Untersuchung molekularer Mechanismen der ......Das Adhäsionsmolekül EVA1 (epithelial v-like antigen 1) verhielt sich in seiner Expression invers zu der von Integrin β3. Es war in

Untersuchung molekularer Mechanismen

der transendothelialen Migration

von Tumorzellen:

Bedeutung von Integrin β3 und EVA1

Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades

vorgelegt von

Katja Bauer

aus Nürnberg

Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der

Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 23. Februar 2007

Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. E. Bänsch

Erstberichterstatter: Prof. Dr. J. Behrens

Zweitberichterstatter: PD Dr. R. Slany

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS 1. ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................. 5 2. SUMMARY....................................................................................................................... 7 3. EINLEITUNG .................................................................................................................. 9

3.1. Metastasierung von Tumoren ....................................................................................... 9

3.1.1. Metastasekaskade ..................................................................................................... 9 3.1.2. EMT in der Tumorentwicklung.............................................................................. 13 3.1.3. An der EMT beteiligte Transkriptionsfaktoren...................................................... 17 3.1.4. Die Rolle von Adhäsionsmolekülen bei der Metastasierung ................................. 19 3.1.5. Migration von Tumorzellen über das Endothel...................................................... 22

3.2. In vitro Modelle zur Metastasierung........................................................................... 23

3.3. Ziel dieser Arbeit ........................................................................................................ 24

4. ERGEBNISSE ................................................................................................................ 25

4.1. Klassifizierung verschiedener Tumorzelllinien im Hinblick auf transendotheliale Migration und Invasion in Kollagen in vitro .............................................................. 25

4.2. Identifizierung differenziell exprimierter Gene in ausgewählten TEM+ und TEM-

Tumorzelllinien mittels DNA-Mikroarray-Analyse ................................................... 28

4.3. Untersuchung der Bedeutung von Integrin β3 bei der transendothelialen Migration von Tumorzellen......................................................................................................... 33

4.3.1. Untersuchung der endogenen Expression von Integrin β3 in verschiedenen

Tumorzelllinien ...................................................................................................... 33 4.3.2. Funktionelle Analyse der Rolle von Integrin β3 bei der transendothelialen

Migration................................................................................................................ 36 4.3.2.1. Hemmung der TEM verschiedener Tumorzelllinien mittels Blockierung des

zelleigenen Integrin αvβ3 ............................................................................... 36 4.3.2.2. RNAi-vermittelter Knockdown der Integrin β3 Expression in 786.0 Zellen . 37 4.3.2.3. Ektopische Expression von Integrin β3 in TEM- A549 Zellen ...................... 39

4.4. Untersuchungen an Epithelial v-like antigen 1 (EVA1)............................................. 41

4.4.1. Untersuchung der endogenen Expression von EVA1 in verschiedenen Geweben

und Tumorzelllinien ............................................................................................... 41 4.4.2. Funktionelle Analyse der Rolle von EVA1 bei der transendothelialen Migration 42

4.4.2.1. Ektopische Expression von EVA1 in TEM+ Zelllinien ................................. 42

INHALTSVERZEICHNIS

4.4.2.2. RNAi-vermittelter Knockdown der EVA1 Expression in MS751 Zellen ...... 45 4.4.3. Analyse der transkriptionellen Regulation von EVA1 durch verschiedene

Transkriptionsfaktoren ........................................................................................... 49 4.4.3.1. Untersuchung der Beteiligung von Slug, ZEB1 und ZEB2 an der EVA1-

Expression...................................................................................................... 50 4.4.3.2. Untersuchung der Beteiligung von Snail an der EVA1-Expression ............... 53

5. DISKUSSION ................................................................................................................. 55 6. MATERIAL UND METHODEN ................................................................................. 69

6.1. Material....................................................................................................................... 69

6.1.1. Organismen ............................................................................................................ 69 6.1.1.1. Bakterienstämme............................................................................................ 69 6.1.1.2. Humane und Tumorzelllinien ........................................................................ 69

6.1.2. Vektoren ................................................................................................................. 71 6.1.3. Oligonukleotide...................................................................................................... 72 6.1.4. Medien.................................................................................................................... 75 6.1.5. Lösungen ................................................................................................................ 75 6.1.6. Weitere Chemikalien und Enzyme......................................................................... 78 6.1.7. Primäre und sekundäre Antikörper ........................................................................ 79 6.1.8. Verbrauchsmaterialien ........................................................................................... 80 6.1.9. Geräte ..................................................................................................................... 81

6.2. Methoden .................................................................................................................... 82

6.2.1. Anzucht der verwendeten Organismen .................................................................. 82

6.2.1.1. Anzucht von Bakterien................................................................................... 82 6.2.1.2. Kultivierung von Zelllinien und HUVEC...................................................... 82

6.2.2. Allgemeine molekularbiologische Methoden ........................................................ 82 6.2.2.1. Herstellung von Dauerkulturen ...................................................................... 82 6.2.2.2. Isolierung von DNA aus Agarosegelen.......................................................... 83 6.2.2.3. Bestimmung der DNA- bzw. RNA-Konzentration........................................ 83 6.2.2.4. DNA-Reinigung und Fällung......................................................................... 83 6.2.2.5. DNA-Sequenzanalyse .................................................................................... 83 6.2.2.6. Plasmidisolierung aus Bakterien .................................................................... 84 6.2.2.7. Herstellung kompetenter Bakterien................................................................ 84 6.2.2.8. Transformation von Bakterien ....................................................................... 84 6.2.2.9. RNA-Isolierung aus Säugerzellen.................................................................. 84 6.2.2.10. Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR).......................................................... 85 6.2.2.11. Quantitative Echtzeit-PCR (real time RT-PCR) ............................................ 86

6.2.3. Proteinchemische Methoden .................................................................................. 86 6.2.3.1. SDS-PAGE und Western Blot-Analyse ......................................................... 86 6.2.3.2. Luziferaseassay zur Bestimmung der Promotoraktivität ............................... 86

6.2.4. Methoden zur immuncytologischen Lokalisierung................................................ 87 6.2.4.1. Immunfluoreszenzfärbung von fixierten Zellen............................................. 87

INHALTSVERZEICHNIS

6.2.4.2. Immunfluoreszenzfärbung von Zellen in Suspension.................................... 87 6.2.5. Methoden zur Arbeit mit Säugerzellen .................................................................. 88

6.2.5.1. Zellzahlbestimmung....................................................................................... 88 6.2.5.2. Isolierung von HUVEC.................................................................................. 88 6.2.5.3. Durchflusszytometrie ..................................................................................... 88 6.2.5.4. Aggregationsversuch...................................................................................... 88 6.2.5.5. Proliferationsversuch...................................................................................... 89 6.2.5.6. Adhäsionsversuche......................................................................................... 89 6.2.5.7. Invasions- und Transendothel-Migrationsversuch......................................... 90 6.2.5.8. Transfektion von Säugerzellen....................................................................... 90

6.2.6. DNA-Mikroarrays und Analyse der differentiellen Genexpression ...................... 91 6.2.7. Plasmidklonierungen.............................................................................................. 92

6.2.7.1. Klonierung von EVA1-Expressionsplasmiden .............................................. 92 6.2.7.2. Klonierung der shRNA gegen Integrin β3 und EVA1.................................... 92 6.2.7.3. Klonierung der Promotorkonstrukte für EVA1 .............................................. 92

7. LITERATUR .................................................................................................................. 93 8. ANHANG ...................................................................................................................... 115

8.1. Während der Arbeit erstellte Vektoren..................................................................... 115

8.2. Sequenzen ................................................................................................................. 122

8.3. Mikroarray-Daten ..................................................................................................... 124

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS A Adenin

Abb. Abbildung

Ac Acetat

ADAM a disintegrin and metalloproteinase domain

Amp Ampizillin

ATP Adenosintriphosphat

AS Aminosäure

bFGF basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (basic fibroblast growth factor)

bp Basenpaar(e)

bHLH basische Helix-Loop-Helix (Transkriptionsfaktoren)

BMPs Bone morphogenetic proteins

BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)

C Cytosin

CD Cluster of differentiation

CDS kodierende Sequenz (coding sequence)

cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

d Tag(e)

Da Dalton

dATP Desoxyadenosintriphosphat

dCTP Desoxycytidintriphosphat

Del1 Developmental endothelial locus 1

DEPC Diethylpyrocarbonat

dGTP Desoxyguanosintriphosphat

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure (deoxyribonucleic acid)

DNAse Desoxyribonuklease

dNTPs Desoxynukleotidtriphosphate

DTT Dithiothreitol

dTTP Desoxythymidintriphosphat

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EGF(R) epidermaler Wachstumsfaktor (Rezeptor) (epidermal growth factor)

1

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS EMSA Gelretardationsversuch (electrophoretic mobility shift assay)

EMT epithelial-mesenchymaler Übergang (epithelial-mesenchymal transition)

EtOH Ethanol

FCS Fötales Kälberserum (fetal calf serum)

FGF(R) Fibroblasten-Wachstumsfaktor (Rezeptor) (fibroblast growth factor)

G Guanin

GAPDH Glyzerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase

gDNA genomische Desoxyribonukleinsäure

GPI-Anker Glycosylphosphatidylinositol-Anker

GSK-3β Glykogensynthase-Kinase 3 beta

GTP Guanosintriphosphat

h Stunde(n)

HCl Salzsäure

HDAC Histondeazetylase

HGF/SF Hepatozyten-Wachstumsfaktor (hepatocyte growth factor/scatter factor)

HUVEC humane Nabelschnur-Endothelzellen (human umbilical vein endothelial cells)

ICAM-1 Interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (intercellular cell adhesion molecule)

IgCAM Immunglobulin-Superfamilie Zelladhäsionsmoleküle (cell adhesion molecules)

IGF insulinähnlicher Wachstumsfaktor (insulin-like growth factor)

IgG Immunglobulin G

Kan Kanamyzin

LEF Lymphoid enhancer factor

LFA Leukocyte function associated molecule

M Mol

µl Mikroliter

MCAM Melanom-Zelladhäsionsmolekül (melanoma cell adhesion molecule)

mcs multiple Klonierungsstelle (multiple cloning site)

MET mesenchymal-epithelialer Übergang (mesenchymal-epithelial transition) min Minute(n)

ml Milliliter

MMP(s) Matrixmetalloproteinase(n)

mol molar

mRNA Boten-Ribonukleinsäure (messenger ribonucleic acid)

2

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

MVEC mikrovaskuläre Endothelzellen (microvascular endothelial cells)

NLS nukleare Lokalisationssequenz

nm Nanometer

nt Nukleotid(e)

OD optische Dichte

P Phosphat

p.a. per analysis

PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese

PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)

PDGF(R) Blutplättchen-Wachstumsfaktor (Rezeptor) (platelet derived growth factor)

PECAM-1 Blutplättchen-Endothelzell-Zelladhäsionsmolekül (platelet/endothelial cell adhesion molecule)

pH pH-Wert

PKB Proteinkinase B

PFA Paraformaledyd

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

PTHrP Parathyroid hormone receptor related peptide

rlu relative Luziferase-Units

RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)

RNAi RNA-Interferenz (RNA interference)

RNAse Ribonuklease

rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)

RT Raumtemperatur

RTK Rezeptor-Tyrosin-Kinase

RT-PCR Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)

SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulphate)

sec Sekunde(n)

shRNA kurze haarnadelförmige doppelsträngige RNA (short hairpin RNA)

SIP Smad-interagierendes Protein

Tab. Tabelle

TCF Ternary complex factor

TEM transendotheliale Migration

TGF transformierender Wachstumsfaktor (transforming growth factor)

TIMP(s) Metalloproteinasen-Inhibitoren (tissue inhibitor of metalloproteinase)

3

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS Tris Trihydroxymethylaminomethan

tRNA Transfer-Ribonukleinsäure

U Unit(s)

uPA Urokinase-Plasminogenaktivator

uPAR Urokinase-Plasminogenaktivator-Rezeptor

üN über Nacht

VEGF(R) vaskulo-endothelialer Wachstumsfaktor (Rezeptor) (vascular endothelial growth factor)

VLA Very late antigen

Vol Volumen

WT Wildtyp

ZEB Zinkfinger E-Box-bindendes Protein

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1. ZUSAMMENFASSUNG

1. ZUSAMMENFASSUNG Eine der vorwiegenden Todesursachen bei Krebspatienten ist die Bildung von Metastasen. Schlüsselschritte hierbei sind die Auswanderung der Tumorzellen aus Blut- oder Lymphgefäßen über das Endothel und die Invasion in das Stroma des umliegenden Gewebes. Da die molekularen Mechanismen, die diesen Prozessen zu Grunde liegen, im Gegensatz zu der Diapedese von Leukozyten noch nicht genau definiert waren, wurden in der vorliegenden Arbeit 41 humane Tumorzelllinien verschiedenen Ursprungs im Hinblick auf ihre Fähigkeit, in vitro durch Endothelzellen zu transmigrieren bzw. in eine Matrix einzuwandern, klassifiziert. Es konnten Zelllinien, die sowohl transmigrierten als auch einwanderten (TEM+) von solchen unterschieden werden, die dazu nicht in der Lage waren (TEM-). Mittels DNA-Mikroarray-Analyse wurden TEM+ Zellen anhand ihres Genexpressionsprofils von TEM- Zellen differenziert. Außerdem wurden zahlreiche zwischen den beiden Gruppen unterschiedlich exprimierte Gene identifiziert, die eine bekannte oder mögliche Funktion bei der transendothelialen Migration und Invasion haben. Unter diesen Genen war Integrin β3, das in TEM+ stärker als in TEM- Zelllinien exprimiert wurde. Die Expression korrelierte auch in den 41 Zelllinien gut mit der TEM+ Gruppe und Integrin αvβ3 war ausschließlich auf der Oberfläche von TEM+ Zelllinien lokalisiert. Da die transendotheliale Migration von TEM+ Zellen, nicht jedoch ihre Adhäsion an HUVEC oder die Invasion in eine Kollagenmatrix, sowohl mittels blockierenden Antikörpern gegen Integrin αvβ3 als auch durch RNAi-vermittelten Abbau von Integrin β3 reduziert werden konnte, ist davon auszugehen, dass Integrin αvβ3 eine wichtige Komponente bei der Passage der Tumorzellen durch die Endothelzellen ist. Hierbei ist die Integrin β3 Untereinheit entscheidend und könnte deshalb ein Ziel für eine gegen Metastasierung gerichtete Therapie sein. Das Adhäsionsmolekül EVA1 (epithelial v-like antigen 1) verhielt sich in seiner Expression invers zu der von Integrin β3. Es war in TEM- Zelllinien wesentlich stärker exprimiert als in TEM+ Zelllinien. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl die Überexpression als auch die Verminderung von EVA1 Veränderungen in der Morphologie verschiedener Zellen verursacht und dass die ektopische Expression von EVA1 die transendotheliale Migration verschiedener Tumorzellen aus der TEM+ Gruppe vermindern kann. EVA1 wurde außerdem als neues Ziel der E-Box-bindenden Transkriptionsfaktoren Snail, ZEB1 und ZEB2 identifiziert, die die Expression von EVA1 reprimieren. Das Adhäsionsmolekül geht vermutlich im Zuge des epithelial-mesenchymalen Übergangs (EMT) verloren und Tumorzellen werden invasiv. EVA1 kann also die transendotheliale Migration vermindern. Da weder die stabile Überexpression von Integrin β3 noch die stabile Reduktion von EVA1 eine Auswirkung auf die Zahl der transmigrierenden Zellen hatte, ist davon auszugehen, dass es nicht ausreicht in TEM- Zelllinien ein an der Transmigration beteiligtes Protein dazuzufügen oder wegzunehmen um den migrativen Phänotyp zu modulieren. Man kann weiterhin daraus schließen, dass Tumorzellen mehrere verschiedene Faktoren während dieses Vorgangs benötigen und die hier erstellte Liste unterschiedlich exprimierter Gene kann als Ausgangspunkt für die Identifikation weiterer an der transendothelialen Migration beteiligter Gene genutzt werden. Ob verschiedene Tumorzelllinien aus unterschiedlichen Geweben einen einheitlichen Mechanismus bei der Migration über die Endothelzellen nutzen, konnte nicht eindeutig geklärt werden, aber die hier erhaltenen Daten geben Hinweise darauf, dass Tumorzellen, die transmigrieren können, ein vergleichbares Genexpressionsprofil haben.

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2. SUMMARY

2. SUMMARY One of the major causes of death in cancer patients is the development of metastases. At this the extravasation of cancer cells from the blood or lymph vessels across the endothelium and the invasion into the stroma of the surrounding tissue are key steps. Since the molecular mechanisms which underlie these processes are not clear defined unlike the diapedesis of leukocytes, 41 human tumor cell lines of different origin were classified according to their ability to transmigrate across endothelial cells and to invade into a matrix in vitro respectively. It was possible to distinguish cell lines that transmigrated as well as invaded (TEM+) from those that did not (TEM-). By DNA microarray analysis TEM+ cells were differentiated from TEM- cells according to their gene expression profile. Furthermore scores of genes differentially expressed between the two groups were identified that have a known or putative role in transendothelial migration or invasion. Among these genes integrin β3 was higher expressed in TEM+ than in TEM- cell lines. The expression showed also a good correlation with the TEM+ group in all 41 cell lines and cell surface localisation of integrin αvβ3 was exclusively found in TEM+ cell lines. Since the transendothelial migration of TEM+ cells but not the adhesion to HUVEC or the invasion into the collagen matrix was reduced by a blocking antibody against integrin αvβ3 or RNAi-mediated knock-down of integrin β3, Integrin αvβ3 must be an important component during the passage of tumor cells through the endothelial cells. At this the integrin β3 subunit is crucial and therefore could be a target for anti-metastatic therapy. The expression of the adhesion molecule EVA1 (epithelial v-like antigen 1) showed an inverse correlation to that of integrin β3. It was much higher expressed in TEM- cell lines as compared to TEM+ cell lines. It has been shown that both the overexpression and the reduction of EVA1 cause a change in the morphology of different cells and the ectopic expression of EVA1 could diminish the transendothelial migration of various tumor cells. EVA1 was also identified as a new target of the E-box binding transcription factors Snail, ZEB1 and ZEB2 which repress the expression of EVA1. The adhesion molecule is probably lost in the course of epithelial-mesenchymal transition (EMT) and tumor cells become invasive. Thus EVA1 is able to reduce the transendothelial migration. Since neither the stable overexpression of integrin β3 nor the stable reduction of EVA1 had an effect on the number of transmigrating cells, one could assume that it is not sufficient to add or to remove only one protein which is involved in the transmigration in TEM- cell lines to modulate the migratory phenotype. Furthermore one could conclude, that tumor cells make use of a variety of different factors during this process an the list of differential expressed genes which was created here can be used as a starting point for the identification of further genes functionally involved in transendothelial migration. It was not definitely resolved weather different tumor cell lines from diverse tissue origin use a consistent mechanism during the process of migration through endothelial cells, but the received data indicate that tumor cells which are able to transmigrate have a comparable gene expression profile.

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3. EINLEITUNG

3. EINLEITUNG

3.1. Metastasierung von Tumoren

3.1.1. Metastasekaskade Genetische Grundlage Die Entstehung von Metastasen aus Primärtumoren ist die hauptsächliche Todesursache bei Krebspatienten. 90% aller Todesfälle sind auf die Bildung sekundärer Tumore in entfernten Geweben zurückzuführen (Sporn, 1996). Metastasierung ist ein komplexer Prozess aus vielen Schritten. Zunächst müssen sich Tumorzellen vom Primärtumor ablösen. Es kommt zur lokalen Invasion und Zerstörung der Basalmembran. Die Tumorzellen wandern in Lymph- oder Blutgefäße ein und verteilen sich so über den Körper. In neuen Organen interagieren sie mit der und adhärieren an die Gefäßwand und wandern in das umliegende Gewebe aus. Wenn die Zellen dort überleben und proliferieren, entstehen Metastasen, in denen sich durch Angiogenese neue Gefäße bilden (Abb. 3.1) (Bashyam, 2002; Chambers et al. 2002). Um diese Schritte zu bewältigen, benötigen Tumorzellen eine Reihe Fähigkeiten. Sie müssen sich ihre Wachstumssignale selber geben können, insensitiv gegenüber wachstumshemmenden Signalen sein, Apoptose umgehen, unbeschränktes Teilungsvermögen haben, der Immunantwort des Körpers entkommen und zur Angiogenese fähig sein (Hanahan und Weinberg, 2000; Bogenrieder und Herlyn, 2003). Hierbei spielen vor allem Änderungen im Genexpressionsprofil eine Rolle. Krebs wird durch eine Anhäufung genetischer Veränderungen verursacht, weshalb Tumorgenome immer an mehreren Stellen verändert sind und sich auch schon die Zellen im Primärtumor phänotypisch und biologisch unterscheiden. Schrittweise Mutationen führen dann zu der Entstehung von malignen metastasierenden Zellen aus benignen Zellen. Deshalb haben metastasebildende Zellen häufig mehr Mutationen als der ursprüngliche Tumor (Yokota, 2000). Die mutierten Gene klassifiziert man allgemein in zwei Gruppen: Onkogene, die zu einem dominanten Funktionsgewinn führen und Wachstum und Entwicklung fördern sowie Tumorsuppressoren, die einen rezessiven Funktionsverlust vermitteln und deshalb einen negativen Effekt auf Wachstum und Entwicklung der Tumorzellen haben (Hanahan und Weinberg, 2000; Bashyam, 2002). Es stellt sich deshalb die Frage, ob alle Zellen eines Tumors das Potential zur Bildung von Metastasen haben, oder ob es nur ein kleiner Teil der Zellen ist. Bernhards und Weinberg (2002) vertreten die Theorie, dass grundsätzlich jede Zelle des primären Tumors in der Lage ist, Metastasen zu bilden und dass es sich bei der Metastasierung um ein frühes Ereignis in der Tumorentwicklung handelt. Dafür spricht, dass es keine Gene oder genetischen Veränderungen gibt, die ausschließlich in den Prozess der Metastasebildung involviert sind, d.h. dieselben Gene, die auch schon den Primärtumor verursachen, veranlassen auch die Metastasen. Deshalb sind die Genexpressionsprofile von Tumoren und Metastasen oft ähnlich (van ’t Veer et al., 2002). Kang et al. (2003) konnten zeigen, dass aus verschiedenen Organen isolierte Metastasen von Brustkarzinomen verschiedene, aber charakteristische Genexpressionsprofile besitzen und primäre Brustkarzinome haben spezifische Expressionsmuster, die mit einem metastatischen oder nicht-metastatischen Phänotyp korrelieren und Vorhersagen über den Verlauf der

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3. EINLEITUNG

Erkrankung ermöglichen (van de Vijver et al., 2002). Mit Hilfe von Genexpressionsprofilen aus Brustkarzinomen kann man deshalb mit 90-prozentiger Genauigkeit vorhersagen, ob ein Tumor Metastasen bildet oder nicht (Wittekind und Neid, 2003). Auch Metastasen aus Adenokarzinomen haben eine spezifische Signatur, die man schon in einigen Primärtumoren findet, was bedeuten würde, dass fast alle Zellen eines Tumors die Fähigkeit zur Bildung von sekundären Tumoren besitzen (Ramaswamy et al., 2003). Diese Erkenntnis steht im direkten Widerspruch zu der Theorie, dass Metastasen aus einer kleinen Subpopulation von Zellen im Primärtumor entstehen und ein spätes Ereignis in der Tumorgenese sind (Fidler und Kripke, 1977). Da sich bei einer anderen Untersuchung von Brustkrebsmetastasen herausstellte, dass nur bei einem Drittel das Profil ähnlich dem der zugehörigen Primärtumore war (Kuukajarvi et al., 1997), sind beide oben genannten Möglichkeiten denkbar.

Abb. 3.1: Schematische Darstellung der Bildung von Karzinomen aus einem normalen Epithel und anschließender Metastasierung. EMT = epithelial-mesenchymaler Übergang; MET = mesenchymal-epithelialer Übergang. Die Genexpressionsprofile der Tumore bestimmen nicht nur, ob sie überhaupt metastasieren, sondern sie legen auch den Weg der Zellen fest, denn die Profile unterscheiden sich, je nachdem ob sich ein Tumor über das Lymphsystem oder die Blutgefäße verteilt (Pantel und Brakenhoff, 2004). Die genetische Grundlage der Tumorgenese ist also verschieden, die Schritte, die für die Metastasierung erforderlich sind, ähneln sich jedoch bei fast allen Tumorzellen.

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3. EINLEITUNG

Modelle der Metastasierung Bei genauerer Betrachtung lassen sich verschiedene Wege der Tumorzellen durch den Körper unterscheiden. Im ersten lösen sich Tumorzellen schon in frühen Stadien vom Primärtumor ab und verteilen sich über Lymph- und Blutgefäßsystem. Sie können aber nur in Lymphknoten proliferieren und Metastasen bilden, in entfernten Organen sterben sie jedoch oder ruhen. Erst in späten Stadien verlassen Tumorzellen dann die Lymphknotenmetastasen und bilden in anderen Organen weitere Metastasen. In diesem Fall wären die Metastasen in den Lymphknoten eine Voraussetzung für sekundäre Tumore. Nach dem zweiten Modell verteilen sich die Tumorzellen ständig über das Blutgefäßsystem und entwickeln sich zu Metastasen, ohne vorher die Lymphknoten passiert zu haben. Diese Unterscheidung ist vor allem für eine erfolgreiche Behandlung der Patienten nötig (Pantel und Brakenhoff, 2004). Aber auch bei der Verteilung über die Gefäße muss man differenzieren. Die klassische Metastasekaskade nimmt an, dass nur wenige Tumorzellen aus den Gefäßen in die Organe auswandern, wo sie proliferieren und metastasieren. Allerdings wurde gezeigt, dass zumindest Brust-karzinomzellen in der Lunge auch schon intravaskulär proliferieren können, ohne vorher auszuwandern (Al-Mehdi et al. 2000; Wong et al., 2002) und dass Tumorzellen die Fähigkeit haben, selbst endothel-ähnliche Funktionen zu übernehmen, d. h. Kanäle zu bilden, über die sie dann in das Gewebe gelangen (Maniotis et al., 1999; Folberg et al., 2000). Diesen Vorgang nennt man vaskuläres Mimikry. Anzumerken ist auch, dass Komplexe aus mehreren Tumorzellen erfolgreicher metastasieren als einzelne Tumorzellen (Liotta et al., 1976; Starkey et al., 1984) und dass Zellen den Primärtumor nicht immer einzeln, sondern auch als Zellaggregate verlassen (Friedl et al., 1995). Metastasierung ist ein ineffizienter Prozess Der Prozess der Metastasebildung an sich ist sehr ineffizient. Obwohl schon kleine Tumore viele Zellen in die Zirkulation entlassen können (Glaves et al., 1988) und frühe Schritte wie der Arrest und die Extravasation effizient ablaufen, bilden nur etwa 0,02% der zirkulierenden Tumorzellen Metastasen (Luzzi et al., 1998; Cameron et al., 2000). Außerdem ist die Überlebenszeit zirkulierender Tumorzellen kurz und es ist kaum etwas darüber bekannt, wie die Zellen im Blutstrom bzw. den Schritt der Extravasation überleben (Pantel und Brakenhoff, 2004). Allerdings können Metastasen auch noch lange nach einer erfolgreichen Behandlung des Primärtumors auftreten, weil die Tumorzellen in der Lage sind, sowohl einzeln (Naumov et al., 2002) als auch in Form von Mikrometastasen (Holmgren et al., 1995) versteckt im Gewebe zu ruhen. Von einer Mikrometastase spricht man, wenn ein Zellverband eine Größe von 0,2 bis 2 mm erreicht hat. Diese können in einer Art Ruhestadium überdauern, bei dem aktive Proliferation durch Apoptose ausgeglichen wird, auf Grund des Unvermögens der Tumorzellen neue Gefäße zu bilden. Ort der Bildung von Metastasen Die meisten Metastasen entstehen in dem Kapillarsystem (Durchmesser etwa 8 µm), das die Tumorzellen zuerst erreichen. Es kommt also zu einem mechanischen Arrest auf Grund der Größe der Tumorzellen (Durchmesser meist größer als 20 µm). Bei zwei Dritteln aller Tumorzellen wird der Ort der Metastasierung folglich durch den Blutfluss bestimmt

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3. EINLEITUNG

(Chambers et al., 2002). Allerdings können Kolonkarzinomzellen ohne Größenlimitierung in Zielorganen arretieren (Schlüter et al., 2006) und Metastasen entstehen auch in entfernten Organen, wobei Tumorzellen eine gewisse Vorliebe für bestimmte Organe zu haben scheinen. So findet man Metastasen von Brustkrebs nicht nur in der Lunge, sondern auch bevorzugt in Knochen, Leber, Gehirn und Nebennieren, die von Prostatakrebs meist in Knochen, und Lungenkarzinome bilden sekundäre Tumore im Gehirn (Pauli et al., 1990). Stephen Pagets vor über hundert Jahren aufgestellte These vom „seed and soil“, bei der es zu spezifischen Wechselwirkungen zwischen der Tumorzelle (dem Samen) und dem Gewebe (dem Boden) kommt, hat also auch heute noch Bestand (Paget, 1889). Es gibt drei verschiedene Theorien, die versuchen, organspezifische Metastasierung zu erklären. Die erste schlägt selektives Wachstum vor, d. h. die Tumorzellen verlassen das Blut und die Lymphe in allen Organen im selben Maß, können sich aber nur dort vermehren, wo die entsprechenden benötigten Wachstumsfaktoren und extrazellulären Matrix-Komponenten verfügbar sind. Nach der zweiten Theorie exprimieren die Endothelzellen, die die Blutgefäße in den Zielorganen auskleiden, bestimmte Adhäsionsmoleküle, welche die Tumorzellen veranlassen, genau in dieses Gewebe auszuwandern. Es würde sich folglich um selektive Adhäsion handeln. Der dritte Mechanismus ist selektive Chemotaxis. Die Zielorgane produzieren gewisse Chemoattraktantien, die in die Blutzirkulation gelangen und bewirken, dass die Tumorzellen an diese Endothelien adhärieren (Liotta, 2001; Woodhouse et al., 1997). Maligne Brustzellen, die CXCR4 exprimieren, bilden z. B. bevorzugt Metastasen in Lunge, Leber und Knochenmark, in denen es eine starke Expression von CXCL12, dem Liganden von CXCR4, gibt. Die endgültige Verteilung der Metastasen spiegelt dann den Gehalt an Chemokinen wieder (Müller et al. 2001). Es ist jedoch anzunehmen, dass die organspezifische Metastasierung auf einem Zusammenspiel dieser drei Mechanismen beruht. Das Muster der gebildeten Metastasen ist auf jeden Fall nie zufällig (Gaßmann, 2004). Mikroumgebung Nicht nur Veränderungen in den Tumorzellen selber, sondern auch ihre Umgebung haben eine wichtige Funktion bei der Bildung sekundärer Tumore. So werden beispielsweise durch die Interaktion zwischen Tumor- und Stromazellen des Wirtsgewebes die beiden Proteasesysteme, die hauptsächlich für Proteolyse außerhalb der Zelle verantwortlich sind, kontrolliert. Hierbei handelt es sich um das Urokinase-Plaminogenaktivator (uPA)/ uPA-Rezeptor (Plasminogen) Netzwerk und die Matrixmetalloproteinasen (MMPs) (Bashyam, 2002). MMPs sind eine Familie von zinkbindenden Proteasen, die sowohl fast alle Komponenten der extrazellulären Matrix spalten als auch Adhäsionsmoleküle abbauen. Sie werden hauptsächlich von den Stromazellen produziert, aber ihre Expression wird durch Tumorzellen über Chemokine, Zytokine und EMMPRIN (extracellular matrix metallo-proteinase inducer) reguliert (Chang und Werb, 2001). MMPs sind ausnahmslos in allen Bindegeweben, die Tumorzellen umgeben, verstärkt exprimiert und ihr Expressionslevel korreliert mit der Invasivität (Arkona und Wiederanders, 1996), da sie die Migration durch den Abbau der extrazellulären Matrix erleichtern. Sie helfen den Tumorzellen aber auch durch die Regulation bestimmter Signalwege und die Inaktivierung und Aktivierung von Chemokinen und Wachstumsfaktoren (Overall und Kleifeld, 2006). Außerdem fördern MMPs die metastatische Verteilung durch Aktivierung von PAR1 (protease-activated receptor 1), einem G-Protein gekoppeltem Rezeptor, der in die Metastasierung zahlreicher Tumore involviert ist (Boire et al., 2005).

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3. EINLEITUNG

Die proteolytische Aktivität von MMPs wird durch spezifische Inhibitoren, so genannte TIMPs (tissue inhibitor of metalloproteinase), reguliert. Deshalb können TIMPs auch die Entstehung von Metastasen beeinflussen. Es wurde gezeigt, dass TIMP-2 Überexpression die Bildung von Läsionen im Knochenmark vermindern kann (de Clerck et al., 1992). Allerdings sind TIMPs auch in der Lage, Krebszellen vor Apoptose zu schützen (Valente et al., 1998; Jiang et al., 2001). Rolle von Angiogenese und Lymphangiogenese bei der Metastasierung Der Bildung neuer Blutgefäße kommt eine wichtige Funktion bei der Entstehung des Primärtumors zu. Es besteht eine Korrelation zwischen der Größe des Tumors und der Angiogenese (Srivastava et al., 1988). Letztere trägt aber auch zur Metastasierung bei. So konnte eine negative Korrelation zwischen dem Überleben der Patienten und dem Grad der Vaskularisierung für Tumore aus verschiedensten Geweben nachgewiesen werden (Woodhouse et al., 1997). Starke Vaskularisierung erhöht die Chance für Tumorzellen in die Zirkulation zu gelangen und vermutlich sind neue Blutgefäße durchlässiger (Denijn und Ruiter, 1993). Aber auch Lymphangiogenese ist nicht zu vernachlässigen. Sie kann direkt zur Bildung von Lymphknotenmetastasen führen (Christofori, 2006). Es spielen also sowohl Angiogenese, als auch Lymphangiogenese eine Rolle bei der Metastasierung.

3.1.2. EMT in der Tumorentwicklung 90% aller Tumore entstehen aus Epithel. Wenn aus einem benignen Tumor ein maligner, metastatischer entsteht, sind vor allem Änderungen in der Morphologie der Zelle zu beobachten. Aus differenzierten, polarisierten Epithelzellen müssen mobile mesenchymale Zellen werden. Dies geschieht mittels eines Vorgangs, der als epithelial-mesenchymaler Übergang („epithelial-mesenchymal transition“; EMT) bezeichnet wird (Abb. 3.2). Hierbei handelt es sich um einen Schlüsselschritt der embryonalen Morphogenese, der die Bildung des dreischichtigen Embryos bei der Gastrulation von Vertebraten ermöglicht (Thiery, 2002). Ohne EMT kann sich kein Organismus weiter als bis zur Blastula entwickeln (Thiery und Sleemann, 2006). Bei der Bildung von Metastasen lässt sich der Prozess des EMT jedoch zeitlich und räumlich so gut wie nicht verfolgen. Es findet in den meisten Tumoren auch kein vollständiger EMT statt, weshalb die Rolle bei der Ausbreitung der Tumorzellen stark umstritten ist (Thompson et al., 2005; Tarin et al., 2005). Dennoch weisen viele Aspekte auf eine Beteiligung an der Metastasierung hin. Wichtig ist jedoch eine genaue Unterscheidung zwischen Epithel- und Mesenchymzellen. Epithelien sind Zellschichten mit Zellverbindungen wie Tight, Anchoring und Gap junctions. Sie haben eine apikal-basolaterale Polarität und ein polarisiertes Zytoskelett und sind mit einer Basalmembran verbunden. Diese rigide Struktur unterdrückt die Entfernung einzelner Zellen aus dem Epithel. Deshalb wandern Epithelien meist als kollektiver Strang oder Haufen (Friedl und Wolf, 2003). Anders mesenchymale Zellen. Sie bilden keine organisierten Zellschichten, sondern Strukturen von unregelmäßiger Gestalt, ohne Polarität von Zelloberflächenmolekülen oder Aktinzytoskelett. Sie stehen nur über lokale Kontakte mit benachbarten Zellen in Verbindung und haben keine Basalmembran. Deshalb haben sie auch

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im Vergleich zu Epithelzellen eine gestreckte Morphologie und können als individuelle Zellen wandern (Lee et al., 2006). Bei dem EMT kommt es zu drastischen Veränderungen in den Zellen. Epitheliale und adhäsive Verbindungen werden aufgelöst, das Zytoskelett wird umorganisiert, wobei aus kortikalem Aktin Stressfasern entstehen, die Zellen verlieren ihre apikal-basolaterale Polarität und die Expression mesenchymaler Gene wird induziert (Huber et al., 2005). Es ist allerdings nicht eindeutig geklärt, was genau ausschließlich mesenchymale Marker sind (Zavadil und Böttinger, 2005).

