negativ (0)

#24 88 1+ 114 negativ (0)

#28 85 1+ 350 negativ (0)

#32 19 1+ 240 negativ (0)

#1 22 3+ 20 3+

#8 80 2+ 62 2+

Tabelle 16: Veränderungen in der funktionellen Sensibilisierung gegen Culicoides nubeculosus (Cn) von Juli bis Oktober 2003 bei sieben Pferden mit unterschiedlichen Gesamt-IgE-Titerverhältnissen

Die Tabelle zeigt fünf Pferde (#10, #16, #24, #28, #32) mit den Cn-spezifischen Sensibilisierungen ihrer basophilen Granulocyten (in Sensibilisierungsgraden, 3.4.3.2) und mit dem Gesamt-IgE-Titer in ELISA-Units (3.4.6.3) im Juli und im Oktober 2003, die im Oktober eine Erhöhung oder einen gleich bleibend hohen Gesamt-IgE-Titer aufwiesen (4.6.3). Zum Vergleich sind zwei weitere Pferde aufgeführt (#1, #8), bei denen kein Anstieg oder ein Absinken des Total-IgE-Spiegels beobachtet werden konnte. Bei den fett und kursiv gedruckten Pferden (#10, #1 und #8) handelt es sich um klinische Ekzemer, die anderen sind klinisch gesund, jedoch funktionell sensibilisiert.

Bei Tier #16 konnte zu diesem Termin auch ein Anstieg des Cyathostominae-spezifischen

IgE-Spiegels nachgewiesen werden (Abbildung 46).

Möglicherweise hat also der Anstieg des Gesamt-IgE-Titers im Herbst einen Einfluss auf die

eine Reduktion der Sensibilisierungsgrade der basophilen Granulocyten. Ein Anstieg im

Sommer hat keinen reduzierenden Effekt (#8, Tabelle 16 und Abbildung 48).

Diskussion 124

5 Diskussion

Der Mechanismus der Typ-I-Hypersensitivitätsreaktion tritt in zwei Formen auf: als

physiologisch reguliertes Mittel zur Bekämpfung von Parasiten und als pathologisch der

Kontrolle entglittene allergische Erkrankung. Dabei kommen beide Formen oftmals innerhalb

desselben Organismus vor. Vorhergehende Untersuchungen (LYNCH ET AL., 1993b, HAGEL ET

AL., 1993a, STEIN, 1999) ergaben eine mögliche gegenseitige Beeinflussung, die in dieser

Arbeit näher erforscht werden sollte. Dazu standen Islandpferde zur Verfügung, von denen

ein Teil unter den Symptomen des sog. „Sommerekzems“ litt, einer Typ-I-Allergie auf

Bestandteile blutsaugender Insekten, insbesondere Culicoides nubeculosus. Ihr

Sensibilisierungsstatus gegen verschiedene Insekten war durch einen Funktionellen in-vitro-

Test (FIT) bekannt und über einen längeren Zeitraum bereits dokumentiert (GEIBEN, 2003).

Da die Tiere in einer Herde in Weidehaltung gehalten wurden, war eine Belastung der Pferde

mit Helminthen gegeben. Mit dieser Ausgangslage sollten Zusammenhänge der gegenseitigen

Beeinflussung der Helminthen und der Sensibilisierung gegen die Auslöser des

Sommerekzems untersucht werden.

5.1 Zur paradoxen Reaktion der Pferde im Rahmen der Immunisierung mit den

rekombinanten Parasitenproteinen TcA und TcB

Durch Zusammenarbeit mit einer an Schafnematoden forschenden Gruppe (3.3.4) standen

zwei rekombinante Proteine aus Trichostrongylus colubriformis zur Verfügung („TcA“ und

„TcB“). Vorausgehende Tests hatten gezeigt, dass einige der Isländer im FIT auf diese

Proteine reagierten, sie also bereits Kontakt mit diesen oder kreuzreagierenden Proteinen

hatten, ohne darauf klinische Symptome einer „Wurmallergie“ zu zeigen. Da aus anderen

Arbeiten der basophileneliminierende Effekt von Glucocorticoiden bekannt war (TIZARD,

2004, BRUENNLEIN, 2001), sollten die Pferde gegen TcA und TcB immunisiert werden,

dadurch deren spezifischer Antikörperspiegel angehoben, durch Methylprednisolon die bereits

sensibilisierte Basophilenpopulation eliminiert und durch neue, naive Basophile ersetzt

werden. Die neuen Basophilen sollten dann durch ein verändertes Spektrum der Antikörper

auf der Oberfläche ein neues, möglicherweise anti-TcA- und anti-TcB-geprägtes

Sensibilisierungsmuster erhalten.

Die Pferde reagierten – im Gegensatz zu den beiden ersten Tieren, an denen die

Unschädlichkeit der Immunsisierung überprüft werden sollte – völlig unerwartet auf die

intramuskuläre Injektion der rekombinanten Proteine. Eine Hypermotorik des Darmes,

Diskussion 125

hämorrhagische Durchfälle und sekundäre Kreislaufschocks waren deutliche Hinweise auf

eine am Darm lokalisierte, dort generalisierte Mastzelldegranulation im Rahmen einer

überschießenden Typ-I-Reaktion. Durch die freigesetzten Mediatoren wurden eine verstärkte

Darmmotilität, ein Flüssigkeitsefflux aus den Darmkapillaren und weiterhin eine

hämorrhagische Diathese aus diesen Gefäßen verursacht. Das ausgedehnte Reaktionsgebiet

führte zu einem massiven Flüssigkeitsabzug aus dem Blutgefäßsystem und so zu sekundären

Schocksymptomen. Das Ergebnis der Sektion eines Pferdes (#5), das die Immunisierung trotz

Intensivtherapie nicht überlebte, unterstreicht dies. Das sehr schnelle Einsetzen der

Symptomatik (ab 10 min.) bei zwei der Pferde (#18 und #5) kann möglicherweise auf eine

Verletzung winziger Blutgefäße bei der intramuskulären Injektion zurückzuführen sein, so

dass die Immunisierungsproteine vergleichsweise schnell in den Kreislauf und damit zum

Darm gelangten. Bei einem Großteil der anderen behandelten Tiere erfolgte die Reaktion erst

bedeutend später (z. B. #20, ebenfalls mit schwerer Symptomatik, aber erst ca. sechs Stunden

p. med. beginnend).

Die Schwere der Antwort auf die vergleichsweise geringe Proteinmenge von je 100 µg TcA

und TcB pro Tier lässt sich eventuell mit einem im FIT beobachteten Phänomen begründen.

In diesem Test konnte bei vier von acht überlebenden und fünf von zwölf Kontrollpferden

eine Histaminfreisetzung in hohen TcB-Konzentrationen nicht induziert werden, dafür jedoch

mit steigender Verdünnung umso höhere Freisetzungen. Dabei konnten noch in

Konzentrationen von 4x10-4 oder sogar 4x10-5 µg/ml (dies entspricht 0,4 bzw. 0,04 ng/ml)

sehr hohe Freisetzungsraten erreicht werden (siehe auch 4.1.2.2). Setzte man ein

angenommenes Pferdegewicht von 350 bis 400 kg mit einer entsprechenden Menge Wasser

gleich, in der sich 100 µg TcB verteilten, entspräche dies in etwa der Größenordnung der

Konzentration, in der im FIT die stärksten Histaminfreisetzungen zu beobachten waren. So

könnten auch die geringen Mengen des Proteins noch eine dramatische Reaktion ausgelöst

haben. Es konnten für die mit TcA und TcB immunisierten Pferde (TcA/TcB-Pferde) zwar

keine Ausgangswerte im FIT erhoben werden, jedoch ist u. U. in Annäherung eine Folgerung

aus den unbehandelten Kontrollpferden erlaubt. Vier von neun Pferden zeigten ein schweres

klinisches Bild einer generalisierten Mastzelldegranulation an Colon und Caecum. Denkbar

ist, dass sie im FIT das inverse TcB-Phänomen präsentiert hätten, denn das Verhältnis der

Pferde mit schweren zu denen mit leichteren Symptomen der Unverträglichkeit entsprach dem

der Kontrollgruppe, in der fünf von zehn Tieren im FIT auf TcB invers (nicht oder schwach

auf höhere Antigenkonzentrationen, jedoch sehr stark auf niedrigere Antigenmengen)

Diskussion 126

reagierten. Vorstellbar ist daher eine Kreuzreaktion, da TcA und TcB hohe Homologien zu

Proteinen aus anderen Nematoden aufweisen (SHAW ET AL., 2003). Das Verschwinden des

inversen Phänomens bei TcB im FIT im Laufe des Sommers (4.3) lässt vermuten, dass ein

Immunisierungsversuch einige Monate später ohne klinische Symptomatik oder doch

bedeutend milder abgelaufen wäre, sollten die Typ-I-Reaktionen der Pferde auf TcB-

induzierte Mastzelldegranulationen zurückzuführen sein.

Ähnlich heftige Reaktionen auf injiziertes Parasitenantigen beschrieben JACOBSEN ET AL.

(1995), allerdings injizierten sie natürlich infizierten Schweinen einen Extrakt aus Ascaris

suum, keine definierten Proteine eines Parasiten. Mit rekombinanten Helminthenproteinen

sind erfolgreich Vakzinierungen an Tieren gelungen (z. B. TIZARD, 2004).

5.2 Zur Modulation der Sensibilisierung der basophilen Granulocyten durch

anthelminthische Behandlung der Pferde

Um die Pferde nicht in einem erneuten Immunisierungsversuch zu gefährden, sollte statt einer

Immunisierung gegen rekombinante Antigene eine anthelminthischen Behandlung der

teilweise stark mit Nematoden belasteten Tiere durchgeführt werden, um den

parasitenspezifischen Antikörpertiter noch weiter anzuheben. Die basophilen Granulocyten

sollten dann eine Woche später durch Methylprednisolon eliminiert und die aktuell

angepassten Sensibilisierungsspektren funktionell im FIT untersucht werden.

Bezüglich der antigen-, allergen- und antikörpervermittelten Histaminfreisetzungen konnte

festgestellt werden, dass bei fast allen Tieren die Sensibilisierungen deutlich zurückgegangen

war. Teilweise konnten sogar negative Releaseergebnisse beobachtet werden. Dabei ließen

sich anhand der Stärke des Reaktionsrückganges vier Gruppen unterscheiden, nämlich jeweils

stark und schwach verwurmte Tiere bei Ekzemern und Nichtekzemern. Die verminderte

Reaktionsfähigkeit muss keineswegs durch einen plötzlichen Verlust an sensibilisierenden

Antikörpern auf der Basophilenoberfläche (Hypo- oder Desensibilisierung) bedingt sein. Eine

Erklärung dieser Beobachtung ergibt sich aus der Aktivierung eines möglichen

Schutzmechanismus, der bei sehr hoher Antigenanflutung aktiv werden muss, um eine

überschießende Reaktion des Organismus auf die an Mastzellen und Basophilen

bindungsfähigen Parasitenantigene zu vermeiden. SATTI ET AL. (2004) und BERHE ET AL.

