Untersuchungen zur Biosynthese und zum Wirkmechanismus der ...€¦ · 4.2.4 LC-ESI-MS und LC-DAD zur Untersuchung der Abyssomicine 59 4.2.5 Präparative HPLC-MS 60 4.2.6 Umsetzungen

I

Untersuchungen zur Biosynthese

und zum Wirkmechanismus der Abyssomicine

vorgelegt von

Diplom-Biochemikerin

Simone Keller

Von der Fakultät II – Mathematik und Naturwissenschaften

der Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften

Dr. rer. nat.

Genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Prof. Dr. A. Grohmann

Berichter/Gutachter: Prof. Dr. R. D. Süssmuth

Berichter/Gutachter: PD Dr. U. Keller

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 24. April 2007

Berlin 2007

D83

II

für Heiko

I

Zusammenfassung

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, neue Erkenntnisse zum Wirkmechanismus und zur Bio-

synthese der Abyssomicine zu gewinnen. Ein wichtiger Meilenstein hierbei war die Ent-

deckung weiterer Mitglieder der Abyssomicin-Familie, insbesondere des atrop-Abyssomicin

C, welches ein wirksameres Antibiotikum als Abyssomicin C und zudem leichter aufzu-

reinigen ist. Besonders die Untersuchungen zur Abyssomicinbiosynthese wurden von dieser

Entdeckung entscheidend erleichtert. In die Abyssomicinbiosynthese, die im Rahmen dieser

Arbeit mittels Fütterungsexperimenten von 13C-markierten Vorläufern untersucht wurde,

konnten entscheidende Einblicke gewonnen werden. Es gelang die Zuordnung der Herkunft

aller Kohlenstoffatome des atrop-Abyssomicin C. Durch Fütterung von markiertem Acetat,

Propionat und Glucose konnte geklärt werden, dass C-1, C-2, C-7 bis C-13 sowie C-17 von

Acetat stammen, C-3 bis C-6 sowie C-18 und C-19 stammen von Propionat und C-14 bis

C-16 werden vermutlich über Enoylpyruvat-S-ACP in atrop-Abyssomicin C eingebaut.

Die Untersuchung des Wirkmechanismus wurde auf drei Säulen aufgebaut: Zunächst wurde

ein einfaches Modellsystem (Mercaptoethanol, N-Acetyl-Cystein) gewählt, das mit atrop-

Abyssomicin C umgesetzt wurde. So konnte gezeigt werden, dass atrop-Abyssomicin

nucleophil durch Schwefel angegriffen werden kann, und zudem eine Umlagerung zu einer

Abyssomicin D-artigen Struktur erfolgt. Die zweite Säule zur Untersuchung des

Wirkmechanismus war eine hemmkinetikische Untersuchung. Hierfür wurden zunächst die an

der Aminodesoxychorismatsynthese beteiligten Enzyme PabA (Klonierung und

Überexpression erfolgte bereits im Rahmen der Diplomarbeit) und PabB aus aus dem

Gesamtgenom des Abyssomicin-sensitiven B. subtilis in E. coli kloniert, überexprimiert und

eine Reinigungsstrategie etabliert. Zur Verfolgung der Enzymreaktion wurde ein geeignetes

Assay-System entwickelt, das eine direkte Beobachtung der ADC-Synthase Reaktion

ermöglichte. Es wurde eine LC-MS basierte MRM-Methode etabliert, mit der die Bildung von

ADC durch den MRM-Übergang von m/z 226 zu m/z 191 aufgezeichnet wird. Zur

Hemmkinetik wurden verschiedene atrop-Abyssomicinkonzentrationen unterschiedlich lange

mit ADC-Synthase inkubiert, die Enzymreaktion gestartet und mittels MRM quantifiziert.

Dabei ergab sich ein Hemmmuster, das einer irreversiblen Inhibition entspricht. Die dritte

Säule schließlich war die Untersuchung der Bindungsstelle von atrop-Abyssomicin C an

PabB. Diese erfolgte durch Verdau des mit Inhibitor inkubierten Enzyms sowie des

unbehandelten Enzyms durch Endoproteinase GluC, anschließender LC-MS und LC-MS/MS-

Analytik und Vergleich. Hierbei wurde herausgefunden, dass atrop-Abyssomicin C kovalent

an die Seitenkette von 263Cys des Peptids TPDFFQIICGSPE bindet.

Inhaltsverzeichnis

I

1 EINLEITUNG 1 1.1 Antibiotika, die auf den Folsäuremetabolismus wirken 2

1.1.1 Die Bedeutung der Folsäure 2 1.1.2 Die Folsäurebiosynthese 4 1.1.3 Beispiele für Antibiotika des Folsäuremetabolismus 4

1.2 Abyssomicin C 7 1.2.1 Die Screeningmethode 11 1.2.2 Die Biosynthesen des Shikimat-Stoffwechselweges 11

1.3 Die p-Aminobenzoesäurebiosynthese 13 1.3.1 Das Folat-Operon von Bacillus subtilis 13 1.3.2 Die Enzyme der p-Aminobenzoesäuresynthese 14 1.3.3 Abyssomicin C und die p-Aminobenzoesäurebiosynthese 21

1.4 Polyketidsynthese 23 1.4.1 Polyketidsynthasen vom Typ I 24 1.4.2 Der Synthesemechanismus 25 1.4.3 Die Biosynthese von Chlorothricin 26

2 GRUNDLAGEN 29 2.1 Chromatographie und Massenspektrometrie 29

2.1.1 Elektrospray-Ionisierung (ESI) 29 2.1.2 Der Triple Quadrupol Analysator 30 2.1.3 Applied Biosystems/MDS Sciex QTrap 2000 32 2.1.4 LC-ESI-MS-Kopplung 33 2.1.5 MS/MS-Experimente 33

2.2 Kernresonanzspektroskopie 35 2.2.1 Das COSY-Experiment 36 2.2.2 Das TOCSY-Experiment 37 2.2.3 Das HMQC-Experiment 39 2.2.4 Das HMBC-Experiment 39

2.3 Enzymkinetik 40

3 ZIELSETZUNG 44

4 MATERIAL UND METHODEN 45 4.1 Material 45

4.1.1 Geräte 45 4.1.2 Chemikalien 46 4.1.3 Enzyme 47 4.1.4 Medien 47 4.1.5 Medienzusätze 48 4.1.6 Lösungen 49 4.1.7 Bakterienstämme 56 4.1.8 Plasmide 57 4.1.9 Primer 57

4.2 Mikrobiologische Methoden 58 4.2.1 Lagerung und Anzucht von Verrucosispora AB-18-032 58 4.2.2 Fütterungsexperimente mit 13C-isotopenmarkierten Verbindungen 58 4.2.3 Isolierung der Abyssomicine aus Kulturen von Verrucosispora 58

Inhaltsverzeichnis

II

4.2.4 LC-ESI-MS und LC-DAD zur Untersuchung der Abyssomicine 59 4.2.5 Präparative HPLC-MS 60 4.2.6 Umsetzungen von Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C mit Nucleophilen 61 4.2.7 Testierung der Abyssomicine auf antibiotische Aktivität 63

4.3 Molekularbiologische Methoden 63 4.3.1 Isolierung von chromosomaler DNA aus B. subtilis DSM 10 63 4.3.2 Agarose-Gelelektrophorese 64 4.3.3 Polymerasekettenreaktion (PCR) 64 4.3.4 Restriktionsverdau, Phosphatase-Reaktionen und Ligationen 65 4.3.5 Reinigung von DNA-Fragmenten 65 4.3.6 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen 66 4.3.7 Transformation von kompetenten E. coli-Zellen mit Plasmid-DNA 66 4.3.8 Isolierung von Plasmid-DNA 66

4.4 Proteinchemische Methoden 67 4.4.1 Induktion und Überexpression 67 4.4.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 67 4.4.3 Reinigung von PabA 68 4.4.4 Reinigung von PabB 68 4.4.5 Proteinbestimmung 68 4.4.6 GluC-Verdau 69 4.4.7 Kinetik der ADC-Synthase-Reaktion 70

5 ERGEBNISSE 75 5.1 Strukturaufklärung neuer Abyssomicine 75

5.1.1 Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C 75 5.1.2 Abyssomicin B 79 5.1.3 Abyssomicin G 83 5.1.4 Abyssomicin H 90 5.1.5 Weitere Abyssomicine 94 5.1.6 Abyssomicin A 97 5.1.7 Zusammenfassung 97

5.2 Untersuchungen zur Biosynthese von atrop-Abyssomicin C 100 5.2.1 Fütterung von 1-13C markiertem Acetat 100 5.2.2 Fütterung von 1,2-13C-markiertem Acetat 101 5.2.3 Fütterung von 1-13C-markiertem Propionat 103 5.2.4 Die C3-Einheit der Tetronsäure 104 5.2.5 Zusammenfassung 106

5.3 Überexpression und Aufreinigung der Proteine PabA und PabB 108 5.3.1 Konstruktion des Plasmids 108

5.4 Untersuchungen zum Wirkmechanismus von Abyssomicin 111 5.4.1 Umsetzung von atrop-Abyssomicin C mit Mercaptoethanol und N-Acetylcystein 111 5.4.2 Umsetzung von atrop-Abyssomicin C mit PabB 115 5.4.3 Hemmkinetik von ADC-Synthase mit atrop-Abyssomicin C 116

6 DISKUSSION 123 6.1 neue Abyssomicine 123

6.1.1 Abyssomicin B und G 123 6.1.2 Abyssomicin D und H 124 6.1.3 Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C 125

6.2 Biosynthese der Abyssomicine 129 6.3 Wirkung von atrop-Abyssomicin C als irreversibler Inhibitor von PabB 134

Inhaltsverzeichnis

III

6.3.1 Vergleich von atrop-Abyssomicin C mit literaturbekannten irreversiblen Inhibitoren 135 6.3.2 Vergleich von B. subtilis PabB mit PabB anderer Organismen und mit der Anthranilatsynthase 139 6.3.3 Überlegungen zum Resistenzmechanismus von Verrucosispora AB-18-032 144