Abb. 3.2: Übersicht über die am EMT beteiligten Faktoren. EMT wird durch verschiedene Signalwege induziert und intrazellulär durch Transkriptionsfaktoren vermittelt. Diese wirken zusammen in der Repression von epithelialen Markern und der Induktion der de novo Expression von mesenchymalen Markern. Dadurch werden aus polarisierten Epithelzellen migratorische mesenchymale Zellen, bzw. aus in situ Karzinomen invasive Karzinome (angepasst nach Kang und Massagué, 2004). Gesteuert wird dieser Prozess in den meisten Zellen durch Kooperation des TGF-β Signalweges mit onkogenem Ras (Oft et al., 1996; Lehmann et al., 2000; Janda et al., 2002) oder Rezeptortyrosinkinasen (Xie et al., 2004; Seton-Rogers et al., 2004; Ueda et al., 2004). TGF-β hat demnach eine doppelte Rolle in der Tumorprogression. In frühen Phasen vermittelt er Wachstumsrepression und Apoptose, aber in späten Stadien fördert er durch Induzieren des EMT Tumorinvasion und metastatische Verteilung (Christofori, 2006). Neben TGF-β spielen

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noch andere autokrine Faktoren eine Rolle. Hier sind vor allem HGF/SF, EGFs, FGFs, IGFs und PDGF zu nennen, die letztendlich alle EMT und Migration fördern, wobei das aber im Gegensatz zu TGF-β kontextabhängig und nicht universal ist (Huber et al., 2005). Es sind noch zahlreiche weiter Signalwege an der Umstrukturierung der Zellen beteiligt, die z. T. wiederum durch TGF-β induziert werden können. So zum Beispiel der Wnt-Signalweg, der Snail stabilisiert (Yook et al., 2005) und die Repression und den Abbau von E-Cadherin bewirkt, der Notch-Signalweg, der Hey1 und Snail-Transkriptionsfaktoren aktiviert (Timmerman et al., 2004) und somit letztendlich auch zur Repression von E-Cadherin beiträgt und der Hedgehog-Signalweg der Snail-Transkriptionsfaktoren sowie LEF/TCF-Zielgene aktiviert (Huber et al., 2005). Letzterer verursacht beispielsweise EMT in Brustkrebs (Karhadkar et al., 2004). Krebszellen reaktivieren also auch latente entwicklungsbiologische Programme, um die Schritte der Tumorgenese zu kontrollieren. Konstitutiv aktive Akt/PKB veranlasst Plattenepithelkarzinome zu EMT (Grille et al., 2003) und aktiviertes NF-κB ist ebenfalls essentiell zur Steuerung dieses Vorgangs, da es die Expression von E-Cadherin und Desmoplakin unterdrückt und die von Vimentin steigert (Chua et al., 2006). Bei Brustkrebs verhindert die Blockierung von NF-κB die Metastasierung (Huber et al., 2004). GSK-3β kann Snail an zwei verschiedenen Stellen phosphorylieren und somit blockieren, da die Phosphorylierung sowohl zur Ubiquitinierung und nachfolgendem Abbau führen kann als auch zum Export aus dem Kern (Zhou et al., 2004). Außerdem kann GSK-3β Snail und NF-κB auf transkriptioneller Ebene inhibieren (Bachelder et al., 2005). Aus diesen Gründen wird die Kinase beim EMT durch einen aktiven Wnt-Signalweg bzw. Signalgebung über PDGF gehemmt (Yang et al., 2006). Auch Hypoxie moduliert die Expression von Genen, die an der Metastasierung beteiligt sind. So führt sie zum Beispiel zur Transkription des met-Onkogens und damit zu einer Überexpression des Met-Rezeptors, was eine Verstärkung der HGF-Signale bewirkt (Pennacchietti et al., 2003). Der Verlust des epithelialen Phänotyps wird hauptsächlich durch Veränderungen in der Zelladhäsion gesteuert. Hier ist wiederum E-Cadherin bestimmend. In vitro ist ein direkter Zusammenhang zwischen der Verminderung des Adhäsionsmoleküls und dem Wegfall des epithelialen Phänotyps zu beobachten (Behrens et al. 1989). Außerdem ist der Verlust von E-Cadherin ein limitierender Schritt bei der Entwicklung von Adenomen zu Karzinomen in vivo (Perl et al., 1998). Es gibt zahlreiche Möglichkeiten E-Cadherin zu reduzieren. Auf der transkriptionellen Ebene über die Transkriptionsfaktoren Snail (Batlle et al., 2000, Cano et al., 2000), Slug (Hajra et al., 2002), ZEB1/δEF1 (Eger et al., 2005), ZEB2/SIP1 (Comijn et al., 2001), E12/E47 (Perez-Moreno et al. 2001) und Twist (Yang et al., 2004), durch Promotorhypermethylierung (Tamura et al., 2000) oder Histondeazetylierung (Peinado et al., 2004). Außerdem ist eine Verminderung durch Mutationen im E-Cadheringen möglich, was für Brust- und Magenkarzinome gezeigt werden konnte (Becker et al., 1994; Berx et al., 1995; Berx et al. 1998). Auch auf posttranslationeller Ebene wird die Menge an verfügbarem E-Cadherin über Phosphorylierung durch RTKs (Rezeptor-Tyrosin-Kinasen) wie EGFR, cMET, IGF-R1 und FGFR bzw. die nicht RTK c-Src reguliert (Kamei et al., 1999; Morali et al., 2001; Lopez und Hanahan, 2002; Lu et al., 2003). Diese führt dann zur Ubiquitinierung durch die E3-Ubiquitinligase Hakai und nachfolgender Endozytose und Abbau von E-Cadherin (Fujita et al., 2002). Durch TGF-β und HGF/SF induzierte MMPs können E-Cadherin extrazellulär spalten und so die Zell-Zell-Kontakte zerstören (Lochter et al., 1997; Noë et al., 2000, Davies

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et al., 2001; Christofori, 2006). γ-Sekretase/Presenilin-1 kann das Adhäsionsmolekül zytoplasmatisch spalten, was ebenfalls zur Auflösung der adhärenten Verbindungen führt (Marambaud et al., 2002). Der Verlust von E-Cadherin veranlasst EMT sowohl durch Auflösen von adhärenten Verbindungen, was dazu führt, dass sich die Zellen aus der Epithelzellschicht herauslösen, als auch durch einen direkten Effekt auf Signalwege, die an der Migration von Tumorzellen und dem Tumorwachstum beteiligte sind, wie den Wnt-Signalweg, und die Modulation des Aktinzytoskeletts über GTPasen aus der Rho-Familie. Außerdem geht der Verlust von E-Cadherin meist mit der Zunahme von N-Cadherin einher, einem mesenchymalen Cadherin, dem verschiedene migrations- und invasionsfördernde Eigenschaften zukommen (Cavallaro et al., 2002; Jechlinger et al., 2003). Diesen Vorgang bezeichnet man als Cadherin-Switch. Ein weiterer Wechsel ist von Typ I Cadherinen zu Typ II Cadherinen zu beobachten. Letztere vermitteln wesentlich schwächere Adhäsion (Chu et al., 2006). Während des EMT kommt es auch zu einem Austausch zwischen E-Cadherin und Integrinen. Die Reduktion von E-Cadherin signalisiert an Integrine und führt zur Bildung von Fokalkontakten, was wiederum eine Umwandlung von Cadherin- zu Integrin-vermittelter Adhäsion bedeutet (Balzac et al., 2005). Integrine selber können dann wieder über zahlreiche Wege die Reduktion von E-Cadherin veranlassen (Gimond et al., 1999; Li et al., 2003; Oloumi et al., 2004). Weitere Zelladhäsionsmoleküle, die beim EMT verloren gehen oder vermindert werden, sind Desmoplakin, Plakophilin 1 und Occludin (Jechlinger et al., 2003; Lee et al., 2006). Das heißt es werden während des EMT nicht nur adhärente Verbindungen aufgelöst, sondern auch Tight junctions und Desmosomen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass jedes Ereignis während des EMT durch eine Reihe bestimmter EMT Aktivatoren und Repressoren reguliert wird und auf dem Zusammenspiel von extrazellulären Signalen und Wachstumsfaktoren beruht, die wiederum zur Aktivierung von Signalwegen führen. Diese veranlassen einerseits über die Induzierung intrazellulärer Signalmoleküle wie Ras, Rho und Rac sowie von Src-Tyrosinkinasen den Umbau des Zytoskeletts und die Auflösung von Zellverbindungen, sowie andererseits über die Aktivierung von bestimmten Transkriptionsfaktoren den Abbau von E-Cadherin und anderen Zelladhäsionsmolekülen. Doch wann genau während der Tumormetastasierung wird EMT gebraucht? Es ist noch nicht genau bekannt, bei welchen Schritten der Metastasekaskade EMT eine Rolle spielt. Möglich ist, dass der Wechsel in der Morphologie primären Tumorzellen ermöglicht, die Basalmembran zu durchbrechen. Dafür spricht, dass EMT-spezifische Gene in der invasiven Front primärer Tumore exprimiert werden (Hlubek et al., 2004; Gavert et al., 2005; Lee et al., 2006). Denkbar wäre aber auch, dass EMT bei der Intravasation nötig ist. Es wurde gezeigt, dass Twist-induzierte EMT eben diesen Schritt ermöglicht (Yang et al., 2004). Andere Modelle sprechen dem EMT eine Funktion bei der Extravasation zu (Grünert et al., 2003). In einigen Tumoren ist EMT transient und tritt nur in der invasiven Front während der Metastasierung auf. Bei der Etablierung von Metastasen kommt es dann jedoch zu einem mesenchymal-epithelialen Übergang (MET) und einer Re-Expression von E-Cadherin (Schipper et al., 1991; Thiery, 2002; Grünert et al., 2003; Spaderna et al., 2006).

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3. EINLEITUNG

3.1.3. An der EMT beteiligte Transkriptionsfaktoren Wie schon zuvor beschrieben, spielen eine Reihe von Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle bei der Regulation der E-Cadherin-Expression und somit bei der Kontrolle des EMT. Auf diese Transkriptionsfaktoren soll hier nun kurz eingegangen werden. Eine Übersicht findet sich in Abb. 3.3. Snail und Slug sind die zwei Vertebraten-Vertreter der Snailfamilie von Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren mit insgesamt mehr als 50 Mitgliedern. Es handelt sich um transkriptionelle Repressoren, die eine hochkonservierte carboxyterminale Region mit vier bis sechs Zinkfingern vom C2H2-Typ und eine divergente aminoterminale Region haben. Ihre Repressoraktivität hängt von den Zinkfingern und der neun Aminosäuren langen N-terminalen SNAG-Domäne, sowie von Korepressoren wie CtBP (in Drosophila) und HDACs ab. Die Konsensusbindesequenz CANNTG zur Bindung an DNA entspricht der E-Box, also der Bindestelle für bHLH Transkriptionsfaktoren (Hemavathy et al., 2000; Nieto, 2002). Mitglieder der Snailfamilie sind wichtig bei der Entwicklung. Sie spielen eine Rolle bei der Mesodermbildung, der Entwicklung des zentralen Nervensystems und der Migration von Neuralrohrzellen. Diese Aufgabe bewältigen sie über die Induzierung des EMT (Hemavathy et al., 2000). Deshalb sterben Snail-mutierte Mäuse auch in der Gastrulation (Carver et al., 2001). Slug-mutierte Mäuse sind hingegen lebensfähig und fertil (Jiang et al., 1998). Snail-Transkriptionsfaktoren sind aber nicht nur essentiell für die Förderung von EMT (Moody et al., 2005), sondern schützen die Zellen auch vor Apoptose (Inukai et al., 1999; Inoue et al., 2002; Kajita et al., 2004; Vega et al., 2004), regulieren die Zelladhäsion und induzieren Migration (Barrallo-Gimeno und Nieto, 2005). Snail und Slug sind vornehmlich Transkriptions-Repressoren: Epitheliale Marker wie E-Cadherin (Batlle et al., 2000; Cano et al., 2000; Hajra et al., 2002), VE-Cadherin (Timmerman et al., 2004), Claudine (Martínez-Estrada et al., 2006), Occludin (Ikenouchi et al., 2003; Ohkubo und Ozawa, 2004), Desmoplakin (Savagner et al., 1997), Zytokeratine, MUC-1 (Guaita et al., 2002), Vitamin D Rezeptor (Pálmer et al., 2004), Kollagen II und Aggrecan (Seki et al., 2003) werden reprimiert, ebenso an der Proliferation beteiligte Gene wie Cyclin D2 (Vega et al., 2004) und CDK4. Allerdings können Snail-Transkriptionsfaktoren auch mesenchymale Gene wie Vimentin (Yokoyama et al., 2003), Vitronektin, Fibronektin, LEF-1 (Guaita et al., 2002) und MMP-2 (Yokoyama et al., 2003; Kuphal et al., 2005) induzieren (De Craene et al., 2005b). Reguliert wird die Aktivität der Transkriptionsfaktoren dabei durch zahlreiche Signalmoleküle wie EGF, FGF, HGF, TGF-β, BMPs, Wnts, PTHrP und Notch. Snail und Slug sind Ziele der induzierten Signalwege und können auf transkriptioneller Ebene, posttranslationell durch Phosphorylierung oder über die subzelluläre Lokalisierung reguliert werden (Barrallo-Gimeno und Nieto, 2005). Vor allem, weil sie EMT induzieren, spielen Snail-Familienmitglieder eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von malignen Tumoren. Nach Snail-Transfektion wird der Transkriptionsfaktor in der invasiven Front exprimiert und verleiht normalen Epithelzellen tumorigene, invasive und migratorische Fähigkeiten (Batlle et al., 2000; Cano et al., 2000). Da Snail-exprimierende Epithelzellen, die EMT durchgemacht haben, sich nicht mehr teilen können (Vega et al., 2004), begünstigt Snail eher Invasion als Tumorwachstum. Snail hat also zwei Hauptfunktionen: Repression des epithelialen Phänotyps und Bewahrung der Zellen vor dem Zelltod.

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3. EINLEITUNG

Abb. 3.3: Schematische Darstellung verschiedener E-Box-bindender Transkriptionsfaktoren. Eingezeichnet sind jeweils die wichtigsten Domänen und die Größe in Aminosäuren. Für ZEB1 und ZEB2 ist zusätzlich die Aminosäureidentität in % angegeben (angepasst nach Postigo und Dean, 2000). Die Transkriptionsfaktoren sind nicht in den richtigen Größenverhältnissen dargestellt. NLS = nukleare Lokalisationssequenz, HLH = Helix-Loop-Helix-Motiv. ZEB1/δEF1 und ZEB2/SIP1 sind ebenfalls Repressoren der Transkription und gehören zu der δEF1-Familie. Sie sind homolog (96% Aminosäureidentität) und haben jeweils zwei Zinkfingergruppen aus drei bzw. vier Zinkfingern, die eine Homöodomäne flankieren (Funahashi et al., 1993; Verschueren et al., 1999). Sie binden auch an E-Box-ähnliche Elemente mit der Kernsequenz CACCT, sog. Z-Boxen (Sekido et al., 1997; Remacle et al., 1999; Verschueren et al., 1999) und rekrutieren den Korepressor CtBP, der für die Funktionalität notwendig ist (Postigo und Dean, 1999; Postigo und Dean, 2000). ZEB1 kann zusätzlich mit den Azetyltransferasen p300 und P/CAF interagieren, die dann als Koaktivatoren wirken (Postigo et al., 2003). ZEB1 und ZEB2 unterscheiden sich in ihrer Aktivität und Gewebeverteilung (Postigo und Dean, 2000). Ebenso wie Snail und Slug sind sie in der Lage, EMT zu induzieren (Eger et al., 2005; Vandewalle et al., 2005). ZEB1 wird durch Östrogen induziert und hat eine Funktion in den späten Stadien der Embryonalentwicklung. Verlust von ZEB1 in Mäusen führt zu T-Zell-Defizienz und Deformierungen des Skeletts. Da kein Phänotyp im zentralen Nervensystem oder den Muskeln zu beobachten ist, wird vermutet, dass ZEB2 den Verlust von ZEB1 kompensieren kann (van Grunsven et al., 2001). Es wurde gezeigt, dass der Transkriptionsfaktor Interleukin 2 (Williams et al., 1991), Kollagen Typ I (Ponticos et al., 2004), Integrin α4 (Remacle et al., 1999) und E-Cadherin reprimieren kann (Eger et al., 2005).

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ZEB2 ist ebenfalls wichtig für entwicklungsbiologische Prozesse wie die Bildung von Mesoderm und neuronalem Gewebe (van Grunsven et al., 2001). Es kann über seine MH2-Domäne mit Smad-Proteinen interagieren (Verschueren et al., 1999). Bekannte Zielgene sind vor allem Zelladhäsionsmoleküle wie Claudin 4, ZO-3, E- und P-Cadherin, Plakophilin 2, Desmoplakin und Konnexine (Comijn et al., 2001; Vandewalle et al., 2005). Auch für die beiden bHLH Transkriptionsfaktoren E12/E47 und Twist konnte eine Funktion beim EMT nachgewiesen werden, weil sie in der Lage sind, E-Cadherin zu reprimieren (Pérez-Moreno et al, 2001; Yang et al., 2004). Proteine der HLH-Familie können als Dimere sequenzspezifisch über E-Boxen an DNA binden. E12 und E47 sind zwei unterschiedliche Splicevarianten des E2A-Genproduktes (Murre et al., 1989), die in zahlreichen adulten Geweben exprimiert werden (Aronheim et al., 1993) und normalerweise für die B-Zelldifferenzierung und Umlagerung der Ig-Gene verantwortlich sind (Bain et al., 1994; Zhuang et al., 1994). Der Verlust führt zur Bildung von Thymuslymphomen, weshalb für E12/E47 auch eine Rolle als Tumorsuppressor angenommen wird (Engel und Murre, 1999). Twist wird in Vertebraten hauptsächlich in der Neuralleiste exprimiert und ist entscheidend an der Morphogenese beteiligt. Während der Metastasierung hat die Expression von Twist eine tragende Rolle bei der Intravasation (Yang et al., 2004).

3.1.4. Die Rolle von Adhäsionsmolekülen bei der Metastasierung Der Prozess der Metastasierung erfordert dynamische Veränderungen der Interaktionen zwischen den einzelnen Tumorzellen, zwischen Tumorzellen und anderen Zellen bzw. der extrazellulären Matrix. Aus diesem Grund spielen zahlreiche Adhäsionsmoleküle auf der Zelloberfläche wie Selektine, Cadherine, IgCAMs, Integrine und der Hyaluronatrezeptor CD44 eine entscheidende Rolle bei der Bildung von Metastasen und können diesen Prozess sowohl positiv als auch negativ beeinflussen. Hierbei agieren sie nicht isoliert, sondern die Funktion bestimmter Adhäsionsmoleküle wird durch die Aktivität anderer Adhäsionsmoleküle und Signalwege moduliert. Deshalb soll ein kurzer Überblick über die beteiligten Rezeptoren geschaffen werden (Abb. 3.4). Selektine sind Typ I Transmembranproteine (N-Terminus im extrazellulären Bereich, C-Terminus im Zytoplasma) mit einer hochkonservierten Lektindomäne, die Ca2+-abhängige, heterophile Interaktionen an Sialyl-Lewis A bzw. X vermitteln. Diese Bindungen sind transient und schwach. Es gibt E-, S- und P-Selektine (Humphries und Newham, 1998). Sie sind vor allem während der Entzündungsreaktion beim Rollen der Leukozyten entlang des Endothels vor der Extarvasation wichtig (Butcher und Picker, 1996), es konnte jedoch auch gezeigt werden, dass die Expression der Liganden und die Verteilung der Selektine auf Endothelien wichtig für die organspezifische Bildung von Metastasen ist (Biancone et al., 1996; Brodt et al., 1997). Wie schon zuvor erwähnt, spielt der Verlust von E-Cadherin eine entscheidende Rolle bei der Bildung von Metastasen und wird deshalb während des EMT stark reguliert. Cadherine sind ebenfalls Typ I Transmembranproteine, die Ca2+-abhängige, meist homophile Interaktionen zwischen benachbarten Zellen vermitteln. Sie bestehen aus fünf extrazellulären Cadherin-domänen, einem transmembranen Bereich und einer hochkonservierten zytoplasmatischen

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3. EINLEITUNG

Domäne, die durch Catenine mit dem Aktinzytoskelett verbunden ist (Humphries und Newham, 1998). Klassische Cadherine sind vor allem für die Bildung von adhärenten Verbindungen wichtig.

Abb. 3.4: Schematische Darstellung von Adhäsionsmolekülen. Selektine sind Transmembranproteine mit einer hochkonservierten Lektindomäne am aminoterminalen Ende. Klassische Cadherine bestehen aus fünf extrazellulären Cadherindomänen, einem transmembranen Bereich und einem hoch konservierten zytoplasmatischen Schwanz. IgCAMs (Immunglobulin-ähnliche Zell-Adhäsionsmoleküle) haben eine oder mehrere Ig-ähnliche Domänen im extrazellulären Bereich, die durch Disulfidbrücken zusammengehalten werden, und eine variable Anzahl von Fibronektin-Typ III-Domänen. Meistens besitzen sie, wie hier dargestellt, eine Transmembrandomäne, sie können aber auch mittels eines GPI-Ankers an die Zelloberfläche gebunden sein. Integrine sind Heterodimere aus einer α- und einer β-Untereinheit, die nicht kovalent assoziiert sind. Die Expression von E-Cadherin ist in den meisten, wenn nicht sogar in allen epithelialen Tumoren verloren gegangen, was vermuten lässt, dass der Verlust von E-Cadherin eine Voraussetzung für Tumorzellinvasion und Metastasierung ist (Birchmeier und Behrens, 1994). Die Inhibierung der E-Cadherin Funktion durch spezifische Antikörper führt zum Verlust der Zell-Zell-Kontakte und Invasivität in sonst nicht-invasiven Epithelzellen in vitro (Behrens et al. 1989). Die Wiederherstellung eines funktionellen Cadherin-Komplexes durch E-Cadherin Überexpression blockiert Invasion und induziert einen benignen, epithelialen Phänotyp (Chen und Öbrink, 1991; Frixen et al., 1991; Vleminckx et al., 1991). Außerdem wird durch E-Cadherin Überexpression die Bildung von Metastasen reduziert (Mbalaviele et al., 1996). Vermutlich ist der Verlust der E-Cadherin vermittelten Zell-Zell-Adhäsion alleine jedoch nicht ausreichend, einen invasiven Phänotyp zu verursachen. Es scheint vielmehr so, dass die Reduzierung des Adhäsionsmoleküls zur Aktivierung spezifischer Signalwege führt, die dann die Tumorzellinvasion veranlassen (Cavallaro et al., 2002).

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3. EINLEITUNG

Ein weiteres am Prozess der Metastasierung beteiligtes Cadherin ist, wie schon kurz erwähnt, N-Cadherin, das Mobilität und Migration der Tumorzellen fördert (Tran et al., 1999; Hazan et al., 2000; Li et al., 2001). Die Suppression der N-Cadherin Expression in invasiven Plattenepithelkarzinomen führt zur Induktion von E- und P-Cadherin und zu einem epithelialen Phänotyp, wohingegen die Überexpression in normalen Plattenepithelzellen die Reduzierung von E- und P-Cadherin veranlasst und einen invasiven Phänotyp induziert (Islam et al., 1996). N-Cadherin kann sogar E-Cadherin vermittelte Zell-Zell-Adhäsion überwinden (Nieman et al., 1999; Hazan et al., 2000). Erhöhte Expression von P-Cadherin in Brustkrebs und Cadherin-6 in Nierenzellkarzinomen ist mit einer schlechten Prognose verbunden (Shimazui et al., 1998). Eine weitere Gruppe von Zelladhäsionsmolekülen, denen eine Funktion bei der Metastasierung zukommt, sind die sog. IgCAMs (Immunglobulin-ähnliche Zell-Adhäsionsmoleküle). Hierbei handelt es sich um Proteine mit einer oder mehreren Ig-ähnlichen Domänen, die durch Disulfidbrücken zusammengehalten werden, und einer variablen Anzahl von Fibronektin-Typ III-Domänen im extrazellulären Bereich. Sie vermitteln kationen-unabhängige homophile aber auch heterophile Interaktionen sowohl mit anderen Adhäsionsmolekülen als auch an Proteine der extrazellulären Matrix. Meistens besitzen sie eine Transmembrandomäne, sie können aber auch mittels eines GPI-Ankers an die Zelloberfläche gebunden sein (Cavallaro und Christofori, 2004). Für L1 (CD171) konnte gezeigt werden, dass es in der invasiven Front verstärkt exprimiert wird und im experimentellen System Mobilität, Transformation und Tumorgenität fördert (Gavert et al., 2005). Außerdem ist es an der Regulation der metastatischen Verteilung von Melanomen beteiligt (Thies et al., 2002). Ein anderer Vertreter, MCAM (MUC18/ Mel-CAM/ CD146) wird in metastatischen Melanomen im Vergleich zu benignen Zellen stark überexprimiert. 80% der Metastasen von Melanomen exprimieren MCAM (Bogenrieder und Herlyn, 2003). In Nacktmäusen besteht eine Korrelation zwischen der Expression von MCAM und der Fähigkeit von Melanomzellen zu metastasieren (Luca et al. 1993; Xie et al., 1997). Außerdem unterdrückt die Verminderung von MCAM Tumorgenese und metastatischen Phänotyp in Melanomzellen in vivo (Satyamoorthy et al., 2001; Mills et al., 2002). Allerdings wurde für Brustkarzinome gezeigt, dass dort die MCAM-Expression verloren geht und die Überexpression zu kohäsiveren Zellen und kleineren Metastasen führt (Shih et al., 1997). ICAM-1 wird stärker in malignen als benignen Läsionen exprimiert und eine Inhibierung der Expression in Melanomzellen vermindert deren Metastasierung (Miele et al., 1994). Für NCAM konnte gezeigt werden, dass eine Verminderung in β-Zelltumoren des Pankreas zur verstärkten Metastasebildung führt (Perl et al., 1999) und dass der Verlust von NCAM mit einer schlechten Prognose korreliert (Cavallaro und Christofori, 2004). Auch Integrine sind bei der Verteilung der Tumorzellen wichtig. Es handelt sich um Heterodimere aus einer α- und einer β-Untereinheit, die nicht kovalent assoziiert sind. Bis heute sind etwa 24 α- und 9 β-Untereinheiten bekannt, die jeweils Typ I Transmembran-proteine sind. Die Adhäsion ist Ca2+- oder Mg2+-abhängig und eher transient, die Festigkeit der Bindung steigt jedoch mit der Anzahl der beteiligten Adhäsionsmoleküle. Integrine sind sog. Matrixrezeptoren, d.h. sie vermitteln hauptsächlich eine Bindung an Komponenten der extrazellulären Matrix, allerdings sind sie ebenso in der Lage, heterophile Interaktionen mit anderen Adhäsionsmolekülen einzugehen. In der Zelle sind die relativ kurzen zytoplasmatischen Bereiche über Adapterproteine mit dem Aktinzytoskelett verbunden.

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3. EINLEITUNG

Integrine können sowohl Signale aus der Zelle weitergeben („inside-out signalling“) als auch Information in die Zelle weiterleiten („outside-in signalling“). Für letzteres ist eine Aktivierung nötig, die durch Ligandenbindung veranlasst werden kann, ersteres führt selber zur Aktivierung. Dies geschieht über Konformationsänderungen und Anhäufung, das sog. Clustern (Humphries und Newham, 1998; Giancotti und Ruoslahti, 1999; Hood und Cheresh, 2002; Hynes, 2002). Die Rezeptoren sind essentiell für die Migration der Tumorzellen im Bindegewebe, weil sie einerseits den Kontakt zur Matrix fördern und andererseits durch die Aktivierung von Proteasen deren Abbau veranlassen. Außerdem sind sie für das Überleben der Zelle im Blutstrom wichtig, da sie durch Anschalten bestimmter Signalwege vor Anoikis schützen und Proliferation fördern. Anoikis ist eine Sonderform der Apoptose, bei der Zellen aufgrund des Verlusts der Zelladhäsion sterben. Bestimmte Integrin-Heterodimere wirken zudem proangiogenetisch (Varner und Cheresh, 1996; Felding-Habermann, 2003; Jin und Varner, 2004). Tumorzellen zeigen dramatische Veränderungen in Menge und Art der exprimierten Integrine und deren Affinität für Komponenten der extrazellulären Matrix. Es kommt also zu einem Integrin–Switch. Hierbei scheinen α2β1 und α3β1 die Tumorprogression zu unterdrücken, wohingegen αvβ3, αvβ6, α4β1, und α6β4 Tumorprogression und zum Teil auch Metastasierung fördern (Guo und Giancotti, 2004). Zelladhäsionsmoleküle halten also nicht nur Zellen zusammen, sondern unterstützen auch den Informationsaustausch zwischen ihnen. Außerdem tragen sie durch Interaktion ihrer zytoplasmatischen Bereiche mit Tyrosinkinasen bzw. der extrazellulären Domänen mit Wachstumsfaktorrezeptoren aktiv zur Signaltransduktion bei.

3.1.5. Migration von Tumorzellen über das Endothel Ein Schlüsselschritt in der Metastasierung ist die Extravasation der Tumorzellen über das Endothel, das die Blutgefäße oder das Lymphsystem auskleidet. Dieser Prozess lässt sich in Adhäsion der Tumorzellen an das Endothel, ihre Migration durch die Grenzen der Endothelzellen und die Wanderung durch das Stroma des Zielorgans unterteilen. Obwohl die transendotheliale Migration von besonderem Interesse ist, sind die zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen im Gegensatz zu der Diapedese von Leukozyten noch nicht genau definiert. Gezeigt wurde, dass Selektine und ihre Liganden auch eine wichtige Funktion beim Rollen von Tumorzellen entlang des Endothels haben (Friederichs et al., 2000; Dimitroff et al., 2004). Allerdings müssen Tumorzellen nicht rollen, um auszuwandern, sondern sie können gleich stabil an die Endothelzellen adhärieren (Glinskii et al., 2003). Auf jeden Fall ist der Arrest vom Gleichgewicht zwischen adhärenten und nicht-adhärenten Kräften abhängig. Auch verschiedene Integrine scheinen wichtig für die Tumor-Endothelzell-Interaktionen zu sein. Antikörper gegen Integrin αV vermindern die Transmigration von HT1080 Fibrosarkomzellen drastisch (Okada et al., 1994) und VLA-4 (α4β1) spielt eine wichtige Rolle bei der transendothelialen Migration von Myelomzellen (Parmo-Cabañas et al., 2004). In Brust- und Kolonkarzinomzellen führt die Kreuzvernetzung von CD44 zur Aktivierung von LFA-1 (αLβ2) und VLA-4, die dann die Adhäsion der Tumorzellen an das Endothel vermitteln und so die transendotheliale Migration erleichtern (Fujisaki et al., 1999; Wang et al., 2005a). Für αvβ3 konnte gezeigt werden, dass es für die Transmigration von WM 239

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3. EINLEITUNG

Melanom- und PC-3 Prostatakarzinomzellen nötig ist (Voura et al., 2001; Wang et al., 2005b). Ähnlich wie bei auswandernden Leukozyten, scheint also auch bei Tumorzellen erst eine transiente Verbindung über Selektine und anschließend eine feste Bindung über Integrine gebildet zu werden. Allerdings sind nicht alle Endothelien gleich, sondern sie können sich in Bezug auf die Expression von Adhäsionsmolekülen auf der Oberfläche unterscheiden. Außerdem werden durch die Bindung der Tumorzellen morphologische und funktionelle Änderungen im Endothel veranlasst (Sandig et al., 1997) und die Endothelzellen können während des Arrests beschädigt werden, was dazu führt, dass die darunter liegende Basallamina frei liegt. Nichtintaktes Endothel fördert dann die Auswanderung der Tumorzellen, da die Bindung an die extrazelluläre Matrix stärker ist als an die Endothelzellen. Es scheint ein direkter Zusammenhang zwischen dem Grad der Beschädigung und der Anzahl an metastasierenden Zellen zu bestehen (Weiss et al., 1988).

3.2. In vitro Modelle zur Metastasierung In vitro Studien wurden schon häufig verwendet, um die Passage der Tumorzellen durch das Endothel zu untersuchen. In einem Kokultursystem von Melanomzellen mit Endothelzellen konnten Veränderungen in der Zellgestalt und Umorganisation des Zytoskeletts beobachtet werden. Die Tumorzellen bildeten Lamellipodien und Pseudopodien aus, welche dann die Endothelzellkontakte penetrierten. Dadurch zogen sich die Endothelzellen zurück und die mit ihnen in Kontakt verbleibenden Melanomzellen wanderten hindurch. Die endothelialen Zelladhäsionsmoleküle PECAM-1 (CD31) und VE-Cadherin werden während dieses Prozesses umverteilt, was zu einem Verlust der Zell-Zell-Adhäsion an der Stelle führt, wo die Melanomzellen eindringen (Sandig et al., 1997; Voura et al., 1998). Ähnliche Ergebnisse wurden bei Versuchen mit Pankreaskarzinom-Zelllinien erzielt, was zeigt, dass Tumorzellen eine erhöhte Permeabilität des Endothels veranlassen (Nakai et al., 2005). Die Rolle von PECAM-1 selbst ist umstritten. Während gezeigt werden konnte, dass es essentiell für die transendotheliale Migration von Leukozyten ist (Muller et al., 1993; Mamdouh et al., 2003), wurde es für die Transmigration von Melanomzellen nicht benötigt (Voura et al., 1998; Voura et al., 2000). VE-Cadherin scheint aber keinen direkten Einfluss auf die Durchwanderung des Endothels zu haben (Voura et al., 1998), wohingegen N-Cadherin den heterotypischen Kontakt zwischen Melanomzellen und Endothel vermittelt (Qi et al., 2005). Außerdem ist bei der Transmigration von Kolonkrebszellen E-Selektin auf den Endothelzellen wichtig (Laferrière et al., 2001). Generell scheinen Tumorzellen bevorzugt an Ecken von drei (Nakai et al., 2005) bzw. an den Grenzen zwischen mehreren Endothelzellen zu transmigrieren (Longo et al., 2001). Einige Studien zeigten, dass die Endothelzellen nach dem Durchwandern der Tumorzellen die entstandene Lücke schließen und so die Einzellschicht wiederherstellen (Longo et al., 2001; Voura et al., 2001), andere Versuche wiederum, bei denen keine einzelnen Zellen, sondern Gruppen transmigrierten, verzeichneten eine irreversible Zerstörung des Endothels (Heyder et al., 2002). Da die meisten dieser Studien nur individuelle Tumorzelllinien von einem Tumortyp untersuchten, kann man die Ergebnisse schlecht verallgemeinern. Es ist deshalb nicht bekannt, ob molekulare Mechanismen existieren, die für verschiedene Tumorarten gleich sind.

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3. EINLEITUNG

3.3. Ziel dieser Arbeit Die Verbreitung von Tumorzellen über den Körper und die Bildung von Metastasen ist die hauptsächliche Todesursache bei Krebspatienten. Ein wichtiger Schritt bei diesem Prozess ist die Wanderung der Tumorzellen über das Endothel, das Blut- und Lymphgefäße auskleidet. Trotz zahlreicher Untersuchungen konnten die molekularen Grundlagen der trans-endothelialen Migration von Tumorzellen jedoch noch nicht genau beschrieben werden. Mittels in vitro Studien wurden zwar einige daran beteiligte Faktoren identifiziert, aber meist nur für eine bestimmte Zelllinie oder bestimmte Tumorarten. Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb, zu untersuchen, ob verschiedene Tumorzelllinien aus unterschiedlichen Geweben einen einheitlichen Mechanismus bei der Migration über die Endothelzellen nutzen bzw. weitere daran beteiligte Gene zu charakterisieren. Um diese Fragestellung zu analysieren, sollte zunächst eine umfangreiche Auswahl an Tumorzelllinien verschiedener Herkunft in vitro auf ihre Fähigkeit hin untersucht werden, eine Schicht aus Endothelzellen zu durchwandern und in einer Matrix zu migrieren, da diese zwei Schritte die Extravasation und Invasion der Metastasekaskade repräsentieren. Anschließend sollte mittels vergleichender Genexpressionsanalyse mit Hilfe von DNA-Mikroarrays nachgeprüft werden, ob sich transmigrierende von nicht transmigrierenden bzw. invasive von nicht invasiven Tumorzellen in ihrem Genexpressionsprofil unterscheiden. Wenn dies der Fall wäre, sollten verschieden exprimierte Gene auf ihre Funktion in der transendothelialen Migration und Invasion hin untersucht werden.

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4. ERGEBNISSE

4. ERGEBNISSE

4.1. Klassifizierung verschiedener Tumorzelllinien im Hinblick auf transendotheliale Migration und Invasion in Kollagen in vitro

Um die molekularen Mechanismen der transendothelialen Migration von Tumorzellen zu untersuchen, wurden zunächst 41 Tumorzelllinien aus verschiedenen Geweben und Tumorarten mittels des in Abb. 4.1 schematisch dargestellten in vitro Versuchs auf folgende Fähigkeiten untersucht:

1. Transmigration über eine Schicht von Endothelzellen 2. Einwanderung in eine Kollagenmatrix

Diese Arbeit wurde zusammen mit Dr. Claudia Mierke (AG Behrens, Experimentelle Medizin II, Universität Erlangen-Nürnberg) durchgeführt.

Abb. 4.1: Schematische Darstellung der Transmigration und Invasion von Tumorzellen in vitro. Für das in vitro Experiment wurden HUVEC (humane Nabelschnur-Endothelzellen) auf einer Kollagen I Matrix kultiviert, bis sie konfluent waren. Anschließend wurden die zu untersuchenden Tumorzelllinien entweder auf die Endothelzellen oder direkt auf das Kollagen ausgesät und nach einer Versuchsdauer von zwei Tagen das Verhalten der Tumorzellen mikroskopisch ausgewertet (Abb. 4.2). Hierbei ließen sich folgende Unterteilungen treffen: Mit Hilfe des Transmigrationsversuchs konnten 15 Zelllinien identifiziert werden, die in der Lage waren, über die Endothelzellschicht in die Matrix einzuwandern. Zelllinien dieser Gruppe werden im Folgenden als TEM+ bezeichnet. Für die Transmigration wurde ein künstlicher Schwellenwert von 100 Zellen/cm² festgelegt, da dieser Wert dem Hintergrund an invasiven HUVEC bzw. in den Präparationen möglicherweise enthaltenen Fibroblasten entspricht. Den anderen im Versuch getesteten 26 Zelllinien fehlte die Fähigkeit zur Durchwanderung des Endothels. Sie fallen deshalb in die TEM- Gruppe.

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4. ERGEBNISSE

Im Invasionsexperiment zeigte sich, dass alle TEM+ Zelllinien mit Ausnahme von A427 auch die Fähigkeit zur Invasion in eine Kollagen I Matrix besitzen, wohingegen kaum eine der TEM- Tumorzellen signifikant in das Kollagen einwandern konnte. Eine detaillierte Übersicht findet sich in Tab. 4.1. Es gab keine Korrelation zwischen Ursprungsgewebe der Zelllinien und Einteilung in eine der beiden Gruppen mit Ausnahme der Kolonkarzinom-Zelllinien, die alle in die TEM- Gruppe fielen.

Abb. 4.2: Transendotheliale Migration und Invasion von Tumorzellen in vitro. (A) Licht-mikroskopische Aufnahmen von 786.0 Nieren- und HCT116 Kolonkarzinomzellen auf der Oberfläche von Endothelzellen (a, b) bzw. im unter dem Endothel liegenden Kollagen I (a’, b’). Die Zellen waren auf konfluente HUVEC ausgesät worden. Die Bilder wurden nach zwei Tagen aufgenommen. Pfeile verweisen auf Zellen, die auf dem Endothel liegen, Pfeilspitzen auf Zellen in der Kollagenmatrix. (B) Elektronenmikroskopische Aufnahmen von MDA-MB-231 Brustkarzinomzellen in verschiedenen Trans-migrationsstadien. (a) Tumorzelle auf dem Endothel, (b) Tumorzelle bei der Passage durch zwei aneinander-grenzende Endothelzellen, (b´) Vergrößerung aus b (gekennzeichnet durch den Kasten), (c) Tumorzelle unter dem Endothel im Kollagen. Größenstandard in a, b und c gleich. (C) Lichtmikroskopische Aufnahmen von MDA-MB-231 und MS751 Brustkarzinomzellen auf der Kollagenoberfläche (a, b) bzw. im Kollagen I

(a’, b’). Pfeile verweisen auf Zellen, die auf dem Kollegen liegen, Pfeilspitzen auf Zellen in der Matrix. Die Bilder wurden 48 h Stunden nach der Aussaat der Zellen aufgenommen. Größenstandard in A und C gleich. Die Mehrzahl der untersuchten Zellen lagerte sich relativ schnell an die HUVEC bzw. das Kollagen an und breitete sich aus, wobei TEM+ Zellen einzeln auf der Oberfläche lagen und die meisten TEM- Zellen in epithelialen Schichten (Abb 4.2 A, C). Einige der TEM- Zellen adhärierten jedoch nur sehr schwach am jeweiligen Untergrund. Hier sind vor allem die zwei Kolonkarzinom-Zelllinien Colo201 und Colo205 zu nennen. Sie lagen als unausgebreitete, abgerundete Zellen alleine oder in Gruppen auf dem Substrat.

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4. ERGEBNISSE

Zelllinie Gewebe TEM Invasion TEM+ MDA-MB-231 Brust 8224 ± 1853 7095 ± 1076 786.0 Niere 6799 ± 2006 5564 ± 1999 EJ-28 Blase 4977 ± 1298 6480 ± 1359 PC-3 Prostata 3476 ± 1522 3820 ± 970 A375 Melanom 2417 ± 1675 3423 ± 841 A125 Lunge 2262 ± 1099 5214 ± 1051 DU145 Prostata 1775 ± 625 947 ± 474 A172 Glioblastom 1603 ± 820 1333 ± 12 HS578T Brust 1270 ± 512 3045 ± 752 MDA-MB-436 Brust 749 ± 629 947 ± 210 A875 Melanom 419 ± 261 998 ±12 CAKI-I Niere 291 ± 45 541 ± 180 FADU Pharynx 223 ± 111 1257 ± 969 A427 Lunge 121 ± 3 17 ± 15 BT549 Brust 117 ± 21 204 ± 120 TEM- LoVo Kolon 83 ± 33 106 ± 126 A431 Haut 78 ± 94 0 ± 0 RT112 Blase 74 ± 81 8 ± 12 A549 Lunge 67 ± 38 13 ± 18 Me180 Cervix 51 8 MDA-MB-468 Brust 47 ± 66 49 ± 69 HT-29 Kolon 44 ± 76 16 ± 27 SkBr3 Brust 40 ± 57 81 ± 114 MiaPaca2 Pankreas 39 ± 54 2 ± 4 MCF-7 Brust 32 ± 41 0 ± 0 SW620 Kolon 25 ± 24 13 ± 18 MDA-MB-453 Brust 17 ± 12 11 ± 15 SW948 Kolon 25 0 MDA-MB-361 Brust 21 ± 6 0 ± 0 MS751 Cervix 22 ± 14 25 ± 16 HCT116 Kolon 54 ± 48 40 ± 37 SW480 Kolon 13 ± 13 0 ± 0 C33A Cervix 8 74 ± 105 CaCo-2 Kolon 8 0 DANG Pankreas 4 55 KS Brust 7 ± 7 15 ± 21 DLD-1 Kolon 0 ± 0 0 ± 0 Capan I Pankreas 0 0 SW48 Kolon 0 0 Colo201 Kolon 0 0 Colo205 Kolon 0 ± 0 0 ± 0

Tab. 4.1: Klassifizierung von Tumorzelllinien auf Grund ihrer Fähigkeit zu transmigrieren bzw. in Kollagen einzuwandern. Angegeben ist das Gewebe, aus dem die untersuchten Zelllinien hervorgegangen sind, sowie die Anzahl der transmigrierten (TEM) bzw. eingewanderten (Invasion) Zellen pro cm² nach 48 h. Die Zahlen spiegeln den Mittelwert aus zwei bis zehn unabhängigen Versuchen ± der Standardabweichung bzw. das Ergebnis aus einem Versuch wieder. Im Kollagen hatten die meisten Tumorzellen eine spindelförmige Morphologie. Doch auch hier gab es Ausnahmen wie z. B. die transmigrierenden Zelllinien EJ-28, A375 und A427, die

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4. ERGEBNISSE

eher rundlich aussahen. Im elektronenmikroskopischen Bild (Dr. Ursula Schlötzer-Schrehardt, Augenheilkunde, Universität Erlangen-Nürnberg) konnte außerdem gezeigt werden, dass die Tumorzellen das Endothel während der Transmigration nicht zerstören, sondern zwischen den Endothelzellen hindurchwandern und während dieses Prozesses in Kontakt mit ihnen zu stehen scheinen (Abb. 4.2 B).

4.2. Identifizierung differenziell exprimierter Gene in ausgewählten TEM+ und TEM- Tumorzelllinien mittels DNA-Mikroarray-Analyse

Zur Identifizierung von Genen, die eine Rolle bei der transendothelialen Migration von Tumorzellen spielen könnten, wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Claudia Mierke und Dr. Ludger Klein-Hitpass (Institut für Zellbiologie, Universität Duisburg-Essen) mit jeweils vier Zelllinien aus den beiden Gruppen DNA-Mikroarray-Analysen durchgeführt. Bei den ausgewählten Zelllinien handelte es sich um EJ-28, MDA-MB-231, 786.0 und A375 für die TEM+ Gruppe und MCF-7, MS751, MDA-MB-453 und SW480 für die TEM- Zellen. Um die Expressionsprofile der acht Zelllinien zu vergleichen, wurden die erhaltenen Daten zunächst einer ungerichteten Clusteranalyse unterzogen. Hierbei werden die Zelllinien anhand ihrer Ähnlichkeiten bzw. Verschiedenheiten ihres Genexpressionsprofils in Gruppen eingeteilt. Für die Analyse wurden die Daten derjenigen Gene eingesetzt, die mindestens in einer der Zelllinien exprimiert wurden. Interessanterweise konnten die TEM+ und die TEM- Tumorzelllinien beim Vergleich der Expressionsdaten für diese 15255 Gene in zwei getrennte Gruppen unterteilt werden (Abb. 4.3 A). Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass Zellen, die zu

Abb. 4.3: Clusteranalyse von DNA-Mikroarray-Daten ausgewählter Tumorzelllinien aus der T

einer der beiden Gruppen gehören, ein ähnliches Trankriptionsprogramm aufweisen.

