Untersuchungen zur Bildung von Furosin und N-terminalen 2

Untersuchungen zur Bildung von Furosin und

N-terminalen 2(1H)-Pyrazinonen

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

Doctor rerum naturalium

(Dr. rer. nat.)

vorgelegt

der Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften

der Technischen Universität Dresden

von

staatl. geprüften Diplom-Lebensmittelchemiker René Krause

geboren am 23. Mai 1972 in Radeberg

Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. T. Henle

Prof. Dr. rer. nat. W. Krause

Prof. Dr. rer. nat. L. W. Kroh

Eingereicht am: 4. November 2004

Tag der Disputation: 21. Januar 2005

„Ohne Spekulation gibt es keine neue Beobachtung.“

Charles Darwin (1809 - 1882)

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung und Zielstellung ..................................................................................................... 1

2 Theoretischer Teil ................................................................................................................... 3

2.1 Die Maillard-Reaktion ......................................................................................................... 3

2.1.1 Die Anfangsphase ..................................................................................................... 4

2.1.2 Die fortgeschrittene Phase......................................................................................... 8

2.1.3 Die finale Phase....................................................................................................... 10

2.1.4 Die Maillard-Reaktion in Relation zu anderen Reaktionen.................................... 11

2.1.5 Zur Bedeutung der Maillard-Reaktion in Lebensmitteln........................................ 12

2.1.6 Zur Bedeutung der Maillard-Reaktion in vivo ........................................................ 14

2.2 Analytik von Amadori-Produkten ...................................................................................... 17

2.2.1 Zur Bedeutung von Amadori-Produkten ................................................................. 17

2.2.2 Analytik von Furosin............................................................................................... 18

2.2.3 Zur molaren Ausbeute an Furosin........................................................................... 23

2.3 Reaktion von Proteinen mit reaktiven α-Dicarbonylverbindungen ................................... 26

2.3.1 Wichtige α-Dicarbonylverbindungen ..................................................................... 26

2.3.1.1 Glyoxal ............................................................................................................. 28

2.3.1.2 Methylglyoxal .................................................................................................. 30

2.3.2 Reaktion von α-Dicarbonylverbindungen mit Proteinen........................................ 31

2.3.3 Reaktion von α-Dicarbonylverbindungen mit freien Aminosäuren ....................... 35

2.3.4. Reaktion von α-Dicarbonylverbindungen am N-Terminus von Peptiden und

Proteinen........................................................................................................................... 37

2.4 Kenntnisse zu Verbindungen mit 2(1H)-Pyrazinon-Struktur............................................. 40

2.4.1 2(1H)-Pyrazinone in Lebensmitteln und Lebensmittelmodellsystemen ................. 40

2.4.2 2(1H)-Pyrazinone in vivo und als Pharmaka........................................................... 42

2.4.3 Naturstoffe mit 2(1H)-Pyrazinon-Struktur.............................................................. 43

3 Experimenteller Teil.............................................................................................................. 45

3.1 Chemikalien, Materialien und Geräte ................................................................................ 45

3.1.1 Chemikalien ............................................................................................................ 45

Inhaltsverzeichnis

3.1.2 Aminosäuren, Peptide und Proteine........................................................................ 47

3.1.3 Materialien und Hilfsmittel ..................................................................................... 48

3.1.4 Geräte ...................................................................................................................... 49

3.2.1 Hochdruckflüssigchromatographie ......................................................................... 50

3.2.2 Kopplung Hochdruckflüssigchromatographie Massenspektroskopie und direkte

Massenspektroskopie ....................................................................................................... 53

3.2.3 Aminosäureanalyse ................................................................................................. 54

3.2.4 Präparative Ionenaustauschchromatographie.......................................................... 55

3.2.5 Tüpfeltest................................................................................................................. 55

3.2.6 Dünnschichtchromatographie (DC) ........................................................................ 56

3.2.7 UV-VIS Spektroskopie ........................................................................................... 56

3.2.8 Fluoreszenzspektroskopie ....................................................................................... 57

3.2.9 Nuklearmagnetische Kernresonanz (NMR)-Spektroskopie.................................... 57

3.2.10 Elementaranalyse .................................................................................................. 58

3.3. Darstellung von Referenzmaterial zur Analytik der Amadori-Produkte........................... 58

3.3.1 Darstellung ausgewählter peptidgebundener Amadori-Produkte............................ 58

3.3.2 Darstellung von Nα-Hippuryl-Nε-carboxymethyl-L-lysin ...................................... 63

3.3.3 Darstellung von Nε-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-L-lysin ......................................... 65

3.3.4 Darstellung von Pyridosin....................................................................................... 67

3.4 Studien zur Bildung der Hydrolyseprodukte...................................................................... 70

3.4.1 Hydrolyse der Amadori-Produkte ........................................................................... 70

3.4.2 Quantifizierung der Hydrolyseprodukte und Bestimmung der molaren Ausbeuten74

3.4.3 Bildung von Furosin ohne Salzsäurehydrolyse und Stabilität von Nε-Fructoselysin

in Salzsäure ...................................................................................................................... 75

3.5.1 Reaktion von ausgewählten Peptiden mit α-Dicarbonylverbindungen .................. 76

3.5.2 Darstellung von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin .................. 80

3.5.3 Darstellung von 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden des Glyoxals ...................................... 83

3.5.4 Darstellung von N-[2-(5-Methyl-2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin... 86

3.6 Analyse peptidgebundener 2(1H)-Pyrazinone nach Salzsäurehydrolyse........................... 88

3.6.1 Säurehydrolyse von 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden...................................................... 88

3.6.2 Darstellung von 2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionsäure und N1-Ethyl-

2(1H)-pyrazinon............................................................................................................... 90

3.6.3 Einfluss der Matrix auf die Säurehydrolyse von 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden ......... 91

Inhaltsverzeichnis

3.7 Untersuchungen zur Reaktion von Insulin mit Glyoxal..................................................... 93

3.8 Untersuchungen zur Reaktion von Insulin mit Glyoxal nach Reduktion und Blockierung

der Sulfhydrylgruppen.............................................................................................................. 96

3.8.1 Reduktion und Blockierung der Sulfhydrylgruppen ............................................... 96

3.8.2 Untersuchungen nach enzymatischer Hydrolyse .................................................. 100

3.9 Untersuchungen zum Nachweis von N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinonen nach

Salzsäurehydrolyse des glyoxal-modifizierten Insulins......................................................... 101

3.10 Vergleich der Reaktivität von Lysin, Arginin und dem N-Terminus unter den

Bedingungen der Inkubation von Insulin anhand von Peptiden ............................................ 104

4 Auswertung und Diskussion der Ergebnisse....................................................................... 107

4.1 Analytik von Amadori-Produkten .................................................................................... 107

4.1.1 Darstellung von Amadori-Produkten und Pyridosin als Referenzmaterial ........... 107

4.1.2 Bestimmung der molaren Ausbeuten der Hydrolyseprodukte .............................. 110

4.1.3 Betrachtungen zum Mechanismus der Bildung der Hydrolyseprodukte .............. 116

4.1.4 Untersuchungen in Hinblick auf die Bildung von Nε-Carboxymethyllysin.......... 119

4.1.5 Weitere Studien zur Bildung von Furosin............................................................. 121

4.2 Überblick zur Reaktivität von Peptiden und individuellen Aminosäureseitenketten

gegenüber α-Dicarbonylverbindungen .................................................................................. 123

4.3 Die Reaktion des N-Terminus von Peptiden mit Glyoxal................................................ 125

4.3.1 Die Reaktion von Gly-Ala-Phe mit Glyoxal ......................................................... 125

4.3.2 Identifikation des Reaktionsproduktes .................................................................. 127

4.3.3 Stabilität von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin .................... 130

4.3.4 Zum Mechanismus der Bildung von 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden.......................... 131

4.4 Einflussfaktoren auf die Reaktion von Peptiden mit α-Dicarbonylverbindungen und die

Bildung von 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden................................................................................. 132

4.4.1 Einfluss der Struktur des Peptides......................................................................... 132

4.4.2 Einfluss der Struktur der α-Dicarbonylverbindung .............................................. 134

4.4.3 Einfluss der Pufferionenart und Konzentration..................................................... 135

4.4.4 Einfluss des pH-Wertes......................................................................................... 137

4.5 Die Reaktion des N-Terminus von Peptiden mit Methylglyoxal..................................... 138

4.5.1 Die Reaktion von Gly-Ala-Phe mit Methylglyoxal .............................................. 138

4.5.2 Identifikation des Reaktionsproduktes .................................................................. 140

4.6 Die Reaktion des N-Terminus von Peptiden mit 3-Desoxyglucosulose .......................... 143

Inhaltsverzeichnis

4.7 Einordnung der Reaktivität des N-Terminus von Peptiden gegenüber

α-Dicarbonylverbindung........................................................................................................ 147

4.8 Analyse peptidgebundener 2(1H)-Pyrazinone nach Salzsäurehydrolyse......................... 149

4.8.1 Salzsäurehydrolyse von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-phenylalanin

........................................................................................................................................ 149

4.8.2 Identifikation der Hydrolyseprodukte von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-

propionyl]-phenylalanin................................................................................................. 151

4.8.3 Salzsäurehydrolyse von N-[2-(5-Methyl-2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-

phenylalanin ................................................................................................................... 154

4.8.4 Einfluss der Matrix auf das Hydrolyseverhalten................................................... 155

4.9 Untersuchungen zur Bildung von 2(1H)-Pyrazinonen am Protein Insulin ...................... 158

4.9.1 Inkubation von Insulin mit Glyoxal unter physiologischen Bedingungen............ 158

4.9.2 Charakterisierung der Reaktionsprodukte am intakten Insulin ............................. 159

4.9.3 Untersuchungen nach Reduktion und Blockierung der Sulfhydrylgruppen ......... 164

4.9.3.1 Charakterisierung der Reaktionsprodukte...................................................... 164

4.9.3.2 Vergleich der Reaktivität der N-Termini von A- und B-Kette ...................... 169

4.9.4 Charakterisierung der Reaktionsprodukte nach enzymatischer Hydrolyse........... 171

4.9.5 Untersuchungen zum Nachweis von N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinonen nach

Salzsäurehydrolyse des glyoxal-modifizierten Insulins................................................. 173

4.9.6 Betrachtungen zur Reaktivität von Lysin und Arginin am Insulin ....................... 177

4.9.6 Zur möglichen physiologischen Relevanz der 2(1H)-Pyrazinon-Bildung am Insulin

........................................................................................................................................ 180

4.10 Zur möglichen Bildung von N-terminalen 2(1H)-Pyrazinonen in Lebensmitteln und

in vivo ..................................................................................................................................... 181

5 Zusammenfassung............................................................................................................... 185

6 Ausblick .............................................................................................................................. 189

7 Literaturverzeichnis............................................................................................................. 190

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

Ac Acetyl

AGE advanced glycation end-product

ALE advanced lipoxidation end-product

AU arbitrary unit

Boc tertiär-Butyloxycarbonyl

Bw Blindwert

Bz Benzoyl

BzG Hippursäure, Nα-Benzoylglycin

BzGFruK Nα-Hippuryl-Nε-(1-desoxy-D-fructos-1-yl)-L-lysin

BzGK Nα-Hippuryl-L-lysin

BzGCMK Nα-Hippuryl-Nε-carboxymethyl-L-lysin

BzGLctK Nα-Hippuryl-Nε-(1-desoxy-D-lactulos-1-yl)-L-lysin

BzGMltK Nα-Hippuryl-Nε-(1-desoxy-D-maltulos-1-yl)-L-lysin

BzGR Nα-Hippuryl-L-arginin

BzGTagK Nα-Hippuryl-Nε-(1-desoxy-D-tagatos-1-yl)-L-lysin

CEL Nε-(1-Carboxyethyl)-lysin

CMA N7-carboxymethylarginin

CMC S-Carboxymethylcystein

CML Nε-Carboxymethyllysin

COSY correlation spectroscopy

DAD Diodenarraydetektor

DEPT distortionless enhancement by polarization transfer

3-DG 3-Desoxyglucosulose

DMSO Dimethylsulfoxid

DOLD deoxyglucosulose-derived lysine dimer

DTT 1,4-Dithiothreitol

EAGLE either advanced glycation or lipoxidation end-product

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

Abkürzungsverzeichnis

em emissison - Emission

ESI-TOF-MS electrospray ionization – time of flight – mass spectrometry

et al. et alii (lat.) - und andere

ex excitation - Anregung

FruK Nε-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-L-lysin

Glarg 5-(2-Imino-5-oxo-1-imidazolidinyl)-norvalin

GO Glyoxal

GOLD glyoxal-derived lysine dimer

HMBC heteronuclear multiple bond correlation

HPLC high pressure liquid chromatography

HSQC heteronuclear single quantum coherence

I Ionenstärke

LC-ESI-MS liquid chromatography - electrospray ionization – mass spectrometry

λem Emissionswellenlänge

λex Anregungswellenlänge

Lsg Lösung

MGO Methylglyoxal

MOLD methylglyoxal-derived lysine dimer

MOPS 3-Morpholino-propansulfonsäure

Mr relative monoisotopische Molekülmasse

m/z Masse/Ladung

NMR nuclear magnetic resonance - Kernmagnetische Resonanz

NP normal phase, Normalphase

PB phosphate buffer - Phosphatpuffer

PBS phosphate buffered saline - Phosphat gepufferte Kochsalzlösung

RP reversed phase, Umkehrphase

Tab. Tabelle

TAPSO N-[Tris(hydroxymethyl)-methyl]-3-amino-2-hydroxy-propansulfonsäure

TIC total ion current - Totalionenstrom

tR Retentionszeit

TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

RAGE receptor for advanced glycation end-products

UV ultraviolett

1 Einleitung und Zielstellung

Insbesondere aufgrund des Einflusses auf den Genusswert ist die Maillard-Reaktion eine der

wichtigsten Reaktionen in gekochten, gebackenen, gerösteten oder anderweitig erhitzten

Lebensmitteln. Weiterhin findet sie mit langsamer Geschwindigkeit in biologischen Systemen

statt. In diesem Zusammenhang wird sie sowohl mit normalen Alterungsprozessen der

Proteine als auch mit unerwünschten physiologischen Veränderungen diskutiert.

Um die mit der Maillard-Reaktion einhergehenden Vorgänge zu verstehen und gezielt zu

beeinflussen, ist es notwendig die Reaktionswege zu kennen und die Produkte durch eine

geeignete Analytik zu erfassen. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit beiden

Teilaspekten. Im ersten Abschnitt werden Untersuchungen zur sicheren Interpretation der

Ergebnisse der Furosin-Analytik durchgeführt. Der zweite Teil widmet sich der Aufklärung

eines unter physiologischen Bedingungen bisher nicht beschriebenen Reaktionsweges sowie

der Charakterisierung und Analyse der neuen Produkte.

Amadori-Verbindungen des Lysins sind die ersten relativ stabilen Intermediate des sehr

komplexen Reaktionsgeschehens. Die oft angewendete Quantifizierung der Amadori-

Verbindungen nach Salzsäurehydrolyse anhand des Hydrolyseproduktes Furosin wurde

jedoch als wenig sicher angesehen. Insbesondere wurde eine gewisse Unsicherheit über die

Höhe der molaren Ausbeute an Furosin, welche die Berechnung der Lysin-Derivatisierung

erlaubt, diskutiert (Resmini et al., 1990, Van Boekel, 1998). Um diese Unsicherheit

auszuräumen, wurden zunächst die in Lebensmitteln und in physiologischen Proben aus

quantitativer Sicht wichtigen Amadori-Produkte des Lysins dargestellt. Anhand von

Hydrolyseexperimenten galt es schließlich die molaren Ausbeuten zu ermitteln und damit

eine sichere Berechnung der Lysin-Derivatisierung zu ermöglichen.

Der zweite Teil der Arbeit widmet sich Reaktionen von α-Dicarbonylverbindungen mit

Peptiden und Proteinen, welche in der fortgeschrittenen Phase der Maillard-Reaktion

stattfinden. Aus der Literatur war bekannt, dass α-Dicarbonylverbindungen bevorzugt mit den

Seitenketten von proteingebunden Arginin, Lysin und Cystein reagieren. Über Reaktionen mit

dem N-Terminus unter physiologischen Bedingungen (pH = 7,4, 37 °C) lagen demgegenüber

keine gesicherten Erkenntnisse vor. Ziel der weiteren Arbeiten war es deshalb, mögliche

Reaktionen der N-terminalen α-Aminogruppe mit physiologisch relevanten α-Dicarbonyl-

verbindungen näher zu untersuchen. Dazu wurden ausgewählte Peptide mit Glyoxal,

- 1 -

1 Einleitung und Zielstellung

Methylglyoxal oder 3-DG inkubiert. Dominierende Produkte konnten anschließend isoliert

und strukturell als 2(1H)-Pyrazinon-Peptide aufgeklärt werden. Es handelt sich dabei um eine

neue Klasse von advanced glycation end-products (AGEs), deren Bildung unter

physiologischen Bedingungen bisher nicht bekannt war. Um die Geschwindigkeit der Bildung

der N-terminalen 2(1H)-Pyrazinon-Struktur mit der von Reaktionen der bekannten

Reaktionspartner für α-Dicarbonylverbindungen gegenüberzustellen, erfolgten Inkubations-

experimente mit Tripeptiden sowie peptidgebundenen Arginin und Lysin. Schließlich stellte

sich die Frage ob die neue N-terminalen Derivatisierung ebenfalls am Protein stattfindet. Zur

Klärung wurde unter physiologischen Bedingungen mit Glyoxal umgesetztes Insulin direkt

und nach gestufter Fragmentierung näher untersucht. Im Weiteren galt es ein allgemein

anwendbares Verfahren zum Nachweis proteingebundener 2(1H)-Pyrazinone zu entwickeln

und zu prüfen.

- 2 -

2 Theoretischer Teil

2.1 Die Maillard-Reaktion

In dem Bestreben die in vivo stattfindende Proteinbiosynthese nachzuvollziehen setzte der

französische Mediziner und Chemiker Louis-Camille Maillard (1878 bis 1936) Glycin und

weitere Aminosäuren mit Glucose und später auch mit anderen Zuckern um. Dabei wurde er

auf eine besonders in der Wärme auftretende Bräunungsreaktion aufmerksam, welche mit der

Entwicklung von Kohlendioxid und der Bildung brauner Pigmente einhergeht (Maillard,

1911, 1912a, 1912b). Er beschäftigte sich im Folgenden intensiv mit dieser Reaktion und

diskutierte sie u. a. im Zusammenhang mit Bräunungsvorgängen bei Lebensmitteln (Maillard,

1917). Nicht zuletzt sah er als biochemisch orientierter Naturwissenschaftler schon damals

eine mögliche Relevanz für Veränderungen in vivo und studierte die Reaktion auch bei

physiologischer Temperatur (Maillard, 1916). Zu Leben und Werk von Louis-Camille

Maillard wird auf den Übersichtsartikel von Billaud & Adrian (2003) verwiesen.

Im Gegensatz zu anderen Namensreaktionen wird unter der nach Maillard benannten

Reaktion keine definierte chemische Reaktion verstanden, sondern eine komplexe

Reaktionsfolge zwischen Aminokomponenten wie Aminosäuren, Peptiden und Proteinen auf

der einen Seite sowie reduzierenden Zuckern und der Abbauprodukten auf der anderen Seite.

Die Phasen der Maillard-Reaktion

Um die im Verlauf der Maillard-Reaktion auftretenden Phänomene und die damit zu

assoziierenden Reaktionen systematisch zu betrachten, hat sich eine Einteilung der

Gesamtreaktionskaskade in drei Stadien (Hodge, 1953) bis heute als sinnvoll erwiesen. Da

das Reaktionsgeschehen sehr komplex ist, sind die Übergänge zwischen den Stadien jedoch

fließend und die Einteilung ist deshalb nicht als Dogma zu sehen.

Die frühe Phase ist gekennzeichnet durch die Kondensation der Amino- mit der

Zuckerkomponente zum Glycosylamin, welches nachfolgend einer Umlagerung zum

Amadori- oder Heyns-Produkt unterliegt. In diesem Stadium wird noch keine Farbbildung und

Absorption im nahen UV-Bereich beobachtet.

- 3 -


In der fortgeschrittenen Phase kommt es zum Abbau der Amadori- und Heyns-Produkte zu

zum Teil sehr reaktiven Intermediaten, welche in Folgereaktionen ein sehr vielfältiges

Produktspektrum liefern. Dies führt zu einer charakteristischen Zunahme der Absorption im

nahen UV-Bereich und dem Auftreten von Fluoreszenz. Reaktionsansätze in diesem Stadium

sind jedoch noch weitgehend farblos oder gelb gefärbt. Zusätzlich ist das Aroma von

geruchsaktiven Verbindungen wahrnehmbar und es wird die Freisetzung von Kohlendioxid

beobachtet.

Das Charakteristikum der finalen Phase ist das Auftreten von braunen Pigmenten, den

Melanoidinen. Weiterhin wird die Bildung von geruchsaktiven Verbindungen und

Kohlendioxid fortgesetzt.

2.1.1 Die Anfangsphase

Bildung von N-Glycosiden

Die ersten fassbaren Produkte der Reaktion zwischen der primären Aminogruppe einer

Aminokomponente und einem reduzierenden Zucker sind N-substituierten Glycosylamine,

welche auch als N-Glycoside bezeichnet werden. Die N-Glycoside von Aminosäuren und

Peptiden sind in freier Form nicht stabil und damit auch nicht isolierbar. Demgegenüber

können die N-Glycoside von Aminosäuren und Aldosen jedoch in Form ihrer Kalium-,

Magnesium-, Calcium- oder Schwermetall-Salze unter wasserfreien Bedingungen erhalten

werden (Weitzel et al., 1957, Beksan et al., 2003). Anhand von umfangreichen

Strukturuntersuchungen an N-Glycosiden von aliphatischen und aromatischen

Aminoverbindungen konnte gezeigt werden, dass die Kohlenhydratkomponente bevorzugt in

der cyclischen β-pyranoiden 4C1-Konformation vorliegt, acyclische Isomere vom Typ einer

Schiff Base konnten an Hand von IR-Untersuchungen ausgeschlossen werden (Paulsen &

Pflughaupt, 1980). Zu dem gleichen Ergebnis kamen Neglia et al. (1983), welche die

primären Glucose-Addukte mit RNase sowie mit n-Butylamin mittels NMR-Spektroskopie

untersuchten. Vom Primär-Addukt konnte jeweils nur das C-1 Atom des cyclischen

Glycosylamins detektiert werden. Ein C-Signal im Resonanz-Bereich der Schiff Basen wurde

dagegen nicht gefunden. Mossine et al. (1999) konnten mittels quantitativer NMR-

Untersuchungen von dem Glycosylamin N-Glucosyl-glycin zeigen, dass im anomeren

- 4 -


Gleichgewicht die β-Pyranose (87 %) gegenüber der α-Pyranose (12 %) dominiert. Die

acyclische „wahre“ Schiff Base wurde ebenfalls nicht detektiert.

Untersuchungen von Tannenbaum (1966) am Insulin-Glucose-System (molares Verhältnis

Insulin:Glucose = 9,4:1; aw = 0,74) zeigten eine höhere Stabilität von am Protein gebildeten

N-Glycosiden an. In der gleichen Weise ist das Vorkommen und die Quantifizierbarkeit eines

N-Glycosids am Hämoglobin, dem sogenannten pre-Hb AIc (= Hb AId), zu interpretieren

(Bolli et al., 1981, 1982, Higgins & Bunn, 1981).

HOO

H

HO

HOH

OH

OH

HOOH

H

HO

HOH

OH

OH

HOO

HO

OHOH

++ H2N R- H2N R

HOOH

H

HO

HOH

OH

OH

H2N R+

HOOH

H

HO

HOH

OH

HN R+

- H2O+ H2O

+ H+

- H+

HOO

H

HO

HOH

HN

OH

R

HOOH

HO

HOH

OH

HN R+

HOOH

HO

HOH

HN

OH

R

HOOH

HOO

HN

OH

R

+ H+- H+

NH

R

+ H+

- H+

Glucose Carbenium-Ion Carbinol-ammonium-Ion

Aminocarbenium-IonImmonium-Ion

Enaminol Glycosylamin

1-Amino-1-desoxyketose 1-Amino-1-desoxyketose (β-Pyranose)

Abb. 2.1.1-1: Reaktion von Glucose mit Aminosäuren - Bildung von Glycosylamin und Amadori-Produkt.

Die Bildung des N-Glycosids kann wie in Abb. 2.1.1-1 am Beispiel der Glucose gezeigt

formuliert werden (Simon & Kraus, 1970, Westphal & Kroh, 1985a). Die Reaktionssequenz

ist dabei grundsätzlich protonenkatalysiert. Im ersten Schritt führt die Protonierung des

- 5 -


endocyclischen Sauerstoffs zu einem Carbenium-Ion, an welches sich nachfolgend das Amin

unter der Bildung eines Carbinolammonium-Ions anlagert (SN2-Reaktion). Durch

Dehydratisierung entsteht eine protonierte Schiff Base (Immonium-Ion) bzw. das mesomere

Aminocarbenium-Ion. Unter Abspaltung eines Protons entsteht schließlich das cyclische

Glycosylamin. Die Reaktion kann auch als SN1-Reaktion oder bei Aminosäuren über einen

synchronen Mechanismus formuliert werden (Westphal & Kroh, 1985a).

Bildung von Amadori-Produkten

Die N-Glycoside der Aminosäuren sind wie bereits erwähnt instabil. Zum einen erfolgt leicht

die Hydrolyse unter Rückbildung der Ausgangsstoffe, und zum anderen kann es zur

sogenannten Amadori-Umlagerung kommen. Beide Prozesse erfolgen im Fall von

Aminosäuren durch die Säurefunktion autokatalytisch.

Der italienische Chemiker Mario Amadori (1886 bis 1941) beschäftigte sich näher mit den

Produkten der Umsetzung von Glucose mit p-Phenetidin (4-Ethoxyanilin) und weiteren

aromatischen Aminen. Nach dem Erhitzen ohne den Zusatz eines Lösungsmittels konnte er

zwei Verbindungen gleicher elementarer Zusammensetzung jedoch unterschiedlicher

Stabilität kristallin erhalten (Amadori, 1925). Das „instabile“ Isomer identifizierte Amadori

als N-Glycosid, was später von Kuhn & Dansi (1936) unter Verwendung von Toluidin als

Base bestätigt wurde. Die Struktur des „stabilen“ Isomers, Amadori vermutete eine Schiff

Base, konnte von Kuhn & Weygand (1937) als das Umlagerungsprodukt Isoglucosamin

(1-Amino-1-desoxyketose, Amadori-Produkt) identifiziert werden.

Es soll an dieser Stelle nicht unerwähnt bleiben, dass schon in früheren Arbeiten die

Umsetzung von aromatischen Aminen mit reduzierenden Zuckern beschrieben wurde

(Wrodnigg & Eder, 2001). Anhand der gewählten Reaktionsbedingungen ist anzunehmen,

dass Basilius Sorokin das Glycosylamin (Sorokin, 1888), Hugo Schiff (1834 bis 1915) die

1-Amino-1-desoxyketose (Schiff, 1871) und Robert Sachsse beide Produkte erhielt (Sachsse,

1871). Die Struktur der Produkte wurde jedoch zum damaligen Zeitpunkt noch nicht erkannt.

Weiterhin ist es bemerkenswert, dass die nach Amadori benannte Umlagerung bereits 1886

von Emil Fischer (1852 bis 1919) als Bestandteil der Bildung von Phenylglucosazon aus

Phenylhydrazin und Glucose beobachtet wurde. Um die Bedeutung ahnend vermutete Fischer

bereits: „Die Bildung des Isoglucosamins aus dem Phenylglucosazon ist der besondere Fall

einer allgemeineren Reaktion.“ (Fischer, 1886).

- 6 -


Der Mechanismus der Amadori-Umlagerung der N-Glycoside von Aldosen lässt sich wie in

Abb. 2.1.1-1 dargestellt beschreiben. Im ersten Schritt kommt es durch eine Protonierung der

endocyclischen Sauerstofffunktion des N-Glycosids zu einer Öffnung des halbacetalen Rings

und die beiden mesomeren Spezies das Immonium-Ion (protonierte Schiff Base) und das

Aminocarbenium-Ion können formuliert werden. Die Elektrophilie dieser Mesomeren führt zu

einer Acidifizierung des an 2-Position befindlichen Protons und fördert damit dessen

basekatalysierte Ablösung. Dieser Schritt wird als geschwindigkeitsbestimmend angesehen.

Das freigesetzte Enaminol tautomerisiert anschließend zur 1-Amino-1-desoxyketose, welche

bevorzugt als cyclisches Halbacetal vorliegt. Durch die Amadori-Umlagerung wird somit ein

Aldosylamin in ein Ketose-Derivat überführt (Simon & Kraus, 1970, Westphal & Kroh,

1985b).

Bildung von Heyns-Produkten

Die Umsetzung von Ketosen mit Aminosäuren führt wie bei den Aldosen über die Schiff Base

ebenfalls zu N-Glycosiden, im Fall der Fructose zum 2-Fructosylamin (Abb. 2.1.1-2).

HO

OH

HO

OOH

OH

HOO

HONHR

OH

OH

HOO

HO

NHR

OH

OH

+ H2N R

- H2N R

HO

NHR

HO

OOH

OH

+ H2O

- H2O

2-Fructosylamin

1-Amino-desoxymannose

Fructose

1-Amino-desoxyglucoseHO

NR

HO

OHOH

OH

OHHO OH

O

OH

NHR

*

*

Schiff Base

3-Keto-Umlagerungsprodukt

Abb. 2.1.1-2: Reaktion von Fructose mit Aminosäuren - Bildung von 2-Fructosylamin, Heyns- und 3-Keto-Umlagerungsprodukt.

Eingeleitet durch 1,2-Enolisierung der Schiff Base erfahren diese analog den Aldosylaminen

eine sogenannte Heyns-Umlagerung, welche zu den entsprechenden 2-Amino-

- 7 -


2-desoxyaldosen (Heyns-Produkten) führt (Heyns et al., 1952, 1956, 1957). Auf diese Weise

entsteht beispielsweise bei der Umsetzung von Fructose mit Glycin 2-N-Glycino-

2-desoxyglucose und erwartungsgemäß auch die epimere 2-N-Glycino-2-desoxymannose

(Heyns et al., 1957). Eine Besonderheit der Heyns-Umlagerung ist ihre Reversibilität (Heyns

& Breuer, 1958). Im Gegensatz dazu ist die Amadori-Umlagerung praktisch nicht reversibel.

Bei der Reaktion von Aminosäuren mit Fructose wird jedoch nicht nur die Bildung des

Heyns-Produktes beobachtet. Heyns et al. (1958) stellte unter Synthesebedingungen auch die

Bildung des Amadori-Produktes fest und führte dies zunächst auf das spezifische

Reaktionsvermögen der endständigen α-Hydroxyketon-Gruppe zurück. Eine vorherige

Isomerisierung der Fructose zu Glucose und Mannose im Sinne einer Lobry-de-Bruyn-

Alberda-van-Ekenstein-Umlagerung (De Bruyn & Van Ekenstein, 1895) und eine

anschließende Reaktion der Aldose zum Amadori-Produkt war nicht nachweisbar.

Entsprechend späterer Betrachtungen von Heyns et al. (1961) dürfte die Bildung des

Amadori-Produktes aus Aminosäuren und Fructose aus einer Sekundärreaktion des Heyns-

Produktes mit einer zweiten Aminosäure resultieren. Die Bildung des Amadori-Produktes

wurde ebenfalls bei der Umsetzung von Fructose mit humanen Serumalbumin (HSA) unter

physiologischen und damit sehr milden Bedingungen (wässrige phosphat-gepufferte Lösung,

pH = 7,4, 37 °C) beobachtet (McPherson et al., 1988).

Im Gegensatz zur Schiff Base aus Glucose und einem Amin, kann die Schiff Base der Fructose

auch einer 2,3-Enolisierung unterliegen und es kann zur Bildung isomerer 3-Keto-

Umlagerungsprodukte kommen (Abb. 2.1.1-2). Auf das Auftreten der 3-Keto-Umlagerungs-

produkte wurde von Suarez et al. (1989) nach Inkubation von bovinem Serumalbumin (BSA)

mit Fructose hingewiesen und nach Weenen et al. (1994) lässt sich nur über sie die Bildung

bestimmter Folgeprodukte wie 1-Desoxy- und 4-Desoxyglucosulose erklären.

2.1.2 Die fortgeschrittene Phase

Ausgangspunkt der fortgeschrittenen Phase ist der Abbau der Amadori- und Heyns-

Verbindungen sowie der 3-Keto-Umlagerungsprodukte zu den Desoxyhexodiulosen

(Desoxyosonen, DGs, siehe Abb. 2.1.2-1). Durch 1,2- bzw. 2,3-Enolisierung und

anschließende Eliminierung der Aminofunktion kommt es zur Bildung von 3-DG bzw. 1-DG.

Vorzugsweise bei Disacchariden bleibt nach 2,3-Enolisierung die Aminofunktion erhalten

und es wird das 1-Amino-4-desoxyoson (1-Amino-4-DG) gebildet (Weenen et al., 1994).

- 8 -


HOO

HONHR

OH

OH

Heyns-Produkt

OHHO OH

O

OH

NHR

*

*

3-Keto-Umlagerungsprodukt

HOO

HO

OHOH

NH

R

Amadori-Produkt

O

O

OH

OH

OH

3-DG

O

O

OH

OH

1-DG

O

O

OH

OH

NHR

1-Amino-4-DG

Abb. 2.1.2-1: Abbau von Amadori- und Heyns-Produkt sowie 3-Keto-Umlagerungsprodukt und Bildung der Desoxyosone (Weenen et al., 1994, modifiziert).

Die Desoxyosone sind sehr reaktiv und insbesondere über Enolisierungsreaktionen können sie

isomeriesieren, cyclisieren, dehydratisieren, sich an Redoxreaktionen beteiligen,

Spaltreaktionen wie der Retroaldolreaktion oder auch oxidativen Spaltungen sowie weiteren

Reaktionen unterliegen. Die daraus resultierenden Intermediate sind zum Teil wiederum

äußerst reaktiv und können ebenfalls die genannten Reaktionen eingehen. Es sind ferner

Reaktionen möglich die zur Knüpfung neuer C-C Bindungen führen, z. B. Reaktionen vom

Aldol-Typ. Weiterhin werden in diesem Stadium sowohl die zuvor freigesetzten

Aminogruppen als auch andere funktionelle Gruppen der Aminosäuren und Proteine,

insbesondere die Guanidinofunktion des Arginins, in die sehr komplexen Umsetzungen

einbezogen. Die Knüpfung neuer Bindungen und anschließende Cyclisierung führt dabei zur

Bildung einer Vielzahl von heterocyclischen Verbindungen (Ledl & Schleicher, 1990,

Weenen et al., 1994).

Eine gewisse Schlüsselrolle kommt in der fortgeschrittenen Phase insbesondere den

kürzerkettigen α-Dicarbonylverbindungen wie Glyoxal und Methylglyoxal zu (siehe

Abschnitt 2.3). Diese bewirken z. B. den raschen Strecker-Abbau von Aminosäuren (siehe

Abschnitt 2.3.3) und initiieren damit eine weitere bedeutende Reaktionskaskade die unter

anderen zu typischen Röstaromastoffen wie den Pyrazinen führt (Ledl & Schleicher, 1990).

- 9 -


Auf ausgewählte und für diese Arbeit relevante Intermediate und Reaktionsprodukte wird im

Abschnitt 2.3 näher eingegangen.

2.1.3 Die finale Phase

In der finalen Phase finden die im fortgeschrittenen Stadium eingeleiteten komplexen

Reaktionen ihre Fortsetzung und es kommt neben der vermehrten Bildung von

heterocyclischen Verbindungen zum Auftreten der sogenannten Melanoidine. Es handelt sich

dabei um braune und per Definition stickstoffhaltige Pigmente deren Molekulargewicht von

> 5000 bis zu Teil > 100000 reicht. Die Bildung ist zum einen ausschließlich aus

niedermolekularen Komponenten wie z. B. Glycin und Glucose möglich und zum anderen

können sie wie im Fall der Milch aus Proteinen und Zuckern entstehen. Im letzten Fall dürfte

die Bildung durch Anlagerung von Chromophoren an das Protein oder durch Bildung der

Chromophore direkt am Protein erfolgen (Ledl & Schleicher, 1990, Rizzi, 1997, Van Boekel,

1998).

Um die Struktur der Melanoidine näher zu untersuchen wurden bisher zahlreiche

niedermolekulare Komponenten miteinander in Anlehnung an die Versuche von Maillard

(Maillard, 1912a) umgesetzt. Unter den niedermolekularen Produkten, den sogenannten

Prämelanoidinen, konnten zahlreiche definierte z. T. farbige Verbindungen wie z. B. Blue-M1

(blue Maillard reaction intermediate-1) strukturell eindeutig aufgeklärt werden (Hayase et al.,

1999). Die Aufklärung der höhermolekularen Melanoidine ist auf Grund der strukturellen

Heterogenität schwierig. Mittels spektroskopischer Methoden konnten heterocyclische

Strukturelemente wie Pyrrol-, Indol-, Pyridin- und Furan-Ringe sowie eine große Anzahl

einfacher funktioneller Gruppen nachgewiesen werden (Ledl & Schleicher, 1990, Rizzi,

1997).

Cämmerer & Kroh (1995) schlossen aus der Analyse von Modellmelanoidinen, welche sie

aus verschiedenen Kohlenhydrate mit Aminosäuren erhielten, dass die elementare

Zusammensetzung und damit auch die Struktur von zahlreichen inneren Parametern, z. B. der

Art des Kohlenhydrates, und äußeren Faktoren wie z. B. der Umsetzung in Lösung oder

lösungsmittelfrei, der Temperatur und der Zeit abhängig ist. Die elementare

Zusammensetzung war jedoch von dem molaren Verhältnis Zucker zu Aminosäure unter

sonst gleichen Reaktionsbedingungen nahezu unabhängig.

- 10 -


Die experimentellen Befunde ließen insgesamt den Schluss zu, dass die Melanoidine keine

fundamentale und allgemeingültige Struktur im Sinn eines regulären Aufbaus aus sich

wiederholenden Einheiten besitzen. Für das Aminosäure-Zucker-System wurde eine

vergleichsweise variable Melanoidin-Grundstruktur vorgeschlagen, welche als

Strukturelemente Desoxyosone und durch Aldol-Kondensation gebildete oligomere

Desoxyosone enthält. Aminosäuren ermöglichen eine weitere Verknüpfung dieser Einheiten

z. B. in Form von Immonium-Brücken (>N+-RAminosäure) oder sie sind als Amadori-Produkt

gebunden (Cämmerer & Kroh, 1995, Cämmerer et al. 2002).

Die Struktur und die funktionellen Eigenschaften von Melanoidinen und auch von farbigen

Prämelanoidinen ist Gegenstand zahlreicher aktueller Untersuchungen. Hervorzuheben sind

hier insbesondere entscheidende Beiträge von der Arbeitsgruppe Hofmann (Hofmann, 1999,

Frank & Hofmann, 2000a, b, Lindenmeier et al., 2002).

2.1.4 Die Maillard-Reaktion in Relation zu anderen Reaktionen

In Lebensmitteln und in vivo finden neben der Maillard-Reaktion weitere

Bräunungsreaktionen statt, wobei mehrere Typen unterschieden werden (Friedman, 1996,

Høltermand, 1966).

Die Karamellisierung ist wie die Maillard-Reaktion eine nichtenzymatische Reaktion und

führt im fortgeschrittenen Stadium ebenfalls zu braunen Pigmenten und aromaaktiven

Verbindungen. Bei der Karamellisierung dienen jedoch ausschließlich Kohlenhydrate als

Ausgangsstoff. Die Umsetzungen sind zum Teil denen der Maillard-Reaktion ähnlich, auf

Grund der fehlenden Amin-Katalyse sind jedoch in der Regel drastischere Bedingungen wie

höhere Temperaturen und stärker saure oder basische pH-Werte erforderlich (Kroh, 1994).

Das bedeutet jedoch nicht, dass die Reaktionswege der Maillard-Reaktion immer dominieren.

Beim Erhitzen von Milch resultiert z. B. aus dem reinen Zuckerabbau mehr 3-Desoxy-

glucosulose als aus dem Abbau des Amadori-Produktes (Van Boekel, 1998). Einige

Reaktionen wie z. B. die Autoxidation von Glucose in Gegenwart von Luftsauerstoff finden

bereits unter physiologischen Bedingungen statt (Thornalley, 1985).

- 11 -


Der Ausgangspunkt der enzymatischen Bräunung sind die in pflanzlichen Material

vorkommenden phenolischen Verbindungen. Diese werden in einer durch Polyphenoloxidase

katalysierten Reaktion weiter hydroxyliert und zu Chinonen oxidiert. Anschließend

polymerisieren die Chinone zu höhermolekularen schwarzen Pigmenten und können damit

farbgebend wirken. Im Unterschied zur Maillard-Reaktion und der Karamellisierung ist die

enzymatische Bräunung an die Gegenwart von Sauerstoff geknüpft.

Als ein Subtyp der enzymatischen Bräunung sind die Interaktionen der Chinone mit

stickstoffhaltigen Verbindungen anzusehen, welche ebenfalls zur Bildung von dunkel

gefärbten Komponenten führt (Friedman, 1996).

Aufgrund der komplexen Zusammensetzung von Lebensmitteln und physiologischen

Systemen finden die einzelnen Bräunungsreaktionen parallel statt und beeinflussen einander.

Das resultierende Reaktionsgeschehen wird damit komplexer.

2.1.5 Zur Bedeutung der Maillard-Reaktion in Lebensmitteln

Durch die Maillard-Reaktion wird der Genusswert von erhitzten Lebensmitteln wesentlich

bestimmt. Die Ausbildung eines lebensmittel-typischen Koch-, Back-, Brat- oder Röst-

Aromas ist hierbei an erster Stelle zu nennen. Dafür sind die zahlreichen heterocyclischen

sowie nicht-cyclischen Verbindungen verantwortlich die ab der fortgeschrittenen Phase

gebildet werden. Weiterhin wird durch die Farbbildung insbesondere beim Backen und

Rösten eine charakteristische Bräunung erreicht (Ledl & Schleicher, 1990). Der Geschmack

wird z. B. durch die Bildung von Röstbitterstoffen beeinflusst (Von Reichenbach, 1844).

Diese Veränderungen sind in dem für das jeweilige Lebensmittel typischen Umfang

gewünscht und charakteristisch. Darüber hinausgehende Veränderungen können zum

off-flavor führen. Dies trifft auch auf Umsetzungen zu die für ein Lebensmittel nicht typisch

sind aber z. B. infolge längerer Lagerung auftreten (Ledl & Schleicher, 1990, Mauron, 1981).

Neben den organoleptischen Eigenschaften nimmt die Maillard-Reaktion auch direkten

Einfluss auf die nutritiven Eigenschaften. Hierbei spielt besonders die Verfügbarkeit der

essentiellen Aminosäuren eine große Rolle. Die chemische Modifikation einer Aminosäure

kann dazu führen, das diese vom Körper nicht mehr für die Proteinbiosynthese genutzt

- 12 -


werden kann. In diesem Zusammenhang schenkt man besonders Lysin Aufmerksamkeit

(siehe Abschnitt 2.2).

Zu einer Modifikation der anderen essentiellen Aminosäuren kommt es erst im Verlauf der

fortgeschrittenen Phase, wobei insbesondere Verluste bei den schwefelhaltigen Aminosäuren

zu verzeichnen sind. Daneben wird in diesem Stadium eine Abnahme der Verdaulichkeit des

gesamten Proteins beobachtet, welche die Verfügbarkeit sämtlicher Aminosäuren einschränkt

(Hurrell et al., 1983, Mauron, 1981, 1990, Möller et al., 1977).

Die Minderung der biologischen Wertigkeit des Proteins einzelner Lebensmittel ist beim

gesunden Erwachsenen und einer gemischten Kost in der Regel kein Problem. In einigen

Fällen wo nur eine sehr begrenzte Anzahl von Lebensmitteln als Ernährungsgrundlage dienen

wie z. B. bei der Säuglingsernährung ist jedoch erhöhte Aufmerksamkeit und die Anwendung

besonders schonender Technologien geboten (Hurrell, 1990).

Eng verknüpft mit der Stabilität und Haltbarkeit von Lebensmitteln sind antioxidativ

wirksame Stoffe. Beim Erhitzen von Lebensmittel kommt es zum Abbau von natürlichen

Antioxidationsmitteln. Gleichzeitig erfolgt aber auch eine Bildung von neuen antioxidativ

wirksamen Verbindungen im Zuge der Maillard-Reaktion wie dies z. B. bei

Tomatenprodukten gezeigt werden konnte (Anese et al., 2003, Giovanelli & Paradiso, 2002).

Antioxidativ wirksamen Maillard-Produkten wird auch in vivo eine positive Rolle

zugeschrieben werden. Van Chuyen et al. (1998) konnten beispielsweise nachweisen, dass

Bestandteile aus einem Peptid-Glucose-Reaktionsgemisch und aus Miso, einem „gebräunten“

Sojaprodukt, auch in vivo antioxidativ wirken. Die Aktivität gegenüber reaktiven

Sauerstoffspezies konnte insbesondere bei Peptid-Glucose-Reaktionsprodukten, Amadori-

Produkten, Modell-Melanoidinen und Melanoidinen aus verschiedenen Lebensmitteln wie

Kaffee und Miso gezeigt werden.

Die Produkte der Maillard-Reaktion werden kontrovers im Zusammenhang mit möglichen

mutagenen und karzinogenen Wirkungen diskutiert. In Modellansätzen und Lebensmitteln

konnten z. B. heterocyclische aromatische Amine identifiziert werden, welche sich in in vitro-

und in in vivo-Testsystemen als potente Mutagene und Karzinogene zeigten (Sugimura et al.,

1990). Gleichzeitig werden jedoch auch antimutagene und antikarzinogene Effekte durch

Bräunungsprodukte beobachtet, wobei insbesondere der antioxidativen Aktivität der

Melanoidine eine Schlüsselrolle zugeschrieben wird (Aeschbacher, 1990).

- 13 -


Die Maillard-Reaktion kann dazu benutzt werden die funktionellen Eigenschaften von

Lebensmittelproteinen unter ausschließlicher Verwendung natürlicher Lebensmittel-

bestandteile gezielt zu verändern. So kann z. B. durch Konjugation eines 34 kDa-Sojaproteins

mit Galactomannan die Löslichkeit insbesondere im isoelektrischen Bereich, die

Hitzestabilität sowie die emulgierenden Wirkung stark verbessert werden. Diese Modifikation

beseitigt gleichzeitig die Allergenität dieses Sojaproteins (Babiker et al., 1998).

2.1.6 Zur Bedeutung der Maillard-Reaktion in vivo

Die Maillard-Reaktion ist nicht auf Lebensmittel beschränkt, sondern sie findet ebenfalls

in vivo statt. In diesem Zusammenhang wird sie in Anlehnung an den englischen Begriff

„glycation“ oft als Glykierung bezeichnet. Zum Teil wird auch der Begriff Glycosylierung

gebraucht. Da es sich abgesehen von den anfangs gebildeten N-Glycosiden bei den Produkten

jedoch nicht um Glycoside handelt und zur Unterscheidung zu den enzymatisch gebildeten

„echten“ Glycosiden am Serin und Asparagin, ist die Verwendung des Begriffs Glykierung

jedoch geeigneter.

Die Proteinglykierung wurde in vivo als erstes beim Hämoglobins (Hb A) beobachtet. Unter

den verschiedenen Glycohämoglobinen (Hb AI) dominiert das sogennante Hb AIc. Als Ort der

Glykierung im Hb AIc konnte von Bookchin & Gallop (1968) die N-terminale

α-Aminogruppe der β-Kette identifiziert werden. Die Aufklärung der Struktur des

gebundenen Hexose-Restes als 1-Amino-1-desoxyfructose und damit als Amadori-Produkt

erfolgte durch Bunn et al. (1975, 1979) sowie Flückiger & Winterhalter (1976).

Zwischenzeitlich machten Rahbar et al. (1969) die interessante Beobachtung, dass der

Hb AIc-Anteil um den Faktor zwei bei Diabetikern erhöht ist. Damit wurde erhebliches

Interesse an in vivo stattfindenden Glykierungsprozessen geweckt. Im Folgenden wurde die

Glykierung sehr vieler Proteine aber auch von Aminophospholipiden (Ravandi et al., 1996)

in vivo beobachtet. Ein erhöhter Glykierungsstatus insbesondere bei Diabetes- und Urämie-

patienten erwies sich dabei als ein generelles Phänomen (Thornalley,1999, Henle & Miyata

2003).

Bunn & Higgins (1981) schrieben der in vivo stattfindenden Proteinglykierung evolutionäre

Bedeutung zu. Sie konnten die Reaktivität verschiedener Aldosen und Ketosen gegenüber

- 14 -


Hämoglobin mit dem Anteil der offenkettigen Form korrelieren und zeigten, dass Glucose

unter den getesteten Aldohexosen am langsamsten reagiert. Die Befunde wurden dahingehend

interpretiert, dass offenbar aus diesem Grund Glucose und nicht ein anderes Monosaccharid

als universeller Metabolit fungiert und somit das Vermögen der Saccharide zur Glykierung

von Proteinen ein Auswahlkriterium in der Evolution war.

Neben der Struktur des reduzierenden Zuckers hat weiterhin das Protein selbst einen

wesentlichen Einfluss auf die Geschwindigkeit der Amadori-Produkt-Bildung. Hierbei sind

insbesondere der pKa-Wert, die sogenannte Mikro-Umgebung und die Zugänglichkeit der

einzelnen Aminogruppen zu diskutieren. So kann der pKa-Wert erheblich durch benachbarte

Aminosäurereste beeinflusst werden. Bestimmte räumlich benachbarte Aminosäuren wie z. B.

Histidin bewirken weiterhin eine lokale Säure-Base-Katalyse oder sie fungieren als

kationische Bindungsstelle für Effektoren, welche dann katalytisch wirken (z. B. Phosphat).

Nicht zuletzt wirkt sich die Art des Lösungsmittels und das Ionenmilieu, z. B. die

Anwesenheit von Phosphat, aus. Im Ergebnis dessen wird die Bildung von Amadori-

Produkten in der Regel an ganz bestimmten individuellen Aminogruppen am Protein

beobachtet (Baynes et al., 1989). Im Fall des Hämoglobins ist der bevorzugte Reaktionsort die

N-terminale α-Aminogruppe der β-Kette, die anderen Aminogruppen sind deutlich weniger

reaktiv (Bunn et al., 1979).

Inzwischen wurde die Glykierung sehr vieler extra- und intrazellulärer Proteine in vivo

beschrieben. Neben der Bildung der frühen Maillard-Produkte kommt es in vivo ebenfalls zur

Bildung von Produkten der fortgeschrittenen Phase. Für diese wurde von Vlassara et al.

(1984) der Begriff AGEs („advanced glycosylation end-products“) eingeführt. Heute wird der

Begriff AGE als Abkürzung für „advanced glycation end-product“ gebraucht. Es werden

darunter stabile Endprodukte der Reaktion von aus Kohlenhydraten hervorgegangenen

Carbonylverbindungen mit Aminokomponenten verstanden. Da einige an der AGE-Bildung

beteiligte Carbonylverbindungen wie z. B. Glyoxal auch bei der Lipidoxidation entstehen,

werden nach Baynes (2000) diese Produkte auch als EAGLEs („either advanced glycation or

lipoxidation end-products“) bezeichnet. Weiterhin findet entsprechend der Begriff ALE

(„advanced lipoxidation end-product“) Anwendung (Requena et al., 1996).

- 15 -


Glykierung - Ursache oder Folge von Krankheiten?

Die Glykierung von Proteinen findet ständig statt und sie ist als ein normaler

Alterungsprozess der Proteine anzusehen. Da Glykierungsprozesse sehr oft mit einer

Änderung der Proteineigenschaften, der Struktur, der Halbwertszeit oder auch der Funktion

einhergehen, dürften sie von physiologischer und gegebenenfalls auch pathophysiologischer

Bedeutung sein (Thornalley, 1999).

Zur Anreicherung von Glykierungsprodukten kommt es z. B. wenn infolge von Diabetes

mellitus die Konzentration an Glucose und anderer glykierenden Agenzien erhöht ist, oder

wenn die Ausscheidung z. B. durch eine renale Dysfunktion vermindert ist. Weiterhin erfolgt

eine Akkumulation an besonders langlebigen Proteinen wie dem Linsenkristallin und

Kollagen (Thornalley, 1999).

Ein vermehrtes Auftreten von AGEs wird bei verschiedenen Krankheiten wie

diabetesbedingten Gefäßerkrankungen, diabetischer Katarakt, Arteriosklerose, chronischer

Niereninsuffizienz, dialysebedingter Amyloidose, neurodegenerativen Erkrankungen wie

Alzheimer sowie mit zunehmenden Alter beobachtet. Welche Rolle AGEs bei diesen

Prozessen zukommt, ob sie ursächlich ist oder ob die verstärkte Bildung und Akkumulation

nur eine Begleiterscheinung ist, wird sehr intensiv und kontrovers diskutiert (Bailey et al.,

1998, Baynes, 2000, 2001, Brownlee, 2000, 2001, Lyons, 2002, Miyata et al., 2000a, 2000b,

Raj et al., 2000, Singh et al., 2001, Stitt, 2001). In letzter Zeit schreiben einige Autoren auch

den mengenmäßig dominierenden proteingebundenen Amadori-Produkten eine patho-

physiologische Rolle zu (Salazar et al., 2000, Schalkwijk et al., 2002).

Nach Baynes (2000, 2001) sind AGEs nicht primär für die Geschwindigkeit des Alterns

verantwortlich, dies ist hauptsächlich die langsame kumulative Schädigung des Genoms. Es

ist jedoch denkbar, das Letzteres auch durch Glykierungsprozesse erfolgen kann.

Die Entstehung von Krankheiten ist multifaktoriell geprägt und Glykierungsprodukte können

deshalb kaum als eine alleinige Ursache angesehen werden. Die Bedeutung von

Glykierungsprodukten ist wahrscheinlich darin zu sehen, dass sie zum Fortschreiten

bestehender und zur Entwicklung neuer pathophysiologischer Prozesse beitragen können,

wenn sie auf einem bestimmten Niveau vorhanden und bestimmte weitere Faktoren gegeben

sind (Baynes, 2001, Stitt, 2001).

- 16 -


Dabei dürften nicht nur veränderte funktionelle Eigenschaften von intrazellulären Proteinen

eine Rolle spielen. Insbesondere bei Komplikationen in Folge von Diabetes mellitus werden

modifizierte extrazelluläre Matrixkomponenten als Ursache für gestörte Matrix-Matrix-,

Matrix-Zell- und Zell-Zell-Interaktionen diskutiert. Weiterhin erfolgt eine Bindung von AGE-

modifizierten Plasmaproteinen an AGE-Rezeptoren wie an RAGE („receptor for advanced

glycation end-products“). In dessen Folge soll es zu bestimmten Zellaktivierungsprozessen

kommen die zur Bildung reaktiver Sauerstoff-Spezies und zu pathophysiologischen

Veränderungen in der Genexpression führen (Brownlee, 2000, 2001). In ähnlicher Weise

werden auch bestimmte Fructoselysin bindende Proteine diskutiert (Salazar et al., 2000).

Neuere Befunde stellen jedoch nachteilige Zellaktivierungsprozesse als Folgen von AGE-

RAGE-Interaktionen in Frage (Valencia et al., 2004).

2.2 Analytik von Amadori-Produkten

2.2.1 Zur Bedeutung von Amadori-Produkten

Amadori-Produkte sind die ersten relativ stabilen Intermediate der Maillard-Reaktion und sie

werden deshalb in sehr vielen Lebensmitteln gefunden. Die Bildung ist besonders bei erhöhter

Temperatur, geringer Wasseraktivität (aw = 0,3 bis 0,7) oder längerer Lagerung begünstigt.

Eine hohe Stabilität und damit eine Anreicherung wird insbesondere bei verminderter

Wasseraktivität, z. B. in Milchtrockenerzeugnissen, Trockenfrüchten und Trockengemüse

beobachtet. Amadori-Produkte sind farb- und geruchlos und damit sensorisch nicht

wahrnehmbar. Sie sind jedoch wichtige Vorstufen für erwünschte oder auch nicht erwünschte

Aroma- und Farbstoffe. Damit sind sie aus lebensmitteltechnologischer Sicht als Parameter

zur Prozesslenkung interessant (Ciner-Doruk & Eichner, 1979, Schräder & Eichner, 1996).

Im Hinblick auf die Stabilität von Lebensmitteln dürfte die ausgesprochen hohe

Reduktionskraft bereits unter milden Bedingungen von Bedeutung sein, welche auch zur

analytischen Detektion genutzt werden kann. Die Desoxyfructosyl-Aminosäuren besitzen

z. B. ein Reduktionsvermögen gegenüber Kaliumhexacyanoferrat(III) in 0,1 M Natronlauge

bei 20 °C die von Glucose oder Fructose erst bei 100 °C erreicht wird. Das

Reduktionsvermögen der isomeren Glycosyl-Aminosäuren ist demgegenüber nur mit dem der

Monosaccharide vergleichbar (Abrams et al., 1955).