(1999) beschreiben Symptome solcher überschießender, nicht ausreichend kompensierter

Typ-I-Mechanismen bei Kindern, z. B. Urticaria, Ödeme oder Übelkeit.

Eine Möglichkeit der Hemmung der Typ-I-Reaktion besteht in der gleichzeitigen

Diskussion 127

Kreuzvernetzung eines an einen aktivierenden Fcε-Rezeptor I (FcεRI) gebundenen IgE-

Moleküls und eines IgG-Immunglobulins, das an einen inhibierenden Rezeptor mit der

Bezeichnung Fcγ-Rezeptor IIb (FcγRIIb) gebunden hat. Fcγ-Rezeptoren (FcγRI, FcγRII,

FcγRIII) sind Zelloberflächenmoleküle, die den aktivierten Fc-Teil von Immunglobulinen des

Isotyps G binden. Sie binden hauptsächlich immunkomplexiertes IgG, aber auch monomeres

IgG (FcγRI), und werden u.a. von Phagocyten, B-Zellen, NK-Zellen oder auch Mastzellen

und Basophilen exprimiert. DAERON ET AL. (1995) konnten bei Nagern nachweisen, dass eine

Coligation von FcεRI und FcγRIIb eine Degranulation von Mastzellen verhindern kann, auch

wenn sie über eine Kreuzvernetzung von FcεRI-ständigen Immunglobulinen induziert wird.

Dabei ist die Summe aus aktivierenden oder hemmenden Signalen entscheidend für die

Reaktion der Zelle. Außerdem kann nicht nur IgG an den niederaffinen FcγRIIb binden,

sondern auch IgE (UJIKE ET AL., 1999). Mäuse, die diesen inhibierenden Rezeptor nicht

besitzen, sind von Hypothermie und Tod im Rahmen einer IgG- und IgE-vermittelten

systemischen anaphylaktischen Reaktion schwerer betroffen als Tiere mit diesem Rezeptor

(TAKAI ET AL., 1996, UJIKE ET AL., 1999). Dieser Effekt der FcγRIIb-Defizienz bei IgE-

vermittelten Reaktionen spiegelt nach TAKIZAWA ET AL. (1992) die Fähigkeit von IgE wider,

auch in Immunkomplexen an FcγRIIb binden zu können. AGGARWAL und HOLMES (2000)

entdeckten Hinweise darauf, dass das Fcγ-Rezeptorensystem auch beim Pferd vorkommt.

Vor diesem Hintergrund ist es denkbar, dass die große Menge an therapiebedingt

freigesetztem Parasitenantigen nicht nur über parasitenspezifisches IgE oder IgG auf

aktivierenden Rezeptoren (FcεRI, FcγRI, FcγRIIa und III) gebunden wurde, sondern auch

über hemmende Rezeptoren wie den FcγRIIb. Es resultierte eine verminderte Aktivierbarkeit

oder gar „Stilllegung“ der basophilen Granulocyten und damit eine verminderte

Freisetzbarkeit von Histamin durch Stimuli in Form von Antikörpern (gαh(IgG), anti-IgE)

oder Allergenen bzw. Antigenen (z. B. Cn, TcA). Aus diesem Denkmodell ist eventuell auch

eine Begründung der Gruppenbildung in stark und schwach verwurmte Tiere bzw. in

Allergiker und klinische Nichtallergiker abzuleiten. Die Histaminfreisetzung über anti-IgG

(gαh, Abbildung 24) zeigte sieben Tage nach anthelmitischer Behandlung eine deutliche

Hemmung bei den stark verwurmten Ekzemern, die bei den stark belasteten Nichtallergikern

weniger stark ausgeprägt war. Schwach verwurmte Allergiker und gesunde Tiere

unterschieden sich in der vergleichsweise mäßigen Reduktion nicht. Bei den Tieren mit

geringer Eiausscheidung könnte die Immunkomplexbindung über hemmende Rezeptoren

aufgrund der geringeren Antigenmenge weniger stark ausgeprägt gewesen sein, so dass nach

Diskussion 128

Stimulation mit anti-IgG (gαh) die Aktivierungssignale über FcγRI und III gegenüber den

hemmenden überwogen und die Zellen nachweisbar degranulierten. Bei den stark verwurmten

Allergikern lag möglicherweise eine resultierende Hemmung durch eine hohe Anzahl von

gebundenen Komplexen über FcεRI und FcγRIIb vor, hier könnten der Einfluss der

aktivierenden Fcγ-Rezeptoren (aus dem allergischen Status bedingt) zugunsten der Fcε-

Rezeptoren verschoben gewesen sein, so dass eine Stimulation durch anti-IgG nicht erfolgen

konnte. Dafür spricht auch die höhere IgG-vermittelte Freisetzung bei den stark verwurmten

Nichtallergikern. Die Summe der aktivierenden Fc-Rezeptoren überwiegt eine Hemmung

durch Immunkomplexe (z. B. aufgrund einer niedrigeren Anzahl an FcγRIIb).

Betrachtet man die Veränderung des anti-IgE-vermittelten Release (Abbildung 25), so

bemerkt man eine bei verwurmten Ekzemern und Nichtekzemern gleichermaßen aufgetretene

Hemmung der Histaminfreisetzung. Die schwach verwurmten Ekzemer waren auf ein Drittel

der Ausgangsfreisetzungen bei unverändertem oder gesteigertem Gesamthistamingehalt

reduziert, während die kaum belasteten, nicht allergischen Pferde in ihrer Histaminfreisetzung

nur wenig vermindert waren. Auch hier kann das Modell der FcγRIIb-vermittelten Hemmung

angewandt werden. Die zahlreichen, über IgE komplexierten und an FcγRIIB gebundenen

Antigenkomplexe unterdrückten eine Aktivierung der Zelle bei den Tieren mit hoher

Eiausscheidungsrate, die eine dementsprechend hohe Antigenanflutung hatten. Bei den

schwach verwurmten Nichtallergikern war die Hemmung aufgrund der geringeren Anzahl der

gebundenen Komplexe nur schwach ausgeprägt, bei den Allergikern mit niedrigen Eizahlen

schien die Hemmung der an Fcγ-RIIb gebundenen Komplexe möglicherweise wegen einer

erhöhten Anzahl dieser Rezeptoren ausgeprägter zu sein. Nach TRIDANDAPANI ET AL. (2002)

werden Fcγ-Rezeptoren IIb durch IL-4, wie es auch in einer allergischen Situation vermehrt

vorkommt, heraufreguliert. In diesem Zusammenhang jedoch widersprach das Vorhandensein

einer erhöhten Anzahl von hemmenden Rezeptoren bei Allergikern dem klinischen Bild.

DOLEN (2003) weist in diesem Zusammenhang darauf hin, dass die bedeutenden Unterschiede

zwischen allergen- und antigenspezifischem IgE dazu führen, dass Allergiker möglicherweise

vergleichsweise mehr IgE an der Oberfläche ihrer Basophilen binden können. Im Falle der

Antigenanflutung nach Entwurmung könnten auch mehr IgE-Immunkomplexe gebunden

werden, die gegenüber nichtallergischen Tieren zu einer vermehrten Hemmung über Fcγ-

RIIb-Bindung führen, so dass eine Reduktion in der Stärke zwischen stark verwurmten

Pferden und nichtallergischen Schwachbelasteten entsteht.

Die Tatsachen, dass die Stärke der Freisetzungsminderung mit dem vorhergehenden

Diskussion 129

Eiausscheidungsstatus in Zusammenhang stand, und dass bei einem mit den gleichen

Anthelmintika behandelten Kontrollpferd überhaupt keine Veränderung in der Reagibilität

gegen anti-IgE oder anti-IgG (gαh) zu beobachten war, sprechen dafür, dass es sich bei den

festgestellten Effekten nicht um eine (Neben-)Wirkung der Medikamente, sondern um eine

Reaktion auf die Antigenfreisetzung durch die absterbenden Helminthen handelte. Dies

bestätigen auch SATTI ET AL. (2004) nach ähnlichen Beobachtungen beim Menschen.

Das Konzept der hemmenden Fcγ-Rezeptoren trägt auch zu einer Erklärung des inversen

Releasephänomens im Falle des TcB bei, bei dem in hohen Proteinkonzentrationen nur ein

schwacher bis gar kein, in steigenden Verdünnungen ein zunehmender Histaminrelease im

FIT zu sehen war. Eine Hemmung der Degranulation der Basophilen ist bei hohen

Konzentrationen durch Bindung des Proteins an relativ viele FcγRIIb-ständige, TcB-

spezifische oder kreuzreagierende Antikörper denkbar. Bei zunehmender Ausverdünnung

wird die Zahl der angesprochenen FcγRIIb-Rezeptoren innerhalb der Basophilenpopulation

geringer, der Einfluss der aktivierenden Rezeptoren überwiegt gegenüber den hemmenden,

und die Zahl der degranulierenden Effektorzellen und damit die Menge des ausgeschütteten

Histamins steigt. Nach Unterschreiten der optimalen Konzentration nimmt die

Freisetzungsrate wieder ab.

Das Verhalten der Basophilen des Pferdes #22, evtl. auch der Pferde #27 und #33, deren

allergenspezifische Sensibilisierungen sich nach der anthelminthischen Behandlung

kurzfristig oder dauerhaft verstärkten, lassen unter Umständen Rückschlüsse auf die Berichte

von Pferdebesitzern zu, die von neu auftretenden allergischen Erkrankungen nach

anthelminthischer Behandlung berichten. Zwar bedeutet die induzierte Sensibilisierung nicht,

dass das Tier an der allergischen Dermatitis erkrankt (KOBELT, 2001, GEIBEN, 2003),

allerdings kann eine Sensibilisierung die entscheidende Grundlage für eine Erkrankung

darstellen. Warum diese Pferde so anders als die anderen reagierten, ist nicht klar schlüssig.

Möglicherweise trat hier beim Pferd mit Induktion von Sensibilisierungen nach

anthelminthischer Behandlung ein Mechanismus in Erscheinung, von dem HAGEL ET AL.

(1993a), STEIN (1999) und LYNCH ET AL. (1997) bereits beim Menschen berichteten (2.7).

YAMAGUCHI ET AL. (1996) beschreiben auf Stimulation mit anti-IgE histaminfreisetzende und

nichthistaminfreisetzende Basophile (releasing und nonreleasing basophils) für den

Menschen. Durch Kultivierung dieser Zellen über drei bis sieben Tage mit IL-3 konnten

ursprünglich nichtfreisetzende Basophile in freisetzende moduliert werden. Eventuell

unterlagen die drei Pferde im Zuge der Entwurmung einem starken IL-3-Einfluss und so die

Diskussion 130

Basophilenpopulation einer (in zwei Fällen kurzfristigen) Umwandlung von ursprünglich

wenig reagiblen zu stärker reagiblen Zellen. Dazu könnten die Beobachtungen von LANTZ ET

AL. (1998) passen, die eine unterstützende Funktion von IL-3 in der erfolgreichen

Bekämpfung von Nematoden durch Förderung von basophilen Granulocyten beschrieben.