EM+ und der TEM- Gruppe. (A) Ungerichtete Clusteranalyse basierend auf den Expressionsdaten von 15255 informativen Genen. (B) Gerichtete Clusteranalyse zur Ermittlung von Genen, die zwischen den TEM+ und TEM- Zellen unterschiedlich exprimiert werden. Rot = verstärkt exprimiert im Vergleich zum Mittelwert, schwarz = kein Unterschied, grün = schwächer exprimiert im Vergleich zum Mittelwert. (C) RT-PCR-Analyse ausgewählter Gene, die unterschiedlich zwischen TEM+ und TEM- Zellen exprimiert werden. BCAT1 = Branched chain amino transferase 1, Intβ3 = Integrin β3, EREG = Epiregulin, SPRY = Sprouty homolog 2, EDIL3 = EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3, EVA1 = epithelial v-like antigen 1, E-CAD = E-Cadherin, SPINT 1 = Serinproteaseinhibitor, CLDN7 = Claudin 7 und JAG2 = Jagged 2.

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4. ERGEBNISSE

Mit den erhaltenen Daten wurde nun eine gerichtete Clusteranalyse durchgeführt, um Gene zu ermitteln, die bei der transendothelialen Migration entscheidend sein könnten. Hierfür wurde der Mann-Whitney Test mit einem Signifikanzfilter von p<0,014 verwendet. Hierbei handelt es sich um einen Signifikanztest, der die Mediane zweier Stichproben vergleicht, die nicht normalverteilt sein müssen. Insgesamt konnten so 736 Gene gefunden werden, die zwischen TEM+ und TEM- Zellen unterschiedlich exprimiert werden. Von diesen wiesen 554 eine Mittelwertsdifferenz von mindestens 200 auf (Abb. 4.3 B). Darunter waren vor allem Gene für Proteine, die an der Signaltransduktion beteiligt sind, extrazelluläre Matrixproteine, matrixabbauende Enzyme, die in TEM+ Zelllinien verstärkt exprimiert wurden und Zell-Zell-Adhäsionsproteine, die in TEM- Zellen hoch reguliert waren, aber auch zahlreiche unbekannte oder mutmaßliche Gene. Eine genaue Übersicht über interessante Gene findet sich in Tab. 4.2, eine Gesamtübersicht im Anhang dieser Arbeit.

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4. ERGEBNISSE

Regulation Gen Expressions-unterschied

Extrazelluläre Matrix/Proteasen

stärker ITGB3 Integrin β3 33 LOX Lysyloxidase 22 PLAU Plasminogenaktivator, Urokinase 18 EDIL3 EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3 8 CTSL Cathepsin L 3 CTSC Cathepsin C 3 ITGA5 Integrin α5 4

schwächer SPINT1 Serinproteaseinhibitor, Kunitz Typ 1 1/55 ITGB6 Integrin β6 1/31 ST14 Matriptase (Suppression of tumorigenicity 14) 1/13 LAD1 Ladinin 1/9

Signaltransduktion/Transkriptionsfaktoren

stärker IL8 Interleukin 8 34 EREG Epiregulin 24 IGFBP1 Insulin-like growth factor binding protein 1 21 TCF8 Transkriptionsfaktor 8 10 TLR2 Toll-like Rezeptor 2 9 TGFBR2 Transforming growth factor beta Rezeptor II 7 IL6 Interleukin 6 7 OSMR Onkostatin M Rezeptor 6 SPRY2 Sprouty homolog 2 (Drosophila) 6 IRS2 Insulinrezeptor Substrat 6 HIPK2 Homöodomain-interagierende Proteinkinase 2 4 JAG1 Jagged 1 4

schwächer ARHGAP8 Rho GTPase aktivierendes Protein 1/40 IRF6 Interferon regulatory factor 6 1/28 ERBB3 v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3 1/19 TACSTD2 Tumor-associated calcium signal transducer 2 1/16 EPHA1 EPH Rezeptor A1 1/10 MYB v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog 1/6 JAG2 Jagged 2 1/5 VDR Vitamin D Rezeptor 1/4 DDR1 Discoidin Rezeptor-Tyrosinkinase 1/4 SOX13 SRY (sex determining region Y)-Box 13 1/3

Zell-Zell-Kontakt

stärker PVRL3 Nectin 3 16 TSPAN4 Transmembrane 4 superfamily member 7 3

schwächer CDH1 E-Cadherin 1/96 EVA1 Epithelial v-like antigen 1 1/91 CDH3 P-Cadherin 1/76 CLDN7 Claudin 7 1/17 DLG3 Discs large homolog 3 (Drosophila) 1/8 EPPK1 Epiplakin 1 1/6 PKP3 Plakophilin 3 1/3 CELSR2 Flamingo homolog (Drosophila) 1/3

Stoffwechsel

stärker AKR1B10 Aldosereduktase 97 APOL1 Apolipoprotein L1 69 BCAT1 Branched chain aminotransferase 1 52

schwächer ABAT 4-Aminobutyrate Aminotransferase 1/56 ASS Argininosuccinatsynthetase 1/7

Andere

stärker FLG Filaggrin 16 MAP1B Mikrotubuli-assoziiertes Protein 1B 8 VIM Vimentin 5

schwächer MAP7 Mikrotubuli-assoziiertes Protein 7 1/25 MYO1D Myosin ID 1/25

Tab. 4.2: Gene, die zwischen TEM+ und TEM- Zelllinien unterschiedlich exprimiert werden. Gezeigt sind ausgewählte Gene eingeteilt nach ihrer Funktion sowie ob sie stärker bzw. schwächer in TEM+ Zellen im Vergleich zu TEM- Zellen exprimiert sind. Der Expressionsunterschied gibt das Verhältnis zwischen den Mittelwerten von den vier TEM+ zu den vier TEM- Zelllinien wieder.

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4. ERGEBNISSE

Um die Zahl der in Frage kommenden Gene weiter einzuschränken, wurde der relative Expressionsunterschied zwischen den Mittelwerten der beiden Gruppen bestimmt. Mit Hilfe dieser Analyse wurden 185 Gene identifiziert, die in den TEM+ Zelllinien signifikant mehr als dreifach stärker exprimiert werden im Vergleich zu TEM- Zelllinien und 151 Gene, die in den TEM- Zelllinien signifikant mehr als dreifach stärker exprimiert werden im Vergleich zu TEM+ Zelllinien. Die Expressionsprofile wurden zunächst mittels RT-PCR für ausgewählte Gene verifiziert (Tab. 4.3; Abb. 4.3 C).

Gen TEM+ TEM-

EJ-28 MDA-MB-231

786.0 A375 MCF-7 MS751 MDA-MB-453

SW480

BCAT1 556 A 711 P 976 P 1185 P 8 A 21 A 16 A 17 ABCAT1 355 P 819 P 1355 P 749 P 8 A 19 A 4 A 36 AInt β3 17 A 94 P 77 P 99 P 30 A 43 A 27 A 17 AInt β3 156 A 2240 P 61 A 127 A 8 A 54 A 6 A 10 AEREG 1554 P 1543 P 5283 P 1801 P 116 P 1 A 57 P 250 PSPRY2 3924 P 1561 P 765 P 695 P 190 P 94 M 257 P 688 PEDIL3 80 A 359 P 717 P 180 P 30 A 17 A 78 P 36 A

EVA1 17 A 9 A 8 A 13 A 3108 P 151 A 2591 P 680 PEVA1 287 P 26 A 33 A 56 A 7756 P 332 P 6131 P 3229 PE-CAD 35 A 8 A 12 A 213 P 15104 P 1665 P 8061 P 829 PSPINT1 57 A 101 A 40 A 22 A 1154 P 3621 P 2681 P 761 PCLDN7 72 A 649 P 120 A 103 A 4088 P 2462 P 5187 P 4612 PJAG2 198 A 323 A 115 A 260 A 1007 P 1600 P 1211 P 851 PJAG2 317 A 324 P 316 A 375 P 946 P 1470 P 1405 P 1022 P

Tab. 4.3: DNA-Mikroarray-Daten ausgewählter Gene, die zwischen TEM+ und TEM- Zelllinien unterschiedlich exprimiert werden. Die Zahlen repräsentieren die durchschnittliche Fluoreszenzintensität aller Sonden für ein Gen auf dem Array, also die Expressionsstärke. P = Present (detektierbar), M = Marginal (Grenzwert), A = Absent (nicht detektierbar). Da Gene identifiziert werden sollten, die eine Funktion bei der transendothelialen Migration zahlreicher Tumorzellen haben, wurde anschließend die Expression einiger interessanter Kandidatengene in allen 41 klassifizierten Zelllinien überprüft, um festzustellen, ob eine Korrelation zu den beiden Gruppen besteht. Wie Abb. 4.4 zu entnehmen ist, konnte für Integrin β3, EDIL3, BCAT1 und Interleukin 8 auch in der Vielzahl an Tumorzelllinien aus verschiedensten Geweben eine Übereinstimmung der Expression mit den TEM+ und TEM- Gruppen gezeigt werden. Für die beiden anderen überprüften Gene gilt das jedoch nicht. Epiregulin und Sprouty homolog 2 sind nahezu in allen getesteten Zelllinien exprimiert. Für Gene, die vorwiegend in TEM- Zellen exprimiert werden, ist die Korrelation für EVA1 am besten. Nur vier der TEM+ Zelllinien exprimieren dieses Gen, wohingegen sich nahezu in alle TEM- Zelllinien ein Amplifikat für EVA1 findet. Weniger gut ist die Übereinstimmung mit den Gruppen bei Jagged 2, E-Cadherin und SPINT1. Claudin 7 wird überhaupt nicht gruppenspezifisch exprimiert.

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4. ERGEBNISSE

E pr l ewählter Ge n llen u or ie

aldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase dienten als Kontrolle für die ingesetzten cDNA-Mengen.

AE

bb. 4.4: x essionsana yse ausg ne i a 41 T m zelllinien mittels RT-PCR. Dinteilung der Zelllinien entspricht derjenigen aus Abb. 4.1. Int αv = Integrin αv, Int β3 = Integrin β3, EDIL3 =

EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3, BCAT1 = Branched chain amino transferase 1, IL8 = Interleukin 8, EREG = Epiregulin, SPRY = Sprouty homolog 2, EVA1 = epithelial v-like antigen 1, E-CAD = E-Cadherin, CLDN7 = Claudin 7, JAG2 = Jagged 2 und SPINT 1 = Serinproteaseinhibitor. Die Haushaltsgene β -M

2

= β2-Mikroglobulin und GAPDH = Glyzerine

32

4. ERGEBNISSE

4.3. Untersuchung der Bedeutung von Integrin β3 bei der transendothelialen Migration von Tumorzellen

ie schon zuvor erwähnt, korrelierte die Expression von Integrin β3 sehr gut mFähigkeit von Tumorzellen zu transmigrieren. Mit Ausnahme von einer Zelllinie (A427) wurde dieses Gen in allen aus der TEM+ Gruppe exprimiert, aber nur in wenigen TEM- Zelllinien und dann auch meist eher schwach (Abb. 4.4). Außerdem konnte für dieses Protein schon früher eine Rolle bei der Transmigration nachgewiesen werden (Felding-Haberm2003). Deshalb sollte die Funktion von Integrin β3 bei diesem Prozess genauer analysiert werden.

4.3.1. Untersuchung der endogenen Expression von Integrin β3verschiedenen Tumorzelllinien

Zunächst wurde überprüft, ob die mRNA von Integrin β3 in ein Protein translatiert und dieses an die Oberfläche der Zellen transportiert wird. Tatsächlich konnte mittels Western BloAnalyse gezeigt werden, dass mit wenigen Ausnahmen alle TEM+ Zelllinien auch das Proteenthalten, aber keine der untersuchten TEM- Zelllinien, obwohl einige von ihnen das Gen exprimieren (Abb. 4.5 A).

Integrin β3 kann sowohl mit Integrin αv als auch mit Integrin αIIb funktionelle Heterodimebilden. Da der Fibrinogenrezeptor Integrin αIIbβ3 jedoch auf das hämatopoietische Systembeschränkt ist und sich auf Thrombozyten befindet, wo er eine Rolle bei der Aggregation

W it der

ann,

in

t-in

re

; Calvete, 1994), bzw. für die Assoziation von Tumorzellen

rchflusszytometrie (in Zusammenarbeit mit Dr. Claudia Mierke) und der Immunlokalisierung wurde deshalb die Oberflächenexpression in verschiedenen Tumorzelllinien analysiert. Abb. 4.5 B sowie Tab. 4.4 zeigen, dass Integrin αvβ3 auf nahezu allen TEM+ Zelllinien vorhanden ist, aber auf keiner der nicht transmigrierenden Zellen. In der Immunfluoreszenz wurde das Heterodimer ebenfalls ausschließlich auf der Oberfläche von TEM+ Zellen nachgewiesen und es zeigte sich weiterhin, dass der Rezeptor in Strukturen zu finden ist, bei denen es sich wahrscheinlich um Fokalkontakte handelt (Abb. 4.5 C). Bei der Färbung von unfixierten Zellen in Suspension mit Antikörpern gegen die beiden Untereinheiten bzw. gegen den Komplex wurde deutlich, dass Zelllinien aus der TEM- Gruppe zwar Integrin αv auf ihrer Oberfläche tragen, das Heterodimer konnte aber nur auf Zellen aus der TEM+ Gruppe gefunden werden (Abb. 4.6). Integrin αv wird in allen der verwendeten Tumorzelllinien exprimiert, was mittels RT-PCR gezeigt werden konnte (Abb. 4.4). Die erhaltenen Daten weisen darauf hin, dass ein Zusammenhang zwischen der Expression von Integrin β3 sowie der Oberflächenlokalisation von Integrin αvβ3 und der Fähigkeit von Tumorzellen zu transmigrieren besteht.

spielt (Perutelli und Mori, 1992mit Blutplättchen wichtig ist (Felding-Habermann et al., 1996), wurde im Folgenden nur Integrin αvβ3 untersucht. Für diesen Rezeptor war bekannt, dass seine Expression mit dem metastatischen Phänotyp von malignen Melanomen korreliert (Varner und Cheresh, 1996; Hood und Cheresh, 2002) und er bei der transendothelialen Migration von WM 239 Melanomzellen und PC-3 Brustkrebszellen wichtig ist (Voura et al., 2001; Wang et al., 2005b). Mit Hilfe der Du

33

4. ERGEBNISSE

Abb. 4.5: Western Blot-Analyse von Integrin β3 und Untersuchung der Oberflächenexpression von endoge α βndoge

nen Integrin v 3 in TEM+ und TEM- Zelllinien. (A) Western Blot-Analyse zum Nachweis von nem Integrin β3. β-Aktin diente als Proteinmengenabgleich. (B) Analyse der Zelloberflächenlokalisation

rd in allen Bildern gleich.

evon Integrin αvβ3 mittels Durchflusszytometrie. Jedes Diagramm zeigt ein repräsentatives Bild für die untersuchten Zelllinien. Die Zellen wurden entweder mit einem Antikörper gegen Integrin αvβ3 gefärbt oder mit einer IgG Isotypkontrolle behandelt. (C) Immunfluoreszenzfärbung von endogenem Integrin αvβ3 in paraformaldehyd-fixierten Zellen. Größenstanda

34

4. ERGEBNISSE

Tab. 4.4: Übe ng der Zelllinien entspricht den nzintensität als bei der Is

Abb. 4.6: einheiten. Unfixierte 78 erhalb der Bilder angegebenen nstandard für alle Bilder gleich

rsicht über die Ergebnisse der FACS-Analyse für Integrin αvβ3. Die Aufteilu Gruppen aus Tab. 4.1. +++: >20-fach, ++: 5 – 2-fach +: 2 – 4-fach stärkere Fluoresze

otypkontrolle, -/+: heterogene Population, -: kein Unterschied zur Isotypkontrolle.

Immunfluoreszenzfärbung von endogenem Integrin αvβ3 und den beiden Unter6.0 Nieren- bzw. SW480 Kolonkarzinomzellen wurden in Suspension mit den obAntikörpern gefärbt oder mit einer Maus IgG Isotypkontrolle behandelt. Größe

.

TEM+ TEM- Zelllinie αvβ3 Zelllinie αvβ3 Zelllinie αvβ3 MD - A-MB-231 +++ LoVo - HCT116 786. - EJ- - PC - A37 - A12 -

- A17 - HS - MD - A87 - CA FA A4 BT

0 ++ A431 - SW480 28 + RT112 - C33A -3 + A549 - CaCo-2 5 +++ Me180 - DANG 5 +++ MDA-MB-468 - KS

DU145 + HT-29 - DLD-1 2 - SkBr3 - Capan I

578T ++ MiaPaca2 - SW48 A-MB-436 - MCF-7 - Colo201 5 + SW620 - Colo205

KI-I ++ MDA-MB-453 - DU - SW948 - 27 -/+ MDA-MB-361 - 549 + MS751 -

35

4. ERGEBNISSE

4.3.2. Funktionelle Analyse der Bedeutung von Integrin β bei der

hrte. Blockierende Antikörper gegen die beiden Integrin-Untereinheiten hatten keinen

unterscheiden zu können, ob das Integrin auf Tumor- oder auf Endothelzellen entscheidend ist, wurden entweder die Tumorzellen oder die HUVEC mit dem Antikörper vorinkubiert und

β3

Abb. 4.7: Blockierungsexperimente mit monoklonalem Integrin αvβ3 Antikörper. Auswirkung der Behandlung mit einem blockierenden Antikörper gegen Integrin αvβ3 auf (A) transendotheliale Migration (TEM), (B) Invasion in eine Kollagenmatrix und (C) Adhäsion an HUVEC von MDA-MB-231 Brustkarzinomzellen. Die Transmigration und Invasion wurden nach 48 h bestimmt, die Adhäsion an HUVEC nach 3 h. Die Fehlerbalken geben den Mittelwert ± der Standardabweichung von zwei bis drei unabhängigen Experimenten wieder. *Signifikant unterschiedlich von der Kontrolle (p<0,05).

3transendothelialen Migration

Im folgenden Teil der Arbeit sollte nun die genaue Funktion von Integrin β3 während der Transmigration charakterisiert werden.

4.3.2.1. Hemmung der TEM verschiedener Tumorzelllinien mittels Blockierung des zelleigenen Integrin αvβ3

Zunächst wurde die Wirkung eines blockierenden Antikörpers gegen das Integrin-Heterodimer auf die transendotheliale Migration verschiedener Zelllinien aus der TEM+ Gruppe untersucht. Im Transmigrationsversuch konnte gezeigt werden, dass der Antikörper in einer Konzentration von 5 µg/ml die Anzahl der transmigrierenden Zellen um 37% bei MDA-MB-231 (Abb. 4.7 A), 21% bei 786.0, 50% bei CAKI-I, 42% bei EJ-28 und 31% bei A375 reduziert (Daten nicht gezeigt). Die Behandlung mit einer entsprechenden Isotypkontrolle hatte jedoch keinen Einfluss. Für MDA-MB-231 wurde der Versuch außerdem mit einer Antikörperkonzentration von 20 µg/ml durchgeführt, was zu einer Verminderung von 55% füsignifikanten Effekt auf die Transmigration (Daten nicht gezeigt). Sowohl alle der im Versuch getesteten Tumorzelllinien, als auch HUVEC haben Integrin αvβ3 auf ihrer Oberfläche. Um

dann die Transmigration bestimmt. Lediglich die Vorbehandlung der Tumorzellen führte zu einem vergleichbaren (MDA-MB-231) oder sogar noch stärkeren Effekt (786.0) als die Inkubation aller Zellen mit Integrin αvβ3 Antikörpern. Die Zugabe des Antikörpers zu den HUVEC hatte keine Wirkung auf die Anzahl der transmigrierenden Zellen (Tab. 4.5). DiesesErgebnis zeigt, dass ausschließlich das auf den Tumorzellen befindliche Integrin αv

während der Transmigration eine Rolle spielt.

36

4. ERGEBNISSE

Um herauszufinden, für welchen Schritt dieses Prozesses der Rezeptor wichtig ist, wurde zusätzlich der Effekt des blockierenden Antikörpers auf die Invasion von Tumorzellen in eine

enmatrix und die Adhäsion an HUVKA

ollag EC untersucht. Weder die Invasion noch die

körpers (Daten nicht gezeigt). Das deutet darauf hin, ass Integrin αvβ3 hauptsächlich für die Passage der Tumorzellen durch die Endothelzellen

in

Abb. gegen Inte sequenz

urde hinter den RNA-Polymerase H1-Promotor in pSUPER eingefügt. Sie enthält 19 nt lange Sequenzen, die

dhäsion wurden beeinträchtigt (Abb. 4.7 B, C). Diese Experimente wurden auch für die anderen im Transmigrationsversuch getesteten Zellen durchgeführt. Es zeigte sich ebenfalls kein Effekt durch die Zugabe des Antidbenötigt wird und nicht für die Adhäsion an das Endothel oder die später nachfolgende Invasion die darunter liegende Matrix.

Tab. 4.5: Übersicht über die Ergebnisse der Blockierungsexperimente mit monoklonalem Integrin αvβ3 Antikörper. MDA-MB-231 Brust- und 786.0 Nierenkarzinomzellen wurden wie angegeben mit Antikörper gegen Integrin αvβ3 oder IgG Isotypkontrolle behandelt. Vorinkubation erfolgte für 30 min bei 4°C. Angaben in % transmigrierte Zellen im Vergleich zu unbehandelten parentalen Zellen (=100%).

4.3.2.2. RNAi-vermittelter Knockdown der Integrin β3 Expression in 786.0 Zellen Um die Funktion von Integrin β3 bei der transendothelialen Migration von Tumorzellen weiter zu untersuchen, wurde die RNAi-Technik verwendet. Mit dieser sollte endogenes Integrin β3 in TEM+ Zellen reduziert werden. Hierfür wurden verschiedene Integrin β3 spezifische 19 nt lange Sequenzen in den Vektor pSUPER eingefügt. Wenn das Plasmid exprimiert wird, führt dies zu Bildung von kurzen doppelsträngigen RNAs, sogenannten shRNAs (short hairpin RNAs), die über den Mechanismus der RNA-Interferenz zum Abbau der Integrin β3 RNA führen (Abb. 4.8 A).

4.8: Klonierungsschema für pSUPER-Intβ3 Vektoren und transiente Expression der shRNAgrin β3 in 293T Zellen. (A) Übersicht über die Klonierung von shRNA gegen Integrin β3. Die Ziel

wkomplementär zur Integrin β3 mRNA sind und als umgekehrte Wiederholungen getrennt durch einen 9 nt langen Linker angeordnet sind. Der H1-Promotor führt zur Transkription von RNA-Molekülen definierter Länge, die sich zu einer Haarnadelstruktur zusammenfalten (shRNA). (B) Western Blot-Analyse des Tests zweier verschiedener shRNA gegen Integrin β3 in transienten Kotransfektionen von humanem Integrin β3 und pSUPER-Intβ3-3/4 bzw. 5/6 in 293T Zellen (Integrin β3 negativ). β-Aktin diente als Proteinmengenabgleich.

Zelllinie Antikörper αVβ3 Maus IgG

gemeinsame Inkubation

Tumorzellen vorinkubiert

HUVEC vorinkubiert

gemeinsame Inkubation

Tumorzellen vorinkubiert

HUVEC vorinkubiert

MDA-MB-231 58 59 91 94 92 93 786.0 79 66 90 97 96 93

37

4. ERGEBNISSE

Die Expressionskonstrukte wurden in transienter Transfektion auf Funktionalität getestet. Nur eine der so klonierten Zielsequenzen (Intβ3-5/6) zeigte eine starke Verminderung des Integrin β3 Proteins (Abb. 4.8 B). Da der pSUPER-Vektor keinen für die Selektion geeigneten Marker enthält, musste die Expressionskassette bestehend aus RNA-Polymerase H1-Promotor und Zielsequenz in pcDNA3.1 (+) umgesetzt werden. 786.0 Nierenkarzinomzellen wurden dann entweder mit pcDNA-H1-Intβ3-5/6 oder mit dem leeren pcDNA-H1-Vektor stabil transfiziert. Die erhaltenen Klone wurden selektioniert und für die folgenden Versuche drei Neomyzin-resistente Kontrollklone sowie drei RNAi β3 Klone ausgewählt. Letztere enthielten signifikant weniger mRNA für Integrin β3. Die mRNA Mengen für Integrin α variierten, waren jedoch nicht spezifisch reduziert oder erhöht.

6.0 Nierenkarz UPER Kontr reverse

= β2-Mikro tegrin

3 in ausgewählten Kontrollklonen (neo) und RNAi β3 Klonen (RNAi β3). Die Zahlen in der Mitte geben die lative Menge an Integrin β Protein normalisiert auf β-Aktin wieder. Der Wert für den Kontrollklon neo #3

gegen Integrin αvβ3 keinen Einfluss auf die Invasion und die Adhäsion der getesteten

v

Kontrollansätze ohne reverse Transkriptase (-) zeigten, dass die verwendete RNA keine Verunreinigungen von genomischer DNA enthielt (Abb. 4.9 A). Auch die Proteinmengen von Integrin β3 waren in den RNAi β3 Klonen durchschnittlich um 75% vermindert im Vergleich zu den Kontrollklonen, wobei auch hier die Werte leicht schwankten (Abb. 4.9 B). Die Klone unterschieden sich in ihrer Morphologie weder untereinander noch von den parentalen Zellen und auch bei der Proliferation konnte kein Unterschied beobachtet werden (Daten nicht gezeigt).

Abb. 4.9: Auswirkung des RNAi-vermittelten Abbaus von endogenem Integrin β3 in 78inomzellen. (A) RT-PCR-Analyse der Expression von Integrin αv und β3 in stabilen pS

ollklonen (neo) und RNAi β3 exprimierenden Klonen (RNAi β3). +, - = mit bzw. ohneTranskriptase zur Unterscheidung zwischen cDNA und genomischer DNA. Das Haushaltsgen β2-Mikro.

globulin diente als Kontrolle für die eingesetzten cDNA-Mengen. (B) Western Blot-Analyse von Inβre 3wurde auf 1,0 gesetzt. (C) Transendotheliale Migration (TEM), (D) Invasion in eine Kollagenmatrix und (E) Adhäsion an HUVEC der Klone aus (A) und (B). Die Transmigration und Invasion wurden nach 48 h bestimmt, die Adhäsion an HUVEC nach 2 h. Die Fehlerbalken geben den Mittelwert ± der Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten wieder. *Signifikant unterschiedlich von der Kontrolle (p<0,05). Die RNAi Klone zeigten jedoch eine um 50 – 60% signifikant verminderte Transmigration (Abb. 4.9 C). Wie schon zuvor in den Blockierungsexperimenten, bei denen der Antikörper

38

4. ERGEBNISSE

Tumorzelllinien hatte, konnte auch in diesem Experiment kein Unterschied zwischen Kontrollklonen und RNAi exprimierenden Klonen bei diesen beiden Vorgängen beobachtet werden (Abb. 4.9 D, E). Mit Hilfe der RNAi Technik konnte also erneut nachgewiesen werden, dass Integrin β3 eine spezifische Rolle bei dem Schritt der Transmigration von Tumorzellen zukommen muss.

4.3.2.3. Ektopische Expression von Integrin β3 in TEM- A549 Zellen Mit den bisherigen Experimenten konnte gezeigt werden, dass sowohl die Blockierung des Oberflächen-Integrins αvβ3 mittels Antikörper als auch die Reduzierung des endogenen Integrin β3 durch RNAi zu einer Verminderung der Transmigration von Tumorzellen führt. Es

Integrin β3 exprimieren. Für weitere Versuche wurden drei positive Klone (Abb. 4.10 A) sowie drei Kontrollklone, die mit

ildern gleich. (C) ransendotheliale Migration (TEM) der einzelnen Klone, (D) der gepoolten Zellen mit und ohne HGF-

stellte sich nun die Frage, ob die Überexpression von exogenem Integrin β3 in Zellen aus der TEM- Gruppe zu einer Steigerung der Fähigkeit zu transmigrieren führt. Um dies zu untersuchen, wurden A549 Lungenkarzinomzellen stabil mit einem Expressionsplasmid für humanes Integrin β3 (hIntβ3) transfiziert. Zunächst wurde überprüft, ob die erhaltenen Klone

pcDNA3.1 (+) transfiziert worden waren, ausgewählt.

Abb. 4.10: Auswirkung der ektopischen Expression von Integrin β3 in A549 Lungenkarzinomzellen. (A) Western Blot-Analyse von Integrin β3 in parentalen A549 Zellen und stabil Integrin β3 exprimierenden Klonen (hβ3). β-Aktin diente als Proteinmengenabgleich. (B) Immunfluoreszenzfärbung von Integrin αvβ3 in (a) parentalen Zellen, (b) Klon neo #5, (c) Klon hβ3 #6 und (d) #20. Größenstandard in allen BTBehandlung und (E) Adhäsion der Poole an HUVEC. Die Transmigration wurde nach 48 h bestimmt, die Adhäsion an HUVEC nach 1 h. Die Fehlerbalken geben den Mittelwert ± der Standardabweichung von drei (C, D) bzw. fünf (E) unabhängigen Experimenten wieder. *Signifikant unterschiedlich von der Kontrolle (p<0,01).

39

4. ERGEBNISSE

Um zu testen, ob das gebildete Integrin β3 mit dem endogenen Integrin αv funktionelle Heterodimere auf der Oberfläche bildet, wurden Immunlokalisationen mit einem Antikörper gegen den Komplex durchgeführt. Abb. 4.10 B zeigt, dass sich in den stabilen Klonen Integrin αvβ3 an der Oberfläche in den Fokalkontakten befindet. Es lässt sich jedoch weder bei den parentalen Zellen noch bei den Kontrollklonen nachweisen. Trotz der Lokalisation an er Oberfläche zeigten die untersuchten Klone jedoch keine signifikant erhöhte

Transmigration (Abb. 4.10 C). ruppe mit einem

usätzlichen Rezeptor auszustatten, der wahrscheinlich eine Rolle bei der transendothelialen

hels hat und ob die Überexpression von Integrin β3

F getestet. Wie erwartet, ließ sich die

Effekt E). Die

igrativen

d

Möglicherweise ist es also nicht ausreichend, Zellen aus der TEM- GzMigration spielt. Denkbar wäre, dass die epithelialen A549 Zellen auch bei Expression von Integrin β3 noch zu stark als Zellgruppen aneinanderhängen und somit eine Passage durch das Endothel verhindert wird. Da bekannt war, dass die Behandlung von nicht-invasiven A549 mit HGF/SF zum Dissoziieren der Zellen und zu einem invasiven Phänotyp führt (Weidner et al., 1990; Behrens et al., 1991), sollte überprüft werden, ob die Behandlung mit HGF auch einen Einfluss auf das Durchwandern des Endotdann einen additiven Effekt bewirkt. Deshalb wurden zunächst die drei Kontroll- und die drei Integrin β3-Klone vereinigt und anschließend zusammen mit parentalen Zellen auf ihr Verhalten im Transmigrationsversuch mit und ohne HGAnzahl an Zellen, die sich im Kollagen befanden, mit der HGF-Behandlung bei den parentalen Zellen und dem Kontrollpool steigern. Beim Integrin β3-Pool hatte HGF jedoch keine Auswirkung auf die Passage durch das Endothel und somit auch keinen zusätzlichen

(Abb. 4.10 D). Die Adhäsion an HUVEC war weder vermindert noch erhöht (Abb. 4.10Überexpression von Integrin β3 alleine war also nicht ausreichend, um einen transmPhänotyp in A549 Zellen zu erzeugen.

40

4. ERGEBNISSE

4.4. Untersuchungen an Epithelial v-like antigen 1 (EVA1) Bisher wurde mit Integrin β3 ein Kandidat untersucht, der die Transmigration von Tumorzellen fördert. Da die Expression von EVA1 invers mit der Fähigkeit der Zellen zu transmigrieren korreliert (Abb. 4.4), sollte nun außerdem getestet werden, ob EVA1 möglicherweise diesen Vorgang verhindert.

Abb. 4.11: Expressionsanalyse von EVA1. (A) RT-PCR-Analyse der Expression von EVA1 in verschiedenen humanen Geweben. Das Haushaltsgen β2-Micro. = β2-Mikroglobulin diente als Kontrolle für die eingesetzten cDNA-Mengen. (B) Quantitative Echtzeit-PCR-Analyse der EVA1-Expression in verschiedenen Zelllinien aus der TEM+ und TEM- Gruppe.

4.4.1. Untersuchung der endogenen Expression von EVA1 in verschiedenen Geweben und Tumorzelllinien

Über dieses Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie war nur bekannt, dass es im Thymus exprimiert wird (Guttinger et al. 1998). Deshalb wurde zunächst die Expression des Gens in verschiedenen menschlichen Geweben überprüft. Abb. 4.11 A ist zu entnehmen, dass EVA1 ubiquitär exprimiert wird. Auch die unterschiedliche Expression in Tumorzellen der beiden Gruppen TEM+ und TEM- wurde mittels quantitativer Echtzeit-PCR nachgeprüft (Abb. 4.11 B). Die Daten aus der konventionellen RT-PCR konnten so reproduziert und die Unterschiede in der Expression deutlicher gemacht werden.

41

4. ERGEBNISSE

4.4.2. Funktionelle Analyse der Rolle von EVA1 bei der transendothelialen

tikörper erhältlich ist, wurde zunächst ein xpressionskonstrukt kloniert, das für ein Fusionsprotein aus N-terminalem RFP und EVA1

Funktio s das Fusionsprotein synthetisiert wird und an ie Oberfläche der Zellen, genauer an die Stellen der Zell-Zell-Kontakte transportiert wird,

1 an der ng des

r EVA1. RFP) liegen

bis 216 ohne al. Oberhalb n Fragmente

e (a, a’) und , b’) von

sfizierten 293T ch.

4.4.2.1. Um nun diwurden drei TumEVA1 bzw. m

alerweise selber ke ittels FluoreszenzmExpression von

den Zellen in vesikelartigen Strukturen (Abb. 4.13 A). EVA1-positive Klone schienen Zell-

Migration

Es konnte gezeigt werden, dass EVA1 vorzugsweise in nicht-transmigrierenden, nicht-invasiven Tumorzellen exprimiert wird. Dieses Muster legt die Vermutung nahe, dass das Adhäsionsmolekül die Transmigration bzw. die Invasion von Tumorzellen verhindern kann. Da für EVA1 kein kommerzieller AnEkodiert (Abb. 4.12 A). Außerdem enthält es ein Signalpeptid für die Lokalisation an der Oberfläche. Dieses Konstrukt wurde in transienten Transfektionen in 293T Zellen auf

nalität getestet. Abb. 4.12 B zeigt, dasdwohingegen das als Kontrolle dienende RFP in der ganzen Zelle verteilt ist. Außerdem hat die Überexpression des Konstruktes in 293T, die kein endogenes EVA1 exprimieren, auch einen deutlichen Effekt auf die Morphologie der Zellen. Sie scheinen durch die verstärkten Zell-Zell-Kontakte enger aneinander zu liegen. Dies konnte in den RFP-transfizierten Zellen nicht beobachtet werden.

Abb. 4.12: Lokalisation von EVAZelloberfläche. (A) Schematische DarstelluRFP-markierten Expressionskonstrukts füSignalpeptid (SP) und monomeres RFP (mN-terminal, die cDNA für EVA1 AS 27das Signalpeptid (EVA1 w/o SP) C-termindes Schemas sind die Längen der klonierteangegeben. (B) Lichtmikroskopischfluoreszenzmikroskopische Analyse (btransient mit EVA1-RFP oder RFP tranZellen. Größenstandard in allen Bildern glei

Ektopische Expression von EVA1 in TEM+ Zelllinien

e Rolle von EVA1 bei Transmigration und Invasion genauer zu untersuchen, orzelllinien aus der TEM+ Gruppe stabil mit dem Expressionskonstrukt für

it RFP alleine transfiziert. Bei den verwendeten Zelllinien handelte es sich umEJ-28 Blasen-, MDA-MB-231 Brust- und 786.0 Nierenkarzinomzellen, die norm

in EVA1 exprimieren (Abb. 4.4). Die erhaltenen Klone wurden mikroskopie selektioniert und anschließend in den ausgewählten Klonen die

EVA1 zusätzlich mit RT-PCR nachgewiesen (Abb. 4.13 B). Das Fusionsprotein befand sich in allen untersuchten Klonen an der Zelloberfläche sowie in

Zellkontakte auszubilden und ebenso wie die transient transfizierten 293T Zellen epithelähnliche Schichten zu bilden, was bei den Kontrollklonen nicht der Fall war.

42

4. ERGEBNISSE

Abb. 4.13: Auswirkung der ektopischen Expression von EVA1 in Zelllinien aus der TEM+ Gruppe - 1. (A) Fluoreszenzmikroskopische Analyse von stabil exprimierenden EVA1-RFP und RFP Klonen in EJ-28 Blasen-, MDA-MB-231 Brust- und 786.0 Nierenkarzinomzellen. (B) RT-PCR-Analyse der Expression von EVA1 in stabilen Kontrollklonen (RFP) und EVA1-RFP exprimierenden Klonen (EVA1). Das Haushaltsgen GAPDH = Glyzerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase diente als Kontrolle für die eingesetzten cDNA-Mengen. (C) Transendotheliale Migration (TEM), (D) Invasion in eine Kollagenmatrix und (E) Adhäsion an HUVEC der Klone aus (A) und (B). Die Transmigration und Invasion wurden nach 48 h bestimmt, die Adhäsion an HUVEC nach 2 h. Die Fehlerbalken geben den Mittelwert ± der Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten wieder. *Signifikant unterschiedlich von der Kontrolle (p<0,05).

43

4. ERGEBNISSE

Alle für die weiteren Experimente verwendeten Klone waren homogen, mit AusnahmeEJ-28 RFP #9 und #11 Klone, bei denen nur etwa 80% der Zellen positiv für RFP waren. Im

igrationsversuch zeigten acht der untersuchten EVA1-positiven Klone eine schwache,aber signifikante Reduzierung der Zellen in der Kollagen I Matrix. Nur bei einem der drei EJ-28 Klone (EVA1 #11) war die Transmigration nicht signifikant vermindert (Abb. 4.13konnte kein Unterschied bei der Invasion in das Kollagen I oder bei der Adhäsion an HUVEEinzellschichten zwischen RFP- und EVA1-Klonen festgestellt werden, was darauf hindeutet,dass EVA1 eine spezifische Rolle bei dem Prozess der transendothelialen Migration zukommAbb. 4.13 D, E). Da eine verminderte Transmigration auch auf eine geringere Proliferation

der Zellen zurückzuführen sein kann, wurde diese in den Klonen mittels eines kommeTests untersucht, bei dem Tetrazoliumsalz von lebenden Zellen in Formazan umgesetzt wird,welches nach Lösung im Photometer messbar ist. Es zeigte sich zwar eine starke Variation zwischen den einzelnen Klonen, diese war jedoch nicht signifikant unterschiedlichEVA1- und RFP-Klonen. MDA-MB-231 Klone proliferierten alle langsamparentalen Zellen, bei 786.0 vermehrten sich RFP #5 und EVA1 #21 jeweils schneller als die übrigen Klone (Abb. 4.14 A).

4.14: Auswirkung der ektopischen Expression von EVA1 in Zelllinien aus der TEM+ Gruppe - uchung der Proliferation der stabilen EVA1-RFP und RFP-Klone aus Abb. 4.13 (A) und (B). Die Alen wurde nach zwei Tagen mittels des MTT-Assays bestimmt. Die Y-Achse gibt die optische Di

er, die mit der Zellzahl korreliert. (B) Messung der Aggregation der stabilen EVA1-RFP und RFP-Abb. 4.13 (A) und (B). Die Anzahl aggregierter Zellen wurde nach 1 h bestimmt.

Eine weitere mögliche Ursache für eine geringere Anzahl an transmigrierenden Zellen könnte

n der

Transm

C). Es C

t

(rziellen

zwischen er als die

Abb. 2. (A) Unters nzahl der Zel chte wied Klone aus

i Zelllinien gab.

eine erhöhte Aggregation sein, die verhindert, dass die Zellen das Endothel passieren. Dies wäre denkbar, weil EVA1 homophile Interaktionen zwischen Zellen vermittelt (Guttinger et al., 1998). Mittels eines Aggregationsexperimentes, bei dem das Verhältnis nicht aggregierter zu aggregierten Zellen in Suspension nach einer Stunde bestimmt wurde, konnte jedoch gezeigt werden, dass die Überexpression von EVA1 in den drei Zelllinien nicht zu einer verstärkten Zusammenlagerung der Zellen führte (Abb. 4.14 B). Auffällig war nur, dass alle MDA-MB-231 Klone wesentlich schlechter aggregierten als die parentalen Zellen (Daten nicht gezeigt) und dass es deutliche Unterschiede zwischen den dre

44

4. ERGEBNISSE

EVA1 scheint also spezifisch den Schritt der Transmigration zu verhindern. Allerdings ist es vermutlich nur einer von mehreren Faktoren, die an diesem Prozess beteiligt sind, da die Anzahl der transmigrierenden Zellen bei Überexpression dieses Adhäsionsmoleküls nicht ganz, sondern nur zu einem Teil vermindert wird.