- 17 -


In Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Lebensmittel bezüglich der Kohlenhydrat-

und Stickstoff-Fraktion werden die entsprechenden Amadori-Produkte von freien

Aminosäuren, Peptiden und Proteinen gefunden. Die Bildung von Amadori-Produkten an den

ε-Aminogruppen von proteingebundenen Lysin-Resten spielt bei den meisten Lebensmitteln

die quantitativ wichtigste Rolle. Da als Amadori-Produkt modifiziertes Lysin für die

Proteinbiosynthese nicht mehr genutzt werden kann und Lysin in vielen pflanzlichen

Proteinen (z. B. Getreideproteine) die limitierende essentielle Aminosäure ist, ist diese Lysin-

Modifizierung aus ernährungsphysiologischer Sicht nicht erwünscht. Infolgedessen war man

sehr früh bemüht das verfügbare und das nicht verfügbare (blockierte) Lysin zu bestimmen,

und auf Grundlage dessen technologische Prozesse zu verbessern. Unter den zahlreichen

Methoden die für diesen Zweck entwickelt wurden hat sich die Bestimmung von Furosin als

sehr vorteilhaft erwiesen (Finot et al., 1981) und sie ist neben der direkten

Fluordinitrobenzol-Methode das genaueste Verfahren (Hurrell et al., 1983).

2.2.2 Analytik von Furosin

Das Aminosäurederivat Furosin (Nε-(2-Furoylmethyl)-lysin) entsteht nicht direkt bei der

Maillard-Reaktion und ist damit nicht originär im Protein vorhanden, sondern es wird erst bei

der für die Aminosäureanalytik angewendeten Salzsäurehydrolyse aus Nε-Desoxyhexosyl-

Derivaten des Lysins gebildet (Abb. 2.2.2-1). Im Gegensatz dazu liefern die sich von

Pentosen ableitenden Amadori-Produkte, Heyns-Produkte und 3-Keto-Umlagerungsprodukte

bei der Salzsäurehydrolyse ohne vorherige Derivatisierung keine stabilen neuen Produkte.

Erbersdobler und Zucker (1966) fanden Furosin erstmals in salzsauren Hydrolysaten von

überhitztem Milchpulver und beschrieben es als unbekannte „Substanz X“, welche bei der

Ionenaustauschchromatographie nach Spackman et al. (1958) dem Arginin folgt.

Die unbekannte Verbindung wurde ebenfalls nach Hydrolyse eines Glucose-Lysin-

Reaktionsgemisches detektiert (Erbersdobler & Zucker, 1966), und schließlich konnte

Nε-Desoxyfructosyllysin als direkter Precursor identifiziert werden (Erbersdobler & Bock,

1967, Brüggemann & Erbersdobler, 1968). Heyns et al. (1968) sowie Finot et al. (1968)

isolierten anschließend die neue Verbindung aus Hydrolysaten von Nε-Desoxyfructosyllysin

und konnten sie strukturell als Nε-(2-Furoylmethyl)-lysin aufklären (Abb. 2.2.2-1). Die

- 18 -


Isolierung aus dem Hydrolysat eines Glucose-Casein-Erhitzungsansatzes mit

darauffolgendem strukturellen Nachweis erfolgte schließlich durch Nakai et al. (1975).

Als ein weiteres Folgeprodukt der Salzsäurehydrolyse von Nε-Desoxyfructosyllysin und

Nε-Desoxylactulosyllysin wurde Pyridosin (6-(5-Hydroxy-2-methyl-4-oxo-4H-pyridin-1-yl)-

L-norleucin, Abb. 2.2.2-1) detektiert (Finot et al. 1969). Ferner wurde eine Rückbildung von

Lysin beobachtet (Erbersdobler & Bock, 1967).

110 °C, 23 h

6 M HClHN

O

NH

O

HN

HO

NH2

O

O

O

H2N

HO

NH2

O

N

HO

NH2

O

O

HO

Nε-Desoxyfructosyllysin

Furosin

Lysin

Pyridosin

O

OH

OH

HOHO

Abb. 2.2.2-1: Salzsäurehydrolyse von Nε-Desoxyfructosyllysin.

Furosin wurde schnell als geeigneter Marker für die frühe Phase der Maillard-Reaktion

erkannt und insbesondere für die Beurteilung der Wärmebehandlung von Milchprodukten

sowie zur Verbesserung technologischer Prozesse herangezogen (Finot et al., 1981,

Erbersdobler, 1986). Die Bestimmung von Furosin und Lysin mittels Aminosäureanalyse

erlaubt weiterhin sowohl die Berechnung des biologisch verfügbaren als auch des nicht

verfügbaren Lysins (Bujard & Finot, 1978). Da zur Ermittlung des blockierten Lysins der

Ausgangsgehalt an Lysin nicht bekannt sein muss, ist dies ein Vorteil gegenüber anderen

Verfahren wie z. B. der Fluordinitrophenylierung. Weiterhin kommt es bei der Bestimmung

nicht zu Interferenzen durch die Anwesenheit des Glycosylamins und der im Gleichgewicht

befindlichen Schiff Base wie dies beim Natriumborhydrid-Verfahren zu beobachten ist

(Hurrell & Carpenter, 1981). Dies ist insbesondere bei erhitzter Milch von Interesse, da in

dieser das biologisch verfügbare Glycosylamin gegenüber dem Amadori-Produkt quantitativ

dominiert (Finot et al., 1977).

- 19 -


Methoden zur Bestimmung von Furosin

Furosin wurde und wird bei der Aminosäureanalyse mittels Kationenaustausch-

chromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrin bestimmt, wobei sich die

Elution am Ende des Chromatogramms und damit die gute Abtrennung als vorteilhaft erwies

(Brandt & Erbersdobler, 1972, Henle et al., 1991). Schleicher & Wieland (1981) führten zur

Bestimmung die HPLC mit UV-Detektion bei 280 nm ein und konnten auf diese Weise die

Nachweisgrenze erheblich senken. Dies ermöglichte die nachweisstarke Untersuchung

biologischer Proben und verbesserte damit wesentlich die Kenntnisse um in vivo stattfindende

Glykierungsreaktionen (Schleicher et al., 1981). Im Folgenden wurden weitere Verfahren zur

Furosin-Bestimmung entwickelt, z. B. die Gaschromatographie (Büser & Erbersdobler,

1985), die Kapillarelektrophorese (Tirelli, 1998) sowie die HPLC mit massen-

spektroskopischer Detektion (Takemura et al., 1997). Die gaschromatographische Methode

erwies sich jedoch für die Routineanalytik als ungeeignet (Ruttkat & Erbersdobler, 1994).

Insbesondere bei Milchprodukten wird heute ein Ionenpaar-HPLC-Verfahren nach Resmini et

al. (1990) angewendet bei der das Hydrolysat vorher an einer C18-Phase gereinigt wird. Die

Nachweisgrenze wurde bei dem Verfahren nach Resmini et al. (1990) zu ca. 2 pmol ermittelt

(Knobloch, 1999), das bei der Kationenaustauschchromatographie beträgt ca. 200 pmol.

Furosin als Güteparameter bei Milchprodukten

Bei der Wärmebehandlung und Lagerung von Milch und Milchprodukten steigt der

Furosingehalt (nach Hydrolyse) in der Initialphase linear an. Die Bildung lässt sich mit einer

Kinetik pseudo-nullter Ordnung beschreiben (Claeys et al., 2001). Im fortgeschrittenen

Stadium der Maillard-Reaktion sinkt der Gehalt dagegen wieder. Furosin ist folglich ein sehr

geeigneter Indikator für den Wärmeeintrag bzw. die Lagerbedingungen in der frühen Phase

der Maillard-Reaktion, welche bei normal prozessierten Milchprodukten praktisch nicht

überschritten wird (Finot et al., 1981, Lopez-Fandino & Olano, 1999).

In Tabelle 2.2.2-1 sind die ermittelten Furosingehalte einiger wichtiger Milchprodukte

zusammengestellt. Die bei den Milchpulvern angegebenen Gehalte betreffen frische und sehr

schonend hergestellte Pulver. Nach Van Renterghem & De Block (1996) kann es bei

ungünstiger Lagerung, insbesondere leicht erhöhten Temperaturen, sehr schnell zum Anstieg

der Gehalte auf über 1000 mg / 100 g Protein kommen (12 d, 37 °C).

- 20 -


Tab. 2.2.2-1: Nach Hydrolyse bestimmte Furosingehalte wichtiger Milchprodukte.

Produkt Furosingehalt

[mg / 100 g Protein]

Autoren

Rohmilch 4 - 7 Henle et al., 1995, Clawin-Rädecker et al., 1996

Past. Milch 5 - 8 Henle et al., 1995, Knobloch, 1999, Van

Renterghem & De Block, 1996

UHT Milch, direkt 30 – 110 Birlouez-Aragon et al., 1998, Pellegrino et al.,

1995, Van Renterghem & De Block, 1996

UHT Milch, indirekt 110 - 240 Birlouez-Aragon et al., 1998, Pellegrino et al.,

1995, Van Renterghem & De Block, 1996

Sprühmilchpulver > 50 Clawin-Rädecker et al., 1996

Walzenmilchpulver > 300 Clawin-Rädecker et al., 1996

Die gemessenen Gehalte an Furosin erlauben sowohl eine Differenzierung von niedrig

erhitzten Erzeugnissen als auch den Nachweis von lactosehaltigen Milchtrockenprodukten. In

roher oder pasteurisierter Milch können z. B. noch 5 bis 6 % rekonstituierte Milch

nachgewiesen werden (Van Renterghem & De Block, 1996, Shin et al., 2000). Für einige

Fragestellungen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, Furosin und Lactulose gemeinsam zur

Beurteilung heranzuziehen. Lactulose ist ebenfalls ein Erhitzungsindikator und entsteht durch

Isomerisierung aus Lactose. Da die Bildung beider Indikatoren einer unterschiedlichen

Kinetik gehorcht und verschieden von der Zusammensetzung der Milch und den

Erhitzungsbedingungen abhängig ist, sind detailliertere Aussagen zur Güte möglich (Claeys et

al., 2002). So lässt ein von der Norm abweichendes Lactulose-Furosin-Verhältnis auf die

Gegenwart von rekonstituierter Milch in UHT- oder Sterilmilch, inkorrekte thermische

Behandlung oder eine ungeeignete Lagerung schließen (Corzo et al., 1994, Pellegrino, et al.,

1995, Villamiel et al., 1997). Die Nachweisgrenze von rekonstituierter Milch in UHT-Milch

wird mit ca. 10 % angegeben (Montilla et al., 1997).

Bei einigen Erzeugnissen hat die Gesetzgebung zur Qualitätsbeurteilung Grenzwerte

festgelegt. So darf in Italien z. B. peroxidase-positive pasteurisierte Milch nicht mehr als

8,6 mg Furosin pro 100 g Protein aufweisen (Italienische Regierung, 2001). Die

vorgeschlagene Einführung eines Grenzwertes für pasteurisierte Milch auf europäischer

Ebene erfolgte bisher nicht und ist auch nicht zu erwarten (Glaeser, 1999). In der

- 21 -


Europäischen Gemeinschaft gilt jedoch ein Grenzwert von 10 mg Furosin pro 100 g Protein

für traditionellen Mozzarella im Sinne der Verordnung (EG) Nr. 2527/98 (Europäische

Kommission, 1998).

Furosin in anderen Lebensmitteln und in physiologischen Proben

Furosin wurde auch bei zahlreichen weiteren Lebensmittel als geeigneter Indikator für den

Fortschritt der frühen Maillard-Reaktion und damit als Güte- und Prozesslenkungsparameter

befunden, so z. B. bei Eiern (Hidalgo et al., 2000), gekochtem Schinken (Pompei &

Spagnolello, 1997a, 1997b), Gelee Royale (Marconi et al., 2002), Honig (Villamiel et al.,

2001), Käse (Villamiel et al., 2000), Marmelade (Rada-Mendoza et al., 2002), Teigwaren

(Acquistucci, 2000) und Tomatenprodukten (Hidalgo et al., 1998, Hidalgo & Pompei, 2000,

Giovanelli & Lavelli, 2002). Ein Feld von besonderer Bedeutung sind diätetische Erzeugnisse

wie Säuglings- und Kleinkindernahrungen (Evangelisti et al., 1994, Ferrer, et al., 2003,

Guerra-Hernandez et al., 1999, 2002, Rada-Mendoza et al., 2002) und Produkte für die

enterale Ernährung (Rufian-Henares et al., 2002).

Die Analyse von Furosin findet weiterhin bei biologischen Proben Anwendung. Dies

ermöglicht die Beurteilung der in vivo stattfindenden Proteinglykierung, z. B. zur

glykämischen Kontrolle und Lenkung (Takemura et al., 1997) oder bei Urämie (Floridi et al.,

1999). Sie kann jedoch auch genutzt werden um die Wirkung medizinischer Verfahren wie

z. B. der Hämo- und Peritoialdialyse zu bewerten (Floridi et al., 2002, Wu et al., 1995).

Ferner wird Furosin als definierter chemischer Marker in Studien zum Verbleib von alimentär

zugeführten Amadori-Produkten genutzt (Henle et al., 2000).

Neben Furosin sind auch die N-Furoylmethyl-Derivate anderer Aminosäuren bekannt, welche

analog dem Furosin bei der Salzsäurehydrolyse aus den entsprechenden freien

Nα-Desoxyhexosyl-Aminosäuren entstehen (Lipton et al., 1971). Einige Furoylmethyl-

Aminosäuren eignen sich ebenfalls als Erhitzungs- und Güteindikatoren. Die Anwendung

erfolgte insbesondere bei Honig (Sanz et al., 2003), Orangensaftpulver (Del Castillo et al.,

1998, 1999), Tomatenprodukten (Sanz et al., 2000) und Trockenfrüchten (Sanz et al., 2001).

- 22 -


2.2.3 Zur molaren Ausbeute an Furosin

Wie bereits erwähnt wird bei der Salzsäurehydrolyse aus Nε-Desoxyhexosyl-Derivaten des

Lysins nicht nur Furosin sondern auch Pyridosin und Lysin gebildet, d. h. allein aus der

Quantifizierung des Furosins kann noch nicht auf den Gehalt an Amadori-Produkt

geschlossen werden. Dies schränkt die Aussagekraft der Methode zunächst erheblich ein. Zur

Berechnung des biologisch verfügbaren und des blockierten Lysins ist es erforderlich zu

wissen, wie viel des Amadori-Produkts in Furosin und Lysin überführt wird. Über die Höhe

der molaren Ausbeuten bestehen jedoch gewisse Unsicherheiten, welche einer Klärung

bedürfen (Resmini et al., 1990, Van Boekel, 1998).

In Tab. 2.2.3-1 sind die aus der Literatur bekannten molaren Ausbeuten an den

Hydrolyseprodukten zusammengefasst.

Tab. 2.2.3-1: Molare Ausbeuten der Hydrolyseprodukte nach Hydrolyse verschiedener

Amadori-Produkte mit Salzsäure.

Derivat Säure

[mol/l]

Furosin

[%]

Pyrid.1

[%]

Lysin

[%]

Kalibr.

Furosin

Autoren

For-Lys(Fru)-OH 6,00 20 10 50 Lys

For-Lys(Lct)-OH 7,75 29 11 44 Lys

Finot

& Mauron, 1972

~Lys(Lct)~

(Milchprodukte)

7,80 40 10 50 Arg Brandt

& Erbersdobler, 1972

~Lys(Lct)~

(Milchprodukte)

7,80 36 10 50 Arg Erbersdobler, 1986

~Lys(Lct)~

(Milchprodukte)

6,00 32 k.A.2 k.A.2 Lys Finot et al., 1977

H2N-Lys(Fru)OH 7,80 30 38 32 Furosin Steinig

& Montag, 1982

For-Lys(Fru)-OH 7,80 46 k.A.2 35 Furosin Szölgyenyi et al., 1989

~Lys(Lct)~

(Milchprodukte)

11,003 50 k.A.2 k.A.2 Furosin Watanabe et al., 1995

1 Pyridosin, 2 keine Angabe, 3 10 h, 110 °C

- 23 -


Wie Tab. 2.2.3-1 zu entnehmen ist, werden bei der Hydrolyse mit der für die

Aminosäureanalyse üblichen 6 M Salzsäure molare Ausbeuten für Furosin von 20 und 32 %

angegeben. Für die Hydrolyse mit 7,8 M Salzsäure bewegen sich die Angaben zwischen 29

und 46 %. Als eine entscheidende Ursache für die nicht unerheblichen Unterschiede ist die

Art der Kalibration und der verwendete Standard anzusehen. Da bis Anfang der Neunziger

Jahre des zwanzigsten Jahrhunderts kein Furosin-Standard kommerziell verfügbar war,

musste dieser entweder selbst als Referenz rein dargestellt werden oder es wurde

näherungsweise über die Kalibriergerade des Lysins oder Arginins ausgewertet.

Wenn auch gewisse Unklarheiten über die Höhe der molaren Ausbeuten der

Hydrolyseprodukte bestehen, so können einige wichtige Randbedingungen als gesichert

gelten. So sind die molaren Ausbeuten unter identischen Hydrolysebedingungen (Art und

Konzentration der Säure, Zeit, Temperatur) konstant. Die Art der Hydrolyse, ob unter

Rückfluss oder in verschlossenen Gefäßen, hat keinen Einfluss. Die Anwesenheit von

reduzierenden Zuckern oder das Protein-Salzsäure-Verhältnis wirkte sich gleichfalls nicht

nachteilig im getesteten Bereich aus (Finot, 1973). Die Konzentration der verwendeten

Salzsäure hat dagegen einen erheblichen Einfluss. Nach Henle et al. (1995) steigt die

Ausbeute an Furosin linear mit der Salzsäurekonzentration im Bereich von 4 bis 8 M (23 h,

110 °C).

Bei Verwendung höher konzentrierter Salzsäure ist eine weitere Steigerung der

Furosinbildung möglich. Dabei werden zwei Effekte beobachtet. So steigt am Anfang der

Hydrolyse die Furosinkonzentration rasch an, limitieren dürfte dabei neben der

Furosinbildung als solche die Freisetzung des Furosins aus dem Proteinverband sein.

Gleichzeitig findet ein nicht unerheblicher Abbau statt, so dass zu einer bestimmten Zeit ein

Maximalwert resultiert (Watanabe et al., 1995, Guerra-Hernandez & Corzo, 1996). Da das

Zeitfenster der maximalen Furosinbildung relativ klein ist, dürfte die Reproduzier- und

Vergleichbarkeit der Ergebnisse vermindert sein. Auf Grund dessen, der nur marginal

höheren Ausbeute und der arbeitstechnisch ungünstige Zeit von 10 h hat sich offenbar ein

Hydrolyseverfahren welches z. B. von Watanabe et al. (1995) beschrieben wurde nicht

durchgesetzt. Als Kompromiss wird heute in der Regel mit 8 M Salzsäure für 23 h bei 110 °C

hydrolysiert.

- 24 -


Um die Problematik über die Höhe der molaren Ausbeute zu umgehen, und trotzdem auf die

Lysin-Derivatisierung zu schließen, wurde von Schleicher & Wieland (1981) ein Hydrolysat

von Nε-Desoxyfructosyllysin als externer Standard zur Kalibration verwendet. Ähnlich ist das

Vorgehen von Takemura et al. (1997), welche der Probe zur Hydrolyse Nα-Formyl-

Nε-Desoxyfructosyl-d4-lysin als internen Standard zusetzten. Diese Vorgehensweisen sind im

Einzelfall geeignet, eine breite Anwendung ist jedoch an die kommerzielle Verfügbarkeit der

Standards geknüpft.

Furosin ist kommerziell erhältlich und kann somit zur Kalibration verwendet werden. Es ist

demzufolge sinnvoll käufliches Furosin als Standard zu verwenden und die molaren

Ausbeuten mit definierten Amadori-Produkten zu bestimmen. Anhand der so ermittelten

Überführungsfaktoren sollte dann eine breite und sichere Anwendung des Furosin-Verfahrens

zur Bestimmung der Lysin-Derivatisierung sowohl in Lebensmitteln als auch in biologischen

Proben möglich sein. Durch die Erweiterung dieses Hintergrundwissens dürfte gleichzeitig

die Verwendung von Furosin als Qualitätsparameter auf eine solidere Grundlage gestellt

werden.

Um dies zu erreichen, sind die in Lebensmitteln quantitativ wichtigen Amadori-Produkte als

Referenzsubstanzen darzustellen und gezielt zu hydrolysieren. Die Quantifizierung der

Hydrolyseprodukte mittels Aminosäureanalyse ermöglicht anschließend die Berechnung der

molaren Ausbeuten sowie der Überführungsfaktoren.

- 25 -


2.3 Reaktion von Proteinen mit reaktiven α-Dicarbonylverbindungen

2.3.1 Wichtige α-Dicarbonylverbindungen

Glyoxal Methylglyoxal

O

O

O

O

O

O

OH

OH

OH

3-DG

O

O

Diacetyl

Abb. 2.3.1-1: Wichtige α-Dicarbonylverbindungen.

α-Dicarbonylverbindungen wie z. B. Glyoxal, Methylglyoxal, 3-Desoxyglucosulose (3-DG)

treten sowohl in Lebensmitteln als auch in vivo als reaktive Intermediate auf. In

Lebensmitteln sind sie wichtige Precursoren für aromaaktive Substanzen und

Bräunungsprodukte, welche im Verlauf der Maillard-Reaktion entstehen. Sie haben damit

wesentlichen Einfluss auf dessen sensorischen und nutritiven Wert. Aus physiologischer Sicht

sind sie insbesondere wegen ihres proteinmodifizierenden Potentials von Interesse, und sie

gelten als Schlüsselverbindungen bei der Bildung von AGEs.

Weiterhin erwiesen sie sich in bestimmten Konzentrationen als cytotoxisch und wirkten im

Ames-Test ohne Aktivierung als mutagen. Als Ursache für die Mutagenität wird die

Reaktivität gegenüber den Purinbasen angesehen (Lee & Shibamoto, 2002).

Die Konzentrationen dieser Verbindungen ist in Lebensmitteln und in vivo in der Regel

gering, z. B. im Vergleich zur Plasmaglucosekonzentration (nüchtern) von ca. 5 mM (Lapolla

et al., 2002). Dies ist auf die hohe Reaktivität und auf in vivo stattfindende Entgiftungs-

prozesse zurückzuführen. Die im menschlichem Plasma gemessenen Gehalte bewegen sich

im µM-Bereich und sind bei bestimmten Krankheiten wie Urämie und Diabetes mellitus

erhöht (Tab. 2.3.1-1), wobei die Angaben offenbar methodisch bedingt voneinander

differieren. Die Ursache für die erhöhten Konzentrationen bei Nierenkranken und Diabetikern

ist sowohl in der vermehrten Bildung als auch in einer verminderten Entgiftung und

Elimination zu sehen.

- 26 -


Tab. 2.3.1-1: Konzentrationen von Glyoxal, Methylglyoxal und 3-DG im menschlichen

Plasma.

Glyoxal1

[µmol/l] Methylglyoxal1

[µmol/l] 3-DG1

[µmol/l] Autoren

Gesunder2 1,2 ± 0,3 0,7 ± 0,2 0,2 ± 0,1 Odani et al., 1999b

Diabetiker2 1,4 ± 0,5 2,2 ± 0,6 0,5 ± 0,1

Urämiker3 3,8 ± 0,5 1,5 ± 0,3 0,4 ± 0,1

Gesunder2 215 ± 9 118 ± 7 n. b. Lapolla et al., 2003

Diabetiker4,5 468 ± 148 407 ± 77 n. b.

Diabetiker4,6 355 ± 90 368 ± 82 n. b. 1 Mittelwert ± Standardabweichung, 2 n = 20, 3 n = 15, 4 n = 10, 5 schlechte / 6 gute Einstell-

ung der Blutglucosekonzentration, n. b. nicht bestimmt

Tabelle 2.3.1-2 gibt einen Überblick zu in Lebensmitteln bestimmten Konzentrationen an

α-Dicarbonylverbindungen. Die Gehalte bewegen sich ebenfalls im µmol/l- bzw. µmol/kg-

Bereich oder darunter, wobei davon auszugehen ist, dass ein nicht unerheblicher Teil bereits

durch Folgereaktionen gebunden wurde. Einige Proben wie z. B. der Ossolano-Ziegenkäse

fallen durch höhere Gehalte auf. Insgesamt ist zu resümieren, dass mit der Bildung von

α-Dicarbonylverbindungen insbesondere in stark thermischen behandelten oder fermentierten

Lebensmitteln zu rechnen ist.

Tab. 2.3.1-2: Konzentrationen von α-Dicarbonylverbindungen in Lebensmitteln.

Lebensmittel α-Dicarbonylverb. Gehalt Autoren

Bier Methylglyoxal 10 µmol/l Hayashi & Shibamoto, 1985

Cola Methylglyoxal 3 µmol/l Hayashi & Shibamoto, 1985

Essig Methylglyoxal 26 µmol/l Rodrigues et al., 1999

Kaffee, gebrüht Methylglyoxal 320 µmol/l Hayashi & Shibamoto, 1985

Sojasoße Methylglyoxal 40-100 µmol/l Hayashi & Shibamoto, 1985

Sherry-Wein Glyoxal

Methylglyoxal

7-27 µmol/l

10–25 µmol/l

De Revel & Bertrand, 1993

Wein, rot Glyoxal

Methylglyoxal

3–4 µmol/l

2–6 µmol/l

De Revel & Bertrand, 1993

- 27 -


Lebensmittel α-Dicarbonylverb. Gehalt Autoren

Wein, weiß Glyoxal

Methylglyoxal

9 µmol/l

40 µmol/l

Barros et al., 1999

Butter Diacetyl 6 µmol/kg

330 µmol/kg

Rodrigues et al., 1999

Esteve et al., 2002

Emmentaler-Käse Diacetyl 1 µmol/kg Preininger & Grosch, 1994

Honig Glyoxal

Methylglyoxal

3-DG

29 µmol/kg

33 µmol/kg

1110 µmol/kg

Weigel et al., 2004

Joghurt Glyoxal

Methylglyoxal

Diacetyl

11–16 µmol/kg

8-18 µmol/kg

11-26 µmol/kg

Yamaguchi et al., 1994

Kaffeesahne 3-DG 3 µmol/l Rättich, 2004

Malzbier 3-DG 130 µmol/l Rättich, 2004

Ossolano-Ziegenkäse Diacetyl 52509 µmol/kg Zeppa et al., 2001

Parmesan,

direkt gesalzen

in Lake gesalzen

Methylglyoxal

Methylglyoxal

77 µmol/kg

9 µmol/kg

Lindsay & McDonald, 1992

2.3.1.1 Glyoxal

Glyoxal kann sowohl nichtenzymatisch als auch im Zuge enzymatischer Prozesse entstehen

(siehe Abb. 2.3.1.1-1). Auf nichtenzymatischen Weg kann die Bildung durch reinen

Zuckerabbau (Karamellisierung) oder amin-katalysiert erfolgen. Beim reinen Zuckerabbau

wird zunächst eine Fragmentierung (Retroaldol-Reaktion) der Glucose zu Glycolaldehyd

angenommen, welcher anschließend autoxidativ durch Sauerstoff zu Glyoxal oxidiert wird

(Thornalley, 1985). Es wird jedoch auch eine Retroaldol-Reaktion der Glucose diskutiert, die

direkt zu Glyoxal führt (Thornalley et al., 1999). Wesentlich schneller als der reine

Zuckerabbau erfolgt jedoch die Bildung von Glyoxal in Gegenwart einer Amino-Komponente

durch die Maillard-Reaktion (Thornalley et al., 1999). Hierbei kommt dem sogenannten

Namiki-Weg (Namiki & Hayashi, 1983) eine Schlüsselrolle zu. Dieser beinhaltet einen Abbau

- 28 -


des Glycosylamins durch Fragmentierung und Oxidation, wobei zur Reihenfolge dieser

Teilschritte und zu den Intermediaten in der Literatur konträre Angaben gemacht werden

(Namiki & Hayashi, 1983, Hofmann et al., 1999). Ferner wurde Glyoxal als ein

Oxidationsprodukt von Ascorbinsäure beschrieben (Osthoff, 1966). Ein weiterer Weg zur

Glyoxal-Bildung ist die Autoxidation von ungesättigten Fettsäuren (Loidl-Stahlhofen &

Spiteller, 1994).

Glyoxal

Glucose Glycosylamin Amadori-Produkt

Lipide

Serin

PyrazineOxazoleThiazole

DihydroxyimidazolidinylnorvalinCarboxymethyllysin

Hydroxyacetat

Ascorbat

Abb. 2.3.1.1-1: Bildung, Entgiftung und Reaktionen von Glyoxal (Literatur siehe Text).

Für die Bildung in vivo dürfte der enzymkatalysierte Abbau von Serin durch das Myelo-

peroxidase-Wasserstoffperoxid-Chlorid-System in Phagocyten von Bedeutung sein. Dieser

führt zunächst zur Bildung von Glycolaldehyd und findet bei Entzündungsprozessen statt

(Anderson et al., 1997). Zur Entgiftung ist in vivo das glutathionabhängige Glyoxalase-

System vorgesehen, welches das cytotoxisch wirkende Glyoxal in die inerte

Hydroxyessigsäure überführt. Hydroxyessigsäure wird anschließend über den Urin

ausgeschieden (Thornalley, 1990, 1998).

Sowohl Glyoxal als auch Methylglyoxal weisen eine sehr hohe Carbonylaktivität auf und

reagieren leicht mit Nucleophilen. Als bedeutsam werden insbesondere die Umsetzungen mit

freien Aminosäuren bei erhöhter Temperatur (Strecker-Abbau, siehe Abschnitt 2.3.3) sowie

die Reaktionen mit nucleophilen Seitenketten von proteingebunden Aminosäuren (siehe

Abschnitt 2.3.2) angesehen.

- 29 -


2.3.1.2 Methylglyoxal

Methylglyoxal wird ähnlich dem Glyoxal auf verschieden Wegen gebildet (Abb. 2.3.1.2-1).

Im Zuge der Maillard-Reaktion erfolgt die Bildung über das Amadori-Produkt, dessen Abbau

zum 1-DG und 3-DG und deren basekatalysierten Fragmentierungen (Retroaldolreaktion)

(Weenen, 1998). Es wird jedoch auch von der direkten Bildung aus dem Amadori-Produkt

durch Retroaldolreaktion berichtet (Hayashi & Namiki, 1986). Die Genese direkt aus Glucose

erfolgt ebenfalls durch basekatalysierte Fragmentierung (Thornalley et al., 1999). Im

Gegensatz zur nichtenzymatischen Glyoxal-Bildung sind diese Reaktionswege beim

Methylglyoxal nicht oxidativ.

Methylglyoxal

Glucose

Amadori-Produkt Aceton

Threonin

PyrazineOxazoleThiazole

MethylimidazolidinylnorvalinCarboxyethyllysin

D-Lactat

Desoxyosone

Triosephosphate

1,2-Propandiol

Abb. 2.3.1.2-1: Bildung, Entgiftung und Reaktionen von Methylglyoxal (Literatur siehe Text).

In vivo hat zusätzlich die Bildung aus Metaboliten des Stoffwechsels Bedeutung. Die größte

Rolle dürfte dabei der nichtenzymatischen Fragmentierung von Triosephosphaten zukommen,

welche als Intermediate der Glycolyse und des Polyol-Weges auftreten. Weiterhin wurde die

enzymatische Bildung im Katabolismus von Threonin und des Ketonkörpers Aceton

beschrieben. Die enzymatische Entgiftung erfolgt in erster Linie durch das

glutathionabhängige Glyoxalase-System und führt zur Bildung von D-Lactat. Weiterhin wird

Methylglyoxal durch die NADPH-abhängige Aldose-Reduktase zu 1,2-Propandiol umgesetzt

(Thornalley, 1990).

- 30 -


Methylglyoxal weist eine ähnlich hohe Reaktivität gegenüber primären Amino- sowie

Guanidino- und Sulfhydrylgruppen auf wie Glyoxal und es kommt folglich ebenfalls zur

Bildung von Folgeprodukten des Strecker-Abbaus und der Reaktion mit

Aminosäureseitenketten (siehe Abschnitt 2.3.3 und 2.3.2).

2.3.2 Reaktion von α-Dicarbonylverbindungen mit Proteinen

Auf Grund ihrer hohen Reaktivität kommt Verbindungen mit α-Dicarbonylstruktur bei der

posttranslationalen Modifikation von Proteinen im fortgeschrittenen Stadium der Maillard-

Reaktion eine Schlüsselrolle zu. Die Bildung von AGEs findet dabei insbesondere an den

nucleophilen Seitenketten von Lysin, Arginin und Cystein statt. Die Reaktion kann zu

monovalenten Derivaten führen, d. h. nur eine Aminosäureseitenkette wird modifiziert. Durch

Folgereaktionen entstehen jedoch auch vernetzende Aminosäurederivate, welche

intermolekular ausgebildet die Oligomerisierung von Proteinen bewirken (Thornalley et al.,

2003, Thorpe & Baynes, 2003).

Dem Nachweis und der Bestimmung von AGEs in vivo und in Lebensmitteln geht in der

Regel die Untersuchung von Modellansätzen möglicher Precursoren voraus. Die Isolierung

und strukturelle Aufklärung dort gebildeter Reaktionsprodukte ermöglichen anschließend die

Etablierung geeigneter Analyseverfahren und die gezielte Suche in komplexen Matrizes.

Nicht zuletzt auf Grund dieses systematischen Herangehens ist die Anzahl der identifizierten

und auch quantifizierten Verbindungen sehr groß und wächst ständig. Im Folgenden soll

deshalb vorzugsweise auf ausgewählte und für die vorliegende Arbeit relevante Produkte

Bezug genommen werden.

Nε-Carboxymethyllysin (CML, siehe Abb. 2.3.2-1) ist eines der analytisch bedeutendsten

Derivate. Die Bildung erfolgt hauptsächlich durch oxidativen Abbau von Amadori-Produkten

(Ahmed et al., 1986) und auf dem sogenannten „Namiki-Weg“ (Namiki & Hayashi, 1983) aus

Glycosylaminen (Glomb & Monnier, 1995). Weiterhin wurde CML als Produkt der Reaktion

von Lysin mit Glyoxal beschrieben (Al-Abed & Bucala, 1995). Das Strukturanaloge

Nε-(1-Carboxyethyl)-lysin (CEL) wird entsprechend bei der Reaktion von Lysin mit

Methylglyoxal gebildet (Ahmed et al., 1997). Beide Verbindungen sind salzsäurestabil und

wurden sowohl in Lebensmitteln als auch in physiologischen Proben quantifiziert (Ahmed et

al., 1997, Drusch et al., 1999, Odani et al., 1999a, Helling et al., 2002). Pyrralin

- 31 -


[ε-(2-Formyl-5-hydroxymethyl-pyrrol-1-yl)-norleucin] folgt aus der Reaktion von Lysin mit

3-DG und ist nicht salzsäurestabil. Die Quantifizierung erfolgte in Lebensmitteln und

biologischen Proben nach enzymatischer oder alkalischer Hydrolyse sowie immunologisch

(Hayase et al., 1989, Sengel et al. 1989, Förster & Henle, 2003). Aus der Reaktion von

Glyoxal, Methylglyoxal oder 3-DG mit jeweils zwei Lysin-Seitenketten und vermutlich unter

der Beteiligung von Formaldehyd resultieren die salzsäurestabilen vernetzenden Bislysyl-

imidazolium-Salze GOLD („glyoxal-derived lysine dimer“), MOLD („methylglyoxal-derived

lysine dimer“) und DOLD („deoxyglucosulose-derived lysine dimer“). GOLD und MOLD

wurden in biologischen Proben quantifiziert (Brinkmann et al., 1995, Wells-Knecht et al.,

1995, Skovsted et al., 1998, Odani et al., 1999a, Siegl, 2003). Pentosidin ist ebenfalls

salzsäurestabil und verknüpft die Seitenketten von Lysin und Arginin. Die Bestimmung

erfolgte sowohl in Lebensmittel als auch in physiologischen Flüssigkeiten und Geweben,

wobei oft die intrinsische Fluoreszenz (λex,max = 335 nm, λem,max = 385 nm) zur Detektion

genutzt wurde (Sell & Monnier, 1989, Henle et al., 1997, Odani et al., 1999a).

OHO

NH

H2N

OOH

OHO

NH

H2N

OOH

NHO O

OHO

H2N

N

N

OHO

H2N

OHO

H2N

+N

N

OHO

H2N

OHO

H2N

+

HO

OHHO

N

N

OHO

H2N

OHO

H2N

+

CML CEL Pyrralin GOLD MOLDDOLD Pentosidin

N

N NH

HN

OHO

H2N

+

OHO

H2N

Abb. 2.3.2-1: Ausgewählte Glykierungsprodukte des Lysins und Arginins (Literatur siehe Text).

Im Zusammenhang mit der Reaktion von Arginin mit Glyoxal werden zahlreiche Produkte

diskutiert, insbesondere 5-(4,5-Dihydroxy-2-imino-1-imidazolidinyl)-norvalin (Dihydroxy-

imidazolidin), 5-(2-Imino-5-oxo-1-imidazolidinyl)-norvalin (Glarg), N7-carboxymethyl-

arginin (CMA) und Nδ-(4,5-Dihydro-4-oxo-imidazol-2-yl)-ornithin (αNFC-1,

- 32 -


GO-Imidazolon) (siehe Abb. 2.3.2-2, Schwarzenbolz, 1997, Paul et al., 1998, Glomb & Lang,

2001). Die Vielfalt der Produkte und ihre zum Teil sehr begrenzte Stabilität gestalten die

Quantifizierung jedoch schwierig. CMA konnte bisher nach enzymatischer Hydrolyse im

menschlichen Blutserum bestimmt werden (Odani et al., 2001).

Als Produkte der Umsetzung von Arginin mit Methylglyoxal wurden u. a. Nδ-(4,5-Dihydro-

5-methyl-4-oxo-imidazol-2-yl)-ornithin (MGO-Imidazolon) und das blaue Fluorophor

Argpyrimidin (Nδ-(4,6-Dimethyl-5-hydroxy-pyrimidin-2-yl)-ornithin, λex, max = 320 nm,

λem, max = 382 nm) identifiziert (Henle et al., 1994a, Shipanova et al., 1997). Das

Hydroimidazolon-Derivat weist nur eine geringe Stabilität auf (Glomb & Lederer, 2002), und

konnte nach enzymatischer Hydrolyse in Laugengebäck bestimmt werden (Henle et al.,

1994a). Argpyrimidin wurde in Bier und zahlreichen biologischen Proben quantifiziert

(Glomb et al., 2001, Wilker et al., 2001). Aus der Reaktion von Arginin mit 3-DG resultiert

u. a. das Hydroimidazolon-Derivat Nδ-[4,5-Dihydro-4-oxo-5-(2,3,4-trihydroxybutyl)-

imidazol-2-yl]-ornithin (3-DG-Imidazolon, Imidazolon A). Die Detektion und Quantifizier-

ung erfolgte in Proben biologischer Herkunft (Hayase et al., 1995, Niwa et al., 1997).

H2NO

HO

HN

NHN

O

Glarg

H2NO

HO

HN

NHN

OH

OH

H2NO

HO

HN

NHHN

O

OH

H2NO

HO

HN

NN

OH

H2NO

HO

HN

N NH

O

HO

HOOH

H2NO

HO

HN

N NH

O

H2NO

HO

HN

N NH

O

Dihydroxy- imidazolidin

CMA MGO-Imidazolon

GO-Imidazolon

3-DG-Imidazolon

Argpyrimidin

Abb. 2.3.2-2: Ausgewählte Glykierungsprodukte des Arginins (Literatur siehe Text).

Die freie Sulfhydrylgruppe von Cystein reagiert mit α-Oxoaldehyden rasch und reversibel zu

Hemithioacetalen (siehe Abb. 2.3.2-3, Thornalley, 1998). Bei der Reaktion mit Glyoxal

wurde S-Carboxymethylcystein (CMC) als vergleichsweise stabiles Umlagerungsprodukt

beschrieben (Thorpe & Baynes, 2003).

- 33 -


S

O

OR

NH

OH

O

S

O

HOOH

NH2 O

Hemithioacetal CMC

Abb. 2.3.2-3: Ausgewählte Glykierungsprodukte des Cysteins (Literatur siehe Text).

Vergleichende Untersuchungen von verschiedenen Geweben und physiologischen

Flüssigkeiten zeigten, dass Hydroimidazolone in vivo die quantitativ bedeutsamsten der

untersuchten AGEs sind (siehe Tab. 2.3.2-1). Die Gehalte an CML und CEL sind deutlich

geringer und die der Bislysyl-imidazolium-Salze und des Pentosidins sind vergleichsweise

klein. Aus quantitativer Sicht ist Nε-Fructoselysin das dominierende Glykierungsprodukt. Die

Arginin-Derivatisierung ist jedoch vergleichbar und weist auf die hohe Reaktivität der

α-Oxoaldehyde insbesondere gegenüber Arginin hin (Thornalley et al., 2003).

Tab. 2.3.2-1: Plasmakonzentrationen von AGEs und Nε-Fructoselysin sowie Umfang der

Aminosäure-Derivatisierung bei normal gesunden Probanden (Thornalley et al., 2003).

Analyt Konzentration1

[nM]

Derivatisierung2

[mmol/mol Lys od. Arg]

CML 1109 0,021 ± 0,005

CEL 581 0,011 ± 0,005

GO-Imidazolon 962 0,06 ± 0,03

MG-Imidazolon 15540 0,92 ± 0,12

3-DG-Imidazolon 5922 0,35 ± 0,08

MOLD 42 0,0008 ± 0,0002

Argpyrimidin < 500 < 0,03

Pentosidin 474 0,006 ± 0,002 3

Nε-Fructoselysin 40504 0,77 ± 0,14 1 Mittelwert (n = 5), 2 Mittelwert ± Standardabweichung (n = 5), 3 mmol/mol Lys

- 34 -


2.3.3 Reaktion von α-Dicarbonylverbindungen mit freien Aminosäuren

Einer der bedeutendsten Reaktionswege im Zuge der Maillard-Reaktion ist eine von Adolf

Strecker (1822-1871) erstmals beschriebene Abbaureaktion von α-Aminosäuren durch

bestimmte Carbonylverbindungen (Strecker, 1862). Dabei wird die Aminosäuren simultan

decarboxyliert und desaminiert, und es resultiert der sich von der Aminosäure strukturell

ableitende und um die Carboxylgruppe verkürzte sogenannte Strecker-Aldehyd (Schönberg &

Moubacher, 1952). Diese als Strecker-Abbau bezeichnete Reaktion wird insbesondere beim

Erhitzen von Aminosäuren in der Gegenwart von 1,2-Di- oder 1,2,3-Tricarbonylverbindungen

beobachtet. In Abb. 2.3.3-1 sind zwei diskutierte Reaktionsmechanismen des Strecker-

Abbaus dargestellt.

O

OR2

R3

O

R2

R3 O

R1N

O

H

O

R2

R3

OR1N

O HH

OR1H2N

O HH

- H2O+ H2O+

O

R2

R3

OR1N

O HH

O

R2

R3

R1N

H-

H+O

R2

R3

R1N

H-

O

R2

R3

R1N

H

H

- CO2

H+- CO2

O

R2

R3

R1N

H

H

O

R2

R3

NH2H

O

HR1+

+ H2O- H2O

Aminosäureα-Dicarbonyl Schiff Base1 2

Azomethin-Anion

α-Aminoketon Strecker-Aldehyd

Abb. 2.3.3-1: Reaktion von α-Dicarbonylverbindungen mit Aminosäuren (Strecker-Abbau).

- 35 -


Der erste und essentielle Schritt beim Strecker-Abbau ist die säurekatalysierte Bildung einer

thermisch instabilen Schiff Base (Abb. 2.3.3-1, Schönberg et al, 1948). Daran schließt sich

eine Decarboxylierung an, wobei die undissozierte Säurefunktion der Ausgangspunkt ist (Van

Chuyen et al., 1972). Die Decarboxylierung und die damit einhergehende Umlagerung am

Stickstoff kann sowohl über einen ionischen Mechanismus (Baddar, 1949, 1950) als auch

über einen konzertierten Prozess mit einem cyclischen Übergangszustand (Fujimaki et al.,

1971, Rizzi, 1969) beschrieben werden. Im ersten Fall kommt es zur Bildung eines

mesomeriestabilisierten Azomethin-Anions, welches anschließend das freigesetzte Proton

oder ein Proton aus dem Medium aufnimmt. Die Tautomerisierung des resultierenden Enols

und die darauffolgende Hydrolyse der Azomethin-Bindung führt schließlich zur Freisetzung

eines α-Aminoketons und des Strecker-Aldehydes. Beim zweiten Mechanismus erfolgt die

Übertragung des Protons der Carboxylgruppe auf die Carbonylgruppe in einem konzertierten

Prozess. Denkbar wäre auch eine Übertragung des α-Protons der Aminosäure auf die

Carbonylfunktion, welche bei der Reaktion von Peptiden mit α-Dicarbonylverbindungen

postuliert wird (siehe 4.3.4). Da jedoch α-Aminoisobuttersäure (2-Methylalanin) Strecker-

aktiv ist (Fujimaki et al., 1971, Schönberg et al, 1948), sollte dieser Weg im Fall von

Aminosäuren nicht dominieren.

In der jüngeren Literatur werden beide Reaktionswege mit ähnlicher Häufigkeit angegeben

(Ho, 1996, Mottram et al., 2002, Rizzi et al., 1999). Konzertierte nichtionische Prozesse mit

cyclischem Übergangszustand sind z. B. für die Decarboxylierung von β-Oxocarbonsäuren

belegt (Westheimer & Jones, 1941). Nur der erste Mechanismus kann jedoch einige

Phänomene plausibel erklären. So sind bestimmte Carbonylverbindungen wie z. B.

p-Nitrobenzaldehyd Strecker-aktiv (Baddar, 1949), ohne das sie die Ausbildung eines

cyclischen Übergangszustandes strukturell zulassen. Weiterhin kann nur die Existenz des

Azomethin-Anions im Verlauf des ersten Mechanismus die Bildung von Oxazolidinen als

Folgeprodukte erklären (Ho & Hartman, 1982).

Die Produkte der Strecker-Reaktion und deren Intermediate sind sehr reaktiv und gehen

zahlreiche Folgereaktionen ein. Die dabei entstehenden Pyrazine, Thiazole, Thiazolidine,

Oxazole und Oxazolidine sind wesentlich am Aroma von gekochten, gebackenen und

gerösteten Lebensmitteln beteiligt. Die freigesetzten Strecker-Aldehyde sind als solche schon

aromaaktiv (Ho, 1996).

- 36 -


Der Strecker-Abbau von Aminosäuren durch Glyoxal, Methylglyoxal, Diacetyl und

3-Desoxyglucosulose in Lebensmittel erfolgt bei erhöhten Temperaturen wie 100 °C sehr

rasch. Bei niedrigen Temperaturen wie z. B. bei nur 50 °C ist diese Reaktion jedoch nicht

bevorzugt (Van Chuyen et al., 1972). Unter diesen vergleichsweise milden Bedingungen

kommt es z. B. bei der Reaktion von Alanin mit Glyoxal zur Bildung von

Nα-Carboxymethylalanin (Van Chuyen et al., 1973).

2.3.4. Reaktion von α-Dicarbonylverbindungen am N-Terminus von Peptiden

und Proteinen

Die Aminosäureseitenketten von Lysin, Arginin und Cystein werden als

Hauptreaktionspartner für α-Dicarbonylverbindungen am Protein angesehen und

entsprechende Umsetzungen sind und werden intensiv untersucht (siehe Abschnitt 2.3.2).

Reaktionen von α-Dicarbonylverbindungen am N-Terminus von Peptiden und Proteinen hat

man demgegenüber insbesondere unter physiologischen Bedingungen kaum Beachtung

geschenkt. Die Bildung einiger N-terminaler Modifikationen wurde jedoch unter nicht-

physiologischen oder synthetischen Bedingungen beschrieben (siehe Abb. 2.3.4-1).

Takahashi (1968) konnte bei der Umsetzung des Dipeptides Ala-Gly (1,2 mM) mit

Phenylglyoxal (82,2 mM) bei pH = 8,0 eine sehr rasche Desaminierung der α-Aminogruppe

und die Bildung des α-Ketoacyl-Peptides Pyruvylglycin zeigen (Abb. 2.3.4-1). Der Umsatz

an Peptid war mit ca. 94 % bei 25 °C nach 60 min nahezu vollständig. Die Reaktion wurde

mechanistisch über die Bildung der Schiff Base als Intermediat und eine sich anschließende

Transaminierung ähnlich dem Strecker-Abbau (siehe Abschnitt 2.3.3) erklärt (Takahashi,

1968). Im Unterschied zum Strecker-Abbau wird dabei die Säurefunktion durch die

Peptidbindung stabilisiert und eine peptidgebundene α-Ketosäure resultiert.

Ala-Gly reagierte ebenfalls sehr schnell mit Glyoxal, die präparative Ausbeute an

Pyruvylglycin war jedoch sehr viel geringer. Die Reaktion mit Glyoxal wurde jedoch

insgesamt als ähnlich der mit Phenylglyoxal gewertet und angenommen, dass die Reaktion

der α-Aminogruppe von Proteinen mit Glyoxalderivaten zu einer Ketoacyl-Modifikation des

N-Terminus führt (Takahashi, 1977a).

- 37 -


O

OR4

R5

+H2N

HN

NHR3

R1

O R2

O

O

HN

NHR3

R1

O R2

ON

N OR5

R4

R2NHR3

O

R1

NH

HN

NHR3

R1

O R2

O

HO

O

N N

HN

NHR3

R1

O R2

OHN

R3HN

R1

OR2

O

+

α-Ketoacyl-Peptid

Nα−Carboxymethyl-Peptid 1,3-Bispeptidyl-imidazolium-Salz

2(1H)-Pyrazinon-Peptid

Peptidα-Dicarbonyl

Abb. 2.3.4-1: Derivatisierung von Peptiden durch α-Dicarbonylverbindungen (Literatur siehe Text).

Van Chuyen et al. (1972, 1973c) beobachteten bei der Umsetzung von Alanin mit Glyoxal bei

50 °C nicht den Strecker-Abbau sondern die Bildung von Nα-Carboxymethylalanin. Eine

entsprechende Reaktion wurde später unter physiologischen Bedingungen (37 °C) an der

ε-Aminogruppe proteingebundenen Lysins festgestellt (Wells-Knecht et al., 1995b). Folglich

erscheint eine Carboxymethylierung durch Glyoxal auch am N-Terminus von Proteinen als

möglich (siehe Abb. 2.3.4-1). Am menschlichen Hämoglobin wurde das Nα-Carboxymethyl-

Addukt am N-terminalen Valin-Rest der β-Kette bereits nachgewiesen und quantifiziert (Cai

& Hurst, 1999). Da dieser Valin-Rest jedoch in einem viel höheren Maß als Amadori-Produkt

modifiziert ist (siehe Abschnitt 2.1.6), dürfte die Bildung überwiegend durch den oxidativen

Abbau des Amadori-Produktes (Ahmed et al., 1986) erfolgen.

Eine weitere N-terminale Modifikation wurde von Velisek et al. (1989) und Davidek et al.

(1991) beschrieben. In konzentrierten wässrigen Modellansätzen aus Glycin, Glyoxal mit oder

ohne Zusatz von Formaldehyd (pH-Wert: 4 bis 12, 25° C) konnte das Imidazolium-Salz

1,3-Bis(carboxymethyl)-imidazol identifiziert werden (Velisek et al., 1989). Das

entsprechende Derivat eines Dipeptides (siehe Abb. 2.3.4-1) wurde bei Umsetzung von

- 38 -


Diglycin mit Glyoxal und Formaldehyd in verdünnter Lösung bei pH = 4 und 80 °C erhalten

(Davidek et al. 1991). Bislysyl-Imidazolium-Salze wie GOLD und MOLD wurden wenig

später dargestellt und in physiologischen Proben quantifiziert (siehe Abschnitt 2.3.2).

Prey & Petershofer (1968) synthetisierten 2(1H)-Pyrazinon-Derivate (siehe Abb. 2.3.4-1) des

Diglycins durch Umsetzung von Diglycin mit überschüssigem Benzil, Glyoxal,

Methylglyoxal oder Diacetyl bei pH = 13. Da die dargestellten Derivate eine charakteristische

Absorption bei 320 bis 340 nm zeigten und diese UV-Bande auch in Zuckerfabrikationssäften

auftrat, wurde die Bildung von Verbindungen mit 2(1H)-Pyrazinon-Struktur bei der

Zuckerraffination vermutet.

Van Chuyen et al. (1973a, 1973b) erhitzten verschiedene Peptide mit Glyoxal in

konzentrierter Lösung bei 100 °C und pH = 5,0 für 1 h und beobachteten dabei eine intensive

Bräunung der Ansätze. Als niedermolekulare Reaktionsprodukte konnten 2(1H)-Pyrazinon-

Peptide, freie Aminosäuren und Strecker-Aldehyde identifiziert werden. Auffällig war, dass

in Erhitzungsansätzen mit Tripeptiden nicht nur die 2(1H)-Pyrazinon-Derivate der

Ausgangspeptide gefunden wurden, sondern auch die um die C-terminale Aminosäure

verkürzten 2(1H)-Pyrazinon-Dipeptide. Entsprechend waren in den Ansätzen der Tetrapeptide

die um die C-terminale Aminosäure verkürzten 2(1H)-Pyrazinon-Tripeptide und die um eine

weitere Aminosäure verkürzten 2(1H)-Pyrazinon-Dipeptide detektierbar. Es musste folglich

ein vom C-Terminus beginnender Abbau der 2(1H)-Pyrazinon-Peptide stattgefunden haben.

Aus Modellstudien zur Farbbildung wurde der Schluss gezogen, dass 2(1H)-Pyrazinone eine

die Bräunung fördernde Rolle spielen und dass dafür wahrscheinlich Reaktionen zwischen

den 2(1H)-Pyrazinonen und Zwischenprodukten die zu ihrer Entstehung führen

verantwortlich sind. Die Relevanz der beobachteten Reaktionen wurde für Peptid-Carbonyl-

Systeme wie Soja-Sauce und andere prozessierte Sojaprodukte bei der Farb- und

Aromabildung (Strecker-Aldehyde) gesehen. Weiterhin wurde der Einfluss auf den

Geschmack diskutiert. So schmeckt das Peptid Gly-L-Leu sehr bitter, das aus der Reaktion

mit Glyoxal resultierende 2(1H)-Pyrazinon-Peptid dagegen astringierend, ein wenig säuerlich

und später mild (Van Chuyen et al., 1973a).

- 39 -


2.4 Kenntnisse zu Verbindungen mit 2(1H)-Pyrazinon-Struktur

2.4.1 2(1H)-Pyrazinone in Lebensmitteln und Lebensmittelmodellsystemen

Da man sich nur wenig mit der Rolle von Peptiden bei der Maillard-Reaktion in Lebensmittel

beschäftigt hat, liegen nur einige wenige Studien zur Bildung von 2(1H)-Pyrazinonen vor. Im

wesentlichen sind dies die bereits erwähnten Untersuchungen von Van Chuyen et al. (1973a,

b), welche neben anderen Produkten 2(1H)-Pyrazinon-Peptide bei der Umsetzung von

Peptiden mit Glyoxal (pH = 5,0, 100 °C, 1 °h) erhielten (siehe Abschnitt 2.3.4). Bei späteren

Studien zur Bildung aromaaktiver Verbindungen wurden freie Aminosäuren oder Peptide mit

Glucose im Autoklaven bei pH = 5,2 und 180 °C für 2 h umgesetzt. Bei den peptid-haltigen

Ansätzen konnten N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinone quantifiziert werden. Die Bildung kann über

den Abbau der Glucose zu α-Dicarbonylverbindungen, deren Reaktion mit dem Peptid zum

2(1H)-Pyrazinon-Peptid und eine sich anschließende Decarboxylierung erklärt werden (siehe

Abb. 2.4.1-1). Den N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinone wurde ein einzigartiges röstiges Aroma

zugeschrieben. Aus freien Aminosäuren wurden keine 2(1H)-Pyrazinone gebildet, sie

fungierten als Precursoren für Pyrazine. Bei Di- und Tetrapeptiden dominierte die Bildung

von N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinonen. Da diese Peptide nicht zu den freien Aminosäuren

abgebaut werden, fand kaum eine Bildung von Pyrazinen statt. Dipeptide sind hydrolytisch

stabil und Tetrapeptide werden bevorzugt in der Mitte gespalten. In Tripeptiden ist die zweite

Peptidbindung hydrolyselabil und sie lieferten folglich sowohl 2(1H)-Pyrazinone als auch

Pyrazine (Ho et al., 1992, Izzo & Ho, 1992, Izzo et al., 1993, Oh, et al., 1992).

O

OR4

R5

+

α-Dicarbonyl

N

N OR5

R4

R2NHR3

O

R1

Pyrazinon-Peptid

- H2O+ H2O

Peptid

H2N

HN O

R2NHR3

O

R1 N

N OR5

R4

R2OH

O

R1 N

N OR5

R4

R2

R1+ H2O- H2NR3 - CO2

Pyrazinon-Dipeptid N1-Alkyl-pyrazinon

Abb. 2.4.1-1: Bildung von N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinonen (Van Chuyen et al, 1973b, Ho et al., 1992, Izzo & Ho, 1992, Izzo et al., 1993, Oh, et al., 1992, modifiziert).

Ein zweiter Bildungsweg für N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinone konnte anhand von

Pyrolyseexperimenten (250 °C, 20 s) mit isotopenmarkiertem Glycin und Glucose

- 40 -


nachgewiesen werden. Für die Entstehung von N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinonen wurde eine

mehrstufige Reaktion von einem Molekül Glyoxal oder Methylglyoxal mit insgesamt drei

Molekülen Glycin vorgeschlagen. Die Bildung über die Kondensation von zwei Molekülen

Glycin zum Diglycin und anschließende Reaktion entsprechend dem zuerst genannten Weg

konnte ebenfalls unter diesen Bedingungen postuliert werden (Keyhani & Yaylayan, 1996).