5.3 Zur Modulation der Sensibilisierung der basophilen Granulocyten durch

Methylprednisolon

Zu drei verschiedenen Zeitpunkten wurde den Pferden Methylprednisolon injiziert,

therapeutisch nach der Immunisierung mit den rekombinanten Proteinen TcA und TcB, zur

Modulation der Basophilen nach anthelminthischer Behandlung und zur Überprüfung des

reinen Cortisoneffektes ohne vorhergehenden Einfluss durch Immunisierung oder

Entwurmung. Jedes Mal konnte die Eliminierung der basophilen Granulocyten innerhalb von

sechs bis zwölf Stunden nachgewiesen werden (4.1.2.1, 4.4.4). Die Sensibilisierungen

unterschieden sich in allen drei Ansätzen von den Ausgangswerten.

Bei den Pferden der Kontrollgruppe II des Modulationsversuches durch anthelminthische

Behandlung (3.4.1.2, 4.4.5), die zur Überprüfung des Einflusses der Methylprednisolon-

injektion ohne vorhergehende Entwurmung das Corticosteroid erhalten hatte, wiesen die

basophilen Granulocyten zwei Wochen nach der Applikation eine erhöhte Reagibilität gegen

die eingesetzten Stimulantien (Ak, Ag, Allergene) auf, die nach den hemmenden Einflüssen

der anthelminthischen Behandlung nicht mehr vorhanden waren. Die vermehrte Sensibilität

kann sich unter Umständen aus einer Studie von YAMAGUCHI ET AL. (2001) ableiten lassen.

Die Gegenwart von Dexamethason und Methylprednisolon senkte die Anzahl der

oberflächenständigen Fcε-Rezeptoren I bei Mastzellen in vitro, auch in der Gegenwart von

IgE, das normalerweise die Expression von FcεRI fördert. Eine antigenvermittelte

Degranulation wurde deutlich vermindert oder verhindert. Nach Absetzen der Corticosteroide

lag bei Gegenwart von IgE ein Missverhältnis zwischen FcεRI und IgE vor, so dass die

Rezeptorexpression in einem Reboundphänomen hochgefahren wurde. Eine gesteigerte

Rezeptorexpression konnte möglicherweise im Falle der Kontrollgruppe II zu einer

gesteigerten Sensibilisierung durch vermehrt gebundene sensibilisierende IgE führen.

Dieser Reboundeffekt blieb bei der Versuchsgruppe I, die eine Woche nach der Entwurmung

Methylprednisolon bekam, aus. Dies kann zwei Ursachen haben. Einerseits ist denkbar, dass

die neue Sensibilisierung der Basophilen bei Ausverdünnung der allergenspezifischen

Antikörper in einem Rahmen erfolgreich war, in dem der Effekt des Rebound abgefangen

Diskussion 131

wurde (die vermehrten aktivierenden Rezeptoren wurden auch mit Ak gegen Parasiten

beladen). Fast ausnahmslos wurde das Sensibilisierungsniveau gegen diverse Allergene nicht

erhöht, sondern sank noch ab. Da keine Daten über die folgenden Wochen vorliegen, konnte

die Dauer dieser Erscheinung nicht erfasst und so darüber keine Aussage getroffen werden.

Eine zweite Interpretationsmöglichkeit besteht darin, dass die durch die freigesetzten

Parasitenantigene aktivierten Hemmmechanismen zum Schutz des Organismus ausreichten,

um die zum Rebound führenden Reaktionen zu unterbinden. JABARA ET AL. (1993)

beschreiben einen sequentiellen Isotypenklassenwechsel unter dem Einfluss von

Hydrocortison bei mit Il-4 behandelten B-Zellen. Diese Zellen veränderten ihre

Immunglobulinproduktion von IgM über IgG4 zu IgE. IgG4 wird als bedeutend in der

Modulation von Typ-I-Reaktionen auch im Sinne einer Hyposensibilisierung angesehen

(STERN ET AL., 2004, PLATT-MILLS ET AL., 2004). Möglicherweise hat die anthelminthische

Behandlung und die vergleichsweise hohe Menge parasitären Antigens zu einer kurzfristigen,

deutlichen IL-4-Steigerung geführt, so dass entsprechend beeinflusste B-Zellen unter dem

folgenden Methylprednisolon einen modulatorischen Klassenwechsel vollzogen und die

folgende verminderte Reagibilität sich auch auf die Allergene erstreckte. Eine Veränderung

des strongylidenspezifischen IgG4-Titers konnte im ELISA nicht nachgewiesen werden.

Die therapeutisch mit Methylprednisolon behandelten TcA-/TcB-Pferde (4.1.1) zeigten

ebenfalls kein Reboundphänomen, sondern eine deutlich verminderte oder ausbleibende

Reaktion auf Allergene bei erhaltender Reagibilität gegen anti-IgG (gαh), anti-IgE und

individuell TcA und TcB. Bedacht werden muss jedoch, dass diese Daten nicht vierzehn

Tage, wie in den anderen Fällen, sondern sieben Tage nach der Cortisonapplikation erhoben

wurden. Falls zu diesem Zeitpunkt die von YAMAGUCHI ET AL. (2001) beschriebene

Hemmung der FcεRI-Expression noch wirksam war, so könnte die TcA- und TcB- vermittelte

Degranulation auf eine Bindung über aktivierende Fcγ-Rezeptoren erfolgt sein.

Auch wenn die in den Modulationsversuchen erhobenen Daten in den ersten drei Wochen auf

eine erfolgreiche Modulation der Basophilen im Sinne einer reduzierten

Allergensensibilisierung schließen ließen (4.1.2.2, 4.4.4), so zeigten doch die

Langzeituntersuchungen (und im Falle der Immunisierung mit TcA und TcB die

Untersuchung der Kontrollpferde, 4.3), dass die veränderte Reagibilität nicht auf Dauer

erhalten werden konnte. Bezüglich der mindestens zwei Wochen lang reduzierten

Sensibilisierungsgrade bei den zuerst entwurmten und dann mit Methylprednisolon

behandelten Pferden wäre eine Information über die Reagibilität gegen die Cyathostominae-

Diskussion 132

Präparation interessant gewesen (4.5), ob sich im Gegensatz zu den Ausgangswerten die

Sensibilisierung gegen kleine Strongyliden tatsächlich verstärkt hatte und somit wirklich von

einem verschobenen Sensibilisierungsspektrum zu sprechen war.

Sowohl das Ausschleichen der TcA-/TcB-spezifischen als auch die schnelle Rückkehr der

allergenspezifischen Sensibilisierung kann auf den natürlichen Austausch von Basophilen

oder auf einen Wechsel im Antikörperspektrum auf der Oberfläche der Effektorzellen

zurückzuführen sein. Die Bindung zwischen IgE und Fcε-Rezeptor I ist zwar aufgrund der

hohen Affinität sehr hoch, MCDONNELL ET AL. (2001) beschrieben aber eine Halbwertszeit

von ca. zwei Wochen für über FcεRI gebundene Immunglobuline. Die mittlere In-vitro-

Überlebenszeit der Basophilen wird je nach Autor zwischen zwei Wochen (YAMAGUCHI ET

AL., 1992) und mehr als neunzig Tagen (FAVRE ET AL., 1990) angegeben, über In-vivo-

Verhältnisse liegen keine Daten vor. Dass auch im Winter trotz Allergenkarenz ausreichend

sensibilisierende allergenspezifische Antikörper vorhanden sind, zeigen die in 4.1.2.2 und 4.4

gewonnen Daten. Auch KOBELT (2001) berichtet in diesem Zusammenhang von an

Sommerekzem erkrankten Pferden, die auch nach fünfzehn Jahren Allergenkarenz noch

deutliche Sensibilisierungen der basophilen Granulocyten aufwiesen.

Die Tatsache, dass von den acht überlebenden Pferden sechs bis in das Jahr 2004 hinein nur

geringe Eimengen ausschieden, mag mit der Beobachtung von SHAW ET AL. (2003)

übereinstimmen, die eine erhöhte Resistenz von Schafen gegen Trichostrongylus

colubriformis feststellten, wenn diese vermehrt spezifisches IgE gegen TcA aufwiesen (dabei

zeigten sie keinerlei Anzeichen einer Typ-I-Reaktion gegen diesen Parasiten) (siehe auch 5.4).

Bezogen auf die Releasedaten der unbehandelten Kontrollpferde konnte kein Zusammenhang

zwischen Eiausscheidung und Sensibilisierung gegen TcA oder TcB gefunden werden.

5.4 Zum Isotypen-ELISA

In der Literatur sind zumeist nur Untersuchungen zu IgG(T) (inzwischen IgG3 und IgG5,

WEGE, 2004) bezüglich der Antikörperantwort gegen Helminthen zu finden (z. B. PATTON ET

AL., 1978, WEILAND ET AL., 1991, DOWDALL ET AL., 2002, 2004, PROUDMAN ET AL., 1996,

1997, siehe auch 2.7). In dieser Arbeit wurden ELISA-Systeme für den Nachweis der equinen

Isotypen IgG1, IgG2, IgG4, IgG5, IgA und IgE etabliert. Mit ihnen wurden Seren

ausgewählter Versuchspferde auf Antikörperantworten gegen die rekombinanten Proteine

TcA, TcB und einen Extrakt aus Cyathostominae spp. sowie auf ihren Gesamt-IgE-Gehalt im

Diskussion 133

ELISA untersucht.

Im Gesamt-IgE-ELISA konnte festgestellt werden, dass Pferde mit einer hohen

Eiausscheidungsrate (4.3) einen deutlich höheren Titer hatten als schwach verwurmte Pferde.

Es war kein Zusammenhang zwischen dem Status als klinischer Allergiker oder als

nichtallergisches Pferd erkennbar. Damit widersprechen die Daten für das Pferd der gängigen

Meinung in der Humanmedizin, dass Allergiker höhere IgE-Spiegel haben (JANEWAY ET AL.,

2002), auch wenn bekannt ist, dass mit Endoparasiten belastete Individuen ähnlich hohe Titer

haben wie Allergiker (SATTI ET AL., 2004). LYNCH ET AL. (1993a) und NIELSEN ET AL. (1994)

konnten jedoch bestätigen, dass das Verhältnis zwischen parasitenspezifischem und Gesamt-

IgE Einfluss auf die individuelle Fähigkeit zur Bekämpfung der Helminthenlast hat. Es

konnte ein enges Verhältnis zwischen IgE gegen kleine Strongyliden und dem Gesamttiter bei

schwach verwurmten Pferden beobachtet werden, dagegen ein weiteres bei den stark

verwurmten Pferden. Eine Beziehung zwischen verminderter Parasitenlast und allergischer

Erkrankung, wie sie LYNCH ET AL. (1998) beschrieben, konnte hier nicht erkannt werden.