4.4.2.2. RNAi-vermittelter Knockdown der EVA1 Expression in MS751 Zellen Bisher konnte gezeigt werden, dass EVA1 eine Rolle bei der transendothelialen Migration von drei verschiedenen Tumorzelllinien aus der TEM+ Gruppe zukommt. Um weitere Einblicke in seine Funktion zu erhalten, sollte jedoch auch nachgeprüft werden, ob die Reduzierung von endogenem EVA1 in TEM- Zellen Auswirkungen auf diesen Vorgang zeigt. Deshalb wurden auch gegen EVA1 mehrere unterschiedliche spezifische 19 nt lange Sequenzen in pSUPER kloniert und in transienten Kotransfektionen mit einem Myc-markierten EVA1-Expressionskonstrukt getestet. Das am besten funktionierende Konstrukt (EVA1-9/10) wurde zur Herstellung stabiler Klone wie schon zuvor die RNAi gegen Integrin β3 ).

gegen s

on von A-H1-

den A-H1-dieren.

vermsich um Abb. 4.11

ontrollklonen (neo) deutlich weniger mRNA für EVA1 hatten (Abb. 4.16 A). Diese Daten

in pcDNA3.1 (+) umgesetzt (4.3.2.2.) und erneut auf Funktionalität überprüft (Abb. 4.15Das erhaltene Expressionsplasmid war in der Lage, die Bildung von EVA1 nahezu vollständig zu verhindern.

Abb. 4.15: Transiente Expression der shRNA EVA1 in 293T Zellen. Western Blot-Analyse des Testder shRNA gegen EVA1 in transienter KotransfektiEVA1-myc und pSUPER-EVA1-9/10 bzw. pcDNEVA1-9/10. Als Kontrolle fungierten die beiLeervektoren sowie pSUPER-Intβ3-5/6 bzw. pcDNIntβ3-5/6, die für shRNA gegen Integrin β3 koTubulin diente als Proteinmengenabgleich.

Der Vektor pcDNA-H1-EVA1-9/10 wurde eingesetzt, um stabile Klone zu erzeugen, die eine inderte Menge an endogenem EVA1 besitzen. Bei der verwendeten Zelllinie handelte es

MS751 Cervixkarzinomzellen, die EVA1 selber relativ stark exprimieren (B). Als Kontrolle wurden dieselben Zellen mit dem leeren pcDNA-H1 transfiziert. Die erhaltenen Klone konnten mangels eines Antikörpers gegen das Protein nur über RT-PCR selektioniert werden. Keiner der erhaltenen Klone zeigte einen vollständigen Verlust der EVA1-Expression, es fanden sich jedoch mehrere Klone, die im Vergleich zu den Kkonnten auch mit einer quantitativen Echtzeit-PCR verifiziert werden (Daten nicht gezeigt). Schon unter normalen Zellkulturbedingungen in Plastikschalen war offensichtlich, dass bei den siEVA1-Klonen die Zellen voneinander dissoziieren. Parentale MS751 Zellen und die neo-Klone bildeten dagegen epitheliale Schichten, in denen die einzelnen Zellen dicht beieinander lagen (Abb. 4.16 B und nicht gezeigt). Auch auf Kollagen I war der Unterschied in der Morphologie der Zellen eindeutig. Parentale Zellen sowie Kontrollklone bildeten epitheliale Schichten, in denen die einzelnen Zellen deutlich abgeflacht waren. Die Zellen mit weniger EVA1 hingegen konnten sich nicht mehr auf dem Substrat ausbreiten. Sie hingen zwar in kleinen Aggregaten zusammen, waren aber abgerundet (Abb. 4.16).

45

4. ERGEBNISSE

Abb. 4.16: Auswirkung des RNAi-vermittelten Abbaus von endogenem EVA1 in MS751 Brustkarzinomzellen – 1 (A) RT-PCR-Analyse der Expression von EVA1 in stabilen pcDNA-H1 Kontrollklonen (neo) und RNAi EVA1 exprimierenden Klonen (siEVA1). Das Haushaltsgen GAPDH = Glyzerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase diente als Kontrolle für die eingesetzten cDNA-Mengen. (B) Lichtmikroskopische Analyse der Morphologie der Klone neo #3 (a, b) und siEVA1 #16 (a’, b’) auf Zellkulturschalen (a, a’) und Kollagen I (b, b’). Größ andard in a und a’, sowie b und b’ gleich. (C) Western Blot-Analy u (A). Tubulin diente als Proteinmengenabgleich. (D) Immunfluoreszenzfärbung von E-Cadherin in den Kl nen neo #1 (a), neo #2 (b), siEVA1 # 7 (c) und siEVA1 #16 (d). Größenstandard in allen Bildern gleich. Die auffällige Auswirkung der verminderMorphologie könnte durch einen beginnenwerden epitheliale Marker reduziert, wohingEin bekanntes Beispiel für einen epithelialeAdhäsionsmolekül vermindert synthetisiert,1989). Es sollte deshalb überprüft werden, oHierfür wurde zunächst die Proteinmenge a C

ensts se von E-Cadherin in den Klonen ao

ten EVA1-Expression in MS751-Zellen auf die den EMT verursacht sein. Bei diesem Prozess egen mesenchymale verstärkt exprimiert werden. n Marker ist E-Cadherin. Wird dieses Zell-Zell- beginnen Zellen zu dissoziieren (Behrens et al. b die siEVA1-Klone weniger E-Cadherin haben. uf einem Western Blot verglichen. Abb. 4.16

zeigt, dass alle untersuchten Klone verglei hbare Mengen an E-Cadherin besitzen. Dieses Ergebnis konnte auch mittels Immunfluoreszenzfärbung bestätigt werden. Allerdings kommt es in den siEVA1-Klonen zu einer Umverteilung von E-Cadherin. Es finden sich deutlich weniger durchgehende Zell-Zell-Verbindungen als in den Kontrollklonen. Auch in der E-Cadherin-Färbung lässt sich gut erkennen, dass die Zellen bei Reduktion von EVA1 dissoziieren (

c

Abb. 4.16 D). Die veränderte Morphologie der siEVA1-Klone ließ vermuten, dass sie einen transmigrativen Phänotyp besitzen könnten. Deshalb wurden mit den stabilen Klonen Transmigrations-versuche durchgeführt. Die in Abb. 4.17 A dargestellten Daten zeigen jedoch, dass keiner der untersuchten Klone signifikant durch die HUVEC in das Kollagen einwanderte. Alle erhaltenen Zahlen liegen unter dem zu Beginn definierten Schwellenwert von 100 Zellen pro cm² und die Werte unterscheiden sich nicht zwischen Kontroll- und siEVA1-Klonen. Wie schon unter 4.3.2.3 für die Überexpression von Integrin β3 gezeigt, weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass es nicht ausreicht, einen einzelnen Faktor zu verändern. EVA1 scheint zwar in den Vorgang der Transmigration involviert, aber nicht als einziges für eine Verhinderung dieses Prozesses verantwortlich zu sein bzw. die Abwesenheit scheint nicht ausreichend zu sein, um Transmigration zu ermöglichen.

46

4. ERGEBNISSE

Abb. 4.17: Auswirkung des RNAi-vermittelten Abbaus von endogenem EVA1 in MS75arzinomzellen - 2. (A) Transendotheliale Migration (TEM), (B) Invasion in eine Kollagenmatrix uon an HUVEC der Klone aus Abb. 4.16 (A). Die Transmigration und Invasion wurden nach

stimmt, die Adhäsion an HUVEC nach 2 h. Die Fehlerbalken geben den Mittelwert ± der Standardabweichu

1 Brustk nd (C) Adhäsi 48 h be ng

hä

es sich bei dem beobachteten Effekt nicht um eine uswirkung der Reduzierung von EVA1, sondern um klonale Schwankungen handelt.

von drei unab ngigen Experimenten wieder. Dennoch wurden die Klone auf ihr Verhalten im Invasionsassay hin untersucht. Die drei verwendeten siEVA1 Klone waren tatsächlich invasiv (Abb. 4.17 B). Allerdings war das auch einer der neo-Klone. Um klonale Variationen ausschließen zu können, wurde das Experiment mit je drei weiteren Klonen durchgeführt. Hierbei stellte sich heraus, dass fünf von sechs siEVA1-Klonen und zwei von sechs Kontrollklonen invasiv waren (Daten nicht gezeigt). Es lässt sich also nicht ausschließen, dass ABei der Adhäsion der Klone an HUVEC zeigte sich keine Tendenz zu einer besseren oder schlechteren Anhaftung (Abb. 4.17 C). Wegen des drastischen Unterschiedes der Morphologie der Klone auf Plastik bzw. auf Kollagen, wurde zusätzlich getestet, ob die Adhäsion an eines dieser Substrate verändert ist. Bei diesem Versuch zeigte sich, dass die siEVA1-Klone merklich schlechter an den untersuchten Substraten anhafteten. Jedoch auch hier verhielt sich einer der neo-Klone wie die siEVA1-Klone, so dass erneut klonale Schwankungen nicht ausgeschlossen werden können (Abb. 4.18).

Abb. 4.18: Untersuchung des Adhäsionsverhaltens von MS751 stabilen siEVA1 Klonen. (A) Adhäsion an Plastik und (B) Adhäsion an Kollagen I der Klone aus Abb. 4.16 (A). Die Adhäsion an Plastik wurde nach 30 min, die an Kollagen I nach 1 h bestimmt. Die Fehlerbalken geben den Mittelwert ± der Standardabweichung von zwei bis vier unabhängigen Experimenten wieder. Angegeben ist der relative Unterschied zu parentalen Zellen.

47

4. ERGEBNISSE

Ein t-Test ergab signifikante Unterschiede zwischen den beiden Klon-Typen sowohl für die

die siOligonukleotide waren jedoch nicht in der Lage, en Abbau der gesamten EVA1-mRNA zu bewirken, bzw. die Transfektionseffizienz lag

Abb. 4. RNAi-Oligon 24 bzw. 48 h m ehandelt

Anhaftung an Plastik, als auch an Kollagen (Plastik: p = 0,023; Kollagen: p = 0,002). Die Daten blieben weitgehend identisch, nachdem die Adhäsionsexperimente mit drei zusätzlichen Kontrollklonen durchgeführt worden waren. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass eine verminderte EVA1-Expression die Adhäsion von Zellen sowohl untereinander als auch an verschiedene Substrate stört und deuten darauf hin, dass EVA1 bei diesen Prozessen eine wichtige Rolle spielt. Da in den siEVA1-Klonen die EVA1-mRNA nicht vollständig entfernt werden konnte und diese Zellen deshalb vermutlich noch über EVA1-Protein verfügen, wurde ein Experiment in anderen Zelllinien zur Untersuchung der Rolle von EVA1 bei der transendothelialen Migration durchgeführt. Hierfür wurden EVA1 positive Zelllinien aus der TEM- Gruppe transient mit siOligonukleotiden gegen EVA1 transfiziert und einerseits die Expression von EVA1 mit RT-PCR nachgeprüft bzw. andererseits die transfizierten Zellen für ein Transmigrationsassay eingesetzt. Auchdmöglicherweise nicht bei 100% (Abb. 4.19 A). Allerdings zeigte sich, dass die transfizierten Zellen zu transmigrieren beginnen (Abb. 4.19 B). Hierbei handelt es sich um einen relativ geringen, jedoch signifikanten und reproduzierbaren Effekt (MCF-7: 1,6 – 2,0-fach; HCT116: 1,5-fach). Dies bestärkt die Annahme, dass EVA1 die Passage der Tumorzellen durch das Endothel verhindert.

19: Auswirkung der transienten Reduzierung der EVA1-Expression mittelsukleotiden. (A) RT-PCR-Analyse der EVA1-Expression in MCF-7 und HCT116 Zellen, die fürit siRNA gegen EVA1 (siEVA1) oder Kontroll-siRNA (siGFP) behandelt worden bzw. unb

waren (Kontrolle). Das Haushaltsgen GAPDH = Glyzerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase diente als Kontrolle für die eingesetzten cDNA-Mengen. (B) Transendotheliale Migration von transient mit siRNA gegen EVA1 (siEVA1) oder Kontroll-siRNA (siGFP) transfizierten MCF-7 und HCT116 Zellen. Die Aussaat der Zellen erfolgte 24 h nach der Transfektion. Die Transmigration wurde nach 48 h bestimmt. Die gezeigten Diagramme sind repräsentativ für je zwei unabhängige Versuche.

48

4. ERGEBNISSE

4.4.3. Analyse der transkriptionellen Regulation von EVA1 durch verschiedene Transkriptionsfaktoren

Bei der Kultur der MS751 siEVA1 stabilen Klone wurde beobachtet, dass die Zellen zu dissoziieren beginnen. Dies könnte - wie schon zuvor erwähnt - auf EMT hindeuten. Dieser Prozess wird durch verschiedene Signalwege induziert und intrazellulär durch

ranskriptionsfaktoren gesteuert (siehe 3.1.2). Aus diesem Grund wurde im folgenden Teil

ingegen für Snail mit 1,2-fach kaum ein Unterschied vorlag. Die beiden anderen getesteten Transkriptionsfaktoren ZE 1 und ZEB2 sind auf den für die Analyse eingesetzten

Abb. 4.20: E en mittels RT-PCR. like antigen 1,

Tder Arbeit die Wirkung verschiedener Transkriptionsfaktoren auf die Expression von EVA1 untersucht. Zunächst wurden RT-PCRs mit spezifischen Oligonukleotidpaaren für diverse Transkriptionsfaktoren durchgeführt, von denen bekannt war, dass sie die Expression verschiedener Gene wie z. B. E-Cadherin während des EMT regulieren. Untersucht wurden die Zinkfingerfaktoren Snail, Slug, ZEB1/δEF1 und ZEB2/SIP1. Es stellte sich dabei heraus, dass Snail und ZEB1 in zahlreichen Tumorzelllinien exprimiert werden, unabhängig davon, ob diese EVA1 exprimieren bzw. transmigrieren oder nicht. Die Expression von Slug und ZEB2 korrelierte hingegen sehr gut mit der TEM+ Gruppe und für ZEB2 zeigte sich sogar, dass dieser Transkriptionsfaktor mit Ausnahme von PC-3 exakt invers zu EVA1 in den untersuchten Zelllinien exprimiert wird (Abb. 4.20). Diese Ergebnisse spiegelten sich auch in den Mikroarray-Daten wieder. Für Slug fand sich dort eine 12-fach höhere Expression in den TEM+ Zelllinien, woh

B Arrays nicht enthalten.

xpressionsanalyse ausgewählter Transkriptionsfaktoren in allen 41 TumorzellliniDie Einteilung der Zelllinien entspricht derjenigen aus Tab. 4.1. EVA1 = epithelial v-

ZEB1 = zink finger E-Box binding protein 1 und ZEB2 = zink finger E-Box binding protein 2. Das Haushaltsgen GAPDH = Glyzerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase diente als Kontrolle für die eingesetzten cDNA-Mengen.

49

4. ERGEBNISSE

4.4.3.1. Untersuchung der Beteiligung von Slug, ZEB1 und ZEB2 an der EVA1-Expression

Zur Analyse der Auswirkung von Transkriptionsfaktoren auf die EVA1-Expression wurde zunächst der Promotor von EVA1 kloniert. Da nicht bekannt war, welchen Bereich der 5’-Region genau der Promotor einnimmt, wurden zunächst 750 nt vom Translationsstart aufwärts auf das Vorhandensein von Bindestellen für die Transkriptionsfaktoren untersucht. Die Sequenz wurde aus der Ensembl-Datenbank entnommen. Hier liegt der putative Transkriptionsstart 141 nt vor dem ATG. Snail und Slug binden an sog. E-Boxen. Die

Abb n en

(B xen (B r

beiden Zinkfingergruppen von ZEB1 nd ZEB2 bindet ein ähnliches Motiv, nämlich CACCT(G) – sog. Z-Boxen. Hierbei spielen eder der Abstand zwischen diesen Z-Boxen noch ihre Orientierung eine Rolle (Sekido et al., 1997; Verschueren et al., 1999; Remacle et al., 1999). Auch diese Sequenz kommt dreimal im untersuchten Stromaufwärtsbereich vor: Bei –214 (CACCT), bei –44 (CACCT) und bei +9 (AGGTG). Die letzte Sequenz entspricht

Konsensussequenz lautet CANNTG, die beste Bindung findet man aber bei 5’(A)CAGGTG bzw. CACCTG (Inukai et al., 1999; Mauhin et al., 1993). In der betrachteten Region finden sich drei putative E-Boxen: Bei –562 (CATTTG), -364 (CAAGTG) und bei +8 (CAGGTG) (Abb. 4.21 A).

. 4.21: Promotoranalyse von EVA1. (A) Schematische Darstellung des 5’ Stromaufwärtsbereiches voEVA1 und der in dieser Arbeit klonierten Promotorkonstrukte. Eingezeichnet sind die Lage der E-Box

indestellen für bHLH-Transkriptionsfaktoren, und Snail-Familienmitglieder) sowie die Lage der Z-Boindestellen für ZEB1 und 2). +1 = Transkriptionsstart, ATG = Translationsstart. (B) Test de

Promotorkonstrukte für EVA1 aus (A) in 293T und (C) HCT116 Zellen. Als Kontrollen dienten pGL2-Control mit konstitutiv aktivem Promotor und ein funktionelles Fragment des humanen E-Cadherin-Promotors (hE-Cad Prom). Jede der u

w

50

4. ERGEBNISSE

der dritten Snail-Bindestelle (Abb. 4.21 A). Es wurden zwei Promotorkonstrukte

Bindestelle em wurde ein Konstrukt erstellt, ei dem die dritte Snail-/ZEB-Bindesequenz von CAGGTG zu AAGGTA mutiert wurde.

Da die Expression von Snail weder mit der EVA1-Expression noch mit den beiden Gruppen korrelie

id

dherin-Prom , 2002; Bolós

it diesem

it siZEB1

EVA1lich

Abb. 4.22 ikanter

Effekt m otors

ger et al., 2005). Dies könnte aber möglicherweise an einer zu geringen Menge an

n et al., 2001; Vandevalle et al., 2005).

verschiedener Länge in pGL3-Basic kloniert, deren Größe, Lage und Anzahl beinhalteter n Abb. 4.21 A entnommen werden kann. Außerd

bAlle Promotor-Reportergenkonstrukte wurden in transienten Transfektionen in HEK293T und HCT116 auf Aktivität hin untersucht. Als Kontrolle dienten pGL2-Control mit einem konstitutiv aktiven Promotor und ein Fragment des humanen E-Cadherin-Promotors. Die Ergebnisse finden sich in Abb. 4.21 B und C. Es zeigte sich, dass die Aktivität des kürzeren Konstruktes EVA1-P-359 etwa 75% der Aktivität von EVA1-P-529 betrug und der mutierte Promotor je nach Versuch 1,5- bis 2-mal so aktiv war, wie das entsprechende unmutierte Stück. Die Basalaktivitäten der Promoter-Reprotergenkonstrukte waren zwischen den Zelllinien leicht unterschiedlich und auch die Aktivität des als Kontrolle genutzten Promotors von E-Cadherin schwankte.

rte (Abb. 4.20), wurden mit Slug, ZEB1 und ZEB2 Promotoranalysen durchgeführt. Bei einer Kotransfektion der Promotorkonstrukte zusammen mit einem Expressionsplasmfür Slug zeigte sich, dass die Expression von Slug nicht zu einer verminderten Aktivität der EVA1-Konstrukte führte (Abb. 4.22 A). Für das längere Promotorstück EVA1-P-529 ergab sich eher noch eine Verstärkung des Luziferasesignals. Die Aktivität des E-Ca

otors als bekanntem Ziel der Repression durch Slug war vermindert (Hajra et al.et al., 2003). Auf Grund des fehlenden inhibierenden Einflusses von Slug auf die

Aktivität des EVA1-Promotors wurden keine weiteren Versuche mTranskriptionsfaktor durchgeführt.

In der Expressionsanalyse von ZEB1 zeigte sich zwar keine (inverse) Korrelation zwischen EVA1 und ZEB1, aber DNA-Mikroarray-Daten deuteten darauf hin, dass EVA1 ein Ziel des Transkriptionsfaktors sein könnte. Hier ergab sich beim Vergleich von stabil mtransfizierten SW480 Zellen zu kontrolltransfizierten Zellen eine 1,4-fache Steigerung der

-Expression (Dr. Thomas Brabletz, Pathologie, Universität Erlangen-Nürnberg). Reporterversuche mit einem Expressionsplasmid für ZEB1 bestätigten, dass ZEB1 tatsächdie Aktivität der beiden WT-EVA1-Promotorkonstrukte signifikant verminderte (B). Für den Promotor mit der mutierten Bindestelle ergab sich jedoch kein signif

ehr. Es konnte aber auch kaum Repression des humanen E-Cadherin-Prombeobachtet werden, obwohl es sich bei diesem Gen um ein bekanntes Ziel von ZEB1 handelt (Ekotransfiziertem Transkriptionsfaktor liegen. Für ZEB2 ergaben sich vergleichbare Ergebnisse. Auch hier fand eine Repression bei den WT-EVA1-Promotorkonstrukten, nicht jedoch bei dem mutierten Promotor statt, woraus sich schließen lässt, dass zumindest eine der beiden Zinkfingergruppen an diese Z-Box bindet. Die Aktivität des E-Cadherin-Promotors, der als Positivkontrolle diente, wurde ebenfalls durch Kotransfektion von ZEB2 vermindert (Comij Um weitere Hinweise auf eine Regulation der EVA1-Expression durch ZEB1 oder ZEB2 zu erhalten, wurden verschiedenen Zelllinien mit siRNA Oligonukleotiden gegen diese Gene transfiziert und anschließend in RT-PCR Experimenten die Expression von EVA1 untersucht. Die cDNA aus mit siZEB1 transfizierten SW480-Zellen wurde freundlicherweise von Dr.

51

4. ERGEBNISSE

Thomas Brabletz zu Verfügung gestellt. Wird die endogene Expression von ZEB1 durch die siRNA vermindert, so lässt sich deutlich ein Anstieg des bekannten Zielgens E-Cadherin beobachten und ebenso eine verstärkte Expression von EVA1 (Abb. 4.22 C). Dieser Effekt wurde mittels Echtzeit-PCR quantifiziert und lag bei einer 1,5-fachen Steigerung, was in etwa den Mikroarray-Daten entspricht (Daten nicht gezeigt). Das Ergebnis verstärkt die Annahme, dass auch EVA1 ein Ziel der transkriptionellen Repression durch ZEB1 ist.

Abb. 4.22: Untersuchung der Wirkung von Slug, ZEB1 und ZEB2 auf die Expression von EVA1. (A) Reporterversuche mit EVA1-Promotorkonstrukten aus Abb. 4.21 A und kotransfiziertem Slug bzw. Leervektor (Kontrolle). Die Ergebnisse aus zwei unabhängigen Experimenten wurden auf die Leervektorkontrolle normalisiert, d.h. dieser Wert wurde auf 1 gesetzt. Die Verhältnisse der Balken der verschiedenen Promotoren spiegeln also nicht die Verhältnisse der Aktivitäten zueinander wieder. Diese sind aus Abb. 4.21 B zu entnehmen. Als Kontrollen dienten pGL2-Control mit konstitutiv aktivem Promotor und ein funktionelles Fragment des humanen E-Cadherin-Promotors (hE-Cad Prom). (B) Reporterversuch mit EVA1-Promotorkonstrukten und kotransfiziertem ZEB1 oder ZEB2 bzw. Leervektor (Kontrolle). Berechnung der Daten aus zwei (hE-Cad Prom) bis sechs (alle anderen) unabhängigen Experimenten und Kontrollen wie in (A). (C) RT-PCR-Analyse der Expression von EVA1, E-Cadherin (E-Cad) und ZEB1 in SW480 Zellen, die für 48 h mit siRNA gegen ZEB1 (siZEB1) oder Kontroll-siRNA (siGFP) behandelt worden waren. (D) RT-PCR-Analyse der Expression von EVA1, E-Cadherin (E-Cad) und ZEB2 in PC-3, MDA-MB-436 und CAKI-I Zellen, die für 24 h mit siRNA gegen ZEB2 (siZEB2) oder Kontroll-siRNA (siGFP) behandelt worden waren. Das Haushaltsgen GAPDH = Glyzerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase diente in (C) und (D) als Kontrolle für die eingesetzten cDNA-Mengen. Wie in Abb. 4.20 gezeigt, schließen sich die Expression von ZEB2 und EVA1 in den verwendeten Zelllinien fast vollständig aus. Die einzige Zelllinie, die sowohl den Transkriptionsfaktor als auch das Adhäsionsmolekül exprimiert ist PC-3. Möglicherweise fehlt in diesen Zellen ein Kofaktor, den ZEB2 benötigen würde, um die Expression von EVA1 zu reprimieren. Dennoch wurde diese Prostatazelllinie sowie MDA-MB-436 Brustkarzinomzellen und CAKI-I Nierenkarzinomzellen transient mit einem Pool aus vier verschiedenen siOligonukleotiden gegen ZEB2 transfiziert. Aus der nach 24 h isolierten RNA wurde cDNA synthetisiert und anschließend wurden RT-PCRs durchgeführt. In allen drei Zelllinien war ein RNAi-vermittelter Abbau von ZEB2 zu verzeichnen. Dies hatte jedoch in

52

4. ERGEBNISSE

keiner der untersuchten Zelllinien eine Auswirkung auf die EVA1-Expression. Sie wurde weder in den für EVA1 positiven PC-3 erhöht, noch in den für EVA1 negativen MDA-MB-436 oder CAKI-I induziert. In letzteren ließ sich lediglich ein leichter Anstieg des publizierten Ziels E-Cadherin verzeichnen, der bei den PC-3 Zellen fehlte (Abb. 4.22 D). Anhand der erhaltenen Daten lässt sich also keine exakte Aussage darüber machen, ob es sich bei EVA1 wirklich um ein ZEB2 Zielgen handelt. Hierfür müssten weiterführende Experimente, wie z.B. Chromatin-Immunopräzipizationen oder EMSAs durchgeführt werden.

4.4.3.2.

von allen

von iert

Snail regu EVA1-

Prom A).

Craene trukte des

eporterversuchen deuten darauf hin, dass es sich bei Snail auch um einen transkriptionellen

auf die E-Cadherin-RNA (Abb. 4.23 C). Reporterversuche mit

Untersuchung der Beteiligung von Snail an der EVA1-Expression

In der in Abb. 4.20 gezeigten RT-PCR korrelierte Snail am schlechtestenbetrachteten Transkriptionsfaktoren mit der Expression von EVA1. In DNA-Mikroarray-Daten von DLD-1 Zellen mit induzierbarem Snail (De Craene et al., 2005a) ist die Expression

EVA1 jedoch deutlich vermindert, wenn Snail durch Zugabe von Doxizyklin exprimwurde (persönliche Mitteilung von Dr. Geert Berx, Universität Gent, Belgien).

Infolgedessen wurden auch für Snail Reporterversuche durchgeführt. Als Kontrolle fungierte erneut der E-Cadherin-Promotor, da bekannt ist, dass die Expression von E-Cadherin durch

liert wird (Cano et al., 2000; Batlle et al., 2000). Snail war sowohl in der Lage, die Aktivität dieses Promotors zu reduzieren, als auch die Aktivität aller untersuchten

otorkonstrukte, darunter auch das mit der mutierten Snail-Bindedomäne (Abb. 4.23Keine Repression fand jedoch durch eine Snail-Deletionsmutante (Snail-SnagΔ) statt, der diezur Repressorfunktion nötige SNAG-Domäne am N-terminalem Ende fehlte (Nieto, 2002; De

et al., 2005b). Hier wurde sogar eine Aktivierung der beiden WT-KonsEVA1-Promotors beobachtet, nicht jedoch für den mutierten Promotor. Die Befunde aus denRRepressor von EVA1 handelt, aber dass dieser vermutlich unabhängig von der E-Box im Promotor wirkt. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde ein Pool aus vier siOligonukleotiden gegen Snail in SW480 Zellen transfiziert. Mittels RT-PCR konnte gezeigt werden, dass die siRNA die Menge an gebildeter Snail-RNA deutlich reduzieren konnte. Gleichzeitig führte dieser Effekt zu einem gut sichtbaren Anstieg der EVA1-Expression (Abb. 4.23 B). Dieses Ergebnis zeichnet EVA1 erneut als potentielles Ziel der Repression durch Snail aus. Deshalb sollten die Mikroarray-Daten aus Gent verifiziert werden. Nach Induktion der Snail-Expression in DLD-1TR21-hSnail Zellen für unterschiedliche Zeitspannen, ergab sich, dass die Gegenwart von Snail zu einem drastischen Verlust an EVA1-RNA führt. Dieser war

ergleichbar mit dem Effektvden DLD-1TR21-hSnail Zellen ergaben vergleichbare Daten wie die Experimente mit transient transfiziertem Snail (Abb. 4.23 D). Auch hier zeigten alle untersuchten EVA1-Promotorkonstrukte - WT und mit Mutation in der dritten E-Box - eine verminderte Aktivität nach der Induktion von Snail durch Doxizyklin. Da anhand der erhaltenen Ergebnisse keine Aussage darüber gemacht werden konnte, ob EVA1 ein direktes Ziel von Snail ist, wurde durch Dr. Geert Berx eine Chromatin-Immunopräzipitation durchgeführt, bei der sich deutlich eine Bindung von Snail an den EVA1-Promotor im Bereich +1 bis +102 nachweisen ließ.

53

4. ERGEBNISSE

Abb. 4.23: Untersuchung der Wirkung von Snail auf die Expression von EVA1. (A) Reporterversuche mit EVA1-Promotorkonstrukten aus Abb. 4.21 A und kotransfiziertem Snail oder Snail-SnagΔ (SnagΔ) bzw. Leervektor (Kontrolle). Die Ergebnisse aus acht bis zwölf unabhängigen Experimenten wurden auf die Leervektorkontrolle normalisiert, d.h. dieser Wert wurde auf 1 gesetzt. Als Kontrollen dienten pGL2-Control mit konstitutiv aktivem Promotor und ein funktionelles Fragment des humanen E-Cadherin-Promotors (hE-Cad Prom). (B) RT-PCR-Analyse der Expression von EVA1 und Snail in SW480 Zellen, die für 48 h mit siRNA gegen Snail (siSnail) oder Kontroll-siRNA (siGFP) behandelt worden waren. (C) RT-PCR-Analyse der Expression von EVA1, E-Cadherin (E-Cad) und Snail in DLD-1TR21-hSnail Zellen (DLD-1-hSnail), die für 24 h bzw. 48 h mit Doxizyklin (Dox) behandelt worden waren. Das Haushaltsgen GAPDH = Glyzerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase diente in (B) und (C) als Kontrolle für die eingesetzten cDNA-Mengen. (D) Reporterversuch mit EVA1-Promotorkonstrukten aus Abb. 4.21 (A) in induzierten oder uninduzierten DLD-1TR21-hSnail Zellen. (E) Transendotheliale Migration (TEM) von unbehandelten oder mit Doxizyklin (Dox)

ehandelten DLD-1TR21-hSnail bzw. DLD-1 Zellen. +/* = Vorinkubation der Zellen mit Dox für 24 h, */+ =

von EVA1 diesen Prozess vermindern kann.

bZugabe von Dox zum Transmigrationsversuch, -/* = keine Behandlung mit Dox vor Beginn des Experiments und */- = keine Zugabe von Dox während des Versuchs. Die Transmigration wurde nach 48 h bestimmt. DLD-1TR21-hSnail Zellen zeigen bei der Behandlung mit Doxizyklin deutlich EMT (De Craene et al., 2005a), weil epitheliale Marker wie auch EVA1 durch die Expression von Snail reduziert und im Gegenzug mesenchymale Marker verstärkt werden. Da EVA1 nach den bisher gezeigten Daten eine Funktion bei der transendothelialen Migration von Tumorzellen haben könnte, wurde untersucht, ob die DLD-1TR21-hSnail Zellen durch Zugabe von Doxizyklin die Fähigkeit zur Wanderung durch HUVEC erlangen. Abb. 4.23 E zeigt, dass dies nicht der Fall war. Weder die Vorbehandlung der Zellen, noch eine Inkubation mit Doxizyklin während der Versuchsdauer führten zu einem signifikanten Anstieg der transmigrierenden Zellen und es war auch kein Unterschied zu parentalen DLD-1 Zellen bemerkbar. Bei keinem Versuchansatz stieg die Zahl der im Kollagen gezählten Zellen über den Schwellenwert von 100 Zellen pro cm². Vermutlich ist eine Verminderung der EVA1-Expression wie schon zuvor unter 4.4.2.2. im Versuch mit den stabilen siRNA Klonen in MS751 eben nicht ausreichend, um Transmigration zu bewirken, wohingegen die Expression

54

5. DISKUSSION

5. DISKUSSION Charakterisierung von an der transendothelialen Migration beteiligten Genen Die Wanderung der Tumorzellen über das Endothel sowie die Invasion in die extrazelluläre Matrix sind entscheidende Schritte bei der Metastasierung. Die meisten in vitro Studien, bei denen die transendotheliale Migration bzw. die Invasion bisher untersucht wurden, beschränkten sich auf eine bestimmte Zelllinie oder eine bestimmte Tumorart. Es ist daher schwierig, Rückschlüsse auf einen generellen Mechanismus bei Transmigration und Invasion zu ziehen. Deshalb wurden zunächst 41 Tumorzelllinien aus verschiedenen Geweben und Tumorarten in vitro auf ihre Fähigkeit hin getestet, über eine Schicht von HUVEC zu migrieren bzw. in eine Matrix einzuwandern. Der Vorteil von dem eingesetzten in vitro Versuch ist, dass sich die Zahl der beteiligten Variablen auf ein Minimum reduzieren lässt und es deshalb möglich ist, ausgewählte Aspekte wie Transmigration oder Invasion isoliert zu untersuchen (Brandt et al., 2005). Es gibt natürlich auch mögliche Einwände. Zum Beispiel wurden HUVEC verwendet, die meisten Metastasierungen in vivo finden jedoch in der Mikrovaskulatur statt und MVEC unterscheiden sich von HUVEC. Außerdem ist der Versuch statisch, nicht dynamisch, und es fehlen die normalerweise in den Blutgefäßen vorhandenen Scherkräfte. Viele der bisher in vitro gefundenen Daten konnten jedoch nachträglich in vivo bestätigt werden, weshalb auch in der vorliegenden Arbeit auf diese Methode zurückgegriffen

eln verm b keine

der elf getes iv

lt, lässt

HUVETab. 4.1

utlich

besitzt d ie

verfügen, nicht jedoch über die spezifischen für die Transmigration notwendigen Rezeptoren. Die anderen Tumorzelllinien der TEM+ Gruppe scheinen alle benötigten Faktoren zu haben und deshalb gleichzeitig invasiv zu sein. Allerdings ist anzumerken, dass bei einigen der untersuchten Zelllinien die Zahl der invasiven Zellen die der transmigrierenden weit übersteigt (A125, HS578T, A875, FADU). Folglich stellt das Endothel für diese Zelllinien eine Hürde da, die die Zellzahl im Kollagen merklich vermindert. Ein umgekehrter Effekt ist

wurde (Orr et al., 2000).

Es konnte gezeigt werden, dass sich die untersuchten Tumorzellen hierbei jeweils in zwei Gruppen einteilen lassen: Transmigrierend (TEM+) und nicht transmigrierend (TEM-) bzw. invasiv und nicht invasiv. Die Zahl der transmigrierten bzw. eingewanderten Zellen variierte von Null bis etwa 8000 Zellen pro Quadratzentimeter (Tab. 4.1). Diese Unterschiede spieg

utlich verschiedene Entwicklungsstadien der Ursprungstumore wider. Es gaKorrelation zwischen dem Ursprungsgewebe und der Fähigkeit der Tumorzellen, durch die Endothelzellen zu migrieren oder in die Kollagenmatrix einzuwandern, mit Ausnahme

teten Kolonkrebszelllinien, die alle in die TEM- Gruppe fielen und auch nicht invaswaren. Ob es sich hierbei um Zufall oder eine spezielle Art der Transmigration handesich anhand des eingesetzten Assays nicht sagen. Allerdings ist zumindest für HT-29 bereits bekannt, dass diese Zellen wenig mobil sind und ihre Migration über eine Schicht aus

C erst durch Behandlung mit TNFα erhöht werden kann (Laferrière et al., 2001). ist auch zu entnehmen, dass TEM+ mit invasiven bzw. TEM- mit nicht invasiven

Zelllinien nahezu übereinstimmten. Ausnahmen stellten A427 und DANG Zellen dar. A427 konnten zwar das Endothel überwinden, waren jedoch nicht zur Invasion fähig. Verm

iese Zelllinie also die zur Transmigration nötigen Faktoren, aber ihr fehlen dentsprechenden Matrixproteasen oder Rezeptoren, um in die Kollagenmatrix einzuwandern.DANG Zellen konnten zwar in das Kollagen einwandern, nicht jedoch die Endothelzellen passieren, was zu der Annnahme führt, dass sie zwar über Matrixproteasen und -rezeptoren

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5. DISKUSSION

nur bei DU145 zu beobachten. Hier ist die Zahl der transmigrierenden Zellen höher als die der invasiven, was vermuten lässt, dass DU145 durch das Endothel stimuliert werden könnten. Da aber bis auf die genannten Ausnahmen kein Unterschied bei der Einteilung zwischen transmigrierend und invasiv bestand, wurde im Folgenden nur zwischen TEM+ und TEM- Zelllinien differenziert. Die Klassifizierung der Tumorzelllinien wurde als Ausgangspunkt dafür eingesetzt, molekulare Parameter der transendothelialen Migration zu definieren. Bei der Entwicklung von Tumoren aus Normalgewebe sowie bei der Entstehung von metastatischen Zellen aus Primärtumoren spielen genetische Veränderungen eine entscheidende Rolle (Yokota, 2000). Deshalb ließ sich davon ausgehen, dass auch das unterschiedliche Verhalten bei der Transmigration auf Unterschiede in der Genexpression zurückzuführen ist. Um diese ausfindig zu machen, wurden die Genexpressionsprofile ausgewählter Tumorzelllinien mittels DNA-Mikroarrays erstellt. Da durch ungerichtete Clusteranalyse die TEM+ und TEM- Zelllinien auseinander sortiert werden konnten (Abb. 4.3), kann man davon ausgehen, dass den Zelllinien, die zu einer der beiden Gruppen gehören, jeweils spezielle Genexpressionsmuster zugrunde liegen. Bei einer vergleichenden Genexpressionsanalyse von 60 Tumorzelllinien konnte gezeigt werden, dass die Profile den Ursprungsort des Tumors widerspiegeln und deshalb ähnlich sind. Allerdings galt das nicht für Brustkrebszelllinien (Ross et al., 2000). Deshalb ist es nicht verwunderlich, dass die drei eingesetzten Zelllinien aus der Brust – MDA-MB-231, MDA-MB-453 und MCF-7 – auch hier nicht in einen Cluster

sation

fallen. Es wäre außerdem denkbar, dass die Unterschiede in den für die Transmigration entscheidenden Genen drastischer sind, als die Gemeinsamkeiten zwischen Zelllinien desselben Gewebeursprungs. Bei der gerichteten Clusteranalyse zeigten sich zahlreiche zwischen TEM+ und TEM- Zellen unterschiedlich exprimierte Gene. Es ist anzunehmen, dass diese Unterschiede bei den meisten Genen eher zufällig sind oder sich auf den ungleichen Gewebeursprung zurückführen lassen. Allerdings ist der Prozess der Wanderung über Endothelzellen komplex und vermutlich wird hierfür die koordinierte Aktivität einer Vielzahl verschiedener Genprodukte benötigt. Tatsächlich konnten in der vorliegenden Analyse zahlreiche Gene gefunden werden, denen eine mögliche oder bekannte Funktion bei der Förderung oder der Verhinderung der transendothelialen Migration zukommt (Tab. 4.2). TEM+ Zelllinien wiesen beispielsweise eine erhöhte Expression von Zytokinen wie nterleukin 6 und Interleukin 8 auf (7-fach bzw. 34-fach), die eine Rolle bei der ExtravaI

von Leukozyten spielen (Romano et al., 1997; Huber et al., 1991; Marshall et al., 2003). Für die beiden Zytokine konnte auch schon eine Funktion bei der transendothelialen Passage von Melanomzellen nachgewiesen werden (Paduch et al., 2005). Zugabe von Interleukin 6 erhöhte die Anzahl transmigrierender Tumorzellen in vitro (Kitamura et al., 1997) und Antikörper gegen Interleukin 8 reduzierten die transendotheliale Migration der Zellen um 30% (Ramjeesingh, et al., 2003). Interleukin 8 könnte deshalb wichtig sein, weil es zum Beispiel in mikrovaskulären Endothelzellen zu Aktinreorganisation und dem Zurückziehen der Endothelzellen führt und dadurch die Lückenbildung fördert (Schraufstatter et al., 2001). Auch HUVEC haben zumindest einen Rezeptoren für Interleukin 8 auf der Oberfläche (Murdoch et al., 1999).