Eine für die freie Aminosäure Asparagin spezifische Bildung von 5,6-Dialkyl-5-methyl-

2(1H)-Pyrazinonen wurde bei Umsetzung von Asparagin mit verschiedenen Monosacchariden

in wässriger Lösung (200 °C, 1 h) beobachtet. Dabei findet zunächst eine Isomerisierung von

Asparagin über 3-Aminosuccinimid zu Isoasparagin statt (siehe Abb. 2.4.1-2). Letzteres

reagiert mit einer aus dem Kohlenhydratabbau stammenden α-Dicarbonylverbindung zu

einem 3-Carboxymethyl-2(1H)-pyrazinon, welches anschließend zum Endprodukt

decarboxyliert (Lawrence & Shu, 1995). Von der Decarboxylierung eines 3-Carboxymethyl-

2(1H)-pyrazinons zum 3-Methyl-Derivat wird ebenfalls in der synthetisch orientierten

Literatur berichtet (Taguchi et al., 1996).

O

OR1

R2

H2NHO O

NH2O

OHOH2N

H2N O

NH

O O

NH2

N

NH

OR2

R1

OH

ON

NH

OR2

R1

+Asn 3-Aminosuccinimid

3-Methyl-pyrazinon 3-Carboxymethyl-pyrazinon

Iso-Asn

- CO2

- 2 H2O

Abb. 2.4.1-2: Bildung von asparagin-spezifischen 3-Methyl-2(1H)-pyrazinonen (Lawrence & Shu, 1995).

Insgesamt kann resümiert werden, dass 2(1H)-Pyrazinone aus Modellexperimenten bei stark

erhöhter Temperatur bekannt sind. Der Nachweis in Lebensmitteln wurde jedoch bisher nicht

geführt.

- 41 -


2.4.2 2(1H)-Pyrazinone in vivo und als Pharmaka

Die Bildung von 2(1H)-Pyrazinonen im Zuge von in vivo stattfindenden Glykierungs-

prozessen oder in entsprechenden physiologischen Modellsystemen ist bisher nicht

beschrieben wurden. Es wird jedoch über die Entstehung eines 2(1H)-Pyrazinon-Derivates als

Abbauprodukt von bestimmten β-Lactam-Antibiotika berichtet. So konnte gezeigt werden,

dass Abbau und Aminolyse des Cephalosporins Cefaclor in Gegenwart von n-Propylamin zu

3-Phenyl-6-propylcarbamoyl-2(1H)-pyrazinon führt (siehe Abb. 2.4.2-1). Ein ähnliches

Konjugationsprodukt mit Polylysin wurde durch IgE-Antikörpern von bestimmten Patienten

mit Cefaclor-Allergie erkannt. Folglich können gewisse 2(1H)-Pyrazinon-Derivate als Hapten

bei der Entwicklung einer Aminocephalosporin-Allergie diskutiert werden (Venemalm, 2001).

S

N NH

HOOC

Cl

O

O

H2N N

NH

O

HN

O

H2N1.

2. pH = 7,4

3-Phenyl-6-propylcarbamoyl-2(1H)-pyrazinonCefaclor

Abb. 2.4.2-1: Bildung von 3-Phenyl-6-propylcarbamoyl-2(1H)-pyrazinon (Venemalm, 2001).

Neben diesem 2(1H)-Pyrazinon-Konjugat mit wahrscheinlich nachteiliger Wirkung gibt es

jedoch zahlreiche Verbindungen mit 2(1H)-Pyrazinon-Struktur, welche für gewünschte

pharmakologische Zwecke entwickelt wurden. Es handelt sich dabei insbesondere um

Peptidmimetica mit opioider (Okada, 1999) oder antithrombotischer Wirkung (Sanderson,

1999). Ein potenter und oral verfügbarer Thrombin-Inhibitor mit hoher Selektivität sowie sehr

guter Pharmakokinetik ist das in Abb. 2.4.2-2 dargestellte 2(1H)-Pyrazinon-Derivat

L-375,378 (Sanderson, 1999).

Bemerkenswert an der Struktur von L-375,378 ist die N1-Acetamid-Gruppierung am

2(1H)-Pyrazinon-Ring. Diese ist ebenfalls in 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden vorhanden welche

sich von X-Glycyl-Peptiden ableiten (N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-acetyl]-Peptide, siehe

Abb. 2.4.2-2).

Studien zur Biotransformation von L-375,378 und anderen Thrombin-Inhibitoren dieses Typs

weisen auf eine umfangreiche Metabolisierung des 2(1H)-Pyrazinon-Rings in vivo hin. Es

wurde sowohl die Hydroxylierung direkt am Ring als auch an der Methylgruppe beobachtet.

- 42 -


Weiterhin konnte die Konjugation der hydroxylierten Produkte mit Glutathion festgestellt

werden. Als Folge der metabolischen Aktivierung kam es jedoch auch zur Öffnung des

2(1H)-Pyrazinon-Rings und zur Umlagerung in ein Imidazol-Derivat oder zur Bildung eines

nicht-cyclischen Metaboliten. Eine kovalente Bindung an Plasmaproteine wurde ebenfalls

festgestellt (Riffel et al., 2000, Singh et al., 2003).

N

N O

NH

NH

O

N

H2N

L-375,378

N

N OR3

R1

NHR4

O

R2

N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-acetyl]-Peptid

Abb. 2.4.2-2: Struktur von L-375,378 (Sanderson, 1999) und Struktur von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-acetyl]-Peptiden.

2.4.3 Naturstoffe mit 2(1H)-Pyrazinon-Struktur

Auf Grund ihrer biologischen Wirkung ist man bereits früh auf eine Reihe von

2(1H)-Pyrazinon-Derivaten insbesondere aus Aspergillus-Arten aufmerksam geworden. So

isolierte Dutscher (1947) den antibakteriell wirkenden Sekundärmetaboliten Aspergillussäure

(siehe Abb. 2.4.3-1) aus Aspergillus flavus und identifizierte ihn als 2(1H)-Pyrazinon-Derivat.

Da die ebenfalls gebildete Desoxyaspergillussäure keine antibakterielle Wirkung zeigt, wird

die Hydroxylierung am N1-Stickstoffatom als essentiell für diesen Effekt angesehen

(Dutscher, 1947).

Später wurden weitere 3,6-substituierte Derivate gefunden. Die Biogenese dieser

Verbindungen erfolgt aus zwei Aminosäure-Molekülen. Dabei werden die Kohlenstoffatome

1 und 2 der beteiligten Aminosäuren in den 2(1H)-Pyrazinon-Ring integriert und die

Aminosäure-Seitenketten bestimmen die Substituenten (MacDonald & Bishop, 1977). Das

vermutete Auftreten von Diketopiperazinen als Intermediate konnte nicht bestätigt werden

(Sammes, 1975).

- 43 -


N

NH

O

N

N O

OH

Aspergillussäure Desoxyaspergillussäure

Abb. 2.4.3-2: Struktur von Aspergillussäure und Desoxyaspergillussäure (Sammes, 1975).

In letzter Zeit führte die intensive Suche nach biologisch aktiven Stoffen im Bereich der

marinen Alkaloide zur Aufklärung von 3,6-Bis(indolyl)-2(1H)-pyrazinon- und 3-Benzyl-

5-phenyl-2(1H)-pyrazinon-Derivaten, welche sich vom Tryptophan bzw. Tyrosin ableiten

(Wright et al., 1992, Hirano et al., 2000). Ein besonders bemerkenswerter Vertreter ist

Dragmacidin D (siehe Abb. 2.4.3-2). Dragmacidin D wurde aus dem Tiefseeschwamm

Spongosoritis sp. isoliert und zeigt ein breites Spektrum an biologisch und pharmakologisch

interessanten Wirkungen (Wright, et al., 1992). So wird unter anderem von einer selektiven

Hemmung der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase berichtet, welche ein therapeutischer

Ansatzpunkt für die Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen wie z. B. der Alzheimer

Krankheit ist (Longley et al., 2000).

N

NH

O

HN

NH

HO

Br

NHN

NH2

Dragmacidin D

Abb. 2.4.3-2: Struktur von Dragmacidin D (Wright et al., 1992).

- 44 -

3 Experimenteller Teil

3.1 Chemikalien, Materialien und Geräte

3.1.1 Chemikalien

Verwendete Chemikalien unter Angabe von Bestellnummer, Reinheit und Verantwortlichen,

soweit im Text nicht anders vermerkt:

Acetonitril, chromasolv gradient grade, 34851, Riedel-de Haen, Seelze

Ameisensäure, 98-100 %, 33015, Riedel-de Haen, Seelze

Aminoguanidin, Bicarbonatsalz, A-7259, Sigma, Taufkirchen

Ammoniak 25 % p.a., 30501, Riedel-de Haen, Seelze

di-Ammoniumhydrogenphosphat, p.A., 30402, Riedel-de Haen, Seelze

Anionenaustauscher, Dowex 1X8, p.a., Chlorid-Form, 200 – 400 mesh, 44339, Fluka,

Taufkirchen

Borsäure, p.a., 31146, Riedel-de Haen, Seelze

Bromwasserstoffsäure, 48 %, p.a., 18730, Fluka, Taufkirchen

Citronensäure Monohydrat, p.a., 27490, Fluka, Taufkirchen

3-Desoxyglucosulose (3-DG), hergestellt nach Henle und Bachmann (1996), Diplomarbeit

J. Kahle, TU Dresden, Institut für Lebensmittelchemie

Dimethylformamid, puriss., > 99,5 % , 40228, Fluka, Taufkirchen

Chloroform, p.A., 25690, Fluka, Taufkirchen

Chloroform-d1, 99,9 Atom % D, 41,675-4, Aldrich, Taufkirchen

Deuteriumchlorid, 20 Gew.% in Deuteriumoxid, 99,5 Atom % D, 17,672-9, Aldrich,

Taufkirchen

Deuteriumoxid (D2O), 100,00 Atom % D, 19,170-1, Aldrich, Taufkirchen

Diacetyl, puriss., > 99,5 %, 31530, Fluka, Taufkirchen

Dimethylsulfoxid-d6, 99,5+ Atom % D, 17,594-3, Aldrich, Taufkirchen

Dithiothreitol, > 99,5 %, 43815, Fluka, Taufkirchen

Essigsäure, p.A., 33209, Riedel-de Haen, Seelze

Ethanol, purum, denaturiert, > 96 %, 02893, Fluka, Taufkirchen

Ethanol, absolut, denaturiert, > 99,8 %, 028404, Fluka, Taufkirchen

N-Ethylmorpholin, für Proteinsequenzierung, 04499, Fluka, Taufkirchen

- 45 -


Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz Dihydrat, p.A., 03680, Fluka, Taufkirchen

Furosin, 98,5 % (HPLC), Neosystem, Strasbourg, Frankreich

D(+)-Glucose, wasserfrei, 49139, Fluka, Taufkirchen

Glyoxal, 40 % in Wasser, G-3140, Sigma, Taufkirchen

Glyoxylsäure Monohydrat, purum, > 97,0 %, 50710, Fluka, Taufkirchen

Iodacetamid, > 99 %, 57670, Fluka, Taufkirchen

Kaliumchlorid, p.a., 60130, Fluka, Taufkirchen

Kaliumdihydrogenphosphat, p.a., 60356, Fluka, Taufkirchen

Kationenaustauscher AG 50W-X8, H+-Form, 20 - 50 mesh , Bio-Rad Laboratories, München

Kationenaustauscher DOWEX 50X8-400, H+-Form, 200 - 400 mesh, 20308, Acros, Geel,

Belgien

Lactose Monohydrat, 107660, Merck, Darmstadt

Maltose Monohydrat, 105912, Merck, Darmstadt

Mercaptoethanol, > 99,0 %, 63689, Fluka, Taufkirchen

Methanol, chromasolv gradient grade, 65548, Riedel-de Haen, Seelze

Methanol-d4, 99,8+ Atom % D, 15,194-7, Aldrich, Taufkirchen

Methanol, p.a., 65543, Fluka, Taufkirchen

Methylglyoxal, 40 % in Wasser, M-0252, Sigma, Taufkirchen

3-Morpholinopropansulfonsäure (MOPS), > 99,5 %, 69948, Fluka, Taufkirchen

Natriumazid, p.a., > 99,5 %, 71289, Fluka, Taufkirchen

Natriumborhydrid, p.a., 71320, Fluka, Taufkirchen

Natriumchlorid, p.A., 106404, Merck, Darmstadt

di-Natriumhydrogenphosphat Dihydrat, z.A., 106580, Merck, Darmstadt

Natriumhydroxid, z.A., 106498, Merck, Darmstadt

Natrium-L-lactat, puriss., 71718, Fluka, Taufkirchen

Natriumsulfat, p.a., wasserfrei, 71962, Fluka, Taufkirchen

Ninhydrin, p.a., 33437, Riedel-de Haen, Seelze

Palladium auf Aktivkohle, 10 % Pd, puriss., 75990, Fluka, Taufkirchen

Phenol, p.a., 77610, Fluka, Taufkirchen

Pyridin, purum, > 99,0 %, 82703, Fluka, Taufkirchen

Salzsäure, 37%, ACS, 6011, J.T.Baker, Deventer, Holland (für Salzsäurehydrolysen)

Salzsäure, 37%, p.A., 84426, Fluka, Taufkirchen

Salzsäure, 37%, trace select, 84415, Fluka, Taufkirchen

- 46 -


Thioessigsäure, purum, > 95,0 %, 88620, Fluka, Taufkirchen

2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid (TTC), Feinchemie K.-H. Kallies KG, Sebnitz

Thymol, purum, > 99,0 %, 89330, Fluka, Taufkirchen

Tris-(carboxyethyl)phosphin-Hydrochlorid (TCEP HCl), 99 %, C-4706, Sigma, Taufkirchen

Tris-(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS), > 99,8 %, 93349, Fluka, Taufkirchen

2-N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-ε-amino-2-hydroxypropansulfonsäure (TAPSO), > 99,0 %, 93357, Fluka, Taufkirchen

3.1.2 Aminosäuren, Peptide und Proteine

Es wurden ausschließlich L-Aminosäuren sowie Aminosäure-Derivate und Peptide von

L-konfiguierten Aminosäuren verwendet. Verwendete Aminosäuren, Peptide und Proteine

unter Angabe von Bestellnummer, Reinheit und Verantwortlichen, soweit im Text nicht

anders vermerkt:

Nα-Ac-Cys, 01039, Fluka, Taufkirchen

Nα-Ac-Lys, E-1120, Bachem, Weil am Rhein

Nα-Ac-Ser-Gly, G-1100, Bachem, Weil am Rhein

Nα-Ac-Trp, E-1220, Bachem, Weil am Rhein

Ala-Phe-Gly, H-1575, Bachem, Weil am Rhein

Arg-Phe-Ala × 2,0 CH3COOH × 0,5 H2O, Peptid-Gehalt: 75 %, H-1865, Bachem, Weil am

Rhein

Aminosäure-Standardlösung (Kalibration Aminosäureanalyse), AA-S-18, Sigma, Taufkirchen

Nα-Boc-Lys, A-1920, Bachem, Weil am Rhein

Nα-Bz-His, B-2254, Sigma, Taufkirchen

Nα-Bz-Met, E-1490, Bachem, Weil am Rhein

Carboxypeptidase B (EC 3.4.17.2), DFP treated from hog pankreas, 5 mg/ml, 133 U/mg

protein, 21942, Fluka, Taufkirchen

Endoproteinase Glu-C (EC 3.4.21.19), aus Staphylococcus aureus V8, 500-1000 U/mg,

45172, Fluka, Taufkirchen

Glu-Tyr, G-2000, Bachem, Weil am Rhein

Gly, E-3000, Bachem, Weil am Rhein

Glycinamid × 1,0 HCl, E-1950, Bachem, Weil am Rhein

- 47 -


Gly-Gly, G-2090, Bachem, Weil am Rhein

Gly-Ile, G-2135, Bachem, Weil am Rhein

Gly-Phe, G-2175, Bachem, Weil am Rhein

Gly-Gly-Gly, H-3350, Bachem, Weil am Rhein

Gly-Ala-Phe × 1,9 H2O, Bachem, Weil am Rhein

Gly-Ala-Tyr × 2,0 H2O, Peptid-Gehalt: 89 %, Bachem, Weil am Rhein

Gly-Phe-Ala × 1,0 H2O, H-3590, Bachem, Weil am Rhein

Hippursäure (BzG), 53280, Fluka, Taufkirchen

Nα-Hippuryl-arginin (BzGR), G-2265, Bachem, Weil am Rhein

Nα-Hippuryl-glycin (BzGG), G-2270, Bachem, Weil am Rhein

Nα-Hippuryl-lysin (BzGK), G-2275, Bachem, Weil am Rhein

Insulin aus Rinderpankreas, I-5500, Sigma, Taufkirchen

Leu-Asp, Gehalt: 95 %, G-3835, Bachem, Weil am Rhein

Lys × 1,0 HCl, E-2085, Bachem, Weil am Rhein

Nle, F-1915, Bachem, Weil am Rhein

Phe, E-2230, Bachem, Weil am Rhein

Phenylalaninamid, E-2235, Bachem, Weil am Rhein

Phe-Gly, G-2880, Bachem, Weil am Rhein

Phe-Val, G-2965, Bachem, Weil am Rhein

Phe-Gly-Gly, H-4525, Bachem, Weil am Rhein

3.1.3 Materialien und Hilfsmittel

Liste der verwendeten Materialien und Hilfsmittel, sofern an entsprechender Stelle nicht

detailliert beschrieben:

Einmal-Injektionskanülen Sterican®, (0,90 × 40) mm und (0,8 × 50) mm, Braun, Melsungen

Einmalspritzen, 1 ml, HSW Henke-Sass, Wolf GmbH, Tuttlingen

Einmalspritzen, 2 und 5 ml, Braun, Melsungen

Eppendorf-Gefäß, 1,5 und 2,0 ml, Eppendorf Nethler Hinz GmbH, Hamburg

Faltenfilter Selecta, Nr. 595½, 185 mm, Schleicher & Schuell, Dassel

Kartuschen Sep-Pak® C18, 360 mg, Nr. WAT 051910, Waters, Milford, USA

Kartusche Spe-edTM, SPE-ED C18-18 %, 1 g/6 ml, ASS-Chem, Bad Homburg

- 48 -


Membranfilter, Ø 45 mm, RC 0,45 µm, regenerierte Cellulose, Carl Roth GmbH + Co.,

Karlsruhe

Spritzenfilter Spartan, Ø 13 mm, RC 0,2 µm und 0,45 µm, regenerierte Cellulose, Schleicher

& Schuell, Dassel

3.1.4 Geräte

Liste der verwendeten Geräte, sofern an entsprechender Stelle nicht detailliert beschrieben:

Analysenwaage basia BP 121 S und BP 3100S, Sartorius, Göttingen

Brutschrank ICP 400, Memmert GmbH, Schwabach

Druckreaktor 4565M, 100 ml, Parr Instrument Company, Moline, Illinois, USA

Gefriertrocknungsanlage Alpha 1-2, Christ, Osterode

Gefriertrocknungsanlage Beta 1-8 K, Christ, Osterode

Heizplatte mit Magnetrührwerk IKAMAG® RH, Janke & Kunkel GmbH, Staufen

Hydrolyseröhrchen, 6 ml, 20 ml, Schott Glas, Mainz

Kolbenhubpipetten, 2 – 20 µl, 10 – 100 µl, 10 – 200 µl, 200 – 1000 µl, 1000 – 5000 µl,

Eppendorf Nethler Hinz GmbH, Hamburg

Minishaker MS 1, IKA Labortechnik, Staufen

NMR-Röhrchen Schott Professional, id. 4,20 mm, Art. Nr. 231700211, Schott Glas, Mainz

pH-Elektrode Mettler Toledo Inlab 422, Carl Roth GmbH + Co., Karlsruhe

pH-Meßgerät, WTW pH 526, WTW GmbH, Weilheim

Reinstwasseranlage Purelab plus purification system, USFilter, Ransbach-Baumbach

Reacti-BlockTM F, Pierce, Rockford, Illinois, USA

Reacti-ThermTM Heating/Stirring Module, Pierce, Rockford, Illinois, USA

Thermostat M12, Lauda, Lauda-Königshofen

Trockenschrank Modell 200, Memmert GmbH, Schwabach

Ultraschallbad Sonorex RK100, Bandelin electronic, Berlin

Vakuumrotationsverdampfer Laborata 4002, Heidolph, Schwabach

Zentrifugalverdampfer Speed Vac® SPD 111V mit Universal Vacuum System Plus UVS-

400A, Savant, Farmingdale, USA

Zentrifuge Centrifuge 5804 R, Eppendorf Nethler Hinz GmbH, Hamburg

Vakuumhydrolysegefäß, 8 ml, (10 × 150) mm, Pierce, Rockford, Illinois, USA

Vakuumpumpenstand PC 8, Vakuubrand GmbH + Co. KG, Wertheim

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3.2 Analytische und präparative Methoden, Instrumente und Zubehör

3.2.1 Hochdruckflüssigchromatographie

HPLC-Anlagen

Merck Hitachi (Niederdruckgradienten-System)

bestehend aus: LC Kontrolleinheit L-5000, Gradientenpumpe L-6000, UV-VIS-Detektor

L-4200, Fluoreszenz-Detektor LaChrom L-7485 (Merck Hitachi, Darmstadt),

Autosampler, Säulenofen: Jetstream 2 Plus, 2 × UV-Detektor K2501 (Knauer, Berlin)

Knauer, analytisch (Niederdruckgradienten-System)

bestehend aus: Entgaser, Eluentendosier-System K1500, K1001 Pumpe mit 10 ml-

Pumpenkopf, dynamische Mischkammer, UV-Detektor K2501, Säulenofen: Jetstream 2 Plus,

Autosampler (Wissenschaftlicher Gerätebau, Dr. Ing. Herbert Knauer GmbH, Berlin)

Knauer, semipräparativ (Hochdruckgradienten-System)

bestehend aus: Entgaser, Eluentendosier-System K1500, 2 × K1001 Pumpe mit 50 ml-

Pumpenkopf, dynamische Mischkammer, UV-Detektor K2501, Säulenofen: Jetstream 2 Plus,

Autosampler (Knauer, Berlin)

Säulen

Säule SA1, Knauer (Berlin), Eurospher 100-C18

Knauer Vertex Column, 4,6 mm × 250 mm, Eurospher 100-C18, Partikelgröße 5 µm,

Porengröße 100 Å, mit integrierter Vorsäule, 4 mm × 5 mm, gleichen Trennmaterials

Säule SA2, Knauer (Berlin), Eurospher 100-C18

Knauer Vertex Column, 3,0 mm × 250 mm, Eurospher 100-C18, Partikelgröße 5 µm,

Porengröße 100 Å, mit integrierter Vorsäule, 3 mm × 5 mm, gleichen Trennmaterials

- 50 -


Säule SA3, Polymer Laboratories GmbH, Darmstadt, PLRP-S

4,6 mm × 150 mm, PLRP-S, Partikelgröße 8 µm, Porengröße 300 Å, mit Vorsäule,

3 mm × 5 mm, gleichen Trennmaterials

Säule SA4, Polymer Laboratories GmbH, Darmstadt, PLRP-S

2,1 mm × 150 mm, PLRP-S, Partikelgröße 5 µm, Porengröße 300 Å, mit Vorsäule,

3 mm × 5 mm, gleichen Trennmaterials

Säule SP1, Knauer (Berlin), Eurospher 100-C18

Knauer Vertex Column, 8 mm × 250 mm, Eurospher 100-C18, Partikelgröße 10 µm,

Porengröße 100 Å, mit Vorsäule, 10 mm × 30 mm, gleichen Trennmaterials

Säule SP2, Knauer (Berlin), Eurospher 100-C18

Knauer Vertex Column, 16 mm × 250 mm, Eurospher 100-C18, Partikelgröße 15 bis 25 µm,

Porengröße 100 Å, mit Vorsäule, 16 mm × 30 mm, gleichen Trennmaterials

Eluenten-Systeme

Eluenten-System E1 (Phosphatpuffer-Methanol-System)

A: 10 mM Natriumphosphat-Puffer, pH = 7,0

1,78 g Dinatriummonohydrogenphosphat-Dihydrat in ca. 950 ml Reinstwasser lösen,

mit 12 M Salzsäure pH = 7,0 einstellen, in Maßkolben auf 1000 ml auffüllen,

membranfiltrieren.

B: Methanol, chromasolv

Eluenten-System E2 (Essigsäure-Methanol-System)

A: 50 mM Essigsäure

2,85 ml Essigsäure im Maßkolben mit Reinstwasser auf 1000 ml auffüllen,

membranfiltrieren.

B: 50 mM Essigsäure in Methanol, chromasolv

2,85 ml Essigsäure im Maßkolben mit Methanol auf 1000 ml auffüllen,

membranfiltrieren.

- 51 -


Eluenten-System E3 (Triethylamin-Essigsäure-Ameisensäure-Methanol-System)

A: 0,1 % Triethylamin, 0,05 % Essigsäure, 0,05 % Ameisensäure in Reinstwasser

1,0 ml Triethylamin, 0,5 ml Essigsäure (100 %), 0,5 ml Ameisensäure (100 %) im

Maßkolben mit Reinstwasser auf 1000 ml auffüllen, membranfiltrieren (pH = 3,73).

B: 0,1 % Triethylamin, 0,05 % Essigsäure, 0,05 % Ameisensäure in Methanol, chromasolv

1,0 ml Triethylamin, 0,5 ml Essigsäure (100 %), 0,5 ml Ameisensäure (100 %) im

Maßkolben mit Methanol (chromasolv) auf 1000 ml auffüllen, membranfiltrieren.

Eluenten-System E4 (Essigsäure-Methanol-System)

A: 0,1 % Essigsäure in Reinstwasser

1,0 ml Essigsäure (100 %) im Maßkolben mit Reinstwasser auf 1000 ml auffüllen,

membranfiltrieren.

B: 0,1 % Essigsäure in Methanol, chromasolv

1,0 ml Essigsäure (100 %) im Maßkolben mit Methanol (chromasolv) auf 1000 ml

auffüllen, membranfiltrieren.

Eluenten-System E5 (Ameisensäure-Methanol-System)

A: 0,1 % Ameisensäure in Reinstwasser (pH = 2,8 gemessen)

1,0 ml Ameisensäure (100 %) im Maßkolben mit Reinstwasser auf 1000 ml auffüllen,

membranfiltrieren.

B: 0,1 % Ameisensäure in Methanol, chromasolv

1,0 ml Ameisensäure (100 %) im Maßkolben mit Methanol (chromasolv) auf 1000 ml


Eluenten-System E6 (Ameisensäure-Acetonitril-System)

A: 0,1 % Ameisensäure in Reinstwasser (pH = 2,8 gemessen)

1,0 ml Ameisensäure (100 %) im Maßkolben mit Reinstwasser auf 1000 ml auffüllen,

membranfiltrieren.

B: 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril, chromasolv

1,0 ml Ameisensäure (100 %) im Maßkolben mit Methanol (chromasolv) auf 1000 ml


- 52 -


3.2.2 Kopplung Hochdruckflüssigchromatographie Massenspektroskopie und

direkte Massenspektroskopie

HPLC-Anlage

Agilent 1100 series (Hochdruck Gradienten System)

bestehend aus: Entgaser, binäre Pumpe, Autosampler, Säulenthermostat, Diodenarraydetektor

(DAD), Fluoreszenzdetektor (Agilent Technologies, Palo Alto, USA)

Massenspektrometer

für ESI-TOF-MS (electrospray ionization – time of flight – mass spectrometry)

PerSeptive Biosystems Mariner Flugzeitmassenspektrometer mit ESI-Interface (Applied

Biosystems, Stafford, USA)

Kalibration: Bradykinin, Angiotensin I, Neurotensin

Direkte Analyse mittels ESI-MS:

Mariner Flugzeitmassenspektrometer (siehe oben),

oder: LC-MS-System: Esquire-LC (Hewlett Packard-Bruker, Bremen, Waldbronn, Germany)

Berechnung der relativen monoisotopischen Molekülmasse (Mr):

Es werden die Peaks mit dem geringsten m/z-Verhältnis (monoisotopischer Peak) von

prominenten mehrfach geladenen Ionen ausgewählt und Mr wird entsprechend den angegeben

Gleichungen berechnet.

Positiver Modus, [M+Hz]z+-Ionen: Mr = Mz × z – 1,0078 × z

Positiver Modus, [M+HnNam](m+n)+ -Ionen: Mr = Mz × (m + n) – 22,99 × m – 1,0078 × n

negativer Modus, [M-Hz]z--Ionen: Mr = Mz × z + 1,0078 × z

Mz Masse/Ladung (m/z)-Verhältnis

z Anzahl der Ladungen

m Anzahl der Natrium-Ionen

n Anzahl der Protonen

22,99 Masse von Natrium

1,0078 Masse eines Protons

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3.2.3 Aminosäureanalyse

Gerät: Alpha Plus Aminosäureanalysator (LKB Biochrom, Cambridge, GB)

Säule: PEEK, (4,6 × 125) mm

Kationenaustauscher: Harz 5 µm, Serie 686, Analysentechnik K. Grüning, Olching

Fluss: 0,27 ml/min

Temperaturgradient: 55 bis 85 °C

Detektion: Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrin

Detektor: VIS-Photometer, λ = 570 nm, 440 nm (Prolin)

Puffer: siehe Tabelle 3.2.3-1

Methode: siehe Tabelle 3.2.3-2

Tab. 3.2.3-1: Puffer-Lösungen für die Aminosäureanalyse.

Puffer-Nr. Puffer Molarität [mol/l] pH-Wert

1 Natriumcitrat 0,2 2,20




6 Natronlauge 0,4

Tab. 3.2.3-2: Trennprogramm der Aminosäureanalyse.

Puffer-Nr. Zeit [min] Temperatur [°C]

2 4 : 00 50

3 0 : 05 50

2 0 : 25 50

3 0 : 05 50

2 0 : 25 50

3 0 : 05 50

2 0 : 25 50

3 0 : 05 50

2 0 : 25 50

3 0 : 10 50

- 54 -


Puffer-Nr. Zeit [min] Temperatur [°C]

2 0 : 20 50

3 0 : 10 50

2 0 : 20 50

3 19 : 00 50

5 5 : 00 60

5 26 : 00 85

6 8 : 00 85

2 8 : 00 85

2 (20%) 8 : 00 85

2 11 : 00 50

3.2.4 Präparative Ionenaustauschchromatographie

BioLogic LP Niederdruckchromatographie-System Bio-Rad Laboratories, München

Econo-Column Flow-Adaptor, 15 mmm, 25 mm Bio-Rad Laboratories, München

Fraktionssammler Fraction Collector Model 2128 Bio-Rad Laboratories, München

Fraktionssammler RediFrac Pharmacia Biotech, Freiburg

Glassäule

Econo-Column (25 × 200) mm, (15 × 500) mm Bio-Rad Laboratories, München

Glassäule (25 × 120) mm, (25 × 200) mm Sigma, Steinheim

Schlauchpumpe P-1 Pharmacia Biotech, Freiburg

3.2.5 Tüpfeltest

DC-Platten: DC-Fertigplatten 10 × 20 cm, Schicht: 0,25 mm Kieselgel, Firma Machery-

Nagel, Düren

Auftragsmenge: 2 µl/Fraktion

Sprühreagenz: Ninhydrin-Lösung 0,1 %ig in Ethanol, 10 mg Ninhydrin in 10 ml

96 %igem Ethanol lösen

Sprühreagenz: 2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid (TTC)-Lösung 1 %ig, 100 mg TTC

in 10 ml 1 M Natronlauge lösen

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Detektion: Trockenschrank bei ϑ = 90 °C (Ninhydrin)

Trockenschrank bei ϑ = 50 °C (TTC)

3.2.6 Dünnschichtchromatographie (DC)

DC-Platten:

Normalphase (NP): DC-Fertigplatten SIL G-25 UV254 , 10 × 20 cm, Schicht: 0,25 mm

Kieselgel mit Fluoreszenzindikator, Firma Machery-Nagel, Düren

Umkehrphase (RP): DC-Fertigplatten RP-18W UV254, 10 × 10 cm, Schicht: 0,25 mm

Kieselgel mit Fluoreszenzindikator, Firma Machery-Nagel, Düren

Kammer: DC-Automat: DC-MAT, Desaga, Wiesloch, alternativ: Glastrog-Kammer

Fließmittel: Acetonitril/Wasser/Essigsäure 80/20/20 (v/v/v)

Kammertyp: gesättigte Normalkammer

Konditionierung: 20 min (Kammersättigung)

Sprühreagenz: siehe Abschnitt 3.2.6

Detektion: siehe Abschnitt 3.2.6

Rf-Werte: BzGK (NP: 0,35, RP: 0,23), BzGCML (NP: 0,60), BzGFruK (NP: 0,29, RP: 0,19),

BzGLctK (NP: 0,20, RP: 0,11), BzGMltK (NP: 0,20, RP: 0,11), BzGTagK (NP: 0,32, RP:

0,21), FruK (NP: 0,17, RP: 0,07), Furosin (NP: 0,27, RP: 0,14), Lys (NP: 0,21, RP: 0,07),

Pyridosin (NP: 0,24, RP: 0,14)

3.2.7 UV-VIS Spektroskopie

Gerät: Spektralphotometer Specord S100, Carl Zeiss Jena

Messung: Integrationszeit: 41,0 ms

Akkumulation: 100 Spektren

Bereich: 189,97 bis 499,63 nm Extinktion

Weitere Parameter: automatische Dunkelmessung

Küvette: UV-Präzisions-Küvetten Suprasil 104-QS 10 mm aus Quarzglas

Hellma Optik GmbH, Jena

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3.2.8 Fluoreszenzspektroskopie

Gerät: Fluoreszenz Spektrofluorimeter f-4500 mit Xenon-Lampe, Hitachi, Tokio, Japan

Küvette: Quarzküvette für die Fluoreszenzspektroskopie, 1,000 cm

Parameter für zweidimensionale Spektren:

λex = 300 bis 600 nm λem = 300 bis 600 nm

Scan: 12000 nm/min Contour interval: 50

3.2.9 Nuklearmagnetische Kernresonanz (NMR)-Spektroskopie

Die Aufnahme der NMR Spektren erfolgte durch Frau Annett Rudolph, Frau Dr. Margit

Grunar und Herrn Dr. Dieter Scheller am Institut für Organische Chemie der TU Dresden.

Die Messungen werden an einem NMR Spektrometer DRX 500 (Bruker, Reinstetten) mit

500 MHz für 1H-Experimente und 125 MHz für 13C-Experimente durchgeführt. Die

Zuordnung der Signale basiert auf den zweidimensionalen Experimenten 1H-1H COSY

(correlation spectroscopy), HSQC (heteronuclear single quantum coherence), HMBC

(heteronuclear multiple bond correlation) and DEPT (distortionless enhancement by

polarization transfer).

Die Angabe der chemischen Verschiebung δ in ppm erfolgt relativ zu den folgenden

Referenz-Signalen:

Chloroform (CDCl3): δH = 7,25 ppm, δC = 77,00 ppm (mittlere Linie),

(Lösungsmittel-Signale)

Deuteriumoxid (D2O): δH = 4,70 ppm (HDO intern),

δC = 0,00 ppm (TMS extern)

Dimethylsulfoxid-d6 (DMSO-d6): δH = 2,50 ppm, δC = 39,56 ppm (Lösungsmittel-Signale)

Methanol-d4: δH = 3,38 ppm, δC = 49,00 ppm (Lösungsmittel-Signale)

Das 1H-Spekrum wird weiterhin dazu benutzt die Ergebnisse der Elementaranalyse zu

interpretieren. Mit Hilfe der Flächenintegrale ausgewählter Peaks wird auf das molare

Verhältnis der Zielverbindung zu Lösungsmittelresten wie z. B. Essigsäure geschlossen.

- 57 -


3.2.10 Elementaranalyse

Die Ermittlung der elementaren Zusammensetzung der Präparate erfolgte durch Frau Anke

Peritz am Institut für Organische Chemie der TU Dresden. Die Bestimmung wird am

Elementar-Analysator Euro EA 3000 (Eurovector, Mailand, Italien) durchgeführt.

3.3. Darstellung von Referenzmaterial zur Analytik der Amadori-Produkte

3.3.1 Darstellung ausgewählter peptidgebundener Amadori-Produkte

Lösungen:

- 0,2 M N-Ethylmorpholin-Acetat-Puffer, pH = 8,0

1,25 ml N-Ethylmorpholin in ca. 40 ml Reinstwasser lösen, mit Essigsäure pH = 8,0

einstellen, im Maßkolben auf 50 ml auffüllen.

Synthese

Die Synthese von Nα-Hippuryl-Nε-(1-desoxy-D-fructos-1-yl)-L-lysin (Nα-Benzoylglycyl-Nε-

(1-desoxy-D-fructos-1-yl)-L-lysin, BzGFruK), Nα-Hippuryl-Nε-(1-desoxy-D-tagatos-1-yl)-

L-lysin (Nα-Benzoylglycyl-Nε-(1-desoxy-D-tagatos-1-yl)-L-lysin, BzGTagK), Nα-Hippuryl-

Nε-(1-desoxy-D-lactulos-1-yl)-L-lysin (Nα-Benzoylglycyl-Nε-(1-desoxy-D-lactulos-1-yl)-

L-lysin, BzGLctK) und Nα-Hippuryl-Nε-(1-desoxy-D-maltulos-1-yl)-L-lysin (Nα-Benzoyl-

glycyl-Nε-(1-desoxy-D-maltulos-1-yl)-L-lysin , BzGMltK) erfolgt in Anlehnung an Finot &

Mauron (1969).

Es werden 2,16 g (12,0 mmol) wasserfreie Glucose oder Galactose mit 0,62 g (2,0 mmol)

Nα-Hippuryl-L-lysin (BzGK) in 84 ml Methanol (wasserfrei) unter Rückfluss für 4 h erhitzt

(Finot & Mauron, 1969). Die Umsetzung von 1,44 g (4,0 mmol) Lactose- oder Maltose-

Monohydrat mit 0,62 g (2,0 mmol) BzGK erfolgt in einer Mischung aus 21 ml Methanol

(wasserfrei) und 9 ml Dimethylformamid (wasserfrei) unter Rückfluss für 3 h (Vinale et al.,

1999).

- 58 -


Isolierung der Amadori-Produkte der Monosaccharide

Der jeweilige Ansatz wird am Vakuumrotationsverdampfer unter reduziertem Druck bei

20 °C zur Trockene eingedampft und der Rückstand wird in insgesamt 9,0 ml 0,2 M

N-Ethylmorpholin-Acetat-Puffer pH = 8,0 gelöst. Die Lösung wird in ein Glasgefäß mit

Schraubdeckel überführt und der pH-Wert wird auf pH = 8,0 mit N-Ethylmorpholin

eingestellt. Nach Zugabe von 27 µl einer Lösung von Carboxypeptidase B (EC 3.4.17.2,

665 U/ml, Aktivität im Enzym-Substrat-Ansatz 2 U/ml) wird der Ansatz bei 25 °C und

gelegentlichem Umschwenken inkubiert. Die Kontrolle der Hydrolyse des nicht umgesetzten

BzGK zu Hippursäure erfolgt mittels RP-HPLC (siehe unten). Dazu werden 10 µl Ansatz

entnommen und 1 + 19 mit 10 mM Phosphatpuffer (Eluent A) verdünnt. Nach vollständiger

Hydrolyse (24 h) wird am Vakuumrotationsverdampfer unter reduziertem Druck bei 35 °C

zur Trockene eingedampft, der Rückstand wird in insgesamt 9,0 ml 10 mM Phosphatpuffer

(Eluent A) aufgenommen und die resultierende Lösung wird membranfiltriert (regenerierte

Cellulose, 0,45 µm).

Die Isolierung erfolgt mittels semipräparativer RP-HPLC unter Verwendung von zwei

Eluenten-Systemen (siehe unten). Nach dem ersten chromatographischen Schritt werden die

Fraktionen vereinigt und am Vakuumrotationsverdampfer unter reduziertem Druck bei 35 °C

auf ca. 2 ml eingeengt. Es wird mit 150 µl Essigsäure angesäuert und membranfiltriert

(regenerierte Cellulose, 0,45 µm). Die Fraktionen des zweiten chromatographischen Schrittes

werden vereinigt und am Vakuumrotationsverdampfer unter reduziertem Druck bei 35 °C auf

ca. 20 ml eingeengt und gefriergetrocknet. Die Präparate werden so oft wieder in

Reinstwasser gelöst und gefriergetrocknet, bis der Geruch nach Essigsäure nur noch schwach

wahrnehmbar ist (ca. 5 ×). Die Aufbewahrung der Lyophilisate erfolgt bei - 18 °C.

Isolierung der Amadori-Produkte der Disaccharide

Der jeweilige Synthese-Ansatz wird am Vakuumrotationsverdampfer unter reduziertem

Druck bei 20 °C eingeengt, der Rückstand wird in 10 ml Reinstwasser aufgenommen, die

Lösung wird mit 0,5 ml 6 M Salzsäure angesäuert und mittels eines Kateionenaustauschers

entzuckert.

Anlage: Schlauchpumpe P1 (siehe Abschnitt 3.2.4)

Sigma Glassäule (25 × 120) mm

- 59 -


Säulenbett: stark saurer Kationenaustauscher (AG 50W-X8, 20-50 mesh, H+-Form),

(25 × 120) mm

Konditionierung: 250 ml 6 M Salzsäure, Fluss: 0,5 ml/min

Reinstwasser bis pH-neutral, Fluss: 1,5 ml/min

Probenaufgabe: Probe, Fluss: 0,5 ml/min

20 ml Reinstwasser, Fluss: 0,5 ml/min

Waschen: 300 ml Reinstwasser, Fluss: 1,5 ml/min

Elution: 150 ml 2 M Ammoniak, Fluss: 1,5 ml/min

Das Eluat wird am Vakuumrotationsverdampfer unter reduziertem Druck bei 35 °C zur

Trockene eingeengt und der Rückstand wird in insgesamt 9,0 ml 0,2 M N-Ethylmorpholin-

Acetat-Puffer pH = 8,0 gelöst. Die enzymatische Hydrolyse und die weitere Aufarbeitung

erfolgen wie bei den Amadori-Produkten der Monosaccharide.

Analytische RP-HPLC

Proben: Enzym-Substrat-Ansatz, 1 + 19 mit Eluent A verdünnt

Reinheitskontrolle Präparate, Konzentration: 1 mg / 1 ml Eluent A

HPLC-Anlage: Merck Hitachi, siehe Abschnitt 3.2

Säule: SA1, Knauer Eurospher 100-C18, siehe Abschnitt 3.2

Eluenten-System: E1, Phosphatpuffer-Methanol-System, siehe Abschnitt 3.2

Gradient: linear ansteigend, von 3 auf 7 % B in 25 min

Flussrate: 1,0 ml/min

Temperatur: 20 °C

Injektionsvolumen: 20 µl

Detektor: L4200 (Merck Hitachi), λ = 230 nm, siehe Abschnitt 3.2

Semipräparative RP-HPLC

1. Chromatographischer Schritt


Säule: SP1, Knauer Eurospher 100-C18, siehe Abschnitt 3.2


- 60 -


Gradient: isokratisch, 10 % B 30 min


Temperatur: 20 °C

Injektionsvolumen: 200-500 µl

Detektor: L4200 (Merck Hitachi), λ = 280 nm, siehe Abschnitt 3.2

2. Chromatographischer Schritt

wie 1. Chromatographischer Schritt, geändert:

Eluenten-System: E2, Essigsäure-Methanol-System, siehe Abschnitt 3.2

Analytische Daten

Analytische Daten BzGFruK: ESI-MS, [M+H]+ m/z = 470,3, [M-H]- m/z = 468,2; 1H-NMR

(500 MHz, D2O, β-Pyranose) δ / ppm: 1,30 (2H, m, K-H4), 1,63 (1H, m, K-H3A), 1,63 (2H,

m, K-H5), 1,76 (1H, m, K-H3B), 2,98 (2H, t, K-H6), 3,17 (2H, s, H1'), 3,62 (1H, d, H3'), 3,64

(1H, dd, H6A'), 3,78 (1H, dd, H4'), 3,90 (1H, m, H5'), 3,90 (1H, m, H6B'), 4,00 (1H, d,

G-H2A), 4,05 (1H, d, G-H2B), 4,16 (1H, dd, K-H2), 7,44 (2H, t, Bz-Hm), 7,55 (1H, t,

Bz-Hp), 7,73 (2H, d, Bz-Ho), 13C-NMR (125 MHz, D2O, β-Pyranose) δ / ppm: 21,92 (t,

K-C4), 24,52 (t, K-C5), 30,84 (t, K-C3), 43,02 (t, G-C2), 48,11 (t, K-C6), 52,65 (t, C1'), 54,37

(d, K-C2), 63,77 (t, C6'), 68,77 (d, C5'), 69,16 (d, C4'), 69,43 (d, C3'), 95,27 (s, C2'), 127,10

(d, Bz-Co), 128,74 (d, Bz-Cm), 132,40 (d, Bz-Cp), 132,68 (s, Bz-Ci), 170,77 (s, G-C1),

171,05 (s, Bz-CO), 178,39 (s, K-C1); Elementaranalyse, C21H31N3O9

× 1,8 CH3COOH × 1,9 H2O (Mbrutto = 611,81 g/mol) berechnet: C = 48,29 %, H = 6,92 %,

N = 6,87 %, gefunden: C = 48,32 %, H = 7,06%, N = 6,95 %; weißer Feststoff,

chromatographische Reinheit: > 99 % (HPLC); Ausbeute: 672 mg (molare Ausbeute: 54,9 %)

Analytische Daten BzGTagK: ESI-MS, [M+H]+ m/z = 470,4, [M-H]- m/z = 468,1; 1H-NMR

(500 MHz, D2O, α-Pyranose) δ / ppm: 1,28 (2H, m, K-H4), 1,62 (1H, m, K-H3A), 1,62 (2H,

m, K-H5), 1,75 (1H, m, K-H3B), 2,95 (2H, m, K-H6), 3,09 (1H, d, H1A'), 3,23 (1H, d, H1B'),

3,51 (1H, m, H6A'), 3,71 (1H, m, H6B'), 3,76 (1H, m, H4'), 3,76 (1H, m, H5'), 3,81 (1H, d,

H3'), 3,99 (1H, d, G-H2A), 4,04 (1H, d, G-H2B), 4,14 (1H, dd, K-H2), 7,45 (2H, t, Bz-Hm),

7,54 (1H, t, Bz-Hp), 7,73 (2H, d, Bz-Ho), 13C-NMR (125 MHz, D2O, α-Pyranose) δ / ppm:

21,94 (t, K-C4), 24,38 (t, K-C5), 30,92 (t, K-C3), 43,06 (t, G-C2), 47,89 (t, K-C6), 52,58 (t,

- 61 -


C1'), 54,50 (d, K-C2), 62,58 (t, C6'), 65,67 (d, C5'), 70,54 (d, C4'), 71,76 (d, C3'), 95,24 (s,

C2'), 127,13 (d, Bz-Co), 128,76 (d, Bz-Cm), 132,42 (d, Bz-Cp), 132,71 (s, Bz-Ci), 170,74 (s,

G-C1), 171,02 (s, Bz-CO), 178,53 (s, K-C1); Elementaranalyse, C21H31N3O9

× 0,7 CH3COOH × 1,1H2O (Mbrutto = 531,39 g/mol) berechnet: C = 50,63 %, H = 6,83 %,

N = 7,91%, gefunden: C = 50,64 %, H = 6,89 %, N = 8,01 %; weißer Feststoff,


Analytische Daten BzGLctK: ESI-MS, [M+H]+ m/z = 633,5, [M-H]- m/z = 631,3; 1H-NMR

(500 MHz, D2O, β-Pyranose) δ / ppm: 1,28 (2H, m, K-H4), 1,60 (2H, m, K-H5), 1,61 (1H, m,

K-H3A), 1,74 (1H, m, K-H3B), 2,96 (2H, t, K-H6), 3,17 (2H, s, H1'), 3,48 (1H, dd, H2"),

3,56 (1H, m, H3"), 3,60 (1H, m, H5"), 3,67 (2H, m, H6"), 3,68 (1H, d, H6A'), 3,74 (1H, d,

H3'), 3,80 (1H, m, H4"), 3,88 (1H, d, H6B'), 3,98 (1H, d, G-H2A), 4,00 (1H, m, H4'), 4,03

(1H, d, G-H2B), 4,09 (1H, m, H5'), 4,14 (1H, dd, K-H2), 4,42 (1H, d, H1"), 7,43 (2H, t,

Bz-Hm), 7,53 (1H, t, Bz-Hp), 7,72 (2H, d, Bz-Ho), 13C-NMR (125 MHz, D2O, V) δ / ppm:

21,69 (t, K-C4), 24,27 (t, K-C5), 30,60 (t, K-C3), 42,78 (t, G-C2), 47,90 (t, K-C6), 52,49 (t,

C1'), 54,14 (d, K-C2), 60,81 (t, C6"), 63,14 (t, C6'), 66,20 (d, C5'), 67,90 (d, C3'), 68,30 (d,

C4"), 70,38 (d, C2"), 72,22 (d, C3"), 75,05 (d, C5"), 76,82 (d, C4'), 94,96 (s, C2'), 100,61 (d,

C1"), 125,50 (d, Bz-Cm), 126,87 (d, Bz-Co), 132,16 (d, Bz-Cp), 132,44 (s, Bz-Ci), 170,53 (s,

G-C1), 170,82 (s, Bz-CO), 178,22 (s, K-C1); Elementaranalyse, C27H42N3O14

× 1,2 CH3COOH × 1,1H2O (Mbrutto = 724,51 g/mol) berechnet: C = 48,74 %, H = 6,82 %,

N = 5,80 %, gefunden: C = 48,70 %, H = 6,79 %, N = 5,95 %; weißer Feststoff,


Analytische Daten BzGMltK: ESI-MS, [M+H]+ m/z = 633,5, [M-H]- m/z = 631,4; 1H-NMR

(500 MHz, D2O, β-Pyranose) δ / ppm: 1,28 (2H, m, K-H4), 1,60 (2H, m, K-H5), 1,61 (1H, m,

K-H3A), 1,74 (1H, m, K-H3B), 2,95 (2H, t, K-H6), 3,17 (2H, s, H1'), 3,29 (1H, dd, H3"),

3,45 (1H, dd, H5"), 3,60 (1H, d, H6A'), 3,66 (1H, m, H4"), 3,68 (2H, m, H6"), 3,70 (1H, dd,

H2"), 3,80 (1H, d, H3'), 3,84 (1H, dd, H4'), 3,89 (1H, d, H6B'), 3,99 (1H, d, G-H2A), 4,02

(1H, d, G-H2B), 4,05 (1H, m, H5'), 4,13 (1H, dd, K-H2), 5,10 (1H, dd, H1"), 7,43 (2H, t,

Bz-Hm), 7,53 (1H, t, Bz-Hp), 7,71 (2H, d, Bz-Ho); 13C-NMR (125 MHz, D2O, β-Pyranose) δ

/ ppm: 21,68 (t, K-C4), 24,25 (t, K-C5), 30,59 (t, K-C3), 42,77 (t, G-C2), 47,86 (t, K-C6),

52,33 (t, C1'), 54,14 (d, K-C2), 60,13 (t, C6"), 63,60 (t, C6'), 68,46 (d, C5'), 68,58 (d, C3'),

69,18 (d, C3"), 71,33 (d, C5"), 72,00 (d, C2"), 72,40 (d, C4"), 77,20 (d, C4'), 95,12 (s, C2'),

- 62 -


100,18 (d, C1"), 126,87 (d, Bz-Co), 128,50 (d, Bz-Cm), 132,16 (d, Bz-Cp), 132,43 (s, Bz-Ci),

170,52 (s, G-C1), 170,82 (s, Bz-CO), 178,22 (s, K-C1); Elementaranalyse,

C27H42N3O14 × 1,2 CH3COOH × 2,6 H2O (Mbrutto = 751,54 g/mol) berechnet: C = 46,99 %,

H = 6,97 %, N = 5,59 %, gefunden: C = 46,95 %, H = 6,82 %, N = 5,67 %; weißer Feststoff,


3.3.2 Darstellung von Nα-Hippuryl-Nε-carboxymethyl-L-lysin

Synthese

Die Synthese von Nα-Hippuryl-Nε-carboxymethyl-L-lysin (Nα-Benzoylglycyl-

Nε-carboxymethyl-L-lysin, BzGCML) erfolgt durch reduktive (hydrierende) Alkylierung von

Nα-Hippuryllysin mit Glyoxylsäure nach Liardon et al. (1987), modifiziert durch Helling

(2002). Für die Reinigung wurde ein Verfahren von Van Chuyen (1973c) adaptiert.

1,538 g (5,01 mmol) Nα-Hippuryllysin und 0,600 g (6,52 mmol) Glyoxylsäure-Monohydrat

werden in 20 ml Reinstwasser gelöst. Der pH-Wert wird mit 1,0 M Natronlauge (ca. 8,3 ml)

auf pH = 8,7 eingestellt. Unter Nachspülen mit Reinstwasser wird der Reaktionsansatz in ein

100 ml-Autoklaven-Gefäß überführt. Nach Zugabe von 52,0 mg Palladium auf Aktivkohle

(10 % Pd) wird der Autoklav verschlossen.

Die Umsetzung im Autoklaven (Druckreaktor Serie 4565M, Parr Instrument Company,

Moline, Illinois, USA) erfolgt nach dreimaligen Spülen der Apparatur mit Wasserstoff bei

einem Druck von 20 bar (Wasserstoff), unter Rühren, bei 23 °C und für 29 h. Anschließend

wird die Aktivkohle abfiltriert (Faltenfilter). Die Lösung wird membranfiltriert und am

Vakuumrotationsverdampfer unter reduziertem Druck bei 30 °C auf ca. 20 ml eingeengt.

Reinigung mittels Ionenaustauschchromatographie

Lösungen:

- 1 M Natronlauge (carbonatarm), 80 g Natriumhydroxid in 2000 l frisch gekochtem

und abgekühltem Reinstwasser unter Kühlung lösen.

- 0,5 M Essigsäure, 28,6 ml Essigsäure (Eisessig) im Maßkolben mit Reinstwasser auf

1000 ml auffüllen, membranfiltrieren, im Vakuum entgasen.

- 63 -






- weitere Lösungen und Reinstwasser im Vakuum entgasen.

Anlage: Bio-Rad-Anlage, BioLogic LP (siehe Abschnitt 3.2.4)

Fraktionssammler Bio-Rad Fraction Collector Model 2128 (siehe 3.2.4)

Bio-Rad Glassäule Econo-Column (25 × 200) mm (siehe 3.2.4)

Säulenbett: stark basischer Anionenaustauscher (DOWEX 1X8, 200-400 mesh,

Acetat-Form), (25 × 190) mm

Konditionierung: 2000 ml 1,0 M Natronlauge, Fluss: 1,0 ml/min


300 ml 1,0 M Essigsäure, Fluss: 1,0 ml/min


Probenaufgabe: 20 ml Probe, Fluss: 0,5 ml/min



Elution: 300 ml 0,5 M Essigsäure, Fluss: 0,5 ml/min



Fraktionierung: ca. 6 ml (= 12 min) pro Fraktion

Regeneration: 1000 ml 1,0 M Salzsäure, Fluss: 1,0 ml/min


Zur Identifikation der Nα-Hippuryl-Nε-carboxymethyllysin enthaltenden Fraktionen wird

zunächst mittels Tüpfeltest und Ninhydrin-Detektion (siehe Abschnitt 3.2.5) und anschließend

mittels RP-HPLC (siehe Abschnitt 3.3.1) geprüft. Die Elution des Produktes erfolgt mit 1,0 M

Essigsäure. Die geeigneten Fraktionen werden vereinigt, am Vakuumrotationsverdampfer

unter reduziertem Druck bei 35 °C auf ca. 40 ml eingeengt und gefriergetrocknet. Das

Präparat wird so oft wieder in Reinstwasser gelöst und gefriergetrocknet, bis der Geruch nach

Essigsäure nur noch schwach wahrnehmbar ist (ca. 5 ×). Die Aufbewahrung des Lyophilisates

erfolgt bei – 18 °C.

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Analytische Daten

Analytische Daten BzGCML: ESI-MS, [M+H]+ m/z = 366,2, [M-H]- m/z =364,1; 1H-NMR

(500 MHz, D2O) δ / ppm: 1,35 (2H, m, K-H4), 1,62 (1H, m, K-H3A), 1,69 (2H, m, K-H5),

1,84 (1H, m, K-H3B), 2,94 (2H, t, K-H6), 3,55 (2H, s, CM-H2), 4,01 (1H, d, G-H2A), 4,07

(1H, d, G-H2B), 4,31 (1H, dd, K-H2), 7,45 (2H, t, Bz-Hm), 7,55 (1H, t, Bz-Hp), 7,73 (2H, d,

Bz-Ho), 13C-NMR (125 MHz, D2O) δ / ppm: 23,66 (t, K-C4), 26,49 (t, K-C5), 31,78 (t,

K-C3), 44,58 (t, G-C2), 48,77 (t, K-C6), 50,47 (t, CM-C2), 54,58 (d, K-C2), 128,81 (d,

Bz-Co), 130,46 (d, Bz-Cm), 134,13 (d, Bz-Cp), 134,36 (s, Bz-Ci), 172,42 (s, G-C1), 172,77

(s, Bz-CO), 173,08 (s, CM-C1), 178,00 (s, K-C1); Elementaranalyse, C17H23N3O6

× 0,5 CH3COOH × 0,8 H2O (Mbrutto = 404,42 g/mol) berechnet: C = 53,46 %, H = 6,48 %,

N = 10,39 %, gefunden: C = 53,26 %, H = 6,38%, N = 10,41 %; weißer Feststoff,

chromatographische Reinheit: > 99 % (HPLC); Ausbeute: 1667 mg (molare Ausbeute:

82,4 %)

3.3.3 Darstellung von Nε-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-L-lysin

Synthese

Die Synthese von Nε-Fructoselysin (Nε-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-L-lysin, FruK) erfolgt in

Anlehnung an Reutter und Eichner (1989), wobei zur Vermeidung von Nebenprodukten von

Nα-Boc-Lysin ausgegangen wird.

