Untersuchungen zum Gewebetropismus des Hepatitis A-Virus

im Mausmodell durch quantitative Analyse viraler Nukleinsäure

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

Im Fachbereich Biologie / Chemie

Universität Bremen

vorgelegt von

Alke Heitmann

Juni 2008

1. Gutachter: Dr. habil. Andreas Dotzauer 2. Gutachter: Dr. habil. Stephan Günther

Teile dieser Arbeit sind veröffentlicht in:

Heitmann A., Laue T., Schottstedt V., Dotzauer A., Pichl L.:

Occurrence of Hepatitis A Virus III in Germany Requ ires the Adaptation of

Commercially Available Diagnostic Test Systems

Transfusion 2005 Jul;45(7):1097-105

Pichl L., Heitmann A., Herzog P., Oster J., Smets H., Schottstedt V.:

Magnetic Bead Technology in Viral RNA and DNA Extra ction from Plasma Minipools

Transfusion 2005 Jul;45(7):1106-10

Zayc-Schmidt E.M., Pichl L., Laue T., Heitmann A., Schottstedt V.:

Travel-related Hepatitis A Detected by Hepatitis A Virus RNA Donor Screening

Transfusion 2005 Jun;45(6):1037-8

Danksagung

Zuallererst gilt mein Dank Dr. habil. Andreas Dotzauer für die Überlassung des Themas und

die ausgezeichnete Betreuung meiner Arbeit.

Ich danke Dr. habil. Stephan Günther für die bereitwillige Übernahme des Zweitgutachtens.

Der QIAGEN Hamburg GmbH gebührt mein Dank für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes

und der Arbeitsmittel.

Herrn Thomas Laue danke ich für seine Unterstützung und ständige Gesprächsbereitschaft,

sein Vertrauen in meine Arbeit, was mir ein hohes Maß an Eigeninitiative erlaubte und die

vielen motivierenden Worte.

Meinen Kollegen in Hamburg und am Institut für Virologie in Bremen möchte ich danken, für

die angenehme Zusammenarbeit und ihre ständige Hilfsbereitschaft. Eure Worte, Gesten

und kleinen und großen Taten waren mir große Stütze und haben zum Gelingen dieser

Arbeit beigetragen. Den Mitarbeitern am Institut für Virologie möchte ich besonders für die

Hilfe bei der Betreuung der Tiere danken.

Meiner Familie und meinen Freunden danke ich für ihre rückhaltlose Unterstützung, ihre

unendliche Geduld und das Interesse an meiner Arbeit. Bei Tim möchte ich mich besonders

bedanken, dafür dass er immer an meiner Seite ist.

1

1. EINLEITUNG................................................................................................................. 3

1.1 Hepatitis A-Virus .................................................................................................................................... 3 1.1.1 Historie.................................................................................................................................................3 1.1.2 Systematik............................................................................................................................................ 3 1.1.3 Epidemiologie ...................................................................................................................................... 4 1.1.4 Pathogenese ......................................................................................................................................... 5 1.1.5 Morphologie und Genomorganisation ................................................................................................. 5 1.1.6 Infektionszyklus................................................................................................................................... 6 1.1.7 Klinik, Immunantwort und Diagnostik ................................................................................................ 7

1.2 Zielsetzung............................................................................................................................................. 11

2. MATERIAL UND METHODEN........................... ..............................................................13

2.1 Material......................................................................................................................................................... 13 2.1.1 Versuchstiere........................................................................................................................................... 13 2.1.2 Virusstämme............................................................................................................................................ 13 2.1.3 Zelllinien ................................................................................................................................................. 14 2.1.4 Zellkulturmedien ..................................................................................................................................... 14 2.1.5 Antibiotika und Fungizide....................................................................................................................... 14 2.1.6 Synthetische Nukleinsäuren .................................................................................................................... 15 2.1.7 Enzyme.................................................................................................................................................... 15 2.1.8 Sonstige Proteine..................................................................................................................................... 16 2.1.9 Kits .......................................................................................................................................................... 16 2.1.10 Chemikalien .......................................................................................................................................... 17 2.1.11 Puffer und Lösungen ............................................................................................................................. 17 2.1.12 Verbrauchsmaterialien........................................................................................................................... 18 2.1.13 Geräte .................................................................................................................................................... 19 2.1.14 Software ................................................................................................................................................ 19

2.2 Methoden ....................................................................................................................................................... 20 2.2.1 Kultivierung von Zellen .......................................................................................................................... 20 2.2.2 Bestimmung der Zellzahl ........................................................................................................................ 20 2.2.3 Mykoplasmen-Test.................................................................................................................................. 21 2.2.4 Herstellung von Viruspools..................................................................................................................... 21 2.2.5 Bestimmung des 50 %-Endpunkttiters (TCID50/ml) ............................................................................... 21 2.2.6 Isolierung viraler RNA aus zellfreien Medien......................................................................................... 22 2.2.7 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren ............................................................ 23 2.2.8 Real-time RT-PCR System zur Quantifizierung von HAV RNA............................................................ 23 2.2.9 PCR zum Nachweis von 18S rRNA und GAPDH RNA......................................................................... 27 2.2.10 Agarose-Gelelektrophorese ................................................................................................................... 28 2.2.11 Infektion der Mäuse...............................................................................................................................28 2.2.12 Herstellung der Inokula zur Infektion ................................................................................................... 28 2.2.13 Immunisierung der Mäuse..................................................................................................................... 29 2.2.14 Blutentnahme aus dem retrobulbären Venenplexus .............................................................................. 29 2.2.15 Bestimmung des anti-HAV IgG Status der Mäuse................................................................................ 29 2.2.16 HAV Neutralisation durch Mausseren .................................................................................................. 29 2.2.17 Sektion der Mäuse.................................................................................................................................30 2.2.18 Isolierung der Nukleinsäure aus den Mausgeweben ............................................................................. 30 2.2.19 Neutralisation der anti-HAV/IgA-Komplexe in vitro............................................................................ 31 2.2.20 Herstellung strangspezifischer Kontrolltranskripte ............................................................................... 31 2.2.21 (-) Strang Nachweis mittels Rolling Circle Amplifikation.................................................................... 33 2.2.22 (-) Strang Nachweis mittels Box-PCR................................................................................................... 36 2.2.23 Aufnahme einer HAV Wachstumskurve............................................................................................... 40

3. ERGEBNISSE..................................................................................................................41

2

3.1 Entwicklung eines real-time RT-PCR Systems zum Nachweis und zur Quantifizierung des Hepatitis A-Virus..................................................................................................................................................................... 41

3.1.1 Validierung des HAV real-time RT-PCR Systems ................................................................................. 41 3.1.2 Einsatz des real-time HAV RT-PCR Systems in der in vitro Diagnostik ............................................... 42

3.2 Entwicklung eines Systems zum quantitativen Nachweis von HAV Negativstrang RNA ...................... 43 3.2.1 Herstellung der strangspezifischen Kontrolltranskripte .......................................................................... 43 3.2.2 Strangspezifischer Nachweis mittels Rolling Circle Amplifikation........................................................ 44 3.2.3 Strangspezifischer Nachweis mittels Box-PCR ...................................................................................... 50

3.3 Untersuchung zum IgA vermittelten Carriermechanismus des Hepatitis A-Virus in experimentell infizierten Mäusen............................................................................................................................................... 53

3.3.1 Nachweis des HAV nach intravenöser, intraperitonealer und oraler Inokulation von HAV/anti-HAV IgA-Komplexen................................................................................................................................................ 53 3.3.2 Untersuchung zum HAV Targeting vermittelt durch anti-HAV IgA ...................................................... 55 3.3.3 Einfluss der Immunantwort auf den anti-HAV IgA Carriermechanismus .............................................. 67

4. DISKUSSION...................................................................................................................77

4.1 Entwicklung des quantitativen real-time RT-PCR Systems ...................................................................... 77

4.2 Entwicklung des strangspezifischen RNA Nachweises .............................................................................. 78

4.3 Verteilung des Hepatitis A-Virus im Mausmodell ..................................................................................... 81

4.4 Replikation im Modellorganismus............................................................................................................... 83

4.5 IgA vermitteltes Targeting von HAV zur Leber ........................................................................................ 84

4.6 Abhängigkeit des anti-HAV IgA Carriermechanismus von dem Reifungsgrad der Immunantwort.... 87

5. ZUSAMMENFASSUNG ................................. ..................................................................90

6. LITERATUR....................................... ..............................................................................92

ABKÜRZUNGEN ........................................ .........................................................................98

3

1. EINLEITUNG

1.1 Hepatitis A-Virus

1.1.1 Historie

Das Hepatitis A-Virus (HAV), welches weltweit verbreitet ist, ist heute der häufigste Erreger

der Gelbsucht. Die HAV Infektion war bereits im Mittelalter unter dem Namen Feldzug-

Gelbsucht (Campaign jaundice) als ernste Erkrankung innerhalb der Armee bekannt. Die

ersten Berichte über eine epidemisch auftretende Gelbsucht in der zivilen Bevölkerung

Europas stammen aus dem 17. und 18. Jahrhundert(20). Die virale Ätiologie der „akuten

gelben Atrophie der Leber“ wurde 1908 von McDonald postuliert(85). 1912 sprach Cockayne

erstmals von der „infektiösen Hepatitis“ um die epidemisch auftretende Gelbsucht zu

beschreiben(20). Während des 2. Weltkrieges konnten aufgrund der hohen Inzidenz eine

Reihe an klinischen Studien zu dieser Erkrankung durchgeführt werden. Epidemiologische

Studien und Experimente an Freiwilligen bestätigten die virale Ätiologie und gaben u.a. erste

Einblicke in Inkubationszeit und klinischen Verlauf der infektiösen Hepatitis(10,70,55,68). 1947

führte MacCallum die Begriffe „Hepatitis A“ für die infektiöse Hepatitis und „Hepatitis B“ für

eine ähnliche Erkrankung bis dahin bekannt unter dem Namen „Serum-Hepatitis„ ein(78).

Nachdem Feinstone et al., 1973 die Identifizierung des Hepatitis A-Virus durch Immuno-

Elektronenmikroskopie gelang(41), erreichten Provost und Hillemann 1979 die in vitro

Kultivierung des Virus und ermöglichten damit die Entwicklung eines Impfstoffes(103).

1.1.2 Systematik

Anfang der 80er Jahre wurde das Hepatitis A-Virus aufgrund der zu diesem Zeitpunkt

bekannten biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften in der Familie der

Picornaviridae, dem Genus Enterovirus zugeordnet(51). Bereits zehn Jahre später wurde

diese Klassifizierung aufgrund neuerer Erkenntnisse korrigiert. Für das Hepatitis A-Virus

wurde ein neuer Genus, der Genus Hepatovirus, innerhalb der Familie Picornaviridae

geschaffen(87); es ist bis heute das einzige Mitglied dieses Genus. Das Hepatitis A-Virus wird,

aufgrund der genetischen Analyse von 152 weltweit verbreiteten HAV Stämmen, in sieben

Genotypen eingeteilt(107). Ein Vorschlag zur Neuklassifizierung in fünf Genotypen wurde 2002

von Costa-Mattioli gemacht. Dessen genetische Analysen ergaben, dass die Genotypen II

und VII Subtypen des gleichen Genotyps sind(24). Ein Genotyp ist definiert als eine

Virusgruppe mit mindestens 85%iger Sequenzhomologie. Zwei dieser Genotypen (Genotyp I

4

und Genotyp III) lassen sich noch weiter in Subgenotypen einteilen. Diese Subgenotypen

differieren in höchstens 7,5% ihrer Nukleotidsequenz(107). Es besteht ein Zusammenhang der

jeweiligen Geno- und Subgenotypen zu der geografischen Region ihres Auftretens. So

repräsentiert eine Untergruppe des Subgenotyps IA mit einer Sequenzhomologie von 97%

nahezu alle HAV Stämme aus den USA. In Europa dagegen ist dieses Muster heterogener,

es werden die Genotypen IA und IB sowie besonders in jüngster Zeit Genotyp III

gefunden(107,74,25,6).

1.1.3 Epidemiologie

Das Hepatitis A-Virus ist weltweit verbreitet, wobei die Durchseuchung in

Entwicklungsländern aufgrund des niedrigen Hygienestandards besonders hoch ist(3). In

diesen Ländern liegt die Prävalenz bei Kindern unter zehn Jahren nahezu bei 100%. In

industrialisierten Ländern wird eine Reduktion der Prävalenz bei Kindern beobachtet. Dies

basiert darauf, dass der Erstkontakt mit dem Virus mit fortschreitender Industrialisierung und

damit verbundenenen Hygienestandards erst in höherem Alter stattfindet(58,52). In den

Industrieländern wird die HAV Infektion in erster Linie durch Reisen in Länder mit niedrigem

Hygienestandard erworben(121,139,3), weshalb die Erkrankung durch Hepatitis A-Virus auch

„Reisehepatitis“ genannt wird. In Deutschland sind derzeit nahezu ein Viertel der gemeldeten

Hepatitiden auf HAV zurückzuführen(106).

Die Infektion mit Hepatitis A-Virus erfolgt fäkal-oral über den Kontakt mit infizierten

Personen, kontaminiertem Wasser oder Lebensmitteln. Besonders häufig ist dabei die

Übertragung durch den Verzehr von Meeresfrüchten, da diese das Virus durch Filtern des

Meerwassers aufkonzentrieren(29,119,32,3). Eine Übertragung durch Blut und Blutprodukte, z.B.

Faktor VIII Präparate, ist möglich und wurde in der Vergangenheit bereits mehrfach

beobachtet(29,96,79,19,95). Durch Aufnahme des Hepatitis A-Virus in die Testung der

Blutspendedienste und durch ständige Verbesserung der genutzten Nachweissysteme wird

dieses Risiko der Übertragung stark minimiert(98). Eine Übertragung durch die gemeinsame

Verwendung von Spritzen ist ebenfalls beschrieben. Bei etwa 40 – 50% der i.v.-

Drogenabhängigen in Nordeuropa sind Antikörper gegen HAV nachweisbar. Diese hohe

Rate ist neben der gemeinsamen Nutzung der Spritzen auch auf die schlechten

hygienischen Lebensbedingungen zurückzuführen(67).

5

1.1.4 Pathogenese

Nach der oralen Aufnahme gelangt das Virus über den Magen-Darmtrakt auf bisher

ungeklärte Weise in die Leber und infiziert die Hepatozyten. Das Hepatitis A-Virus weist in

vivo einen starken Hepatotropismus auf. Obwohl eine Vermehrung im Intestinaltrakt

diskutiert wird, ist die Leber sehr wahrscheinlich der einzige Replikationsort des Virus(119,83,82).

In verschiedenen Studien konnte die Anwesenheit des HAV in extrahepatischen Geweben

wie z.B. Milz, Niere, Darmschleimhaut und Tonsillen nachgewiesen werden. Dass das Virus

in Tonsillen und auch im Speichel auffindbar ist, deutet auf eine erste Replikation im

Rachenraum hin, dieses konnte bisher jedoch nicht belegt werden(21). Ebenso fehlen

Hinweise auf eine Replikation im Darmgewebe, wie sie für andere fäkal-oral übertragbare

Picornaviren üblich ist(21,82,83,62). Obwohl die HAV Replikation in vivo bisher nur in

Hepatozyten nachweisbar ist, lassen sich in Zellkultur eine ganze Reihe von Zellen, die nicht

der Leber entstammen, wie z. B. humane Lungenfibroblasten und Affennierenzellen

produktiv infizieren(119,43,34). Das die Leber eine zentrale Rolle im IgA-Metabolismus spielt,

indem sie IgA und IgA-Komplexe aus dem Organismus eliminiert(13), könnte auf eine

Verbindung des HAV mit seinem strikten Hepatotropismus und dem Immunglobulin A

hinweisen. Dotzauer et al., 2005 postulierte den Übergang des HAV aus dem Darm in den

Blutstrom und den Transport zur Leber durch Komplexierung mit Immunglobulin A(33). Die

HAV Replikation in der Leber erfolgt bereits acht bis zehn Tage vor dem Auftreten erster

Symptome. Die in der Leber synthetisierten Virionen gelangen über die Galle in den Darm

und werden mit dem Stuhl ausgeschieden(119,132,73,113). Die Menge der Viruspartikel im Stuhl

und im Blut ist vor Beginn der klinischen Symptome besonders hoch und nimmt im Verlauf

der Infektion deutlich ab(44,11).

1.1.5 Morphologie und Genomorganisation

Das Hepatitis A-Virus besteht aus einem ikosaedrischen, nicht umhüllten Capsid mit einem

Durchmesser von 27 – 32 nm und ist damit morphologisch nicht von anderen Picornaviren

zu unterscheiden(41,104). Das Genom besteht aus linearer, einzelsträngiger RNA in Plusstrang

Orientierung mit einer Länge von 7,5 kb(26,22). Das 5´Ende ist kovalent mit einem Protein

namens VPg (genomassoziiertes Virusprotein) verbunden. Der einzige offene Leserahmen

(ORF) wird am 5´- und 3´-Ende von nicht translatierten Regionen (NTR) flankiert. Die 5´NTR

ist deutlich länger als die 3´NTR und bildet eine komplexe Sekundärstruktur, die interne

ribosomale Eintrittsstelle (IRES), welche die Translation vermittelt. Am 3´Ende befindet sich

neben der NTR ein poly(A)-Anhang(47,14,15). Der offene Leserahmen kodiert für ein 250 kD

6

Polyprotein, welches durch die virale Protease (3C) in drei Polypeptide P1 (Strukturproteine),

P2 und P3 (Nicht-Strukturproteine) gespalten wird(108,60,80,46,114,102). Die P1 Region kodiert für

die Proteine VP1 bis VP4, welche das Capsid bilden. Die Proteine 2A, 2B und 2C entstehen

aus dem Polypeptid P2, ihre Funktionen sind noch nicht vollständig geklärt. Vermutlich erfüllt

das Protein 2A eine wichtige Aufgabe beim Assembly(101), die Proteine 2B und 2C haben

Einfluss auf die Adaptation der viralen Replikation in Zellkultur(36). Desweiteren ist vom

Protein 2C bekannt, dass es eine RNA Helikase Aktivität aufweist(49). Die Region P3 kodiert

für die weiteren Nicht-Strukturproteine; 3A, ein Protein dessen Funktion noch nicht

vollständig geklärt ist, 3B dem VPg Protein welches mit dem 5´Ende des Genoms assoziiert

ist und als Primer für die Replikation dient, sowie 3C und 3D(134). Hinter dem Protein 3D

verbirgt sich die RNA-abhängige RNA-Polymerase und das Protein 3C ist die bereits

erwähnte virale Proteinase(130,1).

1.1.6 Infektionszyklus

Die Infektion beginnt mit der spezifischen Adsorption des Virus an die Hepatozyten. Die

Struktur des Canyons, einer Vertiefung, die die Ikosaederecken (5-fach Symmetrieachsen)

umgibt und aus Aminosäureresten der Proteine VP1, VP2 und VP3 besteht, vermittelt die

Bindung des Virus an spezifische zelluläre Rezeptoren. Für die Transmembranproteine der

TIM-Familie, TIM-1 und TIM-3, konnte eine Bindungseigenschaft an HAV und eine

Unterstützung beim Virusentry gezeigt werden. Sie fungieren jedoch nicht als zellulärer

Rezeptor(122,8,40,61); dieser ist für das Hepatitis A-Virus noch nicht identifiziert. Das

Transmembranprotein TIM-1 wird ubiquitär expremiert(61,40,8) und steht damit in keinem

Zusammenhang mit dem starken Hepatotropismus des HAV. Tami et al., 2007 konnten

zeigen, dass Immunglobulin A spezifisch an TIM-1 bindet. Diese Interaktion könnte eine

wichtige Rolle in der Pathogenese des HAV durch verbesserte Infektion von Zellen, die IgA

und IgA-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche aufweisen, wie Kupfferzellen und Hepatozyten

spielen(125). Zahlreiche Untersuchungen belegen die Anwesenheit von sekretorischem,

virusspezifischem IgA im intestinalen Lumen. Die Antikörper treten sehr früh nach der

Infektion auf und liegen häufig im Komplex mit HAV vor(120,13). HAV/IgA-Komplexe werden

mittels pIgR (Polymeric immunoglobulin receptor) von Epithelzellen transcytiert und gelangen

so vom Darmlumen in die Blutbahn(33). Die HAV/IgA-Komplexe können über den ASGPR

(Asialoglykoproteinrezeptor) Leberzellen infizieren. Da dieser Rezeptor nur in Hepatozyten

expremiert wird, könnte dieser Infektionsweg den starken Hepatotropismus des Virus

erklären(118). Die Aufnahme der HAV/IgA-Komplexe über den ASGPR konnte in vitro sowohl

in der murinen hepatozytären Zellinie NCTC als auch in der humanen Hepatomzellinie

7

HepG2 und primären Hepatozyten humanen Ursprungs gezeigt werden(35). In vivo

Untersuchungen zum Transport der Komplexe mit dem Blutstrom zur Leber stehen noch aus

und sind Ziel dieser Arbeit. Nach dem Eintritt des Virus durch Endocytose erfolgt das

uncoating. Um die Konformationänderung, welche zur Freisetzung der viralen RNA ins

Cytoplasma führt, zu induzieren, sind möglicherweise die zelluläre N-terminale cysteinreiche

immunglobulin-ähnliche Region D1 und die mucin-ähnliche Region des TIM-1

erforderlich(116,123). Die Translationsinitiation erfolgt durch IRES (Typ III IRES) vermittelte

Interaktion der ribosomalen Untereinheiten und den Translationsfaktoren mit einem

Startcodon(131,140). Bereits während der Synthese des Polyproteins beginnt die Spaltung in

die Polypeptide (Prozessierung). Nahezu zeitgleich mit der Translation findet die Synthese

der komplementären Negativstränge statt(140). Dazu wird das Protein VPg an den zellulären

Membrankompartimenten uridinyliert. Der so entstandene VPg-Primer assoziiert an den

Poly(A)-Anhang des Genoms und bildet die Erkennungstelle für die RNA-abhängige RNA

Polymerase, die zunächst ein Replikationsintermediat in Form von Negativstrang RNA

synthetisiert(134,88). Dieser Negativstrang [(-) Strang] weist am 3´Ende zwei Adenosinreste

auf, an die der VPg-Primer ebenfalls assoziiert, so dass neue RNA Positivstränge

synthetisiert werden können. Die so gebildeten neuen Positivstränge werden sofort in das

Capsid verpackt, so dass sie nicht als Template zur weiteren Replikation dienen können(4).

Kotranslational findet durch die Protease 3C die Spaltung des Polyproteins in die P1

(Strukturproteine), P2 und P3 (Nichtstrukturproteine) Polyproteine statt. Anschließend spaltet

3C das Polyprotein P1 in VP0, VP3 und VP1/2A, die Proteine bleiben in Komplexen

zusammen und assoziieren zu Pentameren. Zwölf dieser Pentamere bilden zusammen ein

Procapsid, welches das RNA Genom aufnimmt und so das Provirion bildet. Die

Reifespaltung des VP0 in die Proteine VP2 und VP4 findet vermutlich erst im Provirion statt.

Die assemblierten Virionen werden über einen noch unbekannten Weg aus der Zelle

ausgeschleust ohne diese zu lysieren(64,128). Aus den Leberzellen werden sie über die Galle

ins Darmlumen geleitet, wo sie erneut mit IgA komplexiert werden können(132,119,73).

1.1.7 Klinik, Immunantwort und Diagnostik

Eine Hepatitis A-Virus Infektion ist immer selbst-limitierend, d.h. das Virus wird vom Körper

vollständig eliminiert. Die Erkrankung kann symptomlos bis tödlich verlaufen. Der typische

Krankheitsverlauf lässt sich in vier klinische Phasen einteilen: die Inkubationsphase, das

Prodromalstadium, den Ikterus und die Konvaleszenz(90,65). Die Inkubationszeit beträgt 15 -

50 Tage und ist abhängig von der Infektionsdosis(69). Im Allgemeinen treten 30 Tage nach

Exposition die ersten unspezifischen Symptome wie Übelkeit, Fieber und ein generelles

8

Krankheitsgefühl auf(29). Nach diesem ungefähr eine Woche anhaltenden Prodromalstadium

bildet sich ein Ikterus mit typischer Gelbfärbung der Augen und Haut. Ausprägung der

klinischen Symptomatik und Mortalität sind altersabhängig, so verläuft die HAV Infektion bei

Kindern häufig inapparent. Während bei Kindern unter sechs Jahren bei weniger als 10%

ikterische Verläufe zu beobachten sind, ist dies bei ca. 75 - 90% der infizierten Erwachsenen

der Fall(53,3). In weniger als 1% aller ikterischen Verläufe kommt es zu einer fulminanten

Hepatitis und somit der schwersten durch Hepatitits A-Virus induzierten Verlaufsform(127),

wobei unter 1,5% aller ikterischen Verläufe fatal enden(57).

Hepatitis A-Virus Infektionen treten in verschiedenen atypischen Manifestationen auf. Man

unterscheidet die Entwicklung einer Cholestase, die protrahierte und die relapsierende

Verlaufsform(29,109,50,111,133). Die protrahierte Form tritt in bis zu 8,5 – 12,3% aller Fälle auf Sie

ist durch pathologisch erhöhte Transaminase- und Billirubinwerte über einen Zeitraum von

mehreren Monaten, teilweise bis zu 15 Monaten, gekennzeichnet(138,133). Leberbiopsien

dieser Fälle zeigen Entzündungen, Nekrosen und Fibrosen. Bei diesen Krankheitsverläufen

lässt sich während des gesamten Zeitraums, in dem die Alanin-Aminotransferase (ALT)

Werte erhöht sind, die virale RNA im Stuhl nachweisen(138). Coppola et al., 2007 beschreiben

einen Fall der protrahierten Hepatitis A in Zusammenhang mit Cholestase, bei dem sowohl

erhöhte Transaminase Werte als auch Virus im Plasma über einen Zeitraum von 7 Monaten

nachgewiesen wurde. Bei diesem Patienten konnten zu Beginn der Infektion die

Subgenotypen IA und IB parallel nachgewiesen werden. Im weiteren Verlauf änderte sich

diese Koinfektion. Zunächst konnte nur Genotyp IA und kurz vor der Konvaleszenz nur

Genotyp IB nachgewiesen werden. Diese Koinfektion könnte der oder zumindest einer der

Gründe für den protrahierten Krankheitsverlauf sein(23).

Bei der HAV assoziierten Cholestase leiden die Patienten unter Fieber, Diarrhö,

Gewichtsverlust und Malabsorption, der verminderten enteralen Resorption. Der Bilirubinwert

im Serum ist über drei Monate beträchtlich erhöht (über 10mg/dL; Normwert<0,3mg/dL).

Auch der ALT-Wert ist über diesen Zeitraum deutlich erhöht. Die Cholestase löst sich

langsam aber vollständig auf(29,89,50). Relapsierende Verläufe werden in bis zu 20% der

akuten Hepatitis A beobachtet(48,117). Dabei kommt es nach der initialen Erkrankung zunächst

zur vollständigen Remission der klinischen und biochemischen Symptome. Innerhalb von 4

bis 15 Wochen kommt es, trotz des Vorhandenseins neutralisierender Antikörper, zum

ikterischen Rezidiv, mit im Wesentlichen gleicher Symptomatik wie in der initialen Phase. Die

Enzymwerte sind bis zu 12 Monate erhöht, und in seltenen Fällen treten während dieser Zeit

weitere Rezidive auf, bevor das Virus vollständig eliminiert wird. Während der Rezidivphasen

befinden sich Hepatitis A-Viren sowohl im Blut als auch im Stuhl, wohingegen das Virus

9

während der Remission bisher nicht nachgewiesen werden konnte(48,111). Neben dem Virus

lässt sich in Serum und Stuhl dieser Patienten auch anti-HAV IgM Antikörper

nachweisen(48,29,117).

Abbildung 1: Model des IgA vermittelten HAV Carriermechanismus. Nach der oralen Aufnahme gelangt das Virus über den Magen in den Darm. Dort kann das Virus mit IgA,welches von der Galle sezerniert wird, komplexiert und durch den polymeren Immunglobulin Rezeptor (pIgR) in den Blutstrom abgegeben werden, oder aber das Virus gelangt zunächst unkomplexiert durch den Darm und kann in der Submucosa mit sekretorischem IgA oder aber im Blutstrom mit Serum IgA komplexiert werden. Mit diesem gelangen die HAV/anti-HAV IgA-Komplexe zur Leber und über den Asialoglykoproteinrezeptor (ASGPR) in die Hepatozyten, in denen die Virusreplikation stattfindet. Die neu synthetisierten Virionen werden mit der Gallenflüssigkeit in den Darm geschleusst und können den Kreislauf trotz Anwesenheit von neutralisierender IgG Antikörper erneut durchlaufen. Es wäre möglich, dass die Aviditätssteigerung von anti-HAV IgG im Laufe der Infektion eine Verdrängung des IgA aus den Komplexen zur Folge hat, wodurch der Transport zur Leber unterbrochen wäre, und das Virus vollständig eleminiert werden könnte.

10

Mit Beginn der Symptome lassen sich IgM, IgG und auch IgA Antikörper gegen HAV

Strukturproteine im Serum nachweisen. IgG Antikörper erreichen ihren höchsten Wert in der

Konvaleszenzphase, persistieren lebenslang und schützen dadurch vor einer erneuten

Infektion. Immunglobulin A und IgM Antikörper erreichen innerhalb der ersten vier Wochen

der Erkrankung ihre höchsten Titer und persistieren dann für einen begrenzten Zeitraum.