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5. DISKUSSION

Ein weiteres Beispiel ist Epiregulin, dessen Expression ebenfalls in TEM+ Zelllinien stark rhöht war (24-fach). Epiregulin ist ein Mitglied der EGF-Familie und kann direkt sowohl an

de bereits ezeigt, dass es in Lungenmetastasen von Blasenkrebszellen verstärkt exprimiert wird

se befinden sich diese Endopeptidasen in intrazellulären Vesikeln, ber während der Tumorprogression kann es auch zur Sekretion der inaktiven und aktiven

wäre

eEGFR als auch an ErbB-Mitglieder binden (Komurasaki et al., 1997). Es wurg(Nicholson et al., 2004) und zusammen mit den hier erhaltenen Daten lässt sich vermuten, dass eine erhöhte EGFR-Signalgebung eine Rolle bei der Transmigration spielen könnte. Dafür gibt es bereits Hinweise, denn zumindest in Zusammenarbeit mit Janus Kinase 3 kann die EGFR-Signalgebung die MMP-3 Expression aktivieren und so transendotheliale Migration verstärken (Eum et al., 2006). Auch mehrere Proteasen waren in TEM+ Tumorzelllinien verstärkt exprimiert. Es ist anzunehmen, dass ihnen hauptsächlich eine Funktion beim Abbau der extrazellulären Matrix zukommt, was dann die Invasion fördert. Der Plasminogenaktivator (PLAU, uPA; 18-fach) zum Beispiel, ein Ligand des uPA-Rezeptors, ist schon mit Metastasierung in Verbindung gebracht worden. Diese Serinprotease spielt eine Schlüsselrolle in der Invasion und Metastasebildung von Prostatakrebszellen (Crowley et al., 1993; Achbarou et al., 1994; Sheng, 2001). uPA unterstützt vermutlich die Invasion der TEM+ Tumorzellen unter anderem durch Spaltung von Plasminogen zu Plasmin, da dieses zum Abbau von Komponenten der extrazellulären Matrix beiträgt. Außerdem kann uPA die Aktivierung von HGF/SF katalysieren (Naldini et al., 1992), das wiederum Migration und EMT fördert. TEM+ Zelllinien zeigten zusätzlich eine erhöhte Expression von zwei Cystein-Cathepsinen (je 3-fach). NormalerweiaFormen kommen, die dann an die Tumorzelloberfläche binden (Mohamed und Sloan, 2006). Cathepsin C und L bauen also auch Proteine der extrazellulären Matrix ab. Außerdem kann Cathepsin L die Aktivität von uPA in vitro katalysieren (Goretzki et al., 1992) und auch Adhäsionsmoleküle wie E-Cadherin spalten (Gocheva et al., 2006) und so vermutlich zusätzlich eine invasiven oder auch transmigrativen Phänotyp unterstützen. Nicht nur Proteasen waren in TEM+ Zelllinien erhöht, sondern auch andere extrazelluläre Matrixproteine. EDIL3 (Del1), das 8-fach stärker exprimiert wurde, hat eine komplexe Funktion bei der Regulation der Gefäßbildung. Es ist an vaskulärem Umbau und Angiogenese beteiligt (Hidai et al., 1998; Penta et al., 1999) und könnte deshalb einen Einfluss auf die strukturelle Integrität der Endothel-Einzellschicht haben und so die Passage der Tumorzellen vereinfachen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Bindung an EDIL3 die Gruppierung von Integrinen und die Bildung von Fokalkontakten veranlasst (Penta et al., 1999). Es möglich, dass diese die Invasion der TEM+ Zelllinien in die Kollagenmatrix unterstützen. Normalerweise wird EDIL3 zeitlich begrenzt während der Embryonalentwicklung ausschließlich auf Endothelzellen beschränkt exprimiert, aber die Reexpression konnte schon in mehreren Tumoren nachgewiesen werden und wird dort sowohl in angiogenetischen Endothelzellen, als auch in Tumorzellen gefunden. EDIL3 positive Tumore haben eine zwei- bis vierfach höhere kapillare Dichte (Aoka et al., 2002). Dies wiederum fördert wahrscheinlich die Metastasierung der Tumorzellen, da sie einen besseren Zugang zum Kapillarsystem des Körpers haben. Lysyloxidase wurde schon als Gen charakterisiert, das in MDA-MB-231 stärker exprimiert wird als in MCF-7 (Kirschmann et al., 1999). Es kann deshalb als eine Art Kontrolle für das verwendete experimentelle System angesehen werden, da es auch hier 22-fach höher exprimiert in TEM+ Zelllinien (zu denen MDA-MB-231 gehört) im Vergleich zu TEM- Zelllinien (zu denen MCF-7 gehört) gefunden wurde. Außerdem ist Lysyloxidase in Invasion

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5. DISKUSSION

und Metastasierung involviert (Kirschmann et al., 2002; Erler et al., 2006). Es handelt sich um eine kupferabhängige Aminoxidase, die zur Modulierung der extrazellulären Matrix in der

Tumorzellen möglicherweise stattgefundenen EMT ist, denn in der ntwicklung haben mesenchymale Zellen des Amnions höhere mRNA Mengen für

f den

ausgeht, dass das unterschiedliche Verhalten der Tumorzellen im Transmigrationsassay verschiedene Entwicklungsstadien widerspiegelt, würde man folglich erwarten, dass in den weiter entwickelten TEM+ Zelllinien Matriptase vermindert exprimiert wird, was auch der Fall ist. Ob ihr jedoch eine aktive Funktion bei der Verhinderung von Transmigration zukommt, und wenn ja welche, ist unklar.

Lage ist (Kagan und Trackman, 1991) und vermutlich so den TEM+ Zelllinien ebenfalls die Invasion erleichtert. Es wäre denkbar, dass die erhöhte Expression der Lysyloxidase eine Folge des in den TEM+ELysyloxidase als die amniotischen Epithelzellen (Casey und MacDonald, 1997). Einige am Stoffwechsel der Zellen beteiligte Enzyme waren auffällig verstärkt in den TEM+ Zelllinien zu finden. BCAT1, das hierzu gehört, ist ein zytosolisches Protein und an der Aminosäuresynthese beteiligt. Es ist nicht bekannt, ob es Migration oder Invasion beeinflussen kann. Als direktes Zielgen von c-Myc könnte es aber an der Tumorprogression beteiligt sein (Benvenisty et al., 1992; Ben-Yosef et al., 1996). In den TEM- Tumorzelllinien wurden vor allem Zelladhäsionsmoleküle wie E-Cadherin (96-fach), P-Cadherin (76-fach), Claudin 7 (17-fach) und Plakophilin 3 (3-fach) verstärkt exprimiert, die charakteristisch für einen differenzierten, nicht invasiven epithelialen Phänotyp sind. Dies zeigt, dass der Verlust der epithelialen Differenzierung nicht nur eine Voraussetzung für Invasion (Behrens et al., 1999), sondern auch für transendotheliale Migration ist. Zwar findet man auch Adhäsionsmoleküle, die in TEM+ Zelllinien verstärkt exprimiert wurden im Vergleich zu TEM- Zelllinien, aber diesen muss nicht unbedingt eine Funktion bei der Verankerung oder der Zell-Zell-Adhäsion zukommen, sondern sie könnten durchaus auch einen transmigrativen bzw. invasiven Phänotyp veranlassen. Nectin 3 ist zwar zum Beispiel ein IgCAM, aber es vermittelt nicht nur Zelladhäsion, sondern kann auch die kleinen G-Proteine Cdc42 und Rac aktivieren und so Migration fördern (Nakanishi und Takai, 2004). Nicht nur Adhäsionsmoleküle wurden in TEM- Tumorzelllinien stärker exprimiert als in TEM+ Zellen, sondern beispielsweise auch der Vitamin D Rezeptor. Allerdings besteht hier ein enger Zusammenhang, denn es konnte gezeigt werden, dass Vitamin D3 über die Bindung an den Rezeptor die Expression von E-Cadherin, sowie anderen Adhäsionsmolekülen induzieren kann (Pálmer et al., 2001). Dies ist vermutlich ein Mechanismus, der zur verstärkten Expression von E-Cadherin in TEM- Zellen führt, denn je mehr Rezeptor auZellen vorhanden ist, umso mehr Vitamin D3 kann binden. 13-fach stärker in TEM- Zelllinien wurde auch Matriptase exprimiert. Das ist insofern verwunderlich, als dass diese Serinprotease extrazelluläre Matrixproteine degradiert und beispielsweise uPA und HGF/SF durch Spaltung aktivieren kann (Lee et al., 2000; Takeuchi et al., 2000). Deshalb würde man eher vermuten, dass das Protein Transmigration und Invasion fördert und genau das weisen verschiedene Studien nach. Überexpression von Matriptase in Magenkrebszellen erhöhte die Bildung von Lymphknotenmetastasen in Nacktmäusen (Ihara et al., 2002) und der RNAi-vermittelte Abbau steigert die Invasion bestimmter Tumorzellen in vitro (Suzuki et al., 2003). Allerdings konnte auch gezeigt werden, dass Matriptase vor allem in frühen Stadien von Eierstockkrebs verstärkt exprimiert, während der Weiterentwicklung der Krankheit jedoch herunterreguliert wird (Tanimoto et al., 2005). Wenn man davon

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5. DISKUSSION

Matriptase kommt auf der Zelloberfläche in einem Komplex mit SPINT1 vor (Lin et al., 1999). Dieser Serinproteaseinhibitor ist auch als HAI-1 (HGF-Aktivator Inhibitor 1) bekannt und, wie der Name schon andeutet, ursprünglich als Inhibitor des HGFA (HGF-Aktivator) charakterisiert worden (Shimomura et al., 1997). Das integrale Membranprotein wurde zuerst ebenfalls als Inhibitor von Matriptase identifiziert (Benaud et al., 2001), reguliert aber auch ihren Transport an die Zelloberfläche und ihre Aktivierung (Oberst et al., 2005; Oberst et al., 2003). Hierdurch schützt SPINT1 die Zellen vor unkontrollierter Matriptaseaktivität (Oberst et al., 2005). Während Matriptase 13-fach erhöht in TEM- Zellen war, wurde SPINT1 55-fach stärker exprimiert. Das heißt, der Inhibitor kommt möglicherweise im Überfluss vor und

otch-Rezeptor

e Transmigration

d es zumindest unter den genauer untersuchten Genen

Matriptase an der Zelloberfläche wird sofort inaktiviert, weswegen sie transendotheliale Migration und Invasion nicht begünstigen kann. SPINT1 selber kann diesen Effekt wahrscheinlich dadurch verstärken, dass er auch Plasmin und Trypsin inhibiert und wie schon erwähnt HGFA (Denda et al., 2002). Letzteres würde sonst die Bildung von aktiven HGF aus der Vorstufe fördern. Verstärkte Expression des Serinprotesaseinhibitors hingegen reduziert aktiven HGF und vermindert die Metastasierung von Brustkrebszellen (Parr und Jiang, 2006). Die Reduzierung von SPINT1 führt zum Verlust der epithelialen Integrität durch veränderte Expression von E-Cadherin und β-Catenin (Szabo et al., 2006). Deshalb ist es denkbar, dass SPINT1 in den TEM- Zellen einen epithelialen Phänotyp unterstützt. Bei Betrachtung der differentiell exprimierten Gene fällt auf, dass die beiden NLiganden Jagged 1 und 2 (Luo et al., 1997; Shimizu et al., 2000) unterschiedliche Funktionen in der Wanderung der Tumorzellen über das Endothel zu haben scheinen. Während Jagged 1 vierfach höher in TEM+ Zellen vorkommt, findet man Jagged 2 fünffach mehr in den TEM- Zellen. Jagged 1 wurde mit einem metastatischen Phänotyp von Prostatakrebszellen assoziiert (Santagata et al., 2004) und wird deshalb vermutlich in den TEM+ Zellen stärker exprimiert. Aber auch für Jagged 2, das in metastatischen Melanomzellen stärker exprimiert wird als in nicht-metastatischen, wurde gefolgert, dass es diesen Prozess fördert (Gütgemann et al., 2001). Die erhaltenen Daten deuten jedoch darauf hin, dass Jagged 2 diverhindert, was jedoch noch weiter untersucht werden müsste. Die unterschiedliche Expression zwischen TEM+ und TEM- Zelllinien konnte für einige der untersuchten Gene auch in allen 41 Tumorzellen gezeigt werden (Abb. 4.4). Das lässt vermuten, dass sie eine wichtige Rolle bei der Passage zahlreicher Tumorzellen durch die Endothelzellen spielen. Hierunter fallen Integrin β3, EDIL3, BCAT1 und weniger deutlich IL-8 als Kandidaten, die vermutlich transmigrationsfördernde Eigenschaften haben, sowie EVA1 und Jagged 2, die einen epithelialen Phänotyp unterstützen könnten und somit die Wanderung der Tumorzellen durch das Endothel verhindern würden. Dieses Ergebnis zeigt allerdings auch, dass sich nur etwa die Hälfte der in den acht Zelllinien als verschieden exprimiert gefunden Gene auf alle 41 Tumorzelllinien übertragen lässt. Es wäre deshalb sinnvoll, zur weiteren Eingrenzung der möglichen Kandidaten für einen generellen Mechanismus bei der Transmigration die Mikroarray-Analyse auf weitere Zelllinien auszuweiten. Das Fehlen einer 100-prozentigen Übertragbarkeit deutet aber darauf hin, dass nicht alle TEM+ Zelllinien exakt denselben Mechanismus nutzen unkeines gibt, dessen alleinige An- oder Abwesenheit absolut essentiell ist. Allerdings spiegelt das Expressionsprofil eines Gens nicht die Menge oder Aktivität des gebildeten Proteins wider, das dann die eigentliche Funktion vermittelt, so dass es durchaus möglich ist, dass Zellen zwar ein Gen exprimieren, aber kein funktionelles Protein besitzen. Deshalb wäre es sinnvoll, auch noch die Proteinmengen in Frage kommender Kandidaten zu untersuchen. Bei

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5. DISKUSSION

genauerer Betrachtung von Abb. 4.4 fällt außerdem vor allem bei den in TEM- verstärkt exprimierten Genen auf, dass diese in allen stark transmigrierenden Zelllinien (ganz links dargestellt) fast komplett verloren gegangen sind. Je weniger Zellen im in vitro Versuch transmigrieren (in der Abb. von links nach rechts gehend) umso mehr dieser Marker werden wieder exprimiert. Es scheint also eher eine Kombination von Genen zu sein, deren gemeinsame Expression oder Repression einer Tumorzelllinie die Fähigkeit zur transendothelialen Migration und damit zur Bildung von Metastasen verleiht. Integrin β3 ist notwendig, aber nicht ausreichend für transendotheliale Migration Da eine genauere funktionelle Analyse aller regulierten Gene zu umfangreich gewesen wäre,

urde eine detaillierte Charakterisierung nur für Integrin β3 und EVA1 durchgeführt. Integrin

chwanderung des Endothels ermöglichen und Integrin β3 nur einer davon ist.

ndotheliale Migration notwendig

wβ3 ist an einer Vielzahl zellulärer Prozesse wie Adhäsion an die extrazelluläre Matrix, Zellmigration, Signalgebung, Verhinderung der Apoptose und Angiogenese beteiligt (Felding-Habermann, 2003). Es konnte gezeigt werden, dass Integrin β3 fast nur in TEM+ Tumorzelllinien exprimiert wird und sich der Heterodimer aus αv und β3 ausschließlich auf der Oberfläche dieser Zelllinien befindet (Abb. 4.4, Abb. 4.5, Tab. 4.4). Antikörper gegen Integrin αvβ3 bzw. der RNAi-vermittelte Abbau von endogenem Integrin β3 reduzierten die transendotheliale Migration einer Vielzahl von Tumorzellen aus verschiedenen Geweben, konnten diese aber nicht vollständig verhindern (Abb. 4.7, Abb. 4.9). Eine denkbare Ursache dafür ist, dass es nicht zu einem kompletten Verlust der Integrin β3 Aktivität durch Blockierung mit dem Antikörper bzw. Behandlung mit RNAi gekommen ist. Allerdings deutet dies auch wieder darauf hin, dass Tumorzellen mehrere Faktoren besitzen, die ihnen die DurDa der RNAi-vermittelte Abbau von Integrin β3 in Tumorzellen und Behandlung mit dem blockierenden Antikörper gegen Integrin αvβ3 ähnliche Effekte hatten und die Vorbehandlung der HUVEC mit dem Antikörper keine Auswirkung auf die transendotheliale Migration hatte, kann man davon ausgehen, dass das auf den Tumorzellen befindliche Integrin αvβ3 relevant ist und nicht das auf den Endothelzellen. Es konnte gezeigt werden, dass Integrin αvβ3 für die transeist, nicht jedoch für die Invasion in die Kollagen I Matrix oder die Adhäsion der untersuchten Tumorzellen an die HUVEC. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass Integrin αvβ3 besonders nach dem initialen Kontakt zwischen Tumor- und Endothelzellen wichtig ist und einen stabilen Kontakt zwischen diesen beiden Zelltypen während der Passage der Tumorzelle vermitteln könnte. Anhand der erhaltenen Daten lassen sich keine Aussagen darüber machen, ob das Integrin-Heterodimer hierfür mit einem Rezeptor auf den HUVEC interagieren muss oder ob es sich um eine Bindung an von Endothelzellen gebildeter extrazellulärer Matrix handelt. Integrin αvβ3 kann zahlreiche Liganden binden. Neben verschiedenen Komponenten der extrazellulären Matrix wie beispielsweise Fibronektin, Fibrinogen, Vitronektin, Thrombospondin, Laminin und EDIL3 (Stupack und Cheresh, 2002; Hidai et al., 1998) gehören dazu auch die IgCAMs L1/CD171 (Ebeling et al., 1996; Montgomery et al., 1996) und PECAM-1/CD31 (Piali et al., 1995; Buckley et al., 1996), das Zelladhäsionsmolekül Thy-1/CD90 (Saalbach et al., 2005), sowie ADAM-15 (Zhang et al., 1998) und uPAR (Tarui et al., 2001).

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5. DISKUSSION

Bei Untersuchung der transendothelialen Migration von WM 239 Melanomzellen wurde gezeigt, dass Integrin αvβ3 auf den Tumorzellen mit L1 auf humanen mikrovaskulären Lungenendothelzellen interagiert, und dass die Transmigration sowohl durch Antikörper gegen Integrin αvβ3 als auch L1 reduziert werden konnte (Voura et al., 2001). Diese Interaktion entfällt in dem hier vorliegenden experimentellen System, da die eingesetzten HUVEC kein L1 besitzen (Daten nicht gezeigt). Ein denkbarer Rezeptor ist PECAM-1, das durch homophile Interaktion die Bindung zwischen Endothelzellen vermittelt. Die Rolle von PECAM-1 bei der transendothelialen Migration von Tumorzellen ist zwar nicht eindeutig geklärt, aber funktionelle Studien haben bewiesen, dass PECAM-1 eine entscheidende Funktion bei der transendothelialen Migration von Monozyten hat und dass hierbei vor allem die subzelluläre Lokalisation von Bedeutung ist. Das IgCAM wird nämlich an die Stellen der Zelle umverteilt, an denen aktive Transmigration stattfindet und Antikörper gegen PECAM-1 blockieren spezifisch den Schritt der Durchwanderung des Endothels, wohingegen die Monozyten noch adhärieren und zu den interzellulären Verbindungen zwischen den Endothelzellen wandern können (Muller, 1993; Mamdouh et al., 2003). Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass die Interaktion zwischen Integrin αvβ3 und PECAM-1 für die transendotheliale Migration von Tumorzellen essentiell sein könnte. Aber auch Thy-1, ein Aktivierungs-assoziiertes Zelladhäsionsmolekül, kommt als Interaktionspartner für Integrin

tionen zu modulieren (White, 003). Folglich ist auch das Rezeptorpaar Integrin αvβ3 – ADAM-15 als Vermittler der

αvβ3 in Frage, denn es ist für die Wanderung von Melanomzellen durch humane mikrovaskuläre Endothelzellen aus der Dermis nötig. Allerdings wurde durch Zugabe von Antikörpern gegen Thy-1 auch die Adhäsion an die Endothelzellen reduziert, was gegen diesen Kandidaten spricht (Saalbach et al., 2005). HUVEC exprimiern Thy-1 (Daten nicht gezeigt), es wurde jedoch noch nicht untersucht, ob es sich auch auf ihrer Oberfläche befindet. Bekannt ist außerdem, dass HUVEC ADAM-15 exprimieren und dass Integrin αvβ3 und ADAM-15 zusammen stabile Zell-Zell-Kontakte vermitteln können (Herren et al., 1997; Zhang et al., 1998). ADAMs haben sowohl eine Disintegrindomäne, mit der sie an Integrine auf benachbarten Zellen binden können, als auch eine Matrixmetalloproteinase-Domäne, und sind deshalb in der Lage Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interak2transendothelialen Migration von Tumorzellen denkbar. uPAR kann ebenfalls als Ligand für Integrin αvβ3 auf einer entgegen gesetzten Zelle fungieren (Tarui et al., 2001) und wäre auch noch ein denkbarer Interaktionspartner bei der Transmigration. Allerdings muss noch untersucht werden, ob der Rezeptor auf der Oberfläche von HUVEC vorkommt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde Integrin β3 nicht nur mittels RNAi reduziert, sondern auch in einer TEM- Zelllinie, die kaum endogenes Integrin αvβ3 besitzt, überexprimiert, um zu untersuchen, ob so die transendotheliale Migration induziert werden kann. Obwohl die stabilen Integrin β3-Klone den Komplex aus Integrin αV und β3 auf der Oberfläche hatten, konnte kein Einfluss auf die Zahl transmigrierender Zellen beobachtet werden (Abb. 4.10). Auch die Zugabe von HGF/SF, von dem bekannt ist, dass er die Invasion der verwendeten Zelllinie veranlasst (Weidner et al., 1990), hatte keinen weiteren Effekt auf die Transmigration der Integrin β3 positiven Zellen. HGF/SF war aber in der Lage, die Wanderung der Kontrollzellen durch das Endothel signifikant zu erhöhen. Das zeigt, dass es durchaus möglich ist, die Zahl transmigrierender Zellen in TEM- Zelllinien zu steigern Die erhaltenen Ergebnisse deutet darauf hin, dass Integrin β3 alleine nicht ausreichend ist, um die transendotheliale Migration von TEM- Zelllinien zu veranlassen, obwohl es für diesen Prozess notwendig ist, was anhand der Blockierungsexperimente und des RNAi-vermittelten

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Abbaus gezeigt werden konnte. Das ist allerdings nicht verwunderlich, wenn man davon ausgeht, dass ein so komplexer Vorgang nicht nur durch ein einziges Protein gesteuert wird. Minn et al. (2005) konnten sogar zeigen, dass es nicht einmal ausreicht, drei der insgesamt neun von ihnen als relevant für die Metastasierung von Brutkrebszellen charakterisierten Gene in wenig metastatischen Zellen über zu exprimieren. Erst bei Kombinationen von sechs der Gene konnte ein metastatischer Phänotyp induziert werden. Auch in dieser Studie war die Reduzierung eines der Gene aber schon ausreichend, um die Metastasierung zu vermindern.

ußerdem kann man davon ausgehen, dass für die transendotheliale Migration nicht nur berflächenrezeptoren wichtig sind, sondern auch Änderungen im Zytoskelett der

lärung afür, dass die Überexpression von Integrin β3 keine Transmigration induzierte, könnte sein,

eil von

f derselben Zelle assoziiert und z. T. deren ignalgebung verstärkt (Schneller et al., 1997; Borges et al., 2000; Moro et al., 2002).

dung von Metastasen nach der Bestrahlung von Cervixkarzinompatientinnen (Albelda et al., 1990; Hieken et al., 1996; Natali et al., 1997; Hieken et al., 1999;

AOwandernden Zellen und die Aktivierung von Proteasen. Eine andere mögliche Erkddass Integrin αvβ3 aktiviert werden muss, damit es funktionell ist (Felding-Habermann et al., 2001) und vielleicht fehlen in der verwendeten Zelllinie die zur Aktivierung nötigen Mechanismen. Oder die Integrin-Signalgebung in der Zelle ist wegen nicht vorhandener intrazellulärer Signal- und Adapterproteine nicht möglich. Es stellt sich daher die Frage, wie Integrin β3 zusammen mit Integrin αv die transendotheliale Migration der TEM+ Zelllinien vermittelt. Wichtige Komponenten, die noch zu untersuchen sind, könnten sein: Das IgCAM IAP/CD47 (integrin associated protein), für dessen Assoziation über die Ig-Domäne mit Integrin αvβ3 auf derselben Zelle und anschließende Ligandenbindung schon eine Funktion bei der Diapedese von Leukozyten gezeigt werden konnte (Brown et al., 1990; Imhof et al., 1997; Weerasinghe et al., 1998), Talin, das an den zytoplasmatischen Teil von Integrin β3 bindet, Konformationsänderungen veranlasst und so die Ligandenaffinität erhöht (Tadokoro et al., 2003), sowie die Kinasen ILK (integrin linked kinase) und FAK (focal adhesion kinase), die ebenfalls an den intrazellulären TIntegrin β3 binden und durch Integrinaktivierung in Fokalkontakte rekrutiert werden (Zhao et al., 2004). Überexpression von ILK kann beispielsweise zur Repression von E-Cadherin führen (Oloumi et al., 2004) und so transmigrationsfördernd wirken. Denkbar wäre auch eine Rolle des Insulinrezeptors sowie von EGFR, PDGFR und VEGFR, da Integrin αvβ3 mit diesen Wachstumsfaktor-Rezeptoren auSIntegrin αvβ3 könnte die Transmigration weiterhin erleichtern, weil es sowohl mit MMP-2 und MMP-9 kooperiert und deren Aktivierung induziert (Brooks et al., 1996; Felding-Habermann et al., 2002; Rolli et al., 2003), als auch mit uPA (Tarui et al., 2006). Es war schon bekannt, dass die Expression von Integrin (αv)β3 in Zusammenhang mit der Aggressivität von Tumoren steht. Ein Polymorphismus in der extrazellulären Domäne von Integrin β3, der die Konformation ändert und so die Ligandenaffinität ändern könnte, korreliert mit einem erhöhten Risiko bei der Entwicklung von Krebs (Bojesen et al., 2003). Klinische Untersuchungen von Patienten mit Melanomen oder Cervixkrebs zeigten, dass Integrin β3 in der Mehrzahl der Primärtumore (61-69 %) exprimiert wird und dass diese Expression dann mit einer verkürzten krankheitsfreien Zeit und einem kürzeren Überleben korreliert. Außerdem ließ sich in malignen Läsionen von Melanomen und Cervixkarzinomen mehr Integrin αvβ3 nachweisen als in benignen, und es bestand ein Zusammenhang zwischen der Expression von Integrin β3 und der Entstehung von Lungenmetastasen aus Melanomen sowie der Bil

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Chattopadhyay und Chatterjee, 2001; Gruber et al., 2005). Dass Integrin β3 eine Rolle bei der Metastasierung haben muss, kann auch aus anderen Studien gefolgert werden. Überexpression von Integrin αvβ3 in Brustkrebszellen förderte beispielsweise die Entstehung von Knochenmetastasen in Nacktmäusen (Liapis et al., 1996; Pécheur et al., 2002). Bei der Bildung von Metastasen durch Integrin αvβ3 ist das NPXY-Motiv in der zytoplasmatischen Domäne von Integrin β3 entscheidend (Filardo et al., 1995). Ob es an der transendothelialen Migration von Tumorzellen in vitro beteiligt ist, könnte durch Mutation dieser Sequenz untersucht werden. Einige Studien weisen auch auf eine Rolle von Integrin αvβ3 bei der organspezifischen Metastasierung hin. So konnte beispielsweise durch Überexpression des Adhäsionsmoleküls in CHO-K1 Zellen die Zahl der in der Leber auswandernden Zellen erhöht werden, wohingegen kein Unterschied bei der Bildung von Metastasen in der Lunge beobachtet wurde (Kikkawa et al., 2002). Verstärkte Expression von Integrin αvβ3 in Brustkrebszellen, die vorher nur in der Lunge metastasierten, führte zusätzlich zur Ausbildung von Knochenmetastasen (Sloan et al., 2006). Alle diese Untersuchungen zeigten aber nicht, in welchen Schritt der Metastasierung genau Integrin αvβ3 involviert ist. Mit Hilfe der hier durchgeführten Experimente konnte belegt werden, dass Integrin αvβ3 spezifisch an der transendothelialen Migration von Tumorzellen beteiligt und hierfür essentiell, aber nicht ausreichend ist und dass die entscheidende Untereinheit Integrin β3 sein muss. Für WM 239 Melanomzellen und PC-3 Prostatakrebszellen wurde schon zuvor eine Rolle von Integrin αvβ3 bei der Wanderung durch das Endothel mit Hilfe von Experimenten mit blockierenden Antikörpern abgeleitet (Voura et al., 2001; Wang et al., 2005b). Die vorliegende funktionelle Analyse umfasst jedoch zahlreiche Tumorzelllinien aus diversen Geweben und belegt daher umfassender die Rolle von Integrin αvβ3 bei der transendothelialen Migration. Diese Funktion wird zusätzlich dadurch untermauert, dass sowohl die Expression als auch die Oberflächenlokalisation des Integrin-Heterodimers in einer Vielzahl humaner Tumorzelllinien mit der TEM+ Gruppe korreliert. Anzumerken ist, dass Integrin αvβ3 vermutlich aber eine zusätzliche Aufgabe bei der Metastasierung in vivo zukommt, denn Experimente unter physiologischen Strömungsbedingungen haben Hinweise darauf gegeben, dass Integrin αvβ3 auch die Adhäsion an Blutplättchen vermittelt und so den Arrest der jeweils untersuchten Tumorzellen im Zielorgan fördert (Felding-Habermann et al., 1996; Felding-Habermann et al., 2001). Da Integrin αvβ3 bei der Metastasierung von humanen Tumorzellen maßgeblich beteiligt ist, sind in den vergangenen Jahren zahlreiche Inhibitoren gegen das Adhäsionsmolekül auf ihre Wirkung in Integrin αvβ3-vermittelten Prozessen hin getestet und teilweise auch klinisch evaluiert worden. Hierzu gehören Antikörper (Gutheil et al., 2000; Mitjans et al., 2000), kleine Moleküle (Marugán et al., 2005; Dayam et al., 2006), peptidmimetische Substanzen (Belvisi et al., 2001; Del Gatto et al., 2006) und zyklische Peptide (Dechantsreiter et al., 1999; Mitjans et al., 2000). In klinischen Studien wurde hierbei das hauptsächliche Augenmerk auf die angiogenetische und antiapoptotische Wirkung von Integrin αvβ3 gerichtet. Bei experimentellen Metastasierungsversuchen in Mäusen führte sowohl die Applikation von monoklonalen Antikörpern als auch des Inhibitors S247 zur Reduktion des metastatischen Wachstums (Yun et al., 1996; Trikha et al., 2002; Reinmuth et al., 2003; Harms et al., 2004). Es wäre deshalb interessant, die Auswirkung dieser Inhibitoren im verwendeten Transmigrationsassay zu untersuchen.

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5. DISKUSSION

EVA1 vermittelt Zell-Zell-Adhäsion und reprimiert die transendotheliale Migration EVA1 ist ein Zelloberflächenrezeptor aus der Gruppe der IgCAM mit nur einer extra-zellulären Ig-ähnlichen Domäne. Es wird hauptsächlich auf epithelialen Zellen exprimiert und vermittelt homophile Interaktionen, wenn es in nicht adhärenten Zellen überexprimiert wird (Guttinger et al., 1998). In dieser Hinsicht ähnelt es dem Zelladhäsionsmolekül E-Cadherin, welches der Tumorzellinvasion entgegenwirkt (Behrens et al., 1989). Ansonsten ist über dieses Adhäsionsmolekül bisher nur bekannt, dass es eine Rolle bei der Thymusentwicklung und der Plazentamorphogenese spielt (Guttinger et al., 1998; Teesalu et al., 1998). Die Expression von EVA1 korrelierte bei der Untersuchung der 41 Tumorzelllinien nahezu perfekt mit der TEM- Gruppe und stimmte sogar besser mit ihr überein als die von E-Cadherin (Abb. 4.4). Dieses Ergebnis deutet an, dass EVA1 eine Funktion bei der Hemmung der transendothelialen Migration zukommt. Vermutlich vermittelt das IgCAM diesen Effekt über die Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten zwischen den Tumorzellen, die dann nicht mehr durch das Endothel wandern können. Durch

berexpression von EVA1 in verschiedenen Zelllinien (293T, EJ-28, MDA-MB-231, 786.0)

legten, dass VA1 tatsächlich die Zahl der transmigrierenden Zellen vermindern kann, wenn es stabil

Üund den RNAi-vermittelten Abbau in MS751 Zellen konnte gezeigt werden, dass EVA1 tatsächlich an der Zelladhäsion beteiligt sein muss, da die Überexpression zu einem engeren Kontakt zwischen den Zellen führte, wohingegen sich bei Reduktion der Expression das Dissoziieren der Zellen beobachten ließ (Abb. 4.12, Abb. 4.13, Abb. 4.16). Letzteres war ausschließlich auf die verminderte Menge an endogenem EVA1 zurückzuführen und nicht etwa auf eine geringere Menge an E-Cadherin in den stabilen siEVA1-Klonen. Die Aggregation von Zellen in Suspension konnte stabil exprimiertes EVA1 allerdings nicht fördern (Abb. 4.14). Vielleicht war die für das Experiment gewählte Zeitspanne nicht lang oder kurz genug, um Unterschiede zu erkennen, oder die Klone haben nicht ausreichend EVA1 auf ihrer Zelloberfläche, weil ein großer Teil des gebildeten Proteins in den Zellen bleibt. Der Aggregationsversuch wurde deshalb auch mit transient transfizierten 293T durchgeführt, da in diesen Zellen das gesamte Protein an die Oberfläche transportiert wurde. Hierbei gab es zwar ebenfalls keine Unterschiede in der Größe der Aggregate, allerdings ließ sich beobachten, dass innerhalb dieser Aggregate EVA1-positive Zellen in Gruppen von drei bis fünf zusammen lagen, wohingegen mit RFP als Kontrolle transfizierte Zellen meist nur maximal zu zweit gefunden wurden (Daten nicht gezeigt). Funktionelle Experimente mit Tumorzelllinien aus verschiedenen Geweben beEexprimiert wird (Abb. 4.13). Ebenso wie bei der verminderten Expression von Integrin β3, kam es aber auch hier nicht zu einer vollständigen Hemmung der transendothelialen Migration, sondern nur zu einer schwachen, aber signifikanten Reduzierung. Erneut weist dieses Ergebnis darauf hin, dass an dem komplexen Prozess der Durchwanderung des Endothels zahlreiche Faktoren beteiligt sein müssen und es deshalb nicht ausreicht einen dieser Faktoren hinzuzufügen oder wegzunehmen. EVA1-Überexpression hatte keine Auswirkung auf die Adhäsion der Tumorzellen an HUVEC oder die Invasion in Kollagen I und man kann daher annehmen, dass die durch EVA1-vermittelte Zelladhäsion spezifisch die Transmigration verhindert. Versuche mit RNAi gegen EVA1 zeigten jedoch ein inkonsistenteres Bild. Zwar ließ sich bei transienter Transfektion von siOligonukleotiden die Anzahl der transmigrierten Zellen moderat steigern (Abb. 4.19), aber bei den stabilen siEVA1-Klonen war sie nicht signifikant

64

5. DISKUSSION

erhöht (Abb. 4.17). Dieses Ergebnis belegt, dass es Unterschiede in den einzelnen Tumorzelllinien geben muss im Hinblick auf die für die Transmigration benötigten Faktoren und vermutlich eine Kombination aus diesen Faktoren benötigt wird, um den Prozess zu induzieren bzw. zu verhindern. Keine der mit RNAi gegen EVA1 (shRNA bzw. siOligonukleotide) transfizierten Zellen hat beispielsweise Integrin αvβ3 auf der Oberfläche und die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente legen dem Adhäsionsmolekül eine wichtige Funktion bei der Wanderung der Tumorzellen durch das Endothel nahe. Es wäre deshalb interessant zu testen, ob die gleichzeitige Überexpression von Integrin β3 zusammen

. 4.13). Stabiler RNAi-ermittelter Abbau von EVA1 schien jedoch die Invasivität zu erhöhen (Abb. 4.17). Hierbei

VA1 Expression wird durch E-Box-bindende Transkriptionsfaktoren reguliert

mit der Reduzierung von EVA1 einen Effekt auf die Diapedese hat. MS751, MCF-7 und HCT116 sind außerdem positiv für E-Cadherin, das nachweislich eine Rolle bei der Verhinderung von Invasion hat. Zusätzlicher stabiler RNAi-vermittelter Abbau von E-Cadherin in siEVA1-Klonen konnte die transendotheliale Migration jedoch auch nicht signifikant verstärken (Daten nicht gezeigt). Bei Untersuchung der Invasivität von EVA1-überexprimierenden Klonen war kein signifikanter Unterschied zu Kontrollklonen beobachtet worden (Abbvhandelte es sich aber um einen eher schwachen Effekt, so dass vermutet werden kann, dass eine so geringe Veränderung bei stark invasiven Zelllinien wie EJ-28, MDA-MB-231 und 786.0 nicht auffallen würde. Außerdem war auch nach Untersuchung von mehreren MS751 siEVA1-Klonen nicht auszuschließen, dass die beobachtete Invasivität nur auf klonale Variationen zurückzuführen ist. Deshalb konnte nicht geklärt werden, ob EVA1 auch eine Funktion bei der Invasion hat. Ähnliches gilt für die Adhäsion an unbeschichtetes Plastik und Kollagen I. Die erhaltenen Daten deuten an, dass EVA1 darin involviert sein könnte, da die Verminderung von endogenem EVA1 die Zahl der adhärierten Zellen deutlich reduzierte (Abb. 4.18). Allerdings sind auch hier klonale Variationen nicht auszuschließen. Zur genaueren Bestimmung der Rolle von EVA1 bei Invasion und Adhäsion an verschiedene Substrate müssten noch weitere Experimente durchgeführt werden. Für andere IgCAMs konnte jedoch bereits gezeigt werden, dass sie in der Lage sind, neben der Vermittlung von homophilen Interaktionen auch noch an Komponenten der extrazellulären Matrix zu binden (Cavallaro und Christofori, 2004). E Überexpression von EVA1 in verschiedenen Zelllinien führte zu einem engeren Kontakt zwischen den untersuchten Zellen, eine Veränderung in der Morphologie, die auf MET hindeutet und die Reduktion von EVA1 veranlasste das Dissoziieren der Zellen, wie es für EMT charakteristisch ist. Dieser Vorgang wird durch eine Vielzahl an Transkriptionsfaktoren reguliert, die alle auch als transkriptionelle Repressoren von E-Cadherin identifiziert wurden. Für E-Cadherin wiederum ist bekannt, das der Verlust Invasion verursacht. In dieser Arbeit konnte durch Untersuchung von Snail, Slug, ZEB1 und ZEB2 gezeigt werden, dass diese Transkriptionsfaktoren mit Ausnahme von Slug alle in der Lage sind, auch die Expression von EVA1 zu reprimieren.

65

5. DISKUSSION

ZEB1 kann EVA1 auf RNA-Ebene regulieren und in Reporterversuchen zeigte sich, dass dies ermutlich durch Bindung an den Promotor geschieht. Hierbei scheint vor allem die bei +8

ch EVA1 exprimiert. Alle anderen Zelllinien haben

rung der Promotoraktivität führt. hromatin-Immunpräzipitations-Experimente durchgeführt von Dr. Geert Berx (Universität

sterben (Carver et al., 2001), Slug-defiziente Mäuse aber

vliegende E-/Z-Box wichtig zu sein, da die durch ZEB1 verursachte Repression bei Mutation der Sequenz vermindert war (Abb. 4.22). Insgesamt konnte die Aktivität der Promotorkonstrukte durch Zugabe von ZEB1 aber nur um etwa 30 bis 40% reprimiert werden, was vermuten lässt, dass die Expression von EVA1 über weitere Repressoren gesteuert wird. ZEB2 verminderte die Promotoraktivität im Reporterversuch ebenfalls nur um circa 30%, was dasselbe andeutet. Da die Mutation der E-Box bei +8 zu einem vollständigen Verlust der Repression führte, kann man davon ausgehen, dass zumindest eine der beiden Zinkfingergruppen von ZEB2 an diese Sequenz bindet. RNAi-vermittelter Abbau von ZEB2 in drei verschiedenen Zelllinien hatte aber weder Einfluss auf die Expression des bekannten Zielgens E-Cadherin noch auf EVA1. PC-3 ist die einzige unter allen untersuchten Tumorzelllinien, die sowohl ZEB2 als auentweder RNA für den Transkriptionsfaktor oder das Adhäsionsmolekül. Denkbar ist, dass in PC-3 für ZEB2 nötigen Korepressoren wie etwa CtBP fehlen (Postigo und Dean, 1999) und die Expression von EVA1 in dieser Zelllinie nicht durch ZEB2 reprimiert werden kann. Folglich hat dann auch die Reduzierung des Transkriptionsfaktors keine Auswirkung auf die EVA1-Expression. MDA-MB-436 und CAKI-1 haben keine mRNA für EVA1 und der RNAi-vermittelter Abbau von ZEB2 kann die Expression des Adhäsionsmoleküls nicht induzieren. Wahrscheinlich wird EVA1 in diesen Zelllinien nicht nur durch ZEB2 sondern eben auch durch ZEB1 und Snail reprimiert. Folglich ist die Verminderung eines der drei Transkriptionsfaktoren nicht ausreichend um die Expression zu induzieren. Für Snail konnte gezeigt werden, dass es die Expression von EVA1 auf RNA-Ebene reprimiert (Abb. 4.23). Induzierte Überexpression des Transkriptionsfaktors führte zur Verminderung von EVA1, wohingegen der RNAi-vermittelte Abbau von Snail erhöhte Expression von EVA1 verursachte. Auch im Reporterversuch wurde die Aktivität der EVA1-Promotorkonstrukte um 60% durch Zugabe von Snail vermindert. Im Gegensatz dazu stieg diese bei Zugabe der Snail-SnagΔ Deletionsmutante um 40 bis 50% an (Abb. 4.23). Dies zeigt erstens, dass die Snag-Domäne tatsächlich für die Repressorfunktion nötig ist und zweitens, dass die durch Kotransfektion von Snail verursachte Repression ein spezifischer Effekt sein muss. Anscheinend kann die Deletionsmutante andere funktionelle Transkriptionsrepressoren vom EVA1-Promotor verdrängen, was dann zu einer InduzieCGent, Belgien) zeigten eine Interaktion von Snail mit dem Bereich des EVA1-Promotors von +1 bis +102. Da sich das in der E-Box bei +8 mutierte Promotorkonstrukt aber immer noch um 50% in seiner Aktivität reprimieren ließ, muss Snail wohl an eine andere Stelle in den 90 Nukleotiden binden. Allerdings könnte es sich bei der Repression der Aktivität des mutierten Promotors um einen unspezifischen Effekt handeln, da in vergleichbaren Experimenten auch eine mutierte Version des E-Cadherin Promotors verminderte Aktivität zeigte (Daten nicht gezeigt). Dass Snail, aber nicht Slug die Expression von EVA1 reprimierte, ist verwunderlich, da diese beiden Transkriptionsfaktoren stark homologe Mitglieder der Snail-Familie sind. Allerdings scheinen sie schon in der Entwicklung verschiedene Funktionen zu besitzen, da Snail-mutierte Mäuse in der Gastrulationlebensfähig sind (Jiang et al., 1998). Auch konnten Moreno-Bueno et al. (2006) mit Mikroarray-Analysen zeigen, dass Snail und Slug zum Teil redundant sind, aber auch spezifische Zielgene regulieren.

