Klin. Wsehr. 50, 776--782 (1972) © by Springer-Verlag 1972

Uhrahistochemische Untersuchtmgen mittels RSntgenmikroanalyse: Nachweis biogener Amine in menschlichen Thrombocyten*

H. Hess, M. MMlaseh, M. Marshal l u n d H. Kl ingele Medizinische Polikhnik der Universitgt Niinehen (Direkter: Prof. Dr. W. Seitz)

und Institut fiir t~aster-Elektronenmikroskopie Dr. Ing. Hermann Klingele

Ultra Hi~sioehemical Trails with X-Ray Microanalysis: Evidence ]or Biogneous Amines in Human Platetets.

Summary. A new technique of ultra-histochemical analysis using the scanning electron microscope is discussed.

The combination of a scanning electron microscope with a semi-conductor detector and a multiehamlel analyzer allowed us to produce surface views of biological specimens in magni- fications from 20:1 down to 20 000:1. Simultaneously, accurate X-ray mieroanalysis of the elements contained within these, and even smaller, areas (down to 1 izm diameter) from Na to U was possible.

:~irst trials with human platelets showed thaf~-besides these facilities--, eertMn elements can be deposited through histechemical reactions and measured semi-quantitatively. This method, in combination with ehromaffin and argentaffin reactions, permitted us to semi-quantitatively measure the concentrations of adrenalin, noradrenalin, dopamine, and serotenin in human platelets.

There are strong reasons indicating that this new principle is well suited for the semi-quantitative, and probably, quanti- tative assessment of the concentrations of a whole series of substances in surface layers of tissues. The only prerequisite is that, by means of a specific reaction, an element of these sub- stances normally not yet contained in the tissue to be studied be deposited therein, in a proportion corresponding %o ~he concentration of the substance.

Key words: X-ray microana]ysis, Platelets, adrenMin, noradrenalin, serotonine, dopamine.

Zusammen/assung. Es wird eine neue ~[6gliehkei~ ultra- histochemischer Untersuehungen mit tIilfe des Raster-Elek- tronenmikroskops mitgeteilt.

Die Kombination eines Raster-Elektronenmikroskops mit einem ttalbleiterdetekter und einem Vielkanalanalysator er- mSglieht die Hersteltung yon Oberfl~chenbildern biologiseher Pr/~parate in VergrSl3erungen yon 20:1 bis 20000:1 und gleichzeitig auch eine gezielte t~6ntgenmikroanalyse der in diesen und noch kleindren Arealen (bis zu 1 ~m Durchmesser) enthMtenen Elemente (yon N~ bis U).

In ersten Untersuehungen an menschliehen Thromboeyten wird gezeigt, dag dariiber hinaus dureh histeehemische t~eak- tionen bestimmte Elemente zur Ablagerung gebracht und semiqu~ntitativ naehgewiesen werden k6nnen. Mit Hilfe ehromaffl'ner und argentaffiner Reak%ionen wnrden mit dieser Methode halbquantitative Bestimmungen des Gehalts der Thrombocyten an Adrenalin, Noradrenalin, Dopamin und Serotonin durehgefiihrt.

Es bestehen gute Grfinde daftir, dal~ mit diesem neuen Prinzip halbquantitative und wahrseheinlich aueh quantita- tive Bestimmungen des Gehalts oberfl~chlicher Gewebesehich- ten an einer g~nzen Reihe yon Stoffen mSglieh werden. Vor~ aussetzung ist nur, dab diese Substanzen mit Hilfe spezifiseher Reaktionen in Abh~gigkei~ yon ihrer ~[enge ein im Gewebe nicht enthaltenes Elemen% dort zur Ablagerung bringen.

S&l~sselwSrter: R6ntgenmikroanalyse, Thrombocyten, Ad- renalin, Noradrenalin, Serotenin, Dopamin.

F i i r h is toehemische Un te r suehungen s t anden bis- her nu r das L i eh tmik roskop u n d das konvent ione l le E l e k t r o n e n m i k r o s k o p zur Verfi igung. Beide ermSg- l ichen h is toehemische Un te r suehungen ledigl ieh an Schn i t t p r£pa ra t en .

Mit d e m R a s t e r - E l e k t r o n e n m i k r o s k o p k o n n t e n in den Ie tz ten J a h r e n wergvolle E inb l i eke in die Ul t ra - s t r u k t u r e n yon Oberfl/~ehen gewonnen werden. Der eigene Arbei~skreis h a t m i t dieser Methode eine l%eihe y o n Un te r suchungen zur Pa th0genese der a r te r ie l len Verseh luBkrankhe i ten vorgetegt [3, 7, 8]. Bis lang waren mi t d e m R a s t e r - E l e k t r o n e n m i k r o s k o p abe r nu r morphologische Un te r suehungen m6glich.