Während IgM Antikörper in der Regel bereits nach 6 Monaten nicht mehr nachweisbar sind,

persistieren IgA Antikörper bis zu 2 Jahre(5). Die Rolle der IgA Antikörper während der HAV

Infektion ist bisher ungeklärt und Gegenstand der vorliegenden Arbeit(119,90,73). In Zellkultur

konnte bereits gezeigt werden, dass HAV komplexiert mit IgA aus dem Darmlumen in den

Blutstrom übergehen kann, und dass diese Komplexe über den ASGPR Hepatozyten

infizieren können. Ob diese HAV/IgA-Komplexe in vivo d.h. im Organismus den Weg vom

Eintritt in den Blutstrom hin zur Leber zurücklegen können, und damit den in Abb. 1

dargestellten enterohepatischen Kreislauf schließen können, wurde in dieser Arbeit anhand

eines Mausmodells untersucht. Es wäre denkbar, das HAV trotz funktionsfähiger adaptiver

Immunabwehr seine Anwesenheit im Organismus maskiert indem es IgA als Trägermolekül

verwendet. Das Virus kann die Hepatozyten komplexiert mit IgA über den ASGPR infizieren

und es kommt zur Synthese von Virionen. Diese gelangen mit der Galle in den Darm und

werden dort entweder direkt mit sekretorischem IgA aus der Galle oder aber in der

Submucosa oder dem Blut mit IgA komplexiert und könnten erneut im Komplex mit IgA die

Leber infizieren. Dieser enterohepatische Kreislauf des Virus könnte protrahierte und

relapsierende Verläufe der Infektion erklären. Die wiederholte Infektion der Leber durch die

HAV/anti-HAV IgA-Komplexe während des möglichen enterohepatischen Kreislaufs spiegelt

sich in der Symptomatik der Rezidive, die der initialen Infektion gleichen, wieder. D.h. durch

ein Molekül dessen Funktion eigentlich die Neutralisation von viralen Infektionen ist, wird die

HAV Infektion unterstützt. Der IgA induzierte, enterohepatische Kreislauf könnte eine

entscheidende Rolle bei den durch mehrere Rückfälle charakterisierten Krankheitsverläufen

mit ihren kaskadenartig auftretenden Neuinfektionen spielen. Die Komplexierung mit IgA

schützt das Virus vor IgG und IgM Antikörpern und damit vor der Eliminierung. Mit Reifung

des Immunsystems steigt die Avidität der IgG Antikörper und es wäre denkbar, dass diese

das IgA aus den Komplexen verdrängen und den Reinfektionszyklus damit unterbrechen.

Ähnliche Antikörper-vermittelte Infektionen sind für eine Reihe von Viren bereits beschrieben.

So gelangen Poliovirus und Maul- und Klauenseuche-Virus, weitere Vertreter der Familie

Picornaviridae, komplexiert mit IgG über den Fc-γ Rezeptor in die Zellen. IgA vermittelte

Infektionen über den pIgR (Polymeric immunoglobulin receptor) wurden z.B. bei Eppstein

Barr und Influenza Virus beobachtet(84,81,7,45).

11

Die Diagnostik einer HAV Infektion erfolgt neben der Messung der Transaminasewerte durch

Bestimmung der IgM Antikörper im Serum. Bevor die ersten Antikörper im Serum

detektierbar sind befinden sich hohe Mengen Virus im Blut, Stuhl und Speichel. Wobei sich

im Stuhl mit 109 Virionen/g die höchsten Mengen befinden(137). Der Nachweis von Hepatitis

A-Virus Antigen sowie der viralen RNA z.B. durch RT-PCR ist ebenfalls möglich und schließt

das diagnostische Fenster der Antikörper Detektion(128,82,31,59,137,117). Die PCR ist eine sehr

schnelle und sensitive Methode zur in vitro Amplifikation spezifischer Nukleinsäureabschnitte

und ermöglicht somit die Detektion geringster Nukleinsäuremengen. Im Gegensatz zur

herkömmlichen PCR und der damit verbundenen Endpunktanalyse erlaubt die real-time

Messung eine genaue Quantifizierung des Targets(129).

1.2 Zielsetzung

In dieser Arbeit soll untersucht werden, ob HAV-spezifisches IgA im Organismus als Carrier

für das Targeting des Virus zur Leber dient, d.h. ob das Virus im Komplex mit IgA die Leber

signifikant und selektiv erreicht. Anhand von Zellkulturexperimenten konnte gezeigt werden,

dass HAV komplexiert mit IgA aus dem Darmlumen in den Blutstrom übergehen kann, und

dass HAV/IgA-Komplexe über den ASGPR Hepatozyten infizieren können. Mit Hilfe eines

Mausmodells soll in dieser Arbeit untersucht werden, ob HAV/IgA-Komplexe den Weg vom

Eintritt in den Blutstrom zur Leber zurücklegen können, und damit den anhand der

Zellkulturdaten postulierten unterstützenden Effekt auf die HAV Infektion der Leber sowie

den hypothetischen enterohepatischen Kreislauf schließen. Dieser IgA Carriermechanismus

verbunden mit dem enterohepatischen Kreislauf könnte eine entscheidende Rolle bei den

protrahierten und relapsierenden Krankheitsverläufen mit ihren kaskadenartig auftretenden

Neuinfektionen spielen. Zusätzlich zu dem postulierten Carriermechanismus wird die

Verteilung des Virus sowie das Replikationsverhalten im Modellorganismus nach

experimenteller Infektion untersucht.

Als Modell zur Untersuchung des IgA Carriermechanismus dienten Mäuse des Stammes

C3H/HEN. Generell lassen sich Mäuse nicht mit HAV infizieren. In Vorarbeiten konnte

anhand der murinen Hepatozytenzellinie NCTC, die dem Mausstamm C3H/HEN entstammt,

gezeigt werden, dass eine Infektion durch freies HAV in diesen Zellen nicht möglich ist, dass

aber eine experimentelle Infektion der Leber durch HAV/IgA-Komplexe über den ASGPR

stattfinden kann(35). D.h. die Mäuse des Stammes C3H/HEN bieten durch Ausschluß einer

Infektion durch noch vorhandenes freies HAV aus der Präparation der HAV/IgA-Komplexe,

12

die Möglichkeit eindeutig eine durch HAV/IgA-Komplexe verursachte Infektion

nachzuweisen, was mit den herkömmlichen Primatenmodellen nicht möglich ist.

Um einen generellen Eindruck der Virusverteilung im Organismus zu erhalten und um

nachzuweisen, ob die HAV/Antikörperkomplexe vor Erreichen der Leber von der Niere aus

dem Blut herausgefiltert werden, wurden zusätzlich zur Leber weitere Gewebe, wie Niere,

Milz, Thymus und Gekröse (Lymphgewebe des Darmbereichs) auf eventuell vorhandenes

Virus und virale Replikation untersucht. Im Mausmodell kann von einer eher geringen

recovery rate des Virus im Gewebe ausgegangen werden, daher war es notwendig ein

hochsensitives HAV Nachweissystem zu entwickeln. Zur Analyse der quantitativen

Verteilung des Virus in den Geweben wurde ein real-time RT PCR System und zur

Untersuchung der Virusreplikation ein real-time basierendes System zum Nachweis und zur

Quantifizierung des viralen (-) Stranges, als Replikationsmarker, entwickelt.

13

2. MATERIAL UND METHODEN

2.1 Material

2.1.1 Versuchstiere

Die Tierversuche wurden unter dem Aktenzeichen 522-27-11/2-0 von der Bremischen

Senatorischen Behörde für Arbeit, Frauen, Gesundheit, Jugend und Soziales (SAFGJS)/

Fachreferat Veterinärwesen genehmigt.

Die für diese Arbeit verwendeten Mäuse stammten von Charles River, Research Models and

Services Germany GmbH, Sulzfeld. Die Tiere hatten freien Zugang zu keimarmem Wasser

und Futter und wurden bis Versuchsbeginn unter pathogenfreien Bedingungen gehalten. Für

die Arbeit wurden männliche C3H/HEN-Mäuse im Alter von 42 – 46 (jugendlich) und 63 - 84

Tagen, wobei die Tiere ab einem Alter von 63 Tagen als erwachsen betrachtet werden,

verwendet.

2.1.2 Virusstämme

Hepatitis A-Virus (HAV) Genotyp IA:

HAV/GBM ein ursprünglich aus Stuhlproben gewonnenes Patientenisolat(44);

Passagierung : HAV GBM FRhK-4 62 FRhK-4(USA)

Hepatitis A-Virus (HAV) Genotyp IB:

HAV/7 als Variante des Stammes HM175(22), passagiert in FRhK-4-Zellen

HAV/PI als Variante des Stammes HM175(12,28), passagiert in FRhK-4-Zellen

Hepatitis A-Virus (HAV) Genotyp III:

HAV/HMH ein aus HAV positivem Frischplasma gewonnenes Patientenisolat(56)

14

2.1.3 Zelllinien

FRhK-4-Zellen: fetale Rhesusaffen Nierenzellen (CBER/FDA, Department of

Virology, Behesda, Maryland, USA)

NCTC Zellen: murine Hepatozyten Zelllinie Klon 1469 (ATCC CCL9.1

Mannassas, VA, USA)

2.1.4 Zellkulturmedien

Wachstumsmedium: Dulbecco´s Eagle´s medium (DMEM) mit

2 mM L-Glutamin

26 mM NaHCO3

100 U/ml Penicillin

100 µg/ml Streptomycin

10 % (v/v) fetales Kälberserumg (FCS)

Erhaltungsmedium: DMEM mit

2 mM L-Glutamin

26 mM NaHCO3

100 U/ml Penicillin

100 µg/ml Streptomycin

1 % (v/v) FCS

2.1.5 Antibiotika und Fungizide

Name Firma

Penicillin [10.000 U/ml] Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Streptomycin [10.000 µg/ml] Sigma-Aldrich, Taufkirchen

15

2.1.6 Synthetische Nukleinsäuren

2.1.6.1 Primer und Sonden

Alle Primer und Sonden wurden von Metabion, Martinsried synthetisiert.

Die Sequenzen für das HAV LC RT-PCR System, sowohl Primer und Sonden für die

spezifische als auch die interne Kontroll PCR und die Sequenzen für die (-) Strang

Nachweise unterliegen der Geheimhaltung und werden in dieser Arbeit nicht veröffentlicht.

Primer und Sonden für die PCR der 18S rRNA

18S RNA forward 5´- ACG GCT ACC ACA TCC AAG GA -3’

18S RNA revers 5´- CCA ATT ACA GGG CCT CGA AA -3`

18S RNA Sonde 5´-FAM- CAG GCG CGC AAA TTA CCC ACT CC -TAMRA-3´

Primer und Sonden für die GAPDH PCR

GAPDH forward 5`- CCT GCA CCA CCA ACT GCT TAG -3´

GAPDH revers 5´- CAG TCT TCT GGG TGG CAG TGA -3´

GAPDH Sonde 5´-FAM-ACA ACT TTG GTA TCG TGG AAG GAC TCA TGA CC-TAMRA-3´

2.1.6.2 Andere

Name Firma

Poly (A) RNA Amersham Biosciences, Uppsala, SWE

1 kb DNA Längenstandard MBI Fermentas, St. Leon-Rot

Marker 23 MBI Fermentas, St. Leon-Rot

2.1.7 Enzyme

Name Firma

Bst DNA Polymerase New England BioLabs®, Frankfurt

rBst DNA Polymerase EPICENTRE® Biotechnologies, Madison

Luna Taq DNA Polymerase Bioline Ltd., London, UK

phi29 DNA Polymerase New England BioLabs®, Frankfurt

16

Platinum® Taq DNA Polymerase Invitrogen, Karlsruhe

TaKaRa HS Taq DNA Polymerase TaKaRa Bio Inc., Madison, USA

T4 DNA Ligase New England BioLabs®, Frankfurt

T4 RNA Ligase 2 New England BioLabs®, Frankfurt

Transcriptor Reversen Transcriptase Roche Diagnostics, Mannheim

Trypsin mit Natrium-EDTA [0,2 g/l] Sigma-Aldrich, Taufkirchen

2.1.8 Sonstige Proteine

Name Firma

Bovines Serum Albumin (BSA) Roche Diagnostics, Mannheim

Fetales Kälberserum (FCS) GIBCO BRL, Gaithersburg, USA

anti-HAV (mouse IgG2a), Klon 7E7 [5 mg/ml] mediagnost, Tübingen

anti-HAV (mouse IgA), Klon 1.193 [5 mg/ml] Stanley M. Lemon, UTMB, Texas, USA

anti-Maus IgG, FITC-markiert [0,5 mg/ml] Kierkegaard & Perry, Gaithersburg

T4 Gene 32 Protein Ambion, Austin, USA

Tth RecA BioHelix, Beverly, USA

2.1.9 Kits

Name Firma

High Pure PCR Purification Kit Roche Diagnostics, Mannheim

LightCycler® - HAV Quantification Kit Roche Diagnostics, Mannheim

MEGAscript® T7 Kit Ambion, Huntingdon, UK

RevertAid H- First Strand cDNA Synthesis MBI Fermentas, St. Leon-Rot

RNeasy® Mini Kit QIAGEN, Hilden

T7 Transcription Kit MBI Fermentas, St. Leon-Rot

QIAamp® DSP Virus Kit QIAGEN, Hilden

QIAamp® Viral RNA Mini Kit QIAGEN, Hilden

QIAquick® PCR Purification Kit QIAGEN, Hilden

QIAquick® Gel Extraction Kit QIAGEN, Hilden

17

2.1.10 Chemikalien

Name Firma

Aceton Fluka, Buchs SG, Schweiz

Agarose (ultra-pure grade) Invitrogen, Karlsruhe

Betaine Fluka, Buchs SG, Schweiz

Calciumchlorid Fluka, Buchs SG, Schweiz

DAPI Sigma-Aldrich, Taufkirchen

DMSO Sigma-Aldrich, Taufkirchen

DMEM Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Dynabeads®MyOne™Streptavidin Dynal Biotech, Oslo

Essigsäure Merck, Darmstadt

Evans Blue Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Ethanol Merck, Darmstadt

Ethidiumbromid Merck, Darmstadt

Isopropanol Merck, Darmstadt

Kaliumdihydrogenphosphat Riedel-de Haen, Seelze

6 x Loading dye MBI Fermentas, St. Leon-Rot

Magnesiumsulfat Sigma-Aldrich, Taufkirchen

2-Mercaptotethanol Fluka, Buchs SG, Schweiz

Methanol Merck, Darmstadt

Natriumchlorid Fluka, Buchs SG, Schweiz

Nuklease-freies Wasser Ambion, Huntingdon, UK

PBS Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Polyethylenglycol Sigma-Aldrich, Taufkirchen

TAE AppliChem, Darmstadt

Triton X-100 Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Tris Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Trypanblau Sigma-Aldrich, Taufkirchen

2.1.11 Puffer und Lösungen

Agarose Gelelektrophorese

1 x TAE 10 x TAE 1:10 verdünnt in Aqua dest.

18

Zellzahlbestimmung

0,4 % (w/v) Trypanblau in 0,81 % (w/v) NaCl/0,06 % (w/v) K2HPO4

Mykoplasmenfärbung

DAPI-Lösung 0,1 µg/ml DAPI in PBS

Methanol/Eisessig 75 % (v/v) Methanol in Eisessig

Indirekte Immunfluoreszenz

Aceton 90 % (v/v) Aceton in PBS

Antikörper anti-HAV (mouse IgG2a) Klon 7E7 1 : 600 in PBS

Antikörper anti-Maus-IgG (goat), FITC-markiert 1 : 80 in PBS

2.1.12 Verbrauchsmaterialien

Name Firma

Combitips® Eppendorf, Hamburg

Glasobjektträger Omnilab, Bremen

LightCycler® Kapillaren Roche Diagnostics, Mannheim

Optical Adhesive Covers Applied Biosystems, Foster City, USA

Pipettenspitzen Biozym, Hess. Oldendorf

PCR-Reaktionsgefäße 0,2 ml Biozym, Hess. Oldendorf

Reaktionsgefäße 1,5 ml und 2 ml Eppendorf, Hamburg

Röhrchen, 15 ml und 50 ml Greiner-Bio One, Frickenhausen

RotorGene® Reaktionsgefäße Corbett Life Science, Sydney, AUS

96-Well Optical reaction plates Applied Biosystems, Foster City, USA

Zell- und Gewebekulturgefäße Nunc, Wiesbaden

19

2.1.13 Geräte

Name Firma

ABI Prism™ 7900HT SDS Applied Biosystems, Foster City, USA

Begasungsbrutschrank Heraeus Sepatech, Osterode

Biofuge pico Heraeus Sepatech, Osterode

Brutschrank Model B 5090 E Heraeus Sepatech, Osterode

Digitalkamera Model 120 Kodak digital science, Rochester, USA

ELISA-Reader Molecular Devices, München

Fluoreszenzmikroskop „Axioskop 2“ Zeiss, Jena

Fuchs-Rosenthal Zählkammer Assistent, Sondheim

Gelelektrophoresekammer Horizon 11.14 GIBCO BRL, Gaithersburg, USA

Lichtmikroskop Wilovert S Hund, Wetzlar

LightCycler® 1.2 und 2.0 Roche Diagnostics, Mannheim

Magnetic Particle Concentrator; Dynal MPC® Dynal Biotech, Oslo, NOR

Mastercycler Model 5333 Eppendorf, Hamburg

Mikrowelle AEG Micromat 16 AEG, Stockholm, SWE

Power-Supply Model 250 Ex GIBCO BRL, Gaithersburg, USA

RotorGene 3000 Corbett Life Science, Sydney, AUS

Thermomixer Model comfort, 2 ml und 1,5 ml Eppendorf, Hamburg

Waage Model PB3002-S Delta Range Mettler Toledo, Giessen

Ultra Turrax T25 basic IKA® Werke, Staufen

UV Photometer BioPhotometer Eppendorf, Hamburg

UV Spectrophotometer SpectronHeliosβ Thermo Electron, Dreieich

UV Transilluminator Model TFX-35M GIBCO BRL, Gaithersburg, USA

Zentrifuge 5415D Eppendorf, Hamburg

Zentrifuge J2-21 Beckman Coulter, Unterschleißheim

Zentrifuge Rotanta 96 RSC Hettich, Tuttlingen

2.1.14 Software

Name Firma

ABI 7900 HT SDS 2.1 Applied Biosystems, Foster City, USA

Chromas Vers. 1.45 Griffith University, Queensland, USA

DNASTAR:MegAlign und EditSeq 5.06 DNASTAR, Madison, USA

EndNote Vers.9.0.0 Thomson Scientific, London, UK

20

GraphicConverter V4.3 Lemke Software, Peine

Kodak ds 1D Vers. 2.0.3 Kodak digital science, Rochester, UK

LightCyclerSoftware Vers. 3 und 4 Roche Diagnostics, Mannheim

MacromediaFreeHandMX Vers. 10.3.9 Adobe Systems, München

MicrosoftExcel 2004 Vers. 11.2 Microsoft, Unterschleißheim

MicrosoftWord 2004 Vers. 11.2 Microsoft, Unterschleißheim

OmniGraffle Pro Vers. 3.2.4 The Omni Group, Seattle, USA

Primer Express Vers. 2.0.0 Applied Biosystems, Foster City, USA

PriProbit Vers. 1.63 Kyoto University, Kyoto, Japan

RotorGene 3000 Software 5.0 und 6.0 Corbett Life Science, Sydney, AUS

SPSS 11 SPSS Inc., Chicago, USA

2.2 Methoden

2.2.1 Kultivierung von Zellen

Bis zur Ausbildung eines konfluenten Zellrasens wurden die FRhK-4 Zellen in

Wachstumsmedium bei 37°C und 5% CO 2 kultiviert. Anschließend wurde auf

Erhaltungsmedium gewechselt, welches 1% FCS enthielt. Nach Bedarf, spätestens jedoch

alle zwei Wochen, wurden die Zellen im Verhältnis 1 : 6 gesplittet. Dazu wurde das Medium

abpipettiert, der Zellrasen gründlich mit Trypsin-EDTA-Lösung gewaschen und anschließend

bis zum Ablösen der Zellen in einem Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung inkubiert. Die

Zellsuspension wurde in Wachstumsmedium aufgenommen und entsprechend ihres

Splitverhältnisses in neue Kulturgefäße gegeben.

2.2.2 Bestimmung der Zellzahl

Für die Zellzahlbestimmung wurden die Zellen abtrypsiniert und im Verhältnis 1 : 2 mit einer

0,2%igen Trypanblaulösung vermischt. Mit Hilfe der Fuchs-Rosenthal Zählkammer wurden

die vitalen Zellen der Suspension ausgezählt und unter Berücksichtigung des Kammerfaktors

und dem entsprechenden Verdünnungsfaktor die Zellzahl pro Milliliter berechnet.

21

2.2.3 Mykoplasmen-Test

Die verwendeten Zellen wurden regelmäßig auf etwaige Kontamination durch Mykoplasmen

untersucht. Dazu wurden die Zellen im Verhältnis 1 : 30 gesplittet und auf Glasobjektträgern

bis zur Zelldichte von 30 – 50% kultiviert. Nach Entfernung des Mediums wurde der

Zellrasen zunächst je einmal mit PBS, PBS/75% Methanol in Eisessig (1 : 1) und 75%

Methanol in Eisessig gewaschen und im Anschluss für 15 min. in eiskaltem

Methanol/Eisessig bei Raumtemperatur fixiert. Nachdem der fixierte Zellrasen mit Wasser

gewaschen wurde, erfolgte die eigentliche Färbung der Mykoplasmen durch 10minütige

Inkubation mit 1 µg/ml DAPI in PBS bei Raumtemperatur und im Dunkeln. Die DAPI-Lösung

wurde entfernt, der Zellrasen erneut mit Wasser gewaschen und mit Eindeckmedium

benetzt. Nachdem ein Deckglas aufgelegt wurde erfolgte die Auswertung am

Fluoreszenzmikroskop.

2.2.4 Herstellung von Viruspools

Zur Virusvermehrung wurden FRhK-4 Zellen in 80 cm2 Kulturflaschen bis zum Erreichen

einer Zelldichte von etwa 80% kultiviert und im Anschluss infiziert. Dazu wurde das

Kulturmedium abgenommen und durch 5 ml eines Infektionsmediums, welches aus

DMEM/1% FCS und der entsprechenden Virussuspension bestand, ersetzt. Die Kulturen

wurde 2 Stunden bei 37°C und 5% CO 2 mit dem Infektionsmedium inkubiert, wobei zur

Vermeidung des Austrocknens des Zellrasens alle 20 Minuten geschwenkt wurde.

Anschließend wurden 15 ml des Erhaltungsmediums DMEM/1% FCS zugegeben und für 24

Stunden bei 37°C und 5% CO 2 kultiviert. Danach folgt ein kompletter Medienwechsel mit

20 ml DMEM/1% FCS und die weitere Kultivierung für 14 Tage. Für die Virusernte wurden

die Kulturen dreimal bei – 80°C eingefroren und wie der aufgetaut. Das Zelllysat wurde in 50

ml Röhrchen überführt und um Virusaggregate zu lösen dreimal 20 sec. mit Ultraschall

behandelt. Anschließend wurden die Zelltrümmer durch 10minütige Zentrifugation bei 3.000

rpm und 4°C sedimentiert. Der das Virus enthaltende Überstand wurde abgenommen,

aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei – 80°C gelagert.

2.2.5 Bestimmung des 50 %-Endpunkttiters (TCID 50/ml)

Zur Bestimmung des Virustiters wurden FRhK-4 Zellen in Mikrotiterplatten bis zur Zelldichte

von 80% kultiviert und anschließend infiziert. Dazu wurden von den zu titrierenden

22

Viruspools (HAV/7, HAV/GBM und HAV/PI) serielle, logarithmische Verdünnungsreihen zur

Basis zehn (10-1 – 10-11) in Erhaltungsmedium hergestellt. Nach Entfernung des

Wachstumsmediums wurde in acht parallelen Ansätzen je 100 µl der jeweiligen

Verdünnungsstufe zu den Zellen gegeben und für zwei Stunden bei 37°C und 5% CO 2

inkubiert. Nach Entfernung der Virusverdünnung folgte ein zweimaliger Waschschritt mit

DMEM/1% FCS bevor zur weiteren Kultivierung bei 37°C und 5% CO2 200 µl

Erhaltungsmedium zugegeben wurde. Die Auswertung erfolgte nach 14 Tagen durch

indirekte Immunfluoreszenz. Dafür wurde das Medium abgenommen und der Zellrasen

einmal mit 100 µl PBS/Kavität gespült. Die Zellen wurden mit 100 µl eiskaltem 90%igem

Aceton in PBS für 20 Minuten bei – 20°C fixiert und anschließend zweimal mit 200 µl PBS

gewaschen. Die Bindung des primären monoklonalen anti-HAV-Antikörpers 7E7 erfolgte für

45 Minuten bei 37°C in einer feuchten Kammer, wobei je Kavität 50 µl der

Antikörperverdünnung (anti-HAV 7E7 in PBS 1 : 600) zugegeben wurden. Nach Entfernung

des primären Antikörpers wurde der Zellrasen dreimal mit je 300 µl PBS gewaschen und es

folgte die Zugabe von 50 µl des sekundären, FITC-markierten anti-Maus-IgG-Antikörpers

(1 : 80 in PBS verdünnt; mit 0,5 µl Evans Blue/ml) und erneute Inkubation für 45 Minuten bei

37°C in einer feuchten Kammer. Der sekundäre Antikö rper wurde entfernt und der Zellrasen

dreimal mit je 300 µl PBS/Kavität gewaschen. Die Auswertung erfolgte durch Begutachtung

unter dem Fluoreszenzmikroskop, wobei eine Kavität als positiv bewertet wurde, sobald

mindestens eine Zelle die für HAV typische granuläre Fluoreszenz zeigte.

Die Bestimmung der 50 % Endpunkttiter (TCID50) erfolgte mittels Kärber Gleichung:

Verd. lg. 5,0100

Verd.jeder aus %)(in Wellsinf. Summe Verd. geringste lgTCID lg 50

×

−−−=−

2.2.6 Isolierung viraler RNA aus zellfreien Medien

Alle Extraktionen viraler RNA aus zellfreien Medien wie z.B. Plasma, Serum oder auch

Zellkulturüberstand wurden mit dem QIAamp Viral RNA Mini Kit oder mit dem QIAamp

DSP Virus Kit nach Herstellerangaben durchgeführt. Das Aufreinigungsvolumen im QIAamp

Viral RNA Mini Kit betrug immer 140 µl, der im Protokoll als optional angegebene

Trocknungsschritt direkt vor der Elution wurde bei jeder Aufreinigung durchgeführt. Das

Elutionsvolumen betrug 60 µl bzw. 80 µl AVE Puffer. In die Aufreinigung mit dem QIAamp

DSP Kit ließen sich 500 µl einsetzen, eluiert wurde dabei in 60 µl AVE Puffer.

23

2.2.7 Photometrische Konzentrationsbestimmung von N ukleinsäuren

Zur photometrischen Konzentrationsbestimmung der Nukleinsäuren wurden 100 µl einer

1 : 50 Verdünnung in Quarzküvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm bei 260 nm, dem

Absorptionsmaximum für DNA/RNA, gegen Wasser gemessen. Eine OD260 (optische Dichte

bei 260 nm) entspricht dabei 40 µg RNA/ml. Zusätzlich kann die Reinheit der RNA durch das

Verhältnis der Absorption von Nukleinsäure (A260) zu Proteinen (A280) bestimmt werden.

Der Quotient A260/A280 sollte bei reiner RNA ≥2,0 sein; kleinere Werte weisen auf eine

Verunreinigung durch Proteine hin.

2.2.8 Real-time RT-PCR System zur Quantifizierung von HAV RNA

Die real-time PCR zur HAV RNA Quantifizierung wurde für die Detektion aus Plasma, Serum

und Gewebeproben auf dem LightCycler 1.2 (Roche Diagnostics, Mannheim) entwickelt.

Die Quantifizierung erfolgt über eine externe Standardreihe, wobei die HAV Menge in

Internationalen Einheiten/Mikroliter (IU/µl) angegeben wird. Jeder PCR Lauf wurde mit

mindestens einer Positivprobe (HAV RNA oder Quantifizierunsstandard) und einer

Negativprobe (Wasser) durchgeführt. Die PCR enthält neben dem spezifischen HAV

Detektionssystem ein heterologes Amplifikationssystem (Interne Kontrolle), welches zur

Überprüfung der Extraktion und Amplifikation dient. Für die RT-PCR werden pro Reaktion zu

13 µl Mastermix 2 µl Magnesiumsolution und 5 µl Probe gegeben. Optional können zur

Überprüfung der Amplifikationsreaktion 0,5 µl RNA der Internen Kontrolle zu jedem PCR-

Ansatz und zur Überprüfung der Extraktion 0,1 µl RNA der Internen Kontrolle

pro µl Elutionsvolumen zur Probe gegeben werden.

2.2.8.1 Primer und Sonden Auswahl

Als Basis für die Auswahl der Primer und der Sonde diente die HAV-Sequenz des Stammes

HM-175 (Acc. No. M14707). Die Primer und die Sonde wurden mit Hilfe der Primer

Express Software im Sequenzbereich des VP1 Proteins des HAV Genoms ausgewählt

(Vers. 1.0; Applied Biosystems) und umfassen eine Amplikonlänge von 90 Basen. Als

Sondensystem wurde eine TaqMan®-Sonde gewählt. Die ausgewählten Primer und die

Sonde wurden mit Hilfe der Software MegAlign™ (DNASTAR, USA) auf die Homologie zu

24

allen bisher bekannten HAV Genotypen überprüft, so dass aufgrund der Auswahl der Primer

und der Sonde eine hohe Spezifität gewährleistet ist.