6.4 Zusammenfassung und Ausblick 146

7 LITERATUR 147

8 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 157

9 TABELLENVERZEICHNIS 162

Abkürzungsverzeichnis

IV

ACN Acetonitril

ACP Acyl Carrier Protein

ADC Aminodesoxychorismat

Amp Ampicillin

APS Ammoniumpersulfat

AT Acyltransferase

ATP Adenosintriphosphat

BCA Bicinchoninsäure

BSA Rinderserumalbumin

CRM Charged Residue Model

DH Dehydratase

DHF Dihydrofolsäure

DNA Desoxyribonucleinsäure

dNTP Desoxyribonucleosidtriphosphat

DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

dTMP Desoxythymidinmonophosphat

DTT Dithiothreitol

dUMP Desoxyuridinmonophosphat

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EIC Extracted ion chromatogram

EMS Enhanced MS

EPI Enhanced Product Ion Scan

ER Enoylreduktase

ES Elektrospray

ESI Elektrospray-Ionisation

eV Elektronenvolt

GATase Glutamin-Amidotransferase

HPLC High performance liquid chromatography

IEM Ion Evaporation Model

IMP Inositolmonophosphat

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

kDa Kilodalton

KR Ketoreduktase

KS Ketosynthase

Abkürzungsverzeichnis

V

LC Liquid chromatography

MRM Multiple Reaction Monitoring

MCS Multiple cloning site

MS Massenspektrometrie

m/z Verhältnis Masse zu Ladung

NL Neutral Loss / Neutralverlust

OD Optische Dichte

ORF Open reading frame

pABA p-Aminobenzoesäure

PabA β-Untereinheit der ADC-Synthase

PabB α-Untereinheit der ADC-Synthase

PabC ADC-Lyase

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PC Precursor Ion Scan

PCR Polymerasekettenreaktion

PI Product Ion Scan / Produktionen Scan

PKS Polyketidsynthase

PLP Pyridoxalphosphat

RNA Ribonucleinsäure

rpm Revolutions per Minute

SDS Natriumdodecylsulfat

TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin

TE Thioesterase

TFA Trifluoressigsäure

THF Tetrahydrofolsäure

TIC Totalionen-Chromatogramm

TRAP Tryptophan-RNA-Binding Attenuation Protein

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

Für Aminosäuren wurde entsprechend den Vorschlägen der IUPAC-IUB-Kommission (1984)

für biologische Nomenklatur der Ein- oder Dreibuchstaben-Code verwendet.

Einleitung

1

1 Einleitung „Da für die (…) Masse von Leichnamen, die täglich und fast stündlich zu jeder Kirche

gebracht wurden, die geweihte Erde für das Begräbnis nicht mehr ausreichte, besonders,

wenn man nach altem Brauch jedem sein eigenes Grab hätte geben wollen, wurden in den

Kirchhöfen, als jeder Platz belegt war, große Gräben ausgehoben und die Neuverstorbenen

zu Hunderten hineingelegt. Sie wurden dort schichtweise, wie im Schiffsraum die Waren,

übereinandergestapelt und mit wenig Erde bedeckt…“

So schreibt Giovanni Boccaccio in seinem Meisterwerk „Il Decamerone“ über das Jahr 1348

in Florenz, als die Pest in Europa so viele Opfer forderte wie nie zuvor und nie wieder seither

eine Seuchenkatastrophe. Heutzutage tritt die Pest im europäischen Raum höchst selten auf,

und falls doch, lässt sie sich hervorragend z. B. mit dem Antibiotikum Streptomycin

behandeln. Wie die Pest sind die meisten bakteriellen Infektionen mittlerweile gut durch

Antibiotika in den Griff zu bekommen. Dies ist um so beeindruckender, wenn man bedenkt,

dass noch zu Beginn des 20. Jahrhunderts die Heilungschancen einer schweren bakteriellen

Infektion kaum besser standen als heutzutage die eines bösartigen Tumors oder von HIV. Die

Tatsache, dass inzwischen eine Vielzahl hochwirksamer, routinemäßig einsetzbarer

Medikamente zur Behandlung von Infektionskrankheiten zur Verfügung steht, wäre nicht

vorstellbar ohne herausragende Arbeiten von Forschern der letzten zwei Jahrhunderte.

Der erste, der einen lebenden Mikroorganismus als Ursache einer Infektionskrankheit

identifizieren konnte, war Robert Koch, der 1876 das Milzbrandbazillus entdeckte. Er war es

auch, der die Grundlagen der Bakteriologie schuf, in dem er Methoden zur Züchtung und

Färbung von Bakterien entwickelte.

Sicherlich ein Meilenstein in der Geschichte der Antibiotika war Alexander Flemings

Entdeckung des Penicillins 1928 (Publikation 1929). Fleming hatte beobachtet, dass

Stoffwechselprodukte des Pilzes Penicillium notatum das Wachstum von Bakterienkolonien

hemmen. Kurze Zeit später (1932) entdeckte Gerhard Domagk die antibiotische Wirkung des

Azofarbstoffs Prontosil.

Im zweiten Weltkrieg zeigte sich der unschätzbar hohe Wert des Penicillins, dessen Isolierung

E. Chain und H.W. Florey 1940 gelang, im Kampf gegen verschiedenste

Infektionskrankheiten (Abraham, 1983). Dies regte die Suche nach neuen antibiotisch

wirksamen Naturstoffen und wirksamen chemischen Abwandlungen derselben an.

Heute verfügen wir über eine Vielzahl hochaktiver Antibiotika, denen unterschiedlichste

chemische Strukturen und Wirkorte zugrunde liegen. Die Suche nach neuen Antibiotika

Einleitung

2

jedoch ist aktuell geblieben. Allzuschnell vermögen die meisten Bakterien

Resistenzmechanismen zu entwickeln, durch die sie sich der antibiotischen Therapie

entziehen können. Die zukünftige Bekämpfung von bakteriellen Infektionskrankheiten wird

also immer ein Wettlauf mit der Zeit sein, bei dem der Mensch neue Wirkstoffe den sich

entwickelnden Resistenzen entgegensetzen muß.

1.1 Antibiotika, die auf den Folsäuremetabolismus wirken

1.1.1 Die Bedeutung der Folsäure

Folsäure gehört zu den Vitaminen der B-Gruppe. Während der menschliche Organismus

Folsäure nicht synthetisieren kann und seinen Bedarf über die Nahrung decken muss,

verfügen Pflanzen, Bakterien und einige Protozoen wie z.B. Plasmodien über die zur

Biosynthese erforderlichen Enzyme. Die im Organismus aktive Form ist die durch Reduktion

entstehende Tetrahydrofolsäure (Abbildung 1-1), die als Überträger von Methyl- und

Formylgruppen dient. Eine wichtige Rolle kommt der Tetrahydrofolsäure beim

Nucleotidstoffwechsel zu: Sowohl zum Aufbau der Purinnucleotide (Abbildung 1-2) als auch

zur Umwandlung von dUMP zu dTMP (Abbildung 1-3) wird Tetrahydrofolat benötigt.

N

N

HN

NH

H2N

O HN

HN

O

COO-H

COO-

H

10

5

p-Aminobenzoesäure

Glutamat

Abbildung 1-1. Struktur der Tetrahydrofolsäure.

Bei der Purinbiosynthese wird an zwei Stellen eine Formylgruppe von N10-Formyl-

Tetrahydrofolat auf eine Aminogruppe des Zwischenprodukts übertragen (Benkovic, 1984;

Mueller und Benkovic, 1981). Dabei wird N10-Formyl-Tetrahydrofolat zu Tetrahydrofolat

(s. Abbildung 1-2) umgewandelt.

Einleitung

3

HN

N N

N

P-Ribosyl

O

H2N

NH

N

N

P-Ribosyl

O

O

H

H2N

H2N N

N

P-Ribosyl

O

NH

HN

P-Ribosyl

O

H

ONH

NH2

P-Ribosyl

O

N10-Formyl-THF THF

GAR TFase

AICAR TFase

GAR FGAR

AICAR FAICAR IMP

5 Schritte

3 SchritteRibose-5'-P

N10-Formyl-THF THF

Abbildung 1-2. Schritte der Purinbiosynthese, an denen THF beteiligt ist. GAR = Glycinamid-β-D-ribofuranosyl-5’-monophosphat; FGAR = Formylglycinamid-β-D-ribofuranosyl-5’-mono-phosphat; GAR TFase = Glycinamidribonucleotid Transformylase; AICAR = 5-Amino-4-imidazolcarboxamid-β-1-D-ribofuranosyl-5’-monophosphat; FAICAR = 1’-[(5-Formylamino)-4-(aminocarbonyl)-1-imidazolyl]-β-D-ribofuranosyl-5’-monophosphat; AICAR TFase = 5-Amino-4-imidazolcarboxamid-ribonucleotid Transformylase

Im Hinblick auf mögliche Zielproteine oder Zielstrukturen für Antibiotika noch interessanter

ist die Biosynthese von Thymidylat (dTMP) aus dUMP (s. Abbildung 1-3). Die Umwandlung

von dUMP zu dTMP wird durch Thymidylat-Synthase katalysiert. Diese überträgt eine

Methylengruppe von N5,N10-Methylen-Tetrahydrofolat auf dUMP. Ungewöhnlich an dieser

Reaktion ist, dass bei der anschließenden Reduktion der Methylen- zur Methylgruppe

Tetrahydrofolat zu Dihydrofolat oxidiert wird und durch Dihydrofolat-Reduktase wieder zu

Tetrahydrofolat reduziert werden muss (Carreras und Santi, 1995).