I m fo lgenden sell gezeig~ werden, d a b mi~ d e m R a s t e r - E l e k t r o n e n m i k r o s k o p gleichzei t ig morpholo- gisehe u n d bioehemische Un te r suchungen durchge- f i ihr t werden kSrmen.

Pr inz ip

Das l~as te r -Elek~ronenmikroskop a rbe i t e t m i t e inem auf e twa 100--200 ~ fokus ie r ten Prim/~relektronen-

* Die Arbeit wurde zum Tell mit Unterstiitzung der Deutsehen Forsehungsgemeinsehaft durchgefiihrt.

s t rahl , der m i t Hilfe yon e lekt roniseh ges teuer ten Ab- lenkspulen P u n k t ffir P u n k t u n d Zeile ffir Zeile in va r i i e rba re r Geschwindigke i t das zu un te r suehende Objek t in e inem quadra t i sehen F lgchenabschn i t t ab- t as te r .

Die auf die Oberfli iehe auf t re f fenden Prim/~relek- t r onen dr ingen in Abhangigkei~ y o n ihrer Energie u n d der Dich te des Unte r suchungsmate r iMs mehr oder weniger t ier (einige ~m) in das Ob jek t elm Dabe i wer- den die Elek~ronen abge lenk t und gebremst . E in Tell y o n ihnen k a n n die Oberfl/~ehe Ms Riieks~reuelek~ro- nen wieder verlassen. Die energiereichen Pr im£r- u n d Rf icks t reue lek t ronen 15sen langsame Sekundiirelek- t r onen aus, die j edoeh n u t aus einer df irmen Ober- fl/~ehensehieh% aus t r e t en k6nnen. Darf iber h inaus regen die energiereichen E l e k t rone n I~6ntgens t rahlung an.

Zur t I e r s t e l lung des ras te r -e lek t ronenmJkroskopi - sehen Brides werden vorwiegend die energiearmen Sekund/£relektronen verwende$.

Die un te r dem E lek t ronenbesehug in der P robe en t s tehende RSn tgens t r ah lung wurde b isher n ieh t ge- nfi tzt . Diese bes t eh t aus e inem kont inu ie r l i ehen B r e m s s p e k t r u m u n d aus einigen he rvor ragenden In -

H. Hess et al. : Ultrahistochemisehe Untersuchungen mittels RSntgenmikroanalyse 777

tensit/~tsmaxima, die ffir die in der yore Pr im~rs t rahl abgeras te ten 0berfl/~che en tha l t enen Elemente eha- rakterist iseh sind.

Das Energ iespekt rum dieser RSntgens t rah lung k a n n dureh e inen Halble i terdetektor aufgenommen u n d mi~ einem Vielkanalanalysator au fge t r en n t wet- den [9--12] .

Die ffir jedes E lement charakter is t ischen Spektral- l inien in keV sind b e k a n n t und kSnnen einer En~rgie- tabelle [9] e n t n o m m e n werden.

Die K o m b i n a t i o n eines Ras ter -Elekt ronenmikro- skops mi~ einem geeigneten Halble i terdetektor ermSg- lieht die Gewinnung yon Oberfl/~chenbildern biologi- scher Pr~para te in VergrSBerungen yon 20:1 bis 20000:1 u n d eine gezielte energiedispersive RSntgen- mikroanalyse beliebiger AreaIe dieser Pr/~parate bis zu einem Minimaldurehmesser yon 0,1 ~m. Das so ge- wonnene RSntgenenergiespekt rum entspr icht einer Summenana lyse der im un te r such ten Areal vorhan- denen Elemente yon N a t r i u m bis Utah . Leichte EIe- mente kSnnen noch nicht nachgewiesen werden.

Neben den in den betreffenden Geweben enthal- t enen Elemen~en lassen sich du tch histoehemisehe Reak t ionen bes t immte E lemente zur Ablagerung brin- gen u n d gleichzeitig nachweisen. Dies soll in dieser Arbei t exemplarisch gezeigt werden.

Ger~ite ~iir die Untersuchung wurde das Raster-Elektronen-

mikroskop Stereosean Mark II A yon Cambridge in Verbin- dung mit einem Silizinmdetektor yon 0rtee verwendet.