Eine Lösung von 0,62 g (2,5 mmol) Nα-Boc-Lysin und 2,70 g (15,0 mmol) Glucose in

13,8 ml Reinstwasser wird mit 6,75 g Cellulose (mikrokristallin) zu einem Brei verarbeitet.

Die Mischung wird gefriergetrocknet und der resultierende Feststoff fein gemörsert. Zur

Einstellung des aw-Wertes wird im Exsikkator über einer gesättigten Lösung von

Calciumchlorid (aw = 0,35) für 14 d bei 20 °C aufbewahrt. Anschließend wird in einem

verschlossenen Schraubdeckelglas 12 d bei 40 °C inkubiert. Nachfolgend wird das

Reaktionsgemisch dreimal mit Reinstwasser extrahiert. Dazu wird jeweils mit 25 ml

Reinstwasser aufgeschlämmt, die Aufschlämmung zentrifugiert und der Überstand

abgenommen. Der vereinigte Extrakt wird filtriert (Faltenfilter) und mit 2,5 ml Essigsäure

angesäuert. Zur Abspaltung der Boc-Schutzgruppe und zur Entzuckerung mittels eines stark

sauren Kationenaustauscher wird wie unter 3.3.1 (Isolierung der Amadori-Produkte der

- 65 -


Disaccharide) angegeben verfahren. Um die Schutzgruppe vollständig zu entfernen, verbleibt

jedoch das Isolat nach dem Waschschritt über Nacht auf dem Austauscher und wird erst dann

eluiert. Das zur Trockene eingeengte Eluat wird in 10 ml 0,1 M Pyridinium-Formiat-Puffer,

pH = 3,0, aufgenommen und der pH-Wert wird mit Ameisensäure auf pH = 2,8 eingestellt.


Lösungen:

- 2 M Pyridin, 166 ml Pyridin (100 %) mit Reinstwasser im Maßkolben auf 1000 ml

auffüllen, membranfiltrieren, im Vakuum entgasen.

- 0,1 M Pyridinium-Formiat-Puffer, pH = 3,0, 8 ml Pyridin in ca. 950 ml Reinstwasser

lösen, mit Ameisensäure pH = 3,0 einstellen, im Maßkolben auf 1000 ml auffüllen,

membranfiltrieren, im Vakuum entgasen.

- 0,4 M Pyridinium-Acetat-Puffer, pH = 4,35, 33 ml Pyridin in ca. 950 ml Reinstwasser

lösen, mit Essigsäure pH = 4,35 einstellen, im Maßkolben auf 1000 ml auffüllen,

membranfiltrieren, im Vakuum entgasen.

- Reinstwasser, im Vakuum entgasen.


Fraktionssammler Bio-Rad Fraction Collector Model 2128 (siehe

Abschnitt 3.2.4)


Säulenbett: stark saurer Kationenaustauscher (DOWEX 50X 8-400, 200-400 mesh,

Pyridinium-Form), (15 × 480) mm



250 ml 2 M Pyridin, Fluss: 0,17 ml/min


250 ml 0,1 M Pyridinium-Formiat-Puffer, pH = 3,0, Fluss: 0,5 ml/min

Probenaufgabe: 10 ml Probe, Fluss: 0, 17 ml/min

20 ml 0,1 M Pyridinium-Formiat-Puffer, pH = 3,0, Fluss: 0,17 ml/min

Elution: 250 ml 0,4 M Pyridinium-Acetat-Puffer, pH = 4,35, Fluss: 0,17 ml/min

Fraktionierung: 5 ml (= 30 min) pro Fraktion

- 66 -


Die Reinheit der Fraktionen die im Tüpfeltest sowohl mit Ninhydrin als auch mit TTC eine

Rotfärbung zeigen (siehe Abschnitt 3.2.5) wird mittels Dünnschichtchromatographie (siehe

Abschnitt 3.2.6) und Aminosäureanalyse (siehe Abschnitt 3.2.3) überprüft. Die geeigneten

Fraktionen (Nr. 25 bis 36) werden vereinigt und am Vakuumrotationsverdampfer unter

reduziertem Druck bei 35 °C zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in 5 ml trockenem

Methanol aufgenommen und es wird erneut zur Trockene eingeengt. Das zurückbleibende Öl

wird in 5 ml trockenem Methanol gelöst. Die Lösung wird unter intensiven Rühren in 25 ml

Ethylmethylketon eingetropft. Nach 16 h wird das Präzipitat mittels eines Büchnertrichters

abfiltriert und mit Ethylmethylketon gewaschen. Das Präparat wird im Vakuum (10 mbar)

getrocknet und anschließend bei - 18 C aufbewahrt.

Analytische Daten

Analytische Daten FruK: ESI-MS, [M+H]+ m/z = 309,2, [M-H]- m/z = 307,0;1H-NMR

(500 MHz, D2O, mit Deuteriumchlorid-Lösung pH = 5,1 eingestellt [pH-Wert gemessen,

Isotopeneffekt nicht korrigiert], β-Pyranose) δ / ppm: 1,35 (2H, m, K-H4),1,66 (2H, m,

K-H5), 1,79 (2H, m, K-H3), 3,03 (2H, dd, K-H6), 3,19 (2H, s, H1'), 3,61 (1H, d, H3'), 3,63

(1H, m, K-H2), 3,64 (1H, d, H6A'), 3,77 (1H, dd, H4'), 3,89 (1H, dd, H5'), 3,89 (1H, d, H6B'), 13C-NMR (125 MHz, D2O, β-Pyranose) δ / ppm: 21,34 (t, K-C4), 24,66 (t, K-C5), 29,68 (t,

K-C3), 47,83 (t, K-C6), 52,65 (t, C1'), 54,30 (d, K-C2), 63,75 (t, C6'), 68,73 (d, C5'), 69,10 (d,

C4'), 69,39 (d, C3'), 95,24 (s, C2'), 174,38 (s, K-C1); Elementaranalyse, C12H24N2O7

× 0,8 CH3COOH × 0,8CH3OH × 0,1 C2H5COCH3 (Mbrutto = 389,21 g/mol) berechnet:

C = 45,67 %, H = 8,08 %, N = 7,20 %, gefunden: C = 45,40 %, H = 7,99 %, N = 7,17 %;

schwach gelb gefärbter Feststoff, chromatographische Reinheit: > 99 % (Aminosäureanalyse);

Ausbeute: 399 mg (molare Ausbeute: 42,7 %)

3.3.4 Darstellung von Pyridosin

Synthese

Die Synthese von Pyridosin (6-(5-Hydroxy-2-methyl-4-oxo-4H-pyridin-1-yl)-L-norleucin

erfolgt in Anlehnung an Henle et al. (1994b).

1,8 g (10 mmol) Nα-Acetyllysin und 22 g (120 mmol) wasserfreie Glucose werden in 335 ml

absolutem Methanol (chromatosolv) für 4 h unter Rückfluss und Rühren umgesetzt.

- 67 -


Anschließend wird das Lösungsmittel am Vakuumrotationsverdampfer unter reduziertem

Druck bei ca. 20 °C entfernt, der Rückstand wird in 10 ml Reinstwasser gelöst und der Ansatz

wird wie unter 3.3.1 (Isolierung der Amadori-Produkte der Disaccharide) angegeben

entzuckert. Das Nα-Acetyl-Nε-(1-desoxy-D-fructos-1-yl)-L-lysin enthaltende Eluat wird am

Vakuumrotationsverdampfer unter reduziertem Druck bei ca. 35 °C zur Trockene eingeengt.

Der Rückstand wird in 1250 ml 8 M Salzsäure aufgenommen. Die Hydrolyse des Ansatzes

erfolgt durch Erhitzen unter Rückfluss und Rühren für 23 h. Anschließend wird die Salzsäure

im Wasserstrahlvakuum abdestilliert. Der Rückstand wird in 40 ml Reinstwasser gelöst, der

pH-Wert wird durch Zugabe von Trinatriumcitrat auf pH = 1,5 eingestellt und die Lösung

wird membranfiltriert.


Lösungen:

- 0,1 M Natriumcitrat-Puffer, pH = 3,0 (Aufgabepuffer), 4 g Natriumhydroxid in

ca. 900 ml Reinstwasser lösen, mit Citronensäure pH = 3,0 einstellen, auf 1000 ml


- 0,3 M Natriumcitrat-Puffer, pH = 5,35 (Elutionspuffer), 12 g Natriumhydroxid in

ca. 900 ml Reinstwasser lösen, mit Citronensäure pH = 5,35 einstellen, auf 1000 ml


- Reinstwasser, im Vakuum entgasen.


Fraktionssammler Bio-Rad Fraction Collector Model 2128 (siehe 3.2.4)


Säulenbett: stark saurer Kationenaustauscher (DOWEX 50X 8-400, 200-400 mesh,

Natrium-Form), (25 × 180) mm



250 ml 2 M Natronlauge, Fluss: 1,0 ml/min


250 ml Natriumcitrat-Puffer, pH = 3,0, Fluss: 1,0 ml/min

Probenaufgabe: 40 ml Probe, Fluss: 0,5 ml/min

- 68 -


Probenaufgabe: 100 ml 0,1 M Natriumcitrat-Puffer, pH = 3,0, Fluss: 0,5 ml/min

Elution: 250 ml 0,3 M Natriumcitrat-Puffer, pH = 5,35, Fluss: 0,5 ml/min

Fraktionierung: 8,5 ml (17 min) pro Fraktion

Die Reinheit der Fraktionen die im Tüpfeltest sowohl mit Ninhydrin als auch mit TTC eine

Rotfärbung zeigen (siehe Abschnitt 3.2.5) wird mittels Dünnschichtchromatographie (siehe

Abschnitt 3.2.6) und Aminosäureanalyse (siehe Abschnitt 3.2.3) überprüft. Die geeigneten

Fraktionen (Nr. 40 bis 50) werden vereinigt. Nach Verdünnen mit ca. 300 ml Reinstwasser

wird mit 6 M Salzsäure pH = 2 eingestellt und entsalzt.

Entsalzung mittels stark sauren Kationenaustauscher

Anlage: Schlauchpumpe P1 (siehe Abschnitt 3.2.4)

Sigma Glassäule (25 × 200) mm (siehe Abschnitt 3.2.4)

Säulenbett: stark saurer Kationenaustauscher (AG 50W-X8, 20-50 mesh, H+-Form),

(25 × 200) mm



Probenaufgabe: Probe, Fluss: 0,5 ml/min

Waschen: 200 ml Reinstwasser, Fluss: 1,5 ml/min

400 ml 1 M Salzsäure, Fluss: 0,5 ml/min

Elution: 800 ml 4 M Salzsäure, Fluss: 1,5 ml/min

Fraktionierung: 12 ml (8 min) pro Fraktion

Die Fraktionen werden mittels Tüpfeltest mit Ninhydrin-Detektion (siehe Abschnitt 3.2.5)

und Aminosäureanalyse (siehe Abschnitt 3.2.3) überprüft. Die geeigneten Fraktionen (Nr. 8

bis 69) werden vereinigt und die Salzsäure wird im Wasserstrahlvakuum abdestilliert. Der

Rückstand wird in 10 ml Reinstwasser gelöst und die Lösung wird am

Vakuumrotationsverdampfer unter reduziertem Druck bei 35 °C zur Trockene eingeengt

(2 ×). Der Rückstand wird in 1 ml Reinstwasser gelöst und die Lösung wird auf eine

konditionierte RP-18 Kartusche (Spe-edTM, SPE-ED C18-18 %, 1 g/6 ml, Konditionierung:

5 ml Reinstwasser, 5 ml Methanol, 5 ml Reinstwasser) gegeben. Anschließend wird die

Kartusche mit 5 ml 0,001 M Salzsäure gespült. Das Eluat wird ab dem Beginn der

- 69 -


Probenaufgabe gesammelt und am Vakuumrotationsverdampfer unter reduziertem Druck bei

35 °C zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in 5 ml Reinstwasser gelöst, die Lösung

wird membranfiltriert und gefriergetrocknet. Das Lyophilisat wird bei – 18 C aufbewahrt.

Analytische Daten

Analytische Daten Pyridosin: ESI-MS, [M+H]+ m/z = 255,2, [M-H]- m/z = 253,0; 1H-NMR

(500 MHz, DMSO-d6) δ / ppm: 1,38-1,49 (2 H, m, H-K4), 1,79-1,86 (2 H, m, H-K5), 1,87-

1,93 (2 H, m, H-K3), 2,48 (3 H, s, H-7´) 3,95 (1 H, t, H-K2), 4,18 (2 H, t, H-K6), 7,00 (1 H, s,

H-5´), 7,96 (1 H, s, H-2´), 13C-NMR (125 MHz, DMSO) δ / ppm: 18,31 (q, C-7´, 21,06 (t,

C-K4), 28,68 (t, C-K5), 29,17 (t, C-K3), 52,61 (d, C-K2), 55,39 (t, C-K6), 114,34 (d, C-5´),

131,12 (d, C-2´), 142,94 (s, C-3´), 148,48 (s, C-6´),159,42 (s, C-4´),171,98 (s, C-K1);

UV-Daten (0, 1 M Salzsäure): λmax = 245 nm, ε245 = 6655 l⋅mol-1⋅cm-1, λmax = 276 nm,

ε276 = 6086 l⋅mol-1⋅cm-1; Elementaranalyse, C12H18N2O4 × 2,0 HCl × 0,7 NaCl × 2,1 H2O

(Mbrutto = 405,95 g/mol) berechnet: C = 35,50 %, H = 6,01 %, N = 6,90 %, Cl = 23,58 %,

gefunden: C = 35,61 %, H = 6,04 %, N = 6,81 %, Cl = 23,70 %; gelbbrauner Feststoff,

chromatographische Reinheit: > 98 % (Aminosäureanalyse); Ausbeute: 250 mg (molare

Ausbeute: 6,2 %)

3.4 Studien zur Bildung der Hydrolyseprodukte

3.4.1 Hydrolyse der Amadori-Produkte

Lösungen

Amadori-Produkt-Stammlösungen

- Nα-Hippuryl-Derivat-Lösung (2 mg/ml), 50 mg BzGFruK, BzGTagK, BzGLctK oder

BzGMltK in 25 ml Reinstwasser im Maßkolben lösen.

- BzGFruK-Lösung (10 mg/ml), 20 mg BzGFruK in 2,000 ml Reinstwasser lösen

- Nε-Fructoselysin-Lösung (1 mg/ml), 25 mg FruK in 25 ml Reinstwasser im

Maßkolben lösen.

- 70 -


Salzsäure

- 12 M Salzsäure, „ACS Quality“ von J.T.Baker, Deventer, Niederlande

- 12 M Salzsäure, „trace select“ von Fluka, Taufenkirchen, Deutschland (nur für

Vakuumhydrolyse)

Salzsäurehydrolyse - Standard-Verfahren

Zusammensetzung der Hydrolyseansätze:

- Hydrolyse mit 6 M Salzsäure: 1000 µl Amadori-Produkt-Stammlösung (2 mg/ml) +

1000 µl 12 M Salzsäure (Amadori-Produkt-Salzsäure-Verhältnis: 1:1000, FruK:

1:2000)

- Hydrolyse mit 8 M Salzsäure: 1000 µl Amadori-Produkt-Stammlösung (2 mg/ml) +

2000 µl 12 M Salzsäure (Amadori-Produkt-Salzsäure-Verhältnis: 1:1500, FruK:

1:3000)

Zur Salzsäurehydrolyse wird die Amadori-Produkt-Stammlösung und die Salzsäure in ein

6 ml-Hydrolysegefäße pipettiert, der Ansatz wird gemischt, das Gefäß wird mit Stickstoff

gespült und fest verschlossenen. Die Hydrolyse erfolgt bei 110 °C für 23 h im Sandbad im

Trockenschrank. Zur Kontrolle der Dichtheit werden die Hydrolysegefäße vor und nach der

Hydrolyse gewogen. Nach der Hydrolyse werden jeweils 500 µl Hydrolysat in ein

1,5 ml-Eppendorf-Gefäß überführt und im Vakuumzentrifugalverdampfer zur Trockene

eingeengt. Der Rückstand wird in 1000 µl 0,2 M Natriumcitrat-Puffer (pH = 2,20, Puffer 1

siehe Abschnitt 3.2.3) gelöst, die Lösung wird zentrifugiert (6000 min-1, Zentrifuge

Eppendorf 5804 R) und membranfiltriert (0,2 µm, regenerierte Cellulose). Bei veränderter

Amadori-Produkt-Konzentration im Hydrolyseansatz (siehe unten) werden das zu

entnehmende Hydrolysat-Aliquot oder das Lösevolumen entsprechend angepasst. Es wird

jeweils eine Fünfachbestimmung beginnend mit fünf separaten Hydrolyseansätzen

durchgeführt.

Variation der Hydrolysebedingungen

Zusatz möglicher Effektoren

Es erfolgen Hydrolysen von BzGFruK und BzGTagK in 6 M Salzsäure (1:1000, siehe oben)

in Gegenwart von möglichen Effektoren. Die Höhe des Zusatzes beträgt jeweils 0,1 %

- 71 -


(1 mg/ml Gesamthydrolyseansatz) und 1,0 % (10 mg/ml). Es werden Glucose (wasserfrei),

Essigsäure, Citronensäure-Monohydrat, Natriumlactat, Natriumazid, Kaliumdihydrogen-

phosphat, Acetylcystein, Phenol, Thymol, Bromwasserstoffsäure (48 %ig), Mercaptoethanol

und Thioessigsäure geprüft.

Zusatz von Peptiden

Die Hydrolyse von BzGFruK erfolgt in Gegenwart von Dipeptiden (Peptid-Salzsäure-

Verhältnis: 1:125).

- Hydrolyse mit 6 M Salzsäure, 1000 µl BzGFruK-Stammlösung (2 mg/ml) + 1000 µl

12 M Salzsäure + 7 mg Glu-Tyr + 7 mg Leu-Asp

- Hydrolyse mit 8 M Salzsäure, 200 µl BzGFruK-Stammlösung (10 mg/ml) + 466 µl

Reinstwasser + 1334 µl 12 M Salzsäure + 7 mg Glu-Tyr + 7 mg Leu-Asp

Variation der Amadori-Produkt-Konzentration im Hydrolyseansatz

Die Hydrolyse von BzGFruK in 6 M und 8 M Salzsäure erfolgt bei ausgewählten Amadori-

Produkt-Salzsäure-Verhältnissen.

Hydrolyse mit 6 M Salzsäure

- Verhältnis 1:500, 400 µl Stammlösung (10 mg/ml) + 600 µl Reinstwasser + 1000 µl

12 M Salzsäure


12 M Salzsäure

Hydrolyse mit 8 M Salzsäure


12 M Salzsäure


12 M Salzsäure


12 M Salzsäure

- 72 -


Hydrolyse mit 7,3 M Salzsäure

Die Hydrolyse von BzGFruK und BzGTagK erfolgt bei einem Amadori-Produkt-Salzsäure-

Verhältnis von 1:1275 mit 7,3 M Salzsäure (645 µl Amadori-Produkt-Stammlösung

[2 mg/ml] + 1000 µl 12 M Salzsäure).

Hydrolyse mit und ohne Spülen mit Stickstoff

Bei der Hydrolyse von BzGFruK in 6 M Salzsäure nach dem Standardverfahren wird der

Einfluss des Spülens mit Stickstoff geprüft.

Variation: vor dem Verschließen der Hydrolysegefäße

- Spülen des Gasraums mit Stickstoff (= Standardverfahren)

- kein Spülen des Gasraums mit Stickstoff

- Stickstoff durch Hydrolyseansatz blubbern lassen (1 oder 2 min)

Hydrolyse unter Vakuum

Die Hydrolyse von BzGFruK in 6 M und 8 M Salzsäure erfolgt in Vakuumhydrolysegefäßen

(Pierce) unter Verwendung von „Reacti-ThermTM Heating/Stirring Module“ und „Reacti-

BlockTM F“ (Pierce) für 23 h bei 110 °C.

Herstellung der Hydrolyseansätze wie Standardverfahren

Variation: vor dem Verschließen der Hydrolysegefäße

- keine zusätzliche Behandlung (Vergleich)

- Hydrolyseansatz auf -70 °C Kühlen, Gefäß evakuieren

(Endvakuum: 0,001 mbar, 1 min)

Hydrolyse nach Reduktion mit Natriumborhydrid

Das Amadori-Produkt wird mit Natriumborhydrid reduziert (molares Verhältnis: ca. 1:10, 1 h,

pH = 8,5) und anschließend wird mit 6 M Salzsäure hydrolysiert. Dazu werden 1000 µl

BzGFruK-Lösung (2 mg/ml) oder 1000 µl FruK-Lösung (1 mg/ml) in der folgenden Weise

behandelt:

- Zugabe von 1000 µl 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH = 7,4, 500 µM EDTA),

- Zugabe von 1,2 mg Natriumborhydrid (resultierender pH-Wert: 8,5),

- 1 h Inkubation bei 23 C,

- Zugabe von 2000 µl 12 M Salzsäure,

- 73 -


- Standardhydrolyse (23 h, 110 °C).

Anschließend wird ein Aliquot von 500 µl entnommen und in der üblichen Weise (siehe oben:

Standard-Verfahren) aufgearbeitet und mittels Aminosäureanalyse untersucht.

3.4.2 Quantifizierung der Hydrolyseprodukte und Bestimmung der molaren

Ausbeuten

Die Quantifizierung von Furosin, Pyridosin, Lysin, CML und Glycin erfolgt mittels

Aminosäureanalyse (siehe Abschnitt 3.2.3) und externer Kalibration. Für die Kalibration von

Furosin sowie Lysin und Glycin werden käufliche Standards verwendet (siehe Abschnitt

3.1.2). Zur Pyridosin-Bestimmung wird das selbst dargestellte Präparat als Standard

verwendet. CML wird unter Verwendung eines salzsauren Hydrolysates von BzGCML mit

Glycin als interne Referenz kalibriert.

Zur Berechnung der molaren Ausbeuten der Hydrolyseprodukte der Nα-Hippuryl-Amadori-

Produkte wird Glycin als interne Referenz verwendet. Bei Nε-Fructoselysin wird der mittels

Elementaranalyse ermittelte Gehalt genutzt (siehe unten).

Formeln zur Berechnung der molaren Ausbeuten

%100⋅=Gly

xx n

nA (Nα-Hippuryl-Amadori-Produkte)

%100⋅=FruK

xx n

nA (Nε-Fructosyllysin)

Ax molare Ausbeute an Furosin, Pyridosin, Lysin oder CML [%]

nx Stoffmenge an Furosin, Pyridosin, Lysin oder CML [nmol/20µl]

nGly Stoffmenge an Glycin [nmol/20µl]

nFruK Ausgangsgehalt an Nε-Fructoselysin [nmol/20µl]

- 74 -


3.4.3 Bildung von Furosin ohne Salzsäurehydrolyse und Stabilität von

Nε-Fructoselysin in Salzsäure

Bildung von Furosin ohne Salzsäurehydrolyse

Die Untersuchung zur direkten Bildung von Furosin im Zuge der Maillard-Reaktion erfolgt in

Anlehnung an Hollnagel und Kroh (2000).

Dazu werden 36,0 mg (0,1 mmol) Maltose Monohydrat und 24,6 mg (0,1 mmol) Nα-Boc-

Lysin in 1000 µl Reinstwasser gelöst, die Lösung wird gefriergetrocknet und das

pulverförmiges Lyophilisat wird in verschlossenen Pyrex-Hydrolysegefäß bei 120 °C für

15 min im Sandbad im Trockenschrank erhitzt. Die rotbraun gefärbte Probe wird in 1000 µl

Reinstwasser gelöst. Zur Abspaltung der Boc-Gruppe werden zu einem Aliquot von 200 µl

18 µl 12 M Salzsäure hinzugefügt und anschließend wird über Nacht bei Raumtemperatur

inkubiert. Danach wird die Probe 1 + 9 mit 0,2 M Natriumcitrat-Puffer (pH = 2,20, Puffer 1

siehe Abschnitt 3.2.3) verdünnt, membranfiltriert (0,2 µm, regenerierte Cellulose) und mittels

Aminosäureanalyse untersucht (siehe Abschnitt 3.2.3).

Stabilität von Nε-Fructoselysin in Salzsäure

Nle-FruK-Stammlösung

6,1 mg (46,50 µmol) Norleucin (Nle) und 20,4 mg (52,27 µmol) Nε-Fructoselysin (Gehalt:

79 %) in 1000 µl Reinstwasser lösen.

Es wird auf die Stabilität von Nε-Fructoselysin in 6 M und 8 M Salzsäure unter nicht-

hydrolytischen Bedingungen mit Norleucin (Nle) als internen Standard geprüft.

Herstellung der Ansätze:

- Ansatz in 6 M Salzsäure: 200 µl Nle-FruK-Stammlösung + 200 µl 12 M Salzsäure

- Ansatz in 8 M Salzsäure: 200 µl Nle-FruK-Stammlösung + 400 µl 12 M Salzsäure

Die Inkubationen erfolgen bei 6 °C sowie 23 °C. Zur Untersuchung wird ein Aliquot von

20 µl (6 M-Ansätze) oder 30 µl (8 M-Ansätze) mit 0,2 M Natriumcitrat-Puffer (pH = 2,20,

Puffer 1 siehe Abschnitt 3.2.3) auf 1000 µl verdünnt, die Lösung wird membranfiltriert

(0,2 µm, regenerierte Cellulose) und mittels Aminosäureanalyse untersucht (siehe Abschnitt

3.2.3).

- 75 -


3.5 Studien zur Reaktion von Peptiden mit α-Dicarbonylverbindungen

3.5.1 Reaktion von ausgewählten Peptiden mit α-Dicarbonylverbindungen

Lösungen - Puffer

- 100 mM Phosphatpuffer (PB) (pH = 7,4, 1,25-fach)

2,23 g di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat in ca. 90 ml Reinstwasser lösen, mit

Salzsäure pH = 7,4 einstellen und mit Reinstwasser auf 100 ml auffüllen.







- 100 mM Phosphatpuffer (PB) mit definiertem pH-Wert (1,25-fach)


Salzsäure (pH = 3,1, 4,0, 5,1, 6,1, 6,6, 7,1, 8,1, 8,5, 8,9) oder 4 M Natronlauge

(pH = 9,9, 11,1) den pH-Wert einstellen und mit Reinstwasser auf 50 ml auffüllen.

- Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH = 7,4, 1,25-fach)

184,2 mg di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat, 29,3 mg Kaliumdihydrogen-

phosphat, 1000,1 mg Natriumchlorid und 25,2 mg Kaliumchlorid in 100 ml

Reinstwasser lösen.

- MOPS-Puffer (pH = 7,4, 1,25-fach)

2,62 g MOPS (3-Morpholino-propansulfonsäure) in ca. 90 ml Reinstwasser lösen, mit

4 M Natronlauge pH = 7,4 einstellen und mit Reinstwasser auf 100 ml auffüllen.

- TAPSO-Puffer (pH = 7,4, 1,25-fach)

3,24 g TAPSO (N-[Tris(hydroxymethyl)-methyl]-3-amino-2-hydroxy-propansulfon-

säure) in ca. 90 ml Reinstwasser lösen, mit 4 M Natronlauge pH = 7,4 einstellen und

mit Reinstwasser auf 100 ml auffüllen.

- TRIS-Puffer (pH = 7,4, 1,25-fach)

1,51 g TRIS (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan) in ca. 90 ml Reinstwasser lösen, mit


- 76 -


- 100 mM und 200 mM Ameisensäure

377 µl Ameisensäure (100 %) werden mit Reinstwasser auf 100 ml (100 mM) oder

50 ml (200 mM) ergänzt.

Lösungen - α-Dicarbonylverbindungen

- Glyoxal (GO)-Lösung (5 mM, 5-fach)

143 µl Glyoxal-Lösung (40 %) mit Reinstwasser im Maßkolben auf 50 ml auffüllen.

- Methylglyoxal (MGO)-Lösung (5 mM, 5-fach)

188 µl Methylglyoxal-Lösung (40 %) mit Reinstwasser im Maßkolben auf 50 ml

auffüllen.

- 3-Desoxyglucosulose (3-DG)-Lösung (5 mM, 5-fach)

22,5 mg 3-DG in 5 ml Reinstwasser im Maßkolben lösen.

- Diacetyl-Lösung (5 mM, 5-fach)

109,3 µl Diacetyl-Lösung (>99 %) mit Reinstwasser im Maßkolben auf 50 ml

auffüllen.

Lösungen - Peptide

- Gly-Ala-Phe-Lösung (5 mM, 1,25-fach)

20,5 mg Gly-Ala-Phe x 1,9 H2O in 10 ml Puffer (1,25-fach) lösen.

- Phe-Gly-Gly-Lösung (5 mM, 1,25-fach)

17,5 mg Phe-Gly-Gly in 10 ml 100 mM (1,25-fach) PB lösen.

- Phe-Gly-Lösung (5 mM, 1,25-fach)

14,5 mg Phe-Gly (Gehalt: 95,9 %) in 10 ml 100 mM (1,25-fach) PB lösen.

- Ala-Phe-Gly-Lösung (5 mM, 1,25-fach)

18,4 mg Ala-Phe-Gly in 10 ml 100 mM (1,25-fach) PB lösen.

- Gly-Phe-Ala-Lösung (5 mM, 1,25-fach)

19,5 mg Gly-Phe-Ala in 10 ml 100 mM (1,25-fach) PB lösen.

- Phe-Lösung (5 mM, 1,25-fach)

10,6 mg Phe in 10 ml 100 mM (1,25-fach) PB lösen.

- Phenylalaninamid (F-NH2)-Lösung (5 mM, 1,25-fach)

5,1 mg in 5 ml 100 mM (1,25-fach) PB lösen.

- BGG-Lösung (5 mM, 1,25-fach)

14,8 mg BGG in 10 ml 100 mM (1,25-fach) PB lösen.

- 77 -


- BzGK-Lösung (5 mM, 1,25-facht)

19,2 mg BzGK in 10 ml 100 mM (1,25-fach) PB lösen.

- BzGR-Lösung (5 mM, 1,25-fach)

21,0 mg BzGR in 10 ml 100 mM (1,25-fach) PB lösen.

- AcSer-Gly-Lösung (5 mM, 1,25-fach)

12,8 mg AcSerGly in 10 ml 100 mM (1,25-fach) PB lösen.

- AcTrp-Lösung (5 mM, 1,25-fach)

15,4 mg AcTrp in 10 ml 100 mM (1,25-fach) PB lösen.

- AcCys-Lösung (5 mM, 1,25-fach)

10,2 mg AcCys in 10 ml 100 mM (1,25-fach) PB lösen.

- BzMet-Lösung (5 mM, 1,25-fach)

15,9 mg BzMet in 10 ml 100 mM (1,25-fach) PB lösen.

- BzHis-Lösung (5 mM, 1,25-fach)

16,2 mg BzHis in 10 ml 100 mM (1,25-fach) PB lösen.

- Gly-Ala-Phe-BzGR-Lösung (je 5 mM, 1,25-fach) (kompetitive Experimente)

20,5 mg Gly-Ala-Phe x 1,9 H2O sowie 21,0 mg BzGR in 10 ml Puffer (1,25-fach)

lösen.

- Glycinamid-Lösung (5 mM, 1,25-fach)

3,5 mg Glycinamid × 1,0 HCl × 0,8 H2O in 5 ml 100 mM (1,25-fach) PB lösen.

Durchführung

Die Inkubationsansätze werden wie in Tab. 3.5.1-1 angegeben angefertigt (jeweils dreifach)

und bei 60 °C für 72 h, bei 37 °C für 24 h sowie bei 37 °C für bis zu 14 d (ausgewählte

Ansätze) im Brutschrank inkubiert. Zum Abstoppen wird 1 + 1, 1 + 3 (Nα-Hippuryl-,

Nα-Benzoyl-Derivate) oder 1 + 9 (AcTrp) mit 100 mM Ameisensäure verdünnt

(resultierender pH = 2,8). Ansätze mit einem pH ≥ 9,0 werden mit 200 mM Ameisensäure

abgestoppt. Die Herstellung der 1 + 3 und 1 + 9 Verdünnungen erfolgt nach Abkühlen auf

Raumtemperatur mit einem Aliquot. Die Proben werden anschließend mittels RP-HPLC

analysiert. Der pH-Wert wird vor und nach der Inkubation in separaten Ansätzen kontrolliert.

- 78 -


Tab. 3.5.1-1: Zusammensetzung der Inkubationsansätze.

Probe Peptid-Lösung Puffer α-Dicarbonyl-Lösung Reinstwasser

Ansatz 400 µl - 100 µl -

Peptid-Bw* 400 µl - - 100 µl

Dicarbonyl-Bw* - 400 µl 100 µl -

*Bw: Blindwert

Der Umsatz an Peptid und die dazugehörige Standardabweichung wird wie folgt berechnet:

%100100[%] ×=ohne

mit

AAUmsatz

22

100 ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛××=

ohne

ohne

mit

mit

ohne

mit

As

As

AAs

Amit Peakfläche (λ = 220 nm) des Peptidpeaks nach Inkubation mit der α-Dicarbonyl-

verbindung

Aohne Peakfläche (λ = 220 nm) des Peptidpeaks nach Inkubation ohne der α-Dicarbonyl-

verbindung (Peptid-Blindwert)

Analytische RP-HPLC



Nα-Hippuryl-Derivate:


Gradient: linear ansteigend, von 6 auf 13 % B in 25 min (BzGK-Ansätze)

linear ansteigend, von 12 auf 19 % B in 25 min (BzGR-Ansätze)


Sonstige Derivate:

Eluenten-System: E3, Triethylamin-Essigsäure-Ameisensäure-System, siehe Abschnitt 3.2

Gradient: linear ansteigend, von 12 auf 57 % B in 35 min (GO-Ansätze)

Flussrate: 0,5 ml/min (GO-Ansätze)

Gradient: linear ansteigend, von 25 auf 55 % B in 35 min (MGO-, 3-DG-Ansätze)

Flussrate: 0,7 ml/min (MGO-, 3-DG-Ansätze)

- 79 -


Gly-Ala-Phe-Ansätze zur Umsatzbestimmung:

Eluenten-System: E5, Ameisensäure-Methanol-System, siehe Abschnitt 3.2



Temperatur: 20 °C


Detektor: L4200 (Merck Hitachi), λ = 220 nm, alternativ K2501 (Knauer),

λ1 = 220 nm, siehe Abschnitt 3.2

K2501 (Knauer), λ2 = 320 nm, siehe Abschnitt 3.2

LaChrom L-7485 (Merck Hitachi), λex = 320 nm, λem = 400 nm, siehe

Abschnitt 3.2

3.5.2 Darstellung von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin

Darstellung

Um das Reaktionsprodukt der Umsetzung von Gly-Ala-Phe mit Glyoxal strukturell

aufzuklären, wurde ein semipräparativer Ansatz angefertigt und das Produkt mittels

semipräparativer RP-HPLC isoliert.

Lösungen

- Natriumphosphatpuffer (PB) pH = 7,4 (100 mM, einfach)


1 M Salzsäure pH-Wert einstellen und mit Reinstwasser auf 100 ml auffüllen.

235 mg (0,72 mmol) Gly-Ala-Phe × 1,9 H2O werden in 100 ml 100 mM Natriumphosphat-

puffer (pH = 7,4, einfach konzentriert) gelöst und mit insgesamt 0,80 mmol Glyoxal bei 37 °C

für 7 d inkubiert. Die Zugabe des Glyoxals (40 %ig) erfolgt gestaffelt in Portion zu 9,1 µl

(0,08 mmol) zweimal täglich in den ersten fünf Tagen. Der pH-Wert wird täglich geprüft und

falls erforderlich mit 4 M Natronlauge wieder auf pH = 7,4 eingestellt. Nach der Inkubation

wird die Lösung unter reduziertem Druck am Vakuumrotationsverdampfer auf ca. 10 ml

eingeengt, mit 1,0 ml Essigsäure angesäuert, membranfiltriert (0,45 µm, regenerierte

Cellulose) und mittels semipräparativer RP-HPLC fraktioniert.

- 80 -



HPLC-Anlage: Knauer, semipräparativ , siehe Abschnitt 3.2



Gradient: isokratisch, 30 % B 30 min


Temperatur: 20 °C

Injektionsvolumen: 500 - 1000 µl

Detektor: K2501 (Knauer), λ = 320 nm, siehe Abschnitt 3.2

Die Produkt-Fraktionen werden vereinigt, am Vakuumrotationsverdampfer unter reduziertem

Druck bei 35 °C auf ca. 20 ml eingeengt und gefriergetrocknet. Das Präparat wird so oft

wieder in Reinstwasser gelöst und gefriergetrocknet, bis der Geruch nach Essigsäure nur noch

schwach wahrnehmbar ist (ca. 5 ×). Die Aufbewahrung des Lyophilisates erfolgt bei – 18 °C.

Analytische Daten N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin: ESI-MS, [M+H]+

m/z = 315,7, [M-H]- m/z = 313,7; 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ / ppm: 1,45 (3H, d, 3J = 7,2 Hz, A-H3), 2,87 (1H, dd, 2J = 13,3 Hz, 3J = 6,5 Hz, F-H3A), 3,02 (1H, dd, 2J = 13,3 Hz, 3J = 4,9 Hz, F-H3B), 4,08 (1H, dd, 3J = 4,9 Hz, 3J = 6,5 Hz, F-H2), 5,38 (1H, q, 3J = 7,2 Hz, A-H2), 7,04 (2H, m, F-H5,5´), 7,07 - 7,10 (2H, m, F-H6,6´), 7,07 - 7,10 (1H, m,

F-H7), 7,30 (1H, d 3J = 4,5 Hz, P-H5), 7,52 (1H, dd, 3J = 4,5Hz, 5J = 1,0 Hz, P-H6), 7,81 (1H,

d, 3J = 7,1Hz, A-NH-F), 7,99 (1H, d, 5J = 1,0 Hz, P-H3), 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)

δ / ppm: 16,29 (q, A-C3), 37,14 (t, F-C3), 52,50 (d, A-C2), 55,50 (d, F-C2), 122,97 (d, P-C5),

125,65 (d, F-C7), 127,40 (d, P-C6), 127,63 (d, F-C6,6´), 129,35 (d, F-C5,5´), 138,77 (s,

F-C4), 147,56 (d, P-C3), 155,03 (s, P-C2), 167,50 (s, A-C1), 172,71 (s, F-C1); UV- and

Fluoreszenz Daten (100 mM PB, pH = 7,0): λUVmax = 322 nm, ε322 = 4900 l⋅mol-1⋅cm-1,

λex, max = 330 nm, λem, max = 395 nm; Elementaranalyse, C16H17N3O4 × 0,05 CH3COOH

× 0,45 H2O (Mbrutto = 326,43 g/mol) berechnet: C = 59,24 %, H = 5,59 %, N = 12,87 %,

gefunden: C = 59,75 %, H = 5,49 %, N = 12,86 %; Ausbeute: 112 mg (molare Ausbeute:

47,9 %); weißer Feststoff, chromatographische Reinheit: > 99 % (HPLC)

- 81 -


Untersuchungen zur Stabilität von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin -

Stabilität bei ausgewählten pH-Werten

Lösungen

- Phosphatpuffer (PB) mit pH = 2,0, 4,0, 7,4 oder 9,1 (100 mM, einfach)


Salzsäure pH-Wert einstellen und mit Reinstwasser auf 100 ml auffüllen.

- N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin-Lösung (5 mM)

1,6 mg Präparat in 1000 µl 100 mM PB definierten pH-Wertes lösen.

Zur Untersuchung der Stabilität bei verschiedenen pH-Werten werden je 450 µl N-[2-(2-Oxo-

2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin-Lösung (5 mM) bei 60 °C für 72 h im Brutschrank

inkubiert. Anschließend wird 1 + 1 mit 100 mM Ameisensäure verdünnt und mittels HPLC

untersucht (siehe Abschnitt 3.5.1). Es wird je pH-Wert eine Doppelbestimmung durchgeführt.

Untersuchungen zur Stabilität von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin -

Stabilität gegenüber Aminoguanidin (AMG)

Lösungen

- 100 mM Phosphatpuffer (PB) (pH = 7,4, 1,25-fach), siehe Abschnitt 3.5.1

- Aminoguanidin (AMG)-Lösung (5 mM, 5-fach)

17,0 mg Aminoguanidin Bicarbonat in 1000 µl Reinstwasser lösen.

- Glyoxal-Lösung (5 mM, 5-fach), siehe Abschnitt 3.5.1

- N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin-Lösung (5 mM)

4,1 mg Präparat in 2000 µl 100 mM PB (pH = 7,4, 1,25-fach) lösen.

Die Inkubationsansätze werden wie in Tab. 3.5.2-1 angegeben angefertigt (jeweils zweifach)

und bei 60 °C für 72 h im Brutschrank inkubiert. Anschließend wird 1 + 1 mit 100 mM

Ameisensäure verdünnt und mittels HPLC untersucht (siehe Abschnitt 3.5.1). Der Umsatz an

2(1H)-Pyrazinon-Peptid wird wie unter 3.5.1 angegeben berechnet.

- 82 -


Tab. 3.5.2-1: Zusammensetzung der Inkubationsansätze.

Probe Pyrazinon-Lsg Puffer AMG-Lsg Glyoxal-Lsg Reinstwasser

Ansatz 400 µl - 100 µl - -

Pyrazinon-Bw* 400 µl - - - 100 µl

AMG-Bw* - 400 µl 100 µl - -

Triazin-Ansatz - 300 µl 100 µl 100 µl -

*Bw: Blindwert, AMG: Aminoguanidin

3.5.3 Darstellung von 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden des Glyoxals

Um die Reaktionsprodukte der Umsetzung von weiteren Peptiden mit Glyoxal strukturell

aufzuklären, wurden entsprechende semipräparative Ansätze angefertigt und die Produkte

mittels Extraktion oder semipräparativer RP-HPLC isoliert.

3-Methyl-2-(2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-valeriansäure und 2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-2-

phenyl-essigsäure

377 mg (2,0 mmol) Gly-Ile und 335 mg (1,5 mmol) Gly-Phe werden jeweils in 25 ml

100 mM Natriumphosphatpuffer (pH = 7,4, einfach konzentriert, siehe Abschnitt 3.5.2) gelöst

und mit insgesamt 2,1 mmol (Gly-Ile-Ansatz) oder 1,6 mmol (Gly-Phe-Ansatz) Glyoxal bei

37 °C für 7 d inkubiert. Die Zugabe des Glyoxals (40 %ig) erfolgt gestaffelt in Portion zu

23,9 µl (0,21 mmol, Gly-Ile-Ansatz) oder 18,0 µl (0,16 mmol, Gly-Phe-Ansatz) zweimal

täglich in den ersten fünf Tagen. Der pH-Wert wird täglich geprüft und falls erforderlich mit

1 M Natronlauge wieder auf pH = 7,4 eingestellt.

Zur Extraktion des 2(1H)-Pyrazinon-Dipeptides wird der pH-Wert des Ansatzes mit 2 M

Kaliumhydrogensulfat-Lösung (ca. 2,4 ml) auf pH = 2,0 eingestellt, und es wird mit 3 × 30 ml

Ethylacetat extrahiert. Das Ausgangsdipeptid verbleibt dabei in der wässrigen Phase. Die

vereinigten Extrakte werden zweimal mit je 10 ml Reinstwasser gewaschen und anschließend

über Natriumsulfat getrocknet. Nach der Abtrennung des Natriumsulfats durch Filtration über

einen Faltenfilter wird das Ethylacetat am Vakuumrotationsverdampfer (30 °C, 78 mbar)

entfernt. Der Rückstand wird in 20 ml Methanol aufgenommen und es wird am

Vakuumrotationsverdampfer wieder zur Trockene eingeengt. Schließlich wird für 5 h im

Vakuum (25 °C, 0,05 mbar) getrocknet.

- 83 -


Analytische Daten 3-Methyl-2-(2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-valeriansäure: ESI-MS, [M+H]+

m/z = 211,10; 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ / ppm: 0,85 (3H, m, I-H5), 0,85 (3H, m,

I-H6), 1,30 (2H, m, I-H4), 1,85 (1H, m, I-H3), 5,02 (1H, d, 3J = 9,8Hz, I-H2), 7,36 (1H, d, 3J = 4,5 Hz, P-H5), 7,67 (1H, d, 3J = 4,5 Hz, 5J = 1,1 Hz, P-H6), 8,04 (1H, d, 5J = 1,1 Hz

P-H3), 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ / ppm: 11,31 (q, I-C5), 15,54 (q, I-C6), 24,74 (t,

I-C4), 36,47 (d, I-C3), 61,43 (d, I-C2), 123,11 (d, P-C5), 128,36 (d, P-C6), 148,08 (d, P-C3),

155,28 (s, P-C2), 170,22 (s, I-C1), UV- and Fluoreszenz Daten: (HPLC-DAD bzw.

Fluoreszenzdetektor, HPLC-Eluent Wasser-Methanol mit 0,1 % (v/v) Ameisensäure):

λUVmax = 326 nm, λem,max = 396 nm bei λex = 320 nm; Ausbeute: 226 mg (molare Ausbeute:

54 %); dunkelbrauner Feststoff, chromatographische Reinheit: > 92 % (HPLC)

Analytische Daten 2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-2-phenyl-essigsäure: ESI-MS, [M+H]+

m/z = 245,07; 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ / ppm: 3,39 (1H, d, 2J = 6,4Hz, F-H3A), 3,48

(1H, d, 2J = 6,4Hz, F-H3B), 5,40 (1H, dd, 3J = 11,3Hz, 3J = 4,9Hz, F-H2), 7,10 (2H, m, F-

H5,5´), 7,17 (1H, m, F-H7), 7,18 (1H, d, 3J = 4,4Hz, P-H5), 7,23 (2H, m, F-H6,6´), 7,47 (1H,

d, 3J = 4,4Hz, P-H6), 7,92 (1H, d, 5J = 0,8Hz, P-H3), 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)

δ / ppm: 34,13 (t, F-C3), 61,21 (d, F-C2), 122,61 (d, P-C5), 126,72 (d, F-C7), 128,46 (d,

F-C6,6´), 128,77 (d, F-C5,5´), 129,63 (d, P-C6), 136,53 (s, F-C4), 148,13 (d, P-C3), 155,14

(s, P-C2), 169,64 (s, F-C1), UV- and Fluoreszenz Daten: (HPLC-DAD bzw.



82 %); dunkelbraunes Öl, chromatographische Reinheit: > 90 % (HPLC)

N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-2-phenyl-acetyl]-alanin

389 mg (1,25 mmol) Gly-Phe-Ala × 1,0 H2O werden in 200 ml 100 mM Natriumphosphat-

puffer (pH = 7,4, 1,25-fach konzentriert, siehe Abschnitt 3.5.1) gelöst und mit 1,25 mmol

Glyoxal (50 ml 5 mM Glyoxal-Lösung [5-fach, siehe Abschnitt 3.5.1]) bei 37 °C für 5 d

inkubiert. Der pH-Wert wird täglich geprüft und falls erforderlich mit 1 M Natronlauge

wieder auf pH = 7,4 eingestellt. Nach der Inkubation wird die Lösung unter reduziertem

Druck am Vakuumrotationsverdampfer auf ca. 25 ml eingeengt, mit 2,5 ml Essigsäure

angesäuert, membranfiltriert (0,45 µm, regenerierte Cellulose) und mittels semipräparativer

RP-HPLC fraktioniert. Die Anwendung des bei den 2(1H)-Pyrazinon-Dipeptiden

- 84 -


angewendeten Extraktionsverfahrens ist nicht möglich, da das Ausgangstripeptid ebenfalls

extrahierbar ist. Die semipräparative RP-HPLC und die Aufarbeitung der Fraktionen wird wie

in Abschnitt 3.5.2 angegeben durchgeführt.

Analytische Daten N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-2-phenyl-acetyl]-alanin: ESI-MS, [M+H]+

m/z = 316,09; 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ / ppm: 1,25 (3H, d, 3J = 7,2 Hz, A-H3), 3,28

(1H, dd, 2J = 14,6 Hz, 3J = 12,0 Hz, F-H3A), 3,42 (1H, dd, 3J = 14,6 Hz, 3J = 4,5 Hz, F-H3B),

4,08 (1H, q, A-H2), 5,86 (1H, dd, 3J = 12,0Hz, 3J = 4,5Hz, F-H2), 7,13 (1H, m, F-H7), 7,22

(2H, m, F-H5,5´), 7,22 (2H, m, F-H6,6´), 7,25 (1H, d, 3J = 4,5 Hz, P-H5), 7,81 (1H, dd, 3J = 4,5 Hz, 5J = 1,0 Hz, P-H6), 7,84 (1H, d, 5J = 1,0 Hz, P-H3), 8,59 (1H, d, 3J = 7,2 Hz,

A-NH-F), 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ / ppm: 17,94 (q, A-C3), 35,55 (t, F-C3), 49,10

(d, A-C2), 57,21 (d, F-C2), 122,27 (d, P-C5), 126,68 (d, F-C7), 128,29 (d, F-C6,6´), 128,71

(d, P-C6), 128,76 (d, F-C5,5´), 136,25 (s, F-C4), 147,38 (d, P-C3), 155,27 (s, P-C2), 167,26

(s, F-C1), 174,20 (s, A-C1), UV- and Fluoreszenz Daten: (HPLC-DAD bzw.



46 %); schwach gelb gefärbter Feststoff, chromatographische Reinheit: > 98 % (HPLC)

N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-acetyl]-glycin

946 mg (5,0 mmol) Gly-Gly-Gly werden in 40 ml 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH = 7,4,

einfach konzentriert, siehe Abschnitt 3.5.2) gelöst und mit insgesamt 5,0 mmol Glyoxal bei

37 °C für 7 d inkubiert. Die Zugabe des Glyoxals (40 %ig) erfolgt gestaffelt in Portion zu

114,3 µl (0,5 mmol) zweimal täglich in den ersten fünf Tagen. Der pH-Wert wird täglich

geprüft und falls erforderlich mit 1 M Natronlauge wieder auf pH = 7,4 eingestellt. Nach der

Inkubation wird die Lösung unter reduziertem Druck am Vakuumrotationsverdampfer auf

ca. 15 ml eingeengt, mit 1,5 ml Essigsäure angesäuert, membranfiltriert (0,45 µm,

regenerierte Cellulose) und mittels semipräparativer RP-HPLC fraktioniert.

Semipräparative RP-HPLC und Aufarbeitung der Fraktionen

siehe Abschnitt 3.5.2, geändert:

Gradient: isokratisch, 100 % A, 30 min

- 85 -


Analytische Daten N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-acetyl]-glycin: ESI-MS, [M+H]+

m/z = 212,08; 1H-NMR (500 MHz, Methanol-d4) δ / ppm: 3,94 (1H, s, G3-H2), 4,80 (1H, s,

G2-H2), 7,47 (1H, d, 3J = 4,4Hz, P-H5), 7,61 (1H, dd, 5J = 1,0Hz, 3J = 4,4Hz, P-H6), 8,13

(1H, s, 5J = 1,0Hz, P-H3), UV-Daten: (0,01 mg/ml in 0,1 % (v/v) Ameisensäure):

λUVmax = 319 nm; Elementaranalyse, berechnet: C = 45,50 %, H = 4,30 %, N = 19,9 %,

gefunden: C = 36,18 %, H = 4,17 %, N = 15,91 %, Gehalt auf C-Basis = 79,5 %; Ausbeute:

770 mg (molare Ausbeute: 58 % [Gehalt auf C-Basis berücksichtigt]); schwach gelb gefärbter

Feststoff, chromatographische Reinheit: > 97 % (HPLC)

3.5.4 Darstellung von N-[2-(5-Methyl-2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-

phenylalanin

Um das Hauptreaktionsprodukt der Umsetzung von Gly-Ala-Phe mit Methylglyoxal

strukturell aufzuklären, wurde ein semipräparativer Ansatz angefertigt und das Produkt

mittels semipräparativer RP-HPLC isoliert.

470 mg (1,44 mmol) Gly-Ala-Phe × 1,9 H2O werden in 200 ml 100 mM Natriumphosphat-

puffer (pH = 7,4) gelöst und mit insgesamt 1,60 mmol Methylglyoxal bei 37 °C für 12 d

inkubiert. Die Zugabe des Methylglyoxals (40 %ig) erfolgt gestaffelt in Portion zu 24,6 µl

(0,16 mmol) einmal täglich in den ersten zehn Tagen. Der pH-Wert wird täglich geprüft und

falls erforderlich mit 4 M Natronlauge wieder auf pH = 7,4 eingestellt. Nach der Inkubation

wird die Lösung unter reduziertem Druck am Vakuumrotationsverdampfer bei 35 °C auf

ca. 20 ml eingeengt, mit Ameisensäure auf pH = 4,7 angesäuert, membranfiltriert (0,45 µm,

regenerierte Cellulose) und mittels semipräparativer RP-HPLC fraktioniert.





Gradient: isokratisch, 35 % B, 30 min


Temperatur: 20 °C

- 86 -



Detektor: K2501 (Knauer), λ1 = 220 nm, siehe Abschnitt 3.2



Abschnitt 3.2

Das Hauptreaktionsprodukt wird anhand der Absorption bei λ = 320 nm und der Fluoreszenz

gesammelt. Die Fraktionen werden vereinigt, am Vakuumrotationsverdampfer unter

reduziertem Druck bei 35 °C auf ca. 20 ml eingeengt und gefriergetrocknet. Das Präparat wird

so oft wieder in Reinstwasser gelöst und gefriergetrocknet, bis der Geruch nach Essigsäure

nur noch schwach wahrnehmbar ist (ca. 5 ×). Die Aufbewahrung des Lyophilisates erfolgt bei

- 18 °C.

Analytische Daten N-[2-(5-Methyl-2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin: ESI-MS,

[M+H]+ m/z = 330,1, [M-H]- m/z = 328,2; 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ / ppm: 1,61

(3H, d, 3J = 7,2 Hz, A-H3), 2,32 (1H, s, P-5Me-H), 3,02 (1H, dd, 2J = 14,0 Hz, 3J = 8,9 Hz,

F-H3A), 3,27 (1H, dd, 2J = 14,0Hz, 3J = 8,9 Hz, F-H3B), 4,73 (1H, dd, 3J = 8,9 Hz, 3J = 4,9 Hz , F-H2), 5,51 (1H, q, 3J = 7,2 Hz , A-H2), 7,19-7,26 (2H, m, F-H5,5´), 7,19-7,26

(2H, m, F-H6,6´), 7,19-7,26 (1H, m, F-H7), 7,36 (1H , s, P-H6), 8,06 (1H , s, P-H3), 13C-NMR (125 MHz, DMSO) δ / ppm: 16,45 (q, A-C3), 19,51 (q, P-C5Me), 38,27 (t, F-C3),

54,67 (d, A-C2), 55,20 (d, F-C2), 124,74 (d, P-C6), 127,73 (d, F-C7), 129,43 (d, F-C6,6´),

130,37 (d, F-C5,5´), 134,06 (s, P-C5), 138,17 (s, F-C4), 147,72 (d, P-C3), 156,63 (s, P-C2),

170,87 (s, A-C1), 174,32 (s, F-C1); UV- and Fluoreszenz Daten (100 mM PB, pH = 7,0):

λUVmax = 336 nm, ε336 = 4600 l⋅mol-1⋅cm-1, λex, max = 340 nm, λem, max = 405 nm; Elementar-

analyse, C17H19N3O4 × 0,13 CH3COOH × 0,50 H2O (Mbrutto = 346,17 g/mol) berechnet:

C = 59,87 %, H = 5,97 %, N = 12,14 %, gefunden: C = 59,72 %, H = 5,90 %, N = 12,17 %;

Ausbeute: 29 mg (molare Ausbeute: 5,8 %); weißer Feststoff, chromatographische Reinheit:

> 99 % (HPLC)

- 87 -


3.6 Analyse peptidgebundener 2(1H)-Pyrazinone nach Salzsäurehydrolyse

3.6.1 Säurehydrolyse von 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden

Lösungen

- N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin -Lösung

3,4 mg N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin × 0,05 Essigsäure

× 0,45 Wasser (Mbrutto = 326,43 g/mol) in 3000 µl Reinstwasser lösen.

- N-[2-(5-Methyl-2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin -Lösung

3,6 mg N-[2-(5-Methyl-2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin × 0,13 Essig-

säure × 0,50 Wasser (Mbrutto = 346,17 g/mol) in 3000 µl Reinstwasser lösen.

- Citrat-Puffer (2 M, pH = 9,0)

4,2 g (20,0 mmol) Citronensäure Monohydrat in ca. 5 ml Reinstwasser lösen, mit 4 M

Natronlauge pH = 9,0 einstellen und mit Reinstwasser auf 10 ml auffüllen.

Salzsäurehydrolyse

Es werden je 900 µl 2(1H)-Pyrazinon-Peptid-Lösung und 900 µl 12 M Salzsäure (Baker, ACS

quality) in ein 6 ml-Hydrolysegefäße pipettiert, der Ansatz wird gemischt, das Gefäß wird mit

Stickstoff gespült und fest verschlossen. Die Hydrolyse erfolgt bei 110 °C im Sandbad im

Trockenschrank für 16 h, 23 h oder 48 h.