2.2.8.2 Titration der PCR Komponenten

Die Optimierung der PCR erfolgte in Bezug auf das Temperaturprofil und die Wahl und

Menge der einzelnen Reaktionskomponenten, wie Taq DNA Polymerase, Reverse

Transkriptase, Primer und Sonden, Sondenmarkierung, Magnesium, dNTP. Für jede

Komponente wurde eine Verdünnungsreihe angesetzt und mit der gleichen Menge

Positivmaterial (HAV/7) in der RT-PCR getestet. Es wurden die Konzentrationen ausgewählt,

bei der der Schwellenwert bei geringster Zyklenzahl (CT) überschritten wird, und die Signale

größtmögliche Steigung und höchste Fluoreszenzsignale zeigen.

2.2.8.3 In vitro Transkription zur Herstellung der Quantifizierungs standards

Zur Generierung der Quantifizierungsstandards (QS) wurde ein RT-PCR Lauf mit HAV/7

RNA ohne Interne Kontrolle (IC) durchgeführt, bei dem am 5´-Ende des forward Primer die

T7-Promotor Sequenz gekoppelt war, die so ins Amplifikat integrierte. Das Amplifikat wurde

mit dem High Pure PCR Purification Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) entsprechend den

Herstellerangaben gereinigt. 128 ng des Amplifikates mit dem MEGAscript® T7 Kit (Ambion,

Huntingdon) nach Angaben des Herstellers transkribiert und DNase I verdaut. Das in vitro

Transkript (IVT) wurde mit dem RNeasy® Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) gereinigt und

photometrisch vermessen. Über die Amplikonlänge von 90 Basen und die RNA

Konzentration des IVT´s wurde die Kopienzahl bestimmt. Der Vergleich der IVT

Verdünnungsreihe mit dem Internationalen Standard für HAV RNA NAT Assays (NIBSC

Code 00/560) der Weltgesundheitssorganisation (WHO) ergab, dass zehn Kopien des IVT´s

einer Internationalen Einheit (IU) WHO Standard entsprechen. Als Quantifizierungsstandards

(QS 4 – QS 1) wurden IVT Verdünnungen festgelegt die mit einer, zehn, hundert und

tausend internationalen Einheiten übereinstimmen.

2.2.8.4 Sensitivitätsbestimmung

Unterschieden werden die Sensitivitätsbestimmung unter Berücksichtigung der Aufreinigung

mit dem QIAamp® Viral RNA Mini Kit, welche das Sensitivitätslimit der HAV Detektion

25

bezogen auf einen Milliliter Plasma darstellt, und die Sensitivitätsbestimmung ohne

Aufreinigungsverfahren, bei der sich das Sensitivitätslimit auf die HAV Menge im Mikroliter

Eluat bezieht.

2.2.8.4.1 Sensitivitätsbestimmung unter Berücksicht igung der Aufreinigungsmethode

Zur Bestimmung der Sensitivitätsgrenze der HAV RT-PCR wurde der Internationale

Standard für HAV RNA NAT Assays (NIBSC Code 00/560) in HAV negatives Plasma

gegeben und halblogarithmisch von 571,5 IU/ml bis 0,181 IU/ml verdünnt. Jede

Verdünnungsstufe wurde in 24er Replikaten mit dem QIAamp® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN,

Hilden) nach Herstellerangaben (Aufreinigungsvolumen 140 µl; Elutionsvolumen 80 µl)

aufgereinigt und an drei Tagen unter Verwendung von drei verschiedenen Geräten gleicher

Bauart mit der HAV RT-PCR analysiert. Die Auswertung erfolgte durch eine Probit-Analyse

(PriProbit® Vers. 1.63).

2.2.8.4.2 Sensitivitätsbestimmung unabhängig von de r Aufreinigungsmethode

Zur Bestimmung der Sensitivitätsgrenze der HAV RT-PCR wurde der Internationale

Standard für HAV RNA NAT Assays (NIBSC Code 00/560) mit dem QIAamp® Viral RNA Mini

Kit (QIAGEN, Hilden) nach Herstellerangaben (Aufreinigungsvolumen 140 µl;

Elutionsvolumen 60 µl) aufgereinigt und halblogarithmisch von 1 IU/µl bis nominal

0,000316 IU/µl verdünnt. Die Analyse in der HAV RT-PCR erfolgte in achtfach Replikaten an

drei Tagen unter Verwendung von drei verschiedenen Geräten gleicher Bauart. Die

Auswertung erfolgt durch eine Probit-Analyse (PriProbit Vers. 1.63).

2.2.8.5 Robustheitsuntersuchung

Zur Untersuchung der Robustheit der HAV RT-PCR wurden 30 HAV negative

Plasmaproben mit je 0,39 IU/µl Internationale Standard für HAV RNA NAT Assays (NIBSC

Code 00/560) versetzt, mit dem QIAamp® DSP Virus Kit laut Herstellerangaben aufgereinigt

und mit der HAV RT-PCR analysiert. Neben der HAV spezifischen PCR wurde auf gleiche

Weise die Robustheit der Internen Kontrolle überprüft.

26

2.2.8.6 Spezifitätstest

Zur Untersuchung der Spezifität wurden 30 verschiedene HAV negative Plasmaspenden mit

der HAV RT-PCR analysiert. Zusätzlich wurden verschiedene Erreger auf ihre

Kreuzreaktivität untersucht sowie verschiedene humanpathogene HAV Genotypen getestet.

2.2.8.6.1 Kreuzreaktivitätstest

Für die Testung auf Kreuzreaktivität des HAV RT-PCR Systems wurden folgende Erreger

(siehe Tab. 1) mit dem QIAamp® DSP Virus Kit (QIAGEN, Hilden) aufgereinigt. Während der

Aufreinigung wurde Interne Kontroll RNA in das Probenmaterial gegeben. Die Analyse in der

HAV RT-PCR wurde jeweils in Doppelbestimmung durchgeführt, zusätzlich wurde in jedem

PCR Lauf eine Positivkontrolle (HAV/7 RNA) und eine Negativkontrolle (H2O) mitgeführt.

Tab. 1 : Liste der auf Kreuzreaktivität mit dem HAV RT PCR System untersuchten Erreger Virus Konzentration Ursprung Poliovirus 2 104 Kopien/ml Zellkultur Coxsackievirus A9 107 Kopien/ml Zellkultur Coxsackievirus A16 nicht quantifiziert Zellkultur Coxsackievirus B3 8 x 107 Kopien/ml Zellkultur Coxsackievirus B5 2 x 105 Kopien/ml Zellkultur Echovirus 6 nicht quantifiziert Zellkultur Echovirus 9 108 Kopien/ml Zellkultur Echovirus 11 2 x 105 Kopien/ml Zellkultur Echovirus 22 nicht quantifiziert Zellkultur Echovirus 30 108 Kopien/ml Zellkultur Rhinovirus 1b nicht quantifiziert Zellkultur Enterovirus 71 nicht quantifiziert Zellkultur Hepatitis B Virus 106 IU/ml Plasma Hepatitis C Virus 103 IU/ml Standard ACCURUN 305

(BBI Diagnostics, Boston)

2.2.8.6.2 Detektion aller relevanten Genotypen

Zu den für die humane Diagnostik relevanten Genotypen zählen die Genotypen I bis III und

VII. Von den Genotypen IA, IB und III wurde Zellkulturmaterial der Virusstämme

HAV/GBM (IA), HAV/7 (IB) und HAV/HMH (III) getestet. Da von den Genotypen II und VII

kein echtes Virusmaterial zur Verfügung stand, wurden synthetisch Nukleinsäuren

hergestellt. Basierend auf den Sequenzinformationen aus der Genbank für Genotyp II

(HAV/9F94 Acc. Nr AJ437317) und Genotyp VII (HAV/SLF88 Acc Nr, AY032861) wurde der

Targetbereich in zwei Oligonukleotide unterteilt, wobei die Einteilung so vorgenommen

27

wurde, dass ein 25 Basen langer Überlappungsbereich entstand. In einer

Polymerisationreaktion wurden die beiden Oligonukleotide zu einem doppelsträngigen DNA

Konstrukt vervollständigt. Dazu wurden je 10 pmol der Oligonukleotide (Metabion,

Martinsried), 5 mMol MgSO4 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen), 0,2 mMol dNTP-Mix (Roche

Diagnostics, Mannheim) und 0,25 U Taq Polymerase (TaKaRa, Madison, USA) gemischt

und für 10 min. bei 37°C inkubiert. Die Nukleinsäur efragmente wurden in unterschiedlichen

Verdünnungen in der HAV RT-PCR getestet.

2.2.8.7 Präzision

Zur Bestimmung der Intra-Assay-Variabilität wurden acht Replikate einer Plasmaprobe mit

571,5 IU/ml HAV mit dem QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, Hilden) aufgereinigt und in

einem RT-PCR Lauf getestet. Für die Inter-Assay-Variabilität wurden drei verschiedene RT-

PCR Läufe an drei verschiedenen Geräten und von drei verschiedenen Personen

durchgeführt. Die Inter-Chargen-Variabilität ergibt sich aus der Testung von den gleichen

acht Replikaten mit drei unterschiedlichen Chargen des RT-PCR Mastermix.

2.2.9 PCR zum Nachweis von 18S rRNA und GAPDH RNA

Zur Normalisierung der HAV Menge aus den Geweben wurden diese sowohl auf die

18S rRNA als auch auf die GAPDH RNA Menge der Gewebe bezogen. Dazu wurde

zusätzlich zu der HAV RT-PCR aus jedem Eluat eine PCR zur relativen Quantifizierung der

18S rRNA und der GAPDH RNA durchgeführt. Diese PCRs wurden als two-step PCR

durchgeführt. Zunächst wurden je 5 µl der Eluate aus der Gewebeaufreinigung mittels des

RevertAid® H minus First Strand cDNA Synthesis Kits (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) unter

Verwendung des Random Hexamer Primers nach Herstellerangaben in cDNA

umgeschrieben. Diese cDNA wurde 1 : 100 verdünnt und je 2 µl in die eigentliche PCR

eingesetzt. Sowohl die 18S als auch die GAPDH PCR erfolgten in einem Reaktionsvolumen

von 25 µl bestehend aus PCR Puffer (2 x PCR Master Mix, Applied Biosystems, Foster City),

0,5 U Platinum® Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Karlsruhe), je 10 pmol forward und

reverse Primer und 3 pmol der Taqman Sonde. Die PCR wurde im ABI Prism™ 7900HT

SDS mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt: 10 min Denaturierung (95°C) gefolgt von

45 Zyklen von 15 Sek. Denaturierung und 1 min. Annealing und Elongation bei 55°C.

28

2.2.10 Agarose-Gelelektrophorese

Die Amplifikate wurden durch eine Agarose-Gelelektrophorese in einem Gel mit 2% Agarose

in TAE-Puffer und 0,4 µg/ml Ethidiumbromid analysiert. Dazu wurden 8 µl der Probe mit 2 µl

6 x Ladepuffer vermischt und in die Taschen des Gels gegeben. Zusätzlich wurde als

Längenstandard ein 1 kb DNA-Längenmarker (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) aufgetragen.

Die Auftrennung erfolgte in TAE-Puffer bei konstant 70 V für eine Stunde. Anschließend

wurde das Gel in einem UV-Transilluminator begutachtet und dokumentiert, wobei

besonderes Augenmerk auf die Höhe der Bande, d.h. Länge des Fragments, und die

Bandenanzahl gelegt wurde.

2.2.11 Infektion der Mäuse

Nach 7 Tagen der Eingewöhnung wurden die C3H/HEN-Mäuse gewogen und

versuchsabhängig mit 1 ml Zellkulturmedium (als Negativkontrolle), HAV/PI, HAV/anti-HAV

IgA- bzw. HAV/anti-HAV IgG-Komplexen intraperitoneal, intravenös oder oral, mittels

Magensonde, inokuliert. Die Inokula mit den Immunkomplexen enthielten die gleiche HAV

Konzentration wie das Inokula des nicht komplexierten HAV/PI, so dass jeder Maus

unabhängig vom Inokula die gleiche Virusmenge appliziert wurde. Vor und nach der

Inokulation wurden die Mäuse einer visuellen Vitalitätskontrolle unterzogen und bis zur

Sektion gehalten.

2.2.12 Herstellung der Inokula zur Infektion

Zur Herstellung der Inokula wurde zunächst ein in FRhK-4 generierter Viruspool (HAV/PI)

austitriert. Alle Inokula wurden aus diesem Stock mit 1 x 107 TCID50/ml hergestellt, dabei

wurde das nicht komplexierte Virus 1 : 10 in DMEM verdünnt eingesetzt. Zur Herstellung der

Immunkomplexe wurden HAV/PI 1 : 10 verdünnt mit anti-HAV IgG [5 mg/ml] (mediagnost,

Tübingen) 1 : 250 bzw. anti-HAV IgA [8,8 mg/ml] 1 : 440 verdünnt in DMEM angesetzt und

für 3 h bei RT geschwenkt. Anschließend wurden die Komplexe aliquotiert und bis zur

Verwendung bei -70°C eingefroren. Zur Überprüfung d er Antikörperbindung wurde von

jedem Aliquot ein Röhrchen aufgetaut und im Vergleich mit dem HAV/PI Inokula in FRhK-4

Zellen austitriert. Die Komplexe wurden für die Infektionsversuche eingesetzt, sofern die

Titration eine Reduktion der Infektiösität > 99% im Vergleich zur TCID50 des HAV/PI zeigte.

29

2.2.13 Immunisierung der Mäuse

Die Immunisierung der Mäuse erfolgte durch subkutane und intraperitoneale Inokulation der

Mäuse mit jeweils 0,5 ml HAV/PI [1 x 107 TCID50/ml] 1:10 verdünnt in PBS. Die

Immunisierung erfolgte dreimal, zu Beginn des Versuchs (t0) nach einem und nach drei

Monaten. Zur Kontrolle des Immunstatus wurde den Mäusen zu den Zeitpunkten t0, nach

einem, drei und sechs Monaten durch Punktion des retrobulbären Venenplexus Blut

entnommen und auf anti-HAV IgG untersucht.

2.2.14 Blutentnahme aus dem retrobulbären Venenplex us

Zur Blutentnahme wurden die Tiere mit CO2 narkotisiert. Während der Narkose wurde eine

Hämatokritkapillare im Augenwinkel eingeführt und das Venengeflecht hinter dem Augapfel

angestochen. Das gesammelte Blut wurde zur Agglutination für 30 Min. bei 37°C inkubiert.

Nach 10minütiger Zentrifugation bei 6.000 rpm wurde das Serum abgenommen und bis zur

anti-HAV IgG Titerbestimmung bei -20°C gelagert.

2.2.15 Bestimmung des anti-HAV IgG Status der Mäuse

Zur Überprüfung der Immunisierung wurde das Serum der Tiere auf anti-HAV IgG Antikörper

untersucht. Die Antikörperbestimmung wurde mit dem anti-HAV ELISA Kit der mediagnost®,

Tübingen durchgeführt. Die Messung erfolgte bei 450 nm im ELISA-Reader (Molecular

Devices, München). Sowohl Durchführung als auch Auswertung erfolgte nach Angaben des

Herstellers. Dabei sind Proben deren Extinktion größer ist als der cut-off als anti-HAV IgG

negativ und Proben, deren Extinktion kleiner ist als der cut-off als anti-HAV IgG positiv zu

bewerten, wobei gilt je niedriger der Extinktionswert desto höher der anti-HAV IgG Titer. Der

cut-off wird nach folgender Formel berechnet:

( )2

off-cut KontrollepositiveExtinktionKontrollenegativeExtinktion +=

2.2.16 HAV Neutralisation durch Mausseren

Zur Überprüfung der Immunantwort in den Seren der Mäuse wurde die HAV

Neutralisationsfähigkeit der zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Immunisierung

entnommen Seren analysiert. Zur Bildung der HAV Immunkomplexe wurden die Mausseren

30

1:100 verdünnt und in die Komplexbildung (siehe 2.2.12) eingesetzt. FRhK-4 Zellen wurden

in 6-well-Platten ausgesäht und bei einer Zelldichte von 80% mit 500 µl des jeweiligen

Inokula infiziert. Direkt nach der Infektion sowie nach 7 Tagen Inkubation bei 37°C und

5% CO2 erfolgte die Analyse der Zellen. Dafür wurde das Zellkulturmedium abgenommen,

die Zellen abtrypsiniert und mittels Zentrifugation pelletiert. Die RNA Extraktion erfolgte nach

Angaben des Herstellers mit dem RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden). Die Nukleinsäure

wurde bis zur letzten Probenahme bei – 80°C gelager t, anschließend wurde sie auf den

HAV, 18S und GAPDH-Gehalt sowie die gesamte Nukleinsäuremenge untersucht.

2.2.17 Sektion der Mäuse

Die Mäuse wurden mit CO2 narkotisiert und während der Bewusstlosigkeit dekapitiert. Das

austretende Blut wurde direkt aufgefangen und bis zur weiteren Bearbeitung bei - 80°C

eingefroren. Anschließend wurden die Organe entnommen, gewogen und ebenfalls bis zur

Bearbeitung bei – 80°C gelagert.

2.2.18 Isolierung der Nukleinsäure aus den Mausgewe ben

Die Aufreinigung aller Gewebe sowie des Blutes erfolgte nach Herstellerangaben mit dem

RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden). Um eine Veränderung des Genexpressionsmusters und

der RNA Menge zu verhindern wurde besonders darauf geachtet, dass Gewebe und Blut bis

zur Zugabe des Lysepuffers RLT gefroren blieben. Das Elutionsvolumen betrug bei allen

Geweben 100 µl, bei Blut 50 µl AVE Puffer. Die Gewebe wurden in 15 ml Röhrchen

umgefüllt und entsprechend ihres Gewichtes (600 µl RLT pro 30 mg Gewebe) wurde

Lysepuffer RLT zugegeben. Gewebe, die über 50 mg wogen, in der Regel Milz, Leber und

Niere wurden in gefrorenem Zustand mit dem Skalpell halbiert, beide Hälften gewogen und

in zwei Durchgängen aufgereinigt. Das Gewebe/Lysepuffer Gemisch wurde für ca. 10 sek.

mit dem Ultra Turrax (IKA Werke, Staufen) homogenisiert. 600 µl dieses Homogenisates

wurde weiter laut Herstellerangaben aufgereinigt, war mehr Homogenisat vorhanden, wurde

dieses für evtl. Nachtestungen bei - 20°C eingelage rt. Von dem gefrorenen Vollblut wurden

aufgrund der geringen Nukleinsäuremenge 100 mg entnommen, mit 600 µl RLT versetzt,

homogenisiert und entsprechend den anderen Geweben weiter aufgereinigt.

31

2.2.19 Neutralisation der anti-HAV/IgA-Komplexe in vitro

Zur Untersuchung der IgA-Verdrängung aus den Immunkomplexen wurden zunächst NCTC

Zellen in 6-well-Platten ausgesäht und bei einer Zelldichte von 80% mit 500 µl des jeweiligen

Inokula infiziert. Für diesen Versuch wurden die Immunkomplexe wie in 2.2.12 beschrieben

frisch angesetzt, wobei vor der Infektion 10 mM CaCl2 zum Inokula gegeben wurde. Nach

2stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Zellen zw eimal mit DMEM gewaschen, 2 ml

DMEM/1% FCS wurde aufgebracht und die Zellen wurden bis zur Probenahme bei 37°C und

5% CO2 inkubiert. Die erste Probennahme erfolgte direkt nach der 2stündigen Inkubation, die

weiteren nach einem und zwei Tagen. Dazu wurde das Zellkulturmedium abgenommen, die

Zellen wurden abtrypsiniert und mittels Zentrifugation pelletiert. Die RNA Extraktion erfolgte

nach Angaben des Herstellers mit dem RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden). Die

Nukleinsäure wurde bis zur letzten Probenahme bei – 80°C gelagert, anschließend wurde sie

auf den HAV, 18S und GAPDH-Gehalt sowie die Nukleinsäuremenge untersucht.

2.2.20 Herstellung strangspezifischer Kontrolltrans kripte

Zur strangspezifischen Quantifizierung wurden Transkripte in der jeweiligen Orientierung

hergestellt. Dabei wurde besonders darauf geachtet, dass diese keine DNA enthielten. Dazu

wurde ein RT-PCR Lauf mit HAV/7 RNA ohne Interne Kontrolle durchgeführt. Für die

Herstellung von (+) Strang orientierten Quantifizierungsstandards wurde ein forward Primer

eingesetzt, der am 5´-Ende eine Biotinmarkierung und eine T7-Promotor Sequenz enthielt,

die auf diesem Weg in das PCR Produkt integriert wurden. Für die Herstellung von (-) Strang

orientierten Quantifizierungsstandards wurde der revers Primer entsprechend modifiziert

eingesetzt. Die biotinylierte DNA aus der PCR wurde an Streptavidin gecoatete Beads

(Dynabeads®MyOne™Streptavidin; Dynal Biotech, Oslo) gebunden (lt. Herstellerangaben)

und mit dem MEGAscript® T7 Kit (Ambion, Huntingdon) nach Angaben des Herstellers

transkribiert. Nach vierstündiger Transkription wurden die Beads durch den Magnetic Particle

Concentrators (Dynal MPC®) aus der Lösung entfernt. Die Transkripte wurden DNase I

verdaut (MEGAscript® T7 Kit; Ambion, Huntingdon) und im Anschluss mit dem RNeasy® Mini

Kit (QIAGEN, Hilden) gereinigt und photometrisch vermessen. Über die Transkriptlänge von

90 Basen und die Konzentration wurde die Kopienzahl bestimmt. Zusätzlich wurden die

einzelnen Stränge mit der HAV RT-PCR quantifiziert, so dass eine Angabe in Internationalen

Einheiten (IU) auch für die spezifischen Stränge erfolgen konnte.

32

Abb. 2: Schematische Darstellung der strangspezifischen Detektion mittels Padlock ProbeSystem und Rolling Circle Amplifikation. A) durch Hybridisierung der Oligonukleotide und anschließender Ligation wird der Nukleotidring generiert. B) der geschlossene Ring wird im Rolling Circle System durch Primer RCA_1 vermehrt, durch einen zweiten Primer (RCA_2) wird der Doppelstrang generiert. Aufgrund der strand displacement Polymerasen kommt es zur hyperbranched Amplifikation, so dass Amplifikate entstehen, die unterschiedlich viele doppelsträngige Wiederholungen des Oligonukleotidringes entsprechen. Das eigentliche Detektionssignal wird durch die Bindung der Sonde (HAV MGB) an die Amplifikate generiert.

33

2.2.21 (-) Strang Nachweis mittels Rolling Circle Amplifikation

Für die Entwicklung einer PCR unabhängigen Methode zur Detektion des HAV (-) Stranges

wurde das Prinzip der Rolling Circle Amplifikation gewählt. Dieses basiert auf der linearen

Amplifikation eines geschlossenen Nukleotidringes mit Hilfe eines einzigen Primers und einer

Strand-Displacement Polymerase. Die Zugabe eines zweiten Primers (revers Primer) führt

zur hyperbranched Amplifikation und damit zu größerer Ausbeute. Ähnlich der real-time PCR

wird das Signal durch die fluoreszenzmarkierte Sonde generiert. Für die Spezifität des

Systems ist die Generierung des Ringes verantwortlich. Der Ring wird durch Hybridisierung

und Ligation eines bzw. mehrerer Oligonukleotide an das Target erzeugt, so dass die

Amplifikation und damit die Detektion nur bei erfolgreicher Ligation stattfinden. Zur

Entwicklung des (-) Strang Nachweises wurden verschiedene Oligonukleotidsysteme

konstruiert und auf ihre Eignung hin untersucht. Die Enden der Padlock

Probe/Oligonukleotide werden durch Ligation miteinander verbunden, so dass sich ein

geschlossener Ring bildet. Dieser Ring bildet die Grundlage für die Rolling Circle

Amplifikation und ermöglicht durch Einbau einer Sonde die real-time Detektion (Abb.2). Die

Bildung des Ringes wurde durch eine einzelne Padlock Probe, oder aber auch durch drei

kurze Oligonukleotide, von denen zwei (H1 und H2) wie die Padlock Probe ans Target

binden und das dritte (H3) diese beiden Oligonukleotide verbindet, generiert.

2.2.21.1 Oligonukleotidsysteme

Die Ligation erfolgte in einem 10 µl Ansatz mit 5 U T4 RNA Ligase 2 (New England Biolabs,

Frankfurt) und 40 U T4 DNA Ligase (New England Biolabs, Frankfurt), 1 x T4 Ligase Puffer

(New England Biolabs, Frankfurt) sowie je 0,0005 pmol der Oligonukleotide H1 und H2 und

0,5 pmol des Olgionukleotids H3 mit 5 µl Targetmaterial im Mastercycler® (Eppendorf,

Hamburg) für 1 h bei 37°C. 5 µl dieses Ligationsans atzes wurden in die Rolling Circle

Amplifikation eingesetzt und für ca. 1 - 1,5 h bei 61°C im RotorGene ® 3000 (Corbett Life

Science, Sydney) isothermal amplifiziert. Der Amplifikationsansatz besteht aus 24 U BST

(New England Biolabs, Frankfurt) und 1 U rBST Polymerase (EPICENTRE®, Madison), 1 x

Puffer, 0,25 mM dNTP-Mix (Roche Diagnostics, Mannheim), je 10 pmol forward und revers

Primer und 4,5 pmol der Sonde sowie 10 µg BSA (Roche Diagnostics, Mannheim) in einem

Endvolumen von 20 µl.

34

Es wurden vier verschiedene Oligonukleotidsysteme zur Bildung des Amplifikationsringes

getestet. Die unterschiedlichen Systeme sind in Abb. 3 schematisch dargestellt. Das Padlock

Probe System bildet den für die Amplifikation notwendigen Ring durch einfache

Hybridisierung der Oligonukleotidenden (siehe Abb. 3 A) an das Target. In diesem System

wurden Oligonukleotide verschiedener Länge getestet, deren Enden direkt aneinander

anschließen, so dass eine Ligationssite den Ringschluss ermöglicht. Das 2-Oligosystem

(siehe Abb. 3 B) enthält eine lange Padlock Probe, die mit ihren Enden ans Target

hybridisiert, sowie ein kurzes Oligonukleotid, welches zwischen den Enden der Padlock

Probe hybridisiert und diese durch Ligation verbindet. In diesem System sind zwei

Ligationsereignisse nötig um den Ring zu schließen. Das 3-Oligosystem (siehe Abb. 3 C)

enthält zwei Oligonukleotide, die mit je einem Ende ans Target binden und ein drittes

Oligonukleotid, welches an die anderen Enden der ersten beiden Oligonukleotide

hybridisiert. Auch in diesem System sind zwei Ligationsereignisse nötig. Das 4. System

(siehe Abb. 3 D) basiert auf dem 3-Oligosystem, jedoch ist eines der an das Target bindende

Abb. 3: Schematische Darstellung der Oligonukleotidsysteme. A) Padlock Probe System: die Enden der Padlock Probe hybridisieren an das Target, wobei die Enden direkt nebeneinander liegen. Durch Ligation wird dieser Nick und damit der Ring geschlossen. B) 2-Oligosystem: Die Enden der Padlock Probe hybridisieren in der Form an das Target, dass ein Gap frei bleibt. In dieses Gap bindet ein kleineres Oligonukleotid, zwischen den Enden der Padlock Probe und des Oligonukleotids ist keine Base frei. Es sind zwei Ligationsereignisse erforderlich um den Ring zu schließen. C) 3-Oligosystem: Der Ring wird aus zwei Oligonukleotiden (H1 und H2) gebildet, von denen ein Ende an das Target, das andere Ende an ein drittes Oligonukleotid (H3) bindet. Der Ringschluss erfolgt über Ligation der beiden Nicks. D) 3-Oligosystem-RNA: Das Oligonukleotid H2 ist in diesem System eine RNA/DNA Chimäre, bei dem das 3´-Ende des Moleküls aus Ribonukleotiden besteht. Besteht das Target aus RNA, so wird durch diese Kombination die Ligation des Nicks zwischen H1 und H2 erleichtert.

35

Oligonukleotid eine RNA/DNA Chimäre. Sowohl die Ligations- als auch die

Amplifikationsreaktionen wurden optimiert und auf ihre Eignung überprüft.

2.2.21.2 Sequenzierung

Zur Sequenzierung wurden die Proben zunächst in einem 2%igen Agarosegel

elektrophoretisch aufgetrennt, die zu sequenzierenden Banden ausgeschnitten und in ein

2 ml Gefäß überführt. Die Isolierung der Nukleinsäure aus dem Gel erfolgte mit dem

QIAquick® Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden) nach Angaben des Herstellers. Im Anschluss

wurde die Konzentration der gewonnenen Nukleinsäure photometrisch bestimmt. Die

eigentliche Sequenzierung der Proben erfolgte durch den Sequenzierservice der Fa. GATC,

Konstanz.

2.2.21.3 Optimierung der Ligationsbedingungen

Zur Optimierung der Ligationsreaktion wurden zunächst verschiedene Ligasen bzw. Ligase-

Kombinationen getestet. Eingesetzt wurden T4 DNA Ligase, Taq DNA Ligase, E. coli DNA

Ligase und T4 RNA Ligase 2 (New England Biolabs, Frankfurt). Ligasemenge, -puffer

Ligationsdauer und –temperatur wurden entsprechend den empfohlenen Herstellerangaben

gewählt. Der Einsatz der Oligonukleotidmenge wurde durch eine entsprechende

Verdünnungsreihe bei gleicher Menge Positivmaterial bestimmt. Bei den Systemen mit

mehreren Oligonukleotiden wurde eine Kreuztitration durchgeführt. So dass jede

Mengenkombination der Oligonukleotide ausgetestet wurde. Der Einfluss der Additive PEG

(Sigma-Aldrich, Taufkirchen), NaCl (Fluka, Buchs SG, Schweiz) und DMSO (Sigma-Aldrich,

Taufkirchen) sowie der Proteine T4 Gene 32 Protein (Ambion, Austin), Tth recA (BioHelix,

Beverly) und SSBP (Sigma-Aldrich, Taufkirchen) wurde ebenfalls getestet. Für jedes dieser

Additive und der Proteine wurde eine Verdünnungsreihe angesetzt und mit der gleichen

Menge Target in die Ligation eingesetzt. Als Target wurde dabei jeweils synthetisches (-)

Strang Fragment oder IVT sowie als Negativkontrolle Wasser eingesetzt. Je 5 µl der

Ligationsreaktion wurden in die Amplifikation gegeben. Die Komponenten, bei denen im

Vergleich zu einem Ansatz ohne entsprechende Zugabe, das positive Signal bei früherer

Zyklenzahl (CT) messbar war, wurden in der entsprechenden Konzentration ausgewählt;

kam das Signal zu einer späteren Zyklenzahl (CT) als im Vergleichsansatz, wurde die

Komponente nicht verwendet.