In dem lithiumgedrifteten Silizium-ttalbleiterdetektor sitzt ein hoehreiner Einkristall zwisehen zwei ~Ietaltelektro- den, an denen eine Spannung yon 1500 V liegt. Jedes in den Detektor kommende R5ntgenquant erzeugt im tIalbleiter unter Abgabe seiner Energie ffeie Ladungs~r/iger, deren Zahl der Energie des RSntgenquants proportional ist. Die Ladtmgs- tr~ger bewegen sich kraft des elektrisehen Fetdes zu den Elektroden. Ein Vorverst/~rker verwandelt die Ladungen des Detektors in Spannm~gsimpulse, die noch einmal verst~rkt in einen Vielkanalanalysator geleitet und yon diesem naeh Im- pulshShen und damit nach Energiestufen simultan ffir den gesamten gew~'hlten Energiebereieh sortiert werden.

Nach einer beliebig vorw~hlbaren Z~ihlzeit wird das Ener- giespektrum, dessen Anwachsen auf einem Bildschirm laufend beobachtet werden kann, yon einem xy-Sehreiber registriert.

Material und Methode Als Material dienen mensehliche Thromboeyten, die auf

ihren Gehalt an Adrenalin, Noradrenalin, Dopamin und Serotonin untersueht werden sollen.

Naeh den Erfahrungen der Lieht- bzw. Transmissions- elektronenmikroskopie mfifite dies mit Hilfe der unterschied- lichen ehromaffinen und argentMfinen Reaktion der zellst/~n- digen biogenen Amine mSglieh sein [5].

Herstellung der Thromboeytenprgparate Venenbint wird in einer Kunststoffspritze, die 1 ml Na-

trinmnitrat enthglt ad 10 ml entnommen und nach 30 min Aufbewahrung ira Kiihlschrank 5 min bei 1000 Umdrehun-

gen/min zentrifugiei¢. Je 1 Tropfen aus der thromboeyten- reichen Plasmaschicht wird auf eine Aluminium- bzw. Fein- goldfolie gegeben, mit i Tropfen ,,Kochsalzzitrat" (1,5 Teile physiologisehe KoehsalzlSsung ~- 2 Teile Natriumnitrat) ver- miseht und eine halbe Stunde stehengelassen.

Chroma//ine Reaktion nach Coupland und Hopwood [1] Noradrenalin, Dopamin und Serotonin gehen unter unter-

schiedliehen Bedingtmgen eine chromaffine Reaktion ein. Nach Gtuf~ra.ldehydfixlerung reagieren alle drei gena:nn-

ten biogenen Amine mit Kaliumbichromat, nach Formalin- fixierung nur noeh Serotonin. Ob dabei am Reaktionsort Chromtrioxyd ausfi£11t oder Chromkomplexverbindungen ent- stehen, ist noeh nieht bekannt.

Das ThromboeiVcenpr~parat auf Atuminium- oder Fein- goldfolie wird in 6% Glutaraldehyd-Phosphatpuffer ptI 7,3 bzw. 6 % Formaldehyd-Phosphatpuffer ca. 15 rain bei 0--4 ° C fixiert. AnsctflieBend wird das Pr~parat mit Phosphatpuffer- 15sung gespiilt, dann 30 min in 3% KatiumbiehromatlSsung inkubiert und zuletzt wieder mit Phosphatpuffer15sung ge- spiilt.

Argenta//ine Reaktion Die in Speiehervesikeln vorhandenen biogenen Amine

vermSgen ammoniakalisehe SilberlSsungen mit unterschied- licher GesehwindigkeR zu metallisehem Silber zu reduzieren.

Adrenalin und Noradrenalin tun dies in unfixierten Ge- weben innerhalb 1 rain.

Durch Fixierung mit Glutaraldehyd vor Inkubation in SilberlSsung werden Noradrenalin, Dopamin und Serotonin in den Speiehervesikeln pr~zipitiert, w~hrend Adrenalin nicht gef~llt und weitgehend aus dem Gewebe ausgewaschen wird. Bei Inkubation nach Fixierung versilbert Noradrenalin inner- halb yon 30see, Dopamin und Seroton~n brauehen clazu wesentlieh 1/inger.

Zur Herstellung der ammoniakalisehen Silbernitrat15sung werden zu 100 ml 10% AgN03 und 300 ml 5% Natriumcar- bonat tropfenweise konzentrierter Ammoniak gegeben, bis sich der Niedersehlag gerade gelSst hat, und dann 100 ml Aqua dest. zugesetzt.

Zum Nachweis yon Adrenalin und Noradrenalin wird das luftgetrocknete, unfixierte Thrombocytenpr~parat auf Fein- goldfolie 1 rain in der ammoniakalischen SilberlSsung in- kubiert, dann je 5 rain mit Aqua dest. und t % Na-Thiosul- phatlSsung und noch einmat mit Aqua dest. (10 min) gespiitt und sehlieBlich ca. 15 rain bei 0--4 ° C in 6% Glutaraldehyd- Phosphatpuffer pH 7,3 fixiert.