66

5. DISKUSSION

Die untersuchten Transkriptionsfaktoren verursachten im Reporterversuch alle nur eine um 30 bis 60% verminderte Aktivität der EVA1-Promotorkonstrukte. Es wäre deshalb interessant zu untersuchen, welchen Effekt die Kotransfektion von zwei bzw. allen drei Repressoren hat. Außerdem ist bekannt, dass zum Beispiel E-Cadherin nicht nur durch Zinkfingerfaktoren reprimiert wird, sondern auch durch bHLH-Faktoren wie E12/E47 und Twist (Perez-Moreno et al., 2001; Yang et al., 2004). Man könnte folglich vermuten, dass diese beiden Transkriptionsfaktoren ebenso die Expression von EVA1 verhindern könnten, was noch zu überprüfen wäre. Bei Betrachtung von Abb. 4.20 fällt auf, dass die Expression von Slug und ZEB2 mit der TEM+ Gruppe übereinstimmen. ZEB2 korreliert zusätzlich invers mit der Expression von EVA1. Snail und ZEB1 zeigen weder eine Übereinstimmung mit einer der beiden Gruppen noch mit der EVA1-Expression. Obwohl EVA1 in diversen Zelllinien mit den Transkriptions-

ktoren koexprimiert wird, ist es vermutlich ein Zielgen von Snail, ZEB1 und ZEB2, aber

wirken, da keiner die Aktivität des Promotorkonstrukts ollständig reprimierte. Der Verlust von EVA1 veranlasst - wie hier gezeigt - EMT, was den umorzellen dann die transendotheliale Migration ermöglicht.

s könnte sogar ein Zusammenhang zwischen der transmigrationsfördernden Wirkung von

fanicht von Slug. Dies zeigt erneut, dass die Expression nicht die tatsächliche Proteinmenge bzw. die Lokalisation widerspiegelt. Snail wird jedoch vor allem über diese beiden Mechanismen reguliert. Aus diesem Grund wäre es von Interesse, sowohl Proteinmengen als auch subzelluläre Lokalisation der einzelnen Transkriptionsfaktoren zu bestimmen. Möglich wäre auch, dass nicht in allen Zelllinien die zur Wirksamkeit der Repressoren nötigen Kofaktoren wie die Azetyltransferase p300 für Snail und ZEB1 (Postigo et al., 2003; Peña et al., 2006), CtBP für Snail und die beiden ZEBs (Postigo und Dean, 1999; Postigo und Dean, 2000; Peña et al., 2006) bzw. HDACs für Snail und Slug (Tripathi et al., 2005; Peinado et al., 2004) vorhanden sind und sich deshalb kein inverser Zusammenhang zwischen der Expression beobachte ließ. Für das bekannte Zielgen E-Cadherin konnte allerdings zumindest für Slug und die beiden ZEBs in etwa eine inverse Korrelation gefunden werden (Hajra et al., 2002; Eger et al., 2005; Comijn et al., 2001). EVA1 ist also ein Ziel E-Box-bindender Transkriptionsfaktoren, die dafür bekannt sind, durch die Repression von Komponenten verschiedener Zell-Zell-Adhäsionen EMT zu induzieren. Die erhaltenen Daten lassen vermuten, dass Snail, ZEB1 und ZEB2 bei der transkriptionellen Repression von EVA1 zusammen vT EIntegrin β3 und der transmigrationshemmenden von EVA1 bestehen. Integrin β3 kann über seinen zytoplasmatischen Schwanz mit ILK interagieren und über diese Kinase signalisieren (Zhao et al., 2004). Dies führt zur Aktivierung von Snail und ZEB1 (Tan et al., 2001; Guaita et al., 2002; Barberà et al., 2004), die dann wiederum in der Lage sind, EVA1 zu reprimieren. Ob ein solcher Zusammenhang tatsächlich besteht, könnte man zum Beispiel dadurch überprüfen, indem man die Expression von EVA1 in den RNAi-β3 Klonen untersucht.

67

5. DISKUSSION

Die erhaltenen Daten zeigen, dass mit Hilfe von vergleichender Genexpressionsanalyse mehrerer Tumorzelllinien Gene identifiziert werden konnten, die spezifisch an dem Prozess der transendothelialen Migration und nicht an Zellmigration allgemein beteiligt sind und dass Adhäsionsmoleküle, wie hier am Beispiel von EVA1 gezeigt, in der Lage sind, transendotheliale Migration zu hemmen und deshalb im Zuge der EMT mit Hilfe von E-Box-bindenden Transkriptionsfaktoren reprimiert werden. Bei Tumorzellen besteht vermutlich nicht, wie für Monozyten gezeigt, ein einheitlicher Transmigrationsmechanismus, aber verschieden Tumorzellen aus unterschiedlichen Geweben verwenden ähnliche Faktoren, um das Endothel zu überwinden.

68

6. MATERIAL UND METHODEN


6.1. Material

6.1.1. Organismen

6.1.1.1. Bakterienstämme E. coli Stamm Marker Referenz XL1 Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44

relA1 lac[F’ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene Europe, Amsterdam, Niederlande

Tab. 6.1: Escherichia coli-Wildtypstamm

6.1.1.2. Humane und Tumorzelllinien Folgende Zelllinien wurden der Stammsammlung der Arbeitsgruppe entnommen: Zelllinie Gewebe Tumor Zelltyp Referenz 786.0 Niere Adenokarzinom Epithelzellen CRL-1932, ATCC

A125 Lunge Adenokarzinom k.A. k.A.

A172 Gehirn Glioblastom Astrozyten CRL-1620, ATCC

A875 Haut Melanom Melanozyten Giard et al., 1973

C

Colo201 Kolon Karzinom Epithelzellen CCL-224, ATCC

Colo205 Kolon Karzinom Epithelzellen CCL-222, ATCC

CX-1 Kolon Adenokarzinom Epithelzellen ACC129, DSMZ

CX-2 Kolon Adenokarzinom Epithelzellen CLS, Eppelheim

A375 Haut Malignes Melanom Epitheliale Melanozyten

CRL-7904, ATCC

A427 Lunge Karzinom Epithelzellen HTB-53, ATCC

A431 Haut Epidermoidkarzinom Epithelzellen CRL-1555, ATCC

A549 Lunge Karzinom Epithelzellen CCL-185, ATCC

BT549 Brust Duktales Karzinom Epithelzellen HTB-122, ATCC

C33A Cervix Karzinom Epithelzellen HTB-31, ATCC

CaCo-2 Kolon Kolorektales Adenokarzinom

Epithelzellen HTB-37, ATCC

CAKI-I Niere Karzinom Epithelzellen HTB-46, ATCC

Capan I Pankreas Adenokarzinom Epithelzellen HTB-79, ATC

69


DANG Pankreas Adenokarzinom Epithelzellen ACC 249, DSMZ

DLD-1 Kolon Kolorektales Adenokarzinom

Epithelzellen CCL-221, ATCC

DLD-1TR21-hSnail

Kolon De Craene et al., 2005a

DU145 Prostata Karzinom Epithelzellen HTB-81, ATCC

ellen HTB-43, ATCC

HCT116 Kolon Kolorektales Karzinom Epithelzellen CCL-247, ATCC

HEK293T Niere Humane embryonale Zellen

HTL04001, ICLC

HS578T Brust Adenokarzinom Epithelzellen 86082104, ECACCHT-29 Kolon Kolorektales

Adenokarzinom Epithelzellen HTB-38, ATCC

KS Brust Karzinom Epithelzellen LoVo Kolon Kolorektales

Adenokarzinom Epithelzellen CCL-229, ATCC

LX-1 Kolon Karzinom Epithelzellen CLS, Eppelheim

MCF-7 Brust Adenokarzinom Epithelzellen HTB-22, ATCC

MDA-MB-231 Brust Adenokarzinom Epithelzellen HTB-26, ATCC


MDA-MB-436 Brust Adenokarzinom Epithelzellen HTB-130, ATCC MDA-MB-453 Brust Metastatisches

Karzinom Epithelzellen HTB-131, ATCC


Me180 Cervix Epidermoidkarzinom Epithelzellen HTB-33, ATCC

MiaPaca2 Pankreas Karzinom Epithelzellen 85062806, ECACC

MS751 Cervix Epidermoidkarzinom Epithelzellen HTB-34, ATCC

PC-3 Prostata Adenokarzinom Epithelzellen CRL-1435, ATCC

RT112 Blase Karzinom Epithelzellen HTB-30, ATCC

SkBr3 Brust Adenokarzinom Epithelzellen HTL03005, ICLC SW48 Kolon Kolorektales

Adenokarzinom Epithelzellen CCL-231, ATCC

SW480 Kolon Kolorektales Adenokarzinom






T47D Brust Duktales Karzinom Epithelzellen HTB-133, ATCC

EJ-28 Blase Karzinom Epithelzellen CLS, Eppelheim

FaDu Pharynx Karzinom Epithelz

Tab. 6.2: Tumorzelllinien

70


6.1.2. Vektoren Vektoren ohne Insert: Vektor Selektionsmarker Referenz pcDNA3.1 (+) AmpR, G418 Invitrogen, Karlsruhe

pcDNA3.1 (-)/ myc-His A AmpR, G418 Invitrogen, Karlsruhe

pCI neo AmpR, G418 Promega, Mannheim

N anR, G418 Clontech, Saint-Germain-en-Laye, France

mRFP-C2 AmpR, G418 Krieghoff et al., 2006

AmpR Brummelkamp

c ann

nnheim

RSV-βGal AmpR Stratford-Perricaudet et al., 1992

pEGFP- 1 K

pSUPER et al., 2002

pGL3-Basi AmpR Promega, MR Promega, Ma

heim

pGL2-Control Amp

Tab. 6.3: Vektoren ohne Insert

ektoren mit Insert: V Name Vektor Insert Referenz hIntβ3 pcDN humane Integr

Dr. J h (Burn-

A3.1 (+) in β3

cDNAeffrey Smit

ham Institute, La Jolla) EVA1-myc pcDNA3.1

yc-H is 216 diese Arbeit

1 RFP mane EVA1 216

iese

Snail-myc pcDNA4/TO/yc-H

humane Snail . Geert Berx ni

nagΔ-flag cDN ail lknirn

FP pcDN humane SLUGinal

reni

I neo Gallus gallus δEF1 cDNA

st 7;

CI neo gallus /SIP1 cD

st 7;

pGL3-Basic gDNA EVA1 is +124

A1-P-5 GL3 gDNA EVA1 -529 bis +124

se

EVA1-P-3 GL3 EVA1 is +124

se

(-)/ is A

humane EVA1 cDNA AS 1 bm

srEVA m -C2 hu cDNA dAS 27 bis

cDNA Dr

Arbeit

m is (U versität Gent) Snail-S p A-flag humane Sn cDNA Vo er Stemmer

(UNü

versität Erlangen-berg)

Slug-G A3 cDNA Kamit c-term em Flag (U

n Hajra versität Michigan)

ZEB1 pCZEB1/GallusZEB2

PoPostigo

igo und Dean, 199et al., 1997

ZEB2 pNA Postigo

diese Arbeit

Po igo und Dean, 199et al., 1997

pGL3-EVA1-P-823 -823 b

pGL3-EV 29 p -Basic die Arbeit

pGL3- 59 p -Basic gDNA-359 b

die Arbeit

71

6. MATERIAL UND METHODEN pGL3-EVA1-P-

3 EVA1

24 mit Mutse

GL3(Uni

-Intβ3-3/4 pSUPER mRNA Integrin β3 423 - 441

diese Arbeit

R-Intβ3-5 SUP mRNA Integri921 - 939

se

R-EVA1- P mRNA EVA1 se

-Intβ3 cDN ntβ684 - 992

diese

1-EVA

cDN ER-EVA4 - 992

se

359mut2hE-Cad Prom

pGL -Basic gDNA -359 bis die+1

-Basic ation

Dr. Geert Berx

Arbeit

pversität Gent)

pSUPER

pSUPE /6 p ER n β3 die Arbeit

pSUPE 9/10 pSU ER die507 - 525

Arbeit

pcDNA-H1 -5/6 p A3.1 (+) pSUPER-I 3-5/6 Arbeit

pcDNA-H 1- p9/10

A3.1 (+) pSUP 1-9/10 die68

Arbeit

T ektoren m

6 e Alle für diese Arbeit benötigten Oligonukleotide wurden be on ( e) synthe und s ung noti Oligonukleotide für R -PCRs zur Untersuchung der Expression verschiedener Gene:

ab. 6.4: V it Insert

.1.3. Oligonukleotid

von MWG (E rsberg) bzw. OperHuntsvill tisiert ind in 5’-3’-Richt ert.

T

Gen Name Sequenz Ta Zyklen

Branched chain BCAT_for CATTCTGGAaminotrans

CCTGGCACATC 58°C 30ferase 1 BCAT_rev TCAGGATAGCACAATTGTCCAG

β2 Microglobulin B2-Micro_for GCTCCGTGGCCTTAGCTGTGC -Micro

60°C 25 B2 _rev GATAGAAAG GCACCAGTCCTT TG

Claudin 7 Claudin7_for GCAGAGCAC ACla

GGGGATGATG G 62°C 25 udin7_rev CTGGGGCAA GGGAGATCCCA

E-Cadherin E-Cad-2202F CAGGATTGCE-C

AAATTCCTGCC 60°C 30 ad-2640R TTCAGGGAG C

ED

CTCAGACTAG

EDIL3 IL3_for GCTAACTCT CED

TTCACACCCCC 58°C 30 IL3_rev CAGTCCAGT T

E

GTTCTCCATCA TG

piregulin Ereg_for CAGACAGAAGACAATCCACGTG 58°C 30Ere g_rev GAGCTATGA GCCCTGGGAATT

Epithelial v-like EVA1_for GGTGCTGGA GGGCTGTTAATG G 61°C 25antigen EVA1_rev GTGCACGACGCTGAGCCG

Glyzerinald.-3-Phosphat- GAPDH_for CCTGCTTCADeh

CCACCTTCTTG 58°C 25ydrogenase GAPDH_rev CTTCACCACCATGGAGAAGG

Integrin αv Alpha-v_for ATGAAACAG CAl

GAGCGAGAGC 62°C 25 pha-v_rev CGACAGCCACAGAATAACCC

72


Integrin β3 Beta-3_for CGTGACGAGATTGAGTCAGT 58°C 30Beta-3 _rev CCCCGGTACGTGATATTGGT

Interleukin 8 IL-8_for CTCTCTTGGCAGCCTTCCTG 58°C 25IL-8 _rev CAACCCTACAACAGACCCAC

Jagged 2 Jagged2_for CTCCC 58°C 30J

TGCCAGCCACAAG agged2_rev CCGTA ACAACCGTCTCCACC

Serine protease Spint1_for CAGCA 60°C 30unitz t

ACGGAGCTACCTTCCinhibitor, K ype 1 Spint1_rev CAAGT CTATGCCTGCCCAGG

Slug Slug_for GCGCTS

CCTTCCTGGTCAAGA 58°C 30 lug_rev GAGCC ACTGTGGTCCTTGGA

Snail Snail-20F TCAGG 55°C 25/30Snail-488

AAGCCCTCCGACC R TATTC CTTGTTGCAGTATTTGC

Sprouty homolog 2 Spry2_for CCGCG 60°C 30 S

ATCACGGAGTTCAGpry2_rev CCTAG GAGGCTGGCGGTG

ZEB1 ZEB1_for CAAACCCATAGTGGTTGCTT 55°C 30ZEB1 _rev GAATGGCCACCTTGTTGTAT

ZEB2 ZEB2_for AGTCCATGCGAACTGCCATCTGAT 60°C 30ZEB2 _rev CTGGACCATCTACAGAGGCTTGTA

T Oligonukleotide rolle der ktion und zur Un der Expression v Gene. Ta = A d O ide zur Kl V

ab. 6.5: zu Kont RT-Rea tersuchung erschiedener nnealingtemperatur er Oligonukleotide.

ligonukleot onierung von E A1:

Name Sequenz

EVA1_EcoRI_atg_for CGGAATTC TAC

HI_rev C AA

ATGTATGGCAAGAGCTC

EVA1_Bam GCGGATC GTCTGTGTCTTCTA TAAAC Tab. 6.6: Oligonukleotid lonierung von EVA1. Hervorgeh efügten R n. Oligonukleotide zur Klonierung der EVA1-Promotorkonstrukte

e zur K oben sind die eingestriktionsschnittstelle

:

Name Sequenz

EVA1g+124R AGCT AGACCG

-823F A CCA

EVA1g-592F CCGCTCGA TGA

GA CCCTGG

EVA1_mut_rev GAGTTGAG TTGCC

CCCA TGGCCCCAG

G GCC

GACG

EVA1g CCGCTCG CCTTGAGA

GGGCAGGGTGAA

TGTCTG

GCAGGG

EVA1g-359F CCGCTC GGAATGTGG GGTG

TTCCTTACCTT de ng torkonstru ben sind die eingefügten Restriktionsschnittstellen.

ab. 6.7: Oligonukleoti zur Klonieru der EVA1-Promo kte. Hervorgeho

73


O zur Kl RN A n β3:

ligonukleotide onierung der Ai-Konstrukte für EV 1 und Integri

Name Sequenz

RNAi-EVA1-Oligo9 GATCCCCAATTGTAGTGGTCCTC GAGACC TTG

RNAi-EVA1-Oligo10 TTTCC ATTGTAGTGGTCCTCTTCTCTCTAAG ATT

RNAi-EVA1-Oligo9-scr GATCCCCGTTTTTCCAGACGCTTGGT ACCGTC TTTTTG

RNAi-EVA1-Oligo10-sc C TTTTTCCAG TCTCTAAC

RNAi-Int TG AGC TG

AGCTTTTCC TACTTGATGGACCTGTCTTCTCTTGAAAGACAGGTCCATCAAGTAGGGG

RNAi-Intβ3-Oligo5 GATCCCCCTCTGCCTCCACTACCATGTTCAAGAGACAAGAGTTTTTGGAAA

β3-Oligo6 AGCTTTTCCAAAAACTCTGCCTCCACTACCATGTCTCT

CCTCGTCTTCAAGAGACTATACGAGGGTGGAGCAGTTTTTGGAAA

TGAACTATACGAGGGTGGAGCAGGGG

TTCTTCAAGAGAAGAG ACTACAATTTTT GAAA AGCTTGAAG

AAAAAAAGGACCACTACA GGG

TTCAAGAGAGAAA CAAG TGGAAAAAC

r AGCTTTTCTGAAACCA

AAAAAG ACGCTTGGTGGG AGCGTCTGGAAA

β3-Oligo3

GATCCCCCACAGGTC

TACTTGATGGACCATCAAGTAGTTTT

TCTTTCAAGAGAGAAA

AAAAACRNAi-Intβ3-Oligo4

TGGTAGTGGAGGCRNAi-Int

TGAACATGGTAGTGGAGGCAGAGGGG RNAi-Intβ3-Oligo5-scr GATCCCCGATATGCTCCCA

RNAi-Intβ3-Oligo6-scr AGCTTTTCCAAAAAGATATGCTCCCACCTCGTCTCTCT

Tab. 6.nd die s

8: Oligonukleotide zur K g der shRNA-Plasmide für EVA1 und Integrin β rv si pezifischen 19 nt langen n.

otiden 1, um siGENOME S ents vo (P mbH, Bonn). Dies

vier spe o nd NA. Das Kontroll-siOligonukleotid gegen GFP (siGFP) war von Eurogentec Deutschland GmbH

hatte die Sequen C

ide zum Sequ

lonierun Sequenze

3. He orgehoben

Bei den siOligonukle gegen EVA ZEB2 und Snail handelte es sichMARTpool® Reag

ische ausn Dharmacon erbio Science Deutschland G

sind Gem zifischen siOlig nukleotiden gegen die entspreche e Rm

(Köln) und z 5’-AAGCTA CTGTTCCATGGCCA-3’. Oligonukleot enzieren: Name Sequenz Ta

T7 GA 43°C

CCC C

GH_rev GCA 52°C

GG C

54°C

GT

_rev2 GG C

GTAATAC CTCACTATAGGGC

T3 AATTAA TCACTAAAGGG 43°

B TAGAAG CAGTCGAGG

CMV_for CGCAAAT GCGGTAGGCGTG 60°

RV3 CTAGCAAAATAGGCTGTCC

GL2 CTTCCATG GGCTTTACC 54°C

pEGFP-N1 CAGGTTCA GGGAGGTGTG 60°Tab. 6.9: Oligonukleotide zur S a leotidequenzierung. T = Annealingtemperatur der Oligonuk e.

74


6.1.4. Medien

cin , Cölb

Endothelial Cell Growth Medium oCell, Heidelberg)

n wurden die f tib tzt. Am hierf iltrie dem la

LB-Medium (Luria Broth) 0,5% Bacto® Hefeextrakt

® 1%

Bacto Pepton 1% NaCl

DMEM low Glucose +10% FCS +1% Penicillin/Streptomy (PAA Laboratories GmbH e)

2 (Prom Zur Selektio olgenden An iotika-Konzentrationen eingese pizillin undKanamyzin wurden ür steril f rt und den Medien nach Autok vierenhinzugefügt. Organismus Antibiotikum Konzentration Escherichia coli µg/ml Ampizillin 50

Escherichia coli yzin 25

EJ-28 G418 1 mg/ml

0,8 mg/ml

0,8 mg/ml

Kanam µg/ml

786.0 G418 1 mg/ml

MDA-MB-231 G418

MS751 G418Tab. 6.10: Zu den Medien für d zugegebene Antibiotikakonzentrationen

crylamid-Stammlösung 30% Acrylamid

Alkalische Lyse Puffer 1 50 mM Tris HCl pH 8,0 10 A Puffer 2 1% Alkalische Lyse Puffer 3 t pH 5,5

1x PBS 5% Magermilchpulver 0,1% Tween-20

ie Selektion

6.1.5. Lösungen A 0,8% Bisacrylamid

mM EDTA 100 µg/ml RNAse A

lkalische Lyse 200 mM NaOH SDS

3,0 M Kalium-Aceta

lockierungspuffer B

75


Bradford-Färbelösung (5x) 23,5% Ethanol 42,5% Phosphorsäure

0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250 C 50 E s H

1x HEPES (10x)

L

10

56 L1-Puffer

5 mM EDTA 1,0 % Triton-X 100

0,25% Bromphenolblau 0,25% Xylencyanol

Luziferinlösung 0,05 mM Luziferin in Messpuffer Lyse-Puffer (Luziferaseassa pH 8,0

8,0 n

0

M uffer (Luziferaseassa O4 pH 7,8

M-Puffer 50 mM CaCl2 mM MgCl

10 % Glyzerin

thidiumbromid-Stammlö ung 10 mg/ml gelöst in H2O

A-Puffer 0,1% Albumin HEPES

200 mM Hepes 1,25 M NaCl

0,45 M Glucose-Monohydrat 50 mM KCl

acZ-Puffer 0,1 M NaPO4 pH 7,5 mM KCl

1 mM MgSO4 mM β-Mercaptoethanol

20 mM Tris/HCl pH 7,4 (Lyse-Puffer für Säugerzellen) 150 mM NaCl 1 mM DTT 1 mM PMSF

Ladepuffer (10x) 100 mM EDTA pH 8 60% Glyzerin

y) 25 µM Tris/HCl 2 mM EDTA pH 5,0 % Glyzeri 1,0 % Triton-X 10 20 µM DTT

essp y) 100 mM HKP 15 mM MgSO4

5 mM ATP

76


Mowiol 4,9 ml 87% Glyzerin 2,4 g Mowiol 6 ml H20 8,5

ONPG

Cl

1,5 mM KH2PO4

BS-T (1x) 1x PBS

2% (w/v) Ponceau S in 1% Essigsäure

S 4% Acrylamid 4x Sammelgelpuffer 0,06% APS 0,125% Temed Sa 0,5 M Tris/HCl pH 6,8 0,4% SDS

0,1% SDS 192 mM Glyzin

DS-Probenpuffer (4x) 250 mM Tris/HCl pH 6,8

8% SDS

ubstratlösung (Adhäsionsassay) osphat 0,2% Triton-X 100

AE-Puffer (50x) 2 M Tris/Acetat

12 ml 0,2 M Tris/HCl, pH

-Lösung 4 mg ONPG/ml in LacZ-Puffer PBS 137 mM Na

3 mM KCl 6,5 mM Na2HPO4

P 0,5% Tween-20 Ponceaurot

ammelgel

mmelgelpuffer (4x)

SDS-Laufpuffer 25 mM Tris S 20% Glyzerin 20% β-Mercaptoethanol 0,4% Bromphenolblau S 10 mM Nitrophenylph 50 mM NaAcetat T 50 mM EDTA TE-Puffer 10 mM Tris/HCl pH 7,5

1 mM EDTA

77


Trenngel 6 – 8% Acrylamid 0,06%

0,16% Temed

150 mM Glyzin

0,02%

6.1.6. eitere Chemikalien und Enzy Absolu

PAA, Linz,

Agaros

Ampiz

io-Ma

in Fraktion V)

H, arlsruhe

D-Luziferin, Firefly, freie Säure P.J.K. GmbH, Kleinblittersdorf

i-Di Formamidpuffer Applied Biosystems, Foster City, CA

Klenow Enzym

Kollagen G (2 mg/ml) Kälberhaut Typ I GmbH, Heidelberg

Kollagen R (4 mg/ml) Rattenschwanz Typ I , Berlin

he

Mowiol 4-88 Diego, CA

für Restriktionsverdaus albach

4x Trenngelpuffer APS

Trenngelpuffer (4x) 1,5 M Tris/HCl pH 8,8 0,4% SDS Western-Transfer-Puffer 20 mM Tris/HCl pH 7,0 10% (v/v) Methanol

SDS

W me

te SYBR Green Fluorescein Abgene, Hamburg

Accutase Österreich

e NEEO ultra ROTI®GAROSE Roth, Karlsruhe

illin Roche, Mannheim

B germilchpulver Töpfer GmbH, Dietmannsried

BSA (Album Roth, Karlsruhe

Carboxyfluoreszeindiazetat- Invitrogen Gmb KSuccinimidylester (CFDA/SE)

Cell Proliferation Kit 1 (MTT) Roche, Mannheim

Desoxynukleotide Fermentas, St. Leon-Roth

Escort IV Transfektions Reagenz Sigma-Aldrich, Deisenhofen TM

FCS Biochrom AG, Berlin Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn

G418 PAA Laboratories GmbH, Cölbe TMH

Kanamyzin Roche, Mannheim

BioLabs, Schwalbach

Serva Electrophoresis

Biochrom AG

Lipofectin® Reagenz Invitrogen GmbH, Karlsru

Calbiochem, San

NEB-Puffersystem BioLabs, Schw

78


Phalloidin-T Sigma-Aldrich, DeisenRITC markiert hofen

Phosphatase, alkalische albach

PhusionTM High-Fidelity DNA Polymerase

MFS Proteinaseinhibitor Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Random Hexamer Primer bH, Karlsruhe

Restriktionsenzyme BioLabs, ch

everse Transkriptase Invitrogen GmbH, Karlsruhe M II RNase H

itor, RNase OUT Invitrogen rlsruhe

Roti-Phenol Roth, ®

tions Reagenz gen

rizol peqGOLD TrifastTM Peqlab, Erlangen

stern Blot Perkin Elm

BioLabs, Schw

Finnzymes, Espoo, Finnland

P

Ponceau S Roth, Karlsruhe

Proteinstandard SDS 6H Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Invitrogen Gm

Schwalba

RSuperScriptT

RNase A Qiagen, Hilden

RNase Inhib GmbH, Ka

Karlsruhe

Sequenzier-Mix Big Dye Terminator Applied Biosystems, Foster City, CA v1.1 Sequencing Standard Kit

T4-DNA-Ligase BioLabs, Schwalbach

Taq-DNA-Polymerase Invitrogen GmbH, Karlsruhe

TransIT T-KO Transfek MoBiTec GmbH, Göttin

Triton X-100 Sigma-Aldrich, Deisenhofen

T

Trypsin 0,25%/ EDTA 0,05% Biochrom AG, Berlin

Tween®-20 Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Western Lightning® We er, Wellesley, MA Chemiluminescence Reagent Plus

Nicht aufgeführte Chemikalien stammten von Roth, Karlsruhe.

6.1.7. Primäre und sekundäre Antikörper Antikörper Spezifität Referenz

In in tegrin αv Monoklonaler Ratte Anti-Integr αv Antikörper, IgG2a Isotyp, Klon 69.6.5

Immunotech, Marseille, Frankreich

Integrin β3 Monoklonaler Maus Anti-Integrin β3 Antikörper, IgG1 Isotyp, Klon MAB2023Z

Chemicon Europe, Hofheim

tegrin β3 Polyklonaler Ziege Anti-Integrin β3 N-20 Santa Cruz biotechnology, anta Cruz, CA

Ininc, S

Integrin αvβ3 Monoklonaler Maus Anti-Integrin αvβ3 Antikörper Chemicon Europe, Hofheim LM609, IgG1 Isotyp, Klon MAB1976Z

79

6. MATERIAL UND METHODEN L1 -11A (Subklon Anti-L1 (CD171) Antikörper L1 Peter Altevogt (DKFZ,

-Myc Monoklonaler Anti-c-Myc Antikörper 9E10 BD Bioscience, Pharmingen Signaling, Danvers, MA

Klon HECD-1 ler Ratte Anti-

UJ127.11) Heidelberg) DsRed Monoklonaler Maus Anti-DsRed Antikörper, IgG1 BD Bioscience, Pharmingen

Isotyp cc-Myc Monoklonaler Anti-c-Myc Antikörper 9B11 CellE-Cadherin Monoklonaler Anti-human E-Cadherin Antikörper MoBiTec GmbH, Göttingen

α-Tubulin Monoklona α-Tu c, Düsseldorf

iege IgG HRP-konjugierter Esel anti-Ziege IgG Antikörper Dianova, Hamburg Dianova, Hamburg

Antikörper Dianova, Hamburg ierter Zie Dianova, Hamburg

Indocarbocyanin-konjugierter H nova, Hamburg

bulin Antikörper, SeroteIgG2a Isotyp, MCAP77

β-Aktin Monoklonaler Anti-β-Aktin Antikörper, Klon AC- Sigma-Aldrich, Deisenhofen 15

ZMaus IgG HRP-konjugierter Esel anti-Maus IgG Antikörper Ratte IgG HRP-konjugierter Esel anti-Ratte IgGMaus IgG Phycoerythrin- konjug ge anti-Maus IgG

Antikörper Maus IgG ase anti-Maus IgG DiaTab. 6.11: Primäre und sekundäre Antikörpe

r.

ollen

SystemAB005 (R&D S iesbaden)

C extra reiburg

eaktionsgefäße ultradünn TM HiPure Plasmid Maxiprep Kit

mid Maxi Kit

l Ltd., Maidstone,

en, -Flaschen und iz

Isotypkontr Maus IgG Isotypkontrolle MAB002 (R&D s GmbH, Wiesbaden) 1

Ratten IgG1 Isotypkontrolle M ystems GmbH, W

6.1.8. Verbrauchsmaterialien CryoTubeTM vials Nunc, Wiesbaden

Nitrocellulose-Membran Hybond- Amersham Pharmacia biotech, F

NucleoSpin® Extract II Macherey-Nagel, Düren

PCR-R BioLabs, Schwalbach

PureLink Invitrogen GmbH, Karlsruhe

Qiagen Plas Qiagen, Hilden

QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden

QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden

RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden

Röntgenfilm KODAK X-OMAT AR Integra Biosciences, Fernwald

Whatmanf Whatman Internationailter England

Zellkulturschal TPP AG, Trasadingen, Schwe6-, 12-, 24- und 96-Well Platten

80


6.1.9. Geräte Neben den in molekularbiologischen Laboratorien üblichen Geräten wureingesetzt:

den folgende

ytometer FACScan Heidelberg

190 aning

oplan 2

ter DLReady CentroLB 960 logies GmbH & Co. KG, Bad

000 Photometer

Durchflussz BD Biosciences,

Elisa-Reader SpectraMAX Molecular Devices GmbH, Ism

Fluoreszenzmikroskop Axi Zeiss, Göttingen

Fotoaufsatz für Mikroskop und Stereo- Visitron Systems, Puchheim mikroskop RT monochrome Spot

iCyclerTM Biorad, München

Luminome Berthold Techno Wildbad

Luminoimager LAS-3000 FujiFilm raytest Isotopenmessgeräte GmbH, Straubenhardt

Nuaire Biological Safety Cabinets Integra Bioscience GmbH, Fernwald

PCR-Maschine Thermocycler T3 Biometra, Göttingen

SDS-PAGE Apparatur Mini-Protean II Biorad, München TMSequencer ABI Prism 377 Perkin Elmer, Überlingen

TMSmartSpec 3 Biorad, München

Stereomikroskop Axiovert 25 Zeiss, Göttingen

Steri-Cult 200 Incubator Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach

Western-Blotting Apparatur Biorad, München

81


6.2. Metho

u

Die Kultivieru bei 37°C. Bei Anzucht von Flüssigkulturen wurden die fäße

gewährleisten. Bei Selektion auf die verwendeten Plasmide wurden den Medien die de t.

Ku

inie 2 tigkeit

is 1:10 verdünnt wieder ausgesät. Spätestens alle fünf Tage erfolgte ein Mediumwechsel. Bei stabil transfizierter Zelllinien wurde dem Medium der entsprechende

elektionsmarker mit der in Tab. 6.10 angegebenen Konzentration zugesetzt.

oden wie Restriktionsverdau von Plasmid-DNA,

uftrennung von DNA-Fragmenten mittels Agarose-Gelelektrophorese, Ligation von DNA-Dephosphorylierung m osphatase wurden nach

ng g - A amb enden

nnt, die im Handbuch nicht oder anders beschrieben sind.

ellen, wurde di terien-Flüssigkultur in einem

fbewahrt. en in einem Kryoröhrchen ersetzt und auf -80°C gekühlt,

in flüssigem Stickstoff aufbewahrt wurden.

den

6.2.1. Anz cht der verwendeten Organismen

6.2.1.1. Anzucht von Bakterien

ng von E. coli erfolgte Kulturge stets geschüttelt, um eine optimale Belüftung und Durchmischung zu

entsprechen n Antibiotika mit der in Tab. 6.10 angegebenen Konzentrationen zugesetz

6.2.1.2. ltivierung von Zelllinien und HUVEC Tumorzelll n, 293T und HUVEC wurden bei 37°C, 10% CO

it Trypsin/EDTA von den Schalen abgelö und 90% Luftfeuch

st und 1:3 kultiviert. Subkonfluente Zellen wurden mbder Kultivierung S

6.2.2. Allgemeine molekularbiologische Methoden

Molekularbiologische StandardmethAFragmenten und it alkalischer PhHerstellerangaben bzw. gemäß den Anleitu en aus dem Handbuch „Molecular CloninLaboratory Manual“ von Maniatis et al. (S rook et al., 2001) durchgeführt. Im Folgsind nur Methoden gena

6.2.2.1. Herstellung von Dauerkulturen Um eine Dauerkultur herzust e jeweilige BakKryoröhrchen mit einer sterilen 80%igen Glyzerinlösung bis zu einer Endkonzentration von 15% vermischt und bei –80°C auTumorzellen wurd mit 8% DMSO vbevor sie bis zur weitern Verwendung

82


6.2.2.2 Isolierung von DNA aus Agarosegelen

ng von DNA aus Gelen erfolgte mit Hilfe des „QIAquick Gel Extraction Kit“ zw. mit dem vergleichbaren „NucleoSpin® Extract II Kit”. Dazu wurde die in Betracht

und gemäß der urde ein

ösung auf ein lität und

- bzw. RNA-Konzentration

ällung

R Purification Kit it” aufgereinigt.

min bei 13.00 rt, das Pellet mit 70% EtOH

10 min getrocknet un asser

.2.2.5. DNA-Sequenzanalyse Für die PCR wurde gereinigte DNA aus einer Minipräparation in folgendem Ansatz eingesetzt: ca. 500 ng Plasmid-DNA, 5 pmol Primer, 3 µl Sequenziermix, ad 10 µl H2O. Das Annealing erfolgte bei der in Tab. 6.9 angegebenen Temperatur. Anschließend wurde der Reaktionsansatz zur Abtrennung nicht eingebauter Fluoreszenz-didesoxynukleotide mit H2O auf 100 µl aufgefüllt und gefällt. Das DNA-Pellet wurde in 15 µl HPLC-Wasser resuspendiert und für die Sequenzierung 1:5 verdünnt bzw. 15 µl HiDi-Puffer unverdünnt eingesetzt. Die DNA-Sequenz wurde nach Auftrennung durch Kapillar-Elektrophorese mit dem Lesegerät „Sequencer ABI PrismTM 377“ (Perkin Elmer) unter Verwendung der mitgelieferten Programme (ABI PRISM 377 Collection and Sequencing Analysis 3.0) ermittelt.

. Die Isolierubkommende DNA-Bande unter UV-Licht aus dem Gel ausgeschnitten Anleitung des jeweiligen Herstellers aus der Gelmatrix isoliert. Anschließend wAliquot der erhaltenen DNA-L em Agarosegel aufgetrennt, um QuaQuantität der DNA zu überprüfen.

6.2.2.3. Bestimmung der DNA Die DNA- bzw. RNA-Lösung wurde 1:100 verdünnt und ihre Absorption zwischen 220 und320 nm bestimmt. Die Konzentration konnte mittels folgender Beziehungen berechnet werden: DNA: 1 OD260 entspricht 50µg DNA/ml RNA: 1 OD260 entspricht 40µg RNA/ml

6.2.2.4. DNA-Reinigung und F DNA wurde über QIAquick-Säulen der Firma Qiagen nach dem „PCProtocol“ bzw. mit dem vergleichbaren „NucleoSpin® Extract II KFällung der DNA erfolgte mit 1/10 Vol 3 M NaOAc pH 4,8-5,2 und 2,5 Vol 100% EtOH.Nach der Zugabe wurde für 20 0 rpm zentrifugiegewaschen, bei 56°C für d in einem möglichst kleinen Volumen Wresuspendiert.

6

83


6.2.2.6. Plasmidisolierung aus Bakterien

iert und das Pellet in 100 µl Puffer 1

suspendiert. Anschließend wurden 100 µl des Puffers 2 zugegeben, invertiert und nach 5 min 100 µl Puffer 3 dazu pipettiert. Es folgten 10 min Inkubation auf Eis. Bakterielle

le DNA wurden bei 13.000 rpm für 10 min bei 4°C bzentrifugiert und die Plasmid-DNA im Überstand durch Zugabe von 2,5 Volumenprozent

ach erstellerangaben gewonnen.

.2.2.7. Herstellung kompetenter Bakterien

5 min pelletiert nd in 45 ml kaltem CM-Puffer resuspendiert. Anschließend wurde erneut für 10 min

l CM-Puffer abe von 625 µl DMSO, wieder

min Inkubation und die Zugabe von 625 µl DMSO. Nach einer anschließenden Inkubation

00 µl kompetenter Zellen wurden auf Eis aufgetaut, zur Plasmidlösung pipettiert und 20 min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Zellen für 2 min bei 42°C geschockt und auf Eis

l LB-Medium versetzt. Zur Ausbildung der ntibiotika-Resistenz erfolgte eine einstündige Inkubation bei 37°C. Anschließend wurde der

Beim Arbeiten mit RNA wurde darauf geachtet möglichst RNAse-frei zu arbeiten. Deshalb wurden alle Lösungen (außer Tris/HCl) vor dem Autoklavieren mit DEPC in einer Endkonzentration von 0,1% versetzt, mehrmals kräftig geschüttelt und üN inkubiert. Alle Arbeiten wurden grundsätzlich auf Eis durchgeführt.