Einleitung

4

O

HOH

HH

HH

HN

N

O

O

CH3

OP-O

O

O-O

OHOH

HH

HH

HN

N

O

O

OP-O

O

O-

N

N

N

NH

H2N

O

CH2

H

NC RH

HN

N

N

NH

H2N

O HN R

N

N

HN

NH

H2N

O

CH2

HN R

H

dUMP dTMP

Thymidylat-Synthase

N5,N10-Methylen-

tetrahydrofolat

Dihydrofolat

Dihydrofolat-Reduktase

Tetrahydrofolat

Abbildung 1-3. Die Biosynthese von dTMP aus dUMP durch Thymidylat-Synthase. Alle drei Wasserstoffatome der Methylgruppe stammen von N

5,N

10-Methylentetrahydrofolat (grau hinterlegt). Deshalb muss das bei der dTMP-Biosynthese entstehende 7,8-Dihydrofolat durch Dihydrofolat-Reduktase wieder zu Tetrahydrofolat reduziert werden. Der mit Glutamat verknüpfte p-Aminobenzoesäure des Tetrahydrofolats ist in der Abbildung mit R bezeichnet.

1.1.2 Die Folsäurebiosynthese

Die Folsäurebiosynthese beginnt mit der Umwandlung von Guanosinmonophosphat zu

Dihydroneopterin (Mathis und Brown, 1980; Burg und Brown, 1986; Brown und Williamson,

1987; Bracher et al., 2001). Dieses wird durch Pyrophosphorylierung mit ATP aktiviert und

durch eine Reaktion mit p-Aminobenzoesäure zum Dihydropteroat verknüpft. Durch ATP-

abhängige Reaktion der Carboxygruppe mit der Aminogruppe von Glutamat entsteht

schließlich Dihydrofolsäure (Abbildung 1-5) (Green et al, 1996). Die aktive Form der

Folsäure ist die Tetrahydrofolsäure. Diese entsteht durch Reduktion der Dihydrofolsäure

durch Dihydrofolat-Reduktase (Charlton et al, 1979).

1.1.3 Beispiele für Antibiotika des Folsäuremetabolismus

Die Geschichte der Sulfonamid-Antibiotika begann 1932, als Gerhard Domagk bei der

Untersuchung neu synthetisierter Azofarbstoffe die antibiotische Wirkung des Prontosils

(Abbildung 1-5) auf Streptokokken entdeckte (Domagk, 1935). Prontosil selbst besitzt zwar

keine antibiotische Aktivität, wird jedoch nach Aufnahme durch den Säugetierorganismus

zum wirksamen Sulfanilamid (Abbildung 1-4) metabolisiert (Fuller, 1937). Domagk sollte

Einleitung

5

1939 den Nobelpreis für die Entdeckung der antibakteriellen Effekte des Prontosils erhalten,

die damalige nationalsozialistische Regierung gestattete ihm jedoch nicht, die Auszeichnung

anzunehmen. Erst 1947 konnte die Verleihung des Nobelpreises an Domagk stattfinden.

H2N

S

O

NH2

O

Abbildung 1-4. Struktur von Sulfanilamid, dem antibiotisch wirksamen Metaboliten des Prontosils.

Durch chemische Modifikation der Prontosil-Grundstruktur wurde eine große strukturelle

Vielfalt an Sulfonamiden entwickelt, die bei unterschiedlichen pharmakokinetischen und

toxikologischen Eigenschaften eine einheitliche Wirkung zeigten. Entscheidend für die

antibiotische Wirkung ist die freie Aminogruppe in para-Stellung (Northey, 1940). Wie aus

den chemischen Strukturen erkennbar ist, wirken Sulfonamide wie Sulfamethoxazol

(Abbildung 1-5) antibiotisch, indem sie kompetitiv die p-Aminobenzoesäure verdrängen.

Damit diese Verdrängung in ausreichendem Maße verläuft, müssen Sulfonamide in relativ

hohen Dosen (im Gramm-Bereich) verabreicht werden. Da Bakterien p-Aminobenzoesäure

zwar zur Vermehrung benötigen, durch einen Mangel aber nicht abgetötet werden, wirken

Sulfonamide bakteriostatisch und nicht bakterizid. Durch umfangreichen Einsatz von

Sulfonamidantibiotika bildeten sich rasch Resistenzen aus, so dass ihre Anwendung stark

eingeschränkt wurde. Heutzutage werden Sulfonamide nur noch in Kombination mit

Diaminobenzylpyrimidinen verabreicht.

Prominentester Vertreter der Diaminobenzylpyrimidine ist Trimethoprim (s. Abbildung 1-5).

Dieses hemmt die Dihydrofolsäurereduktase (Nichol und Welch, 1950; Burchall und

Hitchings, 1965), die, wie unter 1.1.1 beschrieben, vor allem bei der Synthese von Thymidin

eine entscheidende Rolle spielt, da sie die Reduktion der bei der Thymidinsynthese

entstehenden Dihydrofolsäure zur Tetrahydrofolsäure katalysiert. Wird die

Dihydrofolsäurereduktase gehemmt, so kann Tetrahydrofolsäure nicht regeneriert werden,

was eine Störung der Purin- und Thymidinbiosynthese verursacht. Da beides elementare

Bausteine der Replikation aber auch der Transkription sind, wird so das Bakterienwachstum

gehemmt. Die menschliche Dihydrofolsäurereduktase unterscheidet sich strukturell so stark

vom bakteriellen Enzym, dass sie durch Trimethoprim kaum gehemmt wird (Burchall und

Hitchings, 1965).

Die im medizinischen Einsatz verabreichte Wirkstoff-Kombination von Sulfonamiden mit

Trimethoprim zeichnet sich durch geringe Toxizität für den Wirtsorganismus sowie, als Folge

Einleitung

6

der Kombination der Hemmwirkung auf zwei unterschiedliche Schritte der

Folsäurebiosynthese, durch stärkere Wirksamkeit und verringerte Tendenz der

Resistenzbildung aus. Ein Hauptanwendungsgebiet für solche Kombinationen sind

Harnwegsinfektionen und, in höherer Dosis eingesetzt, die Pneumocystis carinii-Pneumonie.

Der breite Einsatz dieser Kombinationspräparate führte jedoch auch in den letzten Jahren in

starkem Maße zu Resistenzbildungen. Den Resistenzen gegen Sulfonamide und Trimethoprim

liegen mehrere verschiedene Mechanismen zu Grunde. So kann durch Überexpression von

p-Aminobenzoesäure eine Unempfindlichkeit des Bakteriums gegen Sulfonamide

hervorgerufen werden. Auch durch Überexpression der betroffenen Enzyme,

Dihydropteroatsynthase und Dihydrofolsäurereduktase, oder durch Veringerung ihrer

Affinität zu Sulfonamiden und Trimethoprim kann deren Wirkung herabgesetzt werden

(Sköld, 2001). Daneben existieren Resistenzen, die auf der Aufnahme von Folaten oder

Endprodukten wie Thymin aus der Umgebung basieren (Sköld, 2001). Auch Resistenzen, die

auf einer Undurchlässigkeit der äußeren Zellmembran für die beiden Substanzen beruhen

(Then, 1982), sind bekannt.

Dihydroneopterin

Dihydrofolat

Tetrahydrofolat

Dihydropteroat

6-OH-7,8-Dihydropterinpyrophosphat

Prontosil rubrum

N

N

H2C OCH3

OCH3

OCH3NH2

H2N

N

N

NH2

H2N

S

NH2

OO

NH2

S

NH

OO

SN

HN

N

O

H2N NH

HN CH2NH

O

HN

COOH

COOH

HN

N

O

H2N NH

N CH2NH

O

HN

COOH

COOH

HN

N

O

H2N NH

N CH2NH COOH

HN

N

O

H2N NH

N CH2O P-P

HN

N

O

H2N NH

N CH2OH

COOH

NH2

Chorismat

Trimethoprim

Sulfamethoxazol

Dihydroneopterin

Dihydrofolat

Tetrahydrofolat

Dihydropteroat

6-OH-7,8-Dihydropterinpyrophosphat

Prontosil rubrum

N

N

H2C OCH3

OCH3

OCH3NH2

H2N

N

N

NH2

H2N

S

NH2

OO

NH2

S

NH

OO

SN

HN

N

O

H2N NH

HN CH2NH

O

HN

COOH

COOH

HN

N

O

H2N NH

N CH2NH

O

HN

COOH

COOH

HN

N

O

H2N NH

N CH2NH COOH

HN

N

O

H2N NH

N CH2O P-P

HN

N

O

H2N NH

N CH2OH

COOH

NH2

Chorismat

Trimethoprim

Sulfamethoxazol

Abbildung 1-5. Die Tetrahydrofolatbiosynthese und bekannte Inhibitoren.

Ein weiterer Wirkstoff, der in den Folsäurestoffwechsel eingreift, ist Methotrexat (Abbildung

1-6). Wie bei der Betrachtung der Strukturformel unschwer zu erkennen ist, handelt es sich

Einleitung

7

bei Methotrexat um einen Folsäureantagonisten. Methotrexat wird nicht als Antiinfektivum

eingesetzt, sondern zur Therapie von Autoimmunerkrankungen sowie, hoch dosiert, zur

Behandlung von Tumoren und Leukämie.

N

N

N

NH2N

NH2 N

HN

O

COO-H

COO-

10

5

H3C

Abbildung 1-6. Struktur des Folsäureantagonisten Methotrexat.

1.2 Abyssomicin C

Im Rahmen eines Screening-Programms basierend auf einer Idee von Prof. Hans Zähner in

Zusammenarbeit mit unserem Kooperationspartner Prof. Peter Fiedler und seiner

Arbeitsgruppe wurde durch gerichtetes biologisches Screening ein Naturstoff gefunden,

dessen antibiotische Wirkung auf eine Hemmung der Biosynthese von p-Aminobenzoesäure

(pABA) zurückzuführen ist (Riedlinger et al., 2004).