Zum Nachweis yon Noradrenalin allein wird das Pri~parat zuerst in 6% Glutaraldehyd-Phosphatpuffer pH7,3 bei 0--4° C 1--6 S~d fixier~ und naeh Spfilung in Aqua dest. 30 see in der ammon~akalischen SilberlSsung inkubiert und dann nacheinander in Aqua dest., 1% Na-TiosulfatlSsung und wieder in Aqua dest. gespfilt.

Zum Nachweis yon Noradrenatin, Dopamin und Serotonin sind bei im iibrigen gleiehem Vorgehen 30 rain Inkubation in Si]ber]Ssung notwendig.

Vorbereitung /i~r die Untersuchung im Raster-Elektronenmikroskop

Die so vorbehandelten Priioarate werden zur Entw~sse- rung zweimal je 10 rain in 30% Alkohol, ca. 30 rain in 70% Alkohol, je 10 min in 96% und 100% Alkohot gebracht, an- schlieBend im Exsiccator fiber mehrere Stunden getrockrmt, dann auf einem Spezia]tr~ger mit Klebstoff (Uhu hart®) be- festigt und im Hochvakuum mit Kohle und Aluminium be- dampft.

Durch/i~hrung der Untersuchung Das Pr/iparat wird in das Raster-Elektronenmikroskop

eingebraeht und in einem Winkel yon 45 ° zum Prim/irstraM eingestellt. Dieser Winkel ist fiir ein gutes Sekund~relektro- nenbild ebenso giinstig wie fiir die RSntgenstrahlenanalyse.

In der iiblichen Weise wird das Pr~parat morphologisch durchgemustert. Von dem ganzen Areal oder yon jeder be- liebigen Ausschnittvergr513erung kSnnen dann sowohl Bilder angefertigt, a]s auch Summenanalysen der darin jeweils ent- haltenen Elemente gemaeht werden.

778 H. Hess et al. : Ultrahistoehemisehe Untersuchungen mittels RSntgenmikroanalyse Klin. Wschr.

0,40

0,3o

N 0,20

5 Q

~ o

Bere/ch der I Thrombozyten

4

Meftpunkte

5 10

6

~5 [P m] 20

Abb. 1. Obere H~lfte: Mensehliche Thrombocyten auf Alu- miniumunterlage. Das Pr~parat wurde zum Nachweis yon Noradrenalin, Dopamin und Serotonin naeh Glutaraldehyd- fixierung in Kaliumbichromat inkubiert. Eine morphologische Ver~ndertmg durch die chromaffine Reaktion ist nicht fest- stellb~r. Areh.-Nr. 19 798. Vergr. 4400:1. Untere H~lfte: Dia-

~ntensit~t CrK~ 1 gramm aus der GrSl~e des Quotienten

Intensit~t Untergrund an den Mel~punkten 1--8

Der auf 100--200/~ gebfindelte Elektronenstrahl k~nn aber auch auf jeden beliebigen Punkt der Probe fixiert wer- den, und analysiert darm in einer sogenannten Punktanalyse nur den an dieser Stelle yon den Primgrelektronen durch- drungenen Bereieh.

Dutch mehrere Punkt~nalysen auf einer Probe lassen sich untersehiedliehe Verteilungen der Elemente nachweisen (Abb. 1).

Die Verteilung eines Elementes l~ngs einer Geraden kann dureh die Linienanalyse in Form eines Konzentration-Weg- Diagramms dargestellt werden. Dabei fi~hrt der Elektronen-

strah] eine einzige Gerade auf der Probe l~ngsam ~b und der Vielkanalanalys~tor samme]t nur die Impulszahlen der f fir das betreffende Element charakteristisehen RSntgenstrahlen- energie.

Nach demselben Prinzip sind auch Elementverteilungs- bilder fiber Fl~chen herstellbar. Dabei wird nacheinander ein Sekundi~relektronenbild und ein Verteilungsbild der Impulse der elementeharakteristischen Strahlenenergie der gleiehen Bi]4fl~che angefertigt.

Die Eindringtiefe der Prim~relektronen und d~mit der Bereich, aus dem R5ntgenstrahlen zur Analyse kommen, hgngt einerseits yon der Dichte des Objektes und andererseits yon der GrSBe der Anregungsspannung ab. Der Strahl dringt bei 30 kV Anregungspannung z.B. in Aluminium etwa 5 ~m tie~ ein, bei 10 kV nur 1 ~zm. Bei biologisehen Objekten ist mit einer Eindringtiefe yon etwa 15 ~m bei 30 kV und etwa 3 Fm bei 10 kV zu reehnen [13].