Aufarbeitung - Zentrifugalverdampfer

143 µl (ca. 250 nmol) N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin-Hydrolysat bzw.

144 µl (ca. 250 nmol) N-[2-(5-Methyl-2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin-

Hydrolysat werden je in Eppendorf-Gefäß pipettiert und im Zentrifugalverdampfer zur

Trockene eingeengt. Die Proben werden in 500 µl Citrat-Puffer (0,2 M, pH = 2,2, Puffer 1

Tab. 3.2.3-1) im Ultraschallbad gelöst und anschließend membranfiltriert (regenerierte

Cellulose; 0,2 µm). Es werden je 20 µl (ca. 10 nmol) am Aminosäureanalysator (3.2.3) sowie

mittels RP-HPLC untersucht.

- 88 -


Aufarbeitung – Abpuffern der Säure mit Citrat-Puffer

143 µl (ca. 250 nmol) N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin-Hydrolysat bzw.

144 µl (ca. 250 nmol) N-[2-(5-Methyl-2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin-

Hydrolysat werden je in ein Eppendorf-Gefäß pipettiert. Die Proben werden jeweils mit dem

gleichen Volumen Citratpuffer (2 M, pH = 9) versetzt, mit Reinstwasser auf 500 µl ergänzt

(resultierender pH = 1 bis 2) und membranfiltriert (regenerierte Cellulose; 0,2 µm). Es werden

je 20 µl (ca. 10 nmol) am Aminosäureanalysator (3.2.3) sowie mittels RP-HPLC untersucht.

Die aufgearbeiteten Lösungen der 16 h-Hydrolysate werden weiterhin mittels LC-ESI-MS

analysiert.

Aufarbeitung – Extraktion der Abbauprodukte im Alkalischen

500 µl Hydrolysat werden mit 4 M Natronlauge alkalisch gemacht (ca. pH = 12).

Anschließend wird drei mal mit je 300 µl Chloroform (p.a.) extrahiert. Die organischen

Phasen werden mittels Pipette abgenommen und vereinigt. Der so erhaltene Extrakt wird im

Stickstoffstrom zur Trockene eingeengt. Dabei wird nur so lang als notwendig mit Stickstoff

gespült. Der Rückstand wird anschließend sofort in 500 µl Fließmittel (0,1 % Ameisensäure

in Reinstwasser (v/v)) aufgenommen. Die Isolierung wird mittels HPLC kontrolliert.

RP-HPLC




Gradient: linear ansteigend, von 8 auf 22 % B in 25 min (Pyrazinon-Hydrolysate)

linear ansteigend, von 15 auf 42 % B in 35 min (5-Methyl-pyrazinon-

Hydrolysate)


Temperatur: 20 °C





Abschnitt 3.2

- 89 -


LC-ESI-MS

Proben: 16 h-Hydrolysate

HPLC-Anlage: Agilent 1100 series, siehe Abschnitt 3.2.2

Säule: SA1, Knauer Eurospher 100-C18, siehe Abschnitt 3.2.1

Eluenten-System: E5, Ameisensäure-Methanol-System, siehe Abschnitt 3.2.1

Gradient: linear ansteigend, von 8 auf 34 % B in 25 min (Pyrazinon-Hydrolysate)

linear ansteigend, von 15 auf 42 % B in 35 min (5-Methyl-pyrazinon-

Hydrolysate)


Temperatur: 20 °C


Detektor: DAD (Agilent 1100 series), λ1 = 220 nm, λ1 = 320 nm, s. Absch. 3.2.2

ESI-TOF-MS (Applied Biosystems), siehe Abschnitt 3.2.2

3.6.2 Darstellung von 2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionsäure und N1-Ethyl-

2(1H)-pyrazinon

Zur Aufklärung der Hydrolyseprodukte von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-

phenylalanin wird 2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionsäure synthetisiert und anschließend

mit Salzsäure behandelt. Das resultierende Produkt N1-Ethyl-2(1H)-pyrazinon wird im

semipräparativen Maßstab in chromatographisch reiner Form gewonnen.

730,7 mg (5,0 mmol) Gly-Ala werden in 70 ml 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH = 7,4,

siehe Abschnitt 3.5.1) gelöst und mit insgesamt 571 µl (5,0 mmol) Glyoxal bei 37 °C für 8 d

inkubiert. Die Zugabe des Glyoxals (40 %ig) erfolgt gestaffelt in Portion zu 57,1 µl

(0,5 mmol) zweimal täglich in den ersten fünf Tagen. Der pH-Wert wird täglich geprüft und

falls erforderlich mit 1 M Natronlauge wieder auf pH = 7,4 eingestellt.

Nach der Inkubation wird der Ansatz (ca. 70 ml) unter Kühlung mit 70 ml 12 M Salzsäure

p. a. gemischt und auf 20-ml-Hydrolysegefäße verteilt. Nach dem Spülen mit Stickstoff

werden die Gefäße fest verschlossen und die Hydrolyse erfolgt bei 110 °C für 48 h im

Sandbad im Trockenschrank.

- 90 -


Der pH-Wert des Hydrolysates (ca. 140 ml) wird unter Eiswasserkühlung mit 4 M

Natronlauge auf pH = 11 bis 12 eingestellt. Die Lösung wird 3 × mit je 50 ml Chloroform

(reinst) im Schütteltrichter extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit 50 ml

Reinstwasser gewaschen und anschließend über Natriumsulfat (wasserfrei) getrocknet. Der

Extrakt wird am Vakuumrotationsverdampfer (ca. 180 mbar, 25 °C) fast bis zur Trockne

eingeengt. Restliches Chloroform wird anschließend mit Stickstoff abgeblasen. Das Präparat

wird bei – 18 °C im Gefrierschrank aufbewahrt.

RP-HPLC

Proben: - 2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionsäure-Ansatz

- N1-Ethyl-2(1H)-pyrazinon-Präparat

Durchführung: siehe Abschnitt 3.6.1, geändert:


Analytische Daten N1-Ethyl-2(1H)-pyrazinon: ESI-MS, [M+H]+ m/z = 125,09; 1H-NMR

(500 MHz, CDCl3) δ / ppm: 1,36 (3H, t, 3J = 7,26 Hz, Et-H2), 3,92 (2H, q, 3J = 7,26 Hz,

Et-H1), 7,30 (1H, d, 3J = 4,4 Hz, P-H5), 8,11 (1H, d, 5J = 1,0 Hz, P-H3), 7,09 (1H, dd, 3J = 4,4 Hz, 5J = 1,0 Hz, P-H6), 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ / ppm: 13,98 (q, Et-C2),

44,45 (t, Et-C1), 123,95 (d, P-C5), 128,03 (d, P-C6), 149,58 (d, P-C3), 156,04 (s, P-C2); UV-

and Fluoreszenz Daten (0,01 mg / ml 0,1 % (v/v) Ameisensäure): λUVmax = 318 nm,

ε336 = 3535 l⋅mol-1⋅cm-1, λex, max = 360 nm, λem, max = 420 nm; Ausbeute: 17,6 mg (molare

Ausbeute: 2,0 %); brauner, schwach grüner Feststoff, chromatographische Reinheit: > 98 %

(HPLC)

3.6.3 Einfluss der Matrix auf die Säurehydrolyse von 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden

Lösungen

- N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin–Lösung (1 mg / ml)

10 mg N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin × 0,05 Essigsäure

× 0,45 Wasser (Mbrutto = 326,43 g / mol) in 10 ml Reinstwasser lösen.

- Citrat-Puffer (2 M, pH = 9,0)

- 91 -


Durchführung

Entsprechend Tab. 3.6.3-1 werden die Zusätze in 6 ml Hydrolysegefäße eingewogen und mit

1,000 ml 2(1H)-Pyrazinon-Lösung oder Reinstwasser sowie mit je 1,000 ml 12 M Salzsäure

versetzt (Endkonzentration der Salzsäure: 6 M). Die Ansätze werden gemischt, die Gefäße

werden mit Stickstoff gespült und fest verschlossen. Die Hydrolyse erfolgt bei 110 °C mit den

angegebenen Zeiten im Sandbad im Trockenschrank.

Tab. 3.6.3-1: Zusammensetzung der zu Hydrolyse eingesetzten Lösungen.

Probe Zusammensetzung Zeit [h]

Pyrazinon 1 ml Pyrazinon-Lsg 16, 23, 48

Pyrazinon + Glucose 10 1 ml Pyrazinon-Lsg + 10 mg Glucose 16, 23, 48

Pyrazinon + Natriumazid 1 ml Pyrazinon-Lsg + 10 mg Natriumazid 16, 23, 48

Pyrazinon + Mercaptoethanol 1 ml Pyrazinon-Lsg + 10 mg Mercaptoethanol 16, 23, 48

Pyrazinon + Cornflakes 1 ml Pyrazinon-Lsg + 10 mg Cornflakes 16, 23, 48

Cornflakes 1 ml Reinstwasser + 10 mg Cornflakes 16, 23, 48

Pyrazinon + Insulin 1 ml Pyrazinon-Lsg + 2 mg Insulin 23

Pyrazinon + Glucose 1 1 ml Pyrazinon-Lsg + 1 mg Glucose 16

Pyrazinon + Glucose 1 +

Mercaptoethanol

1 ml Pyrazinon-Lsg + 1 mg Glucose +

10 mg Mercaptoethanol

16

RP-HPLC der Hydrolysate

Von den Hydrolysaten wird jeweils 1 ml abgenommen, es wird mit 6 M Natronlauge pH = 2

bis 4 eingestellt, die Lösung wird membranfiltriert (regenerierte Cellulose, 0,45 µm) und

anschließend mittels RP-HPLC untersucht.

Durchführung der RP-HPLC:

siehe Abschnitt 3.6.1, geändert: Injektionsvolumen: 50 µl

- 92 -


3.7 Untersuchungen zur Reaktion von Insulin mit Glyoxal

Inkubation von Insulin mit Glyoxal

Lösungen

- Insulin-Lösung (0,017 mM, 10-fach)

2,0 mg Rinderinsulin in 2000 µl 2 mM Salzsäure lösen.

- Glyoxal-Lösung (0,05 mM, 10-fach)

57,2 µl Glyoxal-Lösung (40 %) im Maßkolben mit Reinstwasser auf 100 ml ergänzen

und ein Aliquot dieser Lösung 1 + 9 mit Reinstwasser verdünnen.

- Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH = 7,4, 1,25-fach), siehe 3.5.1

- 10 mM Phosphatpuffer (PB) (pH = 7,4, 1,25-fach), siehe 3.5.1

Durchführung

Die Inkubationsansätze werden wie in Tab. 3.7-1 angegeben angefertigt (jeweils dreifach) und

bei 37 °C für 15 d im Brutschrank inkubiert. Anschließend werden die Ansätze entnommen,

auf Raumtemperatur abgekühlt und zum Abstoppen der Reaktion werden 33 µl 10 %ige

Ameisensäure (2,65 M) je 1000 µl Ansatz zugegeben (pH = 2,9, gemessen). Ansätze, die im

Anschluss reduziert werden sollen, dürfen nicht abgestoppt werden. Nach Membranfiltration

mittels Spritzenfilter (regenerierte Cellulose, 0,2 µm, Cellulosemischester sind ungeeignet)

werden die Proben unverdünnt mittels HPLC analysiert. Der pH-Wert wird vor und nach der

Inkubation in separaten Ansätzen kontrolliert.

Tab. 3.7-1: Inkubationsansätze von Insulin mit Glyoxal

Probe Puffer Insulin-Lösung Glyoxal-Lösung Reinstwasser

Ansatz 800 µl 100 µl 100 µl -

Insulin-Bw* 800 µl 100 µl - 100 µl

Glyoxal-Bw* 800 µl - 100 µl 100 µl

* Bw: Blindwert

- 93 -


UV-Spektroskopie von Insulin

Im Hinblick auf mögliche Einflüsse des Puffers auf die Struktur von Insulin wird das

UV-Spektrum von Insulin in PBS und in 10 mM Phosphatpuffer aufgenommen.

Lösungen

- PBS (1,25-fach) und 10 mM Phosphatpuffer (PB, 1,25-fach), siehe Abschnitt 3.5.1

- PBS (einfach) zum Verdünnen

8,00 ml PBS (1,25-fach) + 1,00 ml 2 mM Salzsäure + 1,00 ml Reinstwasser

- 10 mM Phosphatpuffer (PB, einfach) zum Verdünnen

8,00 ml 10 mM PB (1,25-fach) + 1,00 ml 2 mM Salzsäure + 1,00 ml Reinstwasser

- 0,1000 mg/ml Insulin in PBS

800 µl PBS (1,25-fach) + 100 µl Insulin-Lösung (0,017 mM, 10-fach, in 2 mM Salz-

säure) + 100 µl Reinstwasser

- 0,0500 und 0,0125 mg/ml Insulin in PBS

500 µl bzw. 125µl der 0,1000 mg/ml Insulin-Lösung in PBS werden mit PBS

(einfach) auf 1000 µl ergänzt.

- 0,1000 mg/ml, 0,0500 und 0,0125 mg/ml Insulin in 10 mM Phosphatpuffer

Die Herstellung erfolgt analog den Lösungen in PBS.

Durchführung

siehe Abschnitt 3.2.8, Lösung in Referenzküvette: jeweiliger Puffer (einfach) zum Verdünnen

Charakterisierung der Inkubationsansätze mittels RP-HPLC

Proben: Glyoxal-Insulin-Inkubationsansätze, siehe oben


Säule: Säule SA3, Polymer Laboratories, PLRP-S, siehe Abschnitt 3.2

Eluenten-System: E6, Ameisensäure-Acetonitril-System, siehe Abschnitt 3.2



Temperatur: 20 °C


- 94 -





Abschnitt 3.2

Der Umsatz an Insulin und die dazugehörige Standardabweichung wird wie folgt berechnet:

%100100[%] ×=ohne

mit

AAUmsatz

22

100 ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛××=

ohne

ohne

mit

mit

ohne

mit

As

As

AAs

Amit Peakfläche (λ = 220 nm) des Insulin-Peaks nach Inkubation mit Glyoxal

Aohne Peakfläche (λ = 220 nm) des Insulin-Peaks nach Inkubation ohne Glyoxal (Blindwert)

Charakterisierung der Inkubationsansätze mittels RP-HPLC und LC-ESI-MS

Proben: Glyoxal-Insulin-Inkubationsansätze, siehe oben






Temperatur: 20 °C



ESI-TOF-MS (Applied Biosystems), Flussrate zum Massenspektrometer

ca. 0,5 ml/min, siehe Abschnitt 3.2.2

Untersuchungen mittels Aminosäureanalyse

Lösungen, siehe oben Inkubation von Insulin mit Glyoxal

- 95 -


Probenvorbereitung

Es wird ein Inkubationsansatz bestehend aus 16,0 ml PBS, 2,0 ml Insulin-Lösung (0,017 mM,

10-fach, in 2 mM Salzsäure) und 2,0 ml Glyoxal-Lösung (0,05 mM, 10-fach) angefertigt. Die

Inkubation erfolgt bei 37 °C für 15 d im Brutschrank. Anschließend wird mit 66 µl

Ameisensäure (100 %ig) angesäuert und die Probe wie in Abschnitt 3.8.1 beschrieben

angereichert. Zum Vergleich wird in der gleichen Weise ein Ansatz von Insulin ohne

Glyoxal-Zugabe (dafür Reinstwasser) angefertigt, inkubiert und angereichert. Die erhaltenen

Eluate werden im Spitzkolben am Rotationsverdampfer (30 °C, 12 mbar) zur Trockene

eingeengt.

Die trockenen Rückstände werden in je 2,0 ml 6 M Salzsäure gelöst, die Lösungen werden in

6 ml-Hydrolysegefäße überführt, die Gefäße werden mit Stickstoff gespült und fest

verschlossen. Die Hydrolyse erfolgt für 23 h bei 110 °C im Sandbad im Trockenschrank. Im

Anschluss werden je 1,5 ml Hydrolysat im Zentrifugalverdampfer zur Trockne eingeengt.

Weiterhin wird Insulin direkt zur Salzsäurehydrolyse eingesetzt. Dazu werden 2,0 mg Insulin

mit 2,0 ml 6 M Salzsäure versetzt und wie oben beschrieben hydrolysiert und getrocknet.

Anschließend werden die Proben in je 300 µl 0,2 M Citratpuffer (pH = 2,2, Puffer 1, siehe

Abschnitt 3.2.3) im Ultraschallbad gelöst. Nach Verdünnung mit 0,2 M Citratpuffer werden

20 µl (1 + 2 Verdünnung) oder 40 µl (1 + 9 Verdünnung) mittels Aminosäureanalyse

analysiert (siehe Abschnitt 3.2.3).

3.8 Untersuchungen zur Reaktion von Insulin mit Glyoxal nach Reduktion

und Blockierung der Sulfhydrylgruppen

3.8.1 Reduktion und Blockierung der Sulfhydrylgruppen

Um die beiden Ketten des Insulins zu trennen, werden die Disulfidbrücken mit Dithiothreitol

(DTT) reduziert und die freigesetzten Sulfhydrylgruppen durch Umsetzung mit Iodacetamid

blockiert. Die Durchführung erfolgt entsprechend einem modifizierten Protokoll von Gray

(1990).

Lösungen

- Dithiothreitol (DTT)-Lösung (30 mM, 25-fach)

18,5 mg 1,4-Dithiothreitol in 160 µl Reinstwasser frisch vor Gebrauch lösen.

- 96 -


- Tris-(carboxyethyl)phosphin (TCEP)-Lösung (30 mM, 25-fach)

34,4 mg Tris-(carboxyethyl)phosphin-Hydrochlorid in 160 µl Reinstwasser frisch vor

Gebrauch lösen.

- Natrium-EDTA-Lösung (2 mM, 10-fach)

74,5 mg Di-Natrium-EDTA-dihydrat in 10 ml Reinstwasser lösen.

- Tris-Acetat-Puffer (0,5 M, pH = 8,0)

1,515 g Tris-(hydroxymethyl)aminomethan in ca. 20 ml Reinstwasser lösen, 2,5 ml

2 mM Natrium-EDTA-Lösung (10-fach) hinzugeben, mit Essigsäure pH = 8,0

einstellen und mit Reinstwasser auf 25 ml ergänzen. Unmittelbar vor Gebrauch

5 - 10 min Stickstoff durch die Lösung blubbern lassen.

- Citronensäure-Lösung (0,5 M)

1,05 g Citronensäure-Monohydrat in 10 ml Reinstwasser lösen.

Reduktion

240 µl einer nicht abgestoppten Insulin-Glyoxal-Inkubation werden mit 10 µl DTT- bzw.

TCEP-Lösung (jeweils 30 mM, 25-fach) gemischt. Zur vollständigen Reduktion wird 50 min

(DTT) bzw. 20 h (TCEP) bei Raumtemperatur im Dunklen aufbewahrt.

Blockierung mit Iodacetamid

100 mg Iodacetamid und 200 µl Tris-Acetat-Puffer werden in ein Eppendorf-Gefäß (1,5 ml)

geben. Das Iodacetamid wird unter gelegentlichem Schütteln im Trockenschrank bei 60 °C

innerhalb von 10 min gelöst. Nach kurzem Abkühlen (ca. 30 °C) werden 250 µl der zuvor

reduzierten Probe mit einer Spritze (feine Nadel) direkt in die Iodacetamid-Lösung

eingespritzt. Es wird intensiv gemischt und nach 35 s wird die Reaktion mit 400 µl 0,5 M

Citronensäure abgestoppt.

Anreicherung an einer C18-Phase

Für einige Folgeuntersuchungen ist eine Anreicherung als auch die Abtrennung der

überschüssigen Reagenzien erforderlich. Die Festphasenextraktion erfolgt entsprechend den

Angaben in Tab. 3.8.1-1. Falls notwendig, wird der pH-Wert der aufzugebenden Lösung vor

der Probenaufgabe mit 10 %iger Ameisensäure auf pH < 3 gebracht.

Zur guten Handhabbarkeit wird auf die Kartusche (Sep-Pak® C18-Kartuschen, 360 mg,

Waters, WAT051910) eine 2 ml-Einwegspritze ohne Stempel gesteckt. Durch das Einbringen

- 97 -


einer gekürzte 200 µl-Eppendorfspitze (gelb) in den Auslauf der Kartusche wird die Flussrate

reproduzierbar gestaltet, sie beträgt ca. 0,6 ml/min. Nach Aufgabe der Elutionslösung werden

die ersten 0,5 ml Eluat verworfen. Das darauffolgende Eluat (ca. 1,5 ml) wird aufgefangen.

Tab. 3.8.1-1: Protokoll zur Anreicherung.

Schritt Lösung Volumen [ml]

Konditionierung Acetonitril

0,1 % Ameisensäure (v/v)

2,0

2,0

Probeaufgabe Probelösung, pH < 3 1,0 bis 20,0

Waschen 0,1 % Ameisensäure (v/v) 4,0

Elution 0,1 % Ameisensäure in 50 % Acetonitril (v/v) 2,0

Analyse mittels RP-HPLC

Proben: - Proben, reduziert und blockiert, ohne Anreicherung (siehe oben) für

Reaktivitätsvergleich A- vs. B-Kette

- Proben, reduziert und blockiert, mit Anreicherung (siehe oben)

Trennsystem und Parameter siehe Abschnitt 3.7, geändert:


Injektionsvolumen: 100 µl oder 500 µl

Der Gesamtumsatz je Kette wird wie folgt berechnet:

%100100[%] ×=ohne

mit

AAKettejetzGesamtumsa

Amit Peakfläche (λ = 220 nm) des Peaks der jeweiligen Kette nach Inkubation mit Glyoxal

Aohne Peakfläche (λ = 220 nm) des Peaks der jeweiligen Kette nach Inkubation ohne

Glyoxal (Blindwert)

Der Umsatz zur pyrazinon-modifizierten Kette wird wie folgt berechnet:

%100[%] ×++

=−NPorgPyr

Pyr

AAAA

KettePyrazinonzurUmsatz

- 98 -


APyr Peakfläche (λ = 220 nm) des Peaks der pyrazinon-modifizierten Kette

Aorg Peakfläche (λ = 220 nm) des Peaks der orginären (nicht umgesetzten) Kette

ANP Peakfläche (λ = 220 nm) eines Nebenproduktpeaks (nur bei B-Kette)

(APyr, ARes, ANP innerhalb eines Chromatogramms bestimmt)

Analyse mittels LC-ESI-MS

Lösungen

siehe oben und Abschnitt 3.7

Inkubation

Es wird ein Inkubationsansatz bestehend aus 16,0 ml PBS, 2,0 ml Insulin-Lösung (0,017 mM,

10-fach, in 2 mM Salzsäure) und 2,0 ml Glyoxal-Lösung (0,05 mM, 10-fach) angefertigt. Die

Inkubation erfolgt bei 37 °C für 15 d im Brutschrank.

Probenvorbereitung - Verfahren mit Anreicherung

20 ml des Inkubationsansatzes werden mit 833 µl DTT-Lösung (30 mM, 25-fach) gemischt.

Die Reduktion erfolgt bei Raumtemperatur im Dunklen für 30 min. Zur Alkylierung werden

3,0 g Iodacetamid und 6,0 ml Tris-Acetat-Puffer in einen Spitzkolben (50 ml) gegeben. Das

Iodacetamid wird unter gelegentlichem Umschwenken im Trockenschrank bei 60 °C

innerhalb von 10 min gelöst. Nach kurzem Abkühlen (ca. 30 °C) wird die zuvor reduzierte

Probe in die Iodacetamid-Lösung gegeben. Es wird intensiv gemischt und nach 35 s wird die

Reaktion mit 12,0 ml 0,5 M Citronensäure abgestoppt. Anschließend erfolgt sofort die oben

beschriebene Anreicherung. Das Eluat (1,5 ml) wird für die Analyse mittels LC-ESI-MS

eingesetzt.

Probenvorbereitung - Verfahren ohne Anreicherung

Die Proben werden wie oben beschrieben reduziert und blockiert. Die Derivatisierung wird

jedoch mit 576 µl Inkubationsansatz, 24 µl DTT-Lösung und 200 mg Iodacetamid in 400 µl

Tris-Acetat-Puffer durchgeführt. Zum Abstoppen werden 40 µl Ameisensäure (100 %ig)

verwendet. Die Proben werden anschließend sofort intensiv geschüttelt und mittels

LC-ESI-MS analysiert. Pro LC-ESI-MS-Lauf sind vier Derivatisierungen vorzunehmen.

- 99 -


LC-ESI-MS

Proben: Reduziert und blockiert, Eluat nach Anreicherung, siehe oben

Trennsystem und Parameter: siehe Abschnitt 3.7, geändert:



Proben: Proben, reduziert und blockiert, ohne Anreicherung, siehe oben

Trennsystem und Parameter: siehe Abschnitt 3.7, geändert:

Gradient: isokratisch 5 % B, 25 min, Flussrate: 1,0 ml/min, anschließend

linear ansteigend, von 5 auf 42 % B in 30 min, Flussrate: 0,5 ml/min


3.8.2 Untersuchungen nach enzymatischer Hydrolyse

Lösungen

- Natriumchlorid-Lösung (0,2 M)

116,9 mg Natriumchlorid in 10 ml Reinstwasser lösen.

- di-Ammoniumhydrogenphosphat-Puffer (1 M)

1,32 g di-Ammoniumhydrogenphosphat in 10 ml Reinstwasser lösen.

- Endoproteinase Glu-C-Lösung (ca. 1 U/µl)

1,0 mg Endoproteinase Glu-C aus Staphylococcus aureus V8 (E.C. 3.4.21.19) in

500 µl Natriumchlorid-Lösung (0,2 M) rekonstituieren. Aufbewahrung kurzfristig bei

5 - 8 °C, längerfristig bei – 18 °C.

- weitere Lösungen, siehe Abschnitt 3.7 und 3.8.1

Probenvorbereitung

Es wird ein 20 ml-Inkubationsansatz von Insulin mit Glyoxal wie in Abschnitt 3.8.1

beschrieben angefertigt, inkubiert, reduziert, blockiert und angereichert. Bei der Anreicherung

werden 1,5 ml Eluat erhaltenen. Zur enzymatischen Hydrolyse werden davon 750 µl mit

400 µl di-Ammoniumhydrogenphosphat-Puffer (1 M) gemischt. Die Hydrolyse erfolgt nach

Zugabe von 50 µl Endoproteinase Glu-C-Lösung (ca. 1 U/µl) mit leichter Bewegung im

Minishaker bei Raumtemperatur für 20 h. Zum Abstoppen werden 120 µl Ameisensäure

- 100 -


(100 %ig) zugegeben. Nach Membranfiltration (regenerierte Cellulose, 0,45 µm) wird mittels

LC-ESI-MS analysiert.

LC-ESI-MS

Proben: siehe oben






Temperatur: 20 °C




3.9 Untersuchungen zum Nachweis von N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinonen nach

Salzsäurehydrolyse des glyoxal-modifizierten Insulins

Darstellung von N1-(2-Methyl-butyl)-2(1H)-pyrazinon und 3-Benzyl-N1-isobutyl-

2(1H)-pyrazinon

Die nach Salzsäurehydrolyse von glyoxal-modifizierten Insulin erwarteten N1-Alkyl-

2(1H)-pyrazinone werden im analytischen Maßstab als Vergleichssubstanzen dargestellt.

Dazu werden die Dipeptide Gly-Ile und Phe-Val mit Glyoxal zu den entsprechenden

2(1H)-Pyrazinon-Dipeptiden umgesetzt. Deren Behandlung mit Salzsäure liefert schließlich

die N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinone.

Lösungen

- Phosphatpuffer (100 mM, 1,66-fach)


konzentrierter Salzsäure pH = 7,4 einstellen und mit Reinstwasser im Maßkolben auf

100 ml auffüllen.

- 101 -


- Phe-Val-Lösung (10 mM, 1,66-fach)

8,8 mg Phe-Val in 2 ml Phosphatpuffer (100 mM, 1,66-fach) lösen.

- Gly-Ile-Lösung (10 mM, 1,66-fach)

6,5 mg Phe-Val in 2 ml Phosphatpuffer (100 mM, 1,66-fach) lösen.

- Glyoxal-Lösung (10 mM, 2,5-fach)

143 µl Glyoxal-Lösung (40%) mit Reinstwasser auf 50 ml ergänzen.

Durchführung

900 µl Phe-Val- und 900 µl Gly-Ile-Lösung werden jeweils mit insgesamt 600 µl Glyoxal-

Lösung (10 mM, 2,5-fach) versetzt und bei 37 °C für 3 d im Brutschrank inkubiert. Die

Zugabe der Glyoxal-Lösung erfolgt gestaffelt in Portion zu 300 µl an den ersten beiden

Tagen. Anschließend wird der Umsatz an Peptid mittels RP-HPLC kontrolliert. In der

gleichen Weise wird eine Blindprobe aus 900 µl Peptid-Lösung und insgesamt 600 µl

Reinstwasser inkubiert.

Jeweils 1,5 ml der inkubierten Lösungen werden im Hydrolyseröhrchen mit 1,5 ml 12 M

Salzsäure (p.a.) gemischt, die Gefäße werden mit Stickstoff gespült und fest verschlossen. Die

Hydrolyse erfolgt bei 110 °C für 48 Stunden im Sandbad im Trockenschrank. Anschließend

wird 1,0 ml Hydrolysat entnommen, mit 6 M Natronlauge wird pH = 2 bis 4 eingestellt, die

Lösung wird membranfiltriert (regenerierte Cellulose, 0,45 µm) und mittels RP-HPLC und

LC-ESI-MS untersucht.

RP-HPLC


Säule: Säule SA1, Knauer (Berlin), Eurospher 100-C18, siehe Abschnitt 3.2


Gradient:

Glyoxal-Gly-Ile-Ansatz: linear ansteigend, von 8 auf 34 % B in 25 min, anschließend:

linear ansteigend auf 68 % B in 5 min, isokrat. 68 % B 5 min

Glyoxal-Phe-Val-Ansatz: linear ansteigend, von 21 auf 64 % B in 25 min, anschließend:

linear ansteigend auf 68 % B in 5 min, isokrat. 68 % B 5 min

Proben nach Hydrolyse: linear ansteigend, von 43 auf 68 % B in 30 min, anschließend:

isokratisch 68 % B 5 min


- 102 -


Temperatur: 20 °C





Abschnitt 3.2

LC-ESI-MS


Säule: Säule SA2, Knauer (Berlin), Eurospher 100-C18, siehe Abschnitt 3.2


Gradient: linear ansteigend, von 43 auf 68 % B in 30 min, anschließend isokrat.

68 % B 5 min


Temperatur: 20 °C




Untersuchungen am glyoxal-modifizierten Insulin

Lösungen

siehe Abschnitt 3.7 und 3.8.1

Inkubation, Anreicherung, Salzsäurehydrolyse, Probenvorbereitung

Es wird ein Inkubationsansatz bestehend aus 80,0 ml PBS, 10,0 ml Insulin-Lösung

(0,017 mM, 10-fach, in 2 mM Salzsäure) und 10,0 ml Glyoxal-Lösung (0,05 mM, 10-fach)

angefertigt. Die Inkubation erfolgt bei 37 °C für 15 d im Brutschrank. Anschließend werden

vier 20 ml-Portionen entnommen. Jede Portion (= 2 mg Insulin) wird mit 66 µl Ameisensäure

(100 %ig) angesäuert (pH < 3,0) und an je einer Kartusche wie in Abschnitt 3.8.1 beschrieben

angereichert.

- 103 -


Die Eluate von jeweils zwei Anreicherungen (= 4 mg Insulin) werden im Spitzkolben

vereinigt. Die beiden resultierenden Ansätze werden am Rotationsverdampfer (30 °C,

12 mbar) auf ca. 500 µl eingeengt. Das Volumen der Rückstände wird mit einer Eppendorf-

Pipette bestimmt und jeweils auf 1000 µl mit Reinstwasser ergänzt. Zu jedem Ansatz werden

1000 µl 12 M Salzsäure gegeben (Salzsäure-Endkonzentration im Ansatz: 6 M). Einem

Ansatz werden 30 µl (33,6 mg) Mercaptoethanol hinzugefügt. Die Gefäße werden mit

Stickstoff gespült und fest verschlossen. Die Hydrolyse erfolgt bei 110 °C für 48 h (ohne

Mercaptoethanol) oder 23 h (mit Mercaptoethanol) im Sandbad im Trockenschrank.

Anschließend werden je 1,0 ml Hydrolysat entnommen, mit 6 M Natronlauge wird pH = 2 bis

4 eingestellt, die Lösungen werden membranfiltriert (regenerierte Cellulose, 0,45 µm) und

mittels RP-HPLC und LC-ESI-MS untersucht.

RP-HPLC und LC-ESI-MS

Anlagen und Trennparameter: siehe oben (Proben nach Salzsäurebehandlung der

2(1H)-Dipeptid-Pyrazinone), geändert:


3.10 Vergleich der Reaktivität von Lysin, Arginin und dem N-Terminus

unter den Bedingungen der Inkubation von Insulin anhand von Peptiden

Nα-Hippuryllysin (BzGK), Nα-Hippurylarginin (BzGR) und das Tripeptid Gly-Ala-Tyr

werden jeweils mit Glyoxal unter den Bedingungen der Inkubation von Insulin (Peptid:

17 µM, Glyoxal: 50 µM) als auch bei höherer Konzentration (Peptid und Glyoxal: je 5 mM)

inkubiert.

Lösungen

- Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH = 7,4, 1,25-fach), siehe Abschnitt

3.5.1

- Glyoxal-Lösung (0,05 mM, 10-fach), siehe Abschnitt 3.7

- Glyoxal-Lösung (5 mM, 5-fach), siehe Abschnitt 3.5.1

- BzGK-Lösung (0,017 mM, 10-fach)

5,2 mg BzGK in 100 ml Reinstwasser im Maßkolben lösen.

- 104 -


- BzGK-Lösung (5 mM, 1,25-facht)

19,2 mg BzGK in 10 ml PBS (1,25-fach) im Maßkolben lösen.

- BzGR-Lösung (0,017 mM, 10-fach)

5,7 mg BzGR in 100 ml Reinstwasser im Maßkolben lösen.

- BzGR-Lösung (5 mM, 1,25-fach)

21,0 mg BzGR in 10 ml PBS (1,25-fach) im Maßkolben lösen.

- Gly-Ala-Tyr-Lösung (0,017 mM, 10-fach)

5,9 mg Gly-Ala-Tyr × 2 H2O in 100 ml Reinstwasser im Maßkolben lösen.

- Gly-Ala-Tyr-Lösung (5 mM, 1,25-fach)

20,6 mg Gly-Ala-Tyr x 2 H2O in 10 ml PBS (1,25-fach) im Maßkolben lösen.

Durchführung

Die Inkubationsansätze werden wie in Tab. 3.10-1 und Tab. 3.10-2 angegeben angefertigt

(jeweils dreifach) und bei 37 °C für 15 d im Brutschrank inkubiert. Zum Abstoppen werden je

Ansatz 33 µl 10 %ige (2,65 M) Ameisensäure zugesetzt. Die 5 mM-Ansätze von Gly-Ala-Tyr

werden 1 + 1 mit 10 mM Phosphatpuffer (HPLC-Eluent A) und die 5 mM-Ansätze der

Nα-Hippuryl-Derivate 1 + 3 mit 0,1 % Ameisensäure (HPLC-Eluent A) verdünnt. Um die

mögliche Wirkung der Ameisensäure auf das Produktspektrum zu prüfen, wird diese beim

Abstoppen und Verdünnen durch Reinstwasser ersetzt. Der pH-Wert wird vor und nach der

Inkubation in separaten Ansätzen geprüft. Die Analyse der Proben erfolgt mittels RP-HPLC.

Der Umsatz an Peptid und die dazugehörige Standardabweichung wird wie in Abschnitt 3.5.1

angegeben berechnet.

Tab. 3.10-1: Zusammensetzung der Inkubationsansätze (Peptid 17 µM, Glyoxal: 50 µM).

Probe Peptid-Lösung

(17 µM, 10-fach)

PBS Glyoxal-Lösung

(50 µM, 10-fach)

Reinstwasser

Ansatz 100 µl 800 µl 100 µl -

Peptid-Blindwert 100 µl 800 µl - 100 µl

- 105 -


Tab. 3.10-2: Zusammensetzung der Inkubationsansätze (Peptid 5 mM, Glyoxal: 5 mM).

Probe Peptid in PBS

(5 mM, 1,25-fach)

Glyoxal-Lösung

(5 mM, 5-fach)

Reinstwasser

Ansatz 800 µl 200 µl -

Peptid-Blindwert 800 µl - 200 µl

Analytische RP-HPLC



Ansätze der Nα-Hippuryl-Derivate:


Gradient: linear ansteigend, von 6 auf 13 % B in 25 min (BzGK)

linear ansteigend, von 12 auf 19 % B in 25 min (BzGR)

Gly-Ala-Tyr-Ansätze:




Temperatur: 20 °C

Injektionsvolumen: 20 µl (5 mM-Ansätze)

100 µl (17 µM-Ansätze)




Abschnitt 3.2

- 106 -

4 Auswertung und Diskussion der Ergebnisse

4.1 Analytik von Amadori-Produkten

Die Bestimmung von Furosin ist eine geeignete und oft angewendete Methode zur

Beurteilung der Wärmebehandlung und des nutritiven Wertes von Lebensmitteln,

insbesondere bei Milchprodukten. Ferner erlaubt die Anwendung der Furosin-Analytik

Rückschlüsse auf in vivo stattfindende Glykierungsprozesse (siehe Abschnitt 2.2.2). Die

Unsicherheit über die Höhe der molaren Ausbeute an Furosin bei der Salzsäurehydrolyse der

Amadori-Produkte des Lysins wurde jedoch immer wieder als Kritikpunkt angeführt (Resmini

et al., 1990, Van Boekel, 1998). Um diese Unsicherheit auszuräumen wurden die in

Lebensmitteln und in vivo relevanten Amadori-Produkte Nε-Fructosyl-, Nε-Tagatosyl-,

Nε-Lactulosyl-, und Nε-Maltulosyl-lysin als peptidgebundene Derivate und Nε-Fructosyl-lysin

in freier Form dargestellt. Die gezielte Hydrolyse und die Quantifizierung der

Hydrolyseprodukte erlaubten anschließend die Bestimmung der molaren Ausbeuten sowie der

sogenannten Überführungsfaktoren auf Basis von Furosin. Letztere ermöglichen jetzt die

sichere Korrelation der Ergebnisse der Furosin-Analytik mit der Lysin-Derivatisierung und

damit exakte Aussagen zum Fortschritt nichtenzymatischer Glykierungsreaktionen in

Lebensmitteln und in vivo.

4.1.1 Darstellung von Amadori-Produkten und Pyridosin als Referenzmaterial

Die ausgewählten Amadori-Produkte des Lysins wurden als Nα-Hippuryl-Derivate (siehe

Abb. 4.1.1-1) dargestellt. Nε-Fructosyllysin wurde weiterhin als freies Derivat gewonnen. Der

Hippursäure-Rest erwies sich auf Grund der UV-Absorption bei 230 nm und der Retention

auf RP-Material (Smith & Thornalley, 1992) sowohl für die Analytik als auch für die

semipräparative Isolierung mittels HPLC als vorteilhaft.

Die Synthese der Hippuryl-Amadori-Produkte der Monosaccharide erfolgte durch Umsetzung

von Nα-Hippuryllysin mit dem entsprechenden Saccharid in siedendem Methanol unter

Rückfluss (Finot & Mauron, 1969). Dabei wurden laut HPLC-Analyse Umsätze zum

Amadori-Produkt von 90 bis 95 % erreicht. Bei den Amadori-Produkten der Disaccharide

- 107 -


waren die Bildungsraten mit ca. 50 % unter diesen Bedingungen deutlich geringer. Deshalb

erfolgte deren Darstellung in einer Mischung aus Methanol und Dimethylformamid (Vinale et

al., 1999). Der auf diese Weise erzielte höhere Umsatz von ca. 95 % beruht vermutlich auf

der besseren Löslichkeit der Disaccharide in dem Lösungsmittelgemisch und der höheren

Reaktionstemperatur beim Kochen unter Rückfluss.

HOO

HO

HO

OH

O

OH

OH

HOHO

Nα-Hippuryl-Nε-fructosyllysin

OHO

HO OH

O

OHO

OH

OH

HO

HO

O

HO OOH

HO O

OH

OHHO

R =

R =R =

R = R =

Nα-Hippuryllysin

Nα-Hippuryl-Nε-tagatosyllysin

Nα-Hippuryl-Nε-maltulosyllysin

Nα-Hippuryl-Nε-lactulosyllysin

HN

NH

OH

O

OO

NHR

H

Abb. 4.1.1-1: Struktur von Nα-Hippuryllysin und der dargestellten Hippuryl-Amadori-Produkte.

Mittels analytischer RP-HPLC und unter Verwendung eines phosphat-gepufferten und

methanolhaltigen Eluenten-Systems konnte eine sehr gute Trennung von Nα-Hippuryllysin

und dem jeweiligen Syntheseprodukt erreicht werden (siehe Abb. 4.1.1-2). Die Trennung war

jedoch stark von der Flussrate abhängig, so dass mit der semipräparativen Säule und

vermindertem linearen Fluss keine Trennung gegeben war. Die Trennung im

semipräparativen Maßstab konnte erst durch eine vorherige Behandlung des Syntheseansatzes

mit Carboxypeptidase B (EC 3.4.17.2) erzielt werden. Carboxypeptidase B ist eine

Exopeptidase, welche C-terminal gebundenes Arginin oder Lysin von Peptiden abspaltet

- 108 -


(Ambler, 1972). Im Syntheseansatz führte die Behandlung mit Carboxypeptidase B folglich

zur Hydrolyse von nicht umgesetzten Nα-Hippuryllysin zu Hippursäure und Lysin. Das als

Amadori-Produkt modifizierte Nα-Hippuryllysin wurde demgegenüber nicht angegriffen

(siehe Abb. 4.1.1-2). Zur Gewinnung der Syntheseprodukte wurden die mit

Carboxypeptidase B behandelten Ansätze zunächst unter Verwendung des trennstarken

phosphat-gepufferten und methanolhaltigen Eluenten-Systems isoliert und anschließend in

einem zweiten chromatographischen Schritt mit wässriger Essigsäure und Methanol als

Eluenten entsalzt.

0 10 20 30 4

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

0

Abso

rptio

n (λ

= 2

30 n

m) [

AU]

BzG

BzGFruK

BzGK

B

A

Zeit [min]

Abb. 4.1.1-2: HPLC-Analyse eines Syntheseansatzes von Nα-Hippuryl-Nε-fructosyllysin (BzGFruK) vor (A) und nach (B) Behandlung mit Carboxypeptidase B. Hippursäure (BzG), Nα-Hippuryllysin (BzGK). (Durchführung: siehe Abschnitt 3.3.1).

Die Synthese von freiem Nε-Fructosyllysin wurde in Anlehnung an Reutter & Eichner (1989)

durchgeführt. Es wurde jedoch Nα-Boc-lysin statt Lysin mit Glucose umgesetzt. Dadurch

konnte die Bildung von Nα-Fructosyllysin und Nα,Nε-Difructosyllysin vermieden und die

chromatographische Reinigung vereinfacht werden. Die Abspaltung der Boc-Schutzgruppe

erfolgte auf schonende Weise an einem stark sauren Kationenaustauscher.

- 109 -


Weiterhin wurden Nα-Hippuryl-Nε-carboxymethylhippuryllysin als Standard zur

Quantifizierung von CML sowie Pyridosin als Standard gewonnen. Alle dargestellten

Verbindungen wurden in chromatographisch reiner Form erhalten. Die massen- und NMR-

spektroskopischen Daten sowie die Ergebnisse der Elementaranalysen der Syntheseprodukte

(siehe Abschnitt 3.3) decken sich mit den erwarteten bzw. den zum Teil aus der Literatur

bekannten Werten (Kroh et al., 1992, Olano et al., 1992, Mossine et al., 1994, Feather &

Mossine, 1998). Die Präparate wurden damit für die folgenden Hydrolysestudien als geeignet

angesehen.

4.1.2 Bestimmung der molaren Ausbeuten der Hydrolyseprodukte

Die Hydrolyse der dargestellten Amadori-Produkte erfolgte unter den für die

Aminosäureanalytik standardisierten Bedingungen in 6 M Salzsäure für 23 h bei 110 °C und

bei einem Präparat-Säure-Verhältnis von 1:1000. Ferner wurde in der für die Furosin-Analyse

oft benutzten 8 M Salzsäure hydrolysiert. Für die Quantifizierung der Hydrolyseprodukte

wurde die Kationenaustauschchromatographie mit Nachsäulenderivatisierung durch

Ninhydrin (Aminosäureanalysator) verwendet, welche die gleichzeitige Bestimmung aller

Hydrolyseprodukte ermöglicht (siehe Abb. 4.1.2-1).

Da Amadori-Produkt und Glycin in den Hippuryl-Derivaten im molaren Verhältnis 1:1

vorliegen, wurde dieser Vorteil genutzt und Glycin als interner Standard zur Berechnung der

molaren Ausbeuten verwendet. Dies sollte sich positiv sowohl auf die Richtigkeit als auch auf

die Präzession der Ergebnisse auswirken.

Abbildung 4.1.2-1 zeigt typische Aminosäurechromatogramme von Hydrolysaten von

Nα-Hippuryl-Nε-fructosyllysin und Nα-Hippuryl-Nε-tagatosyllysin. Schon visuell wird

deutlich, dass sich die Gehalte an Pyridosin, Lysin und Furosin in den beiden Hydrolysaten

deutlich unterscheiden und damit die Hydrolyseprodukte in unterschiedlichem Umfang

gebildet werden. So ist im Vergleich zu Nε-Fructosyllysin bei Nε-Tagatosyllysin der Umfang

der Bildung von Furosin und Pyridosin höher und die Rückbildung von Lysin erniedrigt (6 M

Salzsäure, siehe Abb. 4.1.2-1). Weiterhin ist auffällig, dass in beiden Hydrolysaten geringe

Mengen an CML detektierbar sind (siehe auch Abschnitt 4.1.4).

- 110 -


0 20 40 60

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00Ammoniak

Lys

FurosinPyridosin

CML

Gly

BzGTagK

BzGFruK

Abso

rptio

n (λ

= 5

70 n

m) [

AU

]

Zeit [min]

Abb. 4.1.2-1: Aminosäureanalyse von Hydrolysaten (6 M Salzsäure) von Nα-Hippuryl-Nε-fructosyllysin (BzGFruK) und Nα-Hippuryl-Nε-tagatosyllysin (BzGTagK). (Durchführung: siehe Abschnitt 3.4.1).

Für Fructosyl-, Lactulosyl- und Maltulosyllysin ist ein ähnliches Hydrolyseverhalten

festzustellen (Abb. 4.1.2-2, Tab. 4.1.2-1). Nach Hydrolyse mit 6 M Salzsäure wurden molare

Ausbeuten an Furosin zwischen 30 und 35 % bestimmt. Die anscheinend leicht verminderte

Bildung von Furosin aus freiem Fructoselysin dürfte auf die unterschiedliche Art der

Berechnung zurückzuführen sein. Die Berechnung der Ausgangskonzentration erfolgte bei

diesem Derivat anhand der Elementaranalyse. Die bestimmten Ausbeuten an Furosin bei

Hydrolyse in 6 M Salzsäure stimmen sehr gut mit der von Finot et al. (1977) für

lactulosyliertes Milchprotein ermittelten Ausbeute von 32 % überein. Bei Hydrolyse mit 8 M

Salzsäure liefern Fructosyl-, Lactulosyl- und Maltulosyllysin mit 46, 50 und 51 %

erwartungsgemäß höhere Ausbeuten an Furosin. Die ermittelte Ausbeute bei Fructosyllysin

deckt sich nahezu mit der von Szölgyenyi et al. (1989) ermittelten Ausbeute von 46 % bei

Hydrolyse mit 7,8 M Salzsäure.

- 111 -


Verglichen mit Fructosyl-, Lactulosyl- und Maltulosyllysin, welche an der Amino-Gruppe

einen Fructosyl-Rest aufweisen, zeigt Tagatosyllysin ein anderes Hydrolyseverhalten. Aus

Tagatosyllysin wird bei Hydrolyse mit 6 M Salzsäure mit 42 % signifikant (P < 0,01) mehr

Furosin gebildet. Die von Finot et al. (1981) vermutete erhöhte Bildung von Furosin aus

Tagatosyllysin wurde damit abgesichert und quantifiziert. Im Gegensatz zu den Fructosyl-

Amadori-Produkten bewirkt beim Tagatosyllysin die Erhöhung der Salzsäurekonzentration

auf 8 M keine Erhöhung der molaren Ausbeute an Furosin, so dass bei dieser Konzentration

Tagatosyllysin eine signifikant (P < 0,01) geringere molare Ausbeute liefert.

FruK BzGFruK BzGLctK BzGMltK BzGTagK0

10

20

30

40

50po

nn

nn

mm m

m

Amadori-Produkt

Mol

are

Aus

beut

e an

Fur

osin

[%]

Abb. 4.1.2-2: Molare Ausbeute an Furosin bei Hydrolyse verschiedener Amadori-Produkte in 6 M (graue Balken) oder 8 M Salzsäure (schwarze Balken). Mittelwert ± Standardabweichung (n = 5, f = 4). P < 0,01: m vs n, m vs o, n vs p. (Durchführung: siehe Abschnitt 3.4.1, 3.4.2).

Bei der Bildung von Pyridosin verhalten sich die Fructosyl-Amadori-Produkte wiederum

ähnlich, in 6 M Salzsäure werden jeweils ca. 16 % Pyridosin gebildet (Tab. 4.1.2-1). Die

Bildung aus Tagatosyllysin ist mit 36 % demgegenüber signifikant erhöht. Aus früheren

Arbeiten ist bekannt, dass bei langer Lagerung von UHT-Milch das Pyridosin-zu-Furosin-

Verhältnis steigt (Möller, et al. 1977). Eine Hydrolyse der Lactose, die Reaktion der

freigesetzten Galactose zum Tagatoselysin und die vermehrte Bildung von Pyridosin aus

Tagatosyllysin dürfte dieses Phänomen mit erklären.

- 112 -


Anhand der bestimmten molaren Ausbeuten an Furosin kann das als Amadori-Produkt

modifizierte Lysin berechnet werden. Die dazu notwendigen Konversionsfaktoren sind in

Tab. 4.1.2-2 zusammengefasst. Die Berechnung ist einfach, solange nur ein Typ von

Amadori-Produkt vorliegt. In Milchprodukten in denen die Lactose hydrolysiert wurde liegen

jedoch Nε-Fructosyl- und Nε-Tagatosyllysin nebeneinander vor. Um auch in diesen

Lebensmitteln das nicht verfügbare Lysin zu bestimmen, müssen beide Amadori-Produkte die

gleiche molare Ausbeute an Furosin liefern. Die dazu erforderliche Salzsäurekonzentration

wurde zunächst anhand der mit beiden Nα-Hippuryl-Amadori-Produkten mit 6 M und 8 M

Salzsäure bestimmten Ausbeuten zu 7,3 M berechnet (Gleichungssystem) und anschließend

experimentell bestätigt (Tab. 4.1.2-1). Zur Bestimmung des nicht verfügbaren Lysins in

lactose-hydrolysierten Milchprodukten kann folglich die Hydrolyse mit 7,3 M Salzsäure

empfohlen werden.

Tab. 4.1.2-1: Molare Ausbeuten an Hydrolyseprodukten bei Hydrolyse verschiedener

Amadori-Verbindungen in 6 M, 8 M oder 7,3 M Salzsäure für 23 h bei 110 °C.

Molare Ausbeute [%] * Salzsäure-

konzentration

Amadori-

Verbindung Lysin Furosin Pyridosin CML

6,0 M FruK 56,1 ± 1,4m 30,0 ± 1,2m 14,9 ± 0,3m 1,5 ± 0,1

BzGFruK 56,2 ± 0,4m 32,4 ± 0,5m 15,9 ± 0,2m 1,6 ± 0,1

BzGLctK 57,9 ± 1,5m 33,8 ± 1,4m 15,9 ± 0,9m 1,0 ± 0,2

BzGMltK 56,0 ± 0,6m 34,6 ± 0,5m 15,5 ± 0,2m 1,1 ± 0,1

BzGTagK 28,6 ± 0,2 42,1 ± 0,4 35,6 ± 0,3 2,3 ± 0,1

8,0 M FruK 42,5 ± 0,9m 43,4 ± 1,1 18,6 ± 1,1m 5,0 ± 0,3

BzGFruK 41,7 ± 0,8m 46,1 ± 1,9m 15,9 ± 0,8m 5,9 ± 0,1

BzGLctK 40,5 ± 0,6m 50,2 ± 1,3m 18,4 ± 0,7m 2,5 ± 0,2

BzGMltK 39,4 ± 0,4m 51,0 ± 0,7m 17,5 ± 0,2m 3,5 ± 0,2

BzGTagK 32,2 ± 0,5 41,9 ± 1,7 32,0 ± 1,1 4,1 ± 0,2

7,3 M BzGFruK 48,3 ± 1,2m 42,8 ± 1,8 14,3 ± 0,8m 3,1 ± 0,3

BzGTagK 29,7 ± 1,1 42,1 ± 1,1 35,3 ± 0,7 2,7 ± 0,1

* Mittelwert ± Standardabweichung (n = 5, f = 4), m P < 0,01 vs BzGTagK

- 113 -


Tab. 4.1.2-2: Überführungsfaktoren zur Berechnung des als Amadori-Produkt modifizierten

Lysins.

Überführungsfaktor bei Hydrolyse mit Salzsäure Amadori-Verbindung

6,0 M 8,0 M 7,3 M

Fructosyl- 3,1 2,2 2,4

Lactulosyl-, Maltulosyl- 2,9 2,0 n. b.

Tagatosyl- 2,4 2,4 2,4

n. b. nicht bestimmt

Prüfung von möglichen Einflussfaktoren auf die Hydrolyse

Um zu prüfen, ob sich bei der Hydrolyse die Gegenwart bestimmter

Lebensmittelinhaltsstoffe, Bestandteile von Inkubationsansätzen oder Verfahrensweisen auf

die molare Ausbeute an Furosin auswirken, wurden entsprechende Hydrolyseexperimente

durchgeführt (siehe Abschnitt 3.4.1).

Dazu wurde die Standard-Hydrolyse von Nα-Hippuryl-Nε-fructosyllysin und Nα-Hippuryl-

Nε-tagatosyllysin (6 M und 8 M Salzsäure, Protein-Salzsäure-Verhältnis 1:1000) wie folgt

modifiziert:

- Zusatz von Glucose (bis 10 mg/ml Hydrolyseansatz)

- Zusatz von Peptiden (7 mg/ml, Protein-Salzsäure-Verhältnis 1:125)

- Variation des Protein-Salzsäure-Verhältnisses von 1:500 bis 1:10000

- Zusatz möglicher Effektoren (bis 10 mg/ml), z. B. organische Säuren, Antioxidations-

mittel wie Acetylcystein, Oxidationsmittel wie Natriumazid

- Hydrolyse ohne vorheriges Spülen des Gefäßes mit Stickstoff

- Hydrolyse nachdem Stickstoff direkt durch Hydrolyseansatz geleitet wurde (bis 2 min)

Vom Natriumazid-Zusatz abgesehen zeigte keiner der getesteten Parameter einen

signifikanten (P < 0,05) Einfluss auf die molare Ausbeute an Furosin. Dies spricht sehr für die

Verlässlichkeit der Methode. So wirkte sich insbesondere die Gegenwart von reduzierenden

Zuckern nicht nachteilig auf die Richtigkeit und Präzession der Ergebnisse aus. Das gleiche

gilt für einen verminderten Salzsäureüberschuss von nur 1:125, welcher von Resmini et al.

(1990) zur Furosin-Analytik eingeführt wurde. Weiterhin zeigten die Art des Spülens der

Hydrolysegefäße mit Stickstoff oder ein Verzicht darauf keine Wirkung, so dass dieser

- 114 -


Arbeitsschritt bei der reinen Furosin-Analytik streng genommen nicht notwendig ist. In dieser

Weise ist auch die Feststellung von Finot (1973) zu interpretieren, dass die Hydrolyse im

Kolben unter Rückfluss oder in abgeschmolzenen Ampullen jeweils zum gleichen Ergebnis

führt. Von den geprüften weiteren Zusätzen erwies sich lediglich die Anwesenheit größerer

Mengen von Natriumazid (10 mg/ml Hydrolyseansatz) als ungünstig. Dadurch kam es zu

einer Verminderung der Ausbeute an Furosin (10 % in 6 M Salzsäure) und zur vermehrten

Bildung von CML (10 % in 6 M Salzsäure). Eine geringere Konzentration an Natriumazid

(1 mg/ml Hydrolyseansatz) zeigte keinen Effekt.

Wie bereits in früheren Studien (Finot et al., 1972, Henle et al., 1995) festgestellt wurde, ist

die molare Ausbeute an Furosin stark von der verwendeten Salzsäurekonzentration abhängig.

Die vorliegenden Untersuchungen zeigten jedoch auch, dass dies im untersuchten

Konzentrationsbereich nicht für Tagatosyllysin gilt. Auch in Hinblick auf die Bildung von

Pyridosin und Lysin wurde im Hydrolyseverhalten eine Abhängigkeit von der Art des

Amadori-Produktes beobachtet. Insgesamt betrachtet zeigten damit Amadori-Produkte,

welche einen Fructosyl-Rest enthalten, ein ähnliches Verhalten, das sich signifikant von dem

des Tagatosyllysins unterschied.