36

2.2.21.4 Optimierung der Amplifikationsbedingungen

Die Optimierung der isothermalen Amplifikation erfolgte in Bezug auf die Wahl der

Polymerasen, Primer- und Sondenkonzentration, Magnesium Konzentration, dNTP

Konzentration und Auswahl der Additive Betaine und DMSO. Ausgetestet wurden die strand

displacement Polymerasen phi29 (New England BioLabs®, Frankfurt), Bst (New England

BioLabs®, Frankfurt) und rBst (EPICENTRE®, Madison) sowie eine Kombination dieser

beiden. Zusätzlich wurde der Einsatz der Transcriptor® Reversen Transkriptase (Roche

Diagnostics, Mannheim) getestet. Für jede Komponente wurde eine Verdünnungsreihe

angesetzt und mit der gleichen Ligationsreaktion getestet. Es wurden die Konzentrationen

ausgewählt, bei der der Schwellenwert bei geringster Zyklenzahl überschritten wird, und die

Signale größtmögliche Steigung und höchste Fluoreszenzsignale zeigen.

2.2.21.5 Sensitivitätsbestimmung

Zur Bestimmung der Sensitivitätsgrenze des Strangspezifischen Nachweises mittels Padlock

Probe und Rolling Circle Amplifikation wurden (+) bzw. (–) Strang DNA und RNA Fragmente

logarithmisch von 1 fmol/µl bis nominal 10 zmol/µl sowie in vitro transkribierte RNA von

17 fmol/µl bis 170 zmol/µl verdünnt. Die Analyse durch Ligation und Rolling Circle

Amplifikation erfolgte in vierfach Replikaten. Ausgewertet wurden die Daten durch eine

Probit-Analyse (PriProbit® Vers. 1.63).

2.2.21.6 Spezifitätstest

Zur Untersuchung der Strangspezifität wurden RNA Fragmente bzw. in vitro Transkripte in

komplementärer Orientierung in hohen Konzentrationen (1 fmol/µl und 100 amol/µl) getestet.

2.2.22 (-) Strang Nachweis mittels Box-PCR

Der (-) Strang Nachweis mittels Box-PCR basiert wie Abb. 4 zeigt auf zwei einzelnen

Schritten: dem Einbau der Box, einer spezifischen HAV unabhängigen Sequenz, während

der Erststrang-Synthese und der anschließenden PCR, die auf dieser Box basiert. Die

Strangspezifität wird durch den Einsatz eines Primers, der die eingebaute Box erkennt, und

37

einer TaqMan®-Sonde gewährleistet. Durch den Einsatz dieser Sonde kommt es nur zum

Signal, wenn diese abgebaut wird. Eine einfache Sondenbindung ist nicht ausreichend.

Zwischen Erststrang Synthese und PCR erfolgt die Reinigung der Erststränge um die

Reverse Transkriptase sowie überschüssige Box-Primer zu entfernen.

2.2.22.1 Erststrang Synthese mit Einbau der Box

Zum Einbau der Boxsequenz in den Erststrang wurde das RevertAid® H minus First Strand

cDNA Synthesis Kit verwendet (MBI Fermentas, St. Leon-Rot). Dabei wurden 5 µl Probe

unabhängig von der DNA bzw. RNA Menge mit 10 pmol des forward Primers (BOX_HAV for)

in einem Volumen von 12 µl gemischt. Der forward Primer bindet mit dem 3´Ende an den

HAV (–) Strang und enthält am 5´Ende die spezifische Boxsequenz. Nach 5minütiger

Inkubation bei 70°C und anschließendem Abkühlen auf Eis wurden 7 µl Reaktionsmix

bestehend aus 1 x Transkriptionspuffer und 1 mM dNTP-Mix zugegeben. Nach 5 Minuten bei

37°C werden 200 U RevertAid ® H- Reverse Transkriptase zugegeben und für 60 Minuten bei

42°C inkubiert. Die Transkription wird durch 10minü tige Inkubation bei 70°C gestoppt.

Abb. 4: Schematische Darstellung des (-) Strang Nachweises mittels Box-PCR. A) Während der Erststrang Synthese wird durch den HAV (-) Strang spezifischen Primer eine HAV unspezifische Sequenz (Box) in die cDNA eingebaut. Die RNA wird verdaut und die Nukleinsäure vor Einsatz in die PCR durch Aufreinigung von Primern, Nukleotiden und Enzymen befreit. B) Die PCR erfolgt mit einem HAV spezifischen Primer (F1) und einem Primer (R1) der an die Sequenz komplementär zur eingebauten Box bindet. Die Sonde (TaqMan®-Sonde) gibt ein Signal ab, wenn sie durch die Polymerase abgebaut wird, d.h. wenn der Box-spezifische Primer gebunden hat und die Amplifikation stattfindet.

38

2.2.22.2 RNA Verdau

Um die RNA Templates aus der Erststrang Synthese zu entfernen wurde ein RNAse H

Verdau durchgeführt. Dafür wurde jeweils 1 µl RNAse H (New England BioLabs®, Frankfurt)

zu der cDNA gegeben und für 30 Minuten bei 37°C ink ubiert.

2.2.22.3 Aufreinigung des Erststranges

Die Aufreinigung des Erststranges erfolgte mit Hilfe des QIAamp® Viral RNA Mini Kits

(QIAGEN, Hilden). Die 20 µl cDNA aus der Erststrang-Synthese wurden mit Nuklease freiem

Wasser (Ambion, Huntingdon) auf 140 µl aufgefüllt, 560 µl Lysepuffer AVL und 560 µl

Ethanol (Merck, Darmstadt) wurden zugegeben und gemischt. Die Lösung wurde auf die

Säule gegeben und für 15 s bei 8.000 rpm zentrifugiert, das Filtrat wurde verworfen. Die

Säulenmembran wurde zunächst mit 500 µl Puffer AW1 (15 s 8.000 rpm) und dann mit

500 µl AW 2 (3 min. 14.000 rpm) gewaschen. Nachdem die Membran für 10 min. bei

14.000 rpm getrocknet wurde konnte die cDNA eluiert werden. Dazu wurden 20 µl AVE auf

die Membran aufgebracht, wobei zwingend darauf geachtet wurde, dass keinerlei Flüssigkeit

am Rand der Säule haften blieb. Die Elution erfolgte durch einminütige Zentrifugation bei

14.000 rpm. Das Eluat wurde bis zur weiteren Analyse bei – 20°C aufbewahrt.

2.2.22.4 Real-time PCR System zur Quantifizierung des HAV (-) Strange s

Das real-time PCR System zur HAV (-) Strang Quantifizierung wurde auf dem LightCycler®

1.2 (Roche Diagnostics, Mannheim) entwickelt. In dieser PCR ist nur der revers Primer HAV

spezifisch. Der forward Primer bindet an die eingebaute Box und ermöglicht damit den

strangspezifischen Nachweis. Die Quantifizierung erfolgt über eine externe Standardreihe,

wobei die HAV (–) Strang Menge in IU/µl angegeben wird. Jeder PCR Lauf wurde mit

mindestens einer Positivprobe [HAV (–) Strang IVT] und einer Negativprobe (Wasser)

durchgeführt. Alle Proben durchliefen vor Einsatz in der PCR die Erststrangsynthese und

Aufreinigung. Die PCR wurde im Endvolumen von 20 µl durchgeführt, wobei sich dieses aus

5 µl Probe und 15 µl Reaktionmix zusammensetzte. Im Reaktionsmix enthalten sind je

10 pmol forward und revers Primer, 3 pmol Taqman® Sonde, 10 µg BSA (Roche

Diagnostics, Mannheim), 1 x PCR Puffer (QIAGEN, Hilden), 0,5 mM dNTP-Mix (Roche

Diagnostics, Mannheim), 5 mM MgSO4, 1,25 U Takara HS Taq DNA Polymerase (Takara

39

Bio USA, Madison) und 0,5 U Luna Taq DNA Polymerase (Bioline, London). Der

Temperaturverlauf dieser PCR ist folgendermaßen: Nach einer Initialen Denaturierung für

15 Sekunden bei 95°C erfolgten 50 Zyklen mit 1 sek. 95°C, 20 sek. Annealing bei 55°C und

15 Sek. Extension bei 72°C. Im Anschluss wurden die Ansätze auf 40°C für 30 sek.

heruntergekühlt.

2.2.22.5 Sensitivitätsbestimmung

Zur Bestimmung der Sensitivitätsgrenze des strangspezifischen Nachweises mittels Box-

PCR wurden (+) bzw. (–) Strang orientierte in vitro Transkripte logarithmisch verdünnt und in

vierfach Replikaten analysiert. Die (-) Strang IVT Verdünnungsreihe wurde von 4 x 102 bis

nominell 4 x 10-3 IU/µl, die der (+) Strang IVT von 1 x 103 bis nominell 1 x 10-4 IU/µl erstellt.

Ausgewertet wurden die Daten durch eine Probit-Analyse (PriProbit Vers. 1.63).

2.2.22.6 Spezifitätstest

Zur Untersuchung der Strangspezifität wurden in vitro Transkripte in komplementärer

Orientierung in hohen Konzentrationen getestet und deren Einfluss auf die Quantifizierung

untersucht.

2.2.22.6.1 Detektion des Komplementärstranges

Zur Untersuchung der Spezifität, bzw. zur Bestimmung des Detektionslimits des

Komplementärstranges wurden (+) bzw. (-) Strang in vitro Transkripte logarithmisch verdünnt

[(+) Strang: 1 x 106 – 1 x 101 IU/µl; (-) Strang: 4 x 105 – 4 x 100 IU/µl] und in achtfach

Replikaten in dem entsprechenden Nachweis getestet. D.h. die Verdünnungsreihe der (+)

Strang IVT wurde im (-) Strang Nachweis, die der (-) Strang IVT im (+) Strang Nachweis

untersucht. Die Auswertung erfolgte durch eine Probit-Analyse (PriProbit® Vers. 1.63).

2.2.22.6.2 Untersuchung der linearen Quantifizierun g

Zur Untersuchung des Einflusses von (+) Strang auf die Quantifizierung des (-) Stranges

wurden zu jeder Verdünnungsstufe einer (–) Strang IVT Verdünnung (6 Stufen von 4 x 100 –

40

4 x 105 IU/µl) unterschiedliche Mengen an (+) Strang IVT (0 - 1 x 106 IU/µl) gegeben. Die so

präparierten Proben wurden im (-) Strang Nachweis quantifiziert und der erhaltene Wert mit

dem tatsächlich eingesetzten Material verglichen.

2.2.23 Aufnahme einer HAV Wachstumskurve

Zur Aufnahme der Wachstumskurve wurden FRhK-4 Zellen in 6 cm Zellkulturschalen bis zu

einer Dichte von 80% kultiviert und mit einer MOI 1 mit HAV/PI infiziert. Es wurden 35

Schalen infiziert, wobei die erste Schale direkt nach der Infektion geerntet wurde. Dazu

wurde der Überstand entfernt und der Zellrasen zweimal mit 0,5 ml Trypsin gewaschen. Die

Zellen wurden abtrypsiniert und die Zellzahl bestimmt. Anschließend wurden die Zellen

pelletiert und die Nukleinsäure mit dem RNeasy® Mini Kit extrahiert. Aus der gereinigten

Nukleinsäure wurde die HAV RNA und HAV (-) Strang RNA Menge bestimmt und in Bezug

zur Zellzahl gesetzt. Die weiteren Probenahmen erfolgten alle 12 Stunden bis alle Schalen

verarbeitet waren.

41

3. ERGEBNISSE

3.1 Entwicklung eines real-time RT-PCR Systems zum Nachweis

und zur Quantifizierung des Hepatitis A-Virus

Zur Untersuchung ob HAV durch einen IgA vermittelten Carriermechanismus zur Leber

gelangt und wie sich das Virus im Organismus auf die Organe verteilt wurde ein real-time

RT-PCR System zum Nachweis und zur Quantifizierung des Hepatits A-Virus entwickelt,

welches es ermöglicht bereits geringste HAV RNA Mengen in den Geweben der Mäuse

nachzuweisen. Das real-time RT-PCR System wurde für die Anwendung auf dem

LightCycler® 1.2 Instrument (Roche, Diagnostics) konzipiert. Das System besteht aus zwei

Amplifikationssystemen. Einem Primer- und Sondensystem zur Amplifikation und Detektion

eines 90 Basen langen HAV spezifischen Sequenzbereichs innerhalb der VP1 Region des

Genoms. Sowie einem zweiten Primer- und Sondensystem zur Amplifikation und Detektion

einer sogenannten Internen Kontrolle (IC). Diese Interne Kontrolle kann als

Aufreinigungskontrolle in die Nukleinsäureextraktionsprozedur oder aber als

Inhibitionskontrolle direkt in den RT-PCR Ansatz gegeben werden. Die HAV Quantifizierung

erfolgt über eine Standardreihe von vier Quantifizierungsstandards in den Konzentrationen

1000, 100, 10 und 1 IU/µl. Dazu wurde HAV PCR Produkt in vitro transkribiert, photometrisch

quantifiziert und in Kopien/µl umgerechnet. Vergleichsläufe mit dem Internationalen WHO

Standard (NIBSC Code 00/0560) ergaben, dass eine Internationale Einheit 10 Kopien des in

vitro Transkriptes entsprechen. Die IVT´s wurden entsprechend den oben angegebenen

Konzentrationen eingestellt.

3.1.1 Validierung des HAV real-time RT-PCR Systems

Zur Validierung des HAV RT-PCR Systems wurden verschiedene Leistungsdaten wie

Sensitivität, Spezifität und Robustheit erhoben. Die Sensitivitätslimits wurden durch Probit-

Analyse ermittelt. Unter Berücksichtigung der Aufreinigung mit dem QIAamp® Viral RNA Mini

Kit (QIAGEN, Hilden) beträgt das Sensitivitätslimit 183,02 IU/ml (p ≤ 0,05). D.h. eine Probe

die 183 IU HAV/ml enthält wird mit einer Wahrscheinlichkeit von 95% als positiv detektiert.

Das Sensitivitätslimit bezogen auf das Eluat der Aufreinigung, d.h. ohne Berücksichtigung

der Aufreinigungsprozedur liegt bei 0,13 IU/µl.

Durch Untersuchungen der Spezifität des HAV RT-PCR Systems wurde sichergestellt, dass

das System zum einen alle für die Humandiagnostik relevanten HAV Genotypen detektiert,

42

zum anderen nahe verwandte Viren sowie Erreger die ein ähnliches symptomatisches Bild

hervorrufen nicht detektiert. Getestet wurden Isolate der HAV Genotypen IA, IB und III, sowie

synthetisch hergestellte Nukleinsäurekonstrukte der Genotypen II und VII. Alle diese HAV

Genotypen konnten mit dem HAV RT-PCR System detektiert und quantifiziert werden.

Kreuzreaktivitäten mit anderen Erregern (siehe Tab.1) wurden nicht beobachtet.

Die Präzisionsdaten geben Aufschluss über die Varianz des Systems und setzen sich aus

der Intra-Assay, der Inter-Assay und der Inter-Chargen Variabilität zusammen. Die Daten,

erhoben für eine Konzentration von 571,5 IU HAV/ml zeigen, dass die maximale Variation

zweier Proben der gleichen Konzentration nur 31,40% beträgt. Tabelle 2 zeigt die Daten der

einzelnen Präzisionstests.

Tab.2: Präzisionsdaten des HAV RT-PCR Assays; generiert mit der HAV Konz. 571,5 IU/ml

Standardabweichung [IU/ml]

Varianz [IU/ml]2

Variationskoeffizient [%]

Intra-Assay Variabilität: 167,71 2,8 x 104 28,23 Inter-Assay Variabilität: 184,62 3,4 x 104 30,91 Inter-Chargen Variabilität: 183,80 3,4 x 104 30,69 Totalvarianz: 188,20 3,5 x 104 31,40

3.1.2 Einsatz des real-time HAV RT-PCR Systems in der in vitro Diagnostik

Das hier beschriebene real-time HAV RT-PCR System wird inzwischen von der QIAGEN

Hamburg GmbH als CE (Communauté Européenne)-markiertes Kit kommerziell vertrieben

und kommt dadurch u. a. im DRK Blutspendedienst, West in der in vitro Diagnostik (IVD)

zum Einsatz. Seine sehr gute Performance im Vergleich zu anderen Nachweissystemen hat

das real-time HAV RT-PCR System inzwischen mehrfach unter Beweis gestellt. So wurde

2003 eine HAV positive Blutspende identifiziert, die weder erhöhte Leberenzymwerte, noch

Antikörper gegen HAV aufwies. Die Symptomatik zum Spendezeitpunkt war unauffällig.

Diese Spende wäre ohne Testung mit dem real-time HAV RT-PCR System fälschlicherweise

als HAV negativ deklariert worden. Das Virus aus dieser Spende wurde sequenziert und

phylogenetisch analysiert. Es handelt sich bei diesem Isolat um ein in Europa erst in jüngerer

Zeit häufiger vorkommenden Hepatitis A-Virus Genotyp III. Die Performance des real-time

HAV RT-PCR Systems wird jährlich durch die Teilnahme an Ringversuchen überprüft. Dabei

stellte sich heraus, dass die Spezifität des real-time HAV RT-PCR Systems deutlich besser

ist als andere nukleinsäurebasierende HAV Nachweissysteme. Im Gegensatz zum real-time

HAV RT-PCR System sind sowohl kommerziell erhältliche als auch in house Assays

43

teilweise nicht in der Lage HAV Genotyp III nachzuweisen. Im Sommer 2004 wurden durch

das HAV RT-PCR System noch weitere drei HAV positive Blutspenden identifiziert, deren

Spender zum Spendezeitpunkt keinerlei Symptome zeigten(139). Durch das real-time HAV

RT-PCR System wurde verhindert, dass diese Spenden zur Weiterverarbeitung gelangten,

wodurch das Risiko der HAV Übertragung durch diese und andere mit diesem System

identifizierte Blutspenden verringert wird.

3.2 Entwicklung eines Systems zum quantitativen Nac hweis von

HAV Negativstrang RNA

Die Replikation des Hepatitis A-Virus erfolgt über Negativstrang RNA Intermediate. Diese

spezifische RNA liegt in geringer Menge für einen begrenzten Zeitraum in den Zellen vor und

ist eindeutiges Zeichen für die HAV Replikation. Zur Untersuchung, ob und in welchem Maße

in den Mausgeweben HAV Replikation stattfindet, wurde ein System zum Nachweis und zur

Quantifizierung von HAV Negativstrang [(-) Strang] als Replikationsmarker entwickelt.

3.2.1 Herstellung der strangspezifischen Kontrolltr anskripte

Voraussetzung für die Entwicklung eines strangspezifischen Nachweissystems ist die

Herstellung von geeignetem Kontrollmaterial. Dazu wurden mittels immobilisierter in vitro

Transkription (siehe 2.2.20) RNA Kontrolltranskripte in sense [(+) Strang] und antisense [(-)

Strang] Orientierung hergestellt. Die Kontrolltranskripte umfassen einen 90 Basen langen

Bereich in der VP1 Region des HAV Genoms, der als Targetbereich für den

strangspezifischen Nachweis ausgewählt wurde. Nach dem DNase Verdau wurden die

Transkripte photometrisch vermessen und im 2%igen Agarosegel kontrolliert (Abb. 5). Auf

dem Gelbild sind keinerlei Nebenbanden erkennbar und die Fragmente sind 90 Basen lang.

Über die Anzahl der Basen und die RNA Konzentration wurde die Kopienzahl bestimmt.

Zusätzlich wurden die Transkripte mittels des real-time HAV LC RT-PCR Systems (3.1)

quantifiziert. In Tab. 3 sind die entsprechenden Konzentrationen aufgeführt. Der

Umrechnungsfaktor von Internationalen Einheiten (IU) auf Kopien beträgt zehn, d.h. eine IU

entsprechen zehn Kopien HAV RNA. Von den in vitro Transkripten wurde jeweils eine

Verdünnungsreihe erstellt und zur strangspezifischen Quantifizierung herangezogen.

44

Zusätzlich zu den in vitro Transkripten wurden synthetisch hergestellte DNA und RNA

Moleküle (Metabion, Martinsried) in (+) Strang und (-) Strang Orientierung als

Kontrollmaterial eingesetzt.

3.2.2 Strangspezifischer Nachweis mittels Rolling Circle Amplifikation

Zur Entwicklung einer PCR unabhängigen Methode für die Detektion des HAV (-) Stranges

wurde das Prinzip der Rolling Circle Amplifikation gewählt. Dieses basiert auf der

Amplifikation einer Padlock Probe bzw. eines geschlossenen Nukleotidringes. Zur

Herstellung dieses Nukleotidringes wurden verschiedene Oligonukleotidsysteme konstruiert

und auf ihre Eignung untersucht.

3.2.2.1 Padlock Probe System

Abb. 6 zeigt die Amplifikation einer (+) Strang DNA Verdünnungsreihe (6A zusätzlich (-)

Strang DNA) vor (A) und nach (B) der Optimierung. Die Ligation erfolgte mit dem einfachen

Padlock Probe System (siehe Abb. 3A). Das Signal wird während der isothermalen

Amplifikation durch eine Sonde generiert, deren Bindungsstelle in der Padlock Probe

gegenüber der an die Zielsequenz bindenden Enden liegt. Durch Titration der einzelnen

Reaktionskomponenten wurde eine deutliche Sensitivitätssteigerung von (6A) 10 pmol/µl auf

0,001 pmol/µl (6B) erzielt. Auch konnte der Kurvenverlauf deutlich verbessert werden, die

Kurven zeigen einen sigmoidalen Verlauf und die Fluoreszenzhöhe ist deutlich gesteigert.

Obwohl Padlock Probe Systeme hoch spezifisch sind, zeigen die Wasserproben deutliche

Tab. 3: Konzentrationsbestimmung der Kontrolltranskripte

RNA Konz. Kopien/µl (berechnet)

IU/µl (lt. HAV RT-

PCR)

sense IVT 1234 ng/µl 1 x 1014 2 x 1013

antisense IVT 565 ng/µl 1 x 1013 2 x 1012

Abb. 5: Kontrolltranskripte im 2 %igen Agarosegel. Aufgetragen wurden je 5 µl der antisense und sense in vitroTranskription. Die IVTs beider Reaktionen sind 90 Basen lang, Nebenbanden sind nicht erkennbar.

45

Signale und erlauben keine Unterscheidung von negativen und positiven Proben. Die

einzelnen DNA Konzentrationen (6B) sind gut von einander abgegrenzt, wobei die Abstände

zwischen den Signalen geringer werden, je höher die eingesetzte DNA Konzentration ist.

A

B

Abb. 6: Vergleich der Rolling Circle Amplifikation mit dem Padlock Probe System vor (A) und nach (B) der Optimierung. Eingesetzt wurden Verdünnungen aus einzelsträngiger DNA. In A) wurde sowohl (+) Strang als auch (-) Strang orientierte DNA in B) nur (+) Strang orientierte DNA eingesetzt. A) Detektiert werden Signale bis zur Konzentration von 10 pmol/µl. Der komplementäre Strang und die Negativkontrolle zeigen kein Signal. B) Die Verdünnungsreihe zeigt bis zur letzten Stufe 0,001 pmol/µl gute Signale. Die Fluoreszenz ist deutlich höher und zeigt einen sigmoidalen Kurvenverlauf. Die Negativkontrollen werden falsch positiv detektiert.

46

Die Amplifikate aus Abb. 6B wurden auf einem 3%igem Agarosegel aufgetragen und zeigen

das erwartete Bandenmuster (Abb. 7) aus unterschiedlich vielen aneinander gereiten

Wiederholungen der Padlock Probe. Deutlich zu Erkennen ist eine Verschiebung des

Bandenmusters in den Wasserproben zu kürzeren Fragmenten, wobei das Muster selbst

erhalten bleibt. In der geringsten Targetkonzentration (0,001 pmol/µl) scheint eine Mischform

vorzuliegen, es ist sowohl das Bandenmuster der längeren als auch das der kürzeren

Fragmente sichtbar, dieses ist jedoch deutlich schwächer.

Die Sequenzierung von je zwei Banden der Konzentration 0,01 pmol/µl und den

Negativkontrollen ergab, dass es sich bei den Amplifikaten in den Wasserproben um die

unvollständige Sequenz der Padlock Probe handelt, es fehlt der an die Zielsequenz

bindende Bereich. Die Sequenzierung der Positivproben ergab die vollständige Padlock

Probe Sequenz. Der Einsatz anderer Padlock Probes sowie weitere Optimierungsschritte

konnten die Generierung der falsch positiven Signale nicht verhindern.

3.2.2.2 2-Oligosystem

Bei diesem System sind zum Ringschluss zwei nicks im Targetbereich (siehe Abb. 3B) zu

schließen. Diese stringenteren Ligationsbedingungen sollten die unspezifische Amplifikation

verhindern. Allerdings zeigte sich, wie bei dem einfachen Padlock Probe System, dass es

1 kb

Lei

ter

1 kb

Lei

ter

10 pmol/µl 1 pmol/µl 0,1 pmol/µl 0,01 pmol/µl 0,001 pmol/µl Wasser

Abb. 7: Amplifikate einer (+) Strang DNA Verdünnungsreihe sowie der Negativkontrolle (Wasser) nach isothermaler Amplifikation aufgetrennt in einem 3%igen Agarosegel. Das für RCA typische Bandenmuster zeigt in den Wasserproben eine deutliche Verschiebung der Fragmentgröße im Vergleich zu dem der Verdünnungsreihe.

47

auch ohne Target zur Bildung und Amplifikation des Nukleotidringes kommt, so dass eine

Unterscheidung von geringer positiven und negativen Proben auch mit diesem System nicht

möglich ist (Ergebnisse nicht gezeigt).

3.2.2.3 3-Oligosystem

Dieses System erfordert drei Oligonukleotide mit zwei nick closing sites zum Schließen des

Ringes (siehe Abb. 3C). Zusätzlich wurde eine Sonde eingesetzt, die auf dem Targetbereich

bindet, so dass das Sondensignal nur durch Amplifikation des vollständigen Ringes generiert

werden kann. Durch die drei Oligonukleotide, sowie den Einsatz der neuen Sonde soll die

Generierung der falsch positiven Signale ausgeschlossen werden. Abb. 8 zeigt die Rolling

Circle Amplifikation einer (+) Strang DNA Verdünnungsreihe (Abb. 8A) und einer kleineren

Verdünnungsreihe aus (-) Strang DNA (Abb. 8B).

Die Wasserproben im 3-Oligosystem (Abb.8) zeigen kein Signal, die positiven Proben sind

deutlich von den negativen Proben zu unterscheiden, d.h. die Detektion falsch positiver

Signale tritt bei diesem System nicht auf. Die einzelnen Targetkonzentrationen sind gut

voneinander unterscheidbar und in gleichmäßigem Abstand zueinander. Die

Doppelbestimmungen liegen dicht beieinander. Die Sensitivitätsgrenze für den (+) Strang

DNA Nachweis liegt bei ungefähr 1 zmol/µl, die für den (–) Strang DNA Nachweis bei

ungefähr 10 zmol/µl, da bei diesen Konzentrationen jeweils eine Probe ausfällt.

Der Nachweis von einzelsträngiger RNA in Form von in vitro Transkripten ist in Abb. 9

gezeigt. In das 3-Oligonukleotidsystem zur (-) Strang Detektion wurden (-) Strang orientierte

IVTs in den Verdünnungsstufen 10-3 – 10-5 (109 – 107 IU/µl) sowie als Positivkontrolle (-)

Strang DNA (1 fmol/µl) und als Negativkontrolle Wasser eingesetzt. Die Positivkontrolle und

die (-) Strang IVTs in den Verdünnungsstufen 10-3 und 10-4 wurden positiv detektiert, wobei

das Signal der Verdünnung 10-4 in der Doppelbestimmung zu deutlich unterschiedlichen

Zeitpunkten generiert wird. Die IVT Verdünnung 10-5, sowie die Wasserkontrolle werden

negativ detektiert.

48

Das 3-Oligonukleotidsystem zum Nachweis von (+) Strang zeigte bei Einsatz von RNA

dasselbe Ergebnis. Weitere Versuche (Daten nicht gezeigt) mit synthetisierter DNA und RNA

sowie IVTs zeigten, dass die Sensitivität des Systems bei RNA als Probenmaterial deutlich

schlechter ist als bei DNA. Für den strangspezifischen Nachweis von viraler RNA aus

Gewebe wurde das System modifiziert, so dass die Sensitivität bei Einsatz von RNA als

Probenmaterial verbessert wurde.

Abb. 8 Amplifikation einer (+) Strang DNA (A) und einer (-) Strang DNA (B) Verdünnungsreihe mit dem 3-Oligonukleotidsystem. Die Verdünnungen sind in beiden Reihen deutlich voneinander unterscheidbar. Die Kurven zeigen eine sehr gute Fluoreszenzhöhe. Die Negativproben werden als negativ detektiert, d.h. es kommt nicht zur Detektion falsch positiver Signale.