Die bier vorgelegten Untersuchungen wurden mit einer Anregungsspannung yon 30 kV durchgeffihrt. Die Z~hlzeit zur Anfertigung der integralen RSntgenspektren dauerte immer 300 sec.

Ergebnisse

Nachweis von Nora(~renalin, Dopamin und Serotonin mit chromaHiner Realction

Abb. 1 zeigt in einer VergrSi~erung 4400:1 eine Anhi~ufung yon T h r o m b o c y t e n u n d daneben einzelne Blu tp l~ t t chen .

I n Abb . 2 s ind die in tegra len RSn tgenspek t r en zu- sammengcs te l l t , die durch 8 Pun#tanalysen ent lang der in Abb . 1 e ingezeichneten Hor izon ta le gewonnen wurden. Auf die Ana lyse der Spek t r en soll n~her ers t in der Diskuss ion eingeg~ngen werden. H ie r sei nur vorweg genommen, dal~ Chrom im RSntgenenergie- s p e k t r u m m i t seiner t t a u p t l i n i e CrK~ 1 bei 5,41 keV und mi t der schwgcheren CrKt~l-Linie bei 5,95 keV in Ersche inung t r i t t .

I n den RSntgenspek t ren , gewonnen yon den Punk- t en 1, 2 u n d 8, die wei tab yon T h r o m b o c y t e n m a t e r i a l sind, is t keine Chromlinie abgehoben. Dich t neben den T h r o m b o c y t e n l iegen die P u n k t e 3 und 7, in deren RSn tgenspek t r en jeweils eine kleine Zacke be i 5,41 keV auf t r i t t . Die P u n k t a n a l y s e n 4, 5 u n d 6 z ie l ten auf den T h r o m b o c y t e n h a u f c n und zeigen bei 5,41 keV eine hohe CrK~l-Linie und bei 5,95 keV eine noch sehr deut l iche CrK~l-Linic.

I n einer Linienanalyse, bei der der P r im~rs t r ah l die in der Abb . 1 eingezeichnete Bahn, auf der auch die P u n k t a n a l y s e n durchgeff ihr t wurden inner- ha lb 15 rain beschrieb, hob sich im Bereich der Throm- bocy ten noch ke ine dcut l iche Chromlinie yon der Un~ergrundin tens i t~ t ab. Dazu mfissen die In tens i - t £ t e n des zu lok~l is ierenden E lementes offenbar wesent l ich hSher sein, oder es muB en t sp rechend viel l i inger ana lys i e r t werden. Aus d e m gleichen Grund war auch die Dars te l lung und Lokal i s ie rung in e inem Elementverteilungsbild nich t mSglich.

Nachweis yon Serotonin mit chroma//iner Realction

Bei Summenana lysen (Vergr51~ertmg 50000:1) yon einzelnen T h r o m b o c y t e n und ~us einer Anh~ufung yon B lu tp l~ t t chen s ind jeweils nu r k le ine Zacken im

dO. Jg., Heir 16, 1972 H. Hess et aI.: Ultrahistochemisehe Untersuehungen mittels R6n~genmikroanalyse 779

63

AI pile up

IIIi :a K~I

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I I - I ! I I 2 4 6 8 10 3

® @

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3 6 3 63

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[keV]

Abb. 2. Integrate RSntgenspektren, gewonnen dutch Analysen yon den Punkten 1--8 des Priiparateausschnittes, den Abb.1 zeig~. Es handelt sich urn eine chromaffine Reakgion mit Noradrenalin, Dopamin und Serotonin. Vom Megpunkt 4 ist das ganze Spektrum wiedergegeben, yon den anderen/¢Iel3punkten nur ein Ausschnitt um CrKa 1 und CrK# 1 . Hohe Impulsrate fiir

A1Ka 1 (1,49 keV) fiihrt zu pile up-Effekt mit Gipfet bei der doppelten Energie der A1K~i-Linie (= 2,98 keV)

Spektrum bei 5,41 keV siehtbar als Naehweis e]ner Freie relativ geringen Chromanh/~ufung (Abb. 3). F l d c h e

Nachweis yon Adrenal in und Noradrenalin rait argenta/finer Reaktion

Die integralen 1%Sntgenspektren, gewormen dureh Summenanalysen aus 2 versehiedenen einzeln liegen- den Thromboeyten (Vergr6Berung 50000:1) zeigen bei 2,98 keV, der L~l-Linie des Sflbers, einen praktiseh gleich hohen Gipfel. Eine gleiche Analyse aus einem Thromboeytenagglomerat erbringt einen Silberpeak, der 3,7real gTSger ist als der yon den einzelnen Throm- boeyten (Abb. 4).