Um das blockierte Lysin auch in Proben zu bestimmen, die sowohl Fructosyl- als auch

Tagatosyllysin enthalten, wie z. B. bei Milchprodukten in denen die Lactose hydrolysiert

wurde, hat sich die Hydrolyse mit 7,3 M Salzsäure als geeignet erwiesen. Bei dieser

Konzentration erfolgt die Bildung von Furosin aus beiden Amadori-Produkten im gleichen

Umfang. Insbesondere die Hydrolyse in Gegenwart von überschüssig vorhandenem Zucker

oder Protein (Peptiden) zeigte keinen Einfluss auf die Höhe der molaren Ausbeute an Furosin,

so dass sich folglich diese Lebensmittelbestandteile nicht negativ auf die Ergebnisse

auswirken.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass anhand der durchgeführten Hydrolyseexperimente

das Hintergrundwissen um die Furosin-Bestimmung und ihre Anwendbarkeit erweitert

werden konnte. Insbesondere wurden die molaren Ausbeuten an Furosin und die damit in

Zusammenhang stehenden Überführungsfaktoren bestimmt. Anhand der ermittelten

Überführungsfaktoren ist nun erstmals eine sichere Bestimmung der Lysin-Derivatisierung

auf der Basis der Analytik von Furosin möglich. Dies erlaubt exakte Aussagen zum

Fortschritt der frühen Maillard-Reaktion sowohl in Lebensmittel als auch in vivo.

- 115 -


4.1.3 Betrachtungen zum Mechanismus der Bildung der Hydrolyseprodukte

Die bei der Salzsäurehydrolyse der Amadori-Produkte festgestellten Phänomene werfen

zwangsläufig die Frage nach den Ursachen auf. Dabei erscheinen insbesondere die

Hintergründe für die Bildung von drei Haupthydrolyseprodukten, die beobachtete

Abhängigkeit der molaren Ausbeuten von der Salzsäurekonzentration und der Art des

Amadori-Produktes interessant. Obwohl z. B. die beiden erstgenannten Beobachtungen bereits

mehrere Jahrzehnte bekannt sind, wurden die Ursachen bisher kaum diskutiert. Grundlegend

für die Betrachtungen ist der Mechanismus der Bildung der Hydrolyseprodukte. Dieser wurde

jedoch ebenfalls noch nicht im Detail und unter Hydrolysebedingungen untersucht.

Anhand von bekannten Reaktionen von Zuckern und Amadori-Produkten unter Säurekatalyse

(Anet, 1962, 1964) und Untersuchungen zum Abbau von Amadori-Produkten bei der

Thermolyse im Neutralen (Huber & Ledl, 1990) wird angenommen, dass die Bildung von

Furosin durch eine 2,3-Enolisierung des Amadori-Produktes eingeleitet wird und intermediär

das 1-Amino-1,4-didesoxyoson auftritt (Abb. 4.1.3-1). Die Rückbildung von Lysin ist über

eine 1,2-Enolisierung und anschließende Eliminierung des Lysins erklärbar (Anet, 1960). Für

die Bildung von Pyridosin sind zwei Wege diskutierbar. Die erste Möglichkeit beinhaltet eine

direkte Dehydratisierung der Furanose-Form des Amadori-Produktes zu einem

2-Aminomethyl-furan-Derivat, welches anschließend einer Umlagerung zum Pyridosin

unterliegt (Finot et al., 1969a). Weiterhin ist die Bildung über das 1-Amino-1,4-didesoxyoson

formulierbar (Abb. 4.1.3-1).

Die in Abb. 4.1.3-1 angegebenen Reaktionswege geben zunächst den Fakt wieder, dass es

sich bei den Hydrolyseprodukten um Endprodukte handelt und damit keines ein Intermediat

bei der Bildung eines anderen ist. Eine Schlüsselstellung in Hinblick auf die Anteile bei der

Produktbildung dürfte das spezifische Vermögen der Amadori-Produkte zur 1,2- und

2,3-Enolisierung sowie die Neigung der enolischen Intermediate zur Dehydratisierung

einnehmen. Neben diesen von der Art des Amadori-Produktes abhängigen Faktoren wird

insbesondere bei der Dehydratisierung die Salzsäurekonzentration von Bedeutung sein.

Hierbei sind die Protonierungsgleichgewichte an den Hydroxylgruppen und am Stickstoff zu

betrachten. Für die Dehydratisierung ist die Protonierung der jeweiligen Hydroxylgruppe

Voraussetzung und folglich sollte dieser Prozess mit steigender Säurekonzentration

beschleunigt werden. Gleichzeitig dürfte entsprechend dem angegebenen Mechanismus eine

Protonierung am Stickstoff der Dehydratisierung des 1,2-Enols und damit der Lysinbildung

- 116 -


entgegenwirken. Weiterhin ist anzunehmen, dass die protonierte Aminofunktion aus

elektrostatischen Gründen die Protonierung an der Hydroxylgruppe an Position 3 mehr

behindert als an Position 4. In der Summe kann dies als Erklärung für die vermehrte Furosin-

Bildung bei höheren und die vermehrte Lysinbildung bei niedrigeren Säurekonzentrationen

bei den Fructoysl-Amadori-Produkten angesehen werden. Als Ursache für die sehr ähnliche

molaren Ausbeuten bei den Fructoysl-Amadori-Produkten ist eine vergleichsweise schnelle

Hydrolyse von Nε-Lactulosyl- und Nε-Maltulosyllysin zum Nε-Fructosyllysin anzusehen.

NHR

HO

O

OH

OH

OH

NHR

OH

OH

OH

OH

OH

NHR

O

OH

OH

OH

NHR

O

OH

OH

O

NHR

OO

Furosin

- H2O - 2 H2O

Amadori-Produkt

2,3-Enol 1-Amino-2,3-didesoxyoson

NR

O

Lysin

Pyridosin

O

HO OH

O

OH

HO HOOHNHR

NHR

OH

Amadori-Produkt(Furanose-Form)

1,2-Enol

NHR

HO

OH

OH

OH

OH

NH

OH

OH

OH

OH

R O

O

OH

OH

OH

3-DG

H2N R- H2O

+ H2O+

Aminomethyl-furan

- 2 H2O - H2O

- 2 H2O

NHR

H2O

OH

OH

OH

OH

+

_ +

- H++ H+

NHR

O

OH2

OH

OH

OH

H

+- H+

+ H+

Abb. 4.1.3-1: Überblick zum Bildungsmechanismus von Lysin, Furosin und Pyridosin aus Nε-Fructosyllysin (Literatur siehe Text).

Die tendenziell höheren Werte für Furosin bei den Disaccharid-Amadori-Produkten sind

vermutlich auf eine gewisse Unvollständigkeit der eben genannten Hydrolyse und die

- 117 -


leichtere Eliminierbarkeit des Glycosyl-Restes gegenüber der Hydroxylgruppe vom

Kohlenstoffatom 4 im Fructosyl-Rest zurückzuführen (Hollnagel & Kroh, 2000).

Da sich Nε-Fructosyllysin und Nε-Tagatosyllysin „nur“ in der Stellung der Hydroxylgruppe an

Position 4 unterscheiden, ist diese strukturelle Differenz als Ursache für das unterschiedliche

Hydrolyseverhalten verantwortlich. Bei Nε-Tagatosyllysin ist die stark erhöhte Pyridosin-

Bildung auffällig. Da Pyridosin nach Finot et al. (1969a) direkt aus der furanoiden Form des

Amadori-Produktes hervorgehen soll, wäre es denkbar, dass dieses Konformer beim

Nε-Tagatosyllysin im Vergleich zum Nε-Fructosyllysin im erhöhten Maß vorhanden ist.

Entsprechend den bei Raumtemperatur in Deuteriumoxid und schwach saurem pH-Wert

mittels 13C-NMR Spektroskopie ermittelten Anomer-Anteilen ist dies aber nicht der Fall

(Tab. 4.1.3-1). Die Daten zeigen jedoch, dass sich die beiden Amadori-Produkte sehr deutlich

in ihrer anomeren Zusammensetzung unterscheiden. Die Anomer-Anteile bei den Fructosyl-

Amadori-Produkten sind ähnlich, es dominiert jeweils die β-Pyranose. Zu den Konformeren-

Anteilen unter Hydrolysebedingungen kann keine sichere Aussage getroffen werden, da die

Bestimmung mittels 13C-NMR Spektroskopie in 6 M Salzsäure bereits bei Raumtemperatur

nicht möglich ist. Aus der Literatur ist bekannt, dass die Anomer-Anteile stark vom

Lösungsmittel abhängig sind (Tjan et al., 1974, Jakas & Horvat, 1996). Weiterhin dürfte die

Temperatur von Einfluss sein (Funcke & Klemer, 1976). Für D-Fructose, welche eine nahezu

identische anomere Zusammensetzung aufweist wie Nε-Fructosyllysin, wurde z. B. bereits im

Temperatur-Bereich von 0 bis 80 °C in Wasser eine sehr starke Abhängigkeit in der Weise

beobachtet, dass mit steigender Temperatur die Anteile der beiden furanoiden Formen auf

Kosten der β-Pyranose zunehmen (Tsuzuki et al., 1950, Schneider et al., 1985). Zu einer

Abhängigkeit vom pH-Wert liegen für wässrige Lösungen konträre Angaben vor. Während

eine solche von Altena et al. (1981) im Bereich von pH = 3,5 bis 9,5 festgestellt wurde,

konnte diese von Röper et al. (1983) im Bereich von pH = 0,9 bis 11,9 nicht bestätigt werden.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass sich die Anomer-Anteile unter Hydrolyse-

bedingungen von denen unter moderaten Bedingungen mit Sicherheit unterscheiden werden.

Der Umfang der Verschiebung in der anomeren Zusammensetzung und damit die Plausibilität

der postulierte Bildung von Pyridosin aus der Furanose-Form kann jedoch ohne die

entsprechenden Daten nicht beurteilt werden.

Die Bildung von Pyridosin ist weiterhin aus dem 1-Amino-1,4-didesoxyoson zu diskutieren.

Sofern unter den Hydrolysebedingungen die cis,trans-Isomerie des als Enol entstehenden

1-Amino-1,4-didesoxyoson keine signifikante Rolle spielt, sollte bei Nε-Tagatosyllysin und

- 118 -


Nε-Fructosyllysin das Furosin-zu-Pyridosin-Verhältnis gleich sein. Ein solches vom Amadori-

Produkt unabhängiges Verhältnis wurde jedoch nicht festgestellt und folglich sollte dieser

Bildungsweg nicht der einzige sein.

Tab. 4.1.3-1: Anomer-Anteile der dargestellten Hippuryl-Amadori-Produkte in Deuterium-

oxid-Lösung (pH = 4 bis 5 [gemessener pH-Wert, nicht korrigiert], ϑ = 20 °C).

Amadori- Anomer-Anteil [%] 1,2

Produkt α-Pyranose β-Pyranose α-Furanose β-Furanose

BzGFruK 5 (4) 71 (70) 12 (13) 12 (13) 3

BzGTagK 70 (67) 23 (21) 7 (9) - (3) 4

BzGLctK - (2) 73 (65) 14 (18) 13 (15) 5

BzGMltK - (2) 70 (64) 16 (18) 14 (16) 4

1 Bestimmt mittels 13C-NMR Spektroskopie anhand der Signalintensität ausgewählter

gleichartiger C-Atome der messbaren Anomere. 2 Literaturangaben in Klammern: 3 Mossine

et al. (1994). 4 Feather & Mossine (1998). 5 Olano et al. (1992).

Insgesamt betrachtet können die diskutierten Reaktionswege die Hydrolyse der Amadori-

Produkte im Wesentlichen erklären. Einige Phänomene können jedoch zur Zeit noch nicht

vollständig auf molekularer Ebene interpretiert werden. Zur weiteren Klärung sind

insbesondere Kenntnisse zur Struktur der Amadori-Produkte unter Hydrolysebedingungen

sowie zum Mechanismus der Produktbildung erforderlich.

4.1.4 Untersuchungen in Hinblick auf die Bildung von Nε-Carboxymethyllysin

In den Hydrolysaten der Amadori-Produkte wurden neben Lysin, Furosin und Pyridosin in

geringen Mengen CML detektiert, die molare Ausbeute wurde zu 1 bis 2 % bestimmt. CML

ist als ein oxidatives Abbauprodukt von Fructosyllysin bekannt (Ahmed et al., 1986). Um eine

Verunreinigung der Präparate der Hippuryl-Amadori-Produkte auszuschließen, wurden diese

mittels RP-HPLC auf das Vorhandensein von Nα-Hippuryl-Nε-carboxymethyllysin geprüft.

Das Nε-Fructosyllysin-Präparat wurde mittels Aminosäureanalyse untersucht. Es konnte

weder Nα-Hippuryl-Nε-carboxymethyllysin bzw. CML in den Präparaten nachgewiesen

- 119 -


werden. Weiterhin konnte CML nicht detektiert werden, wenn vor der Salzsäurehydrolyse das

Amadori-Produkt mit Natriumborhydrid reduziert wurde. Folglich muss der oxidative Abbau

während der Hydrolyse erfolgen. Darauf weist auch die vermehrte CML-Bildung bei

Hydrolyse in Gegenwart von Natriumazid hin (siehe Abschnitt 4.1.2), welches in saurer

Lösung als Oxidationsmittel wirkt.

Um die Wirkung von Luftsauerstoff als Oxidationsmittel zu minimieren, wurde die Hydrolyse

unter Vakuum (p < 0,001 mbar) durchgeführt (Abb. 4.1.4-1).

A B C0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8n

m

po

n

m

Art der Hydrolyse

Mol

are

Ausb

eute

[%]

Abb. 4.1.4-1: Molare Ausbeute an CML bei Hydrolyse von Nα-Hippuryl-Nε-fructosyllysin in 6 M Salzsäure: Standardhydrolyse in Hydrolysegefäß nach Spülen mit Stickstoff (A), Hydrolyse in Vakuumhydrolysegefäß, ohne Spülen mit Stickstoff unter Normaldruck (B), Hydrolyse in Vakuumhydrolysegefäß, nach Evakuierung (p < 0,001 mbar) (C). Hydrolyse mit Salzsäure „ACS quality“ von J. T. Baker (graue Balken) und „trace select“ von Fluka (schwarze Balken). Mittelwert ± Standardabweichung (n = 5, f = 4). P < 0,01: m vs o, n vs p. (Durchführung: siehe Abschnitt 3.4.1).

Im Vergleich zur Standardhydrolyse führte die Hydrolyse unter Vakuum zu einer

signifikanten (P < 0,01) Verringerung der CML-Bildung auf etwa die Hälfte. Gewisse Spuren

von Chlor in der Salzsäure sind durch die Vakuum-Behandlung vermutlich nicht vollständig

entfernbar und als Ursache für die restliche CML-Bildung anzusehen. Da Spuren von

Schwermetallen den oxidativen Abbau katalysieren können, fand eine weitere Salzsäure

- 120 -


höchster analytischer Qualität Verwendung. Diese bewirkte jedoch keine signifikant

niedrigere Bildung von CML. Eine vollständige Unterdrückung der CML-Bildung war nur

möglich, wenn vor der Hydrolyse das Amadori-Produkt mit Natriumborhydrid reduziert

wurde. Die Bestimmung von CML in Lebensmitteln nach einer solchen Reduktion wurde

z. B. von Drusch et al. (1999) beschrieben.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass unter Standardhydrolysebedingungen eine geringe

CML-Bildung stattfindet. In Hinblick auf die Bestimmung von Furosin ist dieser Abbau

jedoch aus quantitativen Gründen ohne Belang. Da in Lebensmittel und in vivo das Amadori-

Produkt gegenüber CML um den Faktor 200 bis 1000 dominiert, ist zur Bestimmung von

CML der oxidative Abbau des Amadori-Produktes während der Hydrolyse unbedingt zu

vermeiden. Um dies zu erreichen, hat sich unter Modellbedingungen die vorherige Reduktion

des Amadori-Produktes mit Natriumborhydrid als geeignet erwiesen.

4.1.5 Weitere Studien zur Bildung von Furosin

Bisher wurde Furosin ausschließlich als Produkt der Salzsäurehydrolyse von Amadori-

Produkten betrachtet. Huber & Ledl (1990) berichteten jedoch auch von der thermisch

induzierten Bildung eines 2-Aminoacetylfuran-Derivates aus Salzen des N-Fructosyl-

propylamins in wässriger Lösung im Zuge der Maillard-Reaktion. Weiterhin konnten

Hollnagel & Kroh (2000) nach Umsetzung von Lysin und Maltose unter ähnlichen

Bedingungen Furosin detektieren. In Anlehnung an diese Experimente wurde das Lyophilisat

einer wässrigen Lösung von Nε-Boc-Lysin und Maltose für 15 min bei 120 °C erhitzt. Nach

Abspaltung der Schutzgruppe konnte mittels Aminosäureanalyse eindeutig die Bildung von

Furosin nachgewiesen und die obigen Befunde bestätigt werden. Der Umsatz zu Furosin

wurde zu ca. 0,5 % bestimmt. Über eine Bildung von Pyridosin kann auf Grund von

Interferenzen durch die erforderliche große Injektionsmenge keine sicher Aussage getroffen

werden. Huber (1989) konnte keine Bildung eines dem Pyridosin ähnlichen Derivates aus

N-Fructosylpropylamin beobachten.

Um die Stabilität von Amadori-Produkten in Salzsäure zu untersuchen, wurde freies

Nε-Fructosyllysin in 6 M und 8 M Salzsäure bei 23 °C inkubiert und zu definierten Zeiten

wurde die Lösung mittels Aminosäureanalyse untersucht. Nε-Fructosyllysin zeigte unter den

- 121 -


gewählten Inkubationsbedingungen eine ausgesprochen hohe Stabilität. Erst nach 14 d

Inkubation in 8 M Salzsäure konnte eine geringfügige Furosin-Bildung beobachtet werden. In

6 M Salzsäure war demgegenüber zu diesem Zeitpunkt noch kein Abbau detektierbar. Damit

zeigt Nε-Fructosyllysin in 6 M und 8 M Salzsäure bei 23 °C eine bemerkenswert hohe

Stabilität. Strukturanalytische Untersuchungen der Amadori-Produkte in Salzsäure zur

weiteren Klärung der Reaktionswege bei der Hydrolyse sollten somit prinzipiell möglich sein.

Aus messtechnischen Gründen sind jedoch 13C-NMR-spektroskopische Untersuchungen in

Salzsäure beispielsweise zur Bestimmung der Anteile der einzelnen Anomeren nicht

realisierbar.

- 122 -


4.2 Überblick zur Reaktivität von Peptiden und individuellen

Aminosäureseitenketten gegenüber α-Dicarbonylverbindungen

Obwohl die in vivo stattfindende Glykierung von Proteinen zuerst am N-Terminus des

Hämoglobins festgestellt wurde (Bunn et al., 1975, 1979, Flückiger & Winterhalter, 1976),

schenkte man später Reaktionen an der α-Aminogruppe von Proteinen und Peptiden kaum

Beachtung. Autoren, welche sich aus protein- oder lebensmittelchemischer Sicht mit

Umsetzungen von α-Dicarbonylverbindungen am N-Terminus befassten, kamen zum Teil zu

konträren Ergebnissen (Takahashi, 1968, 1977a, Van Chuyen et al., 1973a, b). Auf Grund der

gewählten Bedingungen lassen diese Untersuchungen auch keine Rückschlüsse auf in vivo

stattfindende Prozesse zu (siehe Abschnitt 2.3.4).

Um Reaktionen am N-Terminus in der fortgeschrittenen Phase der Maillard-Reaktion zu

untersuchen, wurden im Rahmen dieser Arbeit kurzkettige Peptide mit in vivo und in

Lebensmitteln relevanten α-Dicarbonylverbindungen unter physiologischen Bedingungen

bezüglich des pH-Wertes (pH = 7,4) und der Temperatur (ϑ = 37 °C) umgesetzt. Die Peptide

und Aminosäure-Derivate wurden dabei in Hinblick auf die Analytik mittels RP-HPLC und

UV-Detektion bei λ = 220 nm ausgewählt. Da der pH-Wert wesentlichen Einfuß auf die

Kinetik von Amino-Carbonyl-Reaktionen hat, erfolgten die Inkubationen in phosphat-

gepufferter Lösung. Die Pufferionenkonzentration wurde so gewählt, dass die

Konstanthaltung des pH-Wertes (∆pH ≤ 0,1) über den untersuchten Inkubationszeitraum

gewährleistet war.

Als Einstieg wurden ausgewählte Peptide ohne nucleophile Seitenketten, z. B. Gly-Ala-Phe,

Gly-Phe-Ala, Phe-Gly-Gly, mit Glyoxal, Methylglyoxal oder 3-DG im equimolaren

Verhältnis (je 5 mM) für 3 d bei leicht erhöhter Temperatur von 60 °C umgesetzt. Um die

Reaktivität beurteilen zu können, wurden die bekannten Reaktionspartner für α-Dicarbonyl-

verbindungen Lysin und Arginin sowie weitere potentiell reaktive Aminosäuren als

Nα-geschützte Derivate unter den gleichen Bedingungen inkubiert.

Die Umsätze wurden mittels RP-HPLC anhand der Abnahme der Peakfläche des

Ausgangspeptides bestimmt. Anhand der so ermittelten Umsätze (siehe Abb. 4.2-1) ist auf

eine hohe Reaktivität von Peptiden wie Gly-Ala-Phe und Phe-Gly-Gly zu schließen.

Nα-Hippurylarginin war erwartungsgemäß ebenfalls reaktiv. Weiterhin waren Umsätze mit

Cystein und Methionin festzustellen. Als Reaktionsprodukte des Cysteins sind insbesondere

- 123 -


Thiohemiacetale und Thiohemiketale zu vermuten (Thornalley, 1998). Demgegenüber konnte

mit Nα-Hippuryllysin, Nα-Acetyl-Tryptophan, Nα-Ac-Ser-Gly, Nα-Benzoyl-Histidin,

Nα-Hippurylglycin keine Reaktion beobachtet werden. Da CML und CEL als Produkte der

Lysin-Derivatisierung durch Glyoxal bzw. Methylglyoxal bekannt sind (Al-Abed & Bucala,

1995, Ahmed et al., 1997), war die geringe Reaktivität von Lysin nicht zu erwarten. In

Hinblick auf die Untersuchungen von Saito et al. (1986) gilt das gleiche für Tryptophan.

Anhand der Inkubationen mit Nα-Hippurylglycin ist festzustellen, dass der Peptidstickstoff

ebenfalls nicht reaktiv ist.

GAF GFA AFG FGG F AcC BzGR BzMet0

20

40

60

80

100

Um

satz

[%]

Peptid, Aminosäure-Derivat

Abb. 4.2-1: Umsatz an Peptid nach Umsetzung mit Glyoxal (hellgraue Balken), Methylglyoxal (mittelgraue Balken) oder 3-DG (schwarze Balken). (Peptid und α-Dicarbonylverbindung je 5 mM, 100 mM Phosphatpuffer pH = 7,4, 60 °C, 3 d, Durchführung: 3.5.1).

Wie Abb. 4.2-1 weiterhin zu entnehmen ist, zeigen die α-Dicarbonylverbindungen gegenüber

den Tripeptiden eine abgestufte Reaktivität, wobei die Reaktivität in der Reihenfolge vom

3-DG über Methylglyoxal zum Glyoxal hin zunimmt. Dieser Befund steht offenbar in

Zusammenhang mit der Elektrophilie der Carbonylgruppen, da diese auf Grund von

Substituenteneffekten in der gleichen Weise steigt. Weiterhin wird die Neigung zur

Hydratisierung von Bedeutung sein. So ist beim Methylglyoxal bevorzugt die

Aldehydfunktion hydratisiert (Thornalley, 1996) und als reaktive Funktion verbleibt damit

nur die weniger elektrophile Ketogruppe. Beim Glyoxal ist demgegenüber bei Bildung des

Monohydrates immer noch eine reaktivere Aldehydfunktion vorhanden. Bei 3-DG dürfte die

- 124 -


verminderte Reaktivität zusätzlich auf die Ausbildung verschiedener cyclischer Isomere

zurückzuführen sein, welche in wässriger Lösung dominieren (Weenen & Tjan, 1994).

Gegenüber den anderen reaktiven Aminosäure-Derivaten werden andere Reihenfolgen in der

Reaktivität beobachtet. Hier dürften neben der Carbonylaktivität weitere durch die

Aminosäure bestimmte Faktoren eine Rolle spielen.

4.3 Die Reaktion des N-Terminus von Peptiden mit Glyoxal

4.3.1 Die Reaktion von Gly-Ala-Phe mit Glyoxal

Um die Reaktion der N-terminalen α-Amino-Gruppe von Peptiden mit Glyoxal unter

physiologischen Bedingungen detaillierter zu untersuchen, wurde das Tripeptid Gly-Ala-Phe

mit Glyoxal in 100 mM Phosphat-Puffer bei pH = 7,4 und 37 °C inkubiert.

0 10 20 30 40

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0 Gly-Ala-Phe

Produktt = 8 h

t = 0

Abs

orpt

ion

(λ =

220

nm

) [AU

]

Zeit [min]

Abb. 4.3.1-1: HPLC-Chromatogramme der Umsetzung von Gly-Ala-Phe mit Glyoxal. (Gly-Ala-Phe und Glyoxal je 5 mM, 100 mM Phosphatpuffer pH = 7,4, 37 °C, Durchführung: 3.5.1).

- 125 -


Mittels RP-HPLC und Detektion bei λ = 220 nm konnte eine sehr schnelle Derivatisierung

des Ausgangspeptides welche mit der Bildung eines definierten Reaktionproduktes einhergeht

beobachtet werden (Abb. 4.3.1-1 und Abb. 4.3.1-2). Der Umsatz an Peptid betrug bereits nach

8 h Reaktionszeit 53 %. Da in den Ansätzen auch nach 336 h (37 °C-Ansätze) oder 72 h

(60 °C-Ansätze) nur das anfangs gebildete Produkt detektierbar war, muss die Reaktion sehr

spezifisch erfolgen und das Produkt sehr stabil sein.

Aus der näheren kinetischen Analyse folgt, dass es sich bei der Reaktion von Gly-Ala-Phe mit

Glyoxal um eine Reaktion zweiter Ordnung handelt (Abb. 4.3.1-2). Die Geschwindigkeit der

Reaktion ist folglich der Konzentration beider Reaktionspartner proportional.

0 50 100 150 200 250 300 3500,0

0,1

0,2

0,3

0 50 100 150 200 250 300 350

0

100

200

300

400

B

R2 = 0,989

1 / P

eakf

läch

e

Zeit [h]

A

Pea

kflä

che

Abb. 4.3.1-2: Kinetische Analyse der Reaktion von Gly-Ala-Phe mit Glyoxal. A) Zeitlicher Verlauf der Peakfläche des Peptid-Peaks (■) und des Produkt-Peaks (○) bei λ = 220 nm. B) Graphische Prüfung auf eine Reaktion zweiter Ordnung - Zeitlicher Verlauf der reziproken Peakfläche des Peptid-Peaks (□). (Gly-Ala-Phe und Glyoxal je 5 mM, 100 mM Phosphatpuffer pH = 7,4, 37 °C, Durchführung: 3.5.1).

- 126 -


4.3.2 Identifikation des Reaktionsproduktes

Zur Aufklärung der Struktur wurden 112 mg der neuen Verbindung aus einem

semipräparativen Inkubationsansatz mittels RP-HPLC in chromatographisch reiner Form

isoliert. Das UV-Spektrum des Isolates bei pH = 7,0 weist neben der peptidspezifischen

Absorption bei λ = 210 nm eine charakteristische Bande mit einem Maximum bei λ = 322 nm

auf. Bei der daraufhin durchgeführten Prüfung auf Fluoreszenz erwies sich die isolierte

Verbindung als fluoreszierend mit λex, max = 330 nm und λem, max = 395 nm (siehe

Abb. 4.3.2-1). Durch Messung bei pH = 2,4 (100 mM Ameisensäure) oder pH = 8,3 (100 mM

Borat-Puffer) kommt es weder zu einer signifikanten Verschiebung des Maximums im

UV-Spektrum (λ = 322 nm) noch zu einer Veränderung des molaren Extinktionskoeffizienten

(ε322nm). Das gleiche gilt für das Maximum im Fluoreszenzspektrum und die Intensität der

Fluoreszenzemission. Folglich ist anzunehmen, das der Chromophor und Fluorophor keine

leicht ionisierbaren funktionellen Gruppen aufweist.

Mittels direkter ESI-MS Analyse konnte die relative monoisotopische Masse des Produktes

zu Mr = 314,7 bestimmt werden. Anhand dessen ist von einer Reaktion von einem Molekül

Peptid mit einem Molekül Glyoxal unter Elimination von zwei Molekülen Wasser

auszugehen.

200 300 400 5000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

200 300 400 500 600

A

Ext

inkt

ion

Wellenlänge [nm]

B

Rel

ativ

e Fl

uore

szen

zem

issi

on

Wellenlänge [nm]

Abb. 4.3.2-1: Absorptionsspektrum (A) und Fluoreszenzemissionsspektrum (λex, max = 330 nm, B) des Glyoxal-Gly-Ala-Phe-Reaktionsproduktes. Aufgenommen in 100 mM Phosphat-Puffer pH = 7,0.

- 127 -


Mittels ein- und zweidimensionale NMR Spektroskopie (1H, 13C, 1H-1H COSY, DEPT,

HSQC, HMBC) konnte die in Abb. 4.3.2-2 gezeigte Verbindung als Reaktionsprodukt

identifiziert werden. Die spektroskopischen Daten der 1H- und 13C-NMR Experimente sind in

Abschnitt 3.5.2 zusammengefasst.

In den Spektren werden neben den Signalen von Alanin und Phenylalanin zusätzliche Signale

im olefinischen Bereich detektiert. Bemerkenswert ist die Tieffeld-Verschiebung des Signals

des Alanin Methinprotons von δ = 4,37 ppm im Ausgangspeptid nach δ = 5,38 ppm im

Produkt, welche die Bildung eines neuen elektronenziehenden Substituenten anzeigt. Im

HMBC Spektrum korreliert dieses Proton mit dem C-2- und dem C-6-Atom des neuen

Substituenten und zeigt die Verknüpfung über das benachbarte Stickstoff-Atom an. Aus dem 1H-1H COSY und HSQC Spektren ist die Nachbarschaft der CH-5 Methingruppe zur CH-6

Methingruppe zu entnehmen. Das H-3 Methinproton erscheint als kleines Dublett und im

HMBC Spektrum sind Kreuzpeaks zu C-5 und zum quartären C-2 sowie eine schwache

Korrelation zu C-6 festzustellen. In der Summe der Ergebnisse konnte damit das eine

2(1H)-Pyrazinon-Struktur tragende Peptid N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-

phenylalanin (Abb. 4.3.2-2) als Reaktionsprodukt aufgeklärt werden.

H

N

NO

CH3

H

H

H1

3

6HN

OOH

O

N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin

Abb. 4.3.2-2: Strukturformel von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin. Die Pfeile zeigen charakteristische im HMBC Spektrum beobachtete Konnektivitäten an.

Die gefundene chemische Struktur deckt sich mit dem Ergebnis der massenspektroskopischen

Analyse. Die Bildung eines 2(1H)-Pyrazinon-Rings erklärt weiterhin die charakteristische

Absorption im UV oberhalb von 300 nm (λmax = 322 nm). Für das in der Struktur ähnliche

N1-Methyl-2(1H)-pyrazinon wurde ein UV-Maximum mit praktisch identischer Lage

- 128 -


(λmax = 323 nm, wässrige Lösung, pH = 7,0) festgestellt (Mason, 1957). Eine UV-Bande

oberhalb 300 nm ist ein allgemeines Charakteristikum für Pyrazin-Derivate und auf einem

n → π Übergang zurückzuführen (Halverson & Hirt, 1951, Mason, 1959). Der pKa-Wert des

Produktes dürfte ähnlich niedrig sein wie der von N1-Methyl-2(1H)-pyrazinon (pKa = - 0,04,

Albert & Phillips, 1956) und für die Konstanz der Lage der UV-Bande sowie die Konstanz

des Fluoreszenzspektrums im untersuchten pH-Bereich (pH = 2,4 bis 8,3) verantwortlich sein.

N

N O

OH

O

N

N O

OH

O

N

N O

NH

O

OH

O

N

N O

NH

O

OH

O

N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-acetyl]-glycin

N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-2-phenyl-acetyl]-alanin2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-2-phenyl-essigsäure

3-Methyl-2-(2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-valeriansäure

Abb. 4.3.2-3: Strukturformeln von dargestellten 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden

Im Folgenden wurden Inkubationsansätze bei 37 °C und pH = 7,4 von weiteren Peptiden

(z. B. Gly-Phe-Ala, Gly-Gly-Gly, Phe-Gly-Gly, Phe-Gly, Gly-Ile, Gly-Phe) und Glyoxal auf

die Bildung von entsprechenden 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden geprüft. Ausgewählte

2(1H)-Pyrazinon-Peptide wurden dabei semipräparativ gewonnen (Abb. 4.3.2-3). Die Analyse

der Inkubationsansätze erfolgte im ersten Schritt mittels RP-HPLC. Zur spezifischen

Detektion wurde mit Hilfe von zwei UV-Detektoren bei λ = 220 nm und λ = 320 nm sowie

mittels Fluoreszenzdetektor (λex = 320 nm, λem = 400 nm) gemessen. Die Ermittlung der

Masse der Produkte erfolgte mittels LC-ESI-MS. Diese Experimente zeigten, dass es bei der

Umsetzung der geprüften Tripeptide mit Glyoxal sehr schnell und spezifisch zur Bildung der

entsprechenden 2(1H)-Pyrazinon-Peptide kommt. Dipeptide reagierten langsamer und die

Bildung des 2(1H)-Pyrazinon-Peptides war bei einigen Dipeptiden ebenfalls sehr spezifisch,

z. B. bei Phe-Gly. Im Fall von Phe-Val wurde jedoch ein sehr heterogenes Produktspektrum

- 129 -


und kaum 2(1H)-Pyrazinon-Bildung beobachtet. Die Produkte der Reaktion von Gly-Phe-Ala,

Gly-Gly-Gly, Gly-Ile und Gly-Phe mit Glyoxal wurden im semipräparativen Maßstab isoliert

und die Struktur mittels ein- und zweidimensionalen NMR-Spektroskopie sowie ESI-MS

zweifelsfrei als die in Abb. 4.3.2-3 gezeigten 2(1H)-Pyrazinon-Peptide identifiziert (siehe

Abschnitt 3.5.3). Insgesamt betrachtet ist damit die Reaktion von Peptiden und Glyoxal zu

2(1H)-Pyrazinon-Peptiden unter physiologischen Bedingungen als ein allgemein zu

beobachtendes Phänomen anzusehen.

Bei den identifizierten 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden handelt es sich um Derivate die neben

anderen Produkten bereits von Prey & Petershofer (1968) unter Synthesebedingungen

(pH = 13, hoher Überschuss an Glyoxal) und Van Chuyen et al. (1973a, b) beim Erhitzen

(pH = 5,0, 100 °C, 1 h) erhalten wurden (siehe Abschnitt 2.3.4). Mit den vorliegenden

Untersuchungen konnte nun gezeigt werden, dass die Bildung von 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden

aus Peptiden und Glyoxal bereits unter physiologischen und damit sehr milden Bedingungen

erfolgt. Dabei ist besonders die ausgesprochen schnelle Reaktion und die spezifische Bildung

nur eines Reaktionsproduktes (bei Tripeptiden) hervorzuheben. Auf Grund der von Prey &

Petershofer (1968) und Van Chuyen et al. (1973a, b) angewendeten drastischen Bedingungen

war dieses Ergebnis nicht und vor allem nicht mit dieser Deutlichkeit zu erwarten. Eher war

demgegenüber die Bildung von α-Ketoacyl-Peptiden zu vermuten. Takahashi (1977a)

beschrieb deren Entstehung unter relativ milden Bedingungen (pH = 8,0, 25 °C, 1 h). Mittels

der angewendeten Analytik waren jedoch α-Ketoacyl-Peptide sowie andere mögliche

Reaktionsprodukte wie 1,3-Bispeptidyl-imidazolium-Salze (Davidek et al., 1991) und

Nα-Carboxymethyl-Peptide (Van Chuyen et al., 1972, 1973c) nicht nachweisbar.

4.3.3 Stabilität von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin

Um die Stabilität von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin sowohl im leicht

Basischen als auch im Sauren beurteilen zu können, wurden Inkubations-Experimente im

pH-Bereich von 2,0 bis 9,0 (60 °C, 3 d) durchgeführt. Das 2(1H)-Pyrazinon-Peptid zeigte sich

dabei als sehr stabil. Lediglich bei pH = 9,0 war ein kleiner zusätzlicher später eluierender

Peak feststellbar. Der Abbau war jedoch sehr gering (< 3 %).

- 130 -


Die Reversibilität der 2(1H)-Pyrazinon-Bildungsreaktion wurde durch Inkubation von

N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin (5 mM) in Gegenwart des α-Dicarbonyl-

reagenzes Aminoguanidin (25 mM, pH = 7,4, 60 °C, 3 d) geprüft. Mittels HPLC wurde ein

Abbau des 2(1H)-Pyrazinon-Peptides von ca. 9 % bestimmt. Ein zusätzlicher im

Chromatogramm auftretender Peak konnte dem 1,2,4-Triazin-Derivat zugeordnet werden,

welches bei der Reaktion von Aminoguanidin mit Glyoxal gebildet wird. Die Bildung von

2(1H)-Pyrazinon-Peptiden ist damit reversibel. Die nur geringe Rückbildung in Gegenwart

eines fünffachen molaren Überschusses an Aminoguanidin belegt aber auch die hohe

Stabilität der N-terminalen 2(1H)-Pyrazinon-Struktur.

Im Rahmen der durchgeführten Stabilitätsuntersuchungen ist dem 2(1H)-Pyrazinon-Tripeptid

damit insgesamt eine hohe Stabilität zuzuschreiben.

4.3.4 Zum Mechanismus der Bildung von 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden

Der Bildungsweg von 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden kann wie in Abb. 4.3.4-1 dargestellt

formuliert werden.

O

OR4

R5

+

α-Dicarbonyl

NHR3NH

H2N

H

O R2

O

R1 NHR3NH

O R2

OO

NR4

R5

R1

H

NHR3NH

O R2

OOH

NR4

R5

R1N

HN O

R5

R4

R2NHR3

O

R1

O

N

N OR5

R4

R2NHR3

O

R1

2(1H)-Pyrazinon-Peptid

- H2O+ H2O

+ H2O- H2O

Schiff Base

Enaminolα-Aminoketon

Peptid

Abb. 4.3.4-1: Postulierter Bildungsmechanismus von 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden.

Im ersten Schritt erfolgt eine Protonen-katalysierte Bildung einer Schiff Base. Anschließend

findet ähnlich dem Strecker-Abbau (siehe Abschnitt 2.3.3) eine Umlagerung am Azomethin-

- 131 -


Stickstoffatom statt. Es handelt sich dabei um eine Tautomerisierung eines α-Iminoketons in

ein Enaminol eines Imins. Dabei kann eine Übernahme des α-Protons der N-terminalen

Aminosäure durch die Ketogruppe postuliert werden kann. Die Abgabe und Aufnahme eines

Protons an bzw. aus dem Medium wäre ebenfalls denkbar (nicht gezeigt). Anschließend

unterliegt das gebildete Enaminol einer Tautomerisierung zum α-Aminoketon und es folgt

eine intramolekulare nucleophile Addition des Peptid-Stickstoffes an die Ketofunktion. Nach

Wasserabspaltung kommt es schließlich zur Ausbildung eines konjugierten cyclischen

Enamin-Imino-Keton-Systems, welches als 2(1H)-Pyrazinon bezeichnet wird.

Die Annahme, dass ein Enaminol eines Imins als Intermediat auftritt wird durch die

Isolierung und Identifizierung solcher Derivate in Form von N-(2-(3-Desoxy-ascorb-

3-ylimino)-acetyl)-Aminosäuren erhärtet (siehe Abb. 4.3.4-2). Diese Produkte wurden nach

Umsetzung von Dehydroascorbinsäure (DHA) mit verschiedenen Dipeptiden bei 75 °C für

30 min in Methanol erhalten (Sakurai & Ishii, 1988, Sakurai et al., 1988).

O

HO

OH

O

O

O H2N

HN O

OH

O

HH

OH

HO

OH

O

O

N

HN O

OH

O

+- H2O+ H2O

H

Gly-Ala DAIA-AlaDHA

Abb. 4.3.4-2: Reaktion von Dehydroascorbinsäure (DHA) mit Gly-Ala und Bildung von N-(2-(3-Desoxy-ascorb-3-ylimino)-acetyl)-Ala (DAIA-Ala) (Sakurai & Ishii, 1988, Sakurai et al., 1988).

4.4 Einflussfaktoren auf die Reaktion von Peptiden mit

α-Dicarbonylverbindungen und die Bildung von 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden

4.4.1 Einfluss der Struktur des Peptides

Zur Beurteilung des Einflusses der Primärstruktur des Peptides auf die 2(1H)-Pyrazinon-

Bildung wurden Inkubationsexperimente mit weiteren Peptiden und Aminosäure-Derivaten

durchgeführt (siehe Abb. 4.4.1-1). Die Peptide reagierten dabei spezifisch zum

- 132 -


2(1H)-Pyrazinon-Peptid, wobei sich jedoch eine deutliche Abhängigkeit der Primärstruktur

auf die Reaktion zeigte. Während das Ausmaß der 2(1H)-Pyrazinon-Bildung bei Gly-Phe-Ala

praktisch identisch wie bei Gly-Ala-Phe war, wurden bei Ala-Phe-Gly ein deutlich niedriger

und bei Phe-Gly-Gly ein deutlich höherer Umsatz gemessen (Abb. 4.4.1-1). Um diese

gemessenen Reaktivitäten zu diskutieren, wurden die pKa-Werte der N-terminalen

α-Aminogruppen mit der Software Solaris V 4.67 (siehe Literaturverzeichnis: Advanced

Chemistry Development [ACD]) berechnet. Da die pKa-Werte der N-terminalen

α-Aminogruppen von Gly-Phe-Ala (pKa = 7,67, ACD) und Gly-Ala-Phe (pKa = 7,66, ACD)

praktisch identische sind, Ala-Phe-Gly (pKa = 8,12, ACD) den höchsten und Phe-Gly-Gly

(pKa = 7,39, ACD) den niedrigsten pKa-Werte aufweist, bestimmen diese offensichtlich

wesentlich die Reaktionsgeschwindigkeit und vermutlich auch die Gleichgewichtslage. Für

die Kinetik der 2(1H)-Pyrazinon-Bildungsreaktion bedeutet dies, das vermutlich der erste und

einleitende Reaktionsschritt, die Bildung der Schiff Base (siehe Abschnitt 4.3.4), der

geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist und die folgenden intramolekularen Schritte

vergleichsweise schnell erfolgen.

GAF GFA AFG FGG FG F FG F-NH20

20

40

60

80

100

*

*

Um

satz

[%]

Peptid, Aminosäure-Derivat

Abb. 4.4.1-1: Umsatz an Peptid nach Umsetzung mit Glyoxal nach 24 h oder 2 h (*). (Peptid und Glyoxal je 5 mM, 100 mM Phosphatpuffer pH = 7,4, 37 °C, Durchführung: 3.5.1).

Das Dipeptid Phe-Gly zeigte eine deutlich geringere Reaktivität als das in der N-terminalen

Sequenz gleiche Tripeptid Phe-Gly-Gly. Auch hier sind die unterschiedlichen pKa-Werte als

Ursache anzusehen. Der pKa-Wert der α–Aminogruppe von Peptiden sinkt im allgemeinen

- 133 -


mit zunehmender Kettenlänge, so dass der pKa-Wert von Phe-Gly (pKa = 7,53 [25 °C],

Agoston et al.,1999, pKa = 7,55, ACD) höher ist als der von Phe-Gly-Gly (pKa = 7,39, ACD).

Die 2(1H)-Pyrazinon-Bildung aus Säureamiden ist ebenfalls möglich. Phenylalaninamid

(F-NH2) reagiert dabei deutlich schneller als Phe-Gly. Dies dürfte sowohl auf den niedrigeren

pKa-Wert der α-Aminogruppe von Phenylalaninamid (pKa = 7,26 [25 °C], Dallavalle et

al.,1989, pKa = 7,50, ACD) als auch auf eine bessere sterische Zugänglichkeit und Reaktivität

der Amidfunktion des Phenylalaninamids zurückzuführen sein. Aufgrund des Fehlens der

Amidfunktion war aus Phenylalanin erwartungsgemäß keine 2(1H)-Pyrazinon-Bildung zu

beobachten. Da auch kein sonstiger Abbau von Phenylalanin feststellbar war, findet unter den

angewendeten physiologischen Bedingungen ebenfalls kein Strecker-Abbau zum

Phenylacetaldehyd (siehe Abschnitt 2.3.3) und keine Bildung von

Nα-Carboxymethylphenylalanin (siehe Abschnitt 2.3.4) statt. Für diese Reaktionen sind die

Reaktionsbedingungen damit zu mild bzw. die Reaktionszeit ist zu kurz.

4.4.2 Einfluss der Struktur der α-Dicarbonylverbindung

Zur Abschätzung der Reaktivität wichtiger α-Dicarbonylverbindungen gegenüber der

α-Aminogruppe von Peptiden wurden diese mit Gly-Ala-Phe inkubiert. Dabei zeigte Glyoxal

auf Grund seiner hohen Carbonylaktivität die höchste Reaktivität (Abb. 4.4.2-1). Die anderen

α-Dicarbonylverbindung waren ebenfalls reaktiv. Als Ursache für die geringeren Umsätze bei

diesen Derivaten sind die verminderten Carbonylaktivitäten und zusätzlich im Fall von 3-DG

die Ausbildung cyclischer Formen anzusehen (siehe Abschnitt 4.2). Unterschiede waren

weiterhin im Produktspektrum festzustellen. Während die Reaktion mit Glyoxal spezifisch

zum 2(1H)-Pyrazinon-Peptid führte, wurden bei der Umsetzung mit Methylglyoxal mehrere

Produkte detektiert, wobei das 2(1H)-Pyrazinon-Peptid das Hauptprodukt war (siehe

Abschnitt 4.5.1). Bei der Reaktion von Diacetyl mit dem gewählten Peptid wurde

demgegenüber ein sehr komplexes Produktspektrum gebildet und der Umfang der

2(1H)-Pyrazinon-Bildung war gering.

- 134 -


GO MGO 3-DG Diacetyl0

20

40

60

80U

msa

tz a

n P

eptid

[%]

α-Dicarbonylverbindung

Abb. 4.4.2-1: Umsatz an Gly-Ala-Phe nach Reaktion mit Glyoxal, Methylglyoxal, 3-DG oder Diacetyl. Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). (Peptid und α-Dicarbonylverbindung je 5 mM, 100 mM Phosphatpuffer pH = 7,4, 37 °C, 24 h, Durchführung: 3.5.1).

4.4.3 Einfluss der Pufferionenart und Konzentration

Um den Einfluss des Puffers auf die 2(1H)-Pyrazinon-Bildung näher zu untersuchen, wurde

die Inkubation von Gly-Ala-Phe mit Glyoxal in verschiedenen Puffer-Lösungen

vorgenommen. Phosphat-Puffer wurde als Natriumphosphat-Puffer mit einer Konzentration

von 100 mM (Ionenstärke I = 285 mM), 50 mM (I = 143 mM) und 10 mM (I = 29 mM) sowie

als phosphatgepufferte Kochsalz-Lösung (PBS, cPhosphat = 10 mM, I = 167 mM) getestet.

Während die Umsätze im 100 mM und 50 mM Natriumphosphat-Puffer praktisch identisch

waren, wurde mit dem 10 mM Natriumphosphat-Puffer ein signifikant niedriger Umsatz

erzielt (Abb. 4.4.3-1). Die Reaktion in PBS führt zu einem Umsatz, der denen im 100 mM

und 50 mM Natriumphosphat-Puffer vergleichbar war. PBS enthält ebenfalls 10 mM

Phosphat, er weist jedoch eine deutlich höhere Ionenstärke auf. Nach Martell et al. (1998)

bewirkt im unteren Konzentrationsbereich eine Erhöhung der Ionenstärke eine leichte

Absenkung des pKa-Wertes der α-Aminogruppe, so dass in einem Puffer höherer Ionenstärke

der Anteil an unprotonierten und damit reaktiven α-Aminogruppen größer ist. Folglich dürfte

die Reaktionsgeschwindigkeit im untersuchten Konzentrationsbereich nicht primär durch die

Phosphatkonzentration sondern vielmehr durch die Ionenstärke beeinflusst sein. Die

2(1H)-Pyrazinon-Bildung unterliegt damit keiner konzentrationsabhängigen katalytischen

- 135 -


Wirkung durch Phosphat-Ionen wie sie insbesondere für die Amadori-Produkt-Bildung in der

Initialphase der Maillard-Reaktion beschrieben wurde (Watkins et al., 1987).

PB PB PB PBS MOPS Tris TAPSO0

10

20

30

100 mM 50 mM 10 mM 10 mM 100 mM 100 mM 100 mM

Um

satz

an

Pep

tid [%

]

Puffer

Abb. 4.4.3-1: Umsatz an Gly-Ala-Phe nach Reaktion mit Glyoxal in Abhängigkeit von der Art des Puffers. Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). (Peptid und Glyoxal je 5 mM, pH = 7,4, 37 °C, 2 h, Durchführung: 3.5.1).

Weiterhin wurden Inkubationen in Puffer-Lösungen durchgeführt die ebenfalls in

physiologischen Modellen Verwendung finden. Der Umsatz in MOPS-Puffer war dabei im

Vergleich zum PBS und Natriumphosphat-Puffer (50 mM, 100 mM) leicht erhöht. Kein

Umsatz war dagegen im TRIS- und TAPSO-Puffer zu beobachten (siehe Abb. 4.4.3-1). Die

Ursache für die Unterdrückung der 2(1H)-Pyrazinon-Bildung in den beiden letztgenannten

Puffern ist in der Struktur von TRIS und TAPSO zu sehen (siehe Abb. 4.4.3-2).

HN SO3HHO

OH

HO

OH

NH2HO

OH

HO

NO SO3H

MOPS TRIS TAPSO

Abb. 4.4.3-2: Struktur von 3-Morpholino-propansulfonsäure (MOPS), Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) und N-[Tris(hydroxymethyl)-methyl]-3-amino-2-hydroxy-propansulfonsäure (TAPSO)

- 136 -


TRIS und TAPSO besitzen eine primäre oder eine sekundäre Aminogruppe und sind damit

und auf Grund ihrer hohen Konzentration (100 mM) in der Lage das im Ansatz vorhandene

Glyoxal (5 mM) zu binden. Die Reaktion mit TRIS dürfte dabei primär zur Schiff Base

führen. MOPS weist demgegenüber nur eine gegenüber Glyoxal nicht reaktive tertiäre

Aminofunktion auf und wäre deshalb auch als Puffersubstanz geeignet.

4.4.4 Einfluss des pH-Wertes

Der Einfluss des pH-Wertes auf die Bildung von 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden wurde anhand der

Reaktion von Gly-Ala-Phe mit Glyoxal bei 37 °C über 2 und 24 h untersucht.

3,1 4,0 5,1 6,1 6,6 7,1 7,4 8,1 8,5 8,9 9,9 11,10

20

40

60

80

100

Um

satz

an

Pep

tid [%

]

pH-Wert

Abb. 4.4.4-1: Umsatz an Gly-Ala-Phe nach Reaktion mit Glyoxal bei ausgewählten pH-Werten nach 2 h (graue Balken) und 24 h (schwarze Balken). Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). (Peptid und Glyoxal je 5 mM, 100 mM Phosphat-Puffer definierten pH-Wertes, 37 °C, Durchführung: 3.5.1).

Wie Abb. 4.4.4-1 zu entnehmen ist, fand bei den gewählten Temperatur-Zeit-Kombinationen

die Reaktion ab pH = 6,1 statt. Es war mit steigendem pH-Wert ein stetiger Anstieg des

Umsatzes zu beobachten. Da der Anteil der freien unprotonierten und damit reaktiven

Aminofunktion mit zunehmenden pH-Wert steigt, war ein solches Verhalten prinzipiell bei

einer Amino-Carbonyl-Reaktion zu erwarten. Bei pH = 11,1 ist der Umsatz geringer als bei

pH = 9,9. Dieser Umsatzrückgang ist im Zusammenhang mit der bei hohen pH-Werten

- 137 -


stattfindenden Disproportionierung des Glyoxals zu Hydroxyessigsäure und Glyoxylsäure

(Cannizzaro-Reaktion) zu sehen. In den Reaktionsansätzen war ausschließlich das als

2(1H)-Pyrazinon modifizierte Peptid als Produkt zu detektieren, so dass die gemessenen

Umsätze der Bildungsrate des 2(1H)-Pyrazinons entsprechen. Es kann somit auf eine hohe

Spezifität der Reaktion in einem weiten pH-Bereich geschlossen werden.

Auf Grund der Ergebnisse sollten mit Basen behandelte Lebensmittel wie z. B. Laugengebäck

oder aufgeschlossenes Kakaopulver für eine 2(1H)-Pyrazinon-Bildung prädestiniert sein. Um

Anhaltspunkte über die 2(1H)-Pyrazinon-Bildung in den mengenmäßig dominierenden

Lebensmitteln mit schwach saurem pH-Wert zu erhalten, müssten insbesondere Experimente

bei technologisch relevanteren höheren Temperaturen durchgeführt werden.

Die Ergebnisse zeigen ferner, dass das Abstoppen der Inkubationen mit 100 mM oder

200 mM Ameisensäure, was zu einer Absenkung des pH-Wertes auf pH = 3 bis 4 führt, für

die Analytik sehr gut geeignet ist.

4.5 Die Reaktion des N-Terminus von Peptiden mit Methylglyoxal

4.5.1 Die Reaktion von Gly-Ala-Phe mit Methylglyoxal

Die Reaktion von Peptiden mit Methylglyoxal wurde näher anhand des Peptides Gly-Ala-Phe

unter physiologischen Bedingungen (pH = 7,4, 37 °C) untersucht. Wie bereits bei den

Inkubationen mit Glyoxal konnte eine sehr schnelle Derivatisierung des Peptides festgestellt

werden, z. B. 50 % Umsatz nach 8 h. Gegenüber den Umsetzungen mit Glyoxal war das

Produktspektrum jedoch komplexer (siehe Abb. 4.5.1-1). Der Hauptproduktpeak zeigte

jedoch die für 2(1H)-Pyrazinone typische Absorption bei λ = 320 nm sowie Fluoreszenz

(λex = 320 nm, λem = 400 nm) und es konnte die Dominanz eines solchen Produktes vermutet

werden.

- 138 -


0 10 20 30 40

0,0

0,2

0,4

0,6Fluoreszenzex. 320 nmem. 400 nm

Gly-Ala-Phe

Produkt

UV 320 nm

UV 220 nm

Abs

orpt

ion,

Flu

ores

zenz

[AU

]

Zeit [min]

Abb. 4.5.1-1: HPLC-Chromatogramme der Umsetzung von Gly-Ala-Phe mit Methylglyoxal. (Peptid und Methylglyoxal je 5 mM, 100 mM Phosphatpuffer pH = 7,4, 37 °C, 8 h, Durchführung: 3.5.1).

Die kinetischen Betrachtungen zur Reaktion mit Methylglyoxal weisen ebenfalls auf ein

komplizierteres Reaktionsgeschehen hin (Abb. 4.5.1-2). Bis zu einer Reaktionszeit von 96 h

ist bei der Reaktion mit Methylglyoxal der zeitliche Verlauf der Peptid-Derivatisierung der

Umsetzung mit Glyoxal (siehe Abb. 4.3.1-2) ähnlich. Anschließend ist jedoch ein annähernd

linearer Abbau festzustellen. Bei Betrachtung bis zu 240 h lässt sich die Reaktion dennoch gut

als Reaktion zweiter Ordnung beschreiben (Abb. 4.5.1-2, B). Die Produkt-Bildungskurve

weist wie bei Glyoxal einen asymptotischen Verlauf auf. Der Umfang der Bildung des

Hauptproduktes ist jedoch deutlich geringer und die Produkt-Bildung stagniert bereits nach

48 h bis 72 h. Da nach 336 h eine leichte Abnahme an Produkt festzustellen ist, unterliegt

dieses offenbar Folgereaktionen.

- 139 -


0 50 100 150 200 250 300 3500,00

0,03

0,06

0,090 50 100 150 200 250 300 350

0

50

100

150

BR2 = 0,905

1 / P

eakf

läch

e

Zeit [h]

AP

eakf

läch

e

Abb. 4.5.1-2: Kinetische Analyse der Reaktion von Gly-Ala-Phe mit Methylglyoxal. A) Zeitlicher Verlauf der Peakfläche des Peptid-Peaks (■) und des Produkt-Peaks (○) bei λ = 220 nm. B) Graphische Prüfung auf eine Reaktion zweiter Ordnung - Zeitlicher Verlauf der reziproken Peakfläche des Peptid-Peaks (□). (Peptid und Methylglyoxal je 5 mM, 100 mM Phosphatpuffer pH = 7,4, 37 °C, Durchführung: 3.5.1)

4.5.2 Identifikation des Reaktionsproduktes

Um das Hauptprodukt der Reaktion von Gly-Ala-Phe mit Methylglyoxal strukturell

aufzuklären, wurde eine entsprechende semipräparative Inkubation unter physiologischen

Bedingungen (37 °C, pH = 7,4) durchgeführt und der Ansatz mittels RP-HPLC fraktioniert.