A

B

49

3.2.2.4 3-Oligosystem-RNA

Dieses System basiert auf dem 3-Oligosystem, jedoch handelt es sich bei einem der an das

Target bindenden Oligonukleotide um eine RNA/DNA Chimäre. Das 3´-Ende des

Oligonukleotids H2 besteht aus Ribonukleotiden (Abb. 3D). Die Ligation erfolgt zusätzlich mit

Hilfe einer RNA-Ligase. Bei Bindung an ein RNA Target wird durch diese Kombination die

Ligation des nicks zwischen H1 und H2 erleichtert, und damit die Sensitivität des gesamten

Nachweises gesteigert. Das Sensitivitätslimit des RCA (+) und (-) Strang Nachweises mit

dem 3-Oligosystem RNA wurde mit Hilfe der Probit-Analyse (PriProbit® Vers. 1.63) sowohl

für synthetische RNA Fragmente als auch für in vitro transkribierte RNA bestimmt. Die

Ergebnisse der Probit-Analysen sind in Tab. 4 angegeben.

Abb. 9: Untersuchung von in vitro transkribierter RNA im RCA (-) Strang Nachweis. Eingesetzt wurde eine Verdünnungsreihe von (-) Strang orientierten IVTs sowie als Negativkontrolle Wasser. Die (-) Strang IVTs unterschiedlicher Konzentration sind gut voneinander unterscheidbar, es kommt nicht zur Detektion falsch positiver Signale. Bei der Doppelbestimmung der Verdünnungsstufe 10-4 zeigt sich eine große Differenz zwischen den Signalen. die Verdünnung 10-5 zeigt kein positives Signal, dies deutet auf das Erreichen des Sensitivitätslimits hin.

50

Tab 4: Sensitivitätslimits der strangspezifischen Nachweise durch RCA

(+) Strang Nachweis (-) Strang Nachweis

synthetisches RNA Fragment 22,2 amol/µl ≡ 1,3 x 106 IU/µl 33,57 amol/µl ≡ 2,0 x 106 IU/µl

in vitro transkribierte RNA 372,3 amol/µl ≡ 2,2 x 107 IU/µl 535,48 amol/µl ≡ 3,2 x 107 IU/µl

Die HAV RNA Konzentrationen in den Geweben (siehe 3.3) liegen unterhalb des in Tab. 4

angegebenen Sensitivitätslimits. Für den Nachweis von (-) Strang RNA aus Gewebe ist die

Sensitivität dieses System daher nicht ausreichend, so dass eine andere Methode des

strangspezifischen Nachweises zur Untersuchung der Gewebeproben etabliert wurde.

3.2.3 Strangspezifischer Nachweis mittels Box-PCR

Der (-) Strang Nachweis mittels Box-PCR basiert auf zwei Schritten, dem Einbau der Box,

einer spezifischen HAV unabhängigen Sequenz, während der cDNA Synthese und einer

anschließenden PCR. Die Strangspezifität wird durch den Einsatz eines Primers, der an die

eingebaute Box bindet, und einer Taqman®-Sonde, die nur bei tatsächlicher Amplifikation,

ein Signal abgibt, gewährleistet. Im Gegensatz zum strangspezifischen Nachweis durch RCA

wurden im strangspezifischen Nachweis mittels Box-PCR alle Wasserproben als negativ

detektiert (Daten nicht gezeigt). Es kommt nicht zur Detektion falsch positiver Signale bei

Einsatz von Wasser als Probenmaterial, so dass positive und negative Proben von einander

unterscheidbar sind. Zur Etablierung des (-) Strang Nachweises mittels Box-PCR wurden

Spezifitäts- und Sensitivitätsdaten erhoben.

3.2.3.1 Spezifität

Zur Untersuchung der Strangspezifität wurden je acht Verdünnungsstufen (+) Strang IVTs im

(-) Strang Nachweis und (-) Strang IVTs im (+) Strang Nachweis getestet. Dabei wurde

analysiert, ab welcher Konzentration des komplementären Stranges ein Signal generiert

wird, d.h. bis zu welcher RNA Konzentration der jeweilige Nachweis strangspezifisch ist und

ab welcher Konzentration mit falsch positiven Ergebnissen gerechnet werden muss. Die

Auswertung erfolgte durch eine Probit-Analyse (PriProbit® Vers. 1.63). Der Spezifitätswert für

den (-) Strang Nachweis ist 2,7 x 104 IU/µl (p≤0,05). Der Spezifitätswert für den (+) Strang

Nachweis ist 2,5 x 102 IU/µl (p≤0,05), d.h. mit 95%iger Wahrscheinlichkeit werden (-) Strang

orientierte Nukleinsäuren in geringerer Konzentration im (+) Strang Nachweis nicht detektiert.

Bis zu diesem Wert kommt es in dem strangspezifischen Nachweis mittels Box-PCR nicht

zur Detektion falsch positiver Signale aufgrund des Komplementärstranges. Falsch positive

51

Abb. 10: Einfluss verschiedener (+) Strang Konzentrationen auf die Quantifizierung des (-) Stranges; Anhand der aufgetragenen Mittelwerte wird deutlich, dass der (+) Strang unabhängig von der Menge ab einer (-) Strang Konzentration von >40 IU/µl keinerlei Einfluss auf die Quantifizierung hat.

Signale durch den Komplementärstrang höher konzentrierter Proben lassen sich durch

Verdünnung der Proben unter den Spezifitätswert verhindert (Daten nicht gezeigt).

Um den Einfluss von (+) Strang auf die Quantifizierung des (-) Stranges zu untersuchen

wurden zu jeder Verdünnungsstufe einer (-) Strang IVT Reihe unterschiedliche Mengen an

(+) Strang IVT gegeben. Der (-) Strang dieser Ansätze wurde quantifiziert und mit der

tatsächlich eingesetzten Menge verglichen (siehe Abb. 10). Die Quantifizierung des (-)

Stranges ist unbeeinflusst von der evtl. vorhandenen (+) Strang Menge ab einer (-) Strang

Menge von 4 x 101 IU/µl. Geringere (-) Strang Mengen werden bei Vorhandensein von (+)

Strang Konzentrationen von mehr als 10.000 IU/µl überquantifiziert.

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

1 10 100 1000 10000 100000 1000000

- Strang IVT [IU/µl]

quan

tifiz

iert

- Stra

ng IV

T [I

U/µ

l]

0 IU/µl + Strang

10 IU/µl + Strang

100 IU/µl + Strang

1000 IU/µl + Strang

10000 IU/µl + Strang

100000 IU/µl + Strang

1000000 IU/µl + Strang

3.2.3.2 Sensitivität

Das Sensitivitätslimit wurde durch eine Probit Analyse ermittelt und beträgt für den (-) Strang

Nachweis 0,44 IU/µl (p≤0,05) (4,4 Kopien/µl). D.h. mit einer Wahrscheinlichkeit von 95% wird

eine Probe mit dieser Konzentration noch als positiv detektiert. Das Sensitivitätslimit

bezogen auf den (+) Strang Nachweis ist 1,48 IU/µl (14,8 Kopien/µl). Damit liegt die

52

Sensitivität des (-) Strang Nachweises nur geringfügig über dem des real-time HAV RT-PCR

System und ist sensitiv genug um (-) Strang RNA aus Gewebeproben zu detektieren.

Tab 5: Detektionsbereich der strangspezifischen Nachweise mittels Box-PCR

Minimum (Sensitivitätslimit) Maximum (Spezifitätswert)

(-) Strang Nachweis 0,44 IU/µl 2,7 x 104 IU/µl

(+) Strang Nachweis 1,48 IU/µl 2,5 x 102 IU/µl

Tab. 5 zeigt den Bereich in dem eine eindeutige Aussage über die Orientierung des in der

Probe vorhandenen Stranges möglich ist. D.h. zeigt eine Probe mit weniger als 2,7 x 104

IU/µl HAV RNA im (-) Strang Nachweis ein positives Signal, so handelt es sich eindeutig um

(-) Strang HAV RNA, ein falsch positives Signal aufgrund von evtl. vorhandener (+) Strang

RNA tritt in diesem Bereich nicht auf.

3.2.3.3 Quantifizierung einer HAV Replikationskinet ik

Die Eignung des (-) Strang Nachweises wurde durch Detektion der Replikationsintermediate

einer HAV Wachstumskinetik getestet. Dazu wurden FRhK-4 Zellen in 6 cm Schalen infiziert

(HAV/PI; MOI 1). Die Entnahme der Proben erfolgte direkt nach der Infektion, nach

6 Stunden und weiter im 12 Stunden Rhythmus. Die Zellen wurden abtrypsiniert und gezählt.

Aus der gereinigten Nukleinsäure wurde die HAV RNA und HAV (-) Strang RNA Menge

bestimmt und in Bezug zur Zellzahl gesetzt. Die HAV RNA Menge steigt vom Zeitpunkt der

Infektion von 3 x 105 IU/106 Zellen innerhalb der ersten 30 Stunden auf 107 IU/106 Zellen

(siehe Abb. 11). Bis zu 210 Stunden p.i. nimmt die HAV RNA langsam aber stetig weiter zu

und bleibt bei ca. 4 x 107 IU/106 Zellen bis zum Versuchsende relativ konstant, wohingegen

das Replikationsintermediat im Zeitraum von 6 – 30 Stunden nach Infektion stark ansteigt

und bis zu 294 Stunden p.i. ein konstant hohes Level zeigt. Danach sinkt die Menge an (-)

Strang RNA um das Vierfache, und bleibt bis zum Versuchsende (390 Stunden p.i.) auf

diesem Level.

53

3.3 Untersuchung zum IgA vermittelten Carriermechan ismus des

Hepatitis A-Virus in experimentell infizierten Mäus en

3.3.1 Nachweis des HAV nach intravenöser, intraperi tonealer und oraler Inokulation

von HAV/anti-HAV IgA-Komplexen

3.3.1.1 Vergleich der Inokulationsarten

Zur Bestimmung der geeignetsten Inokulationsart der Mäuse wurden zwölf Tiere auf

unterschiedliche Weise (intravenös, intraperitoneal und oral) mit je einem Milliliter HAV/anti-

HAV IgA-Komplexen [2 x 108 IU/ml] inokuliert und im Anschluss sektioniert. Dabei wurden

sechs Tiere einmal und sechs Tiere zweimal inokuliert. Die einmal inokulierten Tiere wurden

nach vier Tagen sektioniert, die anderen Tiere wurden vier Tage nach der ersten Inokulation

ein zweites Mal behandelt und erst weitere sechs Tage später sektioniert. Zusätzlich zur

HAV Menge erfolgte die Quantifizierung der relativen 18S rRNA und GAPDH Mengen und

die photometrische Bestimmung der gesamten RNA Menge aus den Geweben.

Abb. 11: Replikationskinetik des HAV in FRhK-4 Zellen. Dargestellt ist der Verlauf der HAV RNA sowie der (-) Strang RNA Menge bezogen auf die FRhK-4 Zellzahl in Abhängigkeit von der Zeit. Aufgetragen sind die jeweiligen Mittelwerte zweier unabhängiger Infektionsversuche, die Standardabweichung ist durch Fehlerbalken dargestellt.

54

Die Tabellen 6, 7 und 8 zeigen die HAV Mengen in Bezug auf die gesamte RNA Menge, die

relative 18S rRNA und GAPDH Menge.

Tab. 6: HAV RNA Menge (gemittelt) bezogen auf die gesamte RNA Menge in verschiedenen Geweben

Hepatitis A-Virus IU/µg RNA

Maus

Nr.

Infektion Leber

Lymph-

knoten Gekröse Thymus Milz Niere Blut

1 + 2 2 x i. p. 300,37 0,87 1197,31 n.q. 4483,75 59,60 n. q.

3 + 4 2 x oral - - - - - - -

11 2 x i. v. 1129,48 26,73 - n.q. 10402,90 72,60 29,90

6 + 9 1 x i. p. 83,48 46,45 255,07 36,17 2575,00 608,80 10,55

7 + 8 1 x oral - 71,19 1,31 n.q. - 1,80 -

5 + 12 1 x i. v. 800,70 100,92 83,46 n.q. 2668,35 35,80 9,65

10 nicht inf. - - - - - - -

n. q. : nicht quantifizierbar - : nicht nachweisbar Tab. 7: HAV RNA Menge (gemittelt) bezogen auf die 18S rRNA Menge in verschiedenen Geweben

HAV IU/rel. Einheit 18S rRNA

Maus

Nr.

Infektion Leber Lymph-

knoten

Gekröse Thymus Milz Niere Blut

1 + 2 2 x i. p. 9,8 x 10-3 0,5 x 10-5 1,8 x 101 n.q. 7,9 x 10-2 0,55 x 10-3 n.q.

3 + 4 2 x oral - 3,7 x 10-4 - n.q. - - n.q.

11 2 x i. v. 4,3 x 10-2 3,4 x 10-4 - n.q. 1,5 x 10-1 7,8 x 10-4 1,7 x 10-4

6 + 9 1 x i. p. 3,3 x 10-3 6,5 x 10-5 7,1 x 100 1,1 x 10-3 7,4 x 10-2 1,7 x 10-3 4,8 x 10-5

7 + 8 1 x oral 0,5 x 10-5 2,9 x 10-4 3,0 x 10-5 n.q. n.q. 1,0 x 10-5 -

5 + 12 1 x i. v. 1,7 x 10-3 4,7 x 10-4 8,8 x 10-4 n.q. 4,0 x 10-2 3,4 x 10-4 4,3 x 10-5

10 nicht inf. - - - - - - -

n. q. : nicht quantifizierbar - : nicht nachweisbar Tab. 8: HAV RNA Menge (gemittelt) bezogen auf die GAPDH Menge in verschiedenen Geweben

HAV IU/rel. Einheit GAPDH

Maus

Nr.

Infektion Leber Lymph-

knoten

Gekröse Thymus Milz Niere Blut

1 + 2 2 x i. p. 1,6 x 10-1 0,5 x 10-5 1,9 x 10-1 n. q. 3,4 x 10-1 5,3 x 10-4 n. q.

3 + 4 2 x oral - 4,5 x 10-4 - n. q. - - n. q.

11 2 x i. v. 8,3 x 10-1 4 x 10-5 - n. q. 4,6 x 10-1 2,5 x 10-3 8,7 x 10-3

6 + 9 1 x i. p. 9,4 x 10-2 4 x 10-5 9,1 x 10-2 1,8 x 10-4 2,0 x 10-1 4,5 x 10-3 2,5 x 10-3

7 + 8 1 x oral 1 x 10-5 2 x 10-4 2,5 x 10-5 n. q. n. q. 1,5 x 10-5 -

5 + 12 1 x i. v. 3,8 x 10-1 4,6 x 10-4 1,1 x 10-3 n. q. 1,7 x 10-1 5,0 x 10-4 2,3 x 10-3

10 nicht inf. - - - - - - -

n. q. : nicht quantifizierbar - : nicht nachweisbar

55

Nach oraler Inokulation konnten nur unregelmäßig in einigen Geweben sehr geringe HAV

RNA Mengen detektiert werden. Da sich die Fragestellung dieser Arbeit auf den Transport

des Virus im Blut zur Leber bezieht und dadurch nicht den vollständigen natürlichen

Infektionsweg benötigt, war die orale Infektion für die nachfolgenden Experimente nicht

relevant. Die höchsten HAV Mengen wurden im Allgemeinen nach intravenöser Inokulation

detektiert. Trotz guter Ergebnisse wurde auf diese Inokulationsart verzichtet, da die

Applikation in die Schwanzvene aufgrund der geringen Größe und der bei diesen Mäusen

(braune Fell- und Hautfarbe) nicht sichtbaren Schwanzvene sehr schwierig, schlecht

durchführbar und dadurch fehlerbehaftet war. Es zeigte sich, dass nach einmaliger

intraperitonealer Inokulation ausreichend hohe Virusmengen detektiert werden konnten, so

dass alle weiteren Versuche mit intraperitonealer Inokulation und Sektion 4 Tage p.i.

durchgeführt wurden.

3.3.1.2 Auswahl des geeigneten Bezugssystems

Die HAV Menge einer einzigen Probe kann durch absolute Quantifizierung bestimmt werden.

Für den Vergleich der HAV Menge zwischen verschiedenen Proben ist die relative

Quantifizierung notwendig. Durch Normalisierung auf ein endogenes Referenzgen oder die

gesamte RNA werden experimentelle Unterschiede berücksichtigt und es wird die

Vergleichbarkeit der Proben über verschiedene Versuchsansätze hinaus ermöglicht. Die

einzelnen Proben wurden durch real-time PCR sowohl auf ihren 18S rRNA und ihren

GAPDH RNA Gehalt als auch durch photometrische Messung auf den Gesamt-RNA Gehalt

hin untersucht. Die HAV RNA Menge der Proben wurde auf das Referenzgen (18S rRNA

und GAPDH) sowie auf die Gesamt-RNA bezogen und die Daten miteinander verglichen

(Daten nicht gezeigt). Während die Daten bezogen auf 18S rRNA und die Gesamt-RNA im

Verhältnis keine wesentlichen Unterschiede zeigen, weichen die Daten bezogen auf GAPDH

von den anderen Bezugssystemen ab. Für die Auswertung und Darstellung der weiteren

Versuchsergebnisse wurde die HAV RNA Menge und die HAV (-) Strang RNA Menge auf

den Gesamt-RNA Gehalt bezogen.

3.3.2 Untersuchung zum HAV Targeting vermittelt dur ch anti-HAV IgA

In zwei zeitlich versetzt durchgeführten Versuchsreihen wurden je 4 Mäuse im Alter von 42 –

46 Tagen mit HAV, HAV/anti-HAV IgA- und als HAV/Antikörperkomplex Kontrolle mit

56

HAV/anti-HAV IgG-Komplexen inokuliert und nach vier Tagen sektioniert. Die RNA der

entnommenen Gewebe wurde isoliert und mittels quantitativer real-time PCR auf HAV,

GAPDH und 18S rRNA sowie photometrisch auf die Gesamt-RNA Menge untersucht.

Zusätzlich wurde die (-) Strang HAV RNA Menge bestimmt. Die quantifizierte HAV RNA und

(-) Strang RNA Menge wurde auf die total RNA Menge normalisiert. Die RNA Extraktion und

die anschließenden Quantifizierungen wurden in zwei Serien durchgeführt. Diese Serien

wurden zusammen ausgewertet, so dass pro Tier und Gewebe zwei Werte messbar waren.

Die Leber besteht aus verschiedenen Bereichen, die in unterschiedlichen Abständen zu den

zu- und abführenden Blutgefäßen angeordnet sind. Zur Untersuchung, ob ein Unterschied

der HAV Menge zwischen den Bereichen auftritt, wurde der kleinen Leberlappen (Lobus

quadratus) von der restlichen Leber getrennt analysiert. Direkt an diesem Leberlappen treten

die zuführenden Blutgefäße in die Leber ein. Da jedoch keinerlei Unterschiede zwischen den

Werten der Leberlappen zu beobachten waren (Daten nicht gezeigt), wurden diese in der

Auswertung des Versuchs (Abb. 12 und 13) wieder zusammengefügt, d.h. für die Leber

eines jeden Tieres ergaben sich 4 Werte. Neben den Organen Niere, Leber und Milz wurde

das Blut der Mäuse aufgefangen und auf HAV untersucht. Es zeigten sich jedoch keine bzw.

für eine Auswertung zu geringe Mengen HAV im Blut.

3.3.2.1 Nachweis des bevorzugten Virustransports z ur Leber durch anti-HAV IgA

Die HAV RNA und HAV (–) Strang RNA Menge bezogen auf die gesamte RNA aus den

aufgereinigten Leberproben nach i.p. Inokulation der Mäuse mit HAV, HAV/IgA- und

HAV/IgG-Komplexen ist in Abb. 12 gezeigt. In Abb. 12 A und 12 B ist das Ergebnis der

ersten Versuchsreihe, in Abb. 12 C und D das der zweiten Versuchsreihe, dargestellt. In der

ersten Versuchsreihe ist die HAV Menge in der Leber nach Inokulation mit HAV/IgG-

Komplexen deutlich geringer als nach Inokulation mit HAV und HAV/IgA-Komplexen. Die als

Kontrolle für Antikörper-komplexiertes HAV eingesetzten HAV/IgG-Komplexe erreichen die

Leber deutlich schlechter als freies HAV, d.h. das Virus ist durch IgG inhibiert. Sowohl

Immunglobulin G als auch Immunglobulin A Antikörper neutralisieren das Hepatitis A-Virus.

Das Ergebnis zeigt, dass die Neutralisation des HAV durch IgA keinen inhibitorischen Effekt

auf das Erreichen der Leber hat. Nach Inokulation mit HAV und HAV/IgA-Komplexen kommt

in etwa die gleiche Virusmenge in der Leber an. Der Median, d.h. die Viruskonzentration bei

der die Hälfte der Ergebnisse höhere und die andere Hälfte kleinere Viruskonzentrationen

zeigen, ist nach HAV/IgA Inokulation 327 IU/µg RNA. Nach HAV Inokulation liegt der Median

bei 250 IU/µg RNA (siehe Abb. 12 A). Durch die grafische Darstellung in Form eines Boxplot

Diagramms lässt sich die Streuung der Werte direkt ablesen. Die Länge der Box ist das Maß

57

der Streuung. Die Box wird begrenzt durch das Perzentil 25, unterhalb dieses Wertes liegen

25% der Daten und das Perzentil 75, unter dem 75% der Daten liegen. D.h die Box

repräsentiert 50% der Daten. Die horizontal verlaufenden Striche über und unter der Box

kennzeichnen den größten und den kleinsten Wert, der nicht als extremer Wert oder als

Ausreißer klassifiziert wird. Ausreißer werden durch kleine Kreise, extreme Werte durch

Sternchen dargestellt. Die Lage des Median innerhalb der Box gibt einen Eindruck von der

Schiefe der Datenverteilung. Die Streuung, also die Größe der Box, ist nach Inokulation von

HAV und HAV/IgA-Komplexen ebenfalls sehr ähnlich, wobei in beiden Fällen eine schiefe

Verteilung zu den niedrigen Konzentrationen vorliegt. D.h. viele der ermittelten Werte

enthielten geringe HAV RNA Konzentrationen und einige wenige zeigten extrem hohe HAV

RNA Konzentrationen. Bei allen Inokula wurden nur sehr geringe HAV (-) Strang RNA

Mengen in der Leber gefunden. Dabei ist ein deutlicher Unterschied (siehe Abb. 12 B) zu

beobachten, der jedoch nicht signifikant (p<0,5) ist. Die Streuung der Werte unterscheidet

sich deutlich, wobei bei allen Inokula eine Schiefe zu den niedrigen Konzentrationen vorliegt.

Nach Inokulation mit HAV/IgA sind die HAV Konzentrationen in der Leber und die Streuung

der Werte wesentlich größer als bei HAV/IgG und HAV Inokulation.

Generell sind die HAV RNA Konzentrationen in der Mäuseleber der zweiten Versuchsreihe

(Abb. 12 C und D) deutlich geringer als in denen der ersten Versuchsreihe. Während im

ersten Durchgang bis zu 2000 HAV RNA IU/µg total RNA gefunden werden, liegt der

Höchstwert des zweiten Durchgangs bei 700 HAV RNA IU/µg total RNA. Abb. 12 D zeigt das

Ergebnis der Untersuchung auf (-) Strang HAV RNA. Es konnten nur vier Einzelwerte

detektiert werden. Der Rest der Leberproben zeigte keinerlei Replikationsintermediat. Das

Ergebnis der HAV RNA weicht von dem der ersten Versuchsreihe ab. Nach Inokulation mit

HAV konnte in der zweiten Mausreihe signifikant mehr HAV in der Leber detektiert werden

als nach Inokulation mit HAV/IgG- und HAV/IgA-Komplexen. Abb. 12 C zeigt, dass die HAV

RNA Konzentrationen in den Leberproben nach Inokulation mit den beiden HAV

Immunkomplexen nahezu gleich sind. Während in der ersten Versuchsreihe nach Inokulation

mit HAV und HAV/IgA-Komplexen in etwa die gleiche Virusmenge in der Leber ankommt

(Abb. 12A), zeigt sich in der zweiten Versuchsreihe (Abb. 12C) nach Inokulation mit HAV/IgA

eine deutlich geringere Konzentration als nach Inokulation mit freiem HAV. In dieser

Versuchsreihe verhält sich HAV/IgA ähnlich der HAV/IgG Kontrolle.

58

Abb. 12: Boxplot Diagramme der HAV RNA (A, C) sowie HAV (-) Strang RNA (B, D) Konzentration in der Leber nach Inokulation der Mäuse mit HAV, HAV/IgA- und HAV/IgG-Komplexen. A und B zeigt das Ergebnis der ersten, C und D die der zweiten Versuchsreihe. Nach Inokulation von HAV und HAV/IgA-Komplexen sind bei der ersten Versuchsreihe die gleichen HAV RNA Konzentrationen in der Leber zu finden. Abweichend davon zeigen sich bei der zweiten Versuchsreihe nach Inokulation von HAV/IgA in etwa die gleichen Werte in der Leber wie nach Inokulation der HAV/IgG Kontrolle. D.h. deutlich geringere HAV RNA Konzentration als nach Inokulation von nicht Antikörper komplexiertem HAV. HAV (-) Strang RNA konnte in beiden Versuchsreihen in nur sehr geringen Konzentrationen detektiert werden, wobei die Werte bei der ersten Versuchsreihe, insbesondere nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen, etwas höher sind. In der zweiten Versuchsreihe konnte von den 16 Werten pro Inokula nur 2 bei HAV/IgA und je einer bei HAV und HAV/IgG Inokulation positiv für HAV (-) Strang RNA detektiert werden. °= Extremwerte; *= Ausreißer

A B

C D

59

Beide Versuchsreihen unterscheiden sich lediglich dadurch, dass andere Individuen

eingesetzt wurden. Obwohl mit Tieren im Alter von 42 – 46 Tagen gearbeitet wurde,

schienen die Mäuse in den beiden Versuchsreihen in ihrer Größe voneinander abzuweichen,

was auf unterschiedliches Alter der Individuen hindeutet. Aufgrund der unterschiedlichen

Reifung des Immunsystems könnte dies einen Einfluss auf das Ergebnis gehabt haben. Um

diese Schwankungen in den folgenden Versuchen zu minimieren, wurde das Gewicht der

Mäuse bestimmt. Obwohl das Alter der Mäuse in den beiden Versuchsreihen maximal 4

Tage auseinander lag (42 - 46 Tage alt), hatte dies großen Einfluss auf die Erreichbarkeit der

Leber. Nicht nur das Alter der Mäuse, auch andere allgemeine physiologische Unterschiede

zwischen den Individuen scheinen Einfluss auf die Infizierbarkeit der Mäuse zu haben. Um

vor dem Hintergrund mehrerer unabhängiger Variabler, die das Infektionsereignis

beieinflussen können, eine Aussage treffen zu können, wurde das Ergebnis beider

Versuchsreihen in Abb. 13 zusammengefaßt.

Abb. 13: Boxplot Diagramm zusammengefasst aus zwei Versuchstierreihen. HAV RNA Konzentration in der Leber nach Inokulation der Mäuse mit HAV, HAV/IgA- und HAV/IgG-Komplexen. Nach Inokulation von HAV und HAV/IgA-Komplexen ist die Streuung der HAV RNA Konzentrationen in der Leber nahezu gleich, d.h. bei einigen Indiviuen kommen in der Leber nach Inokulation mit HAV/IgA ähnliche virale RNA Konzentrationen an, als nach Inokulation von freiem HAV. Nach HAV/IgA Inokulation zeigt sich jedoch eine deutliche Schiefe in der Verteilung der Werte. Die Hälfte der Individuen zeigt in der Leber ähnliche HAV RNA Konzentrationen wie nach Inokulation der HAV/Antikörper Kontrolle HAV/IgG.D.h. die Erreichbarkeit der Leber in Tieren dieser Altersgruppe ist nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen stark vom Indiviuum abhängig. °= Extremwerte; *= Ausreißer

60

Die Zusammenfassung aller Individuen im Alter von 42 - 46 Tagen (d.h. Versuchsreihe 1

und 2) zeigt sich nach Inokulation mit unkomplexiertem HAV und nach Inokulation mit

HAV/IgA-Komplexen in Größe und Lage der Box ein ähnliches Bild. Der Median der HAV

Konzentrationen in der Leber nach Inokulation mit freiem HAV liegt über 200 HAV RNA IU/µg

total RNA, wohingegen durch Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen bei der Hälfte der Mäuse

in der Leber unter 100 HAV RNA IU/µg total RNA ankommen. Der Median der HAV/IgG

Kontrolle liegt bei 54 HAV RNA IU/µg total RNA, die Werte sind normalverteilt und zeigen

eine geringe Streuung. Die Streuung der Konzentrationen in der Leber nach Inokulation mit

HAV/IgA-Komplexen ist deutlich größer als nach HAV/IgG Inokulation und gleicht der

Streuung nach Inokulation mit freiem HAV. D.h. die Erreichbarkeit durch HAV/IgA-Komplexe,

aber auch durch freies HAV ist stark vom Indiviuum und dessen physiologischer Ausstattung

abhängig. Die deutliche Schiefe der Verteilung nach Inokulation von HAV/IgA (siehe Abb. 13)

zeigt, dass innerhalb dieser Altersklasse viele Werte mit geringer HAV RNA Konzentration

und einige wenige mit extrem hoher HAV RNA Konzentration in der Leber gefunden wurden.