Nachweis von Noradrenalin mit argenta//iner Reaktion

Die RSntgenanalysen aus einzelnen Thrombocyten (VergrSBerung 50000:1) zeigen kleine, aber gleieh hohe, eindeutige Sflbergipfel, die bei Analysen aus Thrombocytenhaufen entspreehend h6her sind (Abb. 5).

Nachwe@ von zYoradrenatin, Do29amin und Serotonin mi t argenta//iner Reaktion

In den zu_r Verfiigung stehenden Pr/~paraten sind nur einzeln liegende Thrombocyten zu finden. Mehrere Analysen aus Thromboeyten des gleichen Probanden ergeben bei 2,98 keV bemerkenswerte Spitzen jeweils etwa gleicher HShe als Erweis Itir das Vorhandensein idenl~ischer Mengen an Sitber (Abb. 5).

Kontrollen

Bei allen Prgparaten warden aueh Analysen yon thromboeytenfreien Area]en durehgefiihrt. Dabei

1 T h r o m b o z y t Th rombozy ten - o g g l o m e r o t

? C1K~CrK~

C/o K cq

~ rKal

6 4 5 4 6 [keV]

Abb. 3. IntegrMe RSntgenspektren aus einem einzelnen Throm- boeyten bzw. einer Anhgufung yon Thrombocyten glmlich wie in Abb. 1, aber n~eh ehromaffiner Reak~ion allein dureh Sero- tonin. Das Prgparat ist auf Aluminiumunterlage hergestellt

lind mit Kohle-Aluminium bedampft

wurde Chrom und Sflber in einem Tell der Pr/iparate offenbar in Abhgngigkeit yon der Dieke der Plasma- sehieht naehgewiesen (Abb. 4). Die Impulse waren aber immer wesentlieh geringer als bei Analysen aus Thromboeyten.

Die AnMysen wurden immer an mehreren Prgpa- raten durehgefiihrt. Soweit die Prgparate a, us der

780 H. Hess et al. : Ultrahistoehemische Untersuchungen mittels RSntgenmikroanalyse Klin. Wschr.

thrombozy ten - freiem Areal

i Au MzO~,~ //gL~,

3 5 2ntensitdf AgLa~ 0,18 Yntens#dt Unfergrund

Analyse aus

1 Thrombozyf Thrombozyten- 1 Thrombozyt agglomerat

Au M~I A i L~t

A A,u L~

i g L~l

1 5 10 [ k e V ] 15 3 5 3

Q39 1,42 0,38

Abb. 4. Integrale RSntgenspektren aus einem Thromboeyten-PrEparat a, uf Feingoldfolie naeh argen~affiner Reakgion durch

Adrenalin und Noradrenalin. Das Pr~para~ ist mit Kohle-Aluminium bedampft. Der Quotien~ Intensit~t Agl~l IntensR~ Untergrund

ist bei den einzelnen Thromboeyten mit 0,39 bzw. 0,38 praktisch gleich, im Thromboeytenhaufen mit 1,43 mehr als dreimal so groB und in einem thrombocytenfreien Areal dicker Plasmaschicht mit 0,18 weitaus der niedrigste

Nora dren alin Nora dren al/n Dopam/n, Serotonin

Thrombozyfen - 1 Thrombozyt 1 Thrombozyt agglomeraf

e ~

AgL~! ~ I0, aK~,

3 ~ Intensitat Ag Le~ ~Q44

Yntensitat O;qte~tund

Ag L~ 1

A g Lul

0,25 0.42

Abb. 5. Auswahl und Aussehnitte aus integralen R6ntgen- spektren von Pr~paraten mensehlicher Thromboeyten auf Feingold. Die Pr~parate waren so hergestell% dab einerseits Noradrena, lin allein, andererseits Noradrenalin, Dopamin und

Serotonin argentaffin wirksam werden konnten

gleichen Blutprobe hergestellt waren, ergab sieh bei allen Reaktionen in bezug auf die H6ht der eharakte- ristischen Intensitgten gute ~Tbertinstimmung. Bei Blutprobtn verschiedener Probanden waren dagegen die In t tns i t~ten der Haup~linien yon Chrom bzw. Silber zum Tell reeht untersehiedlich groB.

Diskussion I m energiedispersivtn integralen RSntgensptkt rum

treten theoretisch alle Linien tines jeden angertgten Elementes auf.

Mit der in dieser Arbeit vtrwendeten An]age ist jedoch fine Analyse Itiehter Elemente (unterhalb yon Natrium) nieh~ m6glich, weft dtren entrgiearme R6ntgenstrahlen das den Detektor sehfitzende 25 Fm dieke Berylliumfenster nicht durehdringen.