H3CCH3

O

HO

OO

O

CH3

HO

*

**

*

** **

*

H3C CH3

O O

OO

O

CH3

HO

*

*

*

** **

H3C CH3

OO

OO

O

CH3

HO

N

HO**

*

****

*

Abyssomicin B8 Sterozentren5 RingeC19H23O7N

Abyssomicin C7 Sterozentren4 RingeC19H22O6

Abyssomicin D9 Sterozentren5 RingeC19H24O7N

Abbildung 1-7. Strukturformeln der Abyssomicine B, C und D.

Die Substanzen wurden aus Kulturen des Actinomyceten Verrucosispora AB 18-032 isoliert,

der aus der Sagami Bay in der Japanischen See aus einer Tiefe von 289 m stammt. Drei

Sekundärmetabolite dieses Stammes, Abyssomicin B, C und D (Abbildung 1-7), wurden

isoliert und ihre Struktur aufgeklärt (Bister et al, 2004).

Einleitung

8

Die Untersuchung der analysenreinen Abyssomicine B, C und D durch einen

Agarplattendiffusionstest zeigte, dass nur Abyssomicin C antibiotisch aktiv ist und

inhibitorische Aktivität gegen Gram-positive Bakterien zeigt. Gram-negative Bakterien und

Pilze reagieren nicht sensitiv auf Abyssomicin C. Das Wirkspektrum von Abyssomicin C ist

in Tabelle 1-1 dargestellt.

Tabelle 1-1. Antibakterielles Spektrum von Abyssomicin C. Angegeben sind die Hemmhöfe des Plattendiffusionstests [mm] bei Verwendung von Komplexmedium (Riedlinger et al., 2004).

Abyssomicin C (mg/ml)

Organismus 1 0,3 0,1

Arthrobacter aurescens DSM 20166 14 10 -

Brevibacillus brevis DSM 30 17 12 9

Bacillus subtilis DSM 10 16 12 10

Micrococcus luteus ATCC 381 - - -

Mycobacterium phlei DSM 750 - - -

Staphylococcus aureus DSM 20231 19 11 9

Rhodococcus erythropolis DSM 1069 27 18 15

Streptomyces viridochromogenes Tü 57 11 9 -

Aufgrund der hochinteressanten Strukturen der Abyssomicine ist es nicht erstaunlich, dass

einige synthetisch arbeitende Gruppen sich an der Totalsynthese des Abyssomicin C versucht

haben. Drei erfolgreiche Synthesen wurden bisher publiziert. Die erste wurde von der Gruppe

Erik Sorensens veröffentlicht, die zweite und dritte von K.C. Nicolaou. Interessanterweise

gelang K.C. Nicolaou die Synthese eines zweiten dem Abyssomicin C sehr ähnlichen

Derivats, dem atrop-Abyssomicin C (Abbildung 1-8).

Einleitung

9

Abbildung 1-8: Röntgenstrukturen von Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C (Bister et al., 2004 und Nicolaou und Harris, 2006).

Es handelt sich hier um atrop-Isomere, die voneinander getrennt werden können und stabil

sind. Der Unterschied besteht in der Stellung der Doppelbindung zur Ketogruppe, die im Falle

des Abyssomicin C transoid (145°), im Falle des atrop-Abyssomicin C cisoid (26°) ist. Da die

Konjugation zwischen der Doppelbindung und der Carbonylgruppe beim atrop-Abyssomicin

C erhöht ist, handelt es sich bei atrop-Abyssomicin C um einen stärkeren Michael-Akzeptor.

Die physiko-chemischen Unterschiede zwischen Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C

sind geringfügig: Die Retentionszeiten unterscheiden sich in einem linearen

Standardgradienten von 5 auf 100 % wässriges ACN auf RP-C18 Phasen um 0,02 min, die

Masse ist identisch, die UV-Spektren ähnlich.

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

500

1000

1500

2000

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

500

1000

1500

2000

Abbildung 1-9: UV-Spektren von Abyssomicin C (links) und atrop-Abyssomicin C (rechts).

H3CCH3

O O

OO

O

CH3

HO

H

H

O=C7-C8=C9 26 °

cisoid

O

H

RO=C7-C8=C9 145 °

transoid

O R

H

Abyssomicin C atrop-Abyssomicin C

Einleitung

10

Einzig in NMR-Spektren sind deutliche Unterschiede bei den 13C-Verschiebungen von C-8

und C-9 sowie der 1H-Verschiebung von CH-9 auffällig. Die Kopplungsmuster in den

2D-Experimenten (COSY, TOCSY, HMBC) sind identisch. Aufgrund der hohen Ähnlichkeit

zwischen Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C gelang die Strukturaufklärung trotz

Identifizierung des atrop-Abyssomicin C in unserer Arbeitsgruppe nicht, bevor K.C. Nicolaou

Röntgenstruktur- und NMR-Daten veröffentlichte.

Einleitung

11

1.2.1 Die Screeningmethode

Die biologische Testierung war darauf ausgelegt, Inhibitoren der Biosynthese aromatischer

Aminosäuren und der p-Aminobenzoesäure zu finden. Es wurden 930 Extrakte von 201

Actinomyceten in einem zweistufigen Prozess getestet. Im ersten Schritt wurde ein

Hemmhoftest durchgeführt. Hierzu wurde Bacillus subtilis DSM 10 auf zwei verschiedenen

Agarplatten kultiviert. Für die erste Platte wurde Minimalmedium verwendet, für die zweite

Platte wurde dasselbe Minimalmedium mit L-Tryptophan (5 mM), L-Phenylalanin (5 mM),

L-Tyrosin (5 mM) und pABA (5 mM) supplementiert. Extrakte, die nur auf der ersten Platte

einen Hemmhof zeigten, nicht aber auf den supplementierten Platten, wurden einem zweiten

Test unterzogen, da bei diesen eine Hemmung einer der drei Biosynthesen zu erwarten war.

Im zweiten Schritt wurde ein Antagonismus-Test durchgeführt. Hierzu wurden zwei

Filterstreifen so auf eine Agarplatte gelegt, dass sie sich kreuzten. Einer der Filterstreifen

wurde mit dem antibiotischen Extrakt getränkt, der zweite Filterstreifen in einer Lösung des

vermuteten Antagonisten (Tyr + Phe, Trp, pABA). Die folgenden Kombinationen von

Antagonisten (jeweils 50 µl, Konzentration der einzelnen Komponenten = 5 mg/ml) wurden

verwendet: 1. Tyr + Trp + Phe + pABA (Kontrolle), 2. Tyr + Phe, 3. Trp, 4. pABA. Im Falle

eines vorliegenden Antagonismus wurde die Wachstumshemmung aufgehoben.

Im Falle des Extrakts aus dem Bakterienstamm Verrucosispora AB 18-032 wurde die

Aufhebung der Wachstumshemmung durch pABA beobachtet. Eine Zugabe von Tyr, Phe

oder Trp zeigte keinen antagonistischen Effekt. Dies ließ darauf schließen, dass ein Schritt in

der Biosynthese von pABA ausgehend von Chorismat inhibiert wurde.

1.2.2 Die Biosynthesen des Shikimat-Stoffwechselweges

Neben p-Aminobenzoesäure und den aromatischen Aminosäuren Tyrosin, Phenylalanin und

Tryptophan werden noch eine Reihe weiterer vorwiegend aromatischer Verbindungen wie

Ubichinon, Enterobactin und einige aromatische Sekundärmetabolite über den Shikimat-

Biosyntheseweg (Abbildung 1-10) gebildet. Shikimat wird bei Bakterien, Pilzen und Pflanzen

aus D-Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat synthetisiert und zu Chorismat

umgewandelt. Chorismat ist das letzte gemeinsame Zwischenprodukt der drei aromatischen

Aminosäuren und pABA. Fünf unterschiedliche Enzyme katalysieren die Reaktion von

Chorismat zu Prephenat, Anthranilat, Aminodesoxychorismat, Isochorismat und

p-Hydroxybenzoat (Dosselaere und Vanderleyden, 2001).

Einleitung

12

Chorismat

Biosynthese

Tryptophan

Ubichinon

Folat

TyrosinPhenylalanin

Shikimat

Enterobactin

Anthranilsäure

COOHO

COOH

NH2

COOHO

COOH

NH2

COOHO

COOH

OH

COOH

OH

OCOOH

COOH

NH2

COO H

OH

COO H

NH2

Pyruvat

Pyruvat

Pyruvat

p-Aminobenzoesäure

p-Hydroxybenzoesäure

Isochorismat

2-Amino-

2-desoxyisochorismat

COOH

OH

OH

2,3-Dihydroxybenzoesäure

4-Amino-4-desoxychorismat

Prephenat

NH3

NH3

NH3

NH3

H2O

H2O

H2O

H2O

Aminodesoxy-Chorismat-Synthase Aminodesoxy-

Chorismat-Lyase

ChorismatLyase

ChorismatMutase

AnthranilatSynthase

IsochorismatSynthase

COOHO

COOH

OH

Chorismat

Biosynthese

Tryptophan

Ubichinon

Folat

TyrosinPhenylalanin

Shikimat

Enterobactin

Anthranilsäure

COOHO

COOH

NH2

COO HO

COOH

NH2

COO HO

COOH

OH

COOH

OH

OCOO H

COO H

NH2

COO H

OH

COO H

NH2

Pyruvat

Pyruvat

Pyruvat

p-Aminobenzoesäure

p-Hydroxybenzoesäure

Isochorismat

2-Amino-

2-desoxyisochorismat

COOH

OH

OH

2,3-Dihydroxybenzoesäure

4-Amino-4-desoxychorismat

Prephenat

NH3

NH3

NH3

NH3

H2O

H2O

H2O

H2O

Aminodesoxy-Chorismat-Synthase Aminodesoxy-

Chorismat-Lyase

ChorismatLyase

ChorismatMutase

AnthranilatSynthase

IsochorismatSynthase

COOHO

COOH

OH

Abbildung 1-10. Biosynthesewege wichtiger Stoffwechselprodukte, die von Chorismat ausgehen.