Innerhalb der untersuchten Altersgruppe ist die Erreichbarkeit der Leber durch HAV/IgA in

einigen Individuen deutlich höher als durch HAV/IgG-Komplexe und vergleichbar mit der

Erreichbarkeit der Leber durch unkomplexiertes HAV. Auch generalisiert über beide

Versuchsreihe wurden bei allen Inokula nur sehr geringe HAV (-) Strang RNA Mengen in der

Leber gefunden. Dabei ist ein deutlicher Unterschied zwischen der HAV (-) Strang RNA

Konzentration in der Leber nach Inokulation von HAV/IgA-Komplexen und nach Inokulation

von HAV/IgG und unkomplexiertem HAV zu beobachten. Nach Inokulation der HAV/IgA-

Komplexe findet eine produktive Infektion der Leber statt. Die über beide Versuchsreihen

generalisierten Werte zeigen eine große Streuung, wobei 75 % der Daten unter 0,325 IU (-)

Strang RNA/µg total RNA liegen. Auch nach Inokulation von HAV/IgG-Komplexen und

unkomplexiertem HAV ist (-) Strang RNA in der Leber einiger Tiere nachweisbar, die

Infektion trat dabei aber nur sehr vereinzelt in einigen Tieren auf, wobei die einzelnen Daten

in der Höhe der (-) Strang RNA Konzentrationen vergleichbar mit denen nach HAV/IgA-

Komplex Inokulation waren.

3.3.2.2 Verteilung des HAV nach Inokulation von HAV , HAV/anti-HAV IgA- und

HAV/anti-HAV IgG-Komplexen

Abb. 14 zeigt die Verteilung der HAV RNA und der HAV (-) Strang RNA Konzentrationen auf

die Organe nach Inokulation von HAV und HAV-Immunkomplexen. In Abb. 14 A und B sind

die Ergebnisse der ersten Versuchstierreihe, in Abb. 14 C und D die der zweiten

Versuchstierreihe gezeigt. Die recovery rate nach Inokulation der Versuchstiere mit HAV

61

anti-HAV IgA-Komplexen ist in der ersten Tierreihe (Abb. 14 A) signifikant höher als nach

Inokulation von HAV bzw. HAV/anti-HAV IgG-Komplexen. Während es nach Inokulation von

HAV und HAV/IgG-Komplexen zwischen den HAV RNA Konzentrationen in den Organen

keinen signifikanten Unterschied gibt, zeigt sich nach Inokulation von HAV/IgA in der Milz

eine signifikant höhere HAV RNA Konzentration als in Leber und Niere. Bezogen auf das

gesamte Organ, d.h. unter Berücksichtigung des Organgewichtes, (siehe Abb.15 A) ist in der

Leber nach HAV/IgA Gabe eine deutlich höhere HAV RNA Menge vorhanden als in Niere

und Milz. Nach Inokulation mit HAV und HAV/IgG-Komplexen zeigen sich zwischen den

Medianen der Organe kaum Unterschiede. Die Streuung der Virusmenge ist in Niere und

Milz sehr gering (Abb. 15 A). In der Leber ist sie bei beiden Inokula wesentlich größer und

zeigt eine deutliche Schiefe der Verteilung zu den niedrigen Virusmengen. D.h. in der ersten

Versuchsreihe ist nach Inokulation von HAV/IgA-Komplexen deutlich mehr virale RNA in den

Organen als nach Inokulation von HAV und HAV/IgG, desweiteren ist bei allen Inokula die

höchste Virusmenge in der Leber zu finden (Abb. 15 A). (-) Strang HAV RNA (Abb. 14 B)

wird in den einzelnen Geweben teilweise in sehr geringen Mengen detektiert, signifikante

Unterschiede zwischen den Inokula zeigen sich dabei nicht, jedoch lässt sich ein leichter

Trend zu häufigeren Replikationsereignissen nach HAV/IgA Inokulation beobachten. Wie bei

Betrachtung der Leber (siehe 3.3.2.1), zeigt sich auch in der Verteilung des Virus auf die

Organe in der zweiten Versuchsreihe (Abb. 14 C und 15 B) ein anderes Bild als in der ersten

Versuchstierreihe (Abb. 14 A und 15 A). Die detektierten Virusmengen sind deutlich geringer

als in dem ersten Versuchsdurchlauf. Die Tiere, die mit HAV/anti-HAV IgG-Komplexen

inokuliert wurden zeigen insgesamt die geringste Viruskonzentrationen, der Unterschied zu

den HAV und HAV/anti-HAV IgA-Komplex inokulierten Tieren ist jedoch geringer als im

ersten Versuchsdurchlauf. Wie Abb. 14 C zeigt ist kein signifikanter Unterschied der HAV

Konzentration in Abhängigkeit vom Inokula auszumachen. Korrelierend mit dem Ergebnis

der ersten Versuchsreihe ist nach Inokulation der Tiere mit HAV/IgA-Komplexen eine

signifikant höhere HAV RNA Konzentration in der Milz als in Leber und Niere vorhanden.

Nach Inokulation von HAV gibt es keine signifikanten Unterschiede der Viruskonzentration

(Abb 14 C) in den einzelnen Organen, wobei die Konzentration in der Niere nicht signifikant

(p<0,05), aber deutlich geringer ist als in Leber und Milz.

62

Abb. 14: Boxplot Diagramme der Hepatitis A-Virus RNA (A und C) und (-) Strang RNA Konzentrationen (B und D) in den Organen der Versuchstiere nach vorheriger Inokulation mit HAV, HAV anti-HAV IgA- und HAV anti-HAV IgG-Komplexen. A) und B) zeigt die Verteilung der HAV RNA und HAV (-) Strang RNA Konzentration in den Organe der ersten Versuchstierreihe; C) und D) zeigt das Ergebnis der zweiten Versuchsreihe. Die erste Reihe (A) zeigt nach Inokulation mit HAV/IgA deutlich höhere Konzentrationen, wobei in der Milz die höchsten Konzentrationen auftreten, als nach Inokulation mit HAV/IgG und HAV. Dagegen zeigt die zweite Versuchsreihe (C) eine deutlich heterogenere Konzentrationsverteilung. HAV (-) Strang RNA (B und D) tritt in beiden Versuchsreihen in sehr geringen Konzentrationen sporadisch auf. Signifikante Unterschiede zwischen den Inokula sind dabei nicht zu beobachten. °= Extremwerte; *= Ausreißer

A B

C D

63

Im Gesamtorgan (Abb. 15 B) zeigt sich, im Gegensatz zu den Konzentrationen, nach HAV

Inokulation ein anderes Muster. In der Leber ist deutlich mehr HAV RNA vorhanden als in

Niere und Milz. Nach Inokulation von HAV/IgG-Komplexen treten ähnlich den HAV/IgA-

Komplexen höhere Viruskonzentrationen in der Milz als in Leber und Niere auf, wobei der

Unterschied zwar deutlich (p=0,09) aber nicht signifikant ist (Abb. 14 C).

Bezogen auf die Virusmenge im Organ lassen sich nach HAV/IgA Inokulation die höchsten

Mengen in der Leber (mit einer schiefen Verteilung zu geringeren Mengen) und nach

Inokulation mit HAV/IgG relativ ähnliche Virusmengen in allen drei Organen, jedoch ebenfalls

die höchsten Menge in der Leber (mit einer schiefen Verteilung zu geringeren Mengen)

finden. D.h. obwohl die Viruskonzentrationen bei Inokulation mit HAV/IgA und HAV/IgG in

der Milz am höchsten und in der Leber am niedrigsten sind, ist die Virusmenge bezogen auf

das gesamte Organ in der Leber, aufgrund der Größe des Organs, höher als in Niere und

Milz wohingegen Inokulation mit HAV sowohl die höchste Konzentration als auch die höchste

RNA Menge in der Leber zeigt. Die (-) Strang HAV RNA (Abb. 14 D) zeigte auch in dieser

Abb. 15: HAV RNA Menge in den Organen der Versuchstiere nach vorheriger Inokulation mit HAV, HAV/IgA- und HAV/IgG-Komplexen dargestellt als Boxplot Diagramm. Abb. A zeigt die Verteilung der HAV RNA Menge in den Organen der ersten Versuchstierreihe; B zeigt das Ergebnis der zweiten Versuchsreihe. In beiden Versuchsreihen ist bei allen Inokula in der Leber die höchste HAV RNA Menge zu finden. Die erste Reihe (A) zeigt nach Inokulation mit HAV/IgA in allen Organen deutlich höhere Virusmengen, als nach Inokulation mit HAV/IgG und HAV. In der zweiten Versuchsreihe dagegen ist der Unterschied zwischen den Inokula deutlich geringer, wobei nach HAV Inokulation wesentlich mehr virale RNA in der Leber zu finden ist als in anderen Organen der gleichen und anderen Inokulationsarten.

°= Extremwerte; *= Ausreißer

A B

64

Tierreihe nur vereinzelte Daten, die keine signifikanten Unterschiede untereinander

beinhalten.

Sowohl bei der Betrachtung der Viruskonzentration als auch bei der Verteilung in den

verschiedenen Organen sind Unterschiede zwischen den Versuchstierreihen aufgetreten.

Die Versuchstiere der jeweiligen Reihen schienen subjektiv in der Größe voneinander

abzuweichen. Ein etwaiger Einfluss des Alters der Mäuse bzw. der Reifung des

Immunsystems könnte Einfluss auf die Versuchsergebnisse nehmen. Generalisiert über

beide Versuchsreihen lassen sich nach HAV/IgA Inokulation in allen Organen deutlich

höhere Virusmengen nachweisen als nach Inokulation von HAV und HAV/IgG. Bei allen

Inokula ist in der Leber mehr virale RNA zu finden als in Niere und Milz. Innerhalb der

untersuchten Altersgruppe ist die Erreichbarkeit der Leber durch HAV/IgA in einigen

Individuen deutlich höher als durch HAV/IgG-Komplexe, jedoch unterliegt dies starken

individuellen Schwankungen.

3.3.2.3 Vergleich des anti-HAV IgA vermittelten Tra nsports zur Leber in Mäusen

unterschiedlichen Alters

Die Mäuse der ersten beiden Versuchsreihen hatten ein Alter von 42 - 46 Tagen. Obwohl der

Zeitraum nur sehr begrenzt ist, schienen die Mäuse der beiden Versuchsreihen in ihrer

Entwicklung, bezogen auf Größe und Gewicht, deutlich auseinander zu liegen. Um die Frage

zu klären, ob der Entwicklungsstand der Mäuse einen Einfluss auf die Verteilung des Virus

und die Erreichbarkeit der Leber hat, wurden Mäuse im Alter von 42 – 46 (jugendlich) und 63

– 84 Tagen (erwachsen) verglichen. Je vier Mäuse beider Altersgruppen wurden mit je

einem Milliliter HAV, HAV/anti-HAV IgA- und HAV/anti-HAV IgG-Komplexen [2 x 108 IU/ml]

i. p. inokuliert und nach vier Tagen sektioniert. Die Gewebe Leber, Niere, Milz, Gekröse

(Lymphgewebe des Darms) und Thymus wurden entnommen und die HAV RNA und

gesamte RNA Menge quantifiziert. Die jugendlichen Mäuse wogen 16,5 - 20,9 g, die älteren

Mäuse zwischen 23,0 und 25,8 g.

Abb. 16 zeigt einen signifikanten Unterschied in der HAV RNA Konzentration (Abb. 16 A)

und der HAV (-) Strang RNA Menge (Abb. 16 B) zwischen jugendlichen und erwachsenen

Mäusen. Generell liessen sich in den erwachsenen Mäusen deutlich höhere HAV RNA und

auch HAV (-) Strang RNA Konzentrationen nachweisen.

65

Abb. 16: Boxplot Diagramme der HAV RNA (A) und (-) Strang RNA Konzentrationen (B) aus den Organen von Versuchstieren unterschiedlicher Altersgruppen. In den jugendlichen Mäusen (42 – 46 Tage) ist die HAV RNA und HAV (-) Strang RNA Konzentration deutlich geringer als in den 63 – 84 Tage alten Mäusen. Gekröse und Thymus zeigen die höchsten HAV RNA und (-) Strang RNA Konzentrationen, wobei die Streuung der Werte wesentlich größer ist als in den anderen Geweben.

°= Extremwerte; *= Ausreißer

B

A

66

In beiden Altersgruppen sind nach Inokulation von HAV/IgA-Komplexen höhere HAV RNA

Konzentrationen nachweisbar als nach Inokulation von HAV/IgG und unkomplexiertem HAV.

Sowohl bei den jugendlichen als auch bei den erwachsenen Mäusen wurden die höchsten

Viruskonzentrationen in den Geweben Gekröse, Thymus und Milz detektiert. In Leber und

Niere sind im Vergleich zu den Lymphgeweben deutlich geringere Konzentrationen

auffindbar. Dieses Verteilungsmuster ändert sich bei Betrachtung der HAV RNA Menge im

gesamten Organ aufgrund der unterschiedlichen Organgrößen. Während die

Konzentrationen in der Leber deutlich geringer sind als in Gekröse und Milz, ist die Viruslast

in der Leber bezogen aufs gesamte Organ deutlich höher (siehe Abs. 3.3.2.2). Bei den HAV

(-) Strang RNA Konzentrationen (Abb. 16 B) ist der Unterschied zwischen den Organen nicht

ganz so deutlich. Lediglich die Streuung in den Proben des Gekröses ist größer, der Median

liegt aber vergleichbar mit den anderen Organen. Eine Ausnahme ist die (-) Strang RNA

Menge erwachsener Mäuse, die mit HAV/IgA-Komplexen inokuliert wurden. Bei diesen

Tieren lies sich im Gekröse deutlich mehr (-) Strang RNA nachweisen als bei den anderen

Mäusen, was auf eine bessere Replikation im Darmgewebe dieser Tiere hinweist.

In Abb. 17 A ist die HAV RNA Konzentration im Boxplot Diagramm aufgetragen, welche nach

Inokulation von Mäusen unterschiedlicher Altersklassen mit HAV, HAV/IgG- und HAV/IgA-

Komplexen in der Leber nachweisbar ist. Unabhängig von der Art des Inokula finden sich in

den jüngeren Mäusen signifikant geringere Viruskonzentrationen als in den älteren, d.h. das

Alter der Mäuse hat einen Einfluss auf den Transport des Virus. Bei den jüngeren Mäusen

lässt sich nach Inokulation mit HAV mehr Virus in der Leber detektieren als nach Gabe von

HAV/IgA- und HAV/IgG-Komplexen, wobei dieser Unterschied nicht signifikant ist. Bei den

älteren Mäusen wird deutlich (p = 0,08) mehr HAV RNA in der Leber nach Inokulation von

HAV/IgA detektiert, als nach Inokulation von HAV oder auch HAV/IgG. Der Nachweis des (-)

Stranges ergab in den jüngeren Mäusen trotz einer größeren Streuung der HAV

Konzentrationen nach Inokulation von HAV und HAV/IgG-Komplexen keinen vom Inokulum

abhängigen Unterschied (siehe Abb. 17 B). Die älteren Mäuse zeigen nach HAV/IgA

Inokulation deutlich mehr (-) Strang RNA in der Leber als nach Inokulation mit HAV und

HAV/IgG-Komplexen, d.h. die Erreichbarkeit der Leber ist mit HAV/IgA-Komplexen deutlich

besser als mit HAV bzw. HAV/IgG-Komplexen und es kommt zur Infektion und

Virusreplikation.

67

Abb. 17: Vergleich der HAV RNA (A) und (-) Strang RNA Konzentrationen (B) in der Leber von Mäusen unterschiedlicher Altersgruppen nach Inokulation mit HAV und HAV Immunkomplexen. In der Leber der älteren Tiere (63 – 84 Tage) sind nach HAV/IgA Inokulation deutlich höhere HAV RNA und HAV (-) Strang RNA Konzentrationen nachweisbar als nach Inokulation von HAV und HAV/IgG, wohingegen in den jugendlichen Mäusen die höchsten HAV RNA Konzentrationen nach Inokulation von unkomplexiertem HAV auftreten. °= Extremwerte; *= Ausreißer

Die Ergebnisse zeigen, dass IgA als Carrier für die Erreichbarkeit der Leber durch HAV

dienen kann, dieser Mechanismus aber vom individuellen physiologischen Zustand des

Tieres abhängig ist. In den älteren Tieren erreichen die HAV/IgA-Komplexe die Leber

deutlich besser, d.h. in höherer Konzentration als freies HAV. In der Gesamtheit der

untersuchten Tiere unterliegt die Erreichbarkeit der Leber durch HAV/IgA-Komplexe starken

Schwankungen. Ob und mit welcher Effinzienz die Leber erreicht wird ist stark vom

individuellen physiologischen Zustand der Tiere abhängig, jedoch wird die Leber nach

Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen auch generalisiert über alle Tiere besser erreicht als

durch die HAV/Antikörper-Komplex Kontrolle HAV/IgG.

3.3.3 Einfluss der Immunantwort auf den anti-HAV Ig A Carriermechanismus

In 3.3.2 wurde gezeigt, dass das Hepatitis A-Virus die Leber durch einen IgA vermittelten

Carriermechanismus erreichen kann. Durch die IgA Komplexierung ist das Virus zunächst

vor Neutralisation durch anti-HAV IgG Antikörper geschützt. Während der Reifung der

Immunreaktion werden hochavide anti-HAV IgG Antikörper gebildet, die das IgA aus den

A B

68

HAV/IgA-Komplexen verdrängen und so den Carriermechanismus zur Leber unterbrechen

könnten. Ob und ab welchem Zeitpunkt die Avidität der anti-HAV IgG Antikörper stark genug

ist das IgA aus den Komplexen zu verdrängen, das Virus zu neutralisieren und dadurch eine

Infektion bzw. den möglichen enterohepatischen Kreislauf zu unterbrechen, wurde in den

folgenden Experimenten untersucht.

3.3.3.1 Neutralisation der HAV/anti-HAV IgA-Komplex e mittels monoklonaler anti-HAV

IgG Antikörper in Zellkultur

In einem Zellkulturversuch wurde untersucht, ob anti-HAV IgG Antikörper in der Lage sind

den IgA vermittelten Carriermechanismus durch Veränderung der HAV/anti-HAV IgA-

Komplexe zu neutralisieren. Dazu wurden NCTC Zellen (murine Hepatozyten) mit

verschiedenen HAV/Immunkomplexen sowie zur Kontrolle mit unkomplexiertem HAV infiziert

und die HAV RNA Konzentrationen zum Zeitpunkt 0, 1 und 2 Tage nach der Infektion

bestimmt. In diesem Experiment wurde der hochavide monoklonale anti-HAV IgG Antikörper

7E7 verwendet. Zur Untersuchung einer möglichen Kompetition zwischen anti-HAV IgA und

anti-HAV IgG wurde die Komplexierung des Virus mit beiden Antikörpern auf

unterschiedliche Weise durchgeführt. In einem Ansatz erfolgte die Zugabe von anti-HAV IgA

und anti-HAV IgG zur Komplexbildung zeitgleich (Abb. 18: HAV/IgA/IgG), so dass eine

direkte Kompetition zu beobachten ist. In einem weiteren Ansatz sollte eine mögliche

Verdrängung des IgA durch anti-HAV IgG aus bereits gebildeten HAV/IgA-Immunkomplexen

geprüft werden. Dazu wurden zunächst HAV/anti-HAV IgA-Komplexe hergestellt, zu denen

dann Immunglobulin G gegeben wurde (siehe Abb. 18: HAV/IgA + IgG).

In NCTC Zellen findet nach Infektion mit HAV keinerlei Viruswachstum statt. Abb. 18 zeigt,

dass das direkt nach der Infektion vorhandene und an die Zellen gebundene Virus nach

einem und zwei Tagen deutlich reduziert ist und keine Replikation stattfindet. Im Gegensatz

dazu ist die Viruslast der Zellen nach Infektion mit HAV/anti-HAV IgA-Komplexen nach ein

und zwei Tagen höher bzw. gleichbleibend, d.h. Virusreplikation findet statt. HAV neutralisiert

mit anti-HAV IgG zeigt bereits direkt nach der Infektion deutlich weniger an die Zellen

gebundenes Virus als nach Infektion mit nicht komplexiertem Virus und den HAV/IgA-

Komplexen, d.h. die Bindung des Virus an die Zellen ist durch den anti-HAV IgG Antikörper

behindert. Auch wird das Virus bei den HAV/IgG-Komplexen nach einem und zwei Tagen

nahezu vollständig eliminiert, Virusreplikation findet nicht statt. Bei paralleler HAV

Komplexierung durch IgA und IgG wird der Effekt des IgA ebenso aufgehoben, wie bei

Zugabe des Immunglobulin G zu fertigen HAV/IgA-Komplexen. Bei Infektion mit diesen

Immunkomplexen findet trotz des vorhandenen IgA keinerlei Viruswachstum in den NCTC

69

Zellen statt. Bereits einen Tag nach der Infektion ist das Virus vollständig aus den Zellen

eliminiert, d.h. anti-HAV IgG Antikörper neutralisieren die Infektiösität der HAV/anti-HAV IgA-

Komplexe. Immunglobulin G ist durch Verdrängung des IgA oder zusätzliche Bindung in der

Lage HAV/IgA-Komplexe zu neutralisieren. Dieses Ergebnis zeigt, dass ein Abbruch des IgA

vermittelten Carriermechanismus in vivo durch Neutralisation der HAV/IgA-Komplexe mit

anti-HAV IgG Antikörpern möglich ist.

3.3.3.2 Untersuchung zur Inhibition des anti-HAV Ig A Carriermechanismus durch anti-

HAV IgG Antikörper

Die Immunisierung der 6 Wochen alten Mäuse (15 Mäuse) erfolgte zum Zeitpunkt 0, 1 und 3

Monate, wobei nicht immunisierte Mäuse nach gleichem Schema mit PBS inokuliert wurden.

Nach weiteren drei Monaten (6 Monate nach der ersten Immunisierung) erfolgte die

Inokulation von 4 nicht immunisierten und 5 immunisierten Mäusen mit HAV sowie 9 nicht

immunisierten und 10 immunisierten Mäusen mit HAV/IgA-Komplexen. Auf die Kontrolle der

Inokulation von HAV/IgG-Komplexen wurde verzichtet, da aus den vorangegangenen

Abb. 18: HAV RNA Konzentrationen in NCTC Zellen nach Infektion mit HAV, HAV/anti-HAV IgA- und IgG-Komplexen sowie Immunkomplexen mit anti-HAV IgA und IgG. Während nach Infektion mit HAV/IgA-Komplexen über zwei Tage Virus in den Zellen nachweisbar ist, ist das Virus nach Infektion mit unkomplexiertem HAV und den IgG enthaltenden Immunkomplexen bereits nach einem Tag nahezu vollständig eleminiert. HAV/IgA/IgG = kompetitive Komplexbildung HAV/IgA + IgG = Zugabe des IgG zu fertigen HAV/IgA Komplexen

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

HAV HAV/IgA HAV/IgG HAV/IgA/IgG HAV/IgA +IgG

Immunkomplexe

HA

V R

NA

IU/µ

g to

tal R

NA

0

1

2

Tage nach Infektion

70

Versuchen der schlechtere Transport des Virus im Vergleich zu HAV und HAV/IgA-

Komplexen ausreichend gezeigt wurde. Die Sektion der Tiere und Analyse der Gewebe

erfolgte weitere vier Tage später.

Tab. 9: Untersuchung des anti-HAV IgG Status mittels EIA aus dem Serum der immunisierten Mäuse

EIA Werte (OD) der Seren vom Maus Nr. 22.03.06 20.04.06 14.06.06 01.08.06

Immunstatus anti-HAV IgG

14 2,4147 2,2028 1,8701 1,8611 +

15 2,4241 2,2451 2,1069 2,4170 +/-

16 2,3185 2,3290 2,1336 2,1055 +/-

17 2,5186 2,2288 1,2410 0,9934 ++

18 2,3877 2,0724 1,2842 1,5996 ++

19 1,9898 1,8535 1,9102 1,7653 +

20 2,0574 1,8130 2,2131 2,0584 +/-

21 2,2596 1,9837 1,8719 1,8810 +

22 2,5369 1,9432 2,0292 1,4174 ++

23 2,4712 2,1325 1,9053 1,8776 +

24 2,5394 2,1567 0,8363 0,8455 ++

25 2,3451 1,8459 2,1151 1,7346 +

26 2,3485 2,1805 1,8863 1,8461 +

27 2,0725 1,7585 1,0885 1,1668 ++

28 2,2831 1,7426 0,9976 1,0363 ++ +/- = geringer anti-HAV IgG Titer + = mittlerer anti-HAV IgG Titer ++ = hoher anti-HAV IgG Titer

Den Mäusen wurde vor der ersten Immunisierung, nach 1, 3 und 5 Monaten durch Punktion

des retrobulbären Venenplexus Blut entnommen und auf anti-HAV IgG Antikörper im EIA

untersucht (siehe Tab. 9). Das Blut der nicht immunisierten Mäuse wurde vor der ersten und

nach der letzten PBS Inokulation im EIA getestet und war in allen Mäusen anti-HAV IgG

Antikörper negativ (Daten nicht gezeigt). Die Menge der anti-HAV IgG Antikörper verhält sich

direkt antiproportional zum OD-Wert aus der EIA, d.h. je kleiner der OD-Wert desto mehr

IgG-Antikörper sind vorhanden. Der cut-off für diese EIA Analyse war 1,5. Bei einem OD-

Wert unterhalb des cut-off ist die Reaktion positiv, d.h. IgG-Antikörper sind vorhanden. Die

Bildung der anti-HAV IgG Antikörper ist stark vom Individuum abhängig, die Schwankung ist

relativ groß und einige Mäuse zeigten sehr schlechte Antikörper Werte bzw. OD-Werte über

dem cut-off. Im Vergleich zu den OD-Werten der Seren vor der ersten Impfung konnten

jedoch alle Mäuse als immunisiert betrachtet, mit HAV bzw. HAV/IgA-Komplexen inokuliert

und mit den entsprechend behandelten nicht immunisierten Mäusen verglichen werden.

71

Abb. 19 A zeigt, dass nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen deutlich höhere HAV RNA

Konzentrationen in den nicht immunisierten Mäusen als in den immunisierten auftreten. Der

Median in den nicht immunisierten Mäusen ist 127,4 IU/µg RNA, wohingegen der Median der

immunisierten Mäuse bei 30 IU/µg RNA liegt. Die Konzentration der viralen RNA ist nach

HAV Inokulation in den nicht immunisierten Mäusen in etwa gleich mit der RNA

Konzentration nach Inokulation mit HAV/IgA in den immunisierten Mäusen. D.h. der für das

Virus positive Einfluss durch den IgA-Carriermechanismus kommt bei immunisierten Tieren

nicht zum tragen und die virale RNA Konzentration ist gleich der nach HAV Inokulation in

nicht immunisierten Mäusen. Korrelierend mit den Ergebnissen aus 3.3.2 zeigt sich, dass

auch hier in den nicht immunisierten Mäusen nach Inokulation von HAV/IgA-Komplexen

wesentlich höhere Viruskonzentrationen in der Leber auftreten als nach HAV Inokulation.

D.h. das Virus erreicht die Leber mit IgA komplexiert deutlich besser als nicht komplexiert. In

Mäusen die anti-HAV IgG Antikörper positiv sind, ist dies nicht mehr der Fall und der

Carriermechanismus des anti-HAV IgA ist aufgehoben. Die Verteilung der HAV RNA

Konzentrationen in den Organen (Abb. 19 B) bestätigt dies. Unabhängig von den Organen ist

in den nicht immunisierten Mäusen, die mit HAV/IgA-Komplexen inokuliert wurden,

Abb. 19: Vergleich der HAV RNA Konzentrationen in der Leber (A) von immunisierten und nicht immunisierten Mäusen nach Inokulation mit HAV und HAV/IgA-Komplexen, sowie der Verteilung der HAV RNA Konzentrationen in den Organen (B). Nach Inokulation mit HAV/IgA ist die Viruskonzentration in der Leber bei nicht immunisierten Tieren deutlich höher als bei immunisierten Tieren und auch deutlich höher als nach Inokulation von unkomplexiertem HAV. Die Verteilung der HAV RNA Konzentration in den Organen zeigt signifikant höhere Konzentrationen nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen. Besonders deutlich wird dies im Gekröse der nicht immunisierten Mäuse. °= Extremwerte; *= Ausreißer

A B

72

signifikant mehr Virus nachweisbar als in den immunisierten. Bei Inokulation mit HAV tritt

kein signifikanter Unterschied der HAV RNA Konzentrationen in den Organen zwischen den

immunisierten und nicht immunisierten Mäusen auf. Diese Ergebnisse lassen die Vermutung

zu, dass der HAV IgA Carriermechanismus durch die Immunisierung bzw. anti-HAV IgG

Antikörper aufgehoben wird.

3.3.3.3 Abhängigkeit der anti-HAV IgA Verdrängung v om Reifungsgrad der

Immunantwort

Zur Klärung, ob die Infektiösität der HAV/IgA-Komplexe durch die Kompetition zwischen IgA-

und neutralisierenden IgG-Antikörpern von der Reifung der Immunantwort, d.h. von Menge

und Avidität der Antikörper abhängig ist, wurden Mäuse immunisiert und zu

unterschiedlichen Zeitpunkten nach Beginn der Immunisierung mit HAV/IgA inokuliert. Es

wird vermutet, dass mit Reifung der Immunantwort antiproportional zur steigenden Avidität

der Immunglobulin G Antikörper der IgA vermittelte Carriermechanismus durch Verdrängung

von IgA aus den Komplexen durch das hochavide IgG inhibiert wird. In Abhängigkeit vom

Reifungsgrad der Immunantwort würde das hochavide IgG zum Abbruch des möglichen

enterohepatischen Kreislaufs, und dadurch schlussendlich zur endgültigen Beendigung der

Infektion führen. D.h. nach Inokulation zu den späteren Zeitpunkten der Immunisierung

würde weniger HAV in der Leber der Tiere ankommen als zu einem frühen Zeitpunkt, bei

dem die Avidität des IgG geringer ist. Sechs Wochen alte Tiere wurden mit HAV (bzw. PBS)

geimpft und eine und drei Monate später geboostert. Einen, drei und sechs Monate nach

Beginn der Immunisierung erfolgte die Inokulation. Dabei wurden zu jedem der Zeitpunkte je

vier immunisierte und vier nicht immunisierte Mäuse mit HAV/IgA-Komplexen, sowie jeweils

drei Mäuse mit HAV inokuliert (Daten nicht gezeigt). Jeweils vier Tage nach der HAV/IgA

Inokulation wurden die Tiere sektioniert und die HAV RNA Menge in den Organen analysiert.