Das UV-Spektrum des chromatographisch rein erhaltenen Hauptproduktes besitzt wie das des

Glyoxalderivates N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin eine charakteristische

Bande oberhalb von 300 nm (Abb. 4.5.2-1). Das Maximum weist jedoch eine bathochrome

Verschiebung auf und liegt bei λmax = 336 nm. Die Wellenlängen für die maximale

Fluoreszenzemission sind mit λex = 340 nm und λem = 405 nm gegenüber dem Glyoxal-

Produkt ebenfalls leicht bathochrom verschoben (Abb. 4.5.2-1). Eine Abhängigkeit der UV-

- 140 -


und Fluoreszenz-Charakteristika vom pH-Wert war im untersuchten Bereich von pH = 2,4

(100 mM Ameisensäure) bis pH = 8,3 (100 mM Borat-Puffer) nicht festzustellen. Damit ist

anzunehmen, das der Chromophor und Fluorophor keine leicht ionisierbaren funktionellen

Gruppen aufweist.

Mittels direkter ESI-MS Analyse konnte die relative monoisotopische Masse des Produktes

zu Mr = 329,1 bestimmt werden. Wie bei der Reaktion mit Glyoxal ist folglich von einer

Reaktion von einem Molekül Peptid mit einem Molekül Methylglyoxal unter Elimination von

zwei Molekülen Wasser auszugehen.

200 300 400 5000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

200 300 400 500 600

A

Extin

ktio

n

Wellenlänge [nm]

BR

elat

ive

Fluo

resz

enze

mis

sion

Wellenlänge [nm]

Abb. 4.5.2-1: Absorptionsspektrum (A) und Fluoreszenzemissionsspektrum (λex, max = 330 nm, B) des Methylglyoxal-Gly-Ala-Phe-Reaktionsproduktes. Aufgenommen in 100 mM Phosphat-Puffer pH = 7,0.

Die chemische Struktur des Reaktionsproduktes konnte anhand der entsprechenden ein- und

zweidimensionale NMR-Experimente (1H, 13C, 1H-1H COSY, DEPT, HSQC, HMBC) als

N-[2-(5-Methyl-2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin (Abb. 4.5.2-2) aufgeklärt

werden und ist konsistent mit der massenspektroskopischen Analyse. Es handelt sich damit

wie das Produkt der Umsetzung mit Glyoxal um ein 2(1H)-Pyrazinon-Derivat.

Bei der Struktur-Aufklärung stellte sich insbesondere die Frage, ob sich die vom

Methylglyoxal stammende Methylgruppe an Position 5 oder 6 am 2(1H)-Pyrazinon-Ring

- 141 -


befindet. Aufschluss gaben hierzu vor allem die im HMBC-Spektrum beobachteten

Kopplungen (Abb. 4.5.2-2). So zeigte das Methinproton vom Alanin nur zum C6-Atom des

2(1H)-Pyrazinon-Rings und nicht zum C5-Atom eine Kopplung. Die Protonen der Ring-

Methylgruppe koppelten sowohl mit C5 als auch mit C6. Anhand dessen war eindeutig

festzustellen, dass sich die Methylgruppe an Position 5 befindet.

H

N

NO

CH3

H

H3C

H1

3

6HN

OOH

O

4

N-[2-(5-Methyl-2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin

Abb. 4.5.2-2: Strukturformel von N-[2-(5-Methyl-2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin. Die Pfeile zeigen charakteristische im HMBC Spektrum beobachtete Konnektivitäten an.

Da das 5-Methyl-2(1H)-pyrazinon das Hauptprodukt ist und keine Hinweise auf das isomere

6-Methyl-Derivat gefunden wurden, muss die Reaktion im hohen Maß regioselektiv sein. Bei

der Bildungsreaktion (siehe Abschnitt 4.3.4) wird dementsprechend im ersten Schritt die

Ketogruppe und nicht die Aldehydfunktion des Methylglyoxals durch die primäre

Aminogruppe angegriffen. Eine Aldehydfunktion ist im allgemeinen reaktiver als eine

Ketogruppe. Im Fall von Methylglyoxal liegt die Aldehydgruppe in wässriger Lösung jedoch

überwiegend hydratisiert und damit weniger reaktiv vor (Thornalley,1996), so das es offenbar

aufgrund dessen zu der beobachteten Regioselektivität kommt.

Die selektive Bildung von 5-substituierten 2(1H)-Pyrazinon-Derivaten ist nicht nur auf die

angewendeten milden physiologischen Bedingungen begrenzt. Bei Umsetzungen von

Methylglyoxal mit N-(Benzyloxy)-glycinamid (Ohkanda, et al., 1996) oder Phenylglyoxal mit

Glycinamid (Sato, 1978) unter synthetischen Bedingungen im stark alkalischen Milieu

wurden ebenfalls eine solche Regioselektivität festgestellt.

- 142 -


4.6 Die Reaktion des N-Terminus von Peptiden mit 3-Desoxyglucosulose

Als weiterer potenzieller Reaktionspartner für die α-Aminogruppe von Peptiden wurde die

α-Dicarbonylverbindung 3-Desoxyglucosulose in die Studien einbezogen. Wie bei den

kürzerkettigen α-Dicarbonylverbindungen war in den Inkubationsansätzen mittels RP-HPLC

die Bildung eines Hauptproduktes zu detektieren, welches Absorption bei λ = 320 nm zeigt

(Abb. 4.6-1).

0 10 20 30 400,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

UV 220 nm

UV 320 nm

HauptproduktGly-Ala-Phe

Abso

rptio

n [A

U]

Zeit [min]

Abb. 4.6-1: HPLC-Chromatogramme der Umsetzung von Gly-Ala-Phe mit 3-DG. (Peptid und 3-DG je 5 mM, 100 mM Phosphatpuffer pH = 7,4, 60 °C, 3 d, Durchführung: 3.5.1).

Im Vergleich zu den zuvor untersuchten α-Dicarbonylverbindungen erfolgt die Reaktion mit

3-DG jedoch deutlich langsamer. Nach 24 h war z. B. ein Umsatz von ca. 10 % festzustellen

(pH = 7,4, 37 °C). Der zeitliche Verlauf der Derivatisierung des Peptides (Abb. 4.6-2) weist

ähnlich wie bei Methylglyoxal auf ein komplexeres Reaktionsgeschehen mit zunehmender

Reaktionszeit hin. Auf Grund dessen ist die Reaktion nicht mehr mit einem einfachen

Geschwindigkeits-Zeit-Gesetz sinnvoll zu beschreiben. Die Auswertung in Hinblick auf eine

- 143 -


Reaktion zweiter Ordnung liefert z. B. lediglich ein Bestimmtheitsmaß von R2 = 0,84 (Daten

bis 240 h) oder R2 = 0,67 (Daten bis 336 h). Hinzu kommt, dass nach 240 h erst ein Umsatz

von 58 % erreicht wird und bei Umsätzen bis 50 % und einem analytischen Fehler von ± 5 %

die Bestimmung der Reaktionsordnung nicht sicher möglich ist (Labuza, 1984). Insbesondere

ab einer Reaktionszeit von 168 h entspricht die Bildung des Hauptproduktes nicht mehr der

Peptid-Derivatisierung. Im Gegensatz zur Umsetzung mit Methylglyoxal kommt es jedoch im

untersuchten Zeitfenster bis 336 h nicht zur Stagnation der Bildung des Hauptproduktes.

0 50 100 150 200 250 300 350

0.000

0.005

0.010

0.015

0 50 100 150 200 250 300 350

0

50

100

150

200

R2 = 0,844

B

1 / P

eakf

läch

e

Zeit [h]

A

Pea

kflä

che

Abb. 4.6-2: Kinetische Analyse der Reaktion von Gly-Ala-Phe mit 3-DG. A) Zeitlicher Verlauf der Peakfläche des Peptid-Peaks (■) und des Produkt-Peaks (○) bei λ = 220 nm. B) Graphische Prüfung auf eine Reaktion zweiter Ordnung - Zeitlicher Verlauf der reziproken Peakfläche des Peptid-Peaks (□). (Peptid und 3-DG je 5 mM, 100 mM Phosphatpuffer pH = 7,4, 37 °C, Durchführung: 3.5.1)

Das UV-Spektrum des Hauptproduktes weist eine Bande oberhalb von 300 nm mit einem

Maximum von λUV, max = 334 nm auf. Weiterhin fluoresziert die Verbindung mit

λex, max = 337 nm und λem, max = 402 nm (siehe Abb. 4.6.-3). Beide Merkmale wurden bereits

bei N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin (siehe Abschnitt 4.3.2) und

- 144 -


N-[2-(5-Methyl-2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin (siehe Abschnitt 4.5.2)

festgestellt und sind charakteristisch für 2(1H)-Pyrazinone. Es ist folglich davon auszugehen,

dass es bei der Reaktion der N-Termini von Peptiden mit 3-Desoxyglucosulose ebenfalls zur

Bildung von 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden kommt. Die weitere Charakterisierung und der

spektroskopische Nachweis der Struktur dieser Produkte sollten Gegenstand weiterer

Untersuchungen sein.

200 300 400

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

200 300 400 500 600

A

Extin

ktio

n

Wellenlänge [nm]

B

Rel

ativ

e Fl

uore

szen

zem

issi

on

Wellenlänge [nm]

Abb. 4.6-3: Absorptionsspektrum (A) und Fluoreszenzemissionsspektrum (λex, max = 337 nm, B) des Hauptproduktes der Reaktion von Gly-Ala-Phe mit 3-DG. Peak bei HPLC mit tR = 31 min (siehe Abb. 4.6.1-1) gesammelt und Spektren in HPLC-Eluent (Eluenten-System E3, ca. 30 % B, siehe Abschnitt 3.2.1) aufgenommen.

Wie bereits erwähnt erfolgte sowohl die Derivatisierung von Gly-Ala-Phe als auch von

anderen Peptiden (siehe auch Abb. 4.2-1) durch 3-Desoxyglucosulose langsamer als durch

Glyoxal und Methylglyoxal. Die in vivo gemessenen Gehalte an Glyoxal, Methylglyoxal und

3-Desoxyglucosulose bewegen sich im µmol/kg-Bereich und in der gleichen Größenordnung

(siehe Tab. 2.3.1-1). Die in Lebensmitteln bestimmten Gehalte an Glyoxal und Methylglyoxal

bewegen sich ebenfalls in diesem Bereich (siehe Tab. 2.3.1-2). Über die Gehalte von

3-Desoxyglucosulose in Lebensmitteln ist demgegenüber vergleichsweise wenig bekannt.

Weigel et al. (2004) bestimmten relativ hohe Gehalte von 1110 µmol/kg (Median) in Honig.

Von Rättich (2004) wurden Gehalte an 3-Desoxyglucosulose in Kaffeesahne, Kondensmilch

und Kakaomilch von ca. 3 µmol/l und in Malzbier von ca. 130 µmol/l ermittelt. Damit sind in

- 145 -


Lebensmitteln Gehalte an 3-Desoxyglucosulose messbar die auch für Glyoxal und

Methylglyoxal gefunden werden. Bei der Beurteilung der bestimmten Gehalte an

α-Dicarbonylverbindungen ist zu berücksichtigen, dass bei der Bestimmung nur die freien

und ggf. die leicht reversibel gebundenen α-Dicarbonylverbindungen erfasst werden.

α-Dicarbonylverbindungen gehen aufgrund ihrer hohen Reaktivität nach der Bildung schnell

Folgereaktionen ein. Die bestimmten Gehalte geben deshalb nur begrenzt Auskunft über die

insgesamt auftretenden Mengen. Zusätzlich hat die Probenvorbereitung zur Bestimmung der

Gehalte einen erheblichen Einfluss auf die Ergebnisse (Lal et al., 1997).

Auf Grund von Modelluntersuchungen von Hofmann (1999) ist das Auftreten von

3-Desoxyglucosulose insbesondere bei stärker erhitzten Lebensmitteln zu erwarten. Weiterhin

ist diesen Untersuchungen zu entnehmen, dass unter den Bedingungen der Maillard-Reaktion

3-Desoxyglucosulose aus quantitativer Sicht bedeutender ist als Glyoxal und Methylglyoxal.

In gewissem Umfang ist dies auch vom Bildungsweg der 3-Desoxyglucosulose zu erwarten.

3-Desoxyglucosulose ist ein direktes Abbauprodukt des Amadori-Produktes (Ledl &

Schleicher, 1990) und Amadori-Produkte sind die quantitativ wichtigsten Verbindungen der

Maillard-Reaktion in Lebensmittel und in vivo (Henle, 2003). Die Bildung von

3-Desoxyglucosulose erfolgt ferner auch direkt aus dem Zucker ohne Aminkatalyse (Anet,

1964) und in vivo zusätzlich aus Fructose-3-phosphat (Szwergold et al., 1990). Fructose-

3-phosphat entsteht bei dem enzymatischen Abbau von Fructoselysin durch das deglykierende

Enzym Fructosamin-3-kinase (Delpierre et al., 2002). Als Folgeprodukte der 3-Desoxy-

glucosulose sind z. B. Hydroxymethylfurfural in Lebensmitteln (Van Boekel, 1998, Sanz et

al., 2003) sowie Pyrralin in Lebensmitteln und in vivo von Bedeutung (Hayase, et al. 1989,

Förster & Henle, 2003). In Hinblick auf die Quantität der Reaktionsprodukte der einzelnen

α-Dicarbonylverbindungen ist damit insgesamt betrachtet zu vermuten, dass die etwas

geringere Reaktivität der 3-Desoxyglucosulose durch ihre höhere Bildungsrate ausgeglichen

wird. Somit könnten N-terminale 2(1H)-Pyrazinone des Glyoxals und Methylglyoxals auf

Grund der hohen Reaktivität und 2(1H)-Pyrazinone der 3-Desoxyglucosulose auf Grund der

hohen Quantität der Ausgangsdicarbonylverbindungen sowohl in Lebensmittel als auch

in vivo von Bedeutung sein.

- 146 -


4.7 Einordnung der Reaktivität des N-Terminus von Peptiden gegenüber

α-Dicarbonylverbindung

In den vorangegangenen Inkubationsexperimenten wurde unter den gewählten

physiologischen Modell-Bedingungen eine hohe Reaktivität der α-Aminogruppe von

Peptiden gegenüber α-Dicarbonylverbindungen festgestellt. In der Literatur werden die

nucleophilen Seitenketten von Arginin und Lysin als die Hauptreaktionspartner für

α-Dicarbonylverbindungen an Proteinen angesehen, wobei Arginin ein höheres Reaktions-

vermögen zugeschrieben wird (siehe Abschnitt 2.3.2, Nakaya, et al. 1967, Takahashi,

1977a, b).

Um die Reaktivität der α-Aminogruppe von Peptiden gegenüber den bekannten

Reaktionspartnern beurteilen zu können, wurden ausgewählte Peptide mit Glyoxal,

Methylglyoxal oder 3-Desoxyglucosulose (3-DG) inkubiert (siehe Abb. 4.7-1 und 4.7-2).

Dabei dienten Gly-Ala-Phe (GAF), Nα-Hippuryllysin (BzGK) und Nα-Hippurylarginin

(BzGR) als Modellpeptide für den N-Terminus, für proteingebundenes Lysin bzw.

proteingebundenes Arginin. Es wurden sowohl separate Ansätze, ein Peptid plus eine

α-Dicarbonylverbindung, als auch kompetitive Ansätze, Gly-Ala-Phe plus Nα-Hippuryl-

arginin plus eine α-Dicarbonylverbindung, angefertigt. Die Konzentration jedes Reaktions-

partners betrug 5 mM und es wurde in 100 mM Phosphatpuffer bei 37 °C für 24 h inkubiert.

0

20

40

60

80

100

separate gemeinsame Inkubationen Inkubation

BzGK BzGR GAF BzGR GAF

Der

ivat

isie

rung

[%]

Abb. 4.7-1: Umsatz an Peptid nach Inkubation mit Glyoxal. (Peptide und Glyoxal je 5 mM, 100 mM Phosphatpuffer pH = 7,4, 37 °C, 24 h, Durchführung: 3.5.1).

- 147 -


Bei den Umsetzungen mit Glyoxal zeigten Nα-Hippurylarginin und Gly-Ala-Phe sowohl bei

separater Inkubation als auch unter kompetiven Bedingungen jeweils eine nahezu gleiche

Reaktivität (siehe Abb. 4.7-1). Eine Lysin-Derivatisierung konnte unter den gewählten

Bedingungen nicht festgestellt werden. Die Inkubation in PBS über 15 d und unter sonst

identischen Bedingungen führte jedoch zu einer gewissen Bildung von Nα-Hippuryl-

Nε-carboxymethyllysin, der Umsatz zum CML-Derivat betrug ca. 0,5 %.

Bei den Inkubationen mit Methylglyoxal zeigte Nα-Hippurylarginin eine deutlich höheres

(separate Inkubationen) oder leicht erhöhtes (gemeinsame Inkubation) Reaktionsvermögen als

Gly-Ala-Phe (siehe Abb. 4.7-2). Mit Nα-Hippuryllysin konnte keine Reaktion beobachtet

werden. Gegenüber 3-DG zeigten Nα-Hippurylarginin und Gly-Ala-Phe sowohl bei separater

als auch bei gemeinsamer Inkubation eine ähnliche Reaktivität (siehe Abb. 4.7-2).

Nα-Hippuryllysin erwies sich wiederum als nicht reaktiv.

0

20

40

60

80

100



Der

ivat

isie

rung

[%]

0

20

40

60

80

100



Der

ivat

isie

rung

[%]

Abb. 4.7-2: Umsatz an Peptid nach Inkubation mit Methylglyoxal (links) oder 3-DG (rechts). (Peptide und α-Dicarbonylverbindung je 5 mM, 100 mM Phosphatpuffer pH = 7,4, 37 °C, 24 h, Durchführung: 3.5.1).

Die Untersuchungen belegen für das gewählte Modellsystem eine ähnliche bis nahezu gleiche

Reaktivität des N-Terminus von Peptiden und der Guanidino-Funktion des Arginins

gegenüber Glyoxal, Methylglyoxal und 3-DG. Lysin zeigte sich demgegenüber als nicht

reaktiv. In vivo als auch in Lebensmitteln wurden bereits zahlreiche Reaktionsprodukte der

untersuchten α-Dicarbonylverbindungen mit Arginin nachgewiesen sowie quantifiziert (siehe

Abschnitt 2.3.2). Folglich ist anzunehmen, dass es ebenfalls zur Derivatisierung der

- 148 -


N-terminalen α-Aminogruppe und der Bildung von 2(1H)-Pyrazinonen in diesen Systemen

kommt.

Als ein weiteres Indiz für diese These ist die charakteristische Fluoreszenz der untersuchten

.8 Analyse peptidgebundener 2(1H)-Pyrazinone nach Salzsäurehydrolyse

4.8.1 Salzsäurehydrolyse von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-phenyl-

Um peptid- und proteingebundene 2(1H)-Pyrazinone in Lebensmitteln und in in vivo-

ie

2(1H)-Pyrazinone zu werten (λex, max = 330 nm bis 340 nm, λem, max = 395 nm bis 405 nm).

Mit dem Fortschreiten der Maillard-Reaktion wird im allgemeinen eine Zunahme der

Fluoreszenz beobachtet. Die Messung dieser Maillard-spezifischen Fluoreszenz wird oft

genutzt um den Fortschritt von Glykierungsreaktionen zu beurteilen. Über die Struktur der

verantwortlichen Fluorophore ist jedoch nur zum Teil bekannt (Kollias et al., 1998, Avendano

et al., 1999, Birlouez-Aragon, et al. 2001). Es ist deshalb zu vermuten, dass ein Teil der in

in vivo und in thermisch behandelten Lebensmitteln beobachteten Fluoreszenz auf die

Bildung von 2(1H)-Pyrazinonen zurückzuführen ist. Weitere Studien sollten sich deshalb mit

dem Nachweis von 2(1H)-Pyrazinonen in in vivo-Proben und in Lebensmitteln befassen.

4

alanin

Materialien spezifisch nachweisen und bestimmen zu können, ist eine reproduzierbare

Freisetzung der 2(1H)-Pyrazinon-Struktur oder eines Folgeproduktes aus dem Peptid- bzw.

Proteinverband notwendig. Ob dies durch eine Säurehydrolyse möglich ist, wurde anhand des

2(1H)-Pyrazinon-Peptides N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-phenylalanin geprüft.

Wie dem in Abb. 4.8.1-1 gezeigten Aminosäurechromatogramm zu entnehmen ist, sind d

Gehalte an Glycin und Alanin in einem Hydrolysat von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-

propionyl]-phenylalanin deutlich geringer als der Gehalt an Phenylalanin. Die Hydrolyse der

2(1H)-Pyrazinon-Struktur zu den Ausgangsaminosäuren ist folglich nicht vollständig. Damit

ist zu vermuten, dass der 2(1H)-Pyrazinon-Ring zu einem nicht unerheblichen Anteil intakt

geblieben ist oder dass ein Abbau zu anderen mit Ninhydrin nicht anfärbbaren Verbindungen

stattgefunden hat. Weiterhin ist eine zeitliche Abhängigkeit des Abbaus während der

Hydrolyse festzustellen. So steigt die Wiederfindung an Glycin (bezogen auf Phenylalanin)

- 149 -


mit 15,5 % (16 h Hydrolysezeit), 21,0 % (23 h) oder 26,0 % (48 h) und die von Alanin mit

29,6 % (16 h), 35,0 % (23 h) oder 40,2 % (48 h) mit zunehmender Hydrolysezeit.

0 10 20 30 40 50 600,0

0,1

0,2

0,3

0,4

Ammoniak

Phe

AlaGlyA

bsor

ptio

n (λ

= 5

70 n

m) [

AU

]

Zeit [min]

Abb. 4.8.1-1: Aminosäurechromatogramm eines Salzsäurehydrolysates von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-phenylalanin. (6 M Salzsäure, 110 °C, 23 h, Durchführung: 3.2.3, 3.6.1).

Um im UV absorbierende sowie fluoreszierende Abbauprodukte zu detektieren, wurden die

Hydrolysate mittels RP-HPLC untersucht. Dazu wurde zunächst wie zur Aminosäureanalyse

üblich die Salzsäure aus den Hydrolysaten im Vakuum am Zentrifugalverdampfer entfernt.

Anschließend wurden die Proben in HPLC-Eluent gelöst. Die HPLC-Chromatogramme der

auf diese Weise aufbereiteten Proben unterschieden sich jedoch wesentlich von den HPLC-

Chromatogrammen bei denen der Salzsäureüberschuss durch Zugabe von Citrat-Puffer

beseitigt wurde (siehe Abb. 4.8.1-2).

In den mit Citrat-Puffer behandelten Proben waren zwei zusätzliche Peaks detektierbar,

welche die für 2(1H)-Pyrazinone charakteristische Absorption bei λ = 320 nm sowie

Fluoreszenz zeigten. Es war somit davon auszugehen, dass es sich um Abbauprodukte mit

2(1H)-Pyrazinon-Struktur handelt, welche im Zentrifugalverdampfer flüchtig sind oder einen

weiteren Abbau unterliegen. Bei den folgenden Untersuchungen wurde deshalb der

Salzsäureüberschuss durch Zugabe von Citrat-Puffer entfernt.

- 150 -


Alternativ ist es möglich beide Abbauprodukte aus einem alkalisch eingestellten Hydrolysat

(ca. pH = 12) mit Chloroform zu extrahieren. Für die anschließende Analyse wird das

Lösungsmittel im Stickstoffstrom entfernt und der Rückstand in HPLC-Eluent aufgenommen.

0 10 20 30

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

2,1

Fluoreszenzex. 320 nmem. 400 nm

UV 320 nm

UV 220 nm

Abs

orpt

ion,

Flu

ores

zenz

emis

sion

[AU

]

Zeit [min]

0 10 20 30

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

2,1 Produkt 1

Produkt 2


UV 320 nm

UV 220 nm

Abs

orpt

ion,

Flu

ores

zenz

emis

sion

[AU

]

Zeit [min]

Abb. 4.8.1-2: HPLC-Chromatogramme eines Salzsäurehydrolysates von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-phenylalanin. Salzsäure mittels Zentrivugalverdampfer entfernt (links). Salzsäure mit Citrat-Puffer abgepuffert (rechts). (Hydrolyse: 6 M Salzsäure, 110 °C, 23 h, Durchführung: 3.6.1).

4.8.2 Identifikation der Hydrolyseprodukte von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-

propionyl]-phenylalanin

Die Untersuchung des Hydrolyseverlaufes zeigte, dass die Konzentration der beiden

Abbauprodukte von der Hydrolysezeit abhängig ist (Abb. 4.8.2-1). Während der Hydrolyse

wird offenbar Abbauprodukt 2 auf Kosten von Abbauprodukt 1 gebildet, so dass Produkt 1

nach 48 h nahezu nicht mehr detektierbar ist.

Um die Hydrolyseprodukte strukturell aufzuklären, wurde ihre Masse mittels LC-ESI-MS

bestimmt. Anhand dessen wurde für Produkt 1 eine relative monoisotopische Masse von

Mr = 168,14 ([M+H]+ m / z = 169,15) und für Produkt 2 Mr = 124,06 ([M+H]+

m / z = 125,07) bestimmt. Bei Hydrolyseprodukt 1 handelt es sich folglich vermutlich um

2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionsäure (Mr,theoret. = 168,05), welches durch Hydrolyse der

Peptidbindung des eingesetzten 2(1H)-Pyrazinon-Tripeptides entsteht (Abb. 4.8.2-2). Die

- 151 -


zwischen Produkt 1 und Produkt 2 auftretende Massendifferenz von ∆M = 44,08 entspricht

der Masse von Kohlendioxid. Somit ist die Decarboxylierung von Produkt 1 und die Bildung

von N1-Ethyl-2(1H)-pyrazinon anzunehmen. Eine solche Decarboxylierung von

2(1H)-Pyrazinon-Dipeptiden und die Bildung der entsprechenden N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinone

wurde auch ohne den Einfluss von Salzsäure bei stark erhöhter Temperatur unter Druck im

Autoklaven festgestellt (wässrige Lösung, 180 °C, 30 min, Izzo & Ho, 1992). Die Absorption

der beiden Produkte bei λ = 320 nm sowie ihre Fluoreszenz zeigen ebenfalls den Erhalt der

2(1H)-Pyrazinon-Struktur an.

0 10 20 30

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Produkt 2Produkt 1t = 16 h

t = 23 h

t = 48 hAbs

orpt

ion

(λ =

320

nm

) [A

U]

Zeit [min]

Abb. 4.8.2-1: HPLC-Chromatogramme von Salzsäurehydrolysaten von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-phenylalanin nach verschiedenen Hydrolysezeiten. (Hydrolyse: 6 M Salzsäure, 110 °C, Durchführung: 3.6.1).

Um den Hydrolysemechanismus (Abb. 4.8.2-2) abzusichern, wurde 2-(2-Oxo-2H-pyrazin-

1-yl)-propionsäure durch Inkubation von Gly-Ala mit Glyoxal gewonnen. Die in Abb. 4.8.2-3

(links) dargestellte Standardaddition zeigt, dass 2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionsäure und

Produkt 1 zeitgleich eluieren. Weiterhin wurde 2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionsäure einer

Salzsäurehydrolyse unterzogen. Das isolierte Abbauprodukt konnte anhand der massen- und

- 152 -


NMR-spektroskopischen Daten zweifelsfrei als das erwartete N1-Ethyl-2(1H)-pyrazinon

aufgeklärt werden (siehe Abschnitt 3.6.2). Die Zuspritzung des semipräparativ gewonnenen

N1-Ethyl-2(1H)-pyrazinon zum Hydrolysat von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-

phenylalanin (Abb. 4.8.2-3) zeigt die Identität des N1-Ethyl-2(1H)-pyrazinons mit Produkt 2

an.

NHOH

O

O

N

N

O

OH

O

N

N

O N

N

O

N1-Ethyl-2(1H)-pyrazinon(1-Ethyl-2H-oxo-2H-pyrazin)

2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionsäure

N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin

- Phe - CO2

Abb. 4.8.2-2: Salzsäurehydrolyse von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin.

0 10 20 30

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

C

B

A Produkt 1

Abso

rptio

n (λ

= 3

20 n

m) [

AU

]

Zeit [min]

0 10 20 30

0,0

0,2

0,4

0,6

F

E

D Produkt 2

Abso

rptio

n (λ

= 3

20 n

m) [

AU

]

Zeit [min]

Abb. 4.8.2-3: HPLC-Chromatogramme zur Identifikation der Abbauprodukte im Hydrolysat von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-phenylalanin. Links: Standardaddition (A) von 2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionsäure (B) zu Hydrolysat von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-phenylalanin (C). Rechts: Standardaddition (D) von N1-Ethyl-2(1H)-pyrazinon (E) zu Hydrolysat von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-phenylalanin (F).

Um zu prüfen ob es bei der Hydrolyse von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-

phenylalanin auch zur Bildung des am Ringstickstoffatom nicht substituierten

- 153 -


2(1H)-Pyrazinon kommt, wurde diese Verbindung im analytischen Maßstab durch Inkubation

von Glycinamid mit Glyoxal gewonnen. Die Bildung wurde mittels LC-ESI-MS ([M+H]+

m / z = 97,05, Mr = 96,04, Mr, theoretisch = 96,03) bestätigt. 2(1H)-Pyrazinon eluierte bei der

HPLC bei tR = 8,5 min (Trennbedingungen wie in Abb. 4.8.2-3) und zeigte Absorption bei

λ = 320 nm sowie Fluoreszenz. In den Hydrolysaten von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-

propionyl]-phenylalanin sowie von 2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionsäure konnte dieser

Peak nicht detektiert werden, auch nicht mittels massenspektroskopischer Detektion. Folglich

findet bei der Hydrolyse kein Abbau zu 2(1H)-Pyrazinon statt.

Insgesamt ist damit festzustellen, dass die bestimmten Massen der Hydrolyseprodukte, der

strukturelle Nachweis von N1-Ethyl-2(1H)-pyrazinon als Folgeprodukt von 2-(2-Oxo-

2H-pyrazin-1-yl)-propionsäure sowie die gezeigten Standardadditionen eindeutig den in

Abb. 4.8.2-2 gezeigten Hydrolysemechanismus belegen.

4.8.3 Salzsäurehydrolyse von N-[2-(5-Methyl-2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-

phenylalanin

Bei der Hydrolyse von N-[2-(5-Methyl-2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-phenylalanin war

ein ähnliches Verhalten wie bei der von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-

phenylalanin festzustellen. Anhand der für 2(1H)-Pyrazinone charakteristischen Absorption

bei λ = 320 nm sowie Fluoreszenz ist darauf zu schließen, dass drei Abbauprodukte mit

2(1H)-Pyrazinon-Struktur gebildet werden (Abb. 4.8.3-1). Für das dominierende

Abbauprodukt 2 konnte dies anhand der Masse bewiesen werden. Es wurde eine relative

monoisotopische Masse von Mr = 138,07 ([M+H]+ m / z = 139,08) bestimmt. In Analogie zur

Hydrolyse von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-phenylalanin handelt es sich

folglich um N1-Ethyl-5-methyl-2(1H)-pyrazinon (Mr,theoret. = 138,08). Die Massen von

Abbauprodukt 1 und 3 waren auf Grund der geringen Bildung nicht mittels LC-ESI-MS

bestimmbar. Eine strukturelle Zuordnung ist damit nicht möglich. Es ist jedoch anzunehmen,

dass es sich bei einem dieser Produkte um das 2(1H)-Pyrazinon-Dipeptid handelt.

Für die gemeinsame Analytik von 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden, welche sich vom Glyoxal oder

Methylglyoxal ableiten, ist jeweils das Abbauprodukt 2 (N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinon) ein

geeigneter Analyt. Auf Grund des unterschiedlichen zeitlichen Verlaufs der Bildung der

N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinone bei den Hydrolysen (Abb. 4.8.2-1 und Abb. 4.8.3-1) ist eine

- 154 -


Hydrolysezeit von 23 h zu wählen. Bei dieser Hydrolysezeit war sowohl das sich vom

Glyoxal als auch das sich vom Methylglyoxal ableitende N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinon im

ausreichenden Maß detektierbar.

0 10 20 30

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

Produkt 3

Produkt 2

Produkt 1

UV 220 nm

UV 320 nm

Fluoreszenz ex. 320 nmem. 400 nm

Abs

orpt

ion,

Flu

ores

zem

issi

on [A

U]

Zeit [min]

0 10 20 30

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4 Produkt 2

Produkt 3Produkt 1

t = 48h

t = 23 h

t = 16 h

Abso

rptio

n (λ

= 3

20 n

m) [

AU]

Zeit [min]

Abb. 4.8.3-1: HPLC-Chromatogramme von Salzsäurehydrolysaten von N-[2-(5-Methyl-2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-phenylalanin. Links: Mit verschiedenen Detektoren aufgenommen (Hydrolysezeit: 16 h). Rechts: Nach ausgewählten Hydrolysezeiten. (Hydrolyse: 6 M Salzsäure, 110 °C, Durchführung: 3.6.1).

Zusammenfassend ist festzustellen, dass N-[2-(5-Methyl-2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-

phenylalanin einem Abbau unterliegt wie er schon für N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-

propionyl]-phenylalanin und 2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionsäure beobachtet wurde

(siehe Abschnitt 4.8.2). Dieser Abbau von pyrazinon-modifizierten N-Termini über das

2(1H)-Pyrazinon-Dipeptid zum N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinon dürfte somit allgemeine Gültigkeit

besitzen.

4.8.4 Einfluss der Matrix auf das Hydrolyseverhalten

Um einen möglichen Einfluss der Matrix auf den Abbau von 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden

während der Säurehydrolyse zu überprüfen, wurde N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-

phenylalanin in Gegenwart von ausgewählten Zusätzen hydrolysiert und das Hydrolysat

mittels RP-HPLC untersucht. Dabei wurde insbesondere geprüft, ob die Zusätze den Abbau

- 155 -


des 2(1H)-Pyrazinon-Tripeptides über das 2(1H)-Pyrazinon-Dipeptid (Produkt 1) zum

N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinon (Produkt 2) beeinflussen.

Entsprechend den Chromatogrammen des Hydrolysates ohne Zusätze und denen des

Hydrolysates unter Zusatz von Insulin (Abb. 4.8.4-1), fand in Gegenwart des Proteins die

Hydrolyse ungehindert statt.

0 10 20 30

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4 Produkt 2Produkt 1

UV 220 nm

UV 320 nm


Abso

rptio

n, F

luor

esze

nzem

issi

on [A

U]

Zeit [min]

0 10 20 30

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2 Produkt 2Produkt 1

UV 220 nm

UV 320 nm


Abso

rptio

n, F

luor

esze

nzem

issi

on [A

U]

Zeit [min]

Abb. 4.8.4-1: HPLC-Chromatogramme von Hydrolysaten von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-phenylalanin. Links: ohne Zusatz (0,5 mg 2(1H)-Pyrazinon-Peptid pro 1 ml Hydrolyse-ansatz). Rechts: Zusatz von Insulin (0,5 mg 2(1H)-Pyrazinon-Peptid, 1 mg Insulin pro 1 ml Hydrolyseansatz). (Hydrolysezeit: 16 h, Durchführung: 3.6.3).

Stark störend wirkte sich demgegenüber der Zusatz von Glucose aus. Dieser unterdrückte den

Abbau zu Produkt 1 und 2 vollständig, so dass beide Hydrolyseprodukte nicht detektierbar

waren (Abb. 4.8.4-2). Die gleiche Beobachtung wurde bei Zusatz von zucker- und

stärkehaltigen Cornflakes oder bei Zusatz des Oxidationsmittels Natriumazid gemacht. Bei

Hydrolyse in Anwesenheit von Glucose konnte der störende Einfluss durch Zugabe von

Mercaptoethanol beseitigt werden (Abb. 4.8.4-2). Die Stabilität der 2(1H)-Pyrazinon-Struktur

weist damit eine gewisse Ähnlichkeit mit der des Tryptophans auf. Tryptophan wird bei der

Salzsäurehydrolyse ebenfalls durch Oxidation abgebaut, wobei schon Spuren von Sauerstoff

und Chlor oder auch Cystin als Oxidationsmittel ausreichen (Olcott & Fraenkel-Conrat,

1947). Dieser Abbau kann durch Zusatz von Mercaptoethanol oder auch anderer Thiole und

sorgfältige Entfernung von Sauerstoff und Chlor unterdrückt werden (Ng, 1987). Weiterhin

wird Tryptophan auch bei Hydrolyse in Anwesenheit von Kohlenhydraten zerstört (Gortner

- 156 -


& Blish, 1915). Im Gegensatz zur Hydrolyse der 2(1H)-Pyrazinon-Peptide ist dieser Abbau

jedoch nicht durch Zusatz von Mercaptoethanol vermeidbar (Ng, 1987).

0 10 20 30

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

UV 220 nm

UV 320 nm


Abso

rptio

n, F

luor

esze

nzem

issi

on [A

U]

Zeit [min]

0 10 20 30

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0 Produkt 2

Produkt 1

UV 220 nm

UV 320 nm


Abso

rptio

n, F

luor

esze

nzem

issi

on [A

U]

Zeit [min]

Abb. 4.8.4-2: HPLC-Chromatogramme von Hydrolysaten von N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propionyl]-phenylalanin. Links: Zusatz von Glucose (0,5 mg 2(1H)-Pyrazinon-Peptid, 5,0 mg Glucose pro 1 ml Hydrolyseansatz). Rechts: Zusatz von Glucose und Mercaptoethanol (0,5 mg 2(1H)-Pyrazinon-Peptid, 0,5 mg Glucose, 5,0 mg Mercaptoethanol pro 1 ml Hydrolyseansatz). (Hydrolysezeit: 16 h, Durchführung: 3.6.3).

Mercaptoethanol wird zur Hydrolyse auf Grund seines Reduktionsvermögens und damit zur

Unterdrückung oxidativer Prozesse zugesetzt. Bei der Salzsäurehydrolyse in Gegenwart von

Kohlenhydraten herrschen ebenfalls reduzierende Bedingungen. So werden z. B. aromatische

Nitrogruppen von 2,4-dinitrophenylierten Lysin zum Teil zu Aminogruppen reduziert

(Carpenter & Booth, 1971). Die Schutzwirkung des Mercaptoethanols auf die

2(1H)-Pyrazinon-Struktur dürfte somit nicht allein auf dessen Reduktionsvermögen

zurückzuführen sein. Beim Erhitzen von Kohlenhydraten in starken Mineralsäuren kommt es

zur Bildung von Derivaten des Furfurals sowie weiterhin von kurzkettigen Aldehyden wie

Formaldehyd, Acetaldehyd und Propionaldehyd (Rice & Fishbein, 1956). Es ist anzunehmen,

dass dabei auftretende reaktive Intermediate für den Abbau der 2(1H)-Pyrazinon-Struktur

verantwortlich sind. Die Schutzwirkung des im Überschuss vorhandenen Mercaptoethanols

(molares Verhältnis 2(1H)-Pyrazinon-Peptid : Glucose : Mercaptoethanol = 3 : 6 : 128) ist

darin zu sehen, dass es mit reaktiven Intermediaten reagiert und dadurch die 2(1H)-Pyrazinon-

Struktur erhalten bleibt. Mercaptoethanol könnte insbesondere mit Carbonylgruppen,

- 157 -


vinylogen Carbonylgruppen und Carbeniumionen reagieren sowie Redoxprozesse

beeinflussen. Auf Grund einer solchen Scavenger-Funktion werden Thiole ebenfalls bei der

Peptidsynthese wie z. B. bei der Abspaltung von Schutzgruppen eingesetzt (Bodanszky,

1993).

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass der Abbau von 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden

zum Teil stark von der Matrix abhängig ist. Insbesondere Zucker aber auch Oxidationsmittel

wie Natriumazid stören den Abbau zu den entsprechenden N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinonen.

Demgegenüber zeigte die Gegenwart von Protein keine Wirkung. Der nachteilige Einfluss

von Zucker konnte durch den Zusatz von Mercaptoethanol unterbunden werden. Für die

Analytik von pyrazinon-modifizierten Komponenten in kohlenhydrathaltigen Matrices sollte

der Zusatz von Mercaptoethanol folglich die gewünschte Bildung der N1-Alkyl-

2(1H)-pyrazinone ermöglichen.

4.9 Untersuchungen zur Bildung von 2(1H)-Pyrazinonen am Protein Insulin

4.9.1 Inkubation von Insulin mit Glyoxal unter physiologischen Bedingungen

Anhand von Umsetzungen von kurzkettigen Peptiden mit α-Dicarbonylverbindungen wie

Glyoxal und Methylglyoxal konnte gezeigt werden, dass es unter physiologischen

Bedingungen zu einer schnellen Derivatisierung des N-Terminus zum 2(1H)-Pyrazinon

kommt. Um zu prüfen ob diese Reaktion ebenfalls an einem Protein stattfindet, wurde die

Reaktion von bovinem Insulin mit Glyoxal untersucht. Dazu wurde Insulin (17 µM) mit

Glyoxal (50 µM) in PBS („phosphate-buffered saline“, 10 mM Phosphat, 0,8 % [w/v]

Natriumchlorid) bei pH = 37 °C für 15 d inkubiert. Die gewählte Pufferionen-Konzentration

erwies sich dabei als ausreichend und gewährleistete die Konstanz des pH-Wertes über den

Inkubationszeitraum (∆pH < 0,2).

Insulin wurde für die vorliegenden Modell-Untersuchungen gewählt, da es im monomeren

Zustand ein kleines und damit übersichtliches Protein ist (Molekulargewicht bovines Insulin

MW = 5733). Es ist aus zwei über zwei Disulfid-Brücken verknüpften Ketten aufgebaut und

besitzt damit zwei N-Termini als potentielle Orte der Bildung von 2(1H)-Pyrazinonen

(Abb. 4.9.1-1). Am N-Terminus der A-Kette befindet sich die Sequenz Gly-Ile und am

N-Terminus der B-Kette die Sequenz Phe-Val. Entsprechend der Aminosäuresequenz des

- 158 -


Insulins kommen der Arginin-Rest Arg-B22 und der Lysin-Rest Lys-B29 innerhalb der

B-Kette als weitere mögliche Reaktionsorte in Betracht.

Da sich bei den vorangegangenen Untersuchungen Lysin als nicht reaktiv zeigte (siehe

Abschnitt 4.7) wurde ein dreifacher molarer Überschuss an Glyoxal gegenüber Insulin

gewählt, so dass pro vermuteten Reaktionsort ein Molekül Glyoxal vorhanden ist. Um

vorzugsweise die spezifischsten und damit die wichtigsten Reaktionen zu erfassen, wurde bei

vergleichsweise niedrigen Konzentrationen inkubiert.

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly

Ala-Lys-Pro-Thr-Tyr-Phe-Phe-Gly-Arg-Glu

S SA-Kette

B-Kette

2 31 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2021

30 29 28 27 26 25 24 23 22 21

SS

SS

Abb. 4.9.1-1: Primärstruktur von Rinderinsulin (Ryle et al., 1955). ↓: Spaltstelle von Endoproteinase Glu-C (siehe Abschnitt 4.9.4).

4.9.2 Charakterisierung der Reaktionsprodukte am intakten Insulin

Analyse mittels RP-HPLC

Abb. 4.9.2-1 zeigt Chromatogramme der HPLC-Analyse eines Inkubationsansatzes von

Insulin mit Glyoxal nach 15 d Reaktionszeit. Neben dem Peak des originären Insulins waren

die Peaks von mindestens vier Folgeprodukten detektierbar. Die direkt dem originären Insulin

folgende Komponente trat ebenfalls bei der Inkubation von Insulin ohne Glyoxal auf, so dass

es sich folglich um ein Autolyseprodukt handeln muss. Durch massenspektroskopische

Analyse (siehe unten) konnte es als desaminiertes Insulin identifiziert werden. Anhand der

Peakflächen bei λ = 220 nm wurde der Umfang der Desaminierung zu ca. 10 % bestimmt.

Desaminierungen sind beim Insulin häufig zu beobachten (Dotsikas und Loukas, 2002).

Insulin weist insgesamt sechs Asparagin- und Glutamin-Reste als mögliche

- 159 -


Desaminierungsstellen auf, von denen der Asparagin-Rest Asn-A21 am leichtesten

desaminiert werden soll (Sundby, 1962).

15,0 17,5 20,0 22,5 25,0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0Insulin,pyrazinon-modifiziertInsulin,

desaminiert

Insulin,originär

UV 320 nm

UV 220 nm


Abs

orpt

ion,

Flu

ores

zenz

emis

sion

[AU

]

Zeit [min]

Abb. 4.9.2-1: HPLC-Chromatogramme der Umsetzung von bovinem Insulin mit Glyoxal. (17 µM Insulin, 50 µM Glyoxal, PBS pH = 7,4, 37 °C, 15 d, Durchführung: 3.7).

Weiterhin waren mindestens drei auf die Inkubation mit Glyoxal zurückführbare Produkte

festzustellen. Sie wiesen die für 2(1H)-Pyrazinone typische Absorption bei λ = 320 nm sowie

Fluoreszenz auf. Die detaillierte Untersuchung mittels LC-ESI-MS zeigte die Bildung von

monopyrazinon-modifizierten Insulin-Komponenten an (siehe unten).

Einfluss des Phosphatpuffers auf die Reaktion

Um den Einfluss des verwendeten Puffers auf die Reaktion zu untersuchen, wurde die

Inkubation ebenfalls in 10 mM Phosphatpuffer durchgeführt. Dieser enthielt im Unterschied

zum PBS kein Natriumchlorid und ebenfalls kein Kaliumchlorid. Der allein durch Glyoxal

bedingte Umsatz an Insulin war in PBS mit (32,1 ± 2,0) % (Mittelwert ±

Standardabweichung, n = 3) höher als der in 10 mM Phosphatpuffer von (22,0 ± 1,6) %

- 160 -


(n = 3). Der zusätzlich durch Desaminierung hervorgerufene Umsatz war dagegen in beiden

Puffern praktisch gleich und wurde zu (9,8 ± 0,4) % (n = 3, PBS) und (10,1 ± 0,4) % (n = 3,

10 mM Phosphatpuffer) bestimmt. Die Reaktion von Insulin mit Glyoxal in PBS bewirkte

insbesondere die vermehrte Bildung der am stärksten fluoreszierenden pyrazinon-

modifizierten Komponente. Wie bereits bei den Umsetzungen von Gly-Ala-Phe mit Glyoxal

gezeigt werden konnte (siehe Abschnitt 4.4.3), spielt offenbar auch bei der Bildung von

2(1H)-Pyrazinonen am Protein die Ionenstärke eine erhebliche Rolle. Dabei ist insbesondere

die Wirkung auf die pKa-Werte der α-Aminogruppen zu diskutieren (siehe Abschnitt 4.4.3).

Weiterhin könnte sich das komplexe Assoziationsverhalten des Insulins (Kaarsholm &

Ludvigsen, 1995) oder andere strukturelle Änderungen auf die Zugänglichkeit der N-Termini

und damit auf die Reaktivität auswirken. Dass die Struktur des Insulins von der Art des

Puffers abhängig ist, verdeutlichen bereits die in Abb. 4.9.2-2 gezeigten UV-Spektren. Wie

ersichtlich ist, wird sowohl die Lage des dominierenden Maximums als auch dessen Intensität

stark vom Puffer beeinflusst. Anhand dessen kann auf eine ungleiche Zugänglichkeit oder

Anregbarkeit der Chromophore und damit auf eine unterschiedliche Struktur geschlossen

werden.

200 250 300 350 4000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

200 250 300 350 4000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

Ext

inkt

ion

Wellenlänge [nm]

0,1000 mg/ml PB

0,0500 mg/ml PB

0,0125 mg/ml PB

0,1000 mg/ml PBS

0,0500 mg/ml PBS

0,0125 mg/ml PBS

Wellenlänge [nm]

Abb. 4.9.2-2: UV-Spektren von Insulin in PBS (links) und in 10 mM Phosphatpuffer (PB, rechts). (Durchführung: 3.7).

- 161 -


Analyse mittels LC-ESI-MS

Um die Peaks anhand ihrer Masse bestimmten Reaktionsprodukte zuordnen zu können,

wurden die Inkubationsansätze mittels LC-ESI-MS untersucht. Die Messungen erfolgten im

positiven Modus. Zur Detektion diente ein Flugzeitmassenspektrometer. Für die Berechnung

der relativen monoisotopischen Molmassen (Mr) wurde der Peak mit dem geringsten

m/z-Verhältnis von dominanten mehrfach geladene Molekülionen ausgewählt und Mr anhand

der Ladung des Molekülions berechnet (siehe Abschnitt 3.2.2, Tab. 4.9.2-1).

Abb. 4.9.2-3 zeigt das TIC-Chromatogramm sowie die beiden UV-Spuren des

Inkubationsansatzes von Insulin mit Glyoxal. Anhand der bestimmten Molmasse kann Insulin

dem zuerst eluierenden Peak A zugeordnet werden (Tab. 4.9.2-1). Die beiden darauffolgenden

Komponenten B und C sind Autolyseprodukte, wobei die detektierten Massenzunahmen

jeweils eine Desaminierung (∆Mr, theoret = 1,00) des Insulins anzeigen. Auf Grund der

Trennung der Produkte erfolgt die Desaminierung offensichtlich an verschiedenen Positionen.

Peak D, E und F sind bei λ = 320 nm (Abb. 4.9.2-3) sowie anhand ihrer Fluoreszenz

(Abb. 4.9.2-1) detektierbar. Damit war die Bildung von pyrazinon-modifizierten Derivaten zu

vermuten, welche es mittels massenspektroskopischer Analyse abzusichern galt. Aus der

Bildung der 2(1H)-Pyrazinon-Struktur resultiert eine Massenzunahme von ∆Mr, theoret = 21,99

(monoisotopisch). Gegenüber dem originären Insulin war eine solche Massenzunahme bei

den Komponenten D und E festzustellen und es handelt sich somit um monopyrazinon-

modifizierte Insulin-Derivate. Bei Komponente F handelt es sich ebenfalls um mono-

pyrazinon-modifiziertes Insulin, welches zusätzlich eine Desaminierung aufweist. Die

Bildung von 2(1H)-Pyrazinonen am intakten Insulin konnte damit massenspektroskopisch

abgesichert werden. Die Bildung einer N-terminalen 2(1H)-Pyrazinon-Struktur ist damit nicht

nur am N-Terminus von kurzkettigen Peptiden möglich sondern sie findet ebenfalls an dem

gewählten Protein statt.

Das Vorhandensein eines Insulin-Derivates mit Mr = 5653,5 und unbekannter Struktur

(Peak D) lässt auf weitere zur Zeit noch nicht aufgeklärte Reaktionen schließen.

- 162 -


15,0 17,5 20,0 22,5 25,0

0

2

4

6

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0

5

10

15

20

25

30

35

E

F

D

UV 320 nm

Abso

rptio

n [m

AU]

Zeit [min]

F

EDCB

AUV 220 nm

Abs

orpt

ion

[AU

]

F

EDCB

ATIC

TIC

[cou

nts

x 10

00]

Abb. 4.9.2-3: HPLC-Chromatogramme (MS- und UV-Detektion) der Umsetzung von bovinem Insulin mit Glyoxal. (17 µM Insulin, 50 µM Glyoxal, PBS pH = 7,4, 37 °C, 15 d, Durchführung: 3.7).

- 163 -


Tab. 4.9.2-1: Bestimmte relative monoisotopische Molmassen und deren Zuordnung.

Peak m / z Ion Mr Mr ∆Mr* Zuordnung Mr, theo.

A 1146,85

1433,29

MH55+

MH44+

5729,61

5729,61

5729,61 0,00 Insulin 5729,56

B 1147,08

1433,66

MH55+

MH44+

5730,36

5730,61

5730,49 0,88 Insulin, desaminiert 5730,57

C 1147,08

1433,66

MH55+

MH44+

5730,37

5730,59

5730,48 0,87 Insulin, desaminiert 5730,57

D 1151,28 MH55+ 5751,36 5751,33 21,72 Insulin, monopyrazinon- 5751,55

1438,83 MH44+ 5751,29 modifiziert

D 1414,38 MH44+ 5653,49 5653,49 - 76,12 ?

E 1151,26

1438,85

MH55+

MH44+

5751,26

5751,37

5751,32 21,71 Insulin, monopyrazinon-

modifiziert

5751,55

F

1151,51

1439,24

MH55+

MH44+

5752,51

5752,93

5752,72 23,11 Insulin, monopyrazinon-

modifiziert, desaminiert

5752,56

* Massendifferenz zur gemessenen relativen monoisotopischen Molmasse des Insulins

4.9.3 Untersuchungen nach Reduktion und Blockierung der Sulfhydrylgruppen

4.9.3.1 Charakterisierung der Reaktionsprodukte

Aus der Anfangsphase der Maillard-Reaktion ist bekannt, das bestimmte Aminogruppen am

Protein eine erhöhte Reaktivität aufweisen. Zum Beispiel findet in vivo die Bildung des

Amadori-Produktes am Hämoglobin bevorzugt an der α-Aminogruppe des N-terminalen

Valin-Restes der β-Kette statt (Bunn et al., 1979). Humanes Serumalbumin wird in vivo

demgegenüber bevorzugt an der ε-Aminogruppe eines Lysin-Restes (Lys-525) durch Glucose

modifiziert (Garlick & Mazer, 1983). Da Insulin zwei N-Termini besitzt, stellte sich die Frage

ob eine solche Spezifität auch bei der Bildung von 2(1H)-Pyrazinonen zu beobachten ist. Um

die Orte der Derivatisierung aufzuklären, wurden die beiden Kette durch Reduktion der

Disulfid-Brücken mit Dithiothreitol (DTT) getrennt und die freigesetzten Ketten durch

Umsetzung mit Iodacetamid stabilisiert. Der Nachweis der 2(1H)-Pyrazinon-Struktur an

kleineren Fragmenten dient ebenfalls zur weiteren Absicherung von deren Bildung.

- 164 -


Analyse mittels RP-HPLC und LC-ESI-MS

Abb. 4.9.3.1-1 zeigt die Chromatogramme der RP-HPLC eines Inkubationsansatzes von

Insulin mit Glyoxal nachdem die Disulfid-Brücken reduziert und die Sulfhydrylgruppen

blockiert wurden. Neben den Peaks der nicht durch Glyoxal modifizierten Ketten werden

weitere Peaks detektiert. Zwei Komponenten zeigen die für die 2(1H)-Pyrazinon-Struktur

charakteristische Absorption bei λ = 320 nm und Fluoreszenz.

10 15 20 25 30

0,0

0,2

0,4

0,6

Fluoreszenz,ex. 320 nm,em. 400 nm

UV 320 nm

UV 220 nm

A-Kette,pyrazinon-modifiziert

B-Kette,pyrazinon-modifiziert

B-Kette

A-Kette

Abso

rptio

n, F

luor

esze

nz [A

U]

Zeit [min]

Abb. 4.9.3.1-1: HPLC-Chromatogramme der Umsetzung von bovinem Insulin mit Glyoxal nach Reduktion und Blockierung der Sulfhydrylgruppen. (17 µM Insulin, 50 µM Glyoxal, PBS pH = 7,4, 37 °C, 15 d, Durchführung: 3.8.1).

Im Unterschied zu den Untersuchungen mittels RP-HPLC war für die Analyse mittels

LC-ESI-MS eine Anreicherung der reduzierten und blockierten Insulin-Derivate mittels

Festphasenextraktion an einer C18-Phase erforderlich. Dies ermöglichte eine eindeutigere

massenspektroskopische Detektion und überführte durch die Abtrennung überschüssiger

- 165 -


Reagenzien gleichzeitig die Proben in eine stabilere Form. Alternativ war ein modifiziertes

Derivatisierungsprotokoll, welches zu einem geringeren Endvolumen führt, und die Injektion

großer Probenmengen möglich. In diesem Fall diente das verwendete HPLC-System zur

Anreicherung.

Abb. 4.9.3.1-2 zeigt das TIC-Chromatogramm sowie die beiden UV-Spuren eines

entsprechend aufgearbeiteten Inkubationsansatzes von Insulin mit Glyoxal. In Tab. 4.9.3.1-1

sind die häufigsten Molekülionen und deren Zuordnungen zu bestimmten Derivaten

zusammengefasst. Das bei λ = 320 nm erhaltene Chromatogramm ist durch zwei dominante

Peaks geprägt. Anhand der bestimmten relativen Molmassen lassen sich diese Peaks eindeutig

der pyrazinon-modifizierten A-Kette (Peak C) und der pyrazinon-modifizierten B-Kette

(Peak I) zuordnen. Die Bildung der 2(1H)-Pyrazinon-Struktur an beiden Ketten ist damit

zweifelsfrei belegt.

Für die korrekte Interpretation der Spektren waren insbesondere bei diesen LC-ESI-MS

Analysen ein erhöhtes Vorkommen von Natrium-Addukten von Bedeutung. So führt die

Bildung eines Natrium-Adduktes zu einer identischen Massenzunahme wie durch

2(1H)-Pyrazinon-Bildung. Zum Beispiel wird für das MNaH2+-Molekülion der originären

A-Kette (m/z = 1295,19) die gleiche Masse erhalten für das MH22+-Molekülion der

pyrazinon-modifizierten A-Kette (m/z = 1295,24, siehe Tab. 4.9.3.1-1). Da die originäre

A-Kette und die modifizierte A-Kette durch die Chromatographie getrennt werden, kann das

MNaH2+-Addukt der originären A-Kette das Vorhandensein der pyrazinon-modifizierten

A-Kette jedoch nicht vortäuschen. Wenn die originäre A-Kette mit in Peak C enthalten wäre,

müsste weiterhin die Masse des MH22+-Molekülions der originären A-Kette (m/z = 1284,18)

detektierbar sein. Diese wurde jedoch nicht gemessen. Zusätzlich war in Peak C das

MNa22+-Molekülion der modifizierten A-Kette messbar (m/z = 1316,90). Ein Peak mit diesem

m/z-Verhältnis kann nur aus der modifizierten A-Kette und nicht aus originären A-Kette

resultieren. Ferner ist Peak C anhand der Absorption bei λ = 320 nm sowie mittels

Fluoreszenz-Detektion erfassbar, so dass insgesamt die 2(1H)-Pyrazinon-Bildung gesichert

ist.