Eine enge Verknüpfung besteht zwischen der Tryptophan- und der Folsäurebiosynthese.

Schon beim ersten Schritt, den Reaktionen der Anthranilat-Synthase und der

Aminodesoxychorismat-Synthase, besteht große Ähnlichkeit. In beiden Fällen wird

Chorismat mit Glutamin als Stickstoffquelle aminiert. Auch die Struktur der beiden Enzyme

ist ähnlich: Beide bestehen aus zwei nicht identischen Untereinheiten α und β, die zu

αβ-Dimeren assoziieren. Die kleinere β-Untereinheit ist eine Glutamin-Amidotransferase

(GATase), die die Amidgruppe von Glutamin zur größeren α-Untereinheit transferiert, die

diese auf Chorismat überträgt. Die größere α-Untereinheit kann auch ohne die β-Untereinheit

Chorismat aminieren, sofern NH3 zur Verfügung steht.

Die enge Verknüpfung der beiden Enzyme zeigt sich auch auf genetischer Ebene. Es wird

angenommen, dass die Gene der Enzyme durch Duplikation und divergente Entwicklung aus

einem gemeinsamen Vorläufer hervorgehen (Dosselaere und Vanderleyden, 2001).

Einleitung

13

1.3 Die p-Aminobenzoesäurebiosynthese

1.3.1 Das Folat-Operon von Bacillus subtilis

Während die Gene der p-Aminobenzoesäure-Synthese pabA, pabB und pabC bei E. coli ohne

Verbindung zueinander auf dem Chromosom liegen (Blattner et al., 1997), befinden sich

diese Gene bei B. subtilis in einem Operon (Slock et al., 1990). Das Folat-Operon von

B. subtilis (Abbildung 1-11) besteht aus neun Genen, von denen nur die ersten sechs an der

Folsäurebiosynthese beteiligt sind (Slock et al., 1990). Die 3’-Region des Operons enthält

drei zusätzliche ORFs: orf3, das vermutlich für ein DNA-bindendes Protein kodiert, orf4, das

zu orf1 des E. coli fis-Operons homolog ist und lysS, das für eine Lysyl-tRNA-Synthetase

codiert (de Saizieu et al., 1997).

Das Folat-Operon enthält zwei Promotoren, einer liegt vor dem ersten Gen pabB und der

zweite vor lysS. Bisher wurden vier mögliche Transkripte identifiziert, die die ersten zwei, die

ersten acht, alle neun bzw. das letzte Gen umfassen (de Saizieu et al., 1997).

pabB pabA pabC sul folKfolA lysSorf43

Lese-

rahmen

1412

2010

2891 3723 4085 4537 4746 5863

1426

2010

2873 37304082 4585

4752 5771

7362

pabB pabA pabC sul folKfolA lysSorf43

Lese-

rahmen

1412

2010

2891 3723 4085 4537 4746 5863

1426

2010

2873 37304082 4585

4752 5771

7362

Abbildung 1-11. Genorganisation des Folat-Operons. Die Richtung der Transkription ist von links nach rechts. Die kodierenden Sequenzen sind durch Pfeile gezeigt, die Zahlen bezeichnen die Position der ersten Base des Startcodons ATG und der letzten Base des Stoppcodons. Oberhalb des Folat-Operons sind die vier möglichen Transkripte eingezeichnet.

Die ersten drei Gene des Operons kodieren für Enzyme, die an der pABA-Synthese beteiligt

sind: pabB kodiert für die α-Untereinheit, pabA für die β-Untereinheit der

Aminodesoxychorismat-Synthase und pabC für die Aminodesoxychorismat-Pyruvat-Lyase.

Das Gen sul codiert für die Dihydropteroat-Synthase, folA für die Dihydroneopterin-Aldolase

und folK für die Pyrophosphokinase. Eine Übersicht über die Aufgabe dieser Enzyme in der

Folsäurebiosynthese samt der dazugehörigen Gene gibt Abbildung 1-12.

Einleitung

14

Dihydroneopterin

Dihydrofolat

Dihydropteroat

6-OH-7,8-Dihydropterin

6-OH-7,8-Dihydropterin-pyrophosphat

Chorismat + Glutamat

p-Aminobenzoesäure

Dihydroneopterin-Aldolase

Pyrophosphokinase

Dihydropteroat-

Synthase

Dihydrofolat-Synthase

folA

folK

sul

folC

AminodesoxychorismatSynthase

pabA

Aminodesoxychorismat

Lyase

pabC

pabB

Dihydroneopterin


6-OH-7,8-


p-Aminobenzoesäure

folA

folK

sul

folC

Aminodesoxychorismat-Synthase

pabA

Aminodesoxychorismat-

Lyase

pabC

pabB

Dihydroneopterin

Dihydrofolat

Dihydropteroat


6-OH-7,8-Dihydropterin-pyrophosphat


p-Aminobenzoesäure

Dihydroneopterin-Aldolase

Pyrophosphokinase

Dihydropteroat-

Synthase

Dihydrofolat-Synthase

folA

folK

sul

folC

AminodesoxychorismatSynthase

pabA

Aminodesoxychorismat

Lyase

pabC

pabB

Dihydroneopterin


6-OH-7,8-


p-Aminobenzoesäure

folA

folK

sul

folC

Aminodesoxychorismat-Synthase

pabA

Aminodesoxychorismat-

Lyase

pabC

pabB

Abbildung 1-12. Ausschnitt aus der Folsäurebiosynthese. Unter den Enzymen sind jeweils die codierenden Gene aufgeführt, dabei sind die Gene aus dem Folat-Operon von B. subtilis grau hinterlegt.

1.3.2 Die Enzyme der p-Aminobenzoesäuresynthese

Die Biosynthese von pABA aus Chorismat erfordert zwei Enzyme: Die

Aminodesoxychorismat-Synthase (PabB; Gen Accession No. P28820; E.C. 6.3.5.8 für die

ADC-Synthase bestehend aus PabA und PabB) mit der Glutamin-Amidotransferase (pabA;

Gen Accession No. P28819) für die Synthese von Aminodesoxychorismat sowie die

Aminodesoxychorismat-Lyase (pabC; Gen Accession No. P28821; E.C. 4.1.3.38) für die

Bildung von pABA (Huang und Gibson, 1970; Ye et al., 1990; Green und Nichols, 1991).

Wie in Abschnitt 1.2.2 erwähnt wurde, weist die Aminodesoxychorismat-Synthase große

Ähnlichkeit zur Anthranilat-Synthase auf. Bei B. subtilis, Acinetobacter calcoaceticus und

Pseudomonas acidovorans (Sawula und Crawford, 1972; Sawula und Crawford, 1973;

Buvinger et al., 1981; Kane et al., 1972; Kane, 1977) existiert für beide Enzyme eine

amphibolische GATase, d. h. es gibt nur eine GATase, die sowohl mit Anthranilat-Synthase

als auch mit Aminodesoxychorismat-Synthase assoziieren kann.

Bei B. subtilis liegt das Gen, das für die amphibole GATase kodiert, im Folat-Operon (Kane

et al., 1972) und wird entweder mit pabA oder trpG bezeichnet. Interessanterweise erfolgt die

Regulation der Expression auf Translationsebene über TRAP (Tryptophan-RNA-Binding

Einleitung

15

Attenuation Protein), das auch die Transkription des trp-Operon reguliert. TRAP wird durch

L-Tryptophan aktiviert, das somit nicht nur seine eigene Biosynthese beeinflusst, sondern

auch die der p-Aminobenzoesäure (de Saizieu et al., 1997).

1.3.2.1 Die Glutamin-Amidotransferase (PabA)

Es gibt zwei Klassen von Glutamin-Amidotransferasen, die Ntn-Amidotransferasen und die

Triade-Amidotransferasen. Die Ntn-Amidotransferasen tragen als N-terminales Nucleophil

(Ntn) ein Cystein, während die Triade-Amidotransferasen eine katalytische Triade aus

Cystein, Histidin und Glutamat tragen. Einer älteren Nomenklatur folgend werden die Ntn-

Amidotransferasen als F-Typ und die Triade-Amidotransferasen als G-Typ bezeichnet. Dies

geht auf die E. coli-Gene purF, das für die Glutamin PRPP-Amidotransferase kodiert und

trpG, das für die Amidotransferase der Anthranilat-Synthase kodiert, zurück (Zalkin und

Smith, 1998).

Die etwa 20 kDa große GATase der Aminodesoxychorismat-Synthase (PabA) gehört zum

Typ der Triade-Amidotransferasen. Die katalytische Triade (Abbildung 1-13) besteht aus Cys,

His und Glu und ist vergleichbar mit der katalytischen Triade der Cysteinprotease Papain. Die

Cysteinseitenkette fungiert als Nucleophil, das am Glutamin angreift, der Histidinrest wirkt

als Protonendonor bei der Hydrolysereaktion, und der Glutamatrest stabilisiert das protonierte

Histidin (Zalkin und Smith, 1998).

NH

CHC

CH2

O

S

NH

CHC

H2C

O

N

NH

N

H

H

NH2

CH

C

H2C

OH

O

H2CCH2N

O

NH

CH

C

H2C

O

H2CCO

O

Cys

His

Glu

Abbildung 1-13. Die katalytische Triade von Glutamin-Amidotransferasen. Der Cysteinrest greift nucleophil am Glutamin an, der Histidinrest wirkt als Protonendonor bei der Hydrolysereaktion, und der Glutamatrest stabilisiert das protonierte Histidin.

Einleitung

16

Die GATase PabA ist nicht funktionsfähig, wenn sie nicht in einem – wenngleich schwachen

– 1:1-Komplex mit der α-Untereinheit der Aminodesoxychorismat-Synthase (PabB) assoziiert

vorliegt (Roux und Walsh, 1992; Viswanathan et al., 1995). PabB induziert vermutlich eine

Konformationsänderung bei PabA, die zur Aktivierung führt.

