QUELLEN:

Fields Virology 5th Edition

Flint Principles of Virology

Bozzola & Russell Electron Microscopy

Rolle & Mayr

Ultrastruktur von Viren

PD Dr. Jürgen Stechjuergen.stech@fli.de

PDF der Vorlesung

zum Download

https://lehre.fli.de

Ultrastruktur-Typen

Aufbau und Unterschiede

Von der Struktur zur Funktion

Ziele dieser Vorlesung

SEM TEM

Art der

Diagnostik

Methode Nachweis von Vorteile/

Nachteile

Direkter Erregernachweis

Virus-Isolierung Anzüchtung auf

Zellkulturen

Infektiösität,

Zytopathogenität

empfindlich,

aber langsam

Elektronen-

mikroskopie (EM)

Negativ-

Kontrastierung,

Transmissions-EM

Viruspartikel schnell, aber

wenig empfindlich

Antigen-Nachweis

im Pat.-Material

Immunfluoreszenz,

Ag-ELISA

Virusproteine schnell, aber nur

z.T. verfügbar

Nukleinsäure-

Nachweis

im Pat.-Material

Gensonde,

Polymerase-

Kettenreaktion

viraler Nukleinsäure

(DNA oder RNA)

schnell, aber kein

dir. Nachweis der

Infektiösität

Indirekter Nachweis

Serologie • Immun-

fluoreszenz

• ELISA

• Hämagglutinations

-Hemmtest

• Western Blot

spezifischen

antiviralen

Antikörpern

im Serum des

Patienten

retrospektive

Diagnose

https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/advanced-chemistryprize2017.pdf

Allgemeiner Aufbau eines Viruspartikels

Virion infektiöses Viruspartikel

Kapsid (Umhüllung, Coat) Proteinschicht, umgibt die genomische Nukleinsäure

Nukleokapsid (Kern, Core) Kapsid als diskrete Substruktur im Viruspartikel

Definitionen

Strukturbegriffe I

Protomer (asymmetrische (Struktur-)Einheit) bildet Kapside oder Nukleokapside, kann aus einer

oder mehreren gleichen oder verschiedenen Protein-

Untereinheiten bestehen

Proteinuntereinheit einzelne gefaltete Polypeptid-Kette

Kapsomer morphologische

Oberflächenstruktur aus

Elektronenmikroskopie(!),

mit Protomer nicht zwingend identisch!

Definitionen

Strukturbegriffe II

Genome Protection

Genome Delivery

Other interactions with the host

Allgemeiner Aufbau eines Viruspartikels

Rotavirus

Tabakmosaikvirus

(TMV)

Vesikuläres

Stomatitisvirus

(VSV)Herpesvirus

Nukleokapside: Ausnahmen

Konisches Nukleokapsid

bei Lentiviren, z. B. HIV

Komplexes Nukleokapsid

bei Pockenviren

Komplexes Nukleokapsid der Poxviridae

Konisches

Nukleokapsid

der Lentiviren

Bei den Retroviren wurde die alte Einteilung

nach Morphologie des Kapsids

durch funktionelle Kriterien ersetzt.

Neuere Ausnahme: „Riesenviren“

Neuere Ausnahme „Riesenviren“

Parachlamydia

Archaea

Verrucomicrobia

Mimivirus

microbe

mimicking

virus

ermöglichen die Selbst-Assemblierung.

Jede Untereinheit hat „identische“

Bindungsstellen zu ihren Nachbarn. Diese regelmäßigen Interaktionen chemisch

komplementärer Oberflächen ermöglichen ein

symmetrisches Arrangement.

Bei ikosaedrischen Nukleokapsiden mit mehr als 60

Untereinheiten gilt das Prinzip der Quasi-Äquivalenz (s. dort).

Diese Bindungskontakte sind nicht kovalent. Die reversible Bildung nicht-kovalenter Bindungen korrekt

gefalteter Untereinheiten führt zu einem fehlerfreien

Aufbau und minimiert die freie Energie.

Symmetrie-Regelnfür konventionelle Nukleokapside

Allgemeiner Aufbau eines Viruspartikels

Rotavirus

Tabakmosaikvirus

(TMV)

Vesikuläres

Stomatitisvirus

(VSV)Herpesvirus

Allgemeiner Aufbau eines Viruspartikels

Rotavirus

Herpesvirus

Ikosahedrales

Nukleokapsid

Zwei Hinweise führten zum … Alle runden Kapside haben genaue Zahlen an

Untereinheiten: Vielfache von 60 (60, 180, 240, …).

Diverse Kapsidgrößen sind bekannt, aber die Größen der

Kapsid-Proteine variieren von ca. 20 bis 60 kDa.