Neben den Peaks der originären und der pyrazinon-modifizierten Ketten waren weitere

Komponenten detektierbar. Es handelt sich dabei um desaminierte Produkte (Peak B, E und

F) sowie um unbekannte Produkte der B-Kette (Peak G und H).

- 166 -


10 15 20 250

1

2

3

0,0

0,1

0,2

0,3

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

UV 320 nm

I

C

Abso

rptio

n [m

AU]

Zeit [min]

IHGFE

D

B

A

UV 220 nm

TICAb

sorp

tion

[AU

]

IHGF

C

E

D

B

A

TIC

[cou

nts

x 10

0000

]

Abb. 4.9.3.1-2: HPLC-Chromatogramme (MS- und UV-Detektion) der Umsetzung von bovinem Insulin mit Glyoxal nach Reduktion und Blockierung der Sulfhydrylgruppen sowie Anreicherung. (Inkubation: 17 µM Insulin, 50 µM Glyoxal, PBS pH = 7,4, 37 °C, 15 d, Durchführung: 3.8.1).

- 167 -


Tab. 4.9.3.1-1: Bestimmte relative monoisotopische Molmassen und deren Zuordnung.

Peak m / z Ion Mr Mr ∆ Mr* Zuordnung Mr, theo.

A 1284,18

1295,19

856,47

MH22+

MNaH2+

MH34+

2566,35

2566,38

2566,37

2566,37 0,00 A-Kette 2566,03

B 1284,71

1295,67

1306,67

MH22+

MNaH2+

MNa22+

2567,40

2567,35

2567,35

2567,37 1,00 A-Kette,

desaminiert

2567,04

C 1295,24

1306,24

1316,90

MH22+

MNaH2+

MNa22

2588,48

2588,48

2587,82

2588,26 21,89 A-Kette,

pyrazinon- modifiziert

2588,02

D 703,46

879,061

1171,74

1757,07

MH55+

MH44+

MH33+

MH22+

3512,23

3512,21

3512,18

3512,11

3512,18 0,00 B-Kette 3511,71

E 703,66

879,32

1172,08

MH55+

MH44+

MH33+

3513,25

3513,25

3513,22

3513,24 1,06 B-Kette,

desaminiert

3512,71

F 703,65

879,31

1172,08

1757,59

MH55+

MH44+

MH33+

MH22+

3513,20

3513,19

3513,22

3513,17

3512,20 1,02 B-Kette,

desaminiert

3512,71

G 860,29

1146,71

1719,56

MH44+

MH33+

MH22+

3437,13

3437,11

3437,10

3437,11 - 75,07 B-Kette,

?

H 886,21

1181,27

1771,43

MH44+

MH33+

MH22+

3540,80

3540,80

3540,85

3540,82 28,64 B-Kette,

?

I 884,55

1179,06

1768,11

MH44+

MH33+

MH22+

3534,17

3534,16

3534,21

3534,17 21,99 B-Kette,

pyrazinon- modifiziert

3533,69

* Massendifferenz zur gemessenen relativen monoisotopischen Molmasse der jeweiligen Kette

- 168 -


4.9.3.2 Vergleich der Reaktivität der N-Termini von A- und B-Kette

Um zu klären welche der beiden Ketten die reaktivere ist, wurden reduzierte und blockierte

Proben von Inkubationsansätzen (17 µM Insulin, ohne oder mit 50 µM Glyoxal, PBS

pH = 7,4, 37 °C, 15 d) mittels RP-HPLC untersucht und die Peakflächen bei λ = 220 nm zur

Auswertung herangezogen.

Der Gesamtumsatz je Kette wurde anhand der Peakflächen nach der Inkubation mit und ohne

Glyoxal ermittelt. Der Gesamtumsatz an der A-Kette wurde zu (5,1 ± 1,2) % (Mittelwert ±

Standardabweichung, n = 3) und der an der B-Kette zu (25,9 ± 1,6) % (n = 3) bestimmt. Die

B-Kette ist damit deutlich reaktiver als die A-Kette. Das Ergebnis stimmt gut mit dem

ermittelten Gesamtumsatz des Insulins von (32,1 ± 2,0) % überein (siehe Abschnitt 4.9.2).

Die Autolyse des Insulins von insgesamt ca. 10 % ist in den Ergebnissen nicht enthalten.

Der Umsatz zur pyrazinon-modifizierten A-Kette wurde zu (2,0 ± 0,4) % (Mittelwert ±

Standardabweichung, n = 3) und zur pyrazinon-modifizierten B-Kette zu (5,9 ± 0,6) % (n = 3)

berechnet. Damit ist die 2(1H)-Pyrazinon-Bildung am N-Terminus der B-Kette (Phe-Val)

etwa um den Faktor drei gegenüber der am N-Terminus der A-Kette (Gly-Ile) bevorzugt.

Bei der B-Kette ist der Unterschied zwischen dem Gesamtumsatz und dem Umsatz zur

pyrazinon-modifizierten B-Kette besonders markant. Folglich findet die Bildung weiterer

Derivate statt. Diese sind z. B. als Peak G und H detektierbar (siehe Abschnitt 4.9.3.1). Ihre

Struktur war nicht Gegenstand dieser Arbeit, die Aufklärung sollte jedoch das Ziel weiterer


Zur Erklärung der bevorzugten 2(1H)-Pyrazinon-Modifizierung am N-Terminus der B-Kette

sind insbesondere die pKa-Werte der beiden α-Aminogruppen zu betrachten. Wie bereits bei

den Umsetzungen von Peptiden verschiedener Sequenz mit Glyoxal diskutiert (siehe

Abschnitt 4.4.1), nimmt die Geschwindigkeit der 2(1H)-Pyrazinon-Bildung mit zunehmenden

Anteil an unprotonierter Aminogruppe zu. Daher ist der niedrigere pKa-Wert der

α-Aminogruppe des N-Terminus der B-Kette (pKa = 7,1) im Vergleich zu dem der A-Kette

(pKa = 8,4, Gao et al., 1995) für die beobachtete Selektivität als Ursache anzusehen. Als

weiteres Kriterium ist die Zugänglichkeit der beiden Termini zu diskutieren. Bei der

verwendeten Konzentration von 17 µM liegt Insulin als Dimer vor (Kaarsholm & Ludvigsen,

1995). Entsprechend der Struktur im Kristall (Blundell et al., 1972) und der Struktur in

Lösung (Kaarsholm & Ludvigsen, 1995) befindet sich keiner der beiden N-Termini im dimer-

bildenden Bereich des Moleküls. In Lösung liegt der N-Terminus der A-Kette zwar relativ

- 169 -


nah am Rumpf, jedoch an der Oberfläche des Moleküls. Der N-Terminus der B-Kette ragt

demgegenüber leicht vom Rumpf weg und die Konformation ist etwas flexibler

(Abb. 4.9.3.2-1, Kaarsholm & Ludvigsen, 1995). Insgesamt betrachtet ist damit anzunehmen,

dass beide Reaktionsorte für Glyoxal gut zugänglich sind.

Phe-B1

Gly-A1

Arg-B22

Lys-B29

Abb. 4.9.3.2-1: Struktur von B9(Asp)-Humaninsulin in Lösung, welche nahezu mit der Struktur von Humaninsulin in Lösung und der T-Konformation im 2Zn-Kristall identisch ist (Jørgensen et al., 1992).

Eine höhere Reaktivität der N-terminalen α-Aminogruppe der B-Kette gegenüber der von der

A-Kette wurde ebenfalls bei der Reaktion von Insulin mit Glucose festgestellt. Dieses

Ergebnis wurde sowohl bei der Umsetzung in einem trockenen System bei einer relativen

Gleichgewichtsfeuchte von 70 % und 37 °C (Schwartz & Lea, 1952, Amaya-F et al., 1976) als

auch in Lösung in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid bei pH = 7,4 und 37 °C erhalten

(O’Harte et al., 1996, 2000). Die Ursache der unterschiedlichen Reaktivität wurde von

Amaya-F et al. (1976) und O’Harte et al. (1996, 2000) nicht diskutiert. Lediglich Schwartz &

Lea (1952) vermuteten eine unterschiedliche Zugänglichkeit der Reaktionsorte als Ursache.

Insulin wurde in zahlreichen weiteren Untersuchungen mit für Aminogruppen spezifischen

Reagenzien wie N-Hydroxysuccinimidylestern (Lindsay & Shall, 1971, Hashimoto et al.,

- 170 -


1989), Diketen (Lindsay & Shall, 1969), weiteren aktivierten Säurederivaten (Tsai et al.,

1997) sowie Aldehyden (Mei et al., 1999) umgesetzt. Diesen Arbeiten ist zu entnehmen, dass

die Reihenfolge der Reaktivität der drei primären Aminogruppen von dem modifizierenden

Reagenz, dem Lösungsmittel, dem pH-Wert, dem Insulin-zu-Reagenz-Verhältnis und

gegebenenfalls von zugesetzten Effektoren abhängig ist. So ist z. B. die selektive

Carbamoylierung der α-Aminogruppe der A-Kette und der ε-Aminogruppe des Lysinrestes

möglich ohne die α-Aminogruppe der B-Kette zu modifizieren (Tsai et al., 1997). Eine

spezifisch Derivatisierung der α-Aminogruppe der B-Kette ist ebenfalls möglich. Dies konnte

beispielsweise in 54 %igen wässrigen Isopropanol bei pH = 6,8 in Gegenwart von 1,5 M

Natriumsalicyclat durch reduktive Alkylierung mit cis-9-Hexadecenal und Natriumcyano-

borhydrid erreicht werden (Mei et al., 1999). Als Ursache für spezifische Derivatisierungen

sind damit die oben genannten inneren und äußeren Einflussfaktoren anzusehen.

4.9.4 Charakterisierung der Reaktionsprodukte nach enzymatischer Hydrolyse

Um den Nachweis der 2(1H)-Pyrazinon-Bildung an kleineren Peptidfragmenten zu

ermöglichen, wurde in Anlehnung an die Arbeit von O´Harte et al. (1996) eine enzymatische

Fragmentierung des glyoxal-modifizierten Insulins (17 µM Insulin, 50 µM Glyoxal, PBS

pH = 7,4, 37 °C, 15 d) mit Endoproteinase Glu-C (E.C. 3.4.21.19) vorgenommen.

Endoproteinase Glu-C spaltet bei pH = 8,0 spezifisch Peptidbindungen, die sich C-terminal an

Glutaminsäure in der Aminosäuresequenz befinden (Drapeau et al., 1972). Dementsprechend

sind aus reduziertem und blockiertem Insulin drei Fragmente der A-Kette (A1-4, A5-17, A18-

21) und drei Fragmente der B-Kette (B1-13, B14-21, B22-30) zu erwarten (siehe

Abb. 4.9.1-1). Abb. 4.9.4-1 zeigt das mittels LC-ESI-MS im positiven Modus erhaltene

TIC-Chromatogramm der enzymatisch hydrolysierten Probe.

Das pyrazinon-modifizierte N-terminale Fragment der B-Kette (PyrB1-13) konnte eindeutig

anhand seiner Masse (MH22+ m/z = 781,26, Mr = 1560,50, Mr, theoret. = 1560,71) identifiziert

werden (Abb. 4.9.4-2). Das Vorhandensein der 2(1H)-Pyrazinon-Struktur wird weiterhin

durch das UV-Spektrum belegt, welches das für 2(1H)-Pyrazinone charakteristische

Maximum bei λmax = 324 nm aufweist (Abb. 4.9.4-2).

Ein pyrazinon-modifiziertes N-terminales Fragment der A-Kette war nicht nachweisbar. Als

Ursache ist die geringere 2(1H)-Pyrazinon Bildung an der A-Kette und die offenbar etwas

- 171 -


gehemmte enzymatische Hydrolyse anzusehen. Weiterhin ist aus dem Retentionsverhalten des

Fragments A1-17 zu vermuten, dass das pyrazinon-modifizierte Fragment A1-17 (PyrA1-17)

erst beim Spülen eluiert werden dürfte und damit nicht mehr detektiert werden konnte.

10 20 30

5

10

15

20

25B14-30

A1-17

PyrB1-13

B22-30

B14-21

B1-13

TIC

[cou

nts

x 10

00]

Zeit [min]

Abb. 4.9.4-1: TIC-Chromatogramm der Umsetzung von bovinem Insulin mit Glyoxal nach Reduktion und Blockierung der Sulfhydrylgruppen, Anreicherung und enzymatischer Hydrolyse mit Endoproteinase Glu-C. (Inkubation: 17 µM Insulin, 50 µM Glyoxal, PBS pH = 7,4, 37 °C, 15 d, enzymatische Hydrolyse: pH = 8,0, 25 °C, 20 h, Durchführung: 3.8.2).

Die Detektion der erwarteten pyrazinon-modifizierten Fragmente PyrA1-4 und PyrA1-17

dürfte zusätzlich durch das Fehlen von leichte protonierbaren basischen Aminofunktionen in

der Sequenz (Abb. 4.9.1-1) erschwert sein. Um dennoch eine Detektion zu ermöglichen wäre

die Messung im negativen Modus unter Verwendung schwach basischer Puffer zu prüfen.

Auf diese Weise war z. B. die Analyse der oxidierten A-Kette des Insulin mittels direkter

ESI-MS möglich (Loo et al., 1992).

- 172 -


770 775 780 785 7900

50

100

150

200

250MH2

2+

m/z = 781,26

Inte

nsitä

t [co

unts

]

m / z

200 250 300 350 4000

50

100

150

200

250

300

324 nm

Abs

orpt

ion

[mA

U]

Wellenlänge [nm]

Abb. 4.9.4-2: Massenspektrum (links) und UV-Spektrum (DAD) (rechts) des pyrazinon-modifizierten Fragments der B-Kette (PyrB1-13). Durchführung: 3.8.2).

4.9.5 Untersuchungen zum Nachweis von N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinonen nach

Salzsäurehydrolyse des glyoxal-modifizierten Insulins

Für die Analyse von peptid- und proteingebundenen 2(1H)-Pyrazinonen wurde ein allgemein

anwendbares Verfahren entwickelt (siehe Abschnitt 4.8). Dieses sieht im ersten Schritt die

Hydrolyse des Proteins mit Salzsäure ggf. unter Zusatz von Mercaptoethanol vor. Dabei

werden N-terminale 2(1H)-Pyrazinone als N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinone freigesetzt. Der

Nachweis der N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinone erfolgt anschließend mittels RP-HPLC mit UV-

und Fluoreszenz-Detektion sowie mittels LC-ESI-MS. Um die 2(1H)-Pyrazinon-Bildung am

Insulin zusätzlich abzusichern und die Eignung der Methode zu beurteilt, wurde das

entwickelte Verfahren am glyoxal-modifizierten Insulin (17 µM Insulin, 50 µM Glyoxal, PBS

pH = 7,4, 37 °C, 15 d) angewendet.

Darstellung der erwarteten N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinone

Für die Anwendung des Verfahrens wurden zunächst die erwarteten N1-Alkyl-

2(1H)-pyrazinone der A-Kette (N1-(2-Methyl-butyl)-2(1H)-pyrazinon, A2, Abb. 4.9.5-1) und

der B-Kette (3-Benzyl-N1-isobutyl-2(1H)-pyrazinon, B2) im analytischen Maßstab als

- 173 -


Vergleichssubstanzen gewonnen. Wie in Abb. 4.9.5-1 gezeigt ist wurden dazu im ersten

Schritt die 2(1H)-Pyrazinon-Dipeptide aus den Dipeptiden Gly-Ile und Phe-Val (N-terminale

Sequenz der A- bzw. B-Kette) jeweils durch Umsetzung mit Glyoxal dargestellt. Durch

Behandlung der Ansätze mit Salzsäure (6 M, 48 h, 110 °C) erfolgte anschließend die

Freisetzung der gewünschten N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinone.

3-Benzyl-N1-isobutyl-2(1H)-pyrazinon (B2)

N1-(2-Methyl-butyl)-2(1H)-pyrazinon (A2)

N

N

O

OH

O

N

N

OHN

H2N

O

OH

O

O

O

N

N

ON

N

O

OH

O

HN

H2N

O

OH

O

O

O

2-(3-Benzyl-2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-3-methyl-buttersäure (B1)

2-(2-oxo-2H-pyrazin-1-yl)-3-methyl-pentansäure (A1)

Gly-Ile(A-Kette)

Phe-Val(B-Kette)

Glyoxal

Glyoxal

+

+(HCl), ∆

(HCl), ∆

- 2 H2O

- 2 H2O

- CO2

- CO2

Abb. 4.9.5-1: Reaktionswege zur Darstellung von N1-(2-Methyl-butyl)-2(1H)-pyrazinon (A2) und 3-Benzyl-N1-isobutyl-2(1H)-pyrazinon (B2).

Abb. 4.9.5-2 zeigt die HPLC-Chromatogramme der erhaltenen Lösungen nach der salzsauren

Behandlung der Glyoxal-Dipeptid-Ansätze. Die N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinone wurden anhand

ihrer Absorption bei λ = 320 nm und der Fluoreszenz identifiziert. Wie aus Abb. 4.9.5-2

weiterhin zu entnehmen ist, konnte N1-(2-Methyl-butyl)-2(1H)-pyrazinon (A2) in relativ guter

Ausbeute erhalten werden. Auf Grund der geringen Bildung des 2(1H)-Pyrazinon-Dipeptides

aus Phe-Val und Glyoxal (B1) war der Gesamtumsatz zum 3-Benzyl-N1-isobutyl-

2(1H)-pyrazinon (B2) demgegenüber relativ gering. Der Nachweis des N1-Alkyl-

2(1H)-pyrazinons mittels LC-ESI-MS gelang deshalb nur bei N1-(2-Methyl-butyl)-

2(1H)-pyrazinon (MH+ m/z = 167,15, Mr = 166,14, Mr, theoret. = 166,12).

- 174 -


0 10 20 30 40 50 60

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

UV 220 nm

UV 320 nm


A2

Abs

orpt

ion,

Flu

ores

zenz

[AU

]

Zeit [min]

0 10 20 30 40 50 60

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50 B2

UV 220 nm

UV 320 nm


Abs

orpt

ion,

Flu

ores

zenz

[AU

]

Zeit [min]

Abb. 4.9.5-2: HPLC-Chromatogramme der mit Salzsäure behandelten Ansätze zur Darstellung von N1-(2-Methyl-butyl)-2(1H)-pyrazinon (Peak A2) (links) und von 3-Benzyl-N1-isobutyl-2(1H)-pyrazinon (Peak B2) (rechts). (Durchführung: 3.9).

Analyse von glyoxal-modifiziertem Insulin

Für die Analyse wurde das glyoxal-modifizierte Insulin zunächst an einer C18-Phase

angereichert und anschließend mit Salzsäure in Gegenwart von Mercaptoethanol hydrolysiert.

Die Hydrolyse in Gegenwart von Mercaptoethanol erwies sich dabei für die Bildung der

gewünschten Hydrolyseprodukte als erforderlich. Als dominierender Peak im bei λ = 320 nm

erhaltenen Chromatogramm des Hydrolysates wurde das 2(1H)-Pyrazinon-Dipeptid der

B-Kette 2-(3-Benzyl-2-oxo-2H)-pyrazin-1-yl)-3-methyl-buttersäure (Peak B1, siehe

Abb. 4.9.5-1) anhand der Masse (MH+ m/z = 287,21, Mr = 286,20, Mr, theoret. = 286,13)

eindeutig identifiziert (Abb. 4.9.5-3). Mit geringerer Intensität wurde das N1-Alkyl-

2(1H)-pyrazinon der pyrazinon-modifizierten B-Kette 3-Benzyl-N1-isobutyl-2(1H)-pyrazinon

(Peak B2) detektiert (siehe Abb. 4.9.5-3, LC-ESI-MS: MH+ m/z = 243,21, Mr = 243,20,

Mr, theoret. = 242,15). Die geringere Peakfläche des N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinons (Peak B2)

gegenüber dem 2(1H)-Pyrazinon-Dipeptid (Peak B1) ist auf die kurze Zeit der Salzsäure-

Behandlung von 23 h zurückzuführen. Nach 48 h würde Peak B2 dominieren. Das N1-Alkyl-

2(1H)-pyrazinon der pyrazinon-modifizierten A-Kette N1-(2-Methyl-butyl)-2(1H)-pyrazinon

- 175 -


war mittels RP-HPLC nicht sicher und mit LC-ESI-MS nicht nachweisbar. Als primäre

Ursache hierfür ist die geringere 2(1H)-Pyrazinon-Modifizierung der A-Kette anzusehen.

0 10 20 30 40

0

10

20

B1

B2

Abs

orpt

ion

(λ =

320

nm

) [m

AU

]

Zeit [min]

275 280 285 290 295

0

50

100

150

200

250 MH+

m/z = 287,21

Inte

nsitä

t [co

unts

]

m / z

Abb. 4.9.5-3: HPLC-Chromatogramm von einem Salzsäurehydrolysat des glyoxal-modifizierten Insulins mit Peak B1 (2-(3-Benzyl-2-oxo-2H)-pyrazin-1-yl)-3-methyl-buttersäure) und Peak B2 (3-Benzyl-N1-isobutyl-2(1H)-pyrazinon) (links). Massenspektrum der bei 22,4 min eluierenden Verbindung (Peak B1) (rechts). (Inkubation: 17 µM Insulin, 50 µM Glyoxal, PBS pH = 7,4, 37 °C, 15 d, Hydrolyse mit Zusatz von Mercaptoethanol, Durchführung: 3.9).

Insgesamt betrachtet ermöglichte die zuvor entwickelte Analysenmethode den sicheren

Nachweis (inklusive Massenspektrum) der 2(1H)-Pyrazinon-Bildung an der B-Kette des

Insulins anhand der Hydrolyseprodukte. Die Methode ist damit prinzipiell zum Nachweis

proteingebundener 2(1H)-Pyrazinone geeignet. Im Vergleich zum Nachweis am intakten oder

partiell fragmentierten Insulin mittels LC-ESI-MS ist die erforderliche Menge an Protein

jedoch deutlich größer. Weitere Untersuchungen sollten deshalb darauf zielen die

Nachweisgrenze zu senken. Hierzu könnten die Analyse mittels LC-ESI-MS und Messung im

negativen Modus sowie die GC-MS als Alternativmethoden geprüft werden. Weiterhin sollten

die Vorgänge während der Hydrolyse näher untersucht werden. In Hinblick auf eine

nachweisstarke Analytik ist insbesondere die Höhe der molaren Ausbeute an N1-Alkyl-

2(1H)-pyrazinon aus dem proteingebunden 2(1H)-Pyrazinon, der Einfluss der Matrix auf die

- 176 -


molare Ausbeute und ob durch geeignete Zusätze oder Verfahrensweisen die molare Ausbeute

erhöht werden kann von Interesse.

4.9.6 Betrachtungen zur Reaktivität von Lysin und Arginin am Insulin

Bei den zuvor diskutierten Untersuchungen am glyoxal-modifizierten Insulin konnte

eindeutig und erstmals die Bildung der 2(1H)-Pyrazinon-Struktur am Protein unter

physiologischen Bedingungen nachgewiesen werden. Damit stellt sich die Frage, ob die

bekannten Reaktionsorte für Glyoxal also die Seitenketten von Lysin und Arginin ebenfalls

reagieren. Um dies zu klären, wurden die Massenspektren der LC-ESI-MS Untersuchungen

auf mögliche Arginin- und Lysin-Derivate (siehe Abschnitt 2.3.2) geprüft. Produkte wie

5-(4,5-Dihydroxy-2-imino-1-imidazolidinyl)-norvalin (Dihydroxyimidazolidin, Abb. 2.3.2-2,

∆Mr = +58,0), 5-(2-Imino-5-oxo-1-imidazolidinyl)-norvalin (Glarg, Abb. 2.3.2-2,

∆Mr = +40,0), N7-carboxymethylarginin (CMA, Abb. 2.3.2-2, ∆Mr = +58,0) und CML

(Abb. 2.3.2-1, ∆Mr = +58,0) konnten jedoch nicht detektiert werden. Weiterhin wurde eine

Aminosäureanalyse des glyoxal-modifizierten Insulins durchgeführt. Es war jedoch nur ein

tendenzieller und statistisch nicht signifikanter Abbau von Arginin und kein Abbau von Lysin

festzustellen. Spezifische Produkte des Arginins oder CML konnten nicht nachgewiesen

werden. Die Aminosäuresequenz des Insulins enthält als weitere basische Aminosäure

zweimal Histidin. Ein Abbau war mittels Aminosäureanalyse nicht feststellbar. Zu dem

gleichen Ergebnis kam Takahashi (1977a, b). Dieser beobachtete unter ähnlichen

Bedingungen ebenfalls keine Derivatisierung von Nα-Acetyl-histidin oder proteingebundenem

Histidin durch Glyoxal.

Um zu prüfen, welche Reaktionen mit 50 µM Glyoxal prinzipiell zu erwarten sind, wurden

entsprechende Modellexperimente mit 17 µM Gly-Ala-Tyr, 17 µM Nα-Hippuryllysin oder

17 µM Nα-Hippurylarginin unter den Bedingungen der Inkubation des Insulins (PBS,

pH = 7,4, 37 °C, 15 d) durchgeführt. Anhand der Analyse mittels HPLC konnte keine Bildung

von Nα-Hippuryl-Nε-carboxymethyllysin oder anderer Lysin-Derivate beobachtet werden. Als

primäre Ursache für die geringe Reaktivität des Lysins ist der hohe pKa-Wert der

ε-Aminogruppe anzusehen. Die ε-Aminogruppe des Lysins im Insulin weist z. B. einen

pKa-Wert von 11,1 auf (Gao, 1995). Folglich ist diese Aminogruppe bei pH = 7,4 vollständig

protoniert und damit nicht reaktiv. Bei dem Ansatz mit Nα-Hippurylarginin mit Glyoxal war

- 177 -


ein Gesamtumsatz von (10,5 ± 1,1) % (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 3) festzustellen.

Wie Abb. 4.9.6-1 zu entnehmen ist, ging die Derivatisierung mit der Bildung von drei

Produkten (P1, P2, P3) einher, wobei Produkt P3 dominierte. Das Peptid Gly-Ala-Tyr diente

als Modell für den N-Terminus. Der Umsatz wurde zu (7,9 ± 1,3) % (Mittelwert ±

Standardabweichung, n = 3) bestimmt. Als Produkt wurde dabei nur das pyrazinon-

modifizierte Peptid detektiert. Die Reaktivitäten der Guanidinofunktion des Arginins und des

N-Terminus des Peptides sind damit auch unter den für die Insulin-Experimente gewählten

Bedingungen ähnlich und eine Derivatisierung des Arginins wäre aufgrund der

Konzentrationsverhältnisse prinzipiell zu erwarten.

10 20 30

0

10

20

30

40

50 BzGR

P3P2P1

Abs

orpt

ion

(λ =

220

nm

) [m

AU]

Zeit [min]

Abb. 4.9.6-1: HPLC-Chromatogramm eines Inkubationsansatzes von Nα-Hippurylarginin (BzGR) mit Glyoxal. (17 µM BzGR, 50 µM Glyoxal, PBS pH = 7,4, 37 °C, 15 d, Durchführung: 3.9.10).

Folglich sind weitere Faktoren wie die Stabilität der Arginin-Derivate bei der Analytik sowie

die räumliche Zugänglichkeit des Arginins im Insulinmolekül zu diskutieren. Die Produkte

der Reaktion von Arginin mit Glyoxal werden zum Teil als wenig stabil beschrieben (Glomb

& Lang, 2001). Für die angewendete Analytik mit oder ohne Abstoppen der Reaktion mit

Ameisensäure (pH = 2,8 nach Abstoppen) und anschließende RP-HPLC sowie LC-ESI-MS

- 178 -


jeweils mit 0,1 % Ameisensäure im Eluenten sollte die Stabilität jedoch gegeben sein. Wie

Abb. 4.9.6-2 zeigt, wurden mittels RP-HPLC identische Produktspektren und Peakflächen

erhalten, wenn ein Ansatz von Nα-Hippurylarginin und Glyoxal ohne Abstoppen oder nach

Abstoppen analysiert wird.

10 20 30

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7 P3

P2

P1

BzGR

B

A

Abso

rptio

n (λ

= 2

20 n

m) [

AU

]

Zeit [min]

Abb. 4.9.6-2: HPLC-Chromatogramme eines Inkubationsansatzes von Nα-Hippurylarginin (BzGR) mit Glyoxal. Injektion in das HPLC-System direkt nach der Inkubation (A) und nach Abstoppen (pH = 2,8) und 12 h Aufbewahrung bei Raumtemperatur (B). (Inkubation: 5 mM BzGR, 5 mM Glyoxal, PBS pH = 7,4, 37 °C, 15 d, Durchführung: 3.9.10).

Nakaya et al. (1967) untersuchten unter proteinchemischen Aspekten die Reaktion von

Insulin (0,5 mM) mit Glyoxal (z. B. 30 mM) bei pH = 9,2, (15 ± 5)° C und einer

Reaktionszeit von 3 h. Die Arginin-Derivatisierung erwies sich dabei als stark vom Zustand

des Proteins abhängig. So war der Arginin-Abbau beim nativen Insulin (ca. 4 % bei 30 mM

Glyoxal) stets deutlich kleiner als beim denaturierten Protein (ca. 36 % bei 30 mM Glyoxal).

Entsprechend der Struktur des Insulins im 2Zn-Kristall (Blundell et al., 1972) und der

Struktur in Lösung (Jørgensen et al., 1992) bildet die Guanidinofunktion des Arginins

- 179 -


(Arg-B22) eine Salzbrücke mit der C-terminalen Carboxylat-Gruppe von Asn-A22 aus. Dies

dürfte sowohl die Zugänglichkeit als auch die Nucleophilie der Guanidinogruppe herabsetzen.

Insgesamt betrachtet erscheint es damit als sehr wahrscheinlich, dass der Arginin-Rest Arg-22

für eine Reaktion mit Glyoxal unter den gewählten Inkubationsbedingungen nicht verfügbar

war und damit eine selektive Umsetzung an den N-Termini erfolgte.

4.9.6 Zur möglichen physiologischen Relevanz der 2(1H)-Pyrazinon-Bildung am

Insulin ist ein Peptidhormon mit großer physiologischer Bedeutung insbesondere für den

tiden mit Glyoxal unter physiologischen

roteinen kann sich die Glykierung auf die funktionellen

Insulin

Kohlenhydrat- und Lipidstoffwechsel aber auch für die Proteinbiosynthese. Die in vitro

beobachtete Bildung der 2(1H)-Pyrazinon-Struktur an den beiden N-Termini wirft die Frage

auf, ob diese Reaktion auch in vivo am Insulin oder anderen Proteinen oder Peptiden

stattfindet. Wenn ja, stellt sich die Frage nach der Bedeutung und den möglichen

physiologischen Folgen dieser Derivatisierung.

Da die Inkubationen von Insulin oder Pep

Bedingungen (pH = 7,4, 37 °C) und bei relativ niedrigen Konzentrationen (Insulin- und

Gly-Ala-Tyr-Ansätze) erfolgten, ist die 2(1H)-Pyrazinon-Bildung in vivo prinzipiell zu

vermuten. Dafür spricht auch die in vivo stattfindende Glykierung von Insulin durch Glucose

oder phosphorylierte Monosaccharide. So beträgt der Anteil des glykierten Insulins am

gesamten zirkulierenden Insulin im menschlichen diabetischen Plasma (Typ 2 Diabetiker)

ca. 9 % (Hunter et al., 2003). Bei Nicht-Diabetikern waren demgegenüber glykiertes Insulins

nicht nachweisbar (McKillop et al., 1999). Die Glykierung selbst findet nicht im Plasma statt,

sondern während der Synthese und Speicherung in den β-Zellen des Pankreas (Abdel-Wahab

et al., 1996). Aufgrund des intensiven Glucose-Metabolismus in den β-Zellen ist das Milieu

in diesem Zelltyp für intrazelluläre Glykierungen geradezu prädestiniert (Boyd et al., 2000).

Infolgedessen ist auch mit der Freisetzung von α-Dicarbonylverbindungen und der Bildung

von 2(1H)-Pyrazinonen zu rechnen.

Insbesondere bei biologisch aktiven P

Eigenschaften auswirken. So zeigte das an der α-Aminogruppe der B-Kette glykierte Insulin

eine gegenüber dem originären Insulin verminderte biologische Aktivität (O’Harte, 2000,

Boyd et al., 2000, Hunter et al., 2003). Im in vitro-Modell wirkte das monoglykierte Insulin

- 180 -


auf Muskelzellen beispielsweise signifikant weniger stimulierend auf den Glucosetransport

und Metabolismus. Die Hormon-Wirkung in vivo wurde an der Maus geprüft. Dabei zeigte

das monoglykierte Insulin ein signifikant vermindertes Vermögen den Plasmaglucosespiegel

zu erniedrigen und damit die Plasmaglucose-Homöostase zu regulieren (Boyd et al., 2000).

Da die Bindung des monoglykierten Insulins an den Insulin-Rezeptor und die metabolische

Elimination im Vergleich zum nativen Insulin unverändert waren, wurde ein

postrezeptorischer Effekt als Ursache für die beeinträchtigte Hormonwirkung angesehen

(Hunter et al., 2003). Auf Grund der Zirkulation glykierten Insulins bei Typ 2 Diabetes und

dessen reduzierter biologischer Aktivität wurde schließlich vermutet, dass die Glykierung von

Insulin mit für die bei Diabetes mellitus Typ 2 charakteristische Glucoseintoleranz und

Insulinresistenz verantwortlich ist (McKillop et al., 1999, 2001, Boyd et al., 2000, Hunter et

al., 2003).

Entsprechend der Untersuchungen am glykierten Insulin (O’Harte, 2000, Boyd et al., 2000,

.10 Zur möglichen Bildung von N-terminalen 2(1H)-Pyrazinonen in

Die Bildung von N-terminalen 2(1H)-Pyrazinonen konnte sowohl an Peptiden als auch an

Hunter et al., 2003) könnte auch das an der B-Kette pyrazinon-modifizierte Insulin eine

verminderte biologische Aktivität aufweisen. Da die N-terminale Aminogruppe der A-Kette

(Gly-A1) und die darauffolgende Peptidbindung zwischen Gly-A1 und Ile-A2 für die

Rezeptorbindung von Bedeutung sind (Nakagawa & Tager, 1992, Olsen et al., 1998), dürfte

dies auch für das an der A-Kette pyrazinon-modifizierte Insulin zutreffen. Insgesamt

betrachtet wäre es somit interessant auf das Vorkommen von pyrazinon-modifizierten Insulin

in vivo sowie dessen biologische Aktivität zu prüfen.

4

Lebensmitteln und in vivo

dem Protein Insulin nachgewiesen werden (Abschnitt 4.3, 4.5, 4.9). Als potente Precursoren

erwiesen sich dabei die α-Dicarbonylverbindungen Glyoxal, Methylglyoxal und

3-Desoxyglucosulose (Abschnitt 4.4.2). Die Bildungsreaktion erfolgt bereits bei

physiologischer Temperatur in einem weiten pH-Bereich von pH = 6 bis 11 (Abschnitt 4.4.4).

Weiterhin wurde jeweils eine nahezu gleiche Geschwindigkeit der 2(1H)-Pyrazinon-Bildung

und der Derivatisierung der Guanidinofunktion des Arginins durch Glyoxal, Methylglyoxal

oder 3-Desoxyglucosulose beobachtet. Die ε-Aminogruppe des Lysins reagierte

- 181 -


demgegenüber nicht (Abschnitt 4.7). Aus Lebensmitteln und in vivo sind bereits zahlreiche

Reaktionsprodukte von Glyoxal, Methylglyoxal oder 3-Desoxyglucosulose mit den

Aminosäureseitenketten von Lysin oder Arginin bekannt (Abschnitt 2.3.2). Da die

Precursoren N-terminaler 2(1H)-Pyrazinone, α-Dicarbonylverbindungen sowie Peptide und

Proteine, sowohl in Lebensmitteln als auch in vivo vorhanden sind, ist folglich insgesamt

betrachtet fest anzunehmen, dass eine Bildung von 2(1H)-Pyrazinonen in Lebensmitteln und

in vivo stattfindet.

Als Indiz für die Bildung von 2(1H)-Pyrazinonen kann die im fortgeschrittenen Stadium der

illard-spezifischen Fluoreszenz wird ebenfalls in vivo beobachtet. Die

2(1H)-Pyrazinone einen Teil der beobachteten Fluoreszenz erklären können. Besonders

Maillard-Reaktion auftretende Fluoreszenz gewertet werden. In Lebensmitteln und

entsprechenden Modellsystemen wird durch eine Wärmebehandlung eine Zunahme der

Fluoreszenzintensität beobachtet. Auf Basis dessen konnte Birlouez-Aragon et al. (1998,

2001) ein auf Fluoreszenzmessung beruhendes Analysenverfahren zur Beurteilung der

Wärmebehandlung etabliert werden. Die Anwendung erfolgte z. B. bei Milch, Cornflakes,

frittiertem Lachs und gerösteten Sojabohnen. Die maximalen Anregungs- und Emissions-

wellenlängen der Maillard-spezifischen Fluoreszenz waren dabei vom Lebensmittel abhängig

und bewegten sich für die Anregung im Bereich von λex, max = 320 nm bis 350 nm und für die

Emission im Bereich von λem, max = 395 nm bis 440 nm. Über die Struktur der

verantwortlichen individuellen Fluorophore konnten jedoch keine Angaben getroffen werden.

Da die identifizierten N-terminalen 2(1H)-Pyrazinone mit einer maximalen Anregungs-

wellenlänge von λex, max = 330 bis 340 nm und einer maximalen Emissionswellenlänge von

λem, max = 395 nm bis 405 nm ebenfalls fluoreszieren, könnte ein Teil der in Lebensmitteln

beobachteten Fluoreszenz auf das Vorkommen dieser N-terminalen Modifikation

zurückzuführen sein.

Das Auftreten der Ma

Intensität nimmt mit steigendem Alter der Proteine zu und tritt verstärkt bei Diabetes mellitus

oder Urämie auf. Auf Grund dessen wird die Fluoreszenz ähnlich wie bei Lebensmitteln als

Summenparameter für den AGE-Status genutzt (Yanagisawa et al., 1998, Henle et al., 1999).

Die Messung der Fluoreszenz erfolgt dabei oft mit der Wellenlängenkombination des

Pentosidins mit λex = 335 nm und λem = 385 nm oder bei höheren Wellenlängen, z. B. mit

λex = 370 nm und λem = 440 nm (Sell & Monnier, 1989, Yanagisawa et al., 1998, Avendano et

al., 1999). Abgesehen vom Pentosidin ist über die Struktur der verantwortlichen individuellen

Fluorophore wenig bekannt. Es ist wiederum zu vermuten, dass N-terminale

- 182 -


wahrscheinlich erscheint dies bei den sogenannten AGE-Peptiden. AGE-Peptide sind

fluoreszierende Peptide mit einer Masse bis 10 kDa die im Blut zirkulieren. Die Gehalte im

Serum und im Urin sind insbesondere bei Diabetikern mit Nierenfehlfunktion erhöht

(Yanagisawa et al., 1998). Durch Hämodialyse werden diese Peptide aus dem Blut entfernt

(Henle et al., 1999, Floridi et al., 2002). Hämodialysate solcher Patienten wären deshalb ein

geeigneter Ausgangspunkt um auf die in vivo-Bildung N-terminale 2(1H)-Pyrazinone zu

prüfen. Die gegenüber Gesunden erhöhten Gehalte an α-Dicarbonylverbindungen im Blut

(Odani et al., 1999b) lassen ebenfalls die 2(1H)-Pyrazinon-Bildung bei Urämikern vermuten.

Auf Grund der hohen Reaktivitäten von Glyoxal und Methylglyoxal sowie der vermuteten

quantitativen Bedeutung der 3-Desoxyglucosulose sind sowohl in Lebensmitteln als auch

in vivo die N-terminalen 2(1H)-Pyrazinone aller drei α-Dicarbonylverbindungen zu erwarten

(siehe Abschnitt 4.6). Weitere α-Dicarbonylverbindungen wie z. B. 1-Desoxyglucosulose

könnten ebenfalls potente Precursoren sein. Eine hohe Anzahl möglicher 2(1H)-Pyrazinone

resultiert aus der N-terminalen Sequenz der Peptide oder Proteine. An der 2(1H)-Pyrazinon-

Bildung sind die erste und zweite Aminosäure vom N-Terminus beginnend betroffen. Es gibt

insgesamt 342 Möglichkeiten, zwei Aminosäuren der neunzehn für die 2(1H)-Pyrazinon-

Bildung in Frage kommenden Aminosäuren (alle proteinogenen Aminosäuren außer Prolin)

zu variieren. Folglich sind bereits 342 2(1H)-Pyrazinon-Dipeptide des Glyoxals formulierbar.

In Hinblick auf den Nachweis einer möglichen 2(1H)-Pyrazinon-Bildung in Lebensmitteln

und in physiologischen Proben wäre es deshalb sinnvoll, gezielt auf diese an bestimmten

ausgewählten Proteinen oder Peptiden zu prüfen. Die Analyse könnte wie der Nachweis am

Insulin mittels RP-HPLC mit UV- und Fluoreszenz-Detektion sowie LC-MS erfolgen. Um

den Nachweis spezifisch zu gestalten, sollte die Analyse ebenfalls nach geeigneter

enzymatischer Hydrolyse durchgeführt werden.

- 183 -

5 Zusammenfassung

Zur Bildung von Furosin aus Amadori-Verbindungen des Lysins

Furosin entsteht bei der Salzsäurehydrolyse aus den Amadori-Produkten des Lysins und wird

als Marker für den Fortschritt der frühen Maillard-Reaktion, zur Beurteilung von

lebensmitteltechnologischen Prozessen sowie zur Berechnung des verfügbaren und des nicht

verfügbaren Lysins verwendet. Für die Nutzung von Furosin als Qualitätsparameter ist die

reproduzierbare und konstante Bildung während der Salzsäurehydrolyse entscheidend. Dies

wird in der Literatur jedoch kontrovers diskutiert. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit galt es

deshalb die molaren Ausbeuten an Furosin und den anderen Hydrolyseprodukten zu

bestimmen und damit eine sichere Interpretation der Ergebnisse zu ermöglichen.

1 Es wurden sowohl die in Lebensmitteln als auch die in vivo quantitativ wichtigen Amadori-

Produkte des Lysins in Form der Nα-Hippuryl-Derivate Nα-Hippuryl-Nε-fructosyl-lysin,

Nα-Hippuryl-Nε-tagatosyl-lysin, Nα-Hippuryl-Nε-lactulosyl-lysin und Nα-Hippuryl-

Nε-maltulosyl-lysin dargestellt. Die chromatographische Isolierung mittels RP-HPLC konnte

dabei durch eine vorgelagerte enzymatische Hydrolyse von nicht umgesetztem

Nα-Hippuryllysin effizient gestaltet werden. Weiterhin wurde freies Nε-Fructosyl-lysin sowie

Pyridosin als Standard gewonnen. Die Absicherung der erforderlichen Reinheit der

Verbindungen erfolgte chromatographisch. Ihre Identität konnte mittels Massenspektroskopie

sowie durch ein- und zweidimensionale NMR-Experimente sichergestellt werden.

2 Die Hydrolyse der Amadori-Verbindungen erfolgte mit der für die Aminosäureanalytik

üblichen Salzsäurekonzentration von 6 M sowie mit der bei der Furosin-Bestimmung oft

verwendeten Salzsäurekonzentration von 8 M. Die Quantifizierung der Hydrolyseprodukte

Furosin, Pyridosin, Lysin und CML in den Hydrolysaten konnte mittels Kationenaustausch-

chromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrin erreicht werden.

3 Die Fructosyl-Verbindungen Nε-Fructosyl-lysin, Nε-Lactulosyl-lysin und Nε-Maltulosyl-

lysin zeigten ein ähnliches Hydrolyseverhalten, welches sich deutlich von dem von

Nε-Tagatosyl-lysin unterschied. Nach Hydrolyse mit 6 M Salzsäure waren bei den Fructosyl-

- 185 -

5 Zusammenfassung

Amadori-Produkten molare Ausbeuten an Furosin zwischen 32 und 35 % feststellbar. Die

Furosin-Bildung aus Nε-Tagatosyl-lysin war demgegenüber mit 42 % signifikant höher. Bei

Hydrolyse mit 8 M Salzsäure wurden bei den Fructosyl-Amadori-Produkten deutlich höhere

molare Ausbeuten zwischen 46 und 51 % bestimmt. Die Bildung aus Nε-Tagatosyl-lysin blieb

bei dieser Konzentration hingegen unverändert bei 42 %. Für die Bestimmung der Lysin-

Derivatisierung bei Proben, welche sowohl Nε-Fructosyl-lysin als auch Nε-Tagatosyl-lysin

enthalten, wie z. B. lactose-hydrolysierte Milchprodukte, wird deshalb die Hydrolyse mit

7,3 M Salzsäure empfohlen. Bei dieser Konzentration liefern beide Amadori-Produkte die

gleiche Menge an Furosin.

4 Die auf Basis der molaren Ausbeuten ermittelten Überführungsfaktoren ermöglichen nun

erstmals eine sichere Bestimmung der Lysin-Derivatisierung auf der Basis der Analytik von

Furosin. Damit sind jetzt exakte Aussagen zum Fortschritt nichtenzymatischer

Glykierungsreaktionen sowohl in Lebensmittel als auch in vivo möglich.

Zur Bildung von N-terminalen 2(1H)-Pyrazinonen

Aufgrund der physiologischen Relevanz von in vivo stattfindenden Glykierungsreaktionen ist

die Untersuchung der Reaktion von Proteinen mit α-Dicarbonylverbindung ein intensiv

untersuchtes Gebiet. Dabei befasste man sich bisher vorzugsweise mit Umsetzungen an den

nucleophilen Seitenketten von Lysin und Arginin. Mögliche Reaktionen am N-Terminus

wurden demgegenüber unter physiologischen Bedingungen (pH = 7,4 und 37 °C) bislang

nicht betrachtet und sollten deshalb der Gegenstand von weiteren Untersuchungen sein.

5 Die Inkubation des Tripeptides Gly-Ala-Phe mit Glyoxal unter physiologischen

Bedingungen führte zu einer sehr schnellen Derivatisierung des Peptides und der

gleichzeitigen Bildung eines definierten Produktes. Nach Isolierung mittels semipräparativer

RP-HPLC konnte das Reaktionsprodukt durch Massenspektroskopie und NMR-Analyse

zweifelsfrei als N-[2-(2-Oxo-2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin identifiziert werden. Die

Verbindung erwies sich in einem weiten pH-Bereich, bei erhöhter Temperatur sowie in

Gegenwart eines Überschusses des α-Dicarbonyl-Reagenzes Aminoguanidin als stabil.

- 186 -

5 Zusammenfassung

6 Bei der Reaktion anderer ausgewählter Peptide, wie Gly-Phe-Ala, Phe-Gly-Gly,

Gly-Gly-Gly, Phe-Gly, Gly-Ile und Gly-Phe, mit Glyoxal war ebenfalls die spezifische

Bildung der entsprechenden 2(1H)-Pyrazinon-Peptide festzustellen. Dabei zeigte sich, dass

die Geschwindigkeit der Reaktion von der Primärstruktur des Peptides, vom pH-Wert und der

Ionenstärke abhängig ist. Die Inkubation von Gly-Ala-Phe mit anderen

α-Dicarbonylverbindung wie Methylglyoxal und 3-Desoxyglucosulose führte ebenfalls zu

den entsprechenden 2(1H)-Pyrazinon-Peptiden sowie weiteren Produkten. Die Reaktion war

damit weniger spezifisch.

7 Nach Inkubation von Gly-Ala-Phe mit Methylglyoxal wurde das Hauptreaktionsprodukt in

chromatographisch reiner Form isoliert und strukturell eindeutig als N-[2-(5-Methyl-2-oxo-

2H-pyrazin-1-yl)-propyl]-phenylalanin aufgeklärt. Die Reaktion mit Methylglyoxal führt

damit regioselektiv zum 5-Methyl-2(1H)-pyrazinon-Derivat.

8 Die identifizierten 2(1H)-Pyrazinon-Derivate sind durch eine charakteristische Bande im

UV oberhalb 300 nm (λUV, max = 322 nm bis 336 nm) und die Eigenschaft zu fluoreszieren

(λex, max = 330 nm bis 340 nm, λem, max = 395 nm bis 405 nm) gekennzeichnet. Dies ermöglicht

die gezielte Analyse mittels RP-HPLC mit UV- und Fluoreszenz-Detektion. Eine

Abhängigkeit der UV- und Fluoreszenz-Charakteristika vom pH-Wert (pH = 2,4 bis 8,3) war

nicht feststellbar.

9 Um die Bedeutung der N-terminalen 2(1H)-Pyrazinon-Bildung beurteilen zu können,

wurden vergleichende Inkubationsexperimente mit peptidgebundenem Lysin und Arginin

sowie Gly-Ala-Phe durchgeführt. Dabei wurde eine ähnliche bis nahezu identische Reaktivität

des N-Terminus von Gly-Ala-Phe und Nα-Hippurylarginin gegenüber Glyoxal, Methylglyoxal

und 3-DG festgestellt. Nα-Hippuryllysin zeigte unter den gewählten Bedingungen hingegen

keine Reaktion. Die Bildung von 2(1H)-Pyrazinonen dürfte damit sowohl in vivo als auch in

Lebensmitteln von Bedeutung sein.

10 Zum Nachweis der 2(1H)-Pyrazinon-Bildung an einem Protein wurde Insulin mit Glyoxal

unter physiologischen Bedingungen in verdünnter Lösung inkubiert. Die Untersuchungen

erfolgten mittels RP-HPLC mit UV- und Fluoreszenz-Detektion sowie mittels LC-ESI-MS

direkt nach der Inkubation am intakten Insulin, am Insulin nach Separierung der Ketten sowie

- 187 -

5 Zusammenfassung

nach enzymatischer Hydrolyse der separierten Ketten. Anhand dessen konnte die Bildung der

2(1H)-Pyrazinon-Struktur sowohl an der A-Kette als auch an der B-Kette eindeutig bewiesen

werden. Dabei wurde eine bevorzugte Derivatisierung des N-Terminus der B-Kette gegenüber

dem der A-Kette festgestellt.

11 Die Reaktion von Insulin mit Glyoxal unter physiologischen Bedingungen in verdünnter

Lösung wurde ebenfalls in Hinblick auf eine Derivatisierung weiterer potentieller

Reaktionsorte geprüft. Modifikationen der Seitenketten des Argininrestes Arg-B22 und des

Lysinrestes Lys-B29 waren durch Anwendung von LC-ESI-MS und Aminosäureanalyse nicht

nachweisbar. Bei Modellumsetzungen von Nα-Hippurylarginin und Nα-Hippuryllysin jeweils

mit Glyoxal unter identischen Bedingungen fanden demgegenüber Reaktionen am Arginin

statt. Nα-Hippuryllysin reagierte nicht. Als Ursache für die verminderte Reaktivität des

proteingebundenen Argininrestes Arg-B22 ist damit die schlechte Zugänglichkeit der

Guanidino-Gruppe in der Raumstruktur des Insulins anzusehen.

12 Es wurde eine Analysenstrategie zum Nachweis peptid- und proteingebundener

2(1H)-Pyrazinone entwickelt. Diese beinhaltet im ersten Schritt die Freisetzung der

N-terminalen 2(1H)-Pyrazinon-Struktur als N1-Alkyl-2(1H)-pyrazinon durch Hydrolyse mit

Salzsäure. Daran schließt sich der Nachweis mittels RP-HPLC mit UV- und Fluoreszenz-

Detektion sowie mittels LC-ESI-MS an. Das Verfahren konnte erfolgreich an glyoxal-

modifizierten Insulin angewendet werden.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass die Bildung von 2(1H)-Pyrazinonen am N-Terminus

von Peptiden und am Protein Insulin durch Reaktion mit α-Dicarbonylverbindungen unter

physiologischen Bedingungen aufgeklärt und bewiesen werden konnte. In den verwendeten

Modell-Systemen zeigte der N-Terminus eine ähnliche Reaktivität wie peptidgebundenes

Arginin. Aufgrund dessen und der durchgeführten Untersuchungen zur Stabilität ist fest

davon auszugehen, dass es sich bei Verbindungen mit 2(1H)-Pyrazinon-Struktur um eine neue

Klasse von AGEs (advanced glycation end-products) mit Bedeutung in physiologischen

Systemen als auch in Lebensmitteln handelt.

- 188 -

6 Ausblick

Die Ergebnisse der im ersten Abschnitt dieser Arbeit durchgeführten Studien zur Analytik

von Amadori-Produkten erlauben eine sichere Bestimmung von Furosin und daraus ableitbare

Berechnung der Lysin-Derivatisierung. Insbesondere bei stark fructosehaltigen Backwaren

wie z. B. bestimmte Diabetikerbackwaren oder Honiggebäcken ist eine dominante

Derivatisierung des Lysins als Heyns-Produkt sowie 3-Keto-Umlagerungsprodukt zu

vermuten. Aufgrund des Fehlens einer geeigneten Analysenmethode für diese Verbindungen

liegen jedoch über diese Derivatisierungen kaum Erkenntnisse vor. Die Etablierung einer

entsprechenden Analytik ist demzufolge erstrebenswert und sollte Gegenstand zukünftiger


Anhand der Studien zur Reaktion von Peptiden oder Insulin mit α-Dicarbonylverbindungen

ist davon auszugehen, dass die Bildung proteingebundener N-terminaler 2(1H)-Pyrazinone

ebenfalls sowohl in vivo als auch in Lebensmitteln stattfindet. Weitere Untersuchungen

sollten sich deshalb mit dem Nachweis dieser Derivatisierung in entsprechenden Proben

befassen. Für die chemische Analytik könnte dabei insbesondere die charakteristische

Fluoreszenz der 2(1H)-Pyrazinone genutzt werden. Wenn die 2(1H)-Pyrazinon-Modifizierung

bestimmter Proteine wie z. B. von Insulin vermutet wird, sollte durch die Verwendung

monoklonaler Antikörper eine sehr spezifische und nachweisstarke Detektion möglich sein.

Weitere Studien sollten sich mit physiologische Aspekten befassen. Dabei könnte in Hinblick

auf eine alimentäre Aufnahme zunächst die Verdau- und Resorbierbarkeit von pyrazinon-

modifizierten Proteinen sowie die Art der Metabolisierung und Elimination der

2(1H)-Pyrazinon-Struktur geprüft werden. Im Zusammenhang mit der möglichen Bildung von

2(1H)-Pyrazinonen in vivo sind insbesondere mögliche Auswirkungen auf die Funktion der

modifizierten Proteine zu betrachtet.

- 189 -

7 Literaturverzeichnis

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Erklärung

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und

ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden

Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Die

Arbeit wurde bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer

anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.

Die Dissertation wurde am Institut für Lebensmittelchemie der Technischen Universität

Dresden unter der wissenschaftlichen Betreuung von Herrn Prof. Dr. rer. nat. Dr.-Ing. habil.

Thomas Henle angefertigt.

Erfolglose Promotionsverfahren haben durch mich bis jetzt nicht stattgefunden.

Die Promotionsordnung der Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften der Technischen

Universität Dresden in der aktuell gültigen Fassung erkenne ich in allen Teilen an.

René Krause

Danksagung

Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Thomas Henle, Direktor am Institut für

Lebensmittelchemie der TU Dresden, für das entgegengebrachte Vertrauen, die Möglichkeit

ein so interessantes Thema bearbeiten zu dürfen sowie die stetige Unterstützung und das

ausgezeichnete freundschaftliche Verhältnis.

Herrn Prof. Dr. Wolfgang Krause, emeritierter Professor am Institut für Lebensmittelchemie

der TU Dresden, und Herrn Prof. Dr. Lothar W. Kroh, Direktor am Institut für

Lebensmittelchemie der TU Berlin, danke ich für die freundliche Übernahme der Korreferate.

Bei Frau DLC Kerstin Knoll, Frau DLC Janina Kühn und Frau DLC Ilka Penndorf möchte ich

mich für die sehr engagierte Mitarbeit im Rahmen ihrer Diplomarbeiten bedanken. Frau Dipl.-

Ing. (FH) Karla Schlosser danke ich für die Durchführung der Aminosäureanalysen und Dr.

Uwe Schwarzenbolz für die Messungen mittels LC-ESI-MS. Bei Frau Annett Rudolf, Herrn

Dr. Dieter Scheller, Frau Dr. Margit Gruner, Herrn Dr. Herbert Kroschwitz und Frau Anke

Peritz vom Institut für Organische Chemie gilt mein Dank für die Aufnahme von NMR- und

MS-Spektren sowie die Durchführung von Elementaranalysen.

Allen Doktoranden, Mitarbeitern, Diplomanden und Studenten des Institutes für

Lebensmittelchemie der TU Dresden danke ich für das freundschaftliche Umfeld und die

angenehme Arbeitsatmosphäre. Ganz besonders möchte ich mich bei meinem Mitstreiter und

sehr guten Freund Dr. Thomas Siegl sowie meinen beiden Diplomandinnen Frau Evelyn

Schwarzer und Frau Katja Wolf bedanken.

Nicht zuletzt danke ich meiner Familie und Freunden durch deren Unterstützung das Gelingen

dieser Arbeit mit ermöglicht wurde.

Documents

Untersuchungen zur Bildung von Furosin und N-terminalen 2