1.3.2.2 Die Aminodesoxychorismat-Synthase (PabB)

Während die β-Untereinheit der Aminodesoxychorismat-Synthase, die GATase PabA nur im

1:1-Komplex mit der α-Untereinheit PabB aktiv ist, kann PabB Chorismat auch ohne PabA

aminieren, sofern NH3 zur Verfügung steht, wenngleich dann die Umsatzrate geringer ist

(Dosselaere und Vanderleyden, 2001).

Die etwa 50 kDa große β-Untereinheit der ADC-Synthase katalysiert eine Mg2+-abhängige

Reaktion, die der Anthranilat-Synthase vermittelten Reaktion sehr ähnlich ist. In beiden

Fällen wird Chorismat aminiert, im ersten Fall zu 4-Amino-4-desoxychorismat (ADC), im

zweiten zu 2-Amino-2-desoxyisochorismat, die sich nur in der Position der Aminogruppe

unterscheiden. Dennoch verläuft die Reaktion der ADC-Synthase vermutlich nach einem

signifikant anderen Mechanismus unter Retention sowohl der Position als auch der

Stereochemie. Kozlowski et al. (1995) schlagen für das E. coli Enzym eine sequenzielle

1,3-Substitution vor, bei dem der nucleophile Angriff zunächst durch eine Lysinseitenkette an

C-2 erfolgt, dabei die Hydroxygruppe an C-4 abgespalten und dann eine Aminogruppe auf

C-4 übertragen wird (Abbildung 1-14).

COO

O

OH

COO

COO

O COO

Nu NuCOO

O

NH3

COO

Chorismat 4-Amino-4-desoxychorismat

NH3

EnzEnz

Abbildung 1-14. Möglicher Mechanismus von PabB nach Kozlowski et al. Die Reaktion verläuft über eine sequenzielle 1,3-Substitution unter Retention der Position und der Stereochemie. Der nucleophile Angriff erfolgt durch eine Aminosäure des Enzyms, begleitet von einer Dehydratisierung und dem nucleophilen Angriff von NH3.

Neuere Forschungsergebnisse der Gruppen von Chris Abell (Cambridge, UK) und Michael

Toney (Davis, Californien, USA) stützen und vertiefen die in Abbildung 1-14 dargestellte

Hypothese. He et al. (2004) konnten zeigen, dass eine Mutation von 274Lys zu Ala zu einem

Einleitung

17

etwa um das 250-fache reduzierten kcat für den Umsatz von Chorismat zu

Aminodesoxychorismat führt. 2006 konnten He und Toney, und zeitgleich auch Bulloch und

Abell (2006) durch ESI-MS direkt nachweisen, dass ein kovalentes Intermediat bei der

ADC-Synthase-Reaktion gebildet wird. Parsons et al. veröffentlichten 2002 eine

Kristallstruktur von PabB, die in Abbildung 1-15 gezeigt ist.

Abbildung 1-15. Bändermodell von PabB aus E. coli. Die Kristalle wurden in Ameisensäure gezüchtet. Im Kalottenmodell dargestellt sind ein Molekül Ameisensäure und ein Molekül Tryptophan, das möglicherweise stabilisierende Funktion besitzt (Quelle: Parsons et al., 2002).

In Abbildung 1-16 ist eine Überlagerung der aktiven Zentren der Kristallstrukturen von ADC-

Synthase und Anthranilatsynthase dargestellt. Grundlage des abgebildeten Modells mit

Chorismat ist die Kristallstruktur der Anthranilatsynthase mit Benzoat und Pyruvat, in die

Chorismat hineinmodeliert wurde. Anschließend wurde die Kristallstruktur der

ADC-Synthase überlagert und über least squares gefittet. Vergleicht man die Sequenzen von

E. coli und B. subtilis (Abbildung 1-17), so stellt man fest, dass das aktive Zentrum fast

vollständig konserviert ist. Einzige Ausnahme ist der wichtigste Rest der E. coli

ADC-Synthase, Lys-274, das kovalent an Chorismat bindet. An dieser Stelle steht bei B.

subtilis ein Alaninrest. Die ADC-vermittelte Katalyse bei B. subtilis wird also etwas anders

ablaufen als bei E. coli.

Einleitung

18

Abbildung 1-16: Überlagerung der Kristallstrukturen der ADC-Synthase (grau) und der Anthranilatsynthase (rosa) von E. coli. Das grüne Atom bezeichnet Magnesium, die Zahlen beziehen sich auf die ADC-Synthase. (Quelle: He et al, 2004)

B.s. : 219 FQVNLSIRQSQSLSVHPYQIYKTLREVNPSPYMAYLETPDFQIICGSPELLVSKKGKLLE 278

+QVNL+ R + S +Q + L + N +P+ A+L I+ SPE + ++

E.c. : 210 YQVNLAQRFHATYSGDEWQAFLQLNQANRAPFSAFLRLEQGAILSLSPERFILCDNSEIQ 269

B.s.: 279 TRPIAGTRSRGKTNEEDEALANELIHNEKERAEHVMLVDLERNDLGRVSRYGSVRVNEFM 338

TRPI GT R +ED A +L ++ K+RAE++M+VDL RND+GRV+ GSV+V E

E.c.: 270 TRPIKGTLPRLPDPQEDSKQAVKLANSAKDRAENLMIVDLMRNDIGRVAVAGSVKVPELF 329

B.s.: 339 AIEKYSHVMHIVSNVQGELQDGYDAVDIIHAVFPGGTITGAPKVRTMEIIEELEPTRRGL 398

+E + V H+VS + +L + A D++ A FPGG+ITGAPKVR MEII+ELEP RR

E.c.: 330 VVEPFPAVHHLVSTITAQLPEQLHASDLLRAAFPGGSITGAPKVRAMEIIDELEPQRRNA 389

B.s.: 399 YTGSIGWFGYNHDLQFNIVIRTIYATGGQAFMQSGAGVVIDSVPKHEYKESFKKAFAMQR 458

+ GSIG+ + ++ +I IRT+ A GQ F +G G+V DS + EY+E+F K + +

E.c.: 390 WCGSIGYLSFCGNMDTSITIRTLTAINGQIFCSAGGGIVADSQEEAEYQETFDKVNRILK 449

B.s.: 459 ALE 461

LE

E.c.: 450 QLE 452

x = übereinstimmende Reste der active site x = ähnlich der active site x = sich unterscheidende Reste der active site

x = 263Cys B. subtilis

Abbildung 1-17: Ausschnitt aus dem Alignment der PabB Sequenz von B. subtilis und E. coli.

Einleitung

19

1.3.2.3 Aminodesoxychorismat-Lyase (PabC)

Lange Zeit nahm man an, dass die ADC-Synthase das einzige Enzym der pABA-Biosynthese

wäre. Entsprechend nannte man den Komplex aus PabA und PabB ursprünglich

p-Aminobenzoatsynthase. Im Gegensatz zur Anthranilat-Synthase, die tatsächlich das

Zwischenprodukt 2-Amino-2-desoxyisochorismat unter Abspaltung von Pyruvat zu

o-Aminobenzoesäure aromatisiert, ist zur Biosynthese von p-Aminobenzoesäure noch ein

weiteres Enzym notwendig (Nichols et al., 1989). Ye und Mitarbeitern gelang es 1990,

„Enzym X als Aminodesoxychorismat-Lyase“ aufzureinigen und zu charakterisieren. Slock et

al. stellten 1990 die Vermutung auf, dass das im Folat-Operon von B. subtilis gefundene Gen

pabC ein dem Enzym X analoges Enzym kodiert, was durch Green et al. 1991 bestätigt

wurde, die in E. coli das entsprechende Gen pabC identifizierten. Im Jahr 2000

veröffentlichten Nakai et al. eine Kristallstruktur der ADC-Lyase von E. coli (s. Abbildung

1-18).

Abbildung 1-18. Bändermodell des PabC-Homodimers mit dem Cofaktor PLP. Eine der Untereinheiten ist in grau dargestellt, die große und kleine Domäne der anderen Untereinheit sind in weiß bzw. schwarz abgebildet (Quelle: Nakai et al., 2000).

Einleitung

20

Die etwa 30 kDa große Aminodesoxychorismat-Lyase ähnelt in ihrer Struktur und in der

Stereospezifität der Wasserstoffabstraktion stark der D-Aminosäure-Aminotransferase und der

verzweigtkettigen-L-Aminosäure-Aminotransferase. Alle drei Enzyme gehören zum Typ IV

der PLP-Enzyme, die entsprechend ihrer Sequenz und Sekundärstruktur in fünf Gruppen

eingeteilt werden. Im Gegensatz zur D-Aminosäure-Aminotransferase und zur

Verzweigtkettige-L-Aminosäure-Aminotransferase wird die ADC-Lyase mechanistisch als

αβ-Lyase klassifiziert.

Die ADC-Lyase katalysiert die Aromatisierung von 4-Amino-4-desoxychorismat zu

p-Aminobenzoesäure unter Abspaltung von Pyruvat. Das Enzym liegt als Homodimer vor

(Green et al., 1992; Nakai et al., 2000) und benötigt als Coenzym Pyridoxal-5’-phosphat

(PLP) (Green et al., 1992). Nach einem von Nakai et al. (2000) vorgeschlagenen

Mechanismus bildet Aminodesoxychorismat eine Schiff-Base mit PLP, wodurch ein

katalytisch aktives Lysin frei wird, das eine Wasserstoffbrücke mit einem Threoninrest

ausbildet. Die basische Aminoseitenkette des Lysins eliminiert ein Proton des ADC, wodurch

ein chinoides Zwischenprodukt entsteht. Aus diesem wird Pyruvat abgespalten, dabei wird ein

Proton von Threonin auf den olefinischen Teil des 4-Amino-4-desoxchorismat-Intermediat

übertragen (Abbildung 1-19).