Strukturkonzept von Caspar & Klug (1962). Watson & Crick: Runde Kapside sind Ikosaeder, aber keine

anderen platonischen Körper.

Kapsid-Untereinheiten sind präferentiell als Hexamere und

Pentamere arrangiert.

Anzahlen dieser Untereinheiten sind Vielfache von 60.

Problem: „Runde“ Kapsideaus unregelmäßig geformten Proteinuntereinheiten?

Ikosaeder = Zwanzigflächner

größtes Volumen unter den Tetraedern

3 Rotationsachsen

mit unterschiedlichen

Freiheitsgraden fünffach

dreifach

zweifach

Ikosahedrales Nukleokapsid

geschlossene Struktur

Pico

RNA

viren

• Maul- und Klauenseuche-

Virus

• Poliovirus

• Hepatitis-A-Virus

• …

Nur bei den einfachsten Ikosaedern mit T=1

entspricht

1 Kapsomer einer asymmetrischen Einheit!

Ikosaeder: 20 Seitenflächen

Triangulationszahl: Wieviele Dreiecke je Seitenfläche?

Im einfachsten Ikosaeder findet sich

1 Seitenfläche = 1 Dreieck T=1 mit jeweils 3 Kapsomeren.

3 x 20 Seitenflächen = 60 Kapsomere

Alle größeren

ikosahedralen Kapside

haben T x 60 Kapsomere.

Alle Ecken sind von Pentameren

umschlossen.

Jede (dreieckige) Seitenfläche grenzt

an drei Pentamere.

h und k sind Anzahlen an Hexameren

als Abstände von einem zu den beiden

anderen Pentameren.

Geometrische Herleitung von T

T = h2 + hk + k2

T = h2 + hk + k2

h = 1, k = 1

T = 12 + 1x1 + 12

T = 3

Zwei Beispiele zur Berechnung

T = h2 + hk + k2

h = 2, k = 1

T = 22 + 2x1 + 12

T = 7

Zwei Beispiele zur Berechnung

T = h2 + hk + k2

h = 4, k = 0

T = 42 + 4x0 + 02

T = 16

Zwei Beispiele zur Berechnung

Prinzip der Quasi-Äquivalenz Bei mehr als 60 Untereinheiten besetzt jede eine

räumlich quasi-äquivalente Position.

Die nicht-kovalenten Bindungen dieser Unterein-

heiten sind einander ähnlich und nicht identisch.

Adenoviridae

Zwar ist das Virion ohne Hülle,

jedoch ist das Ikosaeder sehr komplex!

h = 5, k = 0, T = 25

Zwei

Ikosaeder-Schichten

Ikosaeder und Lipidhülle

bei DNA-Viren

unbehüllt

Parvoviridae – Parvovirus B19

Papillomaviridae – humane Papillomviren

Adenoviridae – humane Adenoviren A-F

behüllt

Hepadnaviridae – Hepatitis-B-Virus

Herpesviridae – Herpes-simplex-Virus I

Ikosahedrales Nukleokapsid

bei RNA-Viren

unbehüllt

Reoviridae – Blauzungenvirus

Birnaviridae – Virus der infektiösen Bursitis

Caliciviridae – Norwalkvirus

Picornaviridae – Poliomyelitisvirus

behüllt

Flaviviridae – Gelbfiebervirus

Togaviridae – Rötelnvirus

Ikosahedrales Nukleokapsid

Allgemeiner Aufbau eines Viruspartikels

Rotavirus

Tabakmosaikvirus

(TMV)

Vesikuläres

Stomatitisvirus

(VSV)Herpesvirus

Allgemeiner Aufbau eines Viruspartikels

Tabakmosaikvirus

(TMV)

Vesikuläres

Stomatitisvirus

(VSV)

Helikales

Nukleokapsid

Symmetrie: P = µ x p µ – Untereinheiten pro Windung

p – Zuwachs pro Untereinheit

P – Abstand pro Windung

Helikales Nukleokapsid

DNA-Viren Baculoviridae – Autographa californica

multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV)

RNA-Viren Tobamovirus – Tabakmosaikvirus

Coronaviridae – SARS-Coronavirus

Filoviridae – Ebola-Zaire-Virus

Rhabdoviridae – VSV, Lyssavirus

Bunyaviridae – Hantaanvirus

Orthomyxoviridae – Influenzavirus A

Paramyxoviridae – Respiratorisches Synzytialvirus

Arenaviridae – Lymphocytic Choriomeningitis Virus

Helikales Nukleokapsid

Baltimore-Klassifikation: Genom mRNA

David Baltimore: Expression of Animal Virus Genomes. Bacteriological Reviews 1971.

Klassifikation DNA-Viren

Ikosaedrische und helikale Nukleokapside

innerhalb der Baltimore-Klasse I!