KOBELT (2001) und GEIBEN (2003) vermuteten, dass es sich bei der auch in dieser Arbeit

festgestellten Verminderung der allergenspezifischen Sensibilisierungen im Herbst

möglicherweise um eine Ausverdünnung der sensibilisierenden Antikörper auf den

Basophilen durch andere, ebenfalls parasitenspezifische Antikörper handelt (oder eine

entsprechende langsame Änderung der Basophilenpopulation), die im Laufe des Sommers

aufgrund der steigenden Nematodenbürde induziert werden. Eine Erhöhung des Titers gegen

kleine Strongyliden konnte bei keinem Isotyp selektiv beobachtet werden, jedoch zeigte sich

bei fünf von elf Pferden eine Erhöhung des Gesamt-IgE-Spiegels. Dieselben fünf Pferde

präsentierten im FIT eine Reduktion der allergenspezifischen Sensibilisierungen, wogegen

Pferde mit unveränderten IgE-Spiegeln keine Verminderung der Reagibilität zeigten (Tabelle

16). Ein Zusammenhang, wie ihn KOBELT (2001) und GEIBEN (2003) vermuteten, ist somit

möglich.

Die IgG1-Spiegel gegen Cyathostominae spp. als Vertreter der Parasitenantigene verhielt sich

hier in vier von sechs Fällen umgekehrt als in der Literatur beschrieben (z. B. MANJILI ET AL.,

1998, GILL ET AL., 1993). Statt hohe spezifische Titer bei einer geringen Wurmbürde

aufzuweisen und niedrige bei einer starken Verwurmung, konnten für jeweils zwei der drei

viel oder wenig Eier ausscheidenden Pferde tendenziell das gegenteilige Verhalten beobachtet

werden. Allerdings ist es eher unwahrscheinlich, dass beim Pferd die mit IgG1, IgG2 etc.

bezeichneten Isotypen auch gleiche Funktionen aufweisen, wie die Isotypen gleicher

Diskussion 134

Bezeichnung bei anderen Spezies (WEGE, 2004). Für das IgG5, das bei den beschriebenen

Untersuchungen auf IgG(T) (eigentlich IgG3 und IgG5) untersucht wurde, konnten die Daten

von PROUDMAN ET AL. (1997) bestätigt werden. Bei fünf von sechs Pferden sank der Titer

nach einer anthelminthischen Behandlung und war bei vier von sechs zum Zeitpunkt der

stärksten Verwurmung erhöht. Die Entwicklung eines vorher nicht nachweisbaren IgG5-

Titers bei einem im Untersuchungszeitraum drei bis dreieinhalbjährigen Pferd widerspricht

den Bobachtungen von WEILAND ET AL. (1991), die bereits bei Fohlen einen IgG(T)-Titer

gegen kleine Strongyliden feststellten. Möglicherweise hat diese Gruppe IgG3 in diesem

Zusammenhang nachgewiesen, das hier nicht mit untersucht wurde.

Für das rekombinante Protein TcA konnten bei allen immunisierten Pferden zwei Wochen

nach der Immunisierung Antikörper aller Isotypen mit Ausnahme des IgE nachgewiesen

werden. Ein TcA-/TcB-Pferd und ein unbehandeltes Kontrollpferd hatten auch ohne

Immunisierung einen natürlich induzierten Titer. Möglicherweise war auch IgE-anti-TcA

nach der Immunisierung vorhanden, aber konnte im ELISA aufgrund einer Verdrängung

durch andere, in höheren Konzentrationen vorliegende TcA-spezifische Antikörpern nicht

nachgewiesen werden. Auffällig ist das sehr schnelle Abfallen der Titer bei den mit

Methylprednisolon behandelten TcA-/TcB-Pferden, bei der diesbezüglich unbehandelten #32

hielten sich die Titer länger. Vielleicht fand dies seine Ursache in einer durch das Cortison

verminderten Antikörperinduktion (UCHAKIN ET AL., 2002).

Die Verminderung der TcA-spezifischen Sensibilisierungen im FIT ist nur unwahrscheinlich

durch den Titerabfall bedingt, denn es konnten Sensibilisierungen auch ohne nachweisbaren

Titer induziert werden (Tabelle 15), sondern vermutlich durch eine langsam erfolgende

Ausverdünnung und Ersetzung durch Antikörper anderer Spezifitäten. Die Sensibilisierungen

und ihre Stärke sind also nicht abhängig vom Antikörpertiter im Serum. Dies wird auch durch

das rekombinante Protein TcB unterstrichen, für das in keinem Fall Antikörper nachgewiesen

werden konnten, gegen das aber eine teilweise sehr hohe Sensibilisierung vorhanden war.

Dass diese Aktivierung der basophilen Granulocyten unspezifisch erfolgte, kann dadurch

ausgeschlossen werden, dass nur ein Teil der Pferde in einem bestimmten

Konzentrationsbereich reagierte. Die Rückkehr der Reagibilitäten auf beide Antigene könnte

in einem steigenden Infektionsdruck oder Verwurmungsgrad begründet sein, was sich jedoch

nicht im Antikörpertiter widerspiegelt. Das Verschwinden der inversen Reaktion und die

Wiederkehr als „normale“ Reaktion der Basophilen auf die TcB-Verdünnungen hatte

Diskussion 135

eventuell im Titer oder in der Affinität zu bestimmten Rezeptoren seine Ursache. Wurden

zunächst viele hemmende Fc-Rezeptoren durch hohe Mengen TcB angesprochen (waren also

viele Antikörper an inhibierende Rezeptoren gebunden), die mit zunehmender Verdünnung

gegenüber den aktivierenden an Einfluss verloren, so wurden nach der Rückkehr der

Reagibilität möglicherweise nur in geringer Zahl vorliegende TcB-erkennende

Immunglobuline hauptsächlich an aktivierende Rezeptoren gebunden.

Der protektive Effekt, den SHAW ET AL. (2003) für erhöhte TcA-spezifische IgE-Titer bei

Schafen gegen Trichostrongylus colubriformis feststellen konnten (dabei zeigten die Tiere

keinerlei Anzeichen einer Typ-I-Reaktion gegen diesen Parasiten), konnte bezogen auf die

Eiausscheidungsrate und TcA-Titer aller Isotypen nicht bestätigt werden.

Zusammenfassung 136

6 Zusammenfassung

Untersuchungen zum Einfluss von parasitären Antigenen auf die Typ-I-Allergie beim

Sommerekzem des Pferdes

Julia E. Heselhaus

Die Typ-I-Reaktion beschreibt physiologische Alarm- und Immunregulationsmechanismen,

die auch bei der Kontrolle von Endoparasiten eine hervorragende Rolle spielen. Im Falle einer

Typ-I-allergischen Erkrankung scheinen diese Schutzmechanismus der physiologischen

Kontrolle entglitten zu sein. Dabei können beide Formen, die physiologisch-schützende und

die pathologische, parallel innerhalb desselben Individuums auftreten und sich

möglicherweise gegenseitig beeinflussen. So ist bekannt, dass allergische Erkrankungen beim

Menschen in Ländern mit endemischen Helminthosen bedeutend seltener vorkommen als in

den Industrieländern. In Weidehaltung gehaltene Pferde in Deutschland sind nahezu immer

mit Helminthen infiziert, und bei einem Teil dieser Tiere tritt u. a. das sog. Sommerekzem

auf, eine Typ-I-Allergie auf Speichelbestandteile verschiedener blutsaugender Insekten,

insbesondere Culicoides nubeculosus. In dieser Arbeit sollte mittels eines Funktionellen In-

vitro-Testes (FIT) anhand der Histaminfreisetzung untersucht werden, ob parasitäre Antigene

einen modulierenden Einfluss auf die allergen- und parasitenspezifische Sensibilisierung

equiner basophiler Granulocyten haben. Dafür standen neben einer Herde von 27

Islandpferden, davon elf mit klinischen Symptomen des Sommerekzems, zwei verschiedene

rekombinante Proteine aus einem Schafnematoden, Trichostrongylus colubriformis, („TcA“

und „TcB“) zur Verfügung. Vorversuche hatten gezeigt, dass einige Pferde im FIT auf diese

Proteine mit einer Histaminfreisetzung reagieren, ohne Symptome einer „Wurmallergie“ zu

zeigen.

In zwei verschiedenen Modulationsversuchen wurde eine Veränderung der allergen- und

parasiten- bzw- TcA-/TcB- spezifischen Sensibilisierungen der basophilen Granulocyten

angestrebt: durch eine Immunisierung mit den rekombinanten Proteinen TcA und TcB und

durch eine anthelminthische Behandlung der teilweise stark mit Nematoden belasteten Pferde.

Das danach veränderte Antikörperspektrum sollte die Sensibilisierungen von neu gebildeten

Basophilen möglicherweise zugunsten der parasitenspezifischen Sensibilisierungen

verschieben, nachdem zuvor die vorhandenen Basophilen mittels Corticosteroiden

eliminierten worden waren.

Schon die reine anthelminthische Behandlung (mit Moxidectin und Praziquantel) bewirkte

Zusammenfassung 137

zum Untersuchungszeitpunkt sieben Tage nach der Entwurmung eine starke, vom

individuellen Verwurmungsgrad abhängige Hemmung der allergen-, antigen- und

antikörpervermittelten Histaminfreisetzung bei nahezu allen Pferden. Diese Reduktion der

Stimulationsfähigkeit der Basophilen gab anhand der erhobenen Daten Hinweise auf eine

möglicherweise Fcγ-Rezeptor IIb-vermittelte Hemmung der Zellen als

Selbstschutzmechanismus vor einer überschießenden Reaktion auf die hohe

Antigenanflutung. Drei Wochen nach der Entwurmung konnte eine Reduktion der

allergenspezifischen Sensibilisierung nur noch in einigen wenigen Fällen festgestellt werden,

spätestens nach drei Monaten waren alle Tiere wieder auf ihre Ausgangswerte zurückgekehrt.

Drei der Pferde zeigten im Gegensatz zu den anderen sieben Tage nach der anthelminthischen

Behandlung eine verstärkte Sensibilisierung gegen Allergene, die in einem Fall auch über

mindestens drei Monate erhalten blieb.

Wurden die basophilen Granulocyten sieben Tage nach der Entwurmung (also zum Zeitpunkt

der festgestellten Hemmung der Histaminfreisetzungen) mittels einer Corticosteroid-

Behandlung „ausgetauscht“, konnte der allergenspezifische Reduktionseffekt für mindestens

zwei weitere Wochen erhalten werden. Nur eine Sensibilisierung gegen die Parasitenproteine

TcA und TcB war nicht supprimiert. Nach drei Monaten befanden sich die Sensibilisierungen

sowohl gegen die untersuchten Allergene als auch gegen die rekombinanten Parasitenproteine

wieder auf dem Ausgangsniveau vor der anthelminthischen Behandlung. Für einen kurzen

Zeitraum (mindestens zwei Wochen nach der Corticoidinjektion und drei Wochen nach der

Entwurmung) konnte möglicherweise von einem Modulationserfolg im Sinne der

Fragestellung gesprochen werden. Ein Langzeiterfolg konnte aber nicht erzielt werden. Bei

einer Anwendung des Corticoides ohne vorhergehende Parasitenantigenfreisetzung durch die

anthelminthische Behandlung konnte vierzehn Tage nach der Injektion eine deutliche

Steigerung der allergenspezifischen Sensibilisierung beobachtet werden.

Der Versuch, den TcA- und TcB-spezifischen Antikörpertiter durch eine Immunisierung mit

den rekombinanten Proteinen anzuheben und danach die Basophilen zu aktualisieren,

resultierte innerhalb kürzester Zeit (zehn Minuten bis sechs Stunden) in einer an Colon und

Caecum lokalisierten Mastzelldegranulation im Sinne einer überschießenden Typ-I-Reaktion,

zu hämorrhagischem Durchfall und zu einem sekundären hypovolämischen Kreislaufschock.

Die Pferde wurden im Rahmen der Erstversorgung auch mit einem Corticoid behandelt und

so auch hier die Basophilen eliminiert. Sieben Tage später wiesen sie ein ähnliches

Sensibilisierungsmuster auf wie die Pferde, die nach der anthelminthischen Behandlung das

Zusammenfassung 138

Corticoid erhalten hatten: die allergenspezifische Reagibilität war deutlich vermindert oder

hatte sich ganz verloren, die gegen TcA und TcB war vorhanden. Auch hier konnte

möglicherweise ein Erfolg der Modulation angenommen, aber kein Langzeiteffekt beobachtet

werden.

Im entwickelten Isotypen-ELISA gegen TcA, TcB und, als Vertreter der Gesamtheit der

Parasitenantigene, einen Extrakt aus Cyathostominae spp. wurden die Isotypen IgE, IgA,

IgG1, IgG2, IgG4 und IgG5 untersucht. Gegen TcB konnten bei deutlich vorhandener

funktioneller Sensibilisierung der Basophilen für keinen untersuchten Isotyp freie Antikörper

nachgewiesen werden. Gegen TcA waren Antikörper aller untersuchten Isotypen außer IgE

nachweisbar, sowohl bei den immunisierten als auch bei einem Teil der nicht immunisierten

Pferde. Bei einzelnen Pferden war auch ohne den ELISA-Nachweis freier Anti-TcA-

Antikörper eine deutliche TcA-Sensibilisierung der Basophilen zu beobachten. Die

funktionelle antigenspezifische Sensibilisierung der Basophilen war somit unabhängig vom

Nachweis freier Antikörper der untersuchten Isotypen im Serum. Dies legt entweder eine

Beteiligung von Antikörpern der hier nicht untersuchten Isotypen an der Sensibilisierung der

Basophilen nahe oder eine sehr selektive Affinität von Antikörpern, die unterhalb der

Nachweisgrenze des ELISA-Systems liegen, für die aktivierenden Fc-Rezeptoren.

Der strongylidenspezifische IgG1-Spiegel verhielt sich bei vier von sechs untersuchten

Pferden anders als in der Literatur beschrieben. Zwei Pferde mit geringer Eiausscheidung

zeigten niedrige, zwei mit hoher Ausscheidung hohe IgG1-Titer gegen Cyathostominae spp.

Eine Untersuchung des Gesamt-IgE-Spiegels bei elf Pferden ergab für fünf Pferde, dass sie

parallel zum Anstieg des Gesamt-IgE im Herbst eine Reduktion der allergenspezifischen

Sensibilisierung ihrer Basophilen aufwiesen, ein Zusammenhang, den schon andere Autoren

unserer Arbeitsgruppe gezeigt hatten. Andere Tiere, bei denen kein Anstieg festgehalten

werden konnte, zeigten keinen Rückgang der allergenspezifischen Sensibilisierung. Ein

Zusammenhang zwischen der Höhe des Gesamt-IgE-Titers und einer allergischen Erkrankung

wie beim Menschen konnte beim Pferd nicht festgestellt werden. Das auch aus der

Humanmedizin bekannte Absinken des Gesamt-IgE-Spiegels nach einer anthelminthischen

Behandlung zeigte sich aber auch in dieser Studie.

Summary 139

7 Summary

Studies on the influence of parasitic antigens on type I allergy (summer eczema) in

horses.

Julia E. Heselhaus

Type I reaction comprises essential physiological immunomechanisms providing alert

reactions and immunomodulatory influence as known e.g. for the control of intestinal

parasites. In case of type I allergic diseases this mechanism appears to be beyond

physiological control. Both forms of type I reactions, the physiological as well as the

pathological one, can occur in one individual and might influence one another. This may be

one reason why allergic diseases seem to be less frequent in areas with endemic helminthosis

than in industrial countries. Nearly all horses kept on pasture in Germany are infected with

helminths. In spite of that, however, some of them suffer form summer eczema, a type I

allergy against salivary components of various biting insects, one of which is Culicoides

nubeculosus. The aim of this study was to investigate the modulating influence of parasitic

antigens on allergen- and parasite-specific sensitisation of equine basophilic granulocytes in a

functional in-vitro-test (FIT) monitoring the amount of histamine released upon triggering the

basophils in vitro under controlled conditions. Main studies were performed on a herd of 27

Icelandic horses eleven of which had clinical signs of summer eczema. These studies included

two different recombinant proteins of sheep nematode Trichostrongylus colubriformis (called

“TcA” and “TcB”) as several of these horses showed sensitisation of their basophils for these

proteins in the FIT without those horses suffering from “worm allergy”.

Two approaches were taken in order to alter the profile of sensitizing antibodies for allergen

and parasitic antigen resp. TcA and TcB on the basophils: one by immunisation with both

recombinant proteins, and the other one by anthelmintic treatment of horses some of which

were partially heavily infected with nematodes. The aim was to shift the sensitisation pattern

of newly generated basophils away from allergen towards parasite specific antibodies,

particularly after elimination of previous basophils by corticosteroids.

Anthelmintic treatment with moxidetin and praziquantel induced a powerful inhibition of

allergen-, antigen- and antibody-induced histamine release from basophils monitored seven

days after treatment in nearly all horses. The magnitude of reduction depended on the

individual parasitic load. The reduced activity of basophils towards Fc-receptor mediated

triggering suggested a functional suppression via inhibitory Fcγ-receptors IIb. This might

Summary 140

resemble a mechanism of self-protection from overshooting immunoreactions caused by

excessive reactions to the high amount of released parasitic antigen. Three weeks after

anthelmintic treatment only very few horses still presented a reduced specific sensitivity for

single allergens. Latest three months after anthelmintic treatment latest all animals had

returned to their previous levels of reactivity in the FIT. In contrast to the general trend of

reduced reactivity three horses showed even an increased sensitivity to allergens seven days

post anthelmintic treatment. One of them maintained enhanced reactivity at least three

months.

If the basophils were eliminated from peripheral blood by a corticosteroid seven days after

deworming, thus, at the peak time of functional inhibition, the reduced reactivity towards

allergens was prolonged for at least another two weeks, while the triggering by TcA and TcB

was not suppressed. For a short period of time (at least two weeks after injection of corticoid

and three weeks after anthelmintic treatment) a kind of the intended down modulation of

allergen specific reactivity of basophils could be considered. No long term effect, however,

was achieved. Applying a corticosteroid without a preceding release of parasitic antigen by

deworming an increase of sensitisation for allergens was observed two weeks after injection.

An attempt to raise or induce antibody titres in the serum against the recombinant proteins

TcA and TcB by immunisation resulted in a sudden mast cell degranulation in the caecum and

the colon exerting an overshooting type I reaction in seven out of nine horses by means of

haemorrhagic diarrhoea and secondary hypovolaemic shock within ten minutes to six hours

after injection of the proteins. Emergency treatment included application of a corticosteroid,

thus eliminating the basophils. Seven days later the horses showed the same pattern of

sensitisation as those who had received the corticosteroid after anthelmintic treatment. The

basophil reaction towards allergens was reduced or had disappeared, but was fully maintained

for TcA and TcB. Again a kind of the intended modulation was achieved, but had no long

term effect.

Indirekt ELISA systems were developed for quantification of serum antibodies against the

recombinant proteins TcA, TcB and an extract of Cyathostominae spp., representing a high

amount of various nematode antigens. Antibodies were differentiated by the equine isotypes

IgE, IgA, IgG1, IgG2, IgG4 and IgG5 were tested. No free serum antibodies against TcB were

decetable, although basophils were functionally sensitized for TcB. Antibodies of all isotypes

but IgE were found against TcA in all immunized as well as in some control horses. Some of

the horses displayed a distinct functional sensitization of their basophils towards TcA without

Summary 141

any detectable anti-TcA antibodies in the serum. Thus, the sensitization of basophils was

obviously independent from the titre of free antibodies of the monitored isotypes determined

in the ELISA. This might be due to an involvement of not monitored isotypes in sensitization

of basophils or in a high selectivity of not detectable antibodies for the activating Fc-

receptors.

Cyathostominae-specific IgG1 titre of four out of six horses contradicted literature

documented findings in other species: two animals with a low number of faecal nematode

eggs had also low titres, while two others with high numbers of faecal nematode eggs had

also high titres of antibodies reacting with Cyathostominae spp.

Monitoring of total serum IgE in eleven horses revealed that five horses with an increase of

total IgE in autumn showed a decreased reactivity of their basophils towards allergens, a

finding confirming previous reports from other authors of our group. Horses which did not

show an increase of total IgE had no reduction of allergen-specific reactivity of their

basophils. There was no correlation between the total serum IgE and allergic dermatitis in the

investigated horses. The decrease of total IgE after anthelmintic treatment known in humans

could be confirmed in this study.

142

8 Literaturverzeichnis

AGGARWAL, N., HOLMES, M.A. (1999)

Characterisation of equine T helper cells: demonstration of Th1- and Th2-like cell in long-

term equine T-cell cultures.

Res. Vet. Sci. 66(3):277-9

AGGARWAL, N., HOLMES, M.A. (2000)

Production and characterisation of two monoclonal antibodies recognising equine IgG Fc

receptors.

Vet. Immunol. Immunopathol. 73:63-71

ALLEN, J.E., MAIZELS, R.M. (1997)

Th1-Th2: reliable paradigm or dangerous dogma?

Immunol. Today 18(8), 387-92

ANDERSON G.S., BELTON P., BELTON E.M. (1993)

A population study of Culicoides obsoletus Meigen (Diptera: Ceratopogonidae) and other

Culicoides species in the Fraser Valley of British Columbia.

Canadian Entomologist 125: 439-447

BAKER, K.P., QUINN, P.J. (1978)

A report on clinical aspects and histopathology of sweet itch.

Equine Vet. J. 10(4):243-8

BAKER, D.G., BRYANT, J.D., URBAN, J.F. J.R., LUNNEY, J.K. (1994)

Swine immunity to selected parasites.

Vet. Immunol. Immunopathol. 43(1-3):127-33

BELL, R.G. (1996)

IgE, allergies and helminth parasites: a new perspective on an old conundrum.

Immunol. Cell Biol. 74(4):337-45

143

BERHE, N., GUNDERSEN, S.G., ABEBE, F., BIRRIE, H., MEDHIN, G., GEMETCHU, T. (1999)

Praziquantel side effects and efficacy related to Schistosoma mansoni egg loads and morbidity

in primary school children in north-east Ehtiopia.

Acta Trop. 72(1):53-63

VAN DEN BIGGELAAR, A.H., VAN REE, R., RODRIGUES, L.C., LELL, B., DEELDER, A.M.,

KREMSNER, P.G., YAZDANBAKHSH, M. (2000)

Decreased atopy in children infected with Schistosoma haematobium: a role for parasite-

induced interleukin-10.

Lancet. 356(9243):1723-7

BORISH, L., AARONS, A., RUMBYRT, J., CVIETUSA, P., NEGRI, J., WENZEL, S. (1996)

Interleukin-10 regulation in normal subjects and in patients with asthma.

J. Allergy Clin. Immunol. 97(6), 1288-96

BRAVERMANN, Y., UNGAR-WARON, H., FRITH, K., BAKER K.P., QUINN P.J. (1983)

Epidemiological and immunological studies of sweet itch in horses in Israel.

Veterinary Record 112(22): 521-524

BROSTROM, H., LARRSON, A., TROEDSSON, M. (1987)

Allergic dermatitis (sweet itch) of Icelandic horses in Sweden: an epidemiological study.

Equine Vet. J. 19(3):229-36

BRUENNLEIN, G. (2001)

Funktioneller in-vitro-Test (FIT) für Typ-I-Allergien beim Pferd: Nachweis allergischer

Sensibilisierung bei Pferden mit chronischer obstruktiver Bronchitis (COB) sowie Einflüsse

verschiedener Therapiemaßnahmen auf den Sensibilisierungsgrad von Patienten.

Tierärztliche Hochschule Hannover, Dissertation

COLDITZ, I.G., LAX, J., MORTIMER, S.I., CLARKE, R.A., BEH, K.J. (1994)

Cellular inflammatory responses in skin of sheep selected for resistance or susceptibility to

fleece rot and fly strike.

Parasite Immunol. 16(6):286-9

144

COOKSON, W.O., MOFFATT, M.F. (1997)

Asthma: an epidemic in the absence of infection?

Science 275(5296):41-2

DAERON, M., MALBEC, O., LATOUR, S., AROCK, M., FRIDMAN, W.H. (1995)

Regulation of high-affinity IgE receptor-mediated mast cell activation by murine low-affinity

IgG receptors.

J. Clin. Invest. 95(2):577-85

DATTA, S. (1939)

Microfilarial pityriasis in equines.

British Veterinary Journal 95, 213-222

Ref. in: UNKEL (1985)

DAWKINS, H.J.S., WINDON, R.G., OUTTERIDGE, P.M., DINEEN, J.K. (1988)

Cellular and humoral responses of sheep with different levels of resistance to

Trichostrongylus colubriformis.

Int. J. Parasitol. 18(4):531-37

DOLEN, W.K. (2003)

IgE antiboby in the serum – detection and diagnostic significance

Allergy 58(8):717-23

DOMBROWICZ, D., FLAMAND, V., MIYAJIMA, I., RAVETCH, J.V., GALLI, S.J., KINET, J.P. (1997)

Absence of FcεRI α chain results in upregulation of FcγRIII-dependent mast cell

degranulation and anaphylaxis.

J. Clin. Invest. 99(5):915-25

DOUCH, P.G., HARRISON, G.B., BUCHANAN, L.L., BRUNSDON, R.V. (1984)

Relationship of histamine in tissues and antiparasitic substances in gastrointestinal mucus to

the development of resistance to trichostrongyle infections in young sheep.

Vet. Parasitol. 16(3-4):273-88

145

DOWDALL, S.M., MATTHEWS, J.B., MAIR, T., MURPHY, D., LOVE, S., PROUDMAN, C.J. (2002)

Antigen-specific IgG(T) responses in natural and experimental cyathostominae infection in

horses.

Vet. Parasitol. 106(3):225-42

DOWDALL, S.M., PROUDMAN, C.J., KLEI, T.R., MAIR, T., MATTHEWS, J.B. (2004)

Characterisation of IgG(T) serum antibody responses to two larval antigen complexes in

horses naturally- or experimentally-infected with cyathostomins.


EDMONDS, J.D., HOROHOV, D.W., CHAPMAT, M.R., POURCIAU, S.S., ANTOKU, K., SNEDDEN,

K., KLEI, T.R. (2001)

Altered immune response to a heterologous protein in ponies with heavy gastrointestinal

parasite burdens.

Equine Vet. 33(7):658-63

ELSE, K.J., ENTWISTLE, G.M., GRENCIS, R.K. (1993)

Correlations between worm burdens and markers of Th1 and Th2 cell subset induction in an

inbred strain of mouse infected with Trichuris muris.


EMERY, D.L., WAGLAMD, B.M., MCCLURE, S.J. (1993)

Rejection of heterologous nematodes by sheep immunized with larval or adult

Trichostrongylus colubriformis.


ERB, K.J. (1999)

Atopic disorders: a default pathway in the absence of infection?

Immunol. Today 20(7):317-22

FADOK, V.A., GREINER, E.C. (1990)

Equine insect hypersensitivity: skin test and biopsy results correlated with clinical data.

Equine Vet. J. 22(4): 236-240

146

FAGAN, D.L., SLAUGHTER, C.A., CAPRA, J.D., SULLIVAN, T.J. (1982)

Monoclonal antibodies to immunoglobulin G4 induce histamine release from human

basophils in vitro.

J. Allergy Clin. Immunol. 70(5):399-404

FAVRE, C., SAELAND, S., CAUX, C., DUVERT, V., DE VRIES, J.E. (1990)

Interleukin-4 has basophilic and eosinophilic cell growth-promoting activity on cord blood

cells.

Blood 75(1):67-73

FINKELMAN, F.D., PEARCE, E.J., URBAN, J.F., SHER, A. (1991)

Regulation and biological function of helminth-induced cytokine response.

Immunol. Today 12(3):A62-6

GALLIN, M., EDMONDS, K., ELLNER, J.J., ERTTMANN, K.D., WHITE, A.T., NEWLAND, H.S.,

TAYLOR, H.R., GREENE, B.M. (1998)

Cell-mediated immune responses in human infection with Onchocera volvulus.

J. Immunol. 140(6):1999-2007

GEIBEN, T. (2003)

Untersuchungen zum Sommerekzem sowie zum Einfluss der Immunmodulators Baypamun N

auf die Allergie vom Typ I am Beispiel des Sommerekzems.


GELL, P.G.H., COOMBS, R.P.A. (1968)

Classification of allergic reactions for clinical hypersensitivity disease.

In: P.G.H. Gell and R.P.A. Coombs: Clinical aspects of immunology.

Blackwell Scientific Publications, Oxford, 575-579

GILL, H.S., GRAY, G.D., WATSON, D.L., HUSBAND, A.J. (1993)

Isotype-specific antibody responses to Haemonchus contortus in genetically resistant sheep.

Parasite immunol. 15(2):61-7

147

HAGEL, I., LYNCH, N.R., PEREZ, M., DI PRISCO, M.C., LOPEZ, R., ROJAS, E. (1993a)

Modulation of the allergic reactivity of slum children by helminthic infection.


HAGEL, I., LYNCH, N.R., DI PRISCO, M.C., ROJAS, E., PEREZ, M., ALVAREZ, N. (1993b)

Ascaris reinfection of slum children: relation with the IgE response.

Clin. Exp. Immunol. 94(1):80-3

HALLDORSDOTTIR, S., LARSEN H.J., MEHL R. (1989)

Intradermal challenge of Icelandic horses with extracts of four species of the genus

Culicoides.

Res. Vet. Sci. 47(3): 283-287

HARRISON, G.B., PULFORD, H.D., GATEHOUSE, T.K., HEIN, W.R., SHOEMAKER, C.B. (2002)

Intestinal infusion of soluble larval antigen stimulates rejection of heterologous nematode

larvae by immune sheep.

Parasitol. Res. 88(5):463-7

HARRISON, G.B., PULFORD, H.D., HEIN, W.R., BARBER, T.K., SHAW, R.J., MCNEILL, M.,

WAKEFIELD, S., SHOEMAKER, C.B. (2003)

Immune rejection of Trichostrongylus colubriformis in sheep; a possible role for intestinal

mucus antibody against an L3-specific surface antigen.


HERZ, U., GERHOLD, K. GRUBER, C., BRAUN, A., WAHN, U., RENZ, H., PAUL, K. (1998)

BCG infection suppresses allergic sensitisation and development of increased airway

reactivity in an animal model.


HONG, C., MICHEL, J.F., LANCASTER, M.B. (1989)

Development of protection and of self-cure in lambs infected daily with Ostertagia

circumcincta.

Vet. Parasitol. 31(2):125-31

148

JACOBSEN, J., JOHNSEN, C.R, SKOV, P.S., WARBERG, J., KNIGGE, U., SECHER, N.H. (1995)

Cardiovascular and hormonal responses to anaphylactic shock in the pig.

Clin. Physiol. 15(1):81-90

JABARA, H.H., LOH, R., RAMESH, N., VERCELLI, D., GEHA, R.S. (1993)

Sequential switching from mu to epsilon via gamma 4 in human B cells stimulated with IL-4

and hydrocortisone.

J. Immunol. 151(9):4528-33

JANEWAY, C.A., TRAVERS, P., WALPORT, M., SHLOMCHIK, M. (2002)

Immunologie

5. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Berlin

KATZ, H.R., RAIZMANN, M.B., GARTNER, C.S., SCOTT, H.C., BENSON, A.C., AUSTEN, K.F.

(1992)

Secretory granule mediator release and generation of oxidative metabolites of arachonidonic

acid via FCγR bridging in mouse mast cells.

J. Immunol. 148(3):868-71

KAUL, S. (1998)

Typ-I-Allergien beim Pferd: Prinzipielle Entwicklung eines funktionellen in vitro

Nachweises.


KIEKENS, R.C., THEPEN, T., BIHARI., I.C., KNOL, E.F., VAN DE WINKEL, J.G., KOOMEN, C.A.

(2000)

Expression of Fc receptors for IgG during acute and chronic cutaneous inflammation in atopic

dermatitis.

Br. J. Dermatol. 142(6):1106-13

149

KING, C.L., XIANLI, J., MALHOTRA, I., LIU, S., MAHMOUD, A.A.F., OETTGEN, H.C. (1997)

Mice with targeted deletion of the IgE gene have increased worm burdens and reduced

granulomatous inflammation following primary infection with Schistosoma mansoni.

J. Immunol. 158(1):294-300

KLINE, J.N., WALDSCHMIDT, T.J., BUSINGA, T.R., LEMISH, J.E., WEINSTOCK, J.V., THORNE,

P.S., KRIEG, A.M. (1998)

Modulation of airway inflammation by CpG oligodeoxynucleotides in a murine model of

asthma.

J. Immunol. 160(6):2555-9

KNOPF, P.M. (2000)

Immunomodulation and allergy.

Allergy Asthma Proc. 21(4):215-20

KOBELT, C. (2001)

Zum Sommerekzem, eine Typ-I-Allergie beim Islandpferd: Verlauf der in vivo-

Sensibilisierung von basophilen Granulocyten nachgewiesen mit einem funktionellen in-vitro-

Test (FIT).


KUROTAKI T., NARAYAMA K., OYAMADA T., YOSHIKAWA H., YOSHIKAWA T. (1994)

Immunopathological study on equine insect hypersensitivity („kasen“) in Japan.

J. Comp. Pathol. 110(2): 145-52

LANGE, S. (2004)

Untersuchungen zur Vererbung des Sommerekzems beim Islandpferd.


150

LANTZ, C.S., BOESIGER, J., SONG, C.H., MACH, N., KOBAYASHI, T., MULLIGAN, R.C., NAWA,

Y., DRANOFF, G., GALLI, S.J. (1998)

Role for interleukin-3 in mast-cell and basophil development in immunity to parasites.

Nature 392(6671):90-3

LECOQ, F. (1842-1843)

Affection psorisque comiliquée d’un phénomène singulier, occasinonné par l’emploi

irrationel du sulfure de potasse.

Memoires de la Société Vétérinaire des Depertements du Calvados et de la mance, 14ième

Année, No. 10

Ref. in : UNKEL, M. (1985)

LEIBOLD, W. (2004)

Vorlesung: Komponenten und Mechanismen des Immunsystems.

Tierärztliche Hochschule Hannover

LYNCH, N.R., HAGEL, I.A., VARGAS, M., PEREZ, M., LOPEZ, R.I., GARCIA, N.M., DI PRISCO,

M.C., ARTHUR, I.H. (1993a)

Effect of age and helminthic infection on IgE levels in slum children.

J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 3(2):96-9

LYNCH, N.R., HAGEL, I.A., PEREZ, M., DI PRISCO, M.C., LOPEZ, R., ALVAREZ, N. (1993b)

Effect of anthelmintic treatment on the allergic reactivity of children in a tropical slum.


LYNCH, N.R., HAGEL, I.A., PALENQUE, M.E., DI PRISCO, M.C., ESCUDERO, J.E., CORAO, L.A.,

SANDIA, J.A., FERREIRA, L.J., BOTTO, C., PEREZ, M., LE SOUEF, P.N. (1998)

Relationship between helminthic infection and IgE response in atopic and nonatopic children

in a tropical environment

J. Allergy Clin. Immunol. 101(2 Pt 1):217-21

151

MCDONNELL, J.M., BEAVIL, A.J., HENRY, A.J., SUTTON, B.J., GOULD, H.J., COWBURN, D.

(2001)

The structure of the IgE Cepsilon2 domain and its role in stabilizing the complex with its

high-affinity receptor FcepsilonRIalpha.

Nat. Struct. Biol. 8(5):437-41

MAASCH, H.J., WAHN, U., WAHL, R. (1984)

Histamine Release

In: Arbeiten aus dem Paul-Ehrlich-Institut, dem Georg-Speyer-Haus und dem Ferdinand-

Blum Institut, Band 79

Gustav Fischer Verlag, Stuttgart-New York, 145-154

MAGRO, A.M., RUDOFSKY, U.H., SCHRADER, W.P., PRENDERGAST, J. (1988)

Characterisation of IgE-mediated histamine release from equine basophils in vitro.

Equine Vet. J. 20(5):352-6

MAIZELS, R.M., LAWRENCE, R.A. (1991)

Immunological tolerance: the key feature in human filariasis?

Parasitol. Today (7):271-76

MAIZELS, R.M., BUNDY, D.A., SELKIRK, M.E., SMITH, D.F., ANDERSON, R.M. (1993)

Immunological modulation and evasion by helminth parasites in human populations.

Nature 365(6449):797-805

MANJILI, M.H., SANGSTER, N.C., ROTHWELL, T.L.W. (1999)

Antibody production in guinea pigs with genetically determined high and low responsiveness

to Trichostrongylus colubriformis.

Int. J. Parasitol. 29:255-61

MARTI, E., GERBER, H, LAZARY, S. (1992)

On the genetic basis of equine allergic diseases: II. Insect bite dermal hypersensitivity.

Equine Vet. J., 24(2), 113-177

152

MAYBERRY, L.F., CONDER, G.A., BRISTOL, J.R., JOHNSON, S.S., MODRIC, S. (1993)

Absence of typical Nippostrongylus brasiliensis self-cure in putative BALB/c mice.

J. Parasitol. 79(6):962-3

MILLER, H.R.P. (1996)

Prospects for the immunological control of ruminant gastrointestinal nematodes: natural

immunity, can it be harnessed?


MITCHELL, L.A., WESCOTT, R.B., PERRYMAN, L.E. (1983)

Kinetics of expulsion of the nematode Nippostrongylus brasiliensis in mast-cell deficient

mice W/WV mice.


MOSMANN, T.R., CHERWINSKI, H., BOND, M.W., GIEDLIN, M.A., COFFMAN, R.L. (1986)

Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine

activities and secreted proteins.

J. Immunol. 136(7):2348-57

NIELSEN, B.W., LIND, P., HANSEN, B., REIMERT, C.M., NANSEN, P., SCHIOTZ, P.O. (1994)

Immune responses to nematode exoantigens: sensitizing antibodies and basophil histamine

release.

Allergy 49(6):427-35

OETTGEN, H.C., MARTIN, T.R., WYNSHAW-BORIS, A., DENG, C., DRAZEN, J.M., LEDER, P.

(1994)

Active anaphylaxis in IgE-deficient mice.

Nature 370:367-70

153

OKAYAMA, Y., KIRSHENBAUM, A.S., METCALFE, D.D. (2000)

Expression of a functional high-affinity IgG receptor, Fc gamma RI, on human mast cells:

Up-regulation by IFN-gamma.

J. Immunol. 164(8):4332-9

VAN OMMEN, R., VREDENDAAL, A.E., SAVELKOUL, H.F. (1994)

Suppression of polyclonal and antigen-specific murine IgG1 but not IgE responses by

neutralizing interleukin-6 in vivo.

Eur. J. Immunol. 24(6):1398-403

PASS, D.A., BOLTON, J.R. (1982)

Chronic eosinophilic gastroenteritis in the horse.

Vet. Pathol.19(5):486-95

PATTON, S., MOCK, R.E., DRUGE, J.H., MORGAN, D. (1978)

Increase of immunoglobulin T concentration in ponies as a response to experimental infection

with the nematode Strongylus vulgaris.

Am. J. Vet. Res. 39(1):19-23

PETERMANN, M. (1994)

Charakterisierung der in-vivo Wirkung monoklonaler Rattenantikörper bei Ratten mit

experimenteller Rotlaufinfektion.


PLATT-MILLS, T.A.E., WOODFOLK, J.A., ERWIN, E.A., AALBERSE, R. (2004)

Mechanisms of tolerance to inhalant allergens: the relevance of a modified Th2 response to

allergens from domestic animals.

Springer Sem. Immun. 25:271-9

154

PRESCOTT, S.L., MACAUBAS, C., SMALLACOMBE, T., HOLT, B.J., SLY, P.D., LOH, R., HOLT,

P.G. (1998)

Reciprocal age-related patterns of allergen-specific T-cell immunity in normal vs. atopic

infants.

Clin. Exp. Allergy Suppl. 5:39-44, discussion 50-1

PROUDMAN, C.J., TREES A.J. (1996)

Correlation of antigen specific IgG and IgG(T) responses with Anoplocephala perfoliata

infection intensity in the horse.


PROUDMAN, C.J., HOLMES, M.A., SHEORAN, A.S., EDWARDS, S.E., TREES, A.J. (1997)

Immunoepidemiology of the equine tapeworm Anoplocephala perfoliata: age-intensity profile

and age-dependency of antibody subtype responses.

Parasitology 114(Pt1):89-94

ROMMEL, M., ECKERT, J., KUTZER E., KÖRTING, W., SCHNIEDER, T. (2000)

Veterinärmedizinische Parasitologie.

5. Auflage, Parey Buchverlag Berlin

ROOK, G.A.W., STANFORD, J.L. (1998)

Give us this day our daily germs.

Immunol. Today 13(113-116)

ROTHWELL, T.L.W. (1989)

Immune expulsion of parasitic nematodes from the alimentary tract.


ROTHWELL, T.L., WAGLAND, B.M., SANGSTER, N.C. (1994)

Expulsion of Trichostrongylus colubriformis by high and low responder guinea-pigs.


155

RÜSBÜLDT, A. (2001)

Sommerekzem. Erkennen, vorbeugen, behandeln.

2. Auflage, Cadmos Verlag

SATTI, M.Z., CAHEN, P., SKOV, P.S., JOSEPH, S., JONES, F.M., FITZSIMMONS, C., HOFFMANN,

K.F., REIMERT, C., KARIUKI, C., KAZIBWE, F., MWATHA, J.K., KIMANI, G., VENNERWALD, B.J.,

OUMA, J.H., KABATEREINE, N.B., DUNNE, D.W. (2004)

Changes in IgE- and antigen-dependent histamine-release in peripheral blood of Schistosoma

mansoni-infected Ugandan fishermen after treatment with praziquantel.

BMC Immunology, 5:6

SHAW, R.J., GATEHOUSE, T.K., MCNEILL, M.M. (1998)

Serum IgE responses during primary and challenge infections of sheep with Trichostrongylus

colubriformis.


SHAW, R.J., MCNEILL, M.M., MAASS, D.R., HEIN, W.R., BARBER, T.K., WHEELER, M.,

MORRIS, C.A., SHOEMAKER, C.B. (2003)

Identification and charaterisation of an aspartyl protease inhibitor homologue as a major

allergen of Trichostrongylus colubriformis.

Int. J. Parasitol. 33(11):1233-43

SHIRAKAWA, T., ENOMOTO, T., SHIMAZU, S., HOPKIN, J.M. (1997)

The inverse association between tuberculin responses and atopic disorder.

Science 275(5296):77-9

STEIN, M. (1999)

Helminthic infections, the immune profile and allergy in Ethiopian new immigrants to Israel.

J. Allergy Clin. Immunol. 103:168

156

STERN, D., EDER, W., TEBOW, G., LOHMAN, I.C., SOPRANA, E., BRAUN-FAHRLANDER, C.,

RIEDLER, J., NOWAK, D., VON MUTIUST, E., HALONEN, M., VERCELLI, D., ALEX STUDY

GROUP (2004)

Rethinking Th2 antibody responses and allergic sensitization.

Novartis Found Symp. 257:25-37; discussion 37-50, 276-85

STRACHAN, D.P. (1989)

Hay fever, hygiene, and household size.