Einleitung

21

NH

OPO3

O

HN

Lys

COO

O

NH2

OOC

NH

OPO3

O

Lys

COO

O

HN

OOC

NH2OH

Thr

H

NH

OPO3

O

Lys

COO

HN

NH2O

Thr

HH

O

CH3

O

O

NH

OPO3

O

HN

Lys

NH2

PLP

PLP

O

OOC

PLP

PLP

COO

NH2

COO

pABA

ADC

Abbildung 1-19. Mechanismus von PabC nach Nakai et al. (2000). Aminodesoxychorismat bildet eine Schiff-Base mit PLP, wodurch ein katalytisch aktives Lysin frei wird, das eine Wasserstoffbrücke mit einem Threoninrest ausbildet. Die basische Aminogruppe des Lysins eliminiert ein Proton des ADC, wodurch ein chinoides PLP-Zwischenprodukt entsteht. Nun kann nach Rearomatisierung des Cofaktors Pyruvat abgespalten werden, wobei ein Proton von Threonin auf den olefinischen Teil des 4-Amino-4-desoxychorismat-Intermediats übertragen wird.

1.3.3 Abyssomicin C und die p-Aminobenzoesäurebiosynthese

In den vorhergehenden Abschnitten wurde beschrieben, wie die zweistufige Biosynthese der

p-Aminobenzoesäure abläuft. Nun stellt sich die Frage, in welcher Weise Abyssomicin C in

die Biosynthese eingreifen kann. Erste Hinweise auf den Wirkmechanismus ergeben sich aus

dem Vergleich des Abyssomicin C mit Chorismat.

In wässriger Lösung liegt Chorismat zu 80 – 90 % in pseudo-diäquatorialer (Abbildung 1-20,

1) und zu 10 – 20 % in pseudo-diaxialer Konformation (Abbildung 1-20, 2) vor (Copley und

Knowles, 1987). Das Oxabicyclooctan-System von Abyssomicin C (Abbildung 1-20, 3) zeigt

große Ähnlichkeit zur pseudo-diaxialen Konformation des Chorismats. Bei der von der

Einleitung

22

Chorismat-Mutase vermittelten Reaktion von Chorismat zu Prephenat, die umfassend

untersucht wurde, liegt Chorismat im Übergangszustand in der diaxialen Konformation vor

(Copley und Knowles, 1985; Hur und Bruice, 2003 a / 2003 b; Marti et al., 2003; Ranaghan

et al., 2004). Die Reaktionen sowohl der Aminodesoxychorismat-Synthase als auch der

Aminodesoxychorismat-Lyase wurden bei weitem nicht so detailliert untersucht wie die der

Chorismat-Mutase, dennoch liegt die Vermutung nahe, es könnte sich bei Abyssomicin C um

ein Mimetikum des Übergangszustands handeln (Abbildung 1-20). Desweiteren wurde die

Hypothese aufgestellt, dass das Michaelsystem C(7)-C(9) eine Rolle bei der antibiotischen

Aktivität von Abyssomicin C spielen (Abbildung 1-21). Diese Hypothese zu überprüfen war

Teil der vorliegenden Arbeit.

OH

COOHO

COOH

OH

COOH

O

HOOC

pseudo-diäquatorial pseudo-diaxial

80 - 90 % 10 - 20 %

Abyssomicin CChorismat

H3C CH3

O O

OO

O

CH3

OH

Abbildung 1-20. Pseudo-diäquatoriale und pseudo-diaxiale Konformation von Chorismat in wässriger Lösung im Vergleich zur Struktur von Abyssomicin C.

H3CCH3

O

HO

OO

O

CH3

HO

CysS

H3C CH3

O O

OO

O

CH3

HO

CysS

H3C CH3

O O

OO

O

CH3

HO

a b

9

8

7

Abbildung 1-21. Zwei denkbare Möglichkeiten der Michael-Addition eines Nucleophils an Abyssomicin C.

Einleitung

23

1.4 Polyketidsynthese

Polyketide sind eine Gruppe von Naturstoffen, die eine bemerkenswerte strukturelle

Diversität aufweisen. Auch ihre Herkunft ist geprägt von Vielfalt: produziert werden sie von

so unterschiedlichen Organismen wie Bakterien, Pflanzen und Pilzen. Das breite

Wirkspektrum, das von Antibiotika über antifungale und antiparasitische bis hin zur

antitumoralen Wirkung reicht, macht Polyketide zu pharmakologisch interessanten

Verbindungen. Klinisch relevante Polyketide sind beispielsweise Tetracycline, Erythromycin,

Rapamycin und Lovastatin.

Die Biosynthese der Polyketide erfolgt – katalysiert von Polyketidsynthasen (PKS) – durch

schrittweise Addition von Bausteinen, die in der Regel zwei, drei oder vier

Kohlenstoffatomen bestehen, wie Acetyl-CoA (als Malonyl-CoA), Propionyl-CoA (als

Methylmalonyl-CoA) und Butyryl-CoA (als Ethylmalonyl-CoA). Die Polyketidsynthese

ähnelt stark der Fettsäurebiosynthese, unterscheidet sich jedoch dahingehend, dass die bei der

Fettsäurebiosynthese immer stattfindende Abfolge von Ketoreduktion, Dehydratisierung und

Enoylreduktion bei der Polyketidsynthese variabel gestaltet ist, sodass entweder alle, einige

oder keine dieser Modifikationen an der Ketogruppe stattfinden, woraus sich eine große

strukturelle Vielfalt ergibt (Staunton, J. und Weissman, K.J., 2001).

Polyketidsynthasen werden historisch gesehen in drei Typen eingeteilt, es hat sich jedoch

gezeigt, dass das Feld der Polyketidsynthese weitaus komplexer ist, und die Grenzen

zwischen den drei Typen fließend sind (Shen, 2003). Nichtsdestotrotz sollen hier die PKS

Typen I, II und III kurz vorgestellt werden, da sie ein für diese Arbeit hinreichendes

Modellsystem darstellen.

PKS I sind multifunktionelle Enzyme, die in Modulen organisiert sind, wobei jedes Modul für

einen Cyclus der Kettenverlängerung zuständig ist. Hingegen sind PKS II

Multienzymkomplexe, die aus einem einzigen Set von iterativ wirkenden Enzymaktivitäten

bestehen, und deren Produkte meist aromatische Polyketide sind. Sowohl Typ I als auch Typ

II verwenden Acylcarrierprotein (ACP), das eine Phosphopantetheingruppe besitzt, um die

Acyl-CoA-Substrate zu aktivieren und die wachsende Polyketidkette zu binden. Typ III PKS

hingegen benötigen kein ACP sondern wirken direkt auf die CoA-Substrate. Typ III PKS

werden oft auch als Chalcone-Synthase-like PKS bezeichnet, und wirken als iterativ

arbeitende Homodimere (Staunton, J. und Weissman, K.J., 2001).

Einleitung

24

1.4.1 Polyketidsynthasen vom Typ I

Für diese Arbeit relevant ist der PKS-Typ I, daher soll er im Folgenden näher beschrieben

werden. Wie bereits erwähnt, sind PKS I modular aufgebaut. Jedes Modul ist für einen

Kettenverlängerungsschritt zuständig. Vom N- zum C-Terminus sind die Module

folgendermaßen angeordnet: Start- oder Lademodul, Elongationsmodule und das

Terminierungsmodul. Jedes Modul besteht wiederum aus Domänen. Jeder Domäne lässt sich

eine bestimmte Funktion zuordnen: Acyltransferase (AT), Acyl Carrier Protein (ACP),

Ketosynthase (KS), Ketoreduktase (KR), Dehydratase (DH), Enoylreduktase (ER),

Thioesterase (TE). Das Start- oder Lademodul besteht aus den Domänen AT und ACP, das

Terminierungsmodul aus TE. Die dazwischen liegenden Elongationsmodule müssen über die

Mindestausstattung von KS, AT und ACP verfügen, um eine Kettenverlängerung zu

ermöglichen. Optional können noch DH, ER und KR enthalten sein. Die Reihenfolge vom N-

zum C-Terminus lautet dabei: KS-AT-[DH-ER-KR]-ACP. An dieser Stelle sei darauf

hingewiesen, dass die Modifikationen der Ketogruppe immer das im vorhergehenden

Kettenverlängerungsschritt angefügte Glied betreffen. Als Modellsystem für

Polyketidsynthasen des Typ I gilt die Erythromycin Polyketidsynthase, deren Aufbau

systematisch in Abbildung 1-22 dargestellt ist. Den drei Genen eryAI, eryAII und eryAIII

entsprechen die drei Proteine DEBS1, DEBS2 und DEBS3, die jeweils drei Modulen (load,

Module 1-6 und end) enthalten. Die Module selbst bestehen aus Domänen, die hier als Kreise

dargestellt sind.

Einleitung

25

O O

OH

O

OH

OH

eryAI eryAII eryAIII

DEBS 1 DEBS 2 DEBS 3

S S SS S S

load

Modul 1 Modul 3Modul 4Modul 2

Modul5Modul 6

end

ATACP KS ATKR

ACPKS ATKR

ACP KS AT ACP KS ATKR

ACP TEKS AT ACP

KRKS AT

DH

ACP

ERKR

S

O

OH

OH

O

O

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OH

O

OH

O

O

O

OH

OH

O O

OH

O

OH

OH

eryAI eryAII eryAIII

DEBS 1 DEBS 2 DEBS 3

S S SS S S

load

Modul 1 Modul 3Modul 4Modul 2

Modul5Modul 6

end

ATACP KS ATKR

ACPKS ATKR

ACP KS AT ACP KS ATKR

ACP TEKS AT ACP

KRKS AT

DH

ACP

ERKR

S

O

OH

OH

O

O

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OH

O

OH

O

O

O

OH

OH

Abbildung 1-22: Schematische Darstellung der Erythromycin Polyketidsynthese durch DEBS1 – DEBS3.