Zur Plasmidisolierung aus E. coli wurde die alkalische Lyse angewendet. Hierfür wurden 1,5 ml einer Übernachtkultur 2 min bei 6000 rpm abzentrifugre

Proteine, Zellreste und chromosomaa100% EtOH gefällt. Die DNA-Pellets wurden mit 70% EtOH gewaschen, getrocknet und in H2O aufgenommen. Größere Mengen Plasmid-DNA wurden mit Hilfe von Qiagen bzw. Invitrogen Kits nH

6 Zur Herstellung kompetenter Bakterien wurde eine Übernachtkultur von E. coli XL1-blue in 500 ml LB-Medium angeimpft und bei 37°C bis zu einer OD von 0,4 – 0,5 geschüttelt. Alle folgenden Arbeitsschritte wurden entweder auf Eis im Kühlraum oder in einer 4°C Zentrifuge durchgeführt. Nach 10 min Abkühlen wurden die Bakterien bei 5000 rpm füruinkubiert, 5 min bei 5000 rpm abzentrifugiert und das Pellet in 17,5 maufgenommen. Es folgte eine 10-minütige Inkubation, die Zug5von 5 min wurden die kompetenten Bakterien aliquotiert und bis zu Verwendung bei -80°C gelagert.

6.2.2.8. Transformation von Bakterien 1

abgeschreckt. Der Ansatz wurde mit 0,8 mAAnsatz 20 s abzentrifugiert, der Überstand abgezogen, die Zellen in etwa 100 µl Medium resuspendiert, auf Selektivmedium ausplattiert und üN bei 37°C inkubiert.

6.2.2.9. RNA-Isolierung aus Säugerzellen

84


Die Zellen wurden mit Trypsin/EDTA von der Zellkulturschale abgelöst und 5 min bei 2.000 das ellet in 500 µl (1 ml) Trizol®

ufgenommen. Nach 5 min Inkubation bei RT wurden 100 µl (200 µl) Chloroform

in 20 µl H2ODEPC resuspendiert. ie Konzentration der RNA wurde durch Messung im Photometer bei 260nm bestimmt.

.2.2.10. Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR)

t, bei der ein cDNA/RNA-Hybrid entsteht, das anschließend als Template in einer ormal PCR Reakt 1 µg RNA in 9 µl H2ODEPC

Primer (1µg/µl) für 10 min ei 70°C inkubiert und auf Eis abgeschreckt. Dann wurden 4 µl 5x Reaktionspuffer, 2 µl 0,1

M DTT, 1 µl dNTPs (je 25 mM), 1 µl RNase-OUT und 1 µl SuperScriptTM II Reverse pipettiert. Es folgte eine 60-minütige Inkubation

ei 42°C und eine 10-minütige Inaktivierung des Enzyms bei 70°C. Der Ansatz wurde mit 30

eines Haushaltsgens wie z.B. GAPDH oder β2-Mikroglobulin angesetzt, das in er Regel in allen Zellen exprimiert wird und die cDNA so auf jeden Fall in der PCR

amplifiziert werden kann. Die PCR-Reaktionen wurden stets mit 10 µl-Ansätzen üh ammensetzten:

einem Agarosegel ausgewertet.

rpm abzentrifugiert, der Überstand abgezogen und Pazugegeben, kräftig geschüttelt und bei 4°C zentrifugiert (10 min, 13.000 rpm). Der wässrige Überstand wurde in ein neues Gefäß überführt, 100 µl (200 µl) Isopropanol zugefügt, mehrmals invertiert und die RNA für 10 min bei RT gefällt. Anschließend wurde erneut bei 4°C zentrifugiert (10 min, 13.000 rpm). Das RNA-Pellet wurde einmal mit 70% EtOH gewaschen, nochmals für 3 min bei 4°C zentrifugiert, getrocknet und zuletztD

6 Für die Herstellung von cDNA aus mRNA wurde die reverse Transkriptase-Reaktion verwenden en - ion eingesetzt werden kann. Hierzu wurdeaufgenommen und nach der Zugabe von 2 µl Random Hexamer b

Transcriptase (reverse Transkriptase) dazubµl H2ODEPC aufgefüllt. Anschließend wurde je 1 µl der gewonnenen cDNA als Template für eine PCR mit spezifischen Oligonukleotiden (Tab. 6.5) eingesetzt. Als Kontrolle für einen erfolgreichen Verlauf der reversen Transkriptase-Reaktion wurde zusätzlich ein Ansatz mit Primern für die Amplifikation d

durchgef rt, die sich wie folgt zus

1,0 µl cDNA aus RT-Reaktionsansatz 1,0 µl 10x Taq-Polymerase-Inkubationspuffer 0,3 µl MgCl2 (50 mM) 0,3 µl dNTPs (10 mM) 0,4 µl 5’-Primer (10 pmol) 0,4 µl 3’-Primer (10 pmol) 1U Taq-DNA-Polymerase ad 10µl H2O

Das Ergebnis wurde auf

85


6.2.2.11. Quantitative Echtzeit-PCR (real t ime RT-PCR)

6.2.3.1. SDS-PAGE und Western Blot-Analyse

um Nachweis von Proteinen wurden subkonfluente Zellen mit 100 µl bis 1 ml L1-Puffer für

Antikörper (1:2000 verdünnt mit Blockierungspuffer) für 1h bei schüttelnder kubation zugegeben. Die Nitrocellulose wurde erneut vier mal 5 min in PBS-T gewaschen,

und für 1 min in einer 1:1 Mischung der Lösungen A und B des Western Lightning® Western m iert. Die Signale wurden über einen Röntgenfilm

der mit dem Luminoimager LAS-3000 von Fuji mit Hilfe des Programms Image Reader

ür Luziferaseassays wurden je 7,5 x 104 293T, HCT116 und SW480 Zellen bzw. 3,75 x 104 MCF-7 Zellen in 12-Well Platten ausgesät und am folgenden Tag transient mit einem

ktosidase Expressionsvektor (RSV-βGal) und it einem Effektorplasmid transfiziert. DLD1TR21-hSnail Zellen wurden zu 7,5 x 104 je

llen mit je 75 µl Lyse-Puffer lysiert und 10 min bei 4°C zentrifugiert.

Um Expressionsunterschiede exakter bestimmen zu können, wurde die quantitative Echtzeit-PCR verwendet. Hierfür wurden in Doppelansätzen je 1µl der in 6.2.2.10 gewonnenen cDNA mit 12,5 µl „Absolute SYBR Green Fluorescein“ und spezifischen Oligonukleotiden in einer Endkonzentration von 0,25 pmol auf ein Gesamtvolumen von 25 µl aufgefüllt und mit Hilfe eines Standardprogramms und einer einheitlichen Annealingtemperatur von 58°C amplifiziert. Die erhaltenen Daten wurden mit Hilfe der iCyclerTM iQ Optical System Software Version 3.0a von Biorad ausgewertet.

6.2.3. Proteinchemische Methoden

Z10 min auf Eis lysiert und 15 min bei 13.000 rpm und 4°C zentrifugiert. Der Proteingehalt wurde mit dem Biorad-Reagenz bestimmt. Gleiche Mengen an Protein wurden mit SDS-Probenpuffer versetzt, durch SDS-PAGE über 1 mm dicke 6 - 8%ige SDS-Polyacrylamidgele aufgetrennt und bei 330 mA 60 min auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Die Nitrocellulose wurde dann für 5 min mit Ponceaurot gefärbt. Nach Abspülen mit H2O wurde der Standard und die Spuren markiert und die Membran zurechtgeschnitten. Anschließend wurde die Nitrocellulose 1 h in Blockierungspuffer geschwenkt. Die Inkubation mit dem primären Antikörper erfolgte für 2 h bei RT bis bei üN bei 4°C. Dann wurden die Membranstücke vier mal 5 min in PBS-T gewaschen und der Peroxidase-gekoppelte sekundäreIn

Blot Che iluminescence Reagent Plus inkuboLAS-3000 Version 2.0 detektiert. Eine Quantifizierung erfolgte mit dem AIDA Image Analyzer v. 3.52 Programm.

6.2.3.2. Luziferaseassay zur Bestimmung der Promotoraktivität F

Luziferase-Reporter, einem konstitutiven β-GalamWell ausgesät und nur mit dem Luziferase-Reporter und RSV-βGal transfiziert. Für die Transfektion von siRNA wurden 3 µl siRNA (20 µM) pro Ansatz in einer 12-Well Platte transfiziert. Kontrollansätze wurden mit siGFP aufgefüllt, um den Gesamtgehalt konstant zu halten. 24 - 48 h nach der Transfektion wurden die Ze

86


Zur Bestimmung der Luziferaseaktivität im Luminometer wurden je 30 µl Lysat mit 50 µl Messpuffer versetzt. Für die Messung wurden dann automatisch jeweils 50 µl Luziferinlösung bei folgenden Einstellungen zugegeben: Injektion bei mittlerer Geschwindigkeit, Verzögerung 3 s, Messzeit 10 s. Um die erhaltenen Werte gegen die Transfektionseffizienz zu

t und mit 25 µl ONPG-Lösung versetzt.

6.2.4. Methoden zur immuncytologischen Lokalisierung

ixierte Zellen wurden gegebenenfalls für 5 min mit 0,5%igem Triton X-100 in PBS

mit den Zellen nach unten darauf gelegt. Die mikroskopische Betrachtung erfolgte nter entsprechendem Anregungslicht.

6.2.4.2. bung von Zellen in Suspension Subkon n mit PBS gewaschen, mit Accutase von der Zellkul nach 5 min Zentrifugation bei 1200 rpm in HA-Puffer resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen mit 1:50 verdünntem monoklonalen Antikörper LM609, Anti-Integrin β3 oder Anti-Integrin αv Antikörper für 30 min bei 4°C

efärbt, zweimal mit HA-Puffer gewaschen und mit 1:50 verdünntem Phycoerythrin-in bei 4°C inkubiert. Dann wurden

e Zellen abzentrifugiert, in einem kleinen Volumen HA-Puffer resuspendiert und auf Objektträger ausgestrichen. Nachdem 15 µl Mowiol auf die Zellen pipettiert worden waren, wurden Deckgläschen aufgelegt.

normalisieren wurden sie durch die β-Galaktosidaseaktivität dividiert. Um die β-Galaktosidaseaktivität zu bestimmen wurden 10-20 µl des Zelllysates in einer 96-Well Platte mit 150 µl 1x LacZ-Puffer gemischAnschließend wurde die Platte bei 37°C inkubiert, bis durch die Umsetzung des ONPG eine gelbe Färbung entstand und die Absorption bei 420 nm gemessen.

6.2.4.1. Immunfluoreszenzfärbung von fixierten Zellen Je nach Zelllinie wurden 1 - 2 x 105 Zellen auf Deckgläschen in 6-Well Platten ausgesät und diese üN bei 37°C, 10% CO2 und 90% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Zum Nachweis von endogenem Protein wurden die Zellen dann mit PBS gewaschen und für 15 min mit 3%igem PFA fixiert. Um die transiente Expression von Proteinen nachzuweisen, wurden die Zellen transfiziert (6.2.5.8) und erneut üN bei 37°C, 10% CO2 und 90% Luftfeuchtigkeit inkubiert, bevor sie ebenfalls fixiert wurden. Zwischen allen folgenden Schritten wurden die Zellen mit PBS gewaschen. Fpermeabilisiert. Zum Blockieren unspezifischer Bindungen wurden die Deckgläschen dann für 30 min mit DMEM/ 10% FCS inkubiert und anschließend 50 µl primärer Antikörper (1:25 bis 1:300 verdünnt mit DMEM/ 10% FCS) vorsichtig auf die Zellen pipettiert. Nach einer einstündigen Inkubation bei RT wurde 45 min mit 50 µl Cy2- bzw. Cy3 gekoppeltem sekundären Antikörper (1:200 verdünnt mit DMEM/ 10% FCS) inkubiert. Anschließend wurden 20 µl Höchst zum Färben der DNA auf die Deckgläschen gegeben. Nachdem 15 µl Mowiol auf einen Objektträger pipettiert worden waren, wurden die Deckgläschen

mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops u

Immunfluoreszenzfär

fluente Tumorzellen wurdeturschale gelöst, vereinzelt und

gmarkierten anti-Maus IgG aus der Ziege erneut für 30 mdi

87


6.2.5. Methoden zur Arbeit mit Säugerzellen

6.2.5.1. Zellzahlbestimmung Die Zellzahl wurde mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer unter dem Lichtmikroskop bestimmt. Bei Auszählung aller vier großen Felder ergab sich folgende Beziehung:

Zellen/ml = gezählte Zellen/ 4 x 104

Zur Gewinnung primärer humaner Nabelschnur-Endothelzellen wurden frische Nabelschnüre / EDTA 0,05% aufgefüllt und an beiden

nden mit sterilen Kanülen und Klemmen verschlossen. Dann wurde für 20 min bei 37°C im

ellen verwendet.

vor der Inkubation

6.2.5.2. Isolierung von HUVEC

mit PBS gewaschen, mit 5 bis 10 ml Trypsin 0,25%EWasserbad inkubiert und anschließend die HUVEC mit etwa 20 ml PBS in 10 ml FCS gespült. Die Zellen wurden für 5 min bei 1200 rpm abzentrifugiert, in 1 ml Endothelial Cell Basal Medium 2 aufgenommen und in eine Zellkulturflasche überführt. Subkonfluente HUVEC wurden maximal bis zur zweiten Passage verwendet.

6.2.5.3. Durchflusszytometrie Subkonfluente Tumorzellen wurden mit PBS gewaschen, mit Accutase von der Zellkulturschale gelöst, vereinzelt und nach 5 min Zentrifugation bei 1200 rpm in HA-Puffer resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen mit 1:50 verdünntem monoklonalen Antikörper LM609 für 30 min bei 4°C gefärbt, zweimal mit PBS gewaschen und mit 1:50 verdünntem Phycoerythrin-markierten anti-Maus IgG aus der Ziege erneut für 30 min bei 4°C inkubiert. Dann wurden die Zellen mit Hilfe des fluoreszenzaktivierten Zellsortierens (fluorescence-activated cell sorting) analysiert. Die Fluoreszenz wurde mit einem FACScan Durchflusszytometer gemessen. Zur Festlegung der Messgrenzen wurden mit Isotypkontrollen behandelte Z

6.2.5.4. Aggregationsversuch Die zu untersuchenden Zellen wurden trypsiniert, vereinzelt und auf 1 x 106 (EJ-28, MDA-MB-231) bzw. 7 x 105 Zellen (786.0) pro ml DMEM eingestellt. Die Bestimmung der Aggregation erfolgte in Dreifachansätzen. Jeweils 1 ml wurde in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß gegeben und die Zellen dann für 1 h bei 37°C inkubiert. Hierbei wurden die Ansätze alle 5 min 2 – 3-mal invertiert. Anschließend wurde mit Glutardialdehyd in ein Endkonzentration von 2 % fixiert und die Zahl der aggregierten Zellen mit Hilfe einer Neubauerzählkammer und folgender Formel bestimmt: aggregierte Zellen [%] = (1 – (Nn/Nv)) x 100 Nn = Zahl aggregierter Zellen nach der Inkubation Nv = Zahl aggregierter Zellen

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6.2.5.5. Proliferationsversuch Zur Erstellung von Wachstumskurven wurde der „Cell Proliferation Kit 1 (MTT)“ verwendet. Zu untersuchende Tumorzellen wurden mit Trypsin/EDTA von der Zellkulturschale abgelöst,

in jede Vertiefung 10 µl TT-Reagenz I zugegeben und die Platte erneut für 4 h bei 37°C inkubiert. In dieser Zeit

lösliche, von je 100 µl MTT-

eagenz II gelöst und die Absorption bei 470 nm gemessen. Für 786.0 wurde die Lösung hierfür in 96-Well Platten umpipettiert.

latten verwendet.

und Kollagen R in einer onzentration von 2,5 µg/ml in jede Vertiefung pipettiert und üN bei 4°C inkubiert. Nicht

sphat zu Nitrophenon umgesetzt, welches als gelber Niederschlag nachgewiesen werden kann. Nach einer erneuten Inkubation von 1 h bei 37°C wurde die Reaktion mit 50 µl 1M NaOH gestoppt und die Absorption bei 405 nm gemessen.

vereinzelt und je 3 x 500 Zellen (EJ-28, MDA-MB-231) in 100 µl DMEM/ 10% FCS pro Tag pro Vertiefung in 96-Well Platten bzw. 3 x 2000 Zellen (786.0) in 300 µl DMEM/ 10% FCS pro Tag pro Vertiefung in 24-Well Platten ausgesät und bis zum entsprechenden Zeitpunkt bei 37°C, 10% CO2 und 90% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Dann wurdeMsetzten lebende Zellen das enthaltene gelbe Tetrazoliumsalz MTT in wasserunpurpurne Formazankristalle um. Diese wurden dann durch ZugabeR

6.2.5.6. Adhäsionsversuche Adhäsion an Endothelzellen

Zur Bestimmung der Zelladhäsion wurden 2 × 105 HUVEC pro Vertiefung in 12-Well Platten ausgesät und üN bei 37°C, 10% CO2 und 90% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Zu untersuchende Tumorzellen wurden mit Trypsin/EDTA von der Zellkulturschale abgelöst, vereinzelt und mit CFDA/SE in einer Endkonzentration von 15 nM für 15 min bei RT gefärbt. Anschließend wurden die Zellen mit HA-Puffer gewaschen und je 5 × 104 Zellen je Vertiefung auf die HUVEC Einzellschicht ausgesät. Nach 1, 2, oder 3 h wurden nicht adhärente Zellen durch zweimaliges Waschen mit HA-Puffer entfernt und die Zellen für 15 min mit 3% PFA fixiert. Die Zahl der adhärenten Zellen wurde durch Zählen von zehn optischen Feldern bei 20-facher Vergrößerung in einem Fluoerszenzmikroskop bestimmt. Adhäsion an Plastik und Kollagen I (Saurer Phosphatase Assay)

Um die Fähigkeit von Zellen zu untersuchen, an Plastik bzw. Kollagen I zu adhärieren, wurden entweder unbeschichtete 96-Well-Platten oder mit Kollagen I beschichtete P

Hierfür wurden je 50 µl eines 1:1 Gemisches von Kollagen G Kgebundenes Kollagen wurde am nächsten Tag mit PBS weggewaschen und die Platte mit 50 µl 1% BSA in PBS 1 h bei 37°C inkubiert, um eventuell noch freigebliebene Stellen abzudecken. Zu untersuchende Zellen wurden trypsiniert, vereinzelt und auf eine Konzentration von 2,5 x 105 Zellen/ml in DMEM (ohne FCS) eingestellt. Die Bestimmung der Adhäsion erfolgte in Dreifachwerten für die jeweils 200 µl für 5 x 104 Zellen in jede Vertiefung ausgesät wurden. Es folgte eine Inkubation von 30 min (Plastik) bzw. 1 h (Kollagen) bei 37°C. Anschließend wurden nichtadhärente Zellen mit je 100 µl PBS weggewaschen und die Zellen mit je 100 µl Substartlösung lysiert. Bei der nun ablaufenden Reaktion wird Nitrophenylpho

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6.2.5.7. Invasions- und Transendothel-Migrationsversuch

Kollagen G und Kollagen R wurden in einem Verhältnis von 1:1 gemischt, 0,11 Vol y /ml) und anschließend 0,11 Vol 10 x DMEM zugefügt, und

ie Lösung mit 1 M NaOH neutralisiert. Je 1,2 ml wurden in die Vertiefungen von 6-Well

ell Basal edium 2 auf die Gele ausgesät und erneut üN bei 37°C, 10% CO2 und 90% Luftfeuchtigkeit

inkubiert bis sie e dem Kollagen gebildet hatten. nschließend wurden die zu untersuchenden Tumorzellen mit Trypsin/EDTA von der

Zellkulturschale abgelöst, vereinzelt und in Endothelial Cell Basal Medium 2 in einer ell auf die HUVEC Einzellschichten ausgesät. Für den

vasionsversuch wurden die Tumorzellen direkt auf die Kollagengele gegeben. Bei

tz wurden 30 optische Felder ezählt.

.2.5.8. Transfektion von Säugerzellen

tabile Transfektion

rden je nach Zellgröße 0,5 - 1 x 106 Zellen in eine 10 cm ellkulturschale ausgesät. Die Transfektion erfolgte mit EscortTM IV oder Lipofectin®

Natriumh drogencarbonat (22 mgdPlatten pipettiert und solange bei 37°C inkubiert, bis sie polymerisiert waren. Zur Untersuchung der Transmigration wurden 5 x 105 HUVEC in Endothelial CM

ine konfluente Einzellschicht auf A

Konzentration von 1 x 105 Zellen je WInBlockierungsexperimenten wurde entweder 30 min bei 4°C mit den entsprechenden Antikörpern vorinkubiert, bzw. die Antikörper in den angegebenen Konzentrationen dazugegeben. Nach einer Inkubation von 48 h bei 37°C, 10% CO2 und 90% Luftfeuchtigkeit wurden die Versuchsansätze gewaschen und für 15 min mit 3% Paraformaldehyd fixiert. Die Zahl der eingewanderten Zellen wurde mit Hilfe eines Stereomikroskopes bei 20-facher Vergrößerung mittels Fokussierung durch das Kollagen bestimmt. Pro Ansag

6 Transiente Transfektion Für die transiente Transfektion wurden die verschiedenen Zelllinien zu je 1 - 2 x 105 Zellen je Vertiefung einer 6-Well Platte bzw. 3,75 – 7,5 x 104 Zellen in 12-Well Platten ausgesät. Bei einer Konfluenz von 50-70% wurden zirkulärer DNA-Konstrukte mit EscortTM IV und siRNA Oligonukleotide mit TransIT-TKO nach Herstellerangaben transfiziert. Die Zellen wurden nach 24 bis 48 h geerntet. S

Zur Herstellung stabiler Klone wuZReagenz nach Herstellerangaben. Hierfür wurden 10 µg Plasmid-DNA eingesetzt. Einen Tag nach der Transfektion wurden die Zellen auf 15 cm Zellkulturschalen verdünnt und in Selektionsmedium mit 0,8 - 1,0 mg G418/ml (Tab. 6.11) kultiviert. Nach einer Selektionsdauer von etwa 14 Tagen, wurden G418 resistente Kolonien vereinzelt. Die Expression von Integrin β3 wurde mittels Western Blot-Analyse und Immunfluoreszenz-färbung überprüft, die von EVA1 mit RT-PCR.

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6.2.6. DNA-Mikroarrays und Analyse der differentiellen Genexpression

schließen, wurde für jedes Array die mittlere ignalintensität berechnet und auf einen Sollwert von 1000 gesetzt. Für die weitere Analyse

wurden nur solche Gene verwendet, die mindesten auf einem der acht Arrays „Present“, d.h. leibenden 15255 Proben wurden der mittlere Signalwert und

er Log-Wert berechnet. Letzterer wurde für eine zweidimensionale hierarchische eighted Pairgroup Method with Arithmetic Mean (UPGMA)).

Für die Analyse der differentiellen Genexpression wurden „Humane genome HG-U133A GeneChips“ der Firma Affymetrix verwendet, auf denen insgesamt mehr als 22.000 Proben für 14.500 Gene sind. Die RNA wurde wie unter Punkt 6.2.2.9 beschrieben isoliert, mit DNAseI verdaut und anschließend mit dem RNeasy Kit gereinigt. Reverse Transkription, Zweitstrangsynthese und Probenherstellung erfolgten nach Herstellerangaben. Die Proben wurden in Kooperation mit Dr. Möröy and Dr. Klein-Hitpass (Institut für Zellbiologie, Tumorforschung, Universität Essen) hybridisiert, gewaschen und mit dem G2500A GeneArray Scanner gelesen. Die Analyse der erhaltenen Daten erfolgte mit Hilfe von MicroArray Suite 5.0 (MAS 5, Affymetrix), Data Mining Tool 3.0 (DMT 3, Affymetrix), Spotfire Decision Site for Functional Genomics 7.0 (Spotfire) und MS Excel und Access. Um unspezifische Variationen auszuS

detektierbar waren. Für die verbdClusteranalyse verwendet (UnwDiese basiert auf der Ähnlichkeit der Genexpressionsprofile der verschiedenen Proben (rot = verstärkt exprimiert im Vergleich zum Mittelwert, schwarz = nicht reguliert und grün = schwächer exprimiert im Vergleich zum Mittelwert). Zur Identifizierung von Gene, die unterschiedlich zwischen TEM+ und TEM- Tumorzelllinien exprimiert werden, wurde der Mann-Whitney-Test mit einem Signifikanzfilter von p<0,014 für eine gerichtete Clusteranalyse eingesetzt. Mit Hilfe dieser Analyse wurden 185 Gene identifiziert, die in den TEM+ Zelllinien signifikant 3-fach oder mehr stärker exprimiert werden im Vergleich zu TEM- Zelllinien und 151 Gene, die in den TEM- Zelllinien signifikant 3-fach oder mehr stärker exprimiert werden im Vergleich zu TEM+ Zelllinien.

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6.2.7. Plasmidklonierungen

6.2.7.1. Klonierung von EVA1-Expressionsplasmiden Für die Klonierung von C-terminal Myc-markiertem EVA1 (EVA1-myc) wurde die cDNA

nd dsRNA entsteht. Für die Aneinanderlagerung der beiden Oligonukleotide wurden 1 µl der 100 pmol Primer in 50 mM Tris/HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP

und 25 µg/ml BSA (pH 7,5) in einem Gesamtvolumen von 100 µl gemischt, für 5 min bei u n. Die so entstanden Inserts wurden direkt über

glII/HindIII in den pSUPER Vektor hinter den humanen RNA-Polymerase-III H1-Promotor II-Schnittstelle zerstört wurde. Die shRNA-Konstrukte wurden

ittels Sequenzanalyse überprüft und in transienten Transfektionen getestet. Da der pSUPER

XhoI

, dCTP und dATP aufgefüllt worden war, eingesetzt. Die sultierenden Vektoren wurden mittels Sequenzanalyse überprüft.

en, wurden

iziert. Die

wurde zunächst eine PCR mit EVA1g-359F nd EVA1_mut_rev durchgeführt. Das erhaltene Amplifikat wurde dann anschließend als

Oligonukleotid zusammen mit EVA1g+124R erneut für eine PCR verwendet, und das Produkt wie oben verdaut und in pGL3-Basic ligiert.

von AS 1 bis 215 (ohne Stoppcodon) aus 293T cDNA mittels der in Tab. 6.6 angegebenen Oligonukleotide amplifiziert und über EcoRI/BamHI in pcDNA3.1 (-)/ myc-His A eingesetzt. N-terminal mRFP-markiertes EVA1 (srEVA1) wurde durch Insertion der kodierenden Sequenz von AS 27 bis 216 (ohne Signalpeptid) von EVA1 über XmaI/NotI in den mRFP-C2 Vektor erzeugt. Das Plasmid enthielt bereits die kodierende Sequenz für das Signalpeptid von hLRP6 (AS 2 bis 25), das über die AgeI-Schnittstelle vor das mRFP1 eingesetzt worden war.

6.2.7.2. Klonierung der shRNA gegen Integrin β3 und EVA1 Für die Klonierung des shRNA-Inserts wurden die in Tab. 6.8 angegebenen Oligonukleotide verwendet. Diese beinhalten jeweils eine spezifische 19 nt lange Zielsequenz, die in fett dargestellt ist. Die dazwischen liegenden 9 nt bilden nach erfolgter Transkription eine Schlaufe (Hairpin), so dass sich die beiden komplementären Sequenzen aneinander lagern können uje

95°C ink biert und auf RT abkühlen gelasseBeingefügt, wobei die BglmVektor keine zur Selektion von stabilen Klonen geeignete Resistenz beinhaltet, wurde die Expressionskassette bestehend aus H1-Promotor und shRNA-Sequenz über SpeI/ausgeschnitten und die XhoI-Schnittstelle mit Klenow, dCTP und dTTP zur Hälfte aufgefüllt. Dieses Fragment wurde in einen BglII/SpeI verdauten pcDNA3.1 (+), bei dem die BglII-Schnittstelle zur Hälfte mit Klenowre

6.2.7.3. Klonierung der Promotorkonstrukte für EVA1 Um die Wirkung von Transkriptionsfaktoren auf die Expression von EVA1 zu testverschiedene Promotorkonstrukte hergestellt. Hierfür wurde zunächst die entsprechende Sequenz mittels der in Tab. 6.7 angegebenen Oligonukleotide und der PhusionTM High-Fidelity DNA Polymerase aus genomischer DNA von 293T Zellen ampliferhaltenen Fragmente sowie der pGL3-Basic Vektor wurden mit XhoI/HindII verdaut und ligiert. Zur Herstellung von EVA1-P-359mut2 u

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113

114

8. ANHANG

8. ANHANG

8.1. Während der Arbeit erstellte Vektoren pcDNA3.1 (-)/ myc-His A mit EVA1:

CMV-PromotorNcoI (403)

EV A 1-myc6150 bp

Neomyzin-Resistenz

Ampizillin-Resistenz

EVA1 cDNA ohne Stopp

BGH PolyA

SV40 PolyA

T7

BGH

f1 Ori

SV40-Promotor und Ori

pUC Ori

Myc-Epitop

Polyhistidin-Tag

BamHI (1398)

EcoRI (747)

HindIII (1416)

SmaI (849)

SmaI (2589)

XmaI (847)

XmaI (2587)

AvaI (714)ApaLI (5975)

PstI (746)

AvaI (847)

AvaI (2587)

NcoI (2473)

NcoI (3208)

ApaLI (5687)

PstI (1093)

ApaLI (1179)ApaLI (1237)

ApaLI (4441)

PstI (2829)

115

8. ANHANG

mRFP-C2 mit EVA1:

CMV EA Promoter

srEV A 15288 bp

EVA1 cDNA ohne Signalpeptid

mRFP1

Kanamyzin-Resistenz

Kozak-Sequenz

PolyAPolyA

SV40 Ori

pUC Ori

LRP6-Signalpeptid

ClaI (3153)

NotI (1957)

SacI (1868)

SmaI (1382)

SmaI (1404)

XmaI (1380)

XmaI (1402)

XbaI (1508)

XbaI (1967)

ApaLI (1734)

ApaLI (1792)

ApaLI (4917) NcoI (361)

NcoI (622)

PstI (657)

PstI (1036)

NcoI (1114)

NcoI (3745)

NcoI (3042) PstI (1648)

116

8. ANHANG

pGL3-EVA1-P-592:

EV A 1-P -5925519 bp

Luziferase-CDS


E-Box

E-Box

Z-Box

Z-Box

E-Box/Z-Box

SV40 PolyA

synth. PolyARV3

GL2

EVA1-Promotor -592 bis +124

fi Ori

BamHI (2674)

EcoRI (194)

HindIII (723)

NcoI (756)

PstI (283)

SmaI (5516)

XmaI (5514)

NotI (5321)

XhoI (1)

SacI (5499)

ClaI (5379) ClaI (5483)

XbaI (412)

ApaLI (574)

ApaLI (4490)

ApaLI (3244)XbaI (2412)

SalI (2680)

ClaI (2667)

117

8. ANHANG

pGL3-EVA1-P-359:

XhoI (1)

EV A 1-P -3595286 bp

Luziferase-CDSAmpizillin-Resistenz

E-Box/Z-Box

Z-Box

Z-Box

SV40 PolyA

synth. PolyARV3

GL2

EVA1-Promotor -359 bis +124

fi Ori

BamHI (2441)

HindIII (490)

NcoI (523)

NotI (5088)

PstI (50)

SacI (5266)

SalI (2447)

SmaI (5283)

XmaI (5281)

XbaI (179)

XbaI (2179)

ApaLI (341)

ApaLI (3011)

ApaLI (4257)

ClaI (2434)

ClaI (5146)ClaI (5250)

118

8. ANHANG

pGL3-EVA1-P-359mut2:

Xh

EV A 1-P -359mut25286 bp

Luziferase-CDSAmpizillin-Resistenz

Z-Box

Z-Box

E-Box/Z-Box mut

SV40 PolyA

snyth. PolyARV3

EVA1-Promotor -359 bis +124 mut

fi Ori

BamHI (2441)

HindIII (490)

NcoI (523)

PstI (50)SmaI (5283)

XmaI (5281)

NotI (5088)

oI (1)

Sac I (5266) XbaI (179)

SalI (2447)

XbaI (2179)

ApaLI (341)

ApaLI (3011)

ApaLI (4257)

ClaI (2434)

ClaI (5146)ClaI (5250)

119

8. ANHANG

pSUPER-RNAi:

(antisense) (HindIII)

In den verschiedenen Vektoren enthaltene shRNA-Sequenzen:

pSUPER-Intβ3-3/4

(BglII) Zielsequenz (sense) Hairpin Zielsequenz5’-GATCCCCCTACTTGATGGACCTGTCTTTCAAGAGAAGACAGGTCCATCAAGTAGTTTTTGGAAA-3’ 3’-GGGGATGAACTACCTGGACAGAAAGTTGTCTTCTGTCCAGGTAGTTCATCAAAAACCTTTTCGA-5’

pSUPER-Intβ3-5/6 5’-GATCCCCCTCTGCCTCCACTACCATGTTCAAGAGACATGGTAGTGGAGGCAGAGTTTTTGGAAA-3’ 3’-GGGGAGACGGAGGTGATGGTAGAAGTTGTCTGTACCATCACCTCCGTCTCAAAAACCTTTTCGA-5’ pSUPER-EVA1-9/10 5’-GATCCCCAATTGTAGTGGTCCTCTTCTTCAAGAGAGAAGAGGACCACTACAATTTTTTTGGAAA-3’ 3’-GGGTTAACATCACCAGGAGAAGAAGTTGTCTCTTCTCCTGGTGATGTTAAAAAAACCTTTTCGA-5’

pSU PER-RNA i3234 bp


shRNA

T3

T7

H1-Promotor

pUC Ori

f1 OriApaLI (2987)

SacI (658)

BamHI (690)

ClaI (1000)

EcoRI (708)

HindIII (993)

NotI (671)

XbaI (678)

XmaI (696)

SmaI (698)

PstI (706)

SalI (1008)ApaLI (1741)

XhoI (1014)

120

8. ANHANG

pcDNA-RNAi:

SalI (7)

cDNA-H1-Intβ3-5/6

(BglII) Zielsequenz (sense) Hairpin Zielsequenz (antisense) (HindIII)

In den verschiedenen Vektoren enthaltene shRNA-Sequenzen:

p 5’-GATCCCCCTCTGCCTCCACTACCATGTTCAAGAGACATGGTAGTGGAGGCAGAGTTTTTGGAAA-3’ 3’-GGGGAGACGGAGGTGATGGTAGAAGTTGTCTGTACCATCACCTCCGTCTCAAAAACCTTTTCGA-5’ pcDNA-H1-EVA1-9/10 5’-GATCCCCAATTGTAGTGGTCCTCTTCTTCAAGAGAGAAGAGGACCACTACAATTTTTTTGGAAA-3’ 3’-GGGTTAACATCACCAGGAGAAGAAGTTGTCTCTTCTCCTGGTGATGTTAAAAAAACCTTTTCGA-5’

pcDNA 3.1-RNA i4837 bp


Neomyzin-Resistenz

shRNA

SV40 PolyA

BGH PolyA

SV40-Promotor

H1-Promotor

bla-Promotor

pUC Ori

fi Ori

BamHI (325)

ClaI (17)

HindIII (22)

NotI (375)

XbaI (387)

XhoI (381)

SpeI (331)

ApaLI (3325)

ApaLI (4568)

EcoRI (307)SalI (4822)

PstI (317)

EcoRI (348)

NcoI (1357)

NcoI (2092)

SmaI (321)

SmaI (1473)

XmaI (319)

PstI (357)

SalI (2637) XmaI (1471)

PstI (1713)

121

8. ANHANG

8.2. Sequenzen

erwendete Sequenz der EVA1-CDS: V

MetTyrGlyLys SerSerThr ArgAlaVal LeuLeuLeuLeu GlyIleGln·

1 ATGTATGGCA AGAGCTCTAC TCGTGCGGTG CTTCTTCTCC TTGGCATACA TACATACCGT TCTCGAGATG AGCACGCCAC GAAGAAGAGG AACCGTATGT

·LeuThrAla LeuTrpProIle AlaAlaVal GluIleTyr ThrSerArgVal·

51 GCTCACAGCT CTTTGGCCTA TAGCAGCTGT GGAAATTTAT ACCTCCCGGG CGAGTGTCGA GAAACCGGAT ATCGTCGACA CCTTTAAATA TGGAGGGCCC

·VLeuGluAla ValAsnGly ThrAspAlaArg LeuLysCys ThrPheSer

101 TGCTGGAGGC TGTTAATGGG ACAGATGCTC GGTTAAAATG CACTTTCTCC ACGACCTCCG ACAATTACCC TGTCTACGAG CCAATTTTAC GTGAAAGAGG

SerPheAlaPro ValGlyAsp AlaLeuThr ValThrTrpAsn PheArgPro·

151 AGCTTTGCCC CTGTGGGTGA TGCTCTAACA GTGACCTGGA ATTTTCGTCC TCGAAACGGG GACACCCACT ACGAGATTGT CACTGGACCT TAAAAGCAGG

·LeuAspGly GlyProGluGln PheValPhe TyrTyrHis IleAspProPhe·

201 TCTAGACGGG GGACCTGAGC AGTTTGTATT CTACTACCAC ATAG AGATCTGCCC CCTGGACTCG TCAAACATAA GATGATGGTG TATCTAGGGA

·PGlnProMet SerGlyArg PheLysAspArg ValSerTrp AspGlyAsn

251 TCCAACCCAT GAGTGGGCGG TTTAAGGACC GGGTGTCTTG GGATGGGAAT AGGTTGGGTA CTCACCCGCC AAATTCCTGG CCCACAGAAC CCTA

ProGluArgTyr AspAlaSer IleLeuLeu TrpLysLeuGln PheAspAsp·

301 CCTGAGCGGT ACGATGCCTC CATCCTTCTC TGGAAACTGC AGTTCGACGA GGACTCGCCA TGCTACGGAG GTAGGAAGAG ACCTTTGACG TCAAGCTGCT

·AsnGlyThr TyrThrCysGln ValLysAsn ProProAsp ValAspGlyVal·

351 CAATGGGACA TACACCTGCC AGGTGAAGAA CCCACCTGAT GTTGATGGGG GTTACCCTGT ATGTGGACGG TCCACTTCTT GGGTGGACTA CAACTACCCC

alArg PheSerGlu 401 TGATAGGGGA GATCCGGCTC AGCGTCGTGC ACACTGTACG CTTCTCTGAG

ACTATCCCCT CTAGGCCGAG TCGCAGCACG TGTGACATGC GAAGAGACTC

eLeu AlaLeuAla IleGlySer AlaCysAlaLeu MetIleIle·

AA CATCACCAGG AGAAGGTCGT AATGGCCTTT TTCGCTACCC

·AGluArgAla HisLysVal ValGluIleLys SerLysGlu GluGluArg

lu LysLysVal SerValTyr LeuGluAspThr Asp***

Das 26 AS lange N-te riptionsstart in gelb (ATG). Über der DNA-Sequenz ist die Aminosäuresequenz angegeben.