Klassifikation RNA-Viren

Ikosaedrische und helikale Nukleokapside

innerhalb der Baltimore-Klasse IV!

Jenseits

der

Nukleokapside …

Taxonomie: Ordnung: Nidovirales

Familie: Coronaviridae, Genus: Coronaviren

Eigenschaften:- Spike-Proteine bilden Corona im EM-Bild

- einzelsträngiges RNA-Genom positiver

Polarität von 27-32 kb Länge

- umhüllte Virionen von 100-140 nm Größe

- Nukleokapsid-Protein umhüllt RNA-Genom

Coronavirus

Namensgebung: lat. corona Krone, nach Morphologie im EM

Systematik: Ordnung Nidovirales, (nested set of mRNAs), Familie Coronoviridae, 3

Serotypen

Genomaufbau: 1 einsträngige plussträngige polyadenylierte RNA mit Cap am 5‘-Ende,

27 bis 32 kB (grösstes RNA-Virusgenom).

Virionstruktur: umhülltes Nukleokapsid, in Hülle eingelagert: S (spike) Glykoprotein, bei

allen CV, bei manchen Hämagglutinin-Esterase, M, transmembrane protein,

envelope protein

Replikationsstrategie und Expression: zwei PolyproteineORF 1a 1b, ribosomaler Frameshift und für kleinere

Proteine diskontinuierliche Transkription in mehrere mRNAs

Epidemiologie und Krankheitsbilder: humanes CV: banale

respiratorische Infekte von Nase, Trachea, Alveolen, Reinfektionen häufig, auch

Darminfektionen; SARS – schwere Pneumonie

Virusreservoir: Mensch, Schwein und div. Säugetiere, Hühnervögel

Genus Coronavirus

Murphy & Whitfield Bull WHO 1975

Familie Arenaviridae - Namensgebung

Namensgebung lat. arena Sand, sandartiges Bild in EM wg.

eingelagerten Ribosomen im Virion

Systematik 2 Genera: Mamm- und Reptarenavirus

Genomaufbau 2 „ambisense“-Segmente

Virionstruktur helikales Nukleokapsid (RNA, L-, N-Protein), umhüllt, GP1/GP2, Z-

Protein, zelluläre Ribosomen

Replikationsstrategie und Expression Transkription von vRNA in mRNA des L- und N-Proteins, Replikation

von vRNA zu cRNA zu vRNA, von cRNA Transkription in mRNA der Z-

und GPC-Proteine (Replikation im Zytoplasma)

Epidemiologie und Krankheitsbilder weltweit, hämorrhagisches Fieber, Lassa-Fieber, lymphozytäre

Choriomeningitis

Virusreservoir Nager oder auch früchtefressende Fledermäuse

Familie Arenaviridae

Abgrenzung aller Virenzu anderen intrazellulären Pathogenen

wie

Rickettsien,

Chlamydien oder

Mykoplasmen

besteht weder in Größe (Ultrafiltrierbarkeit)

noch im obligaten Zellparasitismus

sondern in der Abwesenheit von

eigenen Ribosomen.

RotavirusTabakmosaikvirus

(TMV)

Vesikuläres

Stomatitisvirus

(VSV)

Herpesvirus

Typische Morphologie

Arenavirus

Coronavirus

MasernvirusInfluenzavirus A

Adenovirus

Picornavirus

Nukleokapside: Ausnahmen

Konisches Nukleokapsid

bei Lentiviren, z. B. HIV

Komplexes Nukleokapsid

bei Pockenviren

Rhabdoviridae (VSV)

Cryo-EM Model of the Bullet-Shaped

Vesicular Stomatitis Virus (VSV) Ge et al., Science 2010

Virion enthält zwei Helices: Nukleo(N)-Protein + RNA sowie Matrix(M)-Protein

Andere umhüllte Viren sind pleomorph: rigide Geschoßform der Rhaboviren

durch N-N und M-N Interaktionen zu erklären

Kristallstruktur des M-Proteins in Elektronendichtekarte eingepasst

Interaktion zwischen N und M gezeigt

Cryo-EM Model of the Bullet-Shaped

Vesicular Stomatitis Virus (VSV) Ge et al., Science 2010

Kristallstruktur (Decamer-Ring)

von N-Protein und RNA in

Elektronendichtekarte

eingepasst

-> Orientierung der vRNA im

Virion: 5‘-Ende beginnt mit

Spitze

Hypothese: Assembly beginnt

mit Bildung der Spitze, durch

elektrostatische Wechsel-

wirkung mit RNA werden die

Windungen vergrößert

C-Terminus des G-Proteins interagiert mit M

Cryo-EM Model of the Bullet-Shaped

Vesicular Stomatitis Virus (VSV) Ge et al., Science 2010

Namensgebung: lat. para neben, myxa Schleim

Systematik: 2 Unterfamilien:

Paramyxovirinae (Genera: Respirovirus, Rubulavirus, Avulavirus,

Morbillivirus und Henipavirus) und

Pneumovirinae (Genera: Pneumovirus und Metapneumovirus)

Genomaufbau: 1 nichtsegmentierte negativsträngige RNA ca. 13-18 kB,

(mindestens) 5 Gene: N-P-M-F-H/HN-L, unterbrochen durch intergenische

Regionen; 5‘-Ende: Trailer, 3‘-Ende Leader f. Initiation der Genom-Replikation

Virionstruktur: 1 helikales Nukleokapsid (RNA, N, P, Polymerase L

(=RNP)) umhüllt von Matrixprotein M und Lipidhülle, darin eingelagert F-Protein

sowie genus-spezifisches Glykoprotein

Replikationsstrategie und Expression: nach Freisetzung ins

Zytoplasma Synthese von polyadenylierten monocistronischen mRNAs in

polarer Häufung vom 3‘-5‘-Ende des Nukleokapsides, Transkriptionsstart-

stellen, Genomreplikation: cRNA durch Antitermination als Template für vRNA

Epidemiologie und Krankheitsbilder: Bronchiolitis, Bronchopneumonie, Masern, Mumps

Virusreservoir: Mensch, je nach Genus auch diverse Säuger und Vögel

Familie Paramyxoviridae

Influenza- und Masernviren

werden

am apikalen Pol,

VSV hingegen

am basolateralen Pol

freigesetzt.

Die Virus-Knospung ist polarisiert.

Namensgebung: griech. orthos richtig, myxa Schleim

Systematik: 6 Genera: Influenzavirus A, B, C, Thogotovirus, Isavirus,

Genomaufbau: Quaranjavirus

8 negativsträngige Segmente

Virionstruktur: 8 helikale Nukleokapside (RNA, NP, Polymerase (=RNP)) umhüllt von

M1+Hülle, darin eingelagert Oberflächenproteine HA, NA, M2

Replikationsstrategie und Expression: primerunabhängige Replikation der vRNA zu cRNA zu vRNA im Zellkern,

Transkription von vRNA im Zellkern nach Cap-Snatching zu mRNA,

Spleißen einzelner mRNA, alternative ORF

Epidemiologie und Krankheitsbilder: Pandemien (Influenza A), jährliche Epidemien, Bronchiolitis,

Bronchopneumonie

Virusreservoir: Influenza A: vor allem Entenvögel, Hühnervögel, Schwein, Mensch

Familie Orthomyxoviridae (Influenza A und B)

Influenza-A-Viren

Ribonukleoprotein(RNP)-Komplexe

von Influenza-A-Viren

Nukleoproteine (NP)

heterotrimerer

Polymerase-

Komplex

Structural Organization of a Filamentous Influenza A

Virus Calder et al., PNAS 2010

Virion polar organisiert: Ribonukleoproteine (RNP) beginnen am

Knospungs-Ende, Neuraminidase (NA) vorwiegend am entgegengesetzten Pol

RNP

Coil (M1)

HA

NA

Virionen

kapselförmig

oder

filamentös

Matrix(M1)-Proteine bilden Helix.

Niedriger pH führt zum Verlust der Filament-Struktur.

Verpackung der vRNP-Segmente: zufällig oder spezifisch?Gerber // Marquet, Trends Microbiol 2014

Begrenzt die spezifische Verpackung der vRNP-Segmente

das Reassortment?

Gerber // Marquet, Trends Microbiol 2014

Von Struktur zur Funktion Eine effiziente Kodierung des Nukleokapsides im

Virusgenom wird durch den Aufbau aus identischen

Untereinheiten ermöglicht.

Ikosahedrale Nukleokapside führen zu einer sehr

effizienten Nutzung des Volumens und damit dichten

Verpackung des Genoms, erlauben aber deutlich

weniger Veränderungen.

Helikale Nukleokapside hingegen tolerieren

Anpassungen in der Genom-Länge. Oft ist das

Nukleoprotein in die Replikation und Transkription

involviert.

Enzyme im Virion

Attachment & Penetration ● Genomreplikation ●

Freisetzung ● Virusreifung

Genomaufbau & Baltimore-Klasse

Transkription ● Genexpression ● Genomreplikation

Cap-Erwerb

Genexpression: Initiation der Translation

Kapsidtyp

Uncoating ● Genomreplikation ● Assembly

Lipidhülle?

Attachment & Penetration ● Freisetzung (Knospung)

Morphologische und funktionelle Kriterien

versus

Stadien im Replikationszyklus

Vielen Dank!

juergen.stech@fli.de