1.4.2 Der Synthesemechanismus

Die Polyketidsynthese beginnt mit der Übertragung einer Acylgruppe vom N-terminal

liegenden ACP auf einen Cysteinrest der Ketosynthase. Dann wird die C-terminal liegende an

ACP gebundene aktivierte Acylgruppe (Malonyl-S-ACP im Falle von Acetat) decarboxyliert,

wodurch ein Carbanion-Intermediat entsteht. Dieses fungiert als Nucleophil bei der

anschließenden Claisenkondensation. Dadurch wird die Kette verlängert und zugleich auf das

nächste C-terminal liegende ACP übertragen (Keating und Walsh, 1999). Eventuell

vorhandenen zusätzliche Domänen können noch die Ketogruppe zum Alkohol reduzieren

(Ketoreduktase, KR), eine Dehydratase (DH) kann dann unter Ausbildung einer

Doppelbindung Wasser abspalten, die schließlich zum Alkan reduziert werden kann.

Ist das letzte Modul erreicht, so wird es durch die Thioesterase-Domäne freigesetzt. Zwei

prinzipielle Möglichkeiten können dabei unterschieden werden: Intermolekulare Hydrolyse

setzt das (lineare) Molekül frei, während ein intramolekularer nucleophiler Angriff

beispielsweise durch Hydroxy- oder Aminogruppen zur Zyclisierung zum Makrolakton bzw.

Makrolactam führt (Cane und Walsh, 1999).

Einleitung

26

ACP KS AT ACP

S SHS

ACP KS AT ACP

SH SS

ACP KS AT ACP

SH SHS

R

O

R

O

O

OO

O

R

O O

ACP KS AT ACP

S SHS

ACP KS AT ACP

SH SS

ACP KS AT ACP

SH SHS

R

O

R

O

O

OO

O

R

O O

Abbildung 1-23: Kettenverlängerung bei Polyketidsynthasen. Die wachsende Kette wird von der ACP-Domäne (links) auf eine konservierte Cysteinseitenkette der KS-Domäne übertragen. Die Kettenverlängerung geschieht durch Decarboxylierung eines Malonyl- (im Falle von Propionat Methylmalonyl-) Thioesters an der nächsten ACP-Domäne (rechts). Das dabei entstehende Carbanion greift nucleophil die auf der KS befindliche Kette an. Dadurch erfolgt eine Translokation und Elongation der Polyketidkette. (Nach Keating und Walsh, 1999)

1.4.3 Die Biosynthese von Chlorothricin

Chlorotricin ist wie Abyssomicin ein Spirotetronat-Antibiotikum. Neben dem Chlorothricin-

Aglykon besitzt Chlorothricin zusätzliche Modifikationen mit zwei D-Olivosereste und

2-Methoxy-5-chloro-6-methylsalicylsäure. Interessant im Hinblick auf die Abyssomicin-

Biosynthese ist die Synthese des Aglykons, die von Jia et al 2006 beschrieben wurde.

Chlorothricin leitet sich von einer Polyketidkette ab, die aus 10 Acetatresten und 2

Propionatresten aufgebaut ist. Die noch verbleibenden drei Kohlenstoffe stammen vermutlich

aus einem Enoylpyruvat-Derivat. Vier Geneprodukte, ChlD1, ChlD2, ChlD3 und ChlD4 sind

an der Synthese dieses Enoylpyruvat-Derivats aus einer Zwischenstufe der Glykolyse beteiligt

(Abbildung 1-24).

Einleitung

27

O

H

HO

H

HO

H

HOHH

OH

OHO

OH

HO

O

OH

SACP

SACP

Glykolyse

ChlD1,ChlD2 ChlD3 ChlD4

Abbildung 1-24: Synthese des C3-Bausteins der Tetronsäureeinheit aus einem Glykolyseintermediat durch die Proteine ChlD1, ChlD2, ChlD3 und ChlD4.

ChlD1, ein dem FkbH ähnliches Protein, transferiert vermutliche das Glykolyseintermediat

auf das ACP Protein ChlD2. ChlD3, eine putative Dehydrogenase, katalysiert wahrscheinlich

die 2,3-Dehydrierung, wodurch Enoylpyruvoyl-S-ACP entsteht. Dieses wird vermutlich von

der putativen Acyltransferase ChlD4 vermittelt in das Chlorothricin-Aglykon eingebaut.

Die Synthese des Aglykons wird von einer Typ I Polyketidsynthase vermittelt, die aus einem

Lademodul und elf Kettenverlängerungsmodulen besteht (Abbildung 1-25). Jedes der Module

besteht zumindest aus den drei Domänen KS, AT, und ACP, die den passenden Baustein für

die Kettenverlängerung auswählen, aktivieren und an die wachsende Polyketidkette anfügen.

Einige der Module besitzen zusätzlich noch Domänen wie DH, ER und KR, die reduktive

Modifikationen durchführen.

Im Hinblick auf die Biosynthese des Chlorothricins schlagen Jia et al vor, dass das

Transdecalinsystem enantioselektiv durch eine [4+2]-Diels-Alder-Reaktion entsteht, indem

das C-4-C-5 Dienophil an das C-10-C-13 Dien addiert (Abbildung 1-25). Die Polyketidkette

wird dann unter Ausbildung des Tetronsäure-Fünfrings freigesetzt, wobei die Acyltransferase

ChlD4, die Enoylpyruvat-ACP übertragt, wohl beteiligt ist und die Hydroxygruppe des

Enoylpyruvats als Nucleophil dient. Eine zweite intramolekulare [4+2] Diels-Alder Reaktion

zwischen dem C-2’-C-3’ Dienophil (aus der Enoylpyruvateinheit) und dem C-20-C-23 Dien

führt zur Zyklisierung. Anschließend findet die Oxidation der C-20 Methylgruppe zur

Carbonsäure, die Glykosylierung mit zwei D-Olivoseresten und die Übertragung der

modifizierten Methylsalicylsäure statt (Abbildung 1-25).

Einleitung

28

Abbildung 1-25: Biosyntheseweg des Chlorothricins nach Jia et al, 2006.

Grundlagen

29

2 Grundlagen

2.1 Chromatographie und Massenspektrometrie

2.1.1 Elektrospray-Ionisierung (ESI)

Bei der Elektrospray Ionisation werden unter Atmosphärendruck Ionen erzeugt. Dies

geschieht durch die an der Ionisierungsquelle angelegte Hochspannung (2-6 kV), die zur

Ausbildung eines elektrischen Feldes zwischen der Kapillare und einer Gegenelektrode führt.

In der Analytlösung vorhandene Ionen bewegen sich aufgrund ihrer Ladung auf die

Gegenelektrode zu. Dabei bildet sich an der Spitze der Kapillare ein Überschuss gleichartig

geladener Ionen, die sich gegenseitig abstoßen und einen Taylor-Cone formen, bis sie

schließlich in Form feiner Tropfen die Kapillare verlassen.

Abbildung 2-1: Schematische Darstellung des ESI-Prozesses. Quelle: Lottspeich, F. und Zorbas, H., 1998.

Grundlagen

30

Häufig wird unterstützend ein neutrales Trägergas wie Stickstoff eingesetzt, das die

Vernebelung der Lösung und die Verdampfung des Lösungsmittels fördert. So verkleinert

sich die Tropfengröße, wobei zugleich die Dichte der Ladungen auf der Tropfenoberfläche

zunimmt. Wegen der Abstoßung gleichartiger Ladungen zerplatzen die Tropfen, sobald sie

eine kritische Größer erreicht haben (Rayleigh-Limit) durch Coulomb-Explosion in kleinere

Tröpfchen. Dieser Prozess wiederholt sich, bis aus den verbleibenden Tröpfchen freie Ionen

gebildet werden. Für diesen Prozess herrschen zwei Modelsysteme vor, das Charge Residue

Model (CRM) und das Ion Evaporation Model (IEM). Nach dem CRM finden so lange

Coulomb-Explosion und Verkleinerung der Tröpfchen statt, bis nur noch ein einziges

ionisiertes Analytmolekül übrig bleibt, das durch Verdampfen des restlichen Lösungsmittel

freigesetzt wird. Das IEM hingegen geht davon aus, dass die Freisetzung von Ionen in die

Gasphase bereits auf der Stufe größerer geladener Tropfen stattfindet. Durch Elektrospray-

Ionisierung war erstmals die massenspektrometrische Erfassung großer Biomolekülen

möglich, was 2002 mit der Verleihung des Nobelpreises an Fenn gewürdigt wurde.

2.1.2 Der Triple Quadrupol Analysator

Die Funktionsweise eines Quadrupols beruht auf der Anordnung von vier parallelen

Elektrodenstäben in einem quadratischen Querschnitt, an die Wechsel- und Gleichspannungen

angelegt werden. Gegenüberliegende Stäbe (A und C, B und D) haben sowohl die gleiche

Polarität der Gleichspannung als auch die gleiche Phase der Wechselspannung. Die

Ionentrennung erfolgt durch Ablenkung mittels elektrischer Felder. Das Prinzip des

Quadrupols lässt sich am besten verstehen, wenn man zunächst nur die zwei

gegenüberliegenden Stäbe A und C betrachtet. Wird an diese Stäbe eine Wechselspannung

gelegt, so bauen sich abwechsend positive und negative Felder relativ zur Mittelachse auf.

Positive Ionen, die sich in paralleler Richtung durch das Stabsystem bewegen, werden im

positiven Feld des Stabes zur Mittelachse und im negativen Feld zum am nächsten liegenden

Stab beschleunigt. Wie weit ein Ion von seiner geradlinigen Bahn seitlich abgelenkt wird,

hängt einerseits von der angelegten Spannung und der Frequenz und andererseits vom m/z–

Verhältnis ab. In der