ATCCCT

CCCTTA

·VIleGlyGlu IleArgLeu SerValValHis ThrV

IleHisPh

451 ATCCACTTCC TGGCTCTGGC CATTGGCTCT GCCTGTGCAC TGATGATCAT TAGGTGAAGG ACCGAGACCG GTAACCGAGA CGGACACGTG ACTACTAGTA

·IleValIle ValValValLeu PheGlnHis TyrArgLys LysArgTrpAla·

501 AATAGTAATT GTAGTGGTCC TCTTCCAGCA TTACCGGAAA AAGCGATGGG TTATCATT

551 CCGAAAGAGC TCATAAAGTG GTGGAGATAA AATCAAAAGA AGAGGAAAGG GGCTTTCTCG AGTATTTCAC CACCTCTATT TTAGTTTTCT TCTCCTTTCC

LeuAsnGlnG

601 CTCAACCAAG AGAAAAAGGT CTCTGTTTAT TTAGAAGACA CAGACTAA GAGTTGGTTC TCTTTTTCCA GAGACAAATA AATCTTCTGT GTCTGATT

rminale Signalpeptid ist fett dargestellt, der Transk

122

8. ANHANG

Verwendete Sequenz des EVA1-Promotors: 1 GGCAGGGTGA ATGAGCAGGG ATGGTGTCCT CATTTGTTTT TAAAGTCTTC

51

101

151

CCGTCCCACT TACTCGTCCC TACCACAGGA GTAAACAAAA ATTTCAGAAG

AAAGGTAAAG GATTGTTAAG CATGGAGATT TGATTTGTTG TTTCTGCCAG TTTCCATTTC CTAACAATTC GTACCTCTAA ACTAAACAAC AAAGACGGTC

GTCTCCTGGA AAGCTACAAA CTAGAAGAAG TGCAGGAATC CTTGTGGTAA CAGAGGACCT TTCGATGTTT GATCTTCTTC ACGTCCTTAG GAACACCATT

CAGGGGTATC AGCTTTTTGT CCACAGAGGG TCCTAAGGAA TTCCGACTCC GTCCCCATAG TCGAAAAACA GGTGTCTCCC AGGATTCCTT AAGGCTGAGG

201 CGTTTTGAAA TTGTATCGAA TCCAGTCCCA AGTGAATGTG GCCCTGGGGT

251

301

GCAAAACTTT AACATAGCTT AGGTCAGGGT TCACTTACAC CGGGACCCCA

GGTGCTTTGA GAAGTGGAAT CACTGCAGGA CAGTTTCAAC ATTCACTTCC CCACGAAACT CTTCACCTTA GTGACGTCCT GTCAAAGTTG TAAGTGAAGG

CAGGCAAGCC TAAAGCCTGT TTTAAAAGGG CGTGTGGGGG CCAAACCCAT GTCCGTTCGG ATTTCGGACA AAATTTTCCC GCACACCCCC GGTTTGGGTA

351 AACAGTCTGG GACATTTCAG ACTGGCACCA CCTCCTCTGG CTGTTTCCGA

401

451

TTGTCAGACC CTGTAAAGTC TGACCGTGGT GGAGGAGACC GACAAAGGCT

GGCCATCTAG AGGCCAGAGC CCAGTCAGAT TAACTGAAAG TAAAGAGAGG CCGGTAGATC TCCGGTCTCG GGTCAGTCTA ATTGACTTTC ATTTCTCTCC

ACTGCGGGAG TTTGGGACCT TTGTGCAGAC GTGCTCATGC TCGTTCGTGT TGACGCCCTC AAACCCTGGA AACACGTCTG CACGAGTACG AGCAAGCACA

501 AGAGGGCGGG AGAGAGGAAA GGAAGGAGGG CATTGGGAGC TGAGGCCCCA

TCTCCCGCCC TCTCTCCTTT CCTTCCTCCC GTAACCCTCG ACTCCGGGGT

551 CCTTTCATTT CAGAAAAGTG CACAGGCAGA GCGGGCTGAG TCACAGGCAC

GGAAAGTAAA GTCTTTTCAC GTGTCCGTCT CGCCCGACTC AGTGTCCGTG

601 AGGTGAGGAA CTCAACTCAA ACTCCTCTCT CTGGGAAAAC GCGGTGCTTG

651

TCCACTCCTT GAGTTGAGTT TGAGGAGAGA GACCCTTTTG CGCCACGAAC

CTCCTCCCGG AGTGGCCTTG GCAGGGTGTT GGAGCCCTCG GTCTGCCCCG GAGGAGGGCC TCACCGGAAC CGTCCCACAA CCTCGGGAGC CAGACGGGGC

701

751 ATGAGCACGC CACGAAGAAG AGGAACCGTA TGTCGAGTGT CCATTCTCGG

stellen der zur Klonierung der ngesetzten Oligonukleotide sind in grün dargestellt, der Translations-er Transkriptionsstart in gelb (ATG). Die E- und Z-Boxen sind grau

TCCGGTCTCT GGGGCCAAGG CTGGGTTTCC CTCATGTATG GCAAGAGCTC AGGCCAGAGA CCCCGGTTCC GACCCAAAGG GAGTACATAC CGTTCTCGAG

TACTCGTGCG GTGCTTCTTC TCCTTGGCAT ACAGCTCACA GGTAAGAGCC EVA1 5’-Stromaufwärtsbereich von -592 bis +202. Die BindePromotorkonstrukte eitart in rot (+1) und ds

hinterlegt.

123

8. ANHANG

8.3. Mikroarray-Daten

ine Übersicht über die Ergebnisse aus der DNA-ikroarray-Analyse. Gezeigt sind alle Genen bzw. Proben, bei denen der Mittelwert aus den

ikant der vier

Die folgenden Tabellen enthalten eMExpressionsdaten der vier Zelllinien einer der beiden Gruppen (TEM+ oder TEM-) signifgleich oder mehr als 3-fach höher war, als der Mittelwert aus den Expressionsdaten Zelllinien der anderen Gruppe.

Genname Gensymbol Affymetrix- MW MW TEM TEM Nummer TEM+ TEM- +/- -/+

20 Aldo-keto reductase family 1, member C3 AKR1C3 10305 4 269160_at 77 0,000,01

97 0,01

0,010,02

56 0,0256 0,02

4452_at 0,020,03

36 0,0333 0,03

2859_x_a 32 0,0329 0,0329 0,04

4823_at 28 0,040,040,04

24 0,044802_at 0,055302_at 0,05

20 0,0518 0,06

9432_at 17 0,0617 0,0616 0,0616 0,06

3325_at 0,060,07

15 0,0714 0,07

0,07 0,07

13 0,08

13 0,0813 0,0812 0,0812 0,08

1911_at 12 0,09 11 0,09

11 0,09

0103_s_a 10 0,10

104 115 9 0,11

207052_at Hepatitis A virus cellular receptor 1 HAVCR1 422 47 9 0,11

205623_at Aldehydedehydrogenase 3 ALDH3A1 6895 36 194206561_s_at Aldo-keto reductase family 1, member B10 (aldose

reductase) AKR1B10 11924 122

209546_s_at Apolipoprotein L, 1 APOL1 2536 37 6961219279_at Dedicator of cytokinesis 10 DOCK10 430 7

214390_s_at Branched chain aminotransferase 1 BCAT1 857 15 204557_s_at DAZ interacting protein 1 DZIP1 156 3 21 Branched chain aminotransferase 1 BCAT1 820 17 48

40217626_at Dihydrodiol dehydrogenase 1134 28 211506_s_at Interleukin 8 IL8 1306 37

Integrin β3 ITGB3 646 19 204627_s_at 20 t Interleukin 8 IL8 3247 103 204298_s_at Lysyloxidase LOX 1865 64

11990_at 2 MHC class II DP alpha 1 HLA-DPA1 873 31 0 Neuron navigator 3 NAV3 1598 58 2

211668_s_at Plasminogen activator, Urokinase PLAU 5002 206 2424205767_at Epiregulin EREG 2546 106

01272_at 2 Aldo-keto reductase family 1, member B AKR1B1 17242 718 0 Ras-related associated with diabetes RRAD 398 18 2 22

20 Insulin-like growth factor binding protein 1 IGFBP1 1209 58 21215388_s_at Complement factor H CFH 173 9 17513_at 2 Chromosom 17 ORF 60 C17orf60 113 6

21 Ellis van Creveld syndrome EVC 294 17 213524_s_at G0/G1switch 2 G0S2 2012 120 208209_s_at Complement component 4-binding protein, beta C4BPB 247 15 215704_at Filaggrin FLG 207 13 21 Poliovirus receptor-related 3, Nectin 3 PVRL3 886 57 16205112_at Phospholipase C PLCE1 108 7 15209278_s_at Tissue factor pathway inhibitor-2 TFPI2 9142 614 204620_s_at Chondroitin sulfate proteoglycan 2 (Versican) CSPG2 1296 90 213640_s_at Lysyloxidase LOX 541 38 1421 CDNA FLJ13601 fis, clone PLACE1010069 34 2 143817_at204115_at Guanine nucleotide binding protein (G protein), GNG11 5573 422

gamma 11 210875_s_at Transcription factor 8 TCF8 245 19 207808_s_at Protein S (alpha) PROS1 928 73 213800_at Complement factor H CFH 205 17 205479_s_at Plasminogen activator, Urokinase PLAU 3529 298 22 Ets variant gene 1 ETV1 337 29 22 Ecotropic viral integration site 1 EVI1 468 41 1884_at212764_at Transcription factor 8 (represses interleukin 2 TCF8 1637 144

expression) t Forkhead box A2 FOXA2 146 15 21

219630_at PDZK1 interacting protein 1 PDZK1IP1 631 64 10 0,10213238_at ATPase, Class V, type 10D ATP10D 581 59 10 0,204924_at Toll-like receptor 2 TLR2 106

124

8. ANHANG Affymetrix-Nummer Genname MW MW TEM TEM Gensymbol TEM+ TEM- +/- -/+

222351_at Proteinphosphatase 2 PPP2R1B 143 16 07379_at

9 0,118 0,128 0,128 0,12

8 0,138 0,138 0,138 0,137 0,137 0,137 0,137 0,14

4255_at 7 0,147 0,147 0,157 0,157 0,15

3273_at 7 0,157 0,156 0,16

6 0,166 0,16

6 0,166 0,17

6 0,176 0,17

2859_x_a 6 0,176 0,17

a 6 0,18 6 0,18

6 0,185 0,185 0,195 0,19

8854_at 5 0,19

5 0,195 0,195 0,19

5 0,197850_at 5 0,19

LIM domain containing 2 212609_s_at v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 3

(Proteinkinase B, gamma) AKT3 685 135 5 0,20

205346_at ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 2 ST3GAL2 97 19 5 0,20215517_at Pygopus homolog 1 (Drosophila) PYGO1 142 29 5 0,20219693_at 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 4

(lysophosphatidic acid acyltransferase, delta) AGPAT4 341 69 5 0,20

219028_at Homeodomain-interacting protein kinase 2 HIPK2 513 106 5 0,21205120_s_at Sarcoglycan, beta SGCB 1831 387 5 0,21203650_at Protein C receptor, endothelial (EPCR) PROCR 2465 524 5 0,21202052_s_at retinoic acid induced 14 RAI14 3682 800 5 0,22210563_x_at CASP8 and FADD-like apoptosis regulator CFLAR 4925 1084 5 0,22213455_at FLJ20783 2468 545 5 0,22202920_at Ankyrin 2 ANK2 389 88 4 0,23

2 EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3 EDIL3 334 40 Chromosom 1 ORF 24 C1orf24 2224 271 217967_s_at

214577_at Microtubule-associated protein 1B MAP1B 420 51 9631_at21 Low density lipoprotein-related protein 12 LRP12 1365 175

210538_s_at Baculoviral IAP repeat-containing 3 BIRC3 1311 171 20254_at 2 Low density lipoprotein-related protein 12 LRP12 345 45

209156_s_at Kollagen Typ VI, alpha 2 COL6A2 216 29 203501_at Plasma glutamate carboxypeptidase PGCP 135 18 207591_s_at AT rich interactive domain 1A (SWI- like) ARID1SA 173 23 207334_s_at Transforming growth factor, beta receptor II (70-80kD) TGFBR2 440 59

05743_at 2 SH3 and cysteine rich domain STAC 1293 176 21 ATPase, Class V, type 10A ATP10A 248 34 204596_s_at Stanniocalcin 1 STC1 584 83

07063_at 2 Chromosom Y ORF 14 CYorf14 63 9 ylase 9 HDAC9 222 33 205659_at Histonedeacet

205207_at Interleukin 6 (Interferon beta2) IL6 973 147 21 Odz, odd Oz/ten-m homolog 4 (Drosophila) ODZ4 171 26 220122_at Multiple C2 domains, transmembrane 1 MCTP1 345 52

22379_at 2 strongly similar potassium voltage-gated channel, Isk-related family, member 4

126 20

205100_at glutamine-fructose-6-phosphate transaminase 2 GFPT2 1134 183 05729_at 2 Oncostatin M Rezeptor OSMR 1466 238 0 Glycine receptor, beta GLRB 116 19 2 5280_at

212758_s_at Transcription factor 8 (represses interleukin 2 TCF8 667 112 expression)

208944_at Transforming growth factor, beta receptor II (70/80kDa) TGFBR2 5399 915 205522_at Homeobox D4 HOXD4 440 75 21 t Metallothionein 1E MT1E 34411 5925 202855_s_at Solute carrier family 16 member 3 SLC16A3 5867 1021 16336_x_2 t Metallothionein 1M MT1M 29923 5286 0 sprouty homolog 2 (Drosophila) SPRY2 1736 307 2 4011_at

209184_s_at Insulin receptor substrate 2 IRS2 4141 749 201426_s_at Vimentin VIM 32342 5899 212233_at 3'UTR of hypothetical protein (ORF1) 3690 685 209185_s_at Insulin receptor substrate 2 IRS2 9680 1812 21 Squamous cell carcinoma antigen recognized by T SART2 747 141

cells 2 19427_at 2 FAT tumor suppressor homolog 4 (Drosophila) FAT4 411 78

Cchromosom 1 ORF 24 C1orf24 642 123 217966_s_at 202856_s_at Solute carrier family 16 member 3 SLC16A3 6597 1263

7730_at21 Transmembrane BAX inhibitor motif containing 1 TMBIM1 1687 327 0 Chemokine (C-X-C motif) ligand 3 CXCL3 217 42 2

212607_at v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 3 (Proteinkinase B, gamma)

AKT3 2115 411 5 0,19

205805_s_at Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 ROR1 545 107 5 0,20203729_at Epithelial membrane protein 3 EMP3 7117 1397 5 0,20212472_at Microtubule associated monoxygenase, calponin and MICAL2 2948 581 5 0,20

125

8. ANHANG Affymetrix-Nummer Genname MW MW TEM TEM Gensymbol TEM+ TEM- +/- -/+

202132_at 212473_s_at Microtubule

WW domain containing transcription regulator 1 WWTR1 1829 419 4 0,23associated monoxygenase, calponin and MICAL2 5630 1300 4 0,23

Da CEP170 1717 420 4 0,24Suppressor of cytokine signaling 3 SOCS2 94 23 4 0,25

at otein 238

284 ed kinas

1

cysteine-rich protein with kazal

1 271 ulator 6 17

2t 859

nase interactor 2 in 1G 20842 5787

ted protein kinase kinase kinase kinase 4 4 ansferase (acyl-Coenzyme A: cholesterol 1

t 1548

t t 1

1

main containing 20 20 13t 1 39

in, Motopsin) 2 mology region 2 domain containing 1- 1L1

t ike 2 2 ceptor 1

ly 7, member 11 1 1 51

21

RAGE 7 24t ase 4

4815 1544 rfamily member 7 4 1 6

potential cation channel, subfamily 114

ing 3 t protein 2C 3t otein 1 t

P-activated, gamma 2 non-catalytic 796

t protein 2 1t brane protein 2 2

3345 1 386

LIM domain containing 2 214059_at Interferon-induced protein 44 IFI4 100 23 4 0,23205119_s_at Formyl peptide receptor 1 FPR1 382 89 4 0,23217371_s_at Interleukin 15 IL15 195 47 4 0,24205313_at Transcription factor 2, hepatic, LF-B3 TCF2 793 191 4 0,24219973_at Arylsulfatase family, member J ARSJ 621 151 4 0,24212746_s_at Centrosomal protein 170k206359_at 215617_at 207164_s_

FLJ11754 Zinkfingerpr

191247

4761

44

0,250,25ZNF238

213763_at Homeodomain interacting protein kinase 2 1 (CDC2-relat

HIPK2 1145 4 0,25207766_at cyclin-dependent kinase-like e) CDKL1 182 46 4 0,25205573_s_at 206279_at Protein

Sorting nexin 7 kinase, Y-linked

SNX7 PRKY

4532 189

162 49

44

0,260,26

205407_at Reversion-inducing-motifs

RECK 119 31 4 0,26

201389_at Integrin α5 ptosis reg

ITGA5

018 4 0,27209939_x_at CASP8 and FADD-like apo CFLAR 596 78 4 0,27214500_at H2A histone family, member Y H2AFY

JAG1 965 63 4 0,27

216268_s_a Jagged 1 pled receptor ki

3153 4 0,27209876_at G protein-cou

eGIT2 253 70 4 0,28

204745_x_at Metallothion MT1G 4K

4 0,28218181_s_at Mitogen-activa MAP 1845 513

258 4 0,28

221561_at sterol O-acyltracyltransferase) 1 Tubulin a3

SOAT 917 4 0,28

209118_s_a TUBA3 5388 595

3 0,29204158_s_at 209894_at

T-cell, immune regulator 1 Leptin receptor

TCIRG1 1267 71 3 0,29

LEPR 909 3 0,29211171_s_a Phosphodiesterase 10A

Fatty acid desaturase 1 PDE10A FADS1

355 105 3 0,30208962_s_a 4847 447 3 0,30213249_at F-box and leucine-rich repeat protein 7 FBXL7 384 15 3 0,30216314_at Cysteine-rich secretory protein 1 CRISP1 35 10 3 0,30205383_s_at Zinc finger and BTB do ZBTB 453 6 3 0,30202864_s_a SP100 nuclear antigen SP100 303 2 3 0,30205515_at Serinprotease 12 (Neurotryps PRSS1

WHDC130 39 3 0,30

213908_at WAS protein holike 1

260 79 3 0,30

203001_s_a Stathmin-l STMN 64 20 3 0,30211057_at Receptor tyrosine kinase-like orphan re ROR1 195 60 3 0,30209921_at Solute carrier fami SLC7A1 682 7 3 0,31202180_s_at major vault protein MVP 1104 340 3 0,31214036_at CLONE=IMAGE:3144178 960 97 3 0,31205893_at Neuroligin 1 NLGN 72 22 3 0,31205130_at Renal tumor antigen 62 0 3 0,32206571_s_a Mitogen-activated protein kinase kinase kinase kin

LMAP4K4 2673 843 3 0,32

202087_s_at Cathepsin 209264_s_at

transmembrane 4 supe

CTSL TSPAN

33

0,320,32915 14

211602_s_at Transient receptorC, member 1

TRPC1 352 3 0,32

203355_s_at Pleckstrin and Sec7 domain contain PSD3 1022 334 3 0,33221004_s_a Integral membrane ITM2C 961 14 3 0,33200785_s_a low density lipoprotein-related pr LRP1 203 68 3 0,33207071_s_a Aconitase 1

Protein kinasACO1 2368 801 3 0,34

218292_s_at e, AMsubunit

PRKAG2 2345 3 0,34

214436_at F-box and leucine-rich repea FBXL2 508 73 3 0,34202368_s_a translocation associated mem TRAM2 799 75 3 0,34210822_at RPL13-2 pseudogen LOC28 209 72 3 0,35213434_at Syntaxin 2 STX2 097 3 0,35

126

8. ANHANG Affymetrix-Nummer Genname Gensymbol MW

TEM+ MW

TEM- TEM +/-

TEM -/+

203567_s_at g 38 2t ) 1 1 1 4

damage-inducible, beta B t 1t 1

3 11

otein, RP/EB family, 292

2408 875 1

t ember 7 4 n and SOCS box

22

t tin

t otein beta 1 52

t AG1 214 t

se hatase type 2B

ein 3 1

t se 201 en

tide transhydrogenase

Tripartite motif-containin TRIM38 761 69 3 0,35220750_s_a Leucine proline-enriched proteoglycan (Leprecan LEPRE 333 74 3 0,36207574_s_at Growth arrest and DNA- GADD45 2471 884 3 0,36205079_s_a Multiple PDZ domain protein MPDZ 534 91 3 0,36207196_s_a TNFAIP3 interacting protein 1 TNIP1 3095 111 3 0,36203610_s_at Tripartite motif-containing 38 TRIM38 479 173 3 0,36201487_at Cathepsin C CTSC 118 32 3 0,36202501_at Microtubule-associated pr

member 2 MAPRE2 804 3 0,36

212254_s_at Dystonin DST 3 0,36210605_s_at Milk fat globule-EGF factor 8 protein MFGE8 525 91 3 0,36209263_x_a transmembrane 4 superfamily m

aiTSPAN 1983 728

122 3 0,37

219677_at SplA/ryanodine receptor domcontaining 1

SPSB1 329 3 0,37

203718_at Neuropathy target esterase NTE 588 17 3 0,37210136_at Myelin basic protein MBP 7

237 23 6

88 8 3 0,37

206274_s_a Ciliary rootlet coiled-coil, RootleRelated RAS viral (r-ras) oncoge

CROCC 3 0,37212647_at ne homolog

Growth arrest and DNA damage inducible prRRAS2GADD4

796 299 3 0,38209305_s_a 5B

PIN1 409 29 3 0,38

202927_at Protein NIMA-interacting 1 783 94 3 0,38209098_s_a Jagged 1 J 563 3 0,38204303_s_a KIAA0427 226 87 3 0,38206932_at Cholesterol 25-hydroxyla CH25H 108 42

23 0,39

212230_at Phosphatidic acid phosp PPAP2B 528 04 3 0,39204963_at 206767_at

Sarcospan (Kras oncogene-associated gene) RNA binding motif, single stranded interacting prot

SSPN RBMS3

132 331

51 129

33

0,390,39

212566_at Microtubule-associated protein 4 MAP4 2998 175 3 0,39211019_s_a Lanosterolsyntha LSS 510 3 0,39202863_at SP100 nuclear antig SP100 1313 522 3 0,40219953_s_at Chromosom 11 ORF 17 C11orf17 1185 471 3 0,40202784_s_at Nicotinamide nucleo NNT 1214 483 3 0,40217593_at Zinkfingerprotein 447 ZNF447 183 73 3 0,40

Tab. 8.1: In TE ls in TEM- Zelllinien ex ierte Gen rsi ler G e bm DNA-Array, die in TEM+ Zelllinien signifikant 3-f der mehr ex wu en

elllin sionsdaten für die vier Zelllinie = nsend helEM ittelwerte von TEM+ Zelllinien zu TE el ; TE -/

der M inien

M+ Zelllinien stärker a prim e. Übe cht al en zw. Proben auf de ach o stärker primiert rd , als in TEM- Z ien. MW = Mittelwert der Expres n; TEM Tra ot iale Migration; T +/- = Verhältnis der M M- Z llinien M + = Verhältnis ittelwerte von TEM- Zelllinien zu TEM+ Zelll . Affymetrix-Nummer Genname ol MW Gensymb EM+

MW TEM TT TEM- +/-

EM -/+

203779_s_at 1 0,0t 6 0,0

1 0,0t ase 0,0t 8 0,0

219121_s_at 35A RBM35A 56 2870 0,02 520,0

203780_at EVA1 101 4362 0,02 431 60 0,0

pe 1 20 0,0t 15 0,0

218677_at S100A14 173 5521 0,03 321 0,0

y factor 6 1 0,01100 0,0

0B 1574 0,08 0,0

3 (water channel) AQP3 0,0

Epithelial v-like antigen 1 EVA1 12 6415 33 1 138

201131_s_a Cadherin 1, type 1, E-cadherin (epithelial) CDH1 67 1 96203256_at Cadherin 3, type 1, P-cadherin (placental) CDH3 20 548 1 76209459_s_a 4-Aminobutyrate Aminotransfer ABAT 14 862

12 62

205980_s_a Rho GTPase activating protein 8 RNA binding motif protein

ARHGAP 20 162 2 57

209460_at 4-Aminobutyrate Aminotransferase Epithelial v-like antigen 1

ABAT 12 581 2 50

202575_at Cellular retinoic acid-binding protein 2 CRABP2 50 89 2 41202826_at Serine protease inhibitor, Kunitz ty SPINT1 55 54 3 37202889_x_a Microtubule-associated protein 7

S100 calcium binding protein A14 MAP7 47 72 3 33

213050_at Cordon-bleu homolog (mouse) COBL 33 037 3 31202597_at Interferon regulator IRF6 66 869 4 28212338_at Myosin ID MYO1D 44 4 25213285_at Transmembrane protein 30B TMEM3 65 4 2437117_at Rho GTPase activating protein 8 ARHGAP 76 1692 4 2239249_at Aquaporine 45 929 5 21

127


TEM- TEM +/-

TEM -/+

MW TEM+

202454_s_at ene 1242 0,0

201839_s_at signal transducer 1 TACSTD1 683 12542 0,05 187 40 0,0

) 13 0,0, mitochondrial 1A /B 1A/B 32 0,0

2 0,0t l transducer 2 D2 9 0,0

sis-inducing) 1 0,0454 0,0

t n of tumorigenicity 14 (colon carcinoma) ST14 7 0,0g 2 (Drosophila) 1 0,0

inoma, 1446 0,0

3 0,0t 6 0,1

2 0,1204678_s_at um channel, subfamily K, member 1 KCNK1 45 443 0,10 10

t tor A1 0,1ber 1 0,1

24 0,1e homolog 3 (neuroendocrine-dlg, 0,1

ranscript (mouse) homolog 0,10,10,1

203287_at LAD1 157 1273 0,12 80,1

a) 0,1t ol synthase (phosphatidate 0,1

ceptor 2 0,10,1

t 743 5338 0,10,1

ntaining 2D 2D 0,1t r), 856 0,1

499 0,17 RAS oncogene family 1 6 0,1

t 670 0,1t 0,1

lastosis viral oncogene homolog 0,1e II transcription, homolog MED18 16 0,1

0,11167 0,1

0,10,20,20,2

eptor 0,2in D3) Rezeptor 0,2

5 4 0,2eptor-Tyrosinkinase Isoform b 1 0,2

E 0,2206109_at ransferase 1 (Galactosid- 2-alpha-L- FUT1 68 309 0,22 5

r 3 1 0,2t osinkinase 1 1996 0,2

hannel, subfamily K, member 1 1 0,2222240_s_at Myo-inositol 1-phosphate synthase A1 ISYNA1 164 723 0,23 4

v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncoghomolog 3 Tumor-associated calcium

ERBB3 64 5 19

202790_at Claudin 7 CLDN 236 87 6 17215471_s_at E-MAP-115105 (MAP gene MAP7 83 98 6 17202712_s_at Creatine kinase CKMT 199 56 6 16202890_at Microtubule-associated protein 7 MAP7 130 028 6 16202286_s_a Tumor-associated calcium signa TACST 631 789 6 16205780_at BCL2-interacting killer (apopto BIK 104 557 7 15208084_at Integrin β6 ITGB6 31 7 15216905_s_a Suppressio 56 40 8 13205555_s_at Msh homeobox homolo MSX2 15 88 8 13202005_at Suppression of tumorigenicity 14 (colon carc

matriptase, epithin) ST14 120 8 12

219411_at Engulfment and cell motility ELMO3 48 564 9 12216641_s_a Ladinin 1 LAD1 66 75 0 10219704_at Y box binding protein 2

PotassiYBX2 23 38 0 10

205977_s_a EPH Rezep EPHA1 37 365 0 10202340_x_at Nuclear receptor subfamily 4, group A, mem NR4A1 39 378 0 10222361_at Similar to tubulin, beta 8 LOC6432 36 327 1 9207732_s_at Discs, larg

Drosophila) DLG3 88 744 2 8

202016_at mesoderm specific t MEST 946 7922 2 8209170_s_at Glykoprotein M6B GPM6B 28 230 2 8204952_at LY6/PLAUR domain containing 3

Ladinin 1 LYPD3 90 739 2 8

203144_s_at KIAA0040 37 301 2 8218780_at Hook homolog 2 (Drosophil HOOK2 112 865 3 8205709_s_a CDP-diacylglycer

cytidylyltransferase) 1 CDS1 97 717 3 7

208228_s_at Fibroblast growth factor re FGFR2 36 263 4 7214874_at DKFZp564G052 23 167 4 7207076_s_a Argininosuccinatsynthetase ASS 4 7221665_s_at EPS8-like 1 EPS8L1 62 418 5 7221081_s_at DENN/MADD domain co DENND 133 857 6 6222217_s_a Solute carrier family 27 (fatty acid transporte

member 3 Interleukin 17 Rezeptor B

SLC27A3 142 7 6

219255_x_at IL17BR 83 6218931_at RAB17, member RAB17 04 22 7 6208156_x_a Epiplakin 1 EPPK1 117 7 6218792_s_a B-box and SPRY domain containing BSPRY 106 605 8 6204798_at v-myb avian myelob MYB 121 691 8 6219730_at Mediator of RNA polymeras

(S. cerevisiae)Dual specificit

89 8 6

204794_at y phosphatase 2 DUSP2 79 432 8 5209784_s_at Jagged 2 JAG2

1 224 9 5

91826_at 209324_s_at

EPS8-like 1 Regulator of G

EPS8LRGS16

127 63

655 321

90

55-protein signalling 16

219702_at 219461_at

Placenta-specific 1 p21(CDKN1A)-activated kinase 6

PLAC1 PAK6

131 66

652 321

01

55

204254_s_at Vitamin D (1,25- dihydroxyvitamin D3) Rez VDR 174 840 1 5204255_s_at Vitamin D (1,25- dihydroxyvitam VDR 140 673 1 5206683_at Zinkfingerprotein 165 ZNF16 92 38 1 5207169_x_at Discoidin Rez DDR1 416 969 1 5202708_s_at Histone 2, H2be

FucosyltHIST2H2B 160 736 2 5

fucosyltransferase) 202488_s_at FXYD domain-containing ion transport regulato FXYD3 380 713 2 5208779_x_a Discoidin Rezeptor-Tyr DDR1 446 2 4204679_at Potassium c KCNK1 288 289 2 4

128


TEM- TEM +/-

TEM -/+

MW TEM+

212728_at Discs, large homolog 3 (neuroendocrine-dlg, 0,2

0,261 0,2

an Faktor) 0,2 0,2

4 ORF 147 47 0,2t ferring, 1 0,2

H1710 0,2 phenol-preferring, 1 0,2

0,21143 0,27

1 0,2morphogenesis 1 0,2

nger), 1 1 4401 0,2

1 0,2t 1 0,2

, member 2 0,2147 0,2

main containing 2A A 3 0,2

2 3 0,2 2 0,2

ed moiety X)-type 0,2

neuroendocrine-dlg, 0,2

ptor 0,3pendent 2 3559 0,3

SRY (sex determining region Y)-box 13 SOX13 215 708 0,30 3x_at Cytokine inducible SH2-containing protein CISH 155 506 0,31 3

Bernardinelli-Seip congenital lipodystrophy 2 (Seipin) BSCL2 518 1686 0,31 3C11

at main containing 11 ssory protein-like 2 L2

2t

717 2mily 4

1 10t A 1t in containing 4

otein 10 35 1

t F) 16 t (yotiao) 9 5t cytoplasmic,

t ype receptor 2

) 2

Drosophila) DLG3 123 533 3 4

205355_at Acyl-Coenzyme A Dehydrogenase ACADSB 149 643 3 4220293_at Chromosom 14 ORF 161 C14orf1 30 129 3 4205774_at Koagulationsfaktor XII (Hagem F12 524 2210 4 4211507_s_at Myotubularin related protein 3 MTMR3 43 170 5 4213508_at Chromosom 1 C14orf1 757 2959 6 4215299_x_a Sulfotransferase family, cytosolic, 1A, phenol-pre

member 1 SULT1A1 375 454 6 4

221273_s_at DKFZp761 73 282 6 4203615_x_at Sulfotransferase family, cytosolic, 1A,

member 1 SULT1A1 376 444 6 4

203143_s_212729_at

at KIAA0040 Discs, large homolog 3 (neuroendocrine-dlg,

114 429 6 44

Drosophila) g 1

DLG3 306

219291_at DTW domain containin DTWD 269 998 7

7 4216060_s_at Dishevelled associated activator of DAAM1 211 72 7 4201349_at Solute carrier family 9 (sodiumhydrogen excha

isoform 3 regulatory factor 1 SLC9A3R 208 7 4

32137_at Jagged 2 JAG2 333 211 7 4221655_x_a EPS8-like 1 EPS8L 148 533 8 4201236_s_at BTG family BTG2 119 428 8 4217350_at Keratin 19 LOC160313

HISPPD242 8 4

204578_at Histidin acid phosphatase dohypothetical protein LOC649951

97 36 9 3

205847_at Serinprotease 22 PRSS2 115 99 9 3200961_at Selenophosphate Synthetase 2 SEPHS2 622 132 9 3212183_at Nudix (nucleoside diphosphate link

motif 4 NUDT4 258 882 9 3

212727_at Discs, large homolog 3 (Drosophila)

DLG3 278 949 9 3

204253_s_at Vitamin D (1,25- dihydroxyvitamin D3) Rezex associated, actin de

VDR 149 1

503 0 3201827_at SWISNF related, matri

regulator of chromatin, subfamily d, member 2 219764_at Frizzled homolog 10 (Drosophila) FZD10 30 101 0,30 3204873_at Peroxisome biogenesis factor 1 PEX1 133 442 0,30 3209710_at GATA-binding protein 2 GATA2 282 933 0,30 336499_at Cadherin, EGF LAG seven-pass G-type receptor 2

(Flamingo homolog, Drosophila) CELSR2 229 757 0,30 3

SMARCD 060 0 3

38918_at 221223_208906_at 206745_at 221927_s_

Homeobox Abhydrolase do

HOXC11 ABHD11

195892

6352868

0,310,31

33

221112_at Interleukin 1 receptor acce IL1RAP 71 224 0,31 3203713_s_at Lethal giant larvae (Drosophila) homolog 2 LLGL2 19 681 0,32 3215607_x_a KIAA2010 81 252 0,32 3209873_s_at Plakophilin 3 PKP3 191 0,33 3219622_at RAB20, member RAS oncogene fa RAB20 49 1338 0,34 3218853_s_at Motile sperm domain containing MOSPD1 83 3217 0,34 3222169_x_a SH2 domain containing 3A SH2D3 10 323 0,34 3215923_s_a Pleckstrin and Sec7 doma PSD4 58 171 0,34 336742_at Tripartite motif-containing 15 TRIM15 60 175 0,34 3200929_at Transmembrane emp24-like trafficking pr

(yeast) TMED10 00 0190 0,34 3

219976_at Hook homolog 1 (Drosophila) E

HOOK1 F16

118 1

343 0,35 3208009_s_a Rho guanine exchange factor (G

nARHGE

978 513 0,35 3

210962_s_a A kinase (PRKA) anchor proteitor of activated T-cells,

AKAP 54 1592 0,35 3207416_s_a Nuclear fac

calcineurin-dependent 3 TAP binding protein-like

NFATC3 194 553 0,35 3

218747_s_a TAPBPL 63 179 0,35 3204029_at Cadherin, EGF LAG seven-pass G-t

(Flamingo homolog, DrosophilaCELSR2 43 686 0,35 3

129

8. ANHANG Affymetrix- MW MW TEM TEM Genname Gensymbol Nummer TEM+ TEM- +/- -/+

209885_at Ras homolog gene family, member D Rogdi homol

RHOD 4218394_at og (Drosophila) ROGDI 256 720 0,35 3

siae) t or receptor-bound protein 7

se C domain 1 1

M1

t L1 t ifferentiation, lysophosphatidic acid 1

RMRP) 7 1

216393_at 12 C10orf12 39 103 0,38 3t 3

2 -L2 1t , lysophosphatidic acid 1

S oncogene family 9 2/ B1/

85 1368 0,35 3

212446_s_at LAG1 longevity assurance homolog 6 (S. cerevi LASS6 559 1574 0,36 3210761_s_a Growth fact GRB7 106 296 0,36 3219209_at Interferon induced with helica IFIH1 32 362 0,36 347069_at Proline rich 5 (renal) PRR5 220 605 0,36 3209498_at Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion

molecule 1 CEACA 74 203 0,37 3

218779_x_a EPS8-like 1 EPS8 220 591 0,37 3206722_s_a endothelial d

G-protein-coupled receptor, 4 EDG4 64 438 0,37 3

209380_s_at ATP-binding cassette, sub-family C (CFT ABCC5 33 957 0,37 381811_at Programmed cell death 6

Chromosom 10 ORF PDCD6 173 462 0,37 3

216361_s_a MYST Histon-Acetyltransferase MYST3 49 129 0,38 3219332_at MICAL-like MICAL 81 476 0,38 3206723_s_a endothelial differentiation

G-protein-coupled receptor, 4 EDG4 76 463 0,38 3

203581_at RAB4, member RA RAB4 42 453 0,38 3205871_at Plasminogen-like PLGLB2

A142 110 0,38 3

201562_s_at 6 1222

210749_x_at Discoidin zeptor-Tyrosinkinase 1 DDR1 752 1940 0,39 3t 1

2cleotide binding protein-like 3 ike

per family (NET-5) 1 3

1007_s_at osinkinase 1 DDR1 1153 2924 0,39 31

Sorbitol dehydrogenase SORD 73 747 0,39 3210581_x_at Zinkfingerprotein 278

ReZFN278 575 0,39 3

218681_s_a Stromal cell-derived factor 2-like 1 SDF2L1 225 3158 0,39 3217591_at SKI-like SKIL 61 157 0,39 3204328_at Transmembrane channel-like 6 TMC6 41 620 0,39 3205010_at Guanine nu

(nucleolar)-lGNL3L 415 1062 0,39 3

205665_at Tetraspan transmembrane 4 su TSPAN9 81 207 0,39 3214594_x_at ATPase, Class I, type 8B, member 1

Discoidin Rezeptor-TyrATP8B 29 837 0,39 3

214798_at KIAA0703 26 318 0,40 3

Tab. 8.2: In TE tärker als in TEM+ Zelllinien exprimierte Gene. rsi ler e bzwm Zelllinien signifikant 3-f der mehr stä ex rt en, alllin Mittelwert der Expressionsdaten für d elllinien; s helialEM rte von TEM+ u TE ell ; -/+ =r M elllinien

M- Zelllinien s Übe cht al Gen . Proben auf de DNA-Array, die in TEM- ach o rker primie wurd s in TEM+ Zel ien. MW = ie vier Z TEM = Tran endot e Migration; T +/- = Verhältnis der Mittelwe Zelllinien z M- Z linien TEM Verhältnis de ittelwerte von TEM- Zelllinien zu TEM+ Z .

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DANKSAGUNG An dieser Stelle möchte ich all jenen danken, die direkt oder indirekt zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen habe:

Herrn Prof. Dr. Jürgen Behrens für die Vergabe des interessanten Themas und die wertvolle fachliche Betreuung dieser Arbeit. Außerdem für seine Diskussionsbereitschaft und dafür, dass ich von seinen Erfahrungen profitieren konnte, vor allem auch in Sachen Vortragsstil.

Dr. Claudia Mierke für die Betreuung zu Beginn meiner Arbeit und den hilfreichen Einstieg in die Welt der Mikroarray-Daten.

PD Dr. Robert Slany für die Übernahme des Zweitgutachtens und Prof. Dr. Christian Koch für seine Bemühungen als Zweitprüfer und das Interesse an meiner Arbeit.

Dr. Ludger Klein-Hitpass und seinem Team für die Durchführung der Mikroarrays.

Dr. Ursula Schlötzer-Schrehardt für die elektronenmikroskopische Auswertung meiner Transmigrationsversuche.

Dr. Geert Berx und Dr. Thomas Brabletz für ihre Unterstützung bei der Aufklärung der transkriptionellen Repression von EVA1.

Dr. Ralf Schild und allen Mitarbeiten der Erlanger Frauenklinik für die stetige Versorgung mit Navelschnüren, sowie allen Mitarbeiterinnen der Fürther Frauenklinik für ihren Einsatz zur Beseitigung von Engpässen.

Dr. Bernhard Mayr für die nützlichen Informationen über Bioinformatik und die Behebung meiner Wissenslücken bei Photoshop und CorelDRAW. Außerdem für die kleine Einführung in mein neues Lieblingsprogramm EndNote.

Dr. Martin Sachs für seine Hilfe rund um Computer, Software und Geräte und natürlich den Zitronenbaum.

Gabi Daum für die Einführung in die Zellkultur und Volker Stemmer für die Einführung in den Laboralltag. Letzterem außerdem für das SnailΔSnag-Konstrukt und die Schokolade.

Angela Döbler für die Versorgung mit Nuss- und Hefezöpfen und natürlich die Hilfe bei der Bewältigung von Orgakram.

Allen Mitgliedern des mittäglichen „Sozialseminars“ und Schreibzimmer- bzw. Labor-mitinsassen, die ich bisher noch nicht namentlich erwähnt habe, danke ich ganz besonders für die hilfreichen fachlichen Diskussionen und die netten Gespräche abseits von Arbeit und Forschung bzw. diverse Aufheiterungen.

Alle anderen Mitarbeiter des NFZ für die angenehme, kollegiale Arbeitsatmosphäre.

Bei Andrea Feuerstein möchte ich mich für die bereitwillige Durchsicht des Manuskriptes und ihre hilfreichen Anmerkungen dazu bedanken.

Herzlicher Dank gilt außerdem all denen, die bis hierher durchgehalten haben.

Ein großes Dankeschön geht an meine Familie, die immer für mich da ist und mich schon mein ganzes Leben lang unterstützt und immer an mich geglaubt hat.

Christian - für alles.

Diese Arbeit wurde im Rahmen des Forschungsschwerpunktes „Zelladhäsion, Migration und Invasion: Molekulare Grundlagen und klinische Bedeutung bei Tumorprogression und Metastasierung“ der Mildred Scheel Stiftung (Deutsche Krebshilfe) gefördert.

LEBENSLAUF

Persönliche Daten Name: Katja Christine Bauer

Geburtstag: 08.05.1978

Geburtsort: Nürnberg

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: ledig

Schulbildung 1984 – 1988 Billroth-Grundschule in Nürnberg

1988 – 1997 Wilhelm-Löhe-Schule in Nürnberg

Juli 1997 Allgemeine Hochschulreife

Diplomarbeit im Institut für Molekulare

vember 2002 Diplom in Biologie

Experimentelle Medizin II (Prof. Behrens)

Studium 1997-2001 Studium der Biologie an der Friedrich-

Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

2002

Pflanzenphysiologie (Prof. Sauer)

Thema: „Charakterisierung der physiologischen Rolle des Saccharosetransporters AtSUC1 aus Arabidopsis thaliana“

No

Promotion ab Januar 2003 Doktorarbeit am Lehrstuhl für

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Untersuchung molekularer Mechanismen der ......Das Adhäsionsmolekül EVA1 (epithelial v-like antigen 1) verhielt sich in seiner Expression invers zu der von Integrin β3. Es war in