Uber die eltmtntspezifischtn Impulse hinaus gehen no th a]le jene Impulse in das Spektrum tin, die dur th Ubtrg~nge der Elektronen in freie Zustgnde versehie- dener Energie oberhalb der Ionisierungsgrenze zu- stande kommen. Es entsteht so immer t in kontinuier- tiehes Spektrum, das Elektronenbremskontinuum, das such Unterg~amd gtnannt wird.

50. Jg., He]t 16, 1972 tt. Hess et al. : Ultrahistoehemisehe Untersuehungen mittels RSntgenmikroan~lyse 781

Aus diesem Untcrgrund heben sich elementspezi- fische Impulse nur ab, wenn sie in ausreichender H/~u- figkeit auftreten. Dies ist bei einer Z/~hlzeit yon 100--500 sec und 30 kV Anregungsspannung erst der Fall, wenn das betreffende Element wer~igstens mit etwa 0,1 Gew.-% in dem in die Analyse eingehenden Probenvolumen enthalten ist [9]. Das Verfahren eignet sieh also nieht zum ~qachweis yon Spuren eines Elementes.

In den Untersuchungen, bei denen die Thrombo- cyten auf Aluminiumfolie aufgebr~eht waren und eine Kohle-Aluminium-Bedampfung vorgenommen wurde, ist die Impulsrate f/ir A1K~ x (1,49keV) und AIK~ 1 (1,56keV) extrcm groB. Dabei kommt es vor, dab zwei zeittich aufeinanderfolgende Impulse addiert werden, wodureh bei tier doppelten Energie der Linie A1K~ t (2 × 1,49 keV = 2,98 keV) eine weitere Linie vor- get/~useht ~@d (Abb. 2). Dieses Ph/~nomen wird als pile up-Effekt bezeiehnet.

Bei der Wahl der Unterlage and des Bedampflmgs- materials ist darauf zu achten, dab die Linien der darin vorkommenden Elemente einschlieBIich eines mSg- lichen pile up-Effektes nieht mit den Hauptlinien eines im Objekt zu suchenden Elementes zusammenfallen.

Als Unterlagen ftir Ausstriehpr/~parate eignen sieh naeh unseren Effahrungen am besten reine Metalle, weft eine Vielzahl yon Elementen die Analysen stSren kSnnte. Ans diesem Grund ist aueh Glas nicht gut geeignet. Plexiglas h/ilt der bei der Prim/~rbestrahlung entstehenden W/~rme nicht stand.

Wiehtig ist ferner, dab die Unterlage oder die zur PrKparation verwendeten LSsungen keine uner- wiinschte Reaktion mit den Chrom- oder Sflber- 16sungen eingehen. Die meisten Metalle reagieren z.B. mit ammoniakalischer SilberlSsung und fiihren sofort zu Niederschl~gen. Die Verwendung yon Feingold- folien kann solche vermeiden.

Eine semiquantitative Analyse der Intensit/~ten vorhandener Elemente ist darm mSglieh, wenn eine quantitativ unver/~nderte BezugsgrSBe gegeben ist, mit der ein Quotient gebfldet werden karm. Bei glei- chert Objekten ist die HShe des Untergrundes ira ele- mentspezifisehen Energiebereich eine solche GrSBe, die zur ttShe des Gipfels dar/iber in bezug gesetzt werden kann.

Wenn in nnseren Untersuehungen die Menge des durch die jeweils abgelaufenen Reaktionen zellst/~n- dig gewordenen Chroms bzw. Silbers in einer festen Beziehung steht zur Menge der in den Zellen vor- handenen biogenen Amine, dann kSnnen mit dieser Methode Adrenalin, Noradrenalin, Serotonin und Dopamin in Geweben halbquantitativ bestimmt werden.

Die Ergebnisse der hier vorgelegten ersten Unter- suchungen an Thrombocyten best/~tigen anscheinend diese Annahme. Dutch Bildnng des Quotienten

Intensit/~t Crl;~l fiber dem Untergrund Intensit/~t des Uqltergrundes

f/it jede Punktanalyse der chromaffinen Reaktion mit Nachweis yon Noradrenalin, Dopamin und Serotonin entsteht ein Diagramm, das einer Linienanalyse durch dieses 0bjekt entspricht (Abb. 1 und 2). Die Inten- sit~tsuntersehiede an den einzelnen Analysenpunkten passen gut zur Masse des Thrombocytenmaterials, aus dem die Analyse stammt.