Den Mäusen wurde vor der ersten Immunisierung, nach 1, 3 und 6 Monaten durch Punktion

des retrobulbären Venenplexus Blut entnommen und auf anti-HAV IgG Antikörper im EIA

untersucht (siehe Tab. 10), wobei den inokulierten Mäusen bei der jeweiligen Sektion das

Blut entnommen wurde. Das Blut der nicht immunisierten Mäuse wurde vor der ersten und

nach der letzten Mock-Immunisierung im EIA getestet und war in allen Mäusen anti-HAV IgG

Antikörper negativ, daher wurden diese Mäuse in der Tabelle 10 nicht gesondert aufgeführt.

73

Tab. 10: Untersuchung des anti-HAV IgG Status mittels EIA aus dem Serum der immunisierten Mäuse

EIA Werte (OD) der Seren zum Zeitpunkt nach Beginn der Immunisierung Immunstatus anti-HAV IgG

Maus Nr. 0-Serum 1 Monat 3 Monate 6 Monate 19 0,417 0,369 0,054 0,014 ++ 20 0,438 0,373 0,091 0,021 ++ 21 0,461 0,397 0,421 0,178 + 22 0,449 0,271 0,155 0,075 ++ 23 0,396 0,451 0,153 0,044 ++ 24 0,427 0,185 0,051 0,068 ++ 25 0,456 0,397 0,082 0,037 ++ 26 0,477 0,404 0,089 ++ 27 0,378 0,399 0,121 + 28 0,408 0,244 0,061 ++ 29 0,457 0,317 0,038 ++ 30 0,441 0,188 + 31 0,421 0,389 +/- 32 0,350 0,117 + 33 0,376 0,161 + 34 0,534 0,369 +/- 35 0,406 0,221 +/- 36 0,418 0,309 +/-

Mittelwerte EIA (OD) 0,428 0,251 0,077 0,062

rote Schrift: OD bzw. OD-Mittelwerte der Tiere, die zum angegebenen Zeitpunkt infiziert und 4 Tage später sektioniert wurden +/- = geringer anti-HAV IgG Titer + = mittlerer anti-HAV IgG Titer ++ = hoher anti-HAV IgG Titer

Tabelle 10 zeigt die Entwicklung der anti-HAV IgG Antikörper mittels EIA gemessen. Der

berechnete cut-off Wert für diese Untersuchung ist 0,16. OD-Werte unterhalb dieses Wertes

sind als anti-HAV IgG positiv zu betrachten. Anhand der Mittelwerte der OD des EIA lässt

sich die Zunahme der anti-HAV IgG Antikörper über die Zeit verfolgen. So zeigt das Serum

vor der Immunisierung (0-Serum) im Mittel eine OD von 0,428; einen Monat nach der ersten

Impfung 0,309, 3 Monate nach Beginn der Immunisierung ist der OD-Wert 0,119 und

6 Monate nach Beginn der Immunisierung ist die OD im Mittel 0,062. Die Menge der anti-

HAV IgG Antikörper verhält sich antiproportional zur OD des EIA, d.h. das Immunglobulin G

im Serum der Mäuse nimmt über die Zeit nach der Immunisierung deutlich zu. Die Fähigkeit

des IgG, Hepatitis A-Viren zu neutralisieren wurde in Zellkultur überprüft. Dazu wurde HAV

mit Mausseren komplexiert, und mit den so hergestellten Immunkomplexen wurde eine

Infektion in FRhK-4 Zellen durchgeführt. Nach 7 Tagen zeigt sich eine Neutralisation des

HAV durch eine Verringerung der Viruslast im Vergleich zur Infektion mit nicht

neutralisiertem HAV. In Abb. 19 ist das Ergebnis exemplarisch für zwei Seren (Maus Nr. 22

und Nr. 24) gezeigt. Die Komplexbildung mit den Seren zum Zeitpunkt 0, d.h. am Tag der

Impfung führte nicht zur Neutralisation des Virus. Die Infektiösität des Virus ist durch diese

Seren nicht eingeschränkt. Das Ergebnis des EIA (siehe Tab 10) zeigt direkt nach Beginn

der Immunisierung (0-Serum) ebenfalls kein IgG im Serum. Eine Abnahme der Infektiösität

ist mit dem Serum der Abnahmezeitpunkten 1, 3 und 6 Monate nach Beginn der

74

Immunisierung zu beobachten. Dabei ist bei beiden Seren eine Korrelation der

Neutralisationsfähigkeit mit den zugehörigen OD-Werten des EIA zu beobachten.

Die Inokulation von HAV/IgA-Komplexen in immunisierten bzw. nicht immunisierten Mäusen

zu unterschiedlichen Zeitpunkten ergab die in Abb. 21 gezeigten HAV RNA Konzentrationen

in der Leber (siehe Abb. 21 A) sowie in Niere, Milz, Gekröse und Thymus (siehe Abb. 21 B).

Die HAV/IgA-Komplex Inokulation einen Monat nach Beginn der Immunisierung, zeigt in der

Leber der nicht immunisierten Mäuse etwas höhere HAV RNA Konzentrationen als in den

immunisierten Mäusen, der Unterschied ist jedoch nicht signifikant. Die anti-HAV IgG

Antikörper Antwort zu diesem Zeitpunkt ist noch sehr gering, so dass kein signifikanter

Unterschied zwischen den immunisierten und nicht immunisierten Tieren zu erwarten ist.

Anhand der OD des EIA zeigt sich, dass nach 3 Monaten ein sehr guter anti-HAV IgG

Antikörper Titer aufgebaut ist. Die Menge an anti-HAV IgG nimmt sechs Monate nach Beginn

der Immunisierung nur noch gering zu (OD 0,119 auf OD 0,062). In der Leber werden zu

diesen Zeitpunkten deutlich unterschiedliche HAV Mengen gemessen. Drei Monate nach

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

HAV

HAV/IgG

HAV/M22

0 M

o.

HAV/M22

1 M

o.

HAV/M22

3 M

o.

HAV/M22

6 M

o.

HAV/M24

0 M

o.

HAV/M24

1 M

o.

HAV/M24

3 M

o.

HAV/M24

6 M

o.

Inokula

HA

V R

NA

IU

/µg

tota

l RN

A

Abb. 20: HAV Neutralisation in FRhK-4 Zellen 7 Tage nach Infektion mit HAV, HAV/anti-HAV IgG sowie Immunkomplexen aus Serum der Mäuse Nr. 22 und Nr. 24 zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Beginn der Immunisierung (0, 1, 3 und 6 Monate). Die Infektion mit HAV, welches mit dem Serum 1 Monat nach Erstimpfung komplexiert wurde (HAV/M22 1 Mo. Und HAV/M24 1 Mo.) zeigt bereits eine deutliche Reduktion der HAV RNA Konzentration im Vergleich zu den Komplexen des Serums zum Zeitpunkt 0. Die Komplexe der späteren Zeitpunkte zeigen eine verstärkte Reduktion bzw. Neutralisation des Virus, die mit den IgG Mengen korrelierend verläuft (ermittelt durch EIA, Tab. 10).

75

Beginn der Immunisierung (die Mäuse haben den zweiten Boost erhalten), zeigt sich ein

signifikanter Unterschied der HAV Menge in der Leber (p < 0,08). Die Viruslast in der Leber

der immunisierten Mäuse ist deutlich höher als in denen der nicht immunisierten Tiere. Bei

Inokulation der HAV/IgA-Komplexe sechs Monate nach Immunisierungsbeginn zeigt sich

kein signifikanter Unterschied in der Leber der immunisierten und nicht immunisierten

Mäuse. D.h. die Viruslast in der Leber der immunisierten Tiere nimmt bei nahezu

gleichbleibendem anti-HAV IgG Antikörpertiter deutlich ab, so dass nach 6 Monaten der

signifikante Unterschied zwischen den immunisierten und nicht immunisierten Tieren

verschwunden ist. Die Betrachtung der anderen Organe (Niere, Milz, Gekröse und Thymus)

zeigt deutlich mehr Virus in den Geweben Gekröse und Thymus als in Niere und Milz. Dies

jedoch unabhängig davon, ob die Tiere immunisiert oder nicht immunisiert wurden und auch

unabhängig von der Reifung der Immunantwort. Die Analyse der (-) Strang RNA Menge

(Daten nicht gezeigt) ergab in keinem Gewebe signifikante Unterschiede und lies keine

Korrelation zur Menge der anti-HAV IgG Antikörper zu.

A B

Abb. 21: Vergleich der HAV RNA Konzentration in der Leber (A) von immunisierten und nicht immunisierten Mäuse nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen, sowie der Verteilung der Konzentrationsverteilung der HAV RNA in den Organen (B) zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Beginn der Immunisierung dargestellt im Boxplot Diagramm. Während die HAV RNA Konzentration in den nicht immunisierten Mäusen über die Zeit relativ konstant bleibt, ist sie in den immunisierten Mäusen 3 Monate nach Beginn der Immunisierung deutlich höher als einen Monat nach Beginn. 6 Monate nach Beginn der Immunisierung ist die HAV RNA Konzentration aber wieder deutlich geringer (A). Die Verteilung der HAV RNA Konzentration in den anderen Organen (B) zeigt keinen wesentlichen Unterschied zwischen den immunisierten und nicht immunisierten Tieren, auch im Zeitverlauf sind keine unterschiede auszumachen. °= Extremwerte; *= Ausreißer

76

Die Ergebnisse zeigen, dass die Erreichbarkeit der Leber durch HAV/IgA-Komplexe generell

vergleichbar ist mit der durch unkomplexiertes HAV. In älteren Mäusen erreichen HAV/IgA-

Komplexe die Leber sogar in höherer Konzentration als durch HAV, wobei die HAV RNA

Konzentrationen in diesen Tieren nach HAV/IgA Inokulation in allen Organen höher ist als in

den jüngeren Mäusen. In in vitro Versuchen konnte gezeigt werden, dass monoklonale IgG

Antikörper die Infektiösität der HAV/IgA-Komplexe inhibieren. Auch in vivo wird durch

Immunisierung der Mäuse, vermutlich durch die dabei entwickelten neutralisierenden IgG

Antikörper, die bessere Erreichbarkeit der Leber durch HAV/IgA-Komplexe inhibiert. Im

Zeitverlauf zeigt sich in immunisierten Mäusen zunächst ein Anstieg der HAV RNA

Konzentration, der nach vollständiger Ausbildung der Immunantwort jedoch wieder reduziert

wird, d.h 6 Monate nach Beginn der Immunisierung wird die Infektiösität der HAV/IgA-

Komplexe neutralisiert.

77

4. DISKUSSION

Der Replikationsort der meisten Viren befindet sich direkt auf ihrem Infektionsweg. So

gelangen beispielsweise Polioviren, die wie HAV fäkal-oral übertragen werden, nach der

oralen Aufnahme in den Magen-Darm-Trakt, wo sie in Zellen des Intestinaltraktes vermehrt

werden. Die am Replikationsort produzierten Virionen werden über den Stuhl ausgeschieden

und schließen so den Infektionskreislauf. Der Replikationsort innerhalb des natürlichen

Infektionsweges hat für das Virus naheliegende Vorteile und garantiert die ausreichende

Anzahl neuproduzierter Virionen für die Transmission. Das Hepatitis A-Virus repliziert

entgegen seinem Infektionsweg nicht im Intestinaltrakt sondern gelangt nachdem es oral

aufgenommen wurde über den Magen in den Darm und von dort über den Blutweg in die

Leber, wo die Replikation in den Hepatozyten stattfindet. Über die Gallenflüssigkeit gelangen

die Virionen zurück in den Intestinaltrakt und werden mit dem Stuhl ausgeschieden. Warum

das Virus den Umweg über die Leber macht und wie es dorthin gelangt ist bisher unklar.

Diskutiert wird ein unterstützender Immunglobulin A-vermittelter Transport des Virus. Die

Leber hat unter anderem die Aufgabe IgA und IgA-Komplexe aus dem Organismus zu

eleminieren(13). IgA bindet spezifisch an TIM-1, welches vermutlich eine wichtige Rolle in der

zellulären Rezeptorbindung des Hepatitis A-Virus spielt(125). Der ASGPR

(Asialoglykoproteinrezeptor) wird ausschließlich von Hepatozyten expremiert und erlaubt

HAV in Form von HAV/IgA-Komplexen die Infektion der Zellen(118,35). Die Untersuchung, ob

das Hepatitis A-Virus tatsächlich mittels eines IgA Carriermechanismus zur Leber gelangt,

wie aufgrund der Zellkulturexperimente postuliert, war Ziel dieser Arbeit.

4.1 Entwicklung des quantitativen real-time RT-PCR Systems

Voraussetzung zur Untersuchung des Transportmechanismus des Hepatitis A-Virus ist die

Möglichkeit sehr geringe Virusmengen zu detektieren und auch zu quantifizieren. Die

erreichbare Sensitivität ist zum einen abhängig von der eingesetzten Nachweismethode,

zum anderen von der Abstimmung sowohl der Probengewinnung als auch Isolation und

Detektion. Zur Quantifizierung des Hepatitis A-Virus in den Geweben der Mäuse wurde ein

RT-PCR System entwickelt, welches in der Lage ist HAV der Genotypen I, II, III und VII

nachzuweisen. Die PCR gehört derzeit zu den Methoden, mit denen die größtmögliche

Sensitivität des Nachweises einer spezifischen Targetsequenz erreicht werden kann. Da mit

konventioneller PCR, d.h. mit Durchführung einer Endpunktanalyse eine Quantifizierung des

Targets nicht möglich ist, wurde ein real-time RT-PCR System entwickelt. Bei der real-time

PCR findet die Detektion des Targets während jedes einzelnen PCR Zykluses statt. Die

78

dabei entstehende Fluoreszenz verhält sich in der exponentiellen Phase der PCR

proportional zur Menge des Targets. Das entwickelte System wird mit vier

Quantifizierungsstandards verwendet, mit deren Hilfe eine Standardreihe erstellt und daran

die HAV Menge in den Mausgeweben bestimmt wird. Das Sensitivitätslimit des Systems ist

mit 0,13 IU/µl ausreichend um HAV in den Geweben der Mäuse, die mit 108 internationalen

Einheiten HAV inokkuliert wurden, nachzuweisen und ist mit anderen HAV PCR Assays(110)

vergleichbar. Die hohe Präzision des real-time HAV RT-PCR Systems stellt die

Vergleichbarkeit der Ergebnisse sicher, welche für die Untersuchung des Hepatitis A-Virus in

den verschiedenen Geweben unerlässlich ist. Das real-time HAV RT-PCR System wird

mittlerweile kommerziell vertrieben und konnte seine hervoragende Performance schon

mehrfach in verschiedenen Diagnostiklaboren unter Beweis stellen.

4.2 Entwicklung des strangspezifischen RNA Nachweis es

Mit Hilfe des real-time RT-PCR Systems kann das Hepatitis A-Virus in Gewebe identifiziert

und die Virusmenge quantifiziert werden. Um Aussagen über die Replikation in diesen

Geweben treffen zu können, muss auf das Vorhandensein von HAV (-) Strang untersucht

werden. Das (-) Strang Intermediat ist ein eindeutiger Indikator für die HAV Replikation und

wird daher häufig als Replikationsmarker genutzt. Für den Nachweis erschwerend ist, dass

nur eine geringe Menge (-) Strang RNA aber zeitgleich eine hohe Menge (+) Strang RNA

vorhanden ist. Es gibt eine Reihe von Möglichkeiten zur strangspezifischen Nukleinsäure

Detektion. Die publizierten Protokolle reichen von einfachen Hybridisierungs-

assays(4,18,30,115,112) bis zu NASBA und PCR basierenden Assays(91,71,17). Allerdings konnte

sich bisher keine der Techniken dauerhaft durchsetzen. Während für viele Anwendungen die

Sensitivität der Hybridisierungsassays nicht ausreichend ist, sind die auf Amplifikation

basierenden Assays häufig zu unspezifisch. In dieser Arbeit wurde ein strangspezifisches

Nachweissystem entwickelt, welches die Spezifität der Hybridisierung durch ein Padlock

Probe ähnliches System mit der Sensitivität einer hyperbranched Rolling Circle Amplifikation

verknüpft. Padlock Probes sind lange Oligonukleotide, deren 3´ und 5´ Enden Bereiche

aufweisen, die in direkter Nachbarschaft an das Target binden und durch Ligation zu einem

Ring geschlossen werden(94). Die Hybridisierung an der Ligationsstelle erfordert exakte

Basenpaarungen, was zu hoher Spezifität der Padlock Probes führt(77,94,42,126,76,9). Eine der

häufigsten Anwendungen von Padlock Probes ist die Genotypisierung mittels SNP (Single

Nukleotid Polymorphismus) Analyse. Dabei liegt der SNP im Hybridisierungsbereich und

verhindert die Zirkularisierung der Padlock Probe(124,38,99). Im Gegensatz zur klassischen

Padlock Probe wurde der Ringschluss in dem hier beschriebenen System durch

Hybridisierung der jeweiligen 3´ und 5´Enden zweier kurzer Oligonukleotide an die

79

Zielsequenz und an ein drittes Oligonukleotid erreicht. Die Amplifikation der geschlossenen

Padlock Probe führt zur eigentlichen Detektion. Nilson et al., 2002 beschreiben den Einsatz

einer modifizierten molekularen Beacon Sonde zur real-time Messung während der Rolling

Circle Amplifikation (RCA)(93). Der Einsatz anderer fluoreszenzmarkierter Sondenformate,

wobei in diesem strangspezifischen Nachweissystem die Detektion durch eine Taqman®

Sonde erfolgt, ist ebenfalls möglich(136). Die lineare Amplifikation während der RCA erlaubt

eine genaue Bestimmung der geschlossenen Padlock Probes und damit des

Targetmaterials(93). Wie Abb. 5 zeigt, hat neben der Wahl der Detektionsmethode die

Abstimmung der einzelnen Komponenten enormen Einfluss auf Sensitivität, Spezifität und

Robustheit des Nachweissystems. Während das ursprüngliche Protokoll der RCA nur sehr

schlechte Fluoreszenzsignale und eine geringe Sensitivität zeigt wird nach Titration und

Optimierung der Komponenten eine 10.000fach höhere Sensitivität erreicht. Besonderes

Augenmerk ist dabei auf die Qualität und das Design der Padlock Probe, sowie des

zugehörigen Primersystems zu legen. Sie beeinflussen eine häufig vorkommende Target

unabhängige, unspezifische Amplifikation, wie sie auch in Abb. 5B und 6 ersichtlich ist(99,38).

Neben dem Design kommt es dabei auch auf die Konzentration der Padlock Probe an, so

führt ein Überschuss unzirkularisierte Padlock Probes im Reaktionsansatz zu unspezifischer

Amplifikation(38). Wie es zu dieser unspezifischen Amplifikation kommt ist bisher nicht geklärt.

Die Sequenzierung unspezifischer Amplifikate (siehe 3.2.2.1) zeigt, dass in diesem Fall der

an das Target hybridisierende Bereich der Oligonukleotide nicht amplifiziert wurde. Es wäre

denkbar, dass die Oligonukleotide ohne bzw. bei sehr geringer Targetmenge ringförmige

Sekundärstrukturen ausbilden, die eine Amplifikation ermöglichen. In dieser Arbeit wurde

dieses Problem durch Design verschiedener Padlock Probes, sowie durch Austesten

verschiedener Padlock Probe basierender Oligonukleotidsysteme und Veränderung der

Sondenbindungsstelle gelöst. Durch Änderung der Sonde wurde die Detektion der

unspezifischen Signale, nicht jedoch die Amplifikation an sich verhindert. Alsmadi et al., 2003

lösten dieses Problem durch Einbau einer Hairpin Sequenz am 3´Ende der Padlock Probe,

so dass durch self-priming des Hairpins unligierte Padlock Probes für die Amplifikation nicht

mehr zur Verfügung stehen(2). Die Ligationseffizienz eines DNA/RNA Hybrids, d.h. das

Schließen einer DNA Padlock Probe die an eine RNA Zielsequenz hybridisiert, ist geringer

als bei DNA/DNA Hybriden und erfordert besondere Ligationsbedingungen. Durch Einsatz

von Padlock Probes aus Ribonukleinsäure lässt sich die Effizienz der Ligationsreaktion

deutlich verbessern(16,37,63,92). Durch Einsatz einer DNA/RNA Chimäre konnte die Sensitivität

des stransspezifischen Nachweissystems bei RNA als Targetmaterial gesteigert werden. In

dieser Arbeit wurde ein strangspezifischer RNA Nachweis, basierend auf dem 3-

Oligosystem, entwickelt, der quantitiativ, hochspezifisch und sensitiv ist. Die mit dem real-

time HAV RT-PCR System quantifizierten HAV Mengen in den Geweben der Mäuse sind

80

jedoch geringer als das Sensitivitätslimit des (-) Strang Nachweises, so dass die Sensitivität

des strangspezifischen RCA Systems nicht ausreicht, um eine Replikation in den Geweben

nachzuweisen. Um dennoch einen (-) Strang Nachweis mit höherer Sensitivität zu

ermöglichen, wurde ungeachtet der bekannten Spezifitätproblematik eine strangspezifische

PCR entwickelt.

Aufgrund verschiedenster Nebenreaktionen, wie z.B. Selfpriming durch Sekundärstrukturen,

unspezifischer Primerbindung oder aber auch keiner bzw. nicht vollständiger Inaktivierung

der Reversen Transkriptase kommt es bei strangspezfischen PCRs immer wieder zu falsch

positiven Ergebnissen(72,135,75). Trotz unterschiedlichster Ansätze zur Minimierung der falsch

positiven Signale, ist eine vollständige Verhinderung bisher nicht gelungen(71,86,27). Durch

Untersuchung der Spezifität des in dieser Arbeit validierten (-) Strang RNA Box-PCR

Systems wurde ein Konzentrationsbereich definiert, indem eine eindeutige Aussage sowohl

über das Vorhandensein als auch der Konzentration an (-) Strang RNA möglich ist. Bis zu

einer HAV RNA Konzentration von 2,7 x 104 IU/µl ist der (-) Strang RNA Nachweis hoch

spezifisch. Erst wenn höhere HAV Konzentrationen detektiert werden, ist eine eindeutige

Aussage, ob es sich um (-) Strang RNA handelt nicht mehr möglich. Die Quantifizierung des

(-) Stranges wird durch Anwesenheit von mehr als 10.000 IU/µl (+) Strang RNA beeinflusst,

sofern weniger als 40 IU/µl (-) Strang RNA in der Probe enthalten sind. D.h. in dem

strangspezifischen Box-PCR System konnte die falsch positive Detektion nicht vollständig

verhindert werden, es konnte aber ein Bereich identifiziert werden, indem eindeutige

Aussagen möglich sind. Die Eignung des (-) Strang Box-PCR Systems wurde anhand einer

HAV Replikationskinetik in Zellkultur unter Beweis gestellt. Schmitz et al., 1998 stellten in

HAV infizierten FRhK-4 Zellen 8 – 36 h p. i. einen starken Anstieg, bis 6 Tage p. i ein

konstantes Level und 6 - 8 Tage p. i. einen erneuten leichten Anstieg an HAV (-) Strang RNA

fest(112). Abb. 10 zeigt, dass die Ergebnisse der BOX-PCR mit denen von Schmitz et al.,

1998 korrelieren. Nach 6 – 30 h. p. i konnte eine starke Zunahme detektiert werden, wobei

die (-) Strang Menge bis zu 12 Tage p. i. relativ konstant blieb. Die Korrelation unserer mit

den Ergebnissen anderer HAV Replikationskinetiken(17,112) bestätigt, dass die real-time Box-

PCR zur Identifizierung des HAV Replikationsintermediates geeignet ist. Die hohe

Sensitivität des Assays von 0,44 IU/µl erlaubt die Quantifizierung von (-) Strang RNA in den

Gewebeproben.

81

4.3 Verteilung des Hepatitis A-Virus im Mausmodell

Das natürliche Wirtsspektrum des Hepatitis A-Virus ist auf Menschen und einige andere

Primatenarten (Schimpansen, Krallen- und Nachtaffen) begrenzt. In den 80er Jahren wurden

eine Reihe von Untersuchungen zur Verteilung des HAV im Organismus an experimentell

infizierten Krallenaffen durchgeführt(82,83,21,100,66,97). So konnten Mathiesen et al., 1978 bei

Krallenaffen nach intravenöser Infektion zusätzlich zur Leber bei einigen Tieren Virus in Milz,

Niere und den abdominalen Lymphknoten nachweisen, wobei Dünndarm und Colon

transversum HAV frei waren(82). Nach oraler Infektion von Krallenaffen konnte die gleiche

Gruppe 1980 HAV in Leber, Dünndarm und Galle, jedoch nicht in der Milz und dem Gekröse

der Tiere zeigen(83).

Tab.11 Recovery rate der viralen RNA in den Organen nach i.p. Infektion von Mäusen zweier Altersgruppen mit HAV, HAV/IgA- und HAV/IgG- Komplexen

Alter Inokula Leber Milz Niere Thymus Gekröse recovery rate

HAV/IgG 0,27 % 0,92 % 0,13 % 0,06 % 0,12 % 1,50 HAV/IgA 0,38 % 1,28 % 0,25 % 1,51 % 0,74 % 4,16

42 - 46 Tage

HAV 0,59 % 0,90 % 0,38 % 0,06 % 0,17 % 2,10 HAV/IgG 0,92 % 0,88 % 0,13 % 1,51 % 0,59 % 4,03 HAV/IgA 2,31 % 2,42 % 0,18 % 3,44 % 1,02 % 9,40

63 - 84 Tage

HAV 1,16 % 0,45 % 0,67 % 0,94 % 0,73 % 3,96

Pinto et al., 2002 konnte ebenfalls bei oral infizierten Krallenaffen Hepatitis A-Virus in Leber

und Galle jedoch nicht im Zwölffingerdarm nachweisen(100). Das in Milz und Gekröse kein

Virus nachgewiesen werden konnte bestätigt das Ergebnis von Mathiesen et al., 1980(83).

Diese Studien stellen zum Teil, vermutlich aufgrund der eingesetzten Nachweismethoden

und deren Sensitivitätsgrenzen, recht widersprüchliche Ergebnisse dar. Studienübergreifend

konnte in Primaten nach experimenteller Infektion in den Geweben Leber, Milz, Niere,

Gekröse, Dünndarm, Galle und den Tonsillen Hepatitis A-Virus nachgewiesen werden, über

die Virusmenge in den Organen ist dabei leider nichts bekannt. In dieser Arbeit wurde die

Verteilung des Virus im Mausmodell untersucht. Es zeigte sich, dass in diesem

Modellorganismus das Virus in den gleichen Organen nachgewiesen werden konnte wie im

natürlichen Wirt. Obwohl eine hepatozytäre Zelllinie (NCTC) des hier verwendeten

Mausmodells nicht mit HAV infizierbar ist(35), konnte in dieser Arbeit bei intraperitoneal

infizierten Mäusen sowohl in der Milz als auch im Gekröse Hepatitis A-Virus RNA

nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde virale RNA in der Leber, der Niere und dem

Thymus der Tiere detektiert. Der natürliche Infektionsweg des Virus, d.h. die orale Aufnahme

ist mit diesem Modellorganismus jedoch nicht möglich. Das Virus gelangt nach oraler

82

Applikation vom Magen in den Darm. Es wäre denkbar, dass der Übergang vom Darm in den

Blutstrom im Mausmodell verhindert und das Virus daher direkt über den Darm

ausgeschieden wird, ohne die Leber und andere Organe zu erreichen. Nach intravenöser

und intraperitonealer Infektion, bei denen der Übergang aus dem Darm ins Blut entfällt,

konnte in den Mäusen in den oben genannten Organen HAV RNA nachgewiesen werden.