BMJ 299(7283):376-7

SUTTON, B.J., GOULD, H.J. (1993)

The human IgE network.

Nature 366(6454):421-8

TAKAI, T., ONO, M., HIKIDA, M.., OHMORI, H., RAVETCH, J.V. (1996)

Augmented humoral ans anaphylactic responses in FcγRII-deficient mice.

Nature 379:346-9

TAKIZAWA, F., ADAMCZEWSKI, M., KINET, J.-P. (1992)

Identification of the low affinity receptor for immunoglobulin E and mouse mast cells and

macrophages as FcγRII and FcγRIII.

J. Exp. Med. 176:469-76

TIZARD, I. R. (2004)

Veterinary Immunology – An Introduction

7th Edition, Elsevier, W.B. Saunders Company, Philadelphia, USA

THAMSBORG, S.M., LEIFSSON, P.S., GRONDAHL, C., LARSEN, M., NANSEN, P. (1998)

Impact of mixed strongyle infections in foals one month on pasture.

Equine Vet. J. 30(3):240-5

157

TKACZYK, C., OKAYAMA, Y., WOOLHISER, M.R., HAGAMAN, D.D., GILFILLIAN, A.M.,

METCALFE, D.D. (2002)

Activation of human mast cells through the high affinity IgG receptor.

Mol. Immunol. 38(16-18):1289-93

TKACZYK, C., OKAYAMA, Y., METCALFE, D.D., GILFILLIAN, A.M. (2004)

Fcγ Receptors on Mast Cells: Activatory and inhibitory Regulation of Mediator release.

Int. Arch. Allergy Immunol. 133:305-15

TRIDANDAPANI, S., SIEFKER, K., TEILLAUD, J.L. CARTER, J.E. WEWERS, M.D., ANDERSON,

C.L. (2002)

Regulated expression and inhibitory function of Fcgamma RIIb in human monocytic cells.

J. Biol. Chem. 277(7):5082-9

UBER C.L., ROTH R.L., LEVY D.A. (1980)

Expulsion of Nippostrongylus brasiliensis by mice deficient in mast cells.

Nature 287(5779):226-8

UCHAKIN, P.N., TOBIN, B.W., MORUKOV, B.V., LARINA, I.V., CUBBAGE, M.L. (2002)

Type 1 vs. type 2 cytokine secretion in vitro and its regulation by hydrocortisone in humans

subjected to 120-day anti-orthostatic bed-rest regime.

J. Gravit. Physiol. 9(2):71-82.

UJIKE, A., ISHIKAWA, Y., ONO, M., YUASA, T., YOSHINO, T., FUKUMOTO, M., RAVETCH, J.V.,

TAKAI, T. (1999)

Modulation of immunoglobulin (Ig) E-mediated systemic anaphylaxis by low-affinity Fc-

receptors for IgG.

J. Exp. Med. 189:1573-9

UNKEL, M. (19985)

Zur genetischen Fundierung des Sommerekzems beim Islandpferd.

Universität Bonn, Dissertation

158

WAGNER, B., SIEBENKOTTEN, G., LEIBOLD, W., RADBRUCH, A. (1997)

Organization of the equine immunoglobulin constant heavy chain genes. I. Cε and Cα genes.

Vet. Immunol. Immunopathol. 60:1-13

WAGNER, B., RADBRUCH, A., ROHWER, J., LEIBOLD, W. (2003)

Monoclonal anti-equine IgE antibodies with specificity for different epitopes on the

immunoglobulin heavy chain of native IgE.

Vet. Immunol. Immunopathol. 92(1-2):45-60

WAGNER, B., MILLER, D.C., LEAR, T.L., ANTCZAK, D.F. (2004)

The complete map of the Ig heavy chain constant gene region reveals evidence for seven IgG

isotypes and for IgD in the horse.

J Immunol. 173(5):3230-42

WAKELIN, D. (1992)

Genetic variation in resistance to parasitic infection: experimental approaches and practical

applications.

Res. Vet. Sci. 53:139-47

WEGE, A.K. (2004)

Expression und Charakterisierung dreier IgG-Isotypen des Pferdes und Entwicklung eines

monoklonalen Antikörpers für das equine IgG2


WEILAND, G., HASSLINGER, M.A., MEZGER, S., POLLEIN, W. (1991)

Possibilities and limits of immunodiagnosis of strongyle infections in horses.

Berl. Münch. Tierärztli. Wochenschr. 104(5):149-53

WILSON, A.D., HARWOOD, L.J., BJORNSDOTTIR, S., MARTI, E., DAY, M.J. (2001)

Detection of IgG and IgE serum antibodies to Culicoides salivary gland antigens in horses

with insect dermal hypersensitivity (sweet itch).

Equine Vet. J. 33(79):707-13

159

YAMAGUCHI, M., HIRAI, K., MORITA, Y., TAKAISHI, T., OHTA, K., SUZUKI, K., MOTOYOSHI,

K., KAWANAMI, O., ITO, K. (1992)

Hemopoietic growth factors regulate the survival of human basophils in vitro.

Int. Arch. Allergy Immunol. 97(4):322-9

YAMAGUCHI, M., HIRAI, K., OHTA, K., SUZUKI, K., KINTANI, S., TAKAISHI, T., ITO, K., RA, C.,

MORITA, Y. (1996)

Nonreleasing basophils convert to releasing basophils by culturing with IL-3.

J. Allergy Clin. Immunol. 97(6): 1279-1287

YAMAGUCHI, M., LANTZ, C.S., OETTGEN, H.C., KATONA, I.M., FLEMING, T., MIYAJIMA, I.,

KINET, J.P., GALLI, S.J. (1997)

IgE enhances mouse mast cell FcεRI expression in vitro and in vivo: evidence for a novel

amplification mechanism in IgE-dependent reactions.

J. Exp. Med. 185:663-72

YAMAGUCHI, M., HIRAI, K., KOMIYA, A., MIYAMASU, M., FURUMOTO, Y., TESHIMA, R., OHTA,

K., MORITA, Y., GALLI, S.J., RA, C., YAMAMOTO, K. (2001)

Regulation of mouse mast cell surface Fc epsilon RI expression by dexamethasone.

Int. Immunol. 13(7):843-51

YAZDANBAKHSH, M., PAXTON, W.A., BRANDENBURG, A., VAN REE, R., LENS, M., PARTONO,

F., MAIZELS, R.M., SELKIRK, M.E. (1995)

Differential antibody isotype reactivity to specific antigens in human lymphatic filariasis:

gp15/400 preferentially induces immunoglobulin E (IgE), IgG4, and IgG2.

Infect. Immunol. 63(10):3772-9

YAZDANBAKHSH, M., VAN DEN BIGGELAAR, MAIZELS, R.M. (2001)

Th2 responses without atopy: immunoregulation in chronic helminth infections and reduces

allergic disease.

Trends Immunol. 22(7):372-7

160

Danksagung

An erster Stelle danke ich „meinen“ Pferden, klein, aber großartig – auch wenn ihnen mit

Sicherheit ein Apfel lieber wäre als hier erwähnt zu werden. Ohne ihr Vertrauen und ihre

Nachsicht (und ihre Verfressenheit…) wäre diese Arbeit nie zustande gekommen. Ich

wünsche ihnen, dass jedes einzelne von ihnen einen guten Platz findet, an dem es

pferdegerecht alt werden kann.

Und weil das Pferd immer wichtiger ist als der Reiter bzw. der Mensch, erwähne ich erst an

zweiter Stelle und nur, weil es die Form so gebietet, Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. W. Leibold,

der Dissertationsthema, Arbeitsplatz und eine Herde Isländer stellte.

Diese Arbeit wäre ohne meinen Vater Dieter Heselhaus nicht geschrieben worden. Seine

Ermutigung, mich doch an das Abenteuer Dissertation zu wagen, und seine geduldige

Unterstützung haben mir drei wunderbare Jahre ermöglicht.

Für die vielen konstruktiven Diskussionen und Hilfeleistungen, für die regelmäßige Deckung

meines Erhaltungsbedarfs und für jede schöne Stunde schulde ich Frau Kathrin F.A.

Langner und Frau Patricia Traub, meinem „24h-Computer-Notdienst“, meinen Dank.

Unvergessen bleiben auch alle anderen Mitarbeiter und Doktoranden der Arbeitsgruppe

Immunologie, insbesondere Frau Silke Schöneberg, Herr Udo Rabe, Herr Jens Rohwer

und Herr Alexej Dronov. Spontane Hilfe à la Alexej zu jeder Tages- und Nachtzeit ist mit

nichts zu bezahlen. Für ausführliche Diskussionen mit einem unerschöpflichen Reservoir an

Geduld und Fachwissen stand Jens Rohwers Tür immer offen. Vielen Dank für die

konstruktive Hilfe u.a. durch das Korrekturlesen dieser Arbeit!

Herr Fridbert Njalson und seine Familie stellten der Arbeitsgruppe Immunologie und damit

mir ihre Islandpferde zur Verfügung, obwohl sie mich nicht kannten. Wer Pferde besitzt und

liebt, weiß, was das bedeutet.

Mein Dank geht auch an Herrn Heinrich Baldrich mit Familie und Mitarbeitern, die sich

den größten Teil meiner Zeit in der Immunologie um „meine“ Pferde gekümmert haben.

161

Fehlen darf hier natürlich auch weder Frau Dr. Tanja Geiben, die mich geduldig in die

Hohe Schule des FIT und der Immunologie einführte, noch Herr Karl-Heinz Hanneker, der

mir klar machte, dass Isländer keine gewöhnlichen Pferde sind.

Weiterhin danke ich Frau Kristin Stuke und Herrn PD Dr. med. vet. Georg v. Samson-

Himmelstjerna vom Institut für Parasitologie der TiHo Hannover für die Bereitstellung von

kleinen Strongyliden.

Dr. Wayne Hein und Dr. Richard Shaw aus Upper Hut, Neuseeland, überließen

dankenswerterweise der Arbeitsgruppe Immunologie zwei ihrer rekombinanten

Parasitenproteine.

Das Institut für Anatomie der Medizinischen Fakultät der Otto-von-Guericke-Universität

Magdeburg stellte mir schnell und unkompliziert eines ihrer Mikroskope als Leihgabe zur

Verfügung. Ich danke hierfür Herrn Prof. Dr. H. J. Rothkötter und Frau Dr. med. vet.

Diane Bimczok.

Der Unterstützung und dem Einsatz von Frau Prof. Dr. Astrid Tenter, meiner

Zweitgutachterin, und von Herrn Prof. Dr. Burkhard Meinecke, dem Vorsitzenden der

Promotionskommission, ist es zu verdanken, dass gegen alle Hindernisse meine Promotion

doch noch zu einem Abschluss gebracht werden konnte.

Documents

TiHo Hannover · Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 13 2 LITERATURÜBERSICHT 15 2.1 DIE VERSCHIEDENEN ALLERGIEFORMEN 15 2.2 DAS SOMMEREKZEM – EINE TYP …