Dureh parallele direkte Bestimmung des Gehalts der Thromboeyten an den einze]nen biogenen Aminen k6nnte das AusmaB der Silber- bzw. Chromaffinit~t in. eine Beziehung zur tats/~ehliehen Menge einer jeden dieser Substanzen gebraeht und so vielleicht in Zu- kunft sogar eine quantitative Aussage mit dieser neuen Methode mSglieh werden.

Die Untersehiede in der GrSBe der Quotienten der gleiehen Reaktionen bei versehiedenen Probaaden spreehen ftir erhebliehe individuelle Sehwankungen im Gehalt der Thrombocyten an den einzeinen bio- gegen Aminen.

Bisher ist bekannt, dab die Thrombocyten des Mensehen Serotonin, Adrenalin, Noradrena]in und Histamin enthalten [4]. Quantitative Angaben liegen beim Menschen nur ffir Serotonin vor, yon dem in 109 Thromboeyten 0,13--0,77 ~g gefunden warden [2, 6].

Im Kaninchenblut warden in 109 Thromboeyten 0,02--0,04 ~g Cateeholamine (bereehnet als Noradre- nalin) naehgewiesen [14].

In einem einzelnen Thromboeyten kann demnach mit durchsehnittlieh 0,5.10 -9 ~zg (---- 0,5 fg) Serotonin bzw. 0,03.10 -9 ~g (= 0,03 fg) Catecholaminen gerech- net werden. Bis zu diesen Gr6Benordnungen hinunter scheint die neue Methode empfindlich zu sein.

Zur chemisch-analytisehen Bestimmung der bio- genen Amine in Thromboey~en sind 100 und mehr ml Blur notwendig; mit dem hier gezeigten neuen Prinzip dagegen sind Analysen an einzelnen Thromboeyten und damit aus minimalen Mengen Blur mSglich.

Was zu den beobachteten ~qiedersehl~gen yon Chrom bzw. Silber in dickeren Plasmaschichten ein- zelner Pr/~parate geffihrt hat, bedarf noeh der KI/~- rung. MSglicherweise sind es die gleichen biogenen Amine. Der Quotient

Intensit/~t Crg~ 1 bzw. Agn~ 1 Intensit/tt Untergrund

war in den Thromboeyten jedoch immer deutlieh hSher als im Plasma.

AbschlieBend muB noeh darauf hingewiesen wer- den, dab in allen Analysen, die Thromboeyten erfaBt haben, deutliehe Gipfel bei 2,31 keV entspreehend SK~ 1 und bei 3,69 keV entsprechend C a ~ 1 auftreten als Erweis dafiir, dab diese Zellen reichliehe Mengen Schwefel und Calcium enthalten. Kalium dagegen ist in nachweisbaren Mengen offenbar nich$ in Thrombo- cyten enthalten. Diese Befunde kSnnen beim Ver- gleich mit anderen Zellen und Geweben Bedeutung gewinnen.

782 H. Hess et al. : Ultrahistochemische Untersuchungen mittels l~Sntgenmikroanalyse

Der ebenfalis immer auf t re tende Gipfel bei 6,4 keV weist Eisen (FeK~) naeh, das aus dem Ger~t k o m m t und dm°eh Einsetzen eines Aluminiumfil ters ausgeschaltet werden kann.

Woher Kupfer kommt0 dessen K~x-Strahlung bei 8,05 keV gleiehfalls immer nachzuweisen ist, ist noch unklar. Sieher ist es nicht das h6chstens in Spuren vorkommende Kupfer in Ze]len, sondern wahrsehein- lich ebenfalls Kupfer aus dem Ger/~t.

InZwischen warden gleichartige Untersuchungen auch an Gef/~Bendothelien durchgefiihrt , fiber die in weiteren Arbei ten zu berichten sein wird.

Die bier vorgelegten ersten Ergebnisse ultrahisto- ehemischer Untersuchungen mit Hilfe einer energie- dispersiven RSntgenmikroanalysc lassen hoffen, dab dami t semiquant i ta t ive und vielleicht auch quanti- ta t ive Bes t immungen aller jener Stoffe in oberfl/ich- lichen Gewebesehichten mSglich werden, welche spe- zifisehe Reakt ionen mit LSsungen eingehen, die vorher nicht vorhandene Elemente in ausrciehender Menge dor t zur Ablagerung bringen.

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Prof. :Dr. ]t. Hess Dr. M. Mallaseh Dr. ~. ~arshall Medizinische Poliklinik der Universit~t D-8000 Miinehen 2, Petf~nkoferstraBe 8a Deutschland

Dr. Ing. H. Klingele Institut ffir l~aster-Elektronen-lVIikroskopie D-8000 ~¢[iinchen 22, AdelgundenstraBe 8 Deutschland