Die recovery rate in den Organen der nach intraperitonealer Inokulation detektierten HAV

RNA Mengen aus dem Ergebnis, das in Abb. 16 dargestellt ist, ist in Tab. 11 nochmals

zusammengefasst. Die höchsten HAV RNA Menge in diesem Mausmodell befinden sich in

den lymphatischen Organen Milz und Thymus sowie im Targetorgan des Hepatitis A-Virus,

der Leber. Die blutreinigende Funktion der Milz, d.h. der Abbau von Blutzellen die mit

Antikörpern beladen sind, von Immunkomplexen und anderen im Blut befindlichen Partikeln,

erklärt die hohe Virusmenge in diesem Organ. Im Blut selbst konnte in den meisten Fällen

kein bzw. nur sehr wenig Virus im Mausmodell nachgewiesen werden. Wohingegen bei HAV

Infektion im Menschen eine mehrwöchige Virämie mit Titern um von 104 - 105 HAV IE/ml Blut

auftritt(11). Der prozentuale Anteil in Niere und Gekröse ist wesentlich geringer als der in

Leber, Milz und Thymus. In beiden Altersgruppen filtert die Niere ungebundenes HAV in

deutlich höherem Anteil aus dem Blut heraus als in Immunkomplexe gebundenes Virus. Die

recovery rate aller getesteten Organe aus Abb. 16 ist nach Inokulation mit HAV und

HAV/IgG- Komplexen bei den jungen Mäusen 1,5 - 2,1% und bei den älteren Mäusen 3,96 –

4,03%. Nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen ist die recovery rate mit 4,16% bei den

jungen Mäusen und 9,4% bei den älteren Mäusen deutlich höher. Die insgesamt eher

geringe recovery rate ist zum einen abhängig von der unterschiedlichen Physiologie der

Individuen, zum anderen aber auch stark beeinflusst durch die Art der Applikation. Die

intravenöse Infektion sowie die orale Gabe wären aufgrund der besser kontrollierbaren

Applikation von Vorteil, jedoch war die intravenöse Gabe nicht durchführbar (siehe 3.3.1.1.)

und nach oraler Inokulation war keinerlei virale RNA in den Geweben der Mäuse

nachweisbar. Die Substanzaufnahme nach intraperitonealer Applikation erfolgt über den

Blutweg und erfüllt damit die für diese Arbeit insbesondere für die Untersuchung des IgA

vermittelten Carriermechanismus notwendigen Vorraussetzungen. Diese Applikationsart birgt

jedoch generell das Risiko der Fehlinjektion. So ist es bei einer Maus vorgekommen, dass

das Inokula versehentlich in die Blase appliziert und direkt sichtbar mit dem Harn

ausgeschieden wurde.

83

4.4 Replikation im Modellorganismus

Das (-) Strang Box-PCR System ermöglicht durch Nachweis des Replikationsintermediates

eindeutige Aussagen über die Replikation des Hepatitits A-Virus in den untersuchten

Geweben. Obwohl sich Mäuse generell nicht mit HAV infizieren lassen, konnte bei den

meisten Tieren eine sehr geringe virale Replikation in der Leber festgestellt werden. Dabei

zeigten die Tiere, die mit HAV/IgA-Komplexen inokuliert wurden, deutlich mehr produktive

Infektionen als die Tiere die mit unkomplexiertem HAV bzw. HAV/IgG-Komplexen inokuliert

wurden. Vorarbeiten im Zellkulturexperiment zeigten, dass hepatocytäre Mauszellen (NCTC-

Zellen) mit HAV/IgA-Komplexen produktiv infiziert werden können, nicht jedoch mit

unkomplexiertem HAV. Feigelstock et al., 2005 beschreiben, dass das Wachstum des HAV

in einer Mauszelllinie nach Transfektion mit viraler HAV RNA grundsätzlich möglich ist. Die

Infektion durch intakte Viruspartikel ist jedoch, vermutlich durch eine Blockierung des

Viruseintritts in die Zellen, inhibiert. Diese Blockierung lässt sich durch veränderte

Wachstumsbedingungen der Mauszellen aufheben(39), was einen Rückschluss auf die

individuelle Physiologie der Tiere und ihre Empfänglichkeit für die HAV Infektion zulässt.

Im Gegensatz zu den bisherigen Befunden in der Literatur konnte in dieser Arbeit gezeigt

werden, dass sich im Mausmodell nach intraperitonealer Inokulation auch in

extrahepatischen Geweben (-) Strang RNA befindet. In der Milz und auch in Gekröse und

Thymus konnte (-) Strang nachgewiesen werden, wobei im Gekröse deutlich höhere (-)

Strang RNA Konzentrationen auftraten als in Milz und Thymus. Die (-) Strang RNA im

Gekröse, dem Lymphgewebe des Darms, zeigt die Replikation des Hepatitis A-Virus im

Darmbereich des hier verwendeten Mausmodells. Obwohl die Replikation des HAV im Darm

immer wieder diskutiert wird, konnte sie jedoch bisher beim Menschen nicht nachgewiesen

werden(119,83,82). Der Vergleich zwischen den älteren und den jüngeren Versuchstieren zeigt

dabei generell deutlich mehr Replikationsintermediat in den älteren Tieren. Eine Korrelation

zu der schwereren Symptomatik nach einer HAV Infektion bei älteren Menschen wäre

denkbar. Da der hier verwendete (-) Strang Nachweis deutlich sensitiver ist als die bisher in

der Literatur verwendeten Techniken, wäre eine Übertragung der Ergebnisse durchaus

vorstellbar. Im Gegensatz zur natürlichen Infektion beim Menschen ist eine orale Inokulation

der Mäuse nicht möglich. Desweiteren liess sich, eventuell aufgrund der nur sehr geringen

viralen Replikation, in den Mäusen keine Virämie, wie sie bei natürlicher Infektion auftritt,

nachweisen. Ob es sich bei den Befunden um Artefakte aufgrund des verwendeten

Mausmodells und der Inokulationsart oder um auf eine natürliche Infektion übertragbare

Ergebnisse handelt, muss im Weiteren noch geklärt werden.

84

4.5 IgA vermitteltes Targeting von HAV zur Leber

Die ubiquitäre Expression des für HAV diskutierten Rezeptors TIM-1 und die Tatsache, dass

das Virus in Zellkultur in einer Reihe von nicht hepatischen Zellen repliziert, wohingegen dies

in vivo offensichtlich nicht möglich ist(8,43,61,40,34,119), erlaubt die Hypothese eines

zielgerichteten Carriermechanismus des Virus zur Leber. Durch die Aufnahme über den

Gastrointestinaltrakt treten die Immunzellen des Darm-assoziierten Lymphgewebes (GALT),

wie die Peyerschen Plaques, als erstes mit dem infektiösen Agens in Kontakt.

Sekretorisches, virusspezifisches IgA tritt im intestinalen Lumen direkt nach der Infektion auf

und liegt häufig im Komplex mit HAV vor(120,13). Purcell et al., 1984 konnten in einer Studie

anhand von Infektionsversuchen mit Krallenaffen zeigen, dass die Infektiösität des Hepatitis

A-Virus von der Art des Probenmaterials abhängig ist. So war aus Stuhlproben isoliertes

Virus 100.000fach infektiöser als aus Serumproben gewonnenenes Virus. Dieses wiederum

war 10.000fach infektiöser als aus Speichelproben isoliertes Virus(105). Ob es sich dabei um

freies oder komplexiertes Virus handelt ist nicht bekannt. Es besteht jedoch ein

Zusammenhang zwischen der Art des Probenmaterials und der Immunglobulin Neutralisation

des Virus, z.B. ist im Stuhl befindliches Virus stärker mit Antikörpern komplexiert als Virus

aus Serum oder Plasma. Sodass ein Zusammenhang zwischen Infektiösität des Virus und

Immunglobulin Komplexierung denkbar wäre. Dotzauer et al., 2000 konnten zeigen, dass die

Stabilität von HAV/IgA-Komplexen ausreicht um nach oraler Aufnahme die Magenpassage

als Komplex zu überstehen(35). Da im Stuhl deutlich mehr HAV mit IgA komplexiert vorliegt

als in Serum und Speichel, wäre die heterogene Infektiösität des Virus durch einen IgA

vermittelten Carriermechanismus erklärbar.

Das Ergebnis der ersten beiden Versuchsreihen zum IgA vermittelten Carriermechanismus

(Abb. 12 und 14) zeigte in Abhängigkeit von den Versuchstieren inhomogene Ergebnisse.

Während mit den ersten Versuchstieren ein IgA vermitteltes Targeting von HAV zur Leber

bestimmt werden konnte (Abb. 12A), gelangte bei Wiederholung des Versuchs weniger Virus

nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen zur Leber als nach Inokulation mit freiem HAV

(Abb. 12C). Sowohl die erste als auch die zweite Versuchsreihe wurde mit Tieren im Alter

von 42 - 46 Tagen vorgenommen. Trotz des ähnlichen Alters schienen die Tiere der beiden

Gruppen subjektiv in Größe und Gewicht stark von einander abzuweichen. Leider wurde das

Gewicht der Tiere nicht bestimmt, so dass keine objektiv vergleichbaren Daten vorliegen.

Generalisiert über beide Versuchsreihen zeigte sich nach Inokulation mit HAV und HAV/IgA-

Komplexen ein wesentlich anderes Bild als nach Inokulation mit der HAV/Antikörperkomplex

Kontrolle HAV/IgG. Die Streuung der HAV RNA Konzentration in der Leber nach Inokulation

von unkomplexiertem HAV entsprach in etwa der nach Inokulation von HAV/IgA-Komplexen.

85

Generalisiert über alle Individuen dieser Altersgruppe erreicht das Virus die Leber durch

HAV/IgA in Abhängigkeit von den physiologischen Bedingungen in den gleichen

Konzentrationen wie durch unkomplexiertes HAV. Der Vergleich des Carriermechanismus in

Mäusen unterschiedlichen Alters bestätigt den Verdacht, dass das IgA vermittelte Targeting

von HAV zur Leber altersabhängig ist. Bei den älteren Mäusen (63 – 84 Tage) konnte neben

einer generell höheren recovery rate (Abb. 15) ein Targeting durch HAV/IgA-Komplexe

gezeigt werden, d.h. nach HAV/IgA Inokulation ist signifikant mehr Virus in der Leber

angekommen als nach Inokulation von HAV/IgG und freiem HAV, wohingegen dies in den

jüngeren Mäusen nicht der Fall war (Abb. 17). Tami et al., 2007 zeigten, dass IgA ein

natürlicher Ligand des ubiquitär expremierten TIM-1 Rezepors ist, und dass die IgA-

Assoziation einen synergistischen Effekt auf die Virus-Rezeptor-Interaktion hat(125). Die

Bindung der HAV/IgA-Komplexe an den Rezeptor könnte die generell (d.h. in allen

Geweben) höhere recovery rate der HAV/IgA-Komplexe erklären, wirft aber gleichzeitig die

Frage auf, ob es sich bei dem IgA Carriermechanismus um eine generell bessere HAV/IgA

Bindung im Organismus oder um einen zielgerichteten Transport zur Leber handelt. Es wäre

möglich, dass die Interaktion der HAV/IgA-Komplexe mit TIM-1 zu einer verbesserten,

längeren und gehäuften Bindung an die Zelloberfläche führt und dadurch die Interaktion der

HAV/IgA-Immunkomplexe mit dem Asialoglykoproteinrezeptor und die damit verbundene

Infektion der Leber unterstützt.

In Abb. 22 ist eine Zusammenfassung der Untersuchungen an erwachsenen Mäusen

dargestellt. Gegenübergestellt ist die HAV RNA Konzentration sowie die (-) Strang RNA

Konzentration in der Leber von je vier mit HAV und HAV/IgA-Komplexen inokulierten Mäusen

aus den Versuchsreihen 3.3.2.3 und 3.3.3.2. In beiden Versuchsreihen (Abb. 22 A) ist in der

Leber nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen signifikant mehr Virus nachweisbar als nach

Inokulation mit HAV, d.h. das Virus, welches mit IgA komplexiert und neutralisiert ist, erreicht

die Leber besser als frei vorliegendes Virus. Tendenziell wurde nach Inokulation von

HAV/IgA-Komplexen auch mehr (-) Strang HAV RNA in der Leber gefunden als nach

Inokulation von HAV, jedoch ist aufgrund der geringen Datenmenge eine sicherere Aussage

in Bezug auf die (-) Strang RNA nicht möglich.

Dotzauer et al. 2005 konnte zeigen, dass HAV/IgA-Komplexe mittels Transcytose von

Epithelzellen aus dem Darmlumen in die Blutbahn gelangen können(33). In dieser Arbeit

wurde gezeigt, dass HAV mit IgA komplexiert im Mausmodell bevorzugt oder zumindest mit

gleicher Effizienz wie unkomplexiertes HAV zur Leber gelangt. Die bessere Erreichbarkeit

durch HAV/IgA-Komplexe im Vergleich zu freiem HAV beschränkt sich nicht nur auf die

Leber. Nach Inokulation von HAV Immunkomplexen zeigen auch andere Organe wie Niere,

86

Milz und Thymus höhere Virusmengen im Vergleich zur Inokulation mit freiem HAV. Unsere

Untersuchungen haben ergeben, dass dieser IgA Carriermechanismus altersabhängig ist,

was auf einen Einfluss des Immunsystems oder anderer altersabhängiger physiologischer

Parameter hindeutet.

Die Aufnahme der HAV/IgA-Komplexe in die Hepatozyten durch den

Asialoglykoproteinrezeptor (ASGPR) wurde von Dotzauer et al., 2000 beschrieben. Die

Neutralisation des Virus mit IgA fördert die Infektion der Hepatozyten über den ASGPR,

verhindert jedoch gleichzeitig die Aufnahme in extrahepatische Gewebe, d.h. Zellen ohne

IgA Rezeptor. Es wäre denkbar, dass das Hepatitis A-Virus aufgrund der Komplexierung mit

IgA über den ubiquitär expremierten TIM-1 Rezeptor generell besser an den Organen bindet

und gegenüber freiem HAV dadurch bevorzugt ist. Eine gehäufte Bindung an der

Zelloberfläche könnte die Interaktion der HAV/IgA-Komplexe mit dem ASGPR der

Hepatozyten unterstützen. Die Aufnahme der Komplexe über den ASGPR erklärt den in vivo

Hepatotropismus des Virus(35). In der Leber neuproduzierte Virionen gelangen über die Galle

ins Darmlumen und werden dort in den Blutstrom abgegeben. Die Komplexierung des Virus

kann sowohl in der Submucosa durch sekretorisches IgA als auch im Blut durch Serum-IgA

Abb. 22: Vergleich der HAV RNA Konzentrationen (A) und (-) Strang RNA Konzentrationen (B) in der Leber von erwachsenen Mäusen nach Inokulation mit HAV und HAV IgA Komplexen. In den Boxplot Diagrammen aufgetragen sind zwei verschiedene Versuchsreihen (3.3.2.3. und 3.3.3.2). In beiden Reihen sind in der Leber nach Inokulation mit HAV/IgA deutlich höhere HAV RNA Konzentrationen nachweisbar als nach Inokulation von HAV, korrelierend dazu sind nach HAV/IgA Inokulation mehr Proben positiv für HAV (-) Strang als nach HAV Inokulation °= Extremwerte; *= Ausreißer

A B

87

erfolgen. Die Komplexierung im Darmlumen durch von der Galle sezerniertes IgA ist

ebenfalls möglich, diese HAV/IgA-Komplexe können mittels Transcytose aus dem Darm in

die Blutbahn gelangen und die Leber erreichen. Im Verlauf der Infektion, d.h. mit Reifung der

Immunantwort, steigt die Avidität der Antikörper, sodass im Laufe der Infektion eine

Unterbrechung dieses enterohepatischen Kreislaufs durch hochavides IgG denkbar und eine

Erklärung für sehr lange protrahierende und relapsierende Krankheitsverläufe wäre. D.h. der

Effekt des IgA würde durch die gesteigerte Avidität des IgG verringert, die IgA vermittelte

Bindung des Virus an die Zellen würde vermindert und das Virus könnte entgültig eliminiert

werden.

4.6 Abhängigkeit des anti-HAV IgA Carriermechanismu s von dem

Reifungsgrad der Immunantwort

Die in 3.3.2.3 dargestellten Ergebnisse zeigen den Einfluss des Alters der Versuchstiere auf

das IgA vermittelte Targeting des Virus zur Leber; d.h. bei Mäusen im Alter von 63 - 84

Tagen ist ein Einfluss der IgA-Komplexierung vorhanden, die Leber wird durch HAV/IgA-

Komplexe deutlich besser erreicht als mit freiem HAV. Bei jüngeren Tieren ist dieser Einfluss

nicht bzw. nur deutlich geringer nachweisbar. Die Schwere der Symptomatik bei einer

Hepatitis A Infektion ist stark altersabhängig, so verlaufen bei Kindern unter 5 Jahren 80 -

95% der Infektionen inapparent, bei Erwachsenen nur 10 – 25%(54). Eine Übertragung von

Ergebnissen aus Tierexperimenten auf den Menschen ist generell problematisch. Dennoch

konnte eine Korrelation zwischen der Verteilung des Virus in den Organen des Mausmodells

mit den bisher bekannten Daten aus Primatenstudien gezeigt werden. Das Blutkreislauf- und

Immunsystem der Maus ist dem des Menschen in vielerlei Hinsicht ähnlich, daher wäre

denkbar, dass die altersabhängige Symptomatik mit dem IgA vermittelten

Carriermechanismus in Zusammenhang stehen könnte. Während der Reifung des

Immunsystems ist das vollständige Wirkpotential der IgA-Immunreaktion erst mit Erreichen

der Pubertät abgeschlossen. Es wäre denkbar, dass die Unterstützung durch IgA-

Komplexierung bei Kindern nicht stattfindet. Die Erreichbarkeit der Leber durch das Virus ist

dadurch schlechter als das bei Erwachsenen der Fall ist, wodurch die Infektion inapparent

bzw. mit nur milden Symptomen verläuft.

Zur Untersuchung, ob hochavides anti-HAV IgG die HAV/anti-HAV IgA-Immunkomplexe

neutralisieren und dadurch den enterohepatischen Kreislauf unterbrechen, wurden die

Mäuse mit HAV geimpft und entnommenes Serum auf anti-HAV IgG Antikörper untersucht.

Nach 6 Monaten wurden immunisierte und nicht immunisierte Mäuse mit HAV/IgA-

88

Komplexen sowie freiem HAV inokuliert. Die Mäuse wurden sektioniert und die Gewebe auf

HAV untersucht. Es stellte sich heraus, dass die bessere Erreichbarkeit durch die HAV/IgA-

Komplexe gegenüber freiem HAV in den nicht immunisierten Mäusen bei den immunisierten

Mäusen nicht vorhanden ist. D.h. das durch die Immunisierung gebildete anti-HAV IgG

bewirkt ein schlechteres Targeting der HAV/IgA-Komplexe. Dieser Einfluss könnte auf einem

Verdrängungs- bzw. Neutralisationsmechanismus des IgA in den Immunkomplexen durch

anti-HAV IgG Antikörper beruhen. Dieser Effekt wurde bei Mäusen mit bereits ausgereiftem

Immunsystem beobachtet. Der Einfluss der Immunsystemreifung, d.h. der Einfluss

steigender Avidität der anti-HAV IgG Antikörper, wurde durch Inokulation zu

unterschiedlichen Zeitpunkten nach Beginn der Immunisierung untersucht. Während die

nicht immunisierten Mäuse zu allen Zeitpunkten nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen in

etwa die gleiche HAV Menge in der Leber zeigen, variierte diese bei den immunisierten

Tieren deutlich. Einen Monat nach Beginn der Immunisierung war die HAV RNA Menge in

der Leber der immunisierten und der nicht immunisierten Mäuse in etwa gleich, wohingegen

nach drei Monaten die immunisierten Tiere mehr HAV RNA in der Leber zeigten als die nicht

immunisierten Tiere. D.h. trotz nachweislich (siehe Tab.10) erfolgter Immunantwort bzw.

gebildeter anti-HAV IgG Antikörper erreichten zu diesem Zeitpunkt mehr Virionen die Leber

als ohne neutralisierende IgG Antikörper. Eine Erklärung dafür liegt direkt in der

Immunisierung. Diese erfolgt mit infektiösem Hepatitis A-Virus, welches zum Zeitpunkt der

Sektion zusätzlich zu den HAV/IgA-Komplexen der Inokulation in den Tieren vorliegen

könnte. Zusätzlich kommt es durch die Immunisierung neben den IgG Antikörpern auch zur

Bildung von IgA, welches mit dem HAV der Immunisierung Komplexe bilden kann und so

den Transport zur Leber unterstützt. D.h. in den immunisierten Tieren könnte sich generell

mehr HAV befinden als in den nicht immunisierten Tieren, dabei ist weiterhin zu beachten,

dass die nach 3 Monaten untersuchten Tiere bereits zwei Impfungen, die nach 6 Monaten

untersuchten Tiere 3 Impfungen und die einen Monat nach Beginn der Immunisierung

untersuchten Tiere nur eine Impfung erhalten haben. In vitro konnte anhand von

monoklonalen Antikörpern gezeigt werden, dass die Infektiösität von HAV/IgA-Komplexen

durch anti-HAV IgG neutralisiert wird. In den Mäusen scheint 3 Monate nach Beginn der

Immunisierung die Avidität der anti-HAV IgG Antikörper jedoch noch nicht hoch genug, die

IgA Antikörper aus den HAV-Komplexen zu Verdrängen. Bei gleichbleibender IgG Menge

(siehe Tab. 10) scheint dies nach 6 Monaten jedoch der Fall zu sein. Die HAV Menge in den

immunisierten und nicht immunisierten Tieren in der Leber war nahezu gleich und das

obwohl aus den o.g. Gründen in den immunisierten Tieren mehr HAV zu erwarten gewesen

wäre. Es kann angenommen werden, dass 6 Monate nach Beginn der Immunisierung, also

nach vollständiger dreifach Impfung, die Avidität der IgG Antikörper so gestiegen ist, dass

das IgA aus den Immunkomplexen wirkungslos und das Virus durch IgG neutralisiert werden

89

kann. D.h. bei Infektion wird das Virus mit IgA komplexiert zur Leber transportiert, während

es dort repliziert wird und die Virionen die Leber verlassen, werden anti-HAV IgG Antikörper

gebildet. Die Virionen gelangen mit der Galle in den Darm, wo sie entweder direkt im Darm

oder aber nach Eintritt in die Blutbahn erneut mit IgA Antikörpern komplexiert werden

können. Die Avidität der IgG Antikörper ist zunächst nicht ausreichend um diese Komplexe

zu neutralisieren, so dass es erneut zur Infektion der Leber kommt. Diese protrahierten oder

relapsierenden Verläufe, d.h. der enterohepatische Zyklus, der zu frühen Zeitpunkten der

Infektion möglich ist, wird durch die Reifung der Immunantwort, durch Steigerung der Avidität

der IgG Antikörper unterbrochen. Wie im Experiment sicher gezeigt wurde, neutralisieren

hochavide IgG Antikörper die Infektiösität der HAV/IgA-Komplexe, so dass eine weitere

Infektion der Leber nicht mehr möglich ist.

90

5. ZUSAMMENFASSUNG

Der Replikationsort eines Virus befindet sich meist direkt innerhalb seines Infektionsweges.

Bei Viren die fäkal-oral übertragen werden findet die primäre Replikation häufig im

Intestinaltrakt statt. Die dort produzierten Virionen werden direkt mit dem Stuhl

ausgeschieden. Abweichend davon repliziert das Hepatitis A-Virus ausschließlich in der

Leber, d.h. nach der oralen Aufnahme muss das Virus vom Dünndarm zur Leber gelangen,

von wo es mit der Gallenflüssigkeit wieder zurück in den Intestinaltrakt gelangt.

Virusspezifisches Immunglobulin A tritt sehr früh nach der Infektion auf und liegt häufig im

Komplex mit HAV vor(120,13). In Zellkultur konnte gezeigt werden, das diese Immunkomplexe

mittels Transcytose vom Darmlumen in die Blutbahn gelangen können(33), von wo sie zur

Leber transportiert werden. In dieser Arbeit konnte im Modellorganismus gezeigt werden,

dass Immunglobulin A im Blut dabei als Carrier fungiert. Dabei gilt für das Mausmodell, dass

in der Leber nach i.p. Inokulation von HAV/IgA-Komplexen wesentlich höhere

Viruskonzentrationen nachweisbar sind als nach Inokulation von unkomplexiertem HAV, d.h.

bei gleicher Inokulationsmenge erreichen HAV/IgA-Komplexe die Leber deutlich besser als

nicht komplexiertes Hepatitis A-Virus. Dieser IgA vermittelte Carriermechanismus ist

altersabhängig. Bei Mäusen im Alter von 42 – 46 Tagen zeigt sich kein wesentlicher

Unterschied in Abhängigkeit vom Inokulum, wohingegen bei Mäusen im Alter von 63 - 84

Tagen eine Bevorzugung der HAV/IgA-Komplexe deutlich zum Tragen kommt. Diese

Altersabhängigkeit des Virustransports könnte mit der Schwere der Erkrankungen beim

Menschen korrelieren. Gerade bei Kindern verläuft die Hepatitis A Infektion häufig inapparent

oder zumindest symptomarm. Ein ineffektiver Transport des Virus zur Leber hat aufgrund der

Immunpathogenität der Erkrankung einen symptomarmen Verlauf zur Folge. Nach

Inokulation der Tiere mit HAV/IgA-Komplexen konnten im Vergleich zu HAV/IgG und HAV

nicht nur höhere Virusmengen in der Leber sondern auch in allen anderen untersuchten

Geweben nachgewiesen werden. IgA ist ein natürlicher Ligand des TIM-1 Rezeptors, der

ubiquitär exprimiert wird(125), wodurch es zu einer generellen Bevorzugung der HAV/IgA-

Komplexe kommen könnte. Die gehäufte Bindung der HAV/IgA-Komplexe an die

Zelloberfläche durch die Bindung an TIM-1 könnte, aufgrund der Häufung, zu einer

verbesserten Interaktion der HAV/IgA-Komplexe mit dem Asialoglykoproteinrezeptor

(ASGPR) führen. Der ausschließliche in vivo Hepatotropismus des Virus erklärt sich durch

die Aufnahme der Immunkomplexe über den ASGPR (Asialoglykoproteinrezeptor), der nur in

Hepatozyten exprimiert wird(118). Die in der Leber produzierten Virionen werden über die

Galle zum Darmlumen transportiert, und mit dem Stuhl ausgeschieden. Desweiteren können

die Virionen im Darmbereich erneut mit IgA-Molekülen komplexieren und mittels Transcytose

in das Blut und schließlich zur Leber gelangen. Dieser enterohepatische Kreislauf ist neben

91

dem akuten Verlauf ein Erklärungsmodel für relapsierende und protrahierte Hepatitis A

Verläufe. In vivo konnte nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen durch Reifung der

Immunantwort eine Reduktion der HAV Menge in der Leber gezeigt werden. Eine

Unterbrechung des enterohepatischen Kreislaufs durch die Steigerung der Avidität des anti-

HAV IgG im Verlauf der Infektion ist denkbar. Während der Reifung der Immunantwort steigt

die IgG Avidität, so dass dieses in der Lage ist Immunglobulin A aus den HAV/IgA-

Komplexen zu verdrängen und den Carriermechanismus aufzuheben, wodurch

schlussendlich das Virus vollständig aus dem Organismus eliminiert werden würde.

Die mit dem Modellorganismus Maus erhaltenen Befunde unterstützen somit die auf

Zellkulturdaten basierende Hypothese, wonach die Assoziation von Virionen mit HAV-

spezifischem IgA den Transport des Virus zur Leber unterstützt. Die Infektion der Leber

durch HAV/IgA-Immunkomplexe erfolgt dabei über den Asialoklykoproteinrezeptor.

Neuproduzierte Virionen gelangen über die Galle in den Darm, und können von dort durch

die Bildung von HAV/IgA-Komplexen trotz Anwesenheit neutralisierender IgG Antikörper im

Blut ihren Weg zurück zur Leber finden.

92

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Abkürzungen

a atto A Adenin ADAR dsRNA-spezifische Adenosin-Desaminase ALT Alaninaminotransferase AS Aminosäure AST Aspartataminotransferase ATP Adenosintriphosphat b Base bp Basenpaar BSA Bovines Serumalbumin cDNA komplementäre DNA CPE Cythopathischer Effekt C Cytosin CP Crossing Point Ct Treshold Cycle CTP Cytidintriphosphat d Tag DAPI 4-6-Diamidino-2-phenylindol-di-hydrochlorid dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytidintriphosphat dGTP Desoxyguanosintriphosphat DEAE-Dextran Diethylaminoethyl-Dextran DMEM Dulbecco´s modified Eagle´s medium DMSO Dimethysulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease dNTP Desoxynukleosidtriphosphas ds doppelsträngig dTTP Desoxythymidintriphosphat DTT Dithiothreitol EDTA Ethyslendiamintetraessigsäure EGTA Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylether)-N,N´-tetraessigsäure EIA Enzyme Immuno Assay ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay f femto FCS fetales Kälberserum FRhK-4 fetale Rhesusaffen-Nierenzellen g Gramm G Guanin GALT Gut associated lymphoid tissue geq Genomäquivalent GIT Guanidiniumisothiocyanat GTP Guanosintriphosphat h Stunde HAV Hepatitis A-Virus HDA Hybrid-Detection-Assay I Inosin IFN Interferon IgG Immunglobulin G IgA Immunglobulin A IRES internal ribosomal entry site IU Internationale Einheit Kb Kilobasen

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Kbp Kilobasenpaare kDA Kilodalton IE Infektiöse Einheit IU Internationale Unit l Liter m milli M molar Min Minute MALT Mucosa-associated lymphoid tissue MOI multiplicity of infection mRNA messenger Ribonukleinsäure µ mikro NASBA Nucleic acid sequence based amplification NIH National Institute of Health nt Nucleotid NTR nicht translatierte Region NTP Nukleosidtriphosphat OAS 2´,5´Oligoadenylatsynthetase OD optische Dichte ORF open reading frame p Pico PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PBS phosphate buffered saline PCR polymerase chain reaction pfu plaque-forming unit p.i. post infectionem P/S Penicillin/Streptomycin RCA Rolling Circle Amplifikation rRNA ribosomale Ribonucleinsäure RNA Ribonucleinsäure RNase Ribonuclease rpm revolutions per minute RT Raumtemperatur RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction s Sekunde SD Standardabweichung SDS Sodiumdodecylsulfat ss einzelsträngig TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer TBS tris buffered saline TCID50 tissue culture infectious dose 50 %

TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin T Thymin Taq Thermus aquaticus Tris Tris-hydroxymethyl-aminomethan Tween-20 Synonym für Polyethylenglykol-sorbitan-fettsäureester U Units UV Ultraviolett V Volt v/v Volumen pro Volumen Vol Volumen w/v Gewicht pro Volumen wt Wildtyp y Yocto z Zepto