Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 164, 34--37 (1977) Zeitschrift fur

Lebensmittel- Untersuchung

und-Forschung (~) J. F. Bergmann-Verlag 1977

Uber den enzymatischen Abbau von Tripolyphosphat und Diphosphat in zerkleinertem Fleisch

VII. Einflull von Natriumchlorid auf die Tripolyphosphatase- und Diphosphatase-Aktivit~it im Rindermuskel*

Reiner H a m m und Rune N e r a a l

Institut ftir Chemie und Physik der Bundesanstalt fiir Fleischforschung, Blaich 4, D-8650 Kulmbach

On the Enzymatic Breakdown of Tripolyphosphate and Diphosphate in Comminuted Meat.

VII. Influence of Sodium Chloride on the Tripolyphos- phatase and Diphosphatase Activity in Bovine Muscle

Summary. Sod ium ch lor ide act ivates the t r i po lyphos - pha tase of the muscle tissue. O p t i m u m act iv i ty occurs at 4 - - 5 percen t NaC1. The increase in act ivi ty seems to be due to the effect of Cl-ions. NaC1 inhibi ts the t r ipo- l yphospha t a se act ivi ty of muscle press juice. NaC1 de- creases the to ta l d i p h o s p h a t a s e act ivi ty of muscle tis- sue as well as the d i p h o s p h a t a s e ac t iv i ty of muscle press juice. A d d i t i o n of NaC1 to pre- r igor muscle in- creases the u l t ima te p H value (pos t - r igor-muscle) and, consequent ly , causes a lower t r i p o l y p h o s p h a t a s e ac- t ivi ty and a h igher d i p h o s p h a t a s e act ivi ty t han is ob- served, when NaC1 is a d d e d to the pos t - r igor muscle.

Zusammenfassung. Die T r i p o l y p h o s p h a t a s e des Mus - kelgewebes wird d u t c h N a t r i u m c h l o r i d akt ivier t . Ein Akt iv i t~ i t sopt imum liegt bei 4 - - 5 % NaCI . F a r die Ak- t iv ierung scheinen die C 1 - - I o n e n ve ran twor t l i ch zu sein. Die Tr ipo lyphospha tase -Akt iv i t~ i t des Muske l - PreBsaftes wird durch NaC1 gehemmt . NaC1 setzt so- wohl die gesamte Diphospha tase-Akt iv i t~ i t des Mus - kelgewebes als auch die Diphospha tase-Akt iv i t~ i t des Muske lp regsa f tes herab. Ein Zusa tz von NaC1 zu s ch l ach twarmem Fle i sch (prae-rigor-Muskel) fiihrt zu e inem erht ih ten E n d - p H - W e r t (post-rigor-Muskel) und en t sp rechend n iedr igerer T r i p o l y p h o s p h a t a s e - A k t i v i - t~it und h/Sherer Diphosphatase-Akt iv i t~ i t , als m a n sie bei Zusa tz yon NaC1 zum Post-rigor-Muskel beobach - tet.

Einleitung

Der EinfluB zugesetzter Polyphosphate auf Wasserbindungs- und Fettemulgierungsverm6gen des zerkleinerten Fleisches h~ingt sehr

* Diese Arbeit ist Teil der Dissertation von R.Neraal (Universit~it GieBen, 1975)

wesentlich davon ab, ob und in welcher Menge auch NaC1 zugesetzt wird. NaCI erhtiht das WBV 1 des Fleisches betr~ichtlich, abet die kombinierte Wirkung von NaC1 und Polyphosphaten ist erheblich h~Sher als eine additive Wirkung der beiden Salze erwarten Eigt [1]. Da Diphosphat (DP) und Tripolyphosphat (TP) in der Praxis nor- malerweise zusammen mit Kochsalz oder Nitritp/Skelsalz zugesetzt werden, war die Frage zu beantworten, ob NaC1 die AktivitM der DPase und TPase des Fleisches beeinflugt. Weiterhin war es von Interesse, ob NaC1 direkt auf die Hydrolyse-Stelle des Enzymmole- kills einwirkt oder ob es dutch Beeinflussung der Myosin-Actin- Interaktion die Enzymaktivit~it ver~indert.

Material und Methoden

Den Longissimus-dorsi-Muskel des Rindes nach Eintritt des Rigor- morris (mindestens drei Tage p.m.) dem Tierk6rper entnehmen, an- h~ingendes Fett- und Bindegewebe entfernen und das Magerfleisch im Fleischwolf (3-mm-Scheibe) zerkleinern. TPase- und DPase-Ak- tivit~t nach Zusatz von 0,5% TP bzw. DP und 0--10% NaC1 bei 22 ° C mittels tier frtiher angegebenen Methoden [2] messen.

Ergebnisse und Diskussion

Die hier d i sku t ie r ten Versuche waren jeweils drei- bis fi infmal wiederho l t worden. D a j edoch die durch NaC1 bewi rk ten re la t iven Ver i inderungen stets die gleichen waren, s ind im folgenden jeweils nur die Re- sul tate eines Versuchs angefiihrt .

1. Einflufi yon NaCl auf die Tripolyphosphatase- Aktivitiit

Der EinfluB von NaC1 auf die TPase-Aktivit~it des Muske lgewebes wurde untersucht , i ndem m a n 0 - - 10% NaC1 kurz vor dem TP-Zusa t z dem abgeh~tng- ten, zerk le iner ten Fle isch zumischte. Der p H - W e r t lag bei 5,7. Der Zusa tz von NaC1 ergab eine s ta rke Akt i -

1 Abkfirzungen: DP = Diphosphat; TP = Tripolyphosphat; DPase = Diphosphatase; TPase = Tripo|yphosphatase; p.m. = post mortem; WBV = WasserbindungsvermiSgen

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Abb.1. Einflu8 der NaC1-Konzentration auf die TPase-AktivitSt von zerkIeinertem Rindermuskel. - - Zus/itze: 0,5% TP; 50% H20

Tabelle 1. Einfiu8 von NaCI aufdie TPase-Aktivit/it von zerkleiner- tern Rindfleisch bei verschiedenen pH-Werten. Zusfitze: 0,5% TP; 75% H20. Aktivit/it in gMolen TP/min. g Protein

NaC1 Aktivit/it

pH 5,2 pH 5,6 pH 6,2

0% 2,0 2,0 1,3 2% 3,3 6,6 2,0

Tabeile 2. Polyphosphatase-Aktivit/it in Gewebe und PreSsaft von Rindermuskel. 0,5% Polyphosphat-Zusatz. Aktivit/it (spez. Akt.) in gMolen DP bzw. TP/min • g Protein

Enzym Material pH NaC1 spez. Akt." Akt.

TPase Fleisch 5,8 2% 4,2 4,2 PreSsaft 5,8 2% 0,77 0,29 PreSsaft 5,8 - - 0,82 0,31

DPase Fleisch 6,1 2% 0,22 0,22 Pregsaft 6,3 2% 0,30 0,11 Pregsaft 6,4 - - 0,36 0,14

a Aktivitgt auf die ursprtingliche Fleischmenge bezogen

vierung der TPase, wobei bei 4--5% NaC1 ein ausge- pr~igtes Optimum dieser Wirkung auftrat (Abb. 1). In Obereinstimmung mit diesem Befund beobachteten Mihalyi-Kengyel u. K6rmendy [3] beim zerkleinerten Semimembraneus-Muskel des Schweins eine Steige- rung der TPase-Aktivitfit durch 2% NaC1.

Bei vielen anderen Gewebe-Enzymen ist jedoch eine Hemmung der Enzymaktivit~it durch NaC1 festgestellt worden. Van Hoof u. Harem [4] fanden, dab die Hydrolyse von zugesetztem Adenosintri- phosphat im zerkleinerten Post-rigor-Muskel durch Zusatz yon 2% NaCI verlangsamt wird. Da es sich bier wahrscheinlich um dasselbe Enzym, n/imlich um die auch TP abbauende Myosin-Adenosintri- phosphatase handelt, mu8 dieser Unterschied in der NaC1-Wirkung am unterschiedlichen Substrat oder Produkt liegen.

Um dieser Frage nachzugehen, mu8 zun~ichst die Wirkungsweise von NaC1 n~iher spezifiziert werden. So ist es yon Bedeutung, ob Na +- oder C1--Ionen fiir die Aktivierung verantwortlich sind oder ob kombi- nierte Effekte beider Ionen in Betracht kommen. Ne- ben der allgemeinen Steigerung der Ionenst~irke durch den NaC1-Zusatz wird eine elektrostatische Bindung der lonen durch entgegengesetzt geladene Gruppen der Proteine eintreten. Oberhalb pH 5,2 nimmt die an isolierte Myofibrillen gebundene Menge an Na+-Io - nen mit dem pH-Wert zu [5]. Bei pH 5,2 wird kein Na + gebunden.

Eine durch 0,4 m-NaC1 erhShte L6slichkeit von isoliertem Ac- tomyosin in Anwesenheit yon TP oder DP wurde einer erh6hten Affinit/it der Phosphat-Ionen zum Myosin durch Bildung von Na- Myosinat zugeschrieben [6]. Derselbe Effekt soil fiJr die TPase- Aktivierung verantwortlich sein [7]. Wenn die Bildung yon Na- Myosinat die Hydrolyse von TP beschleunigt, w/ire wohl - - wie bei der LSslichkeit - - eine Erh6hung der Aktivit/it bei h6heren pH- Werten zu erwarten.

Um den Einflul3 der C1--Ionen auf die Enzymakti- vierung zu studieren, wurden dem Fleisch ~iquivalente molare Mengen (342 gmol/g Gewebe) an NaC1 oder Na-Acetat zugesetzt, wobei der pH-Wert auf pH 5,8 nachjustiert wurde. Bei einem Zusatz yon 0,5% TP lag die Aktivit~it der Probe mit NaC1 um 50% h6her als in derjenigen mit Na-Acetat (3,0 bzw. 2,0 grnol TP/min/g Protein). Ftir die Aktivierung sind daher C1--Ionen von wesentlicher Bedeutung. Eine Konkurrenz zwi- schen CI-- und Phosphatgruppen um die zweiwerti- gen Kationen wfirde die Assoziation des TP mit Myo- sin herabsetzen, aber die Produktdissoziation m6gli- cherweise erleichtern. Theoretisch k6nnen beide dieser Stufen unter verschiedenen Bedingungen ftir die Hy- drolyse geschwindigkeitsbestimmend sein. Die Frage, ob eine solche Konkurrenz eine Rolle spielt, mu8 je- doch often bleiben.

Nach Nauss et al. [8] kSnnen 2 Mole DP pro Mol actinfreies Myosin gebunden werden. Sie fanden, dab Ver/inderungen in der Ionenst~irke bis zu 0,6 (pH 7,5) in Anwesenheit von MgCI2 weder die Bindungszahl noch die Bindungskonstante beeinfluSten. Dies l~igt eine Anderung der Affinit/it des Myosins zum Phosphat im Muskel- gewebe durch NaC1 bezweifeln. Bei pH 7,5 ist jedoch die Bindung yon Phosphat an Myosin fester als beim normalen pH-Wert des abgeh~ingten Fleisches [9]. Das pH-Optimum der TPase in Anwe- senheit von NaC1 iiegt wenig oberhalb des isoelektrischen Punktes des Muskelgewebes, an welchem die Nettoladung klein und die Affinit/it des Myosins zu geladenen Gruppen entsprechend gering ist. Die Abnahme der TPase-Aktivit~it geht daher parallel mit einer Zunahme der Stabilit/it des DP-Enzym-Komplexes. Wenn NaC1 auf die Affinit/itskonstante einwirkt, w~ire eine Anderung dieses Einflus- ses mit dem pH-Wert zu erwarten.

In einem weiteren Versuch wurde der pH-Wert auf verschiedene Werte eingestellt und die Aktivit~it mit und ohne 2% NaC1 gemessen. Tab. 1 gibt die Resul- rate wieder. Im Vergleich zu den Proben ohne NaC1 wurde die Aktivit~it durch NaC1 bei pH 5,2 um etwa

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65%, bei pH 5,6 um etwa 230% und bei pH 6,2 um 50% erh6ht, d.h. der Aktivierungseffekt durch NaC1 ist bei dem pH-Optimum der TPase am gr6gten.

Erw~ihnenswert ist die Tatsache, dab die geringe TPase-Aktivit~it, die im MuskelpreBsaft vorliegt - - etwa 5--10% der Gesamtaktivit/it - - und die wahr- scheinlich durch Enzyme des Sarkoplasmas verur- sacht wird, durch NaC1 gehemmt wird (Tab.2). Ftir dieses Enzym gelten also offenbar andere kinetische VerhNtnisse als fiir die Myosin-TPase.

2. EinfluJ3 yon NaCl auf die Diphosphatase-Aktivit&

Die DPase-Aktivit~t des Muskelgewebes wird durch NaC1 eindeutig gehemmt (Abb. 2). Eine Erh6hung der NaC1-Konzentration auf fiber 4% ftihrt nur noch zu einer geringen Zunahme der Hemmung. Eine ~ihnliche Hemmung durch NaC1 liel3 sich auch ftir die im Mus- kelprel3saft enthaltene DPase nachweisen (Tab. 2).

Dieses Ergebnis stimmt mit Befunden von Nakamura et al. [10] iiberein, die sowohl fiir die neutrale als auch fiir die saure DPase (in der submikroskopischen Fraktion) die gleiche Hemmung durch NaC1 nachwiesen. Eine Hemmung der DPase-AktivitM durch 2% NaC1 wurde auch im zerkleinerten Semimembraneus-Muskel des Schweins beobachtet [3]. Da DP nur fiber zweiwertige Kationen wie Mg 2÷ an das Enzym gebunden wird, ist eine Herabsetzung der Affinit~it zum Substrat eine m6gliche Ursache der Hemmung, die durch Abschw~ichung der Affinit~it sowohl zwischen Enzym und MgDP dutch Na + als auch zwischen Mg 2+ und DP durch CI- zustande kommen k6nnte.

Die pH-abh~ingige Aktivierung der DPase [11] er- wies sich auch vonder Ionenstiirke abh~ingig. Nicht nur die Anfangsgeschwindigkeit des DP-Abbaues, sondern auch die Zunahme der Abbaugeschwindig- keit war gr6ger ohne NaC1 als in Gegenwart von 2% NaC1 (Abb. 3).

3. V~rkun9 des Vorsalzens yon schlachtwarmem Fleisch auf die Tripolyphosphatase- und Diphosphatase-Aktivi- tilt

Das hohe WBV des schlachtwarmen Rindfleisches kann man zum Zwecke der Brtihwurstherstellung fiber mehrere Tage dadurch aufrecht erhalten, dab man das Fleisch m6glichst bald nach dem Schlachten (prae rigor) zerkleinert und salzt [-1]. Es war daher die Frage von Interesse, ob dieses Vorsalzen schlachtwar- men Fleisches einen Einflul3 auf die TPase- und DPase-Aktivit~it des zerkleinerten Rindermuskels aus- tibt.

100rain p.m. zerkleinertem Rindermuskel wurden 2% NaC1 zugesetzt. Nach 3 Tagen lag der pH-Wert dieser Probe bei 5,9, w~ihrend der pH-Wert der Kontrollprobe 5,6 betrug. Letzterer Probe wurde NaCI kurz vor der Messung zugemischt. Zu diesen Proben wurden 0,5% TP bzw. DP zugegeben und die Aktivit~iten gemessen (Tab. 3).

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1'0 NaC[ (°/o) Abb.2. Einflu6 der NaCl-Konzentration auf die DPase-Aktivit/it yon zerkleinertem Rindermuskel. - - Zusfitze: 0,5% DP; 50% H20

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%100 El_ C~

'6 E 2~t -~ 50 r"

xa 0 tf) 200 Zeit (min) 400

Abb.3. EinfluB von NaCl auf die Zunahme der Abbaugeschwindig- keit w~ihrend des DP-Abbaues in zerkleinertem Rindermuskel. - - o = 0,5% DP; 2% NaC1; 50% HzO-x = 0,5% DP; 50% H20

Tabelle3. Wirkung des Vorsalzens auf die Polyphosphatase- aktivit~it yon zerkleinertem Rindermuskel. Zus~itze: 0,5 % Phosphat; 2% NaC1; 50% H20. Aktivitgt 3 bzw. 4 Tage p.m., in gMolen TP bzw. DP/min .g Protein

Enzym Zeit pH Akt. NaC1-Zugabe p.m.

TPase 100 rain 6,2 1,5 3 Tage 5,8 4,2

DPase 100 mifi 6,4 0,9 4 Tage 5,9 0,2

W/ihrend die TPase-Aktivit~it in der vorgesalzenen Probe wesentlich niedriger war als in der Kontroll- probe, lag die DPase-Aktivit/it h6her. Diese Unter- schiede sind aufgrund unserer Untersuchungen tiber die pH-Abh~ingigkeit der TPase- und DPase-Aktivit~it [12] beffiedigend mit dem pH-Unterschied in der prae rigor und post rigor gesalzenen Probe zu erkl~iren. NaC1 hemmt die Endstufen der Glykolyse. Dadurch wird die Bildung von Wasserstoffionen durch den Glykogenabbau p.m. vermindert [13, 14]; die Folge ist ein h6herer End-pH-Wert des Fleisches.

R. Hamm und R. Neraal: Abbau von Tripolyphosphat und Diphosphat. VII. 37

Literatur

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Eingegan~len am 8. J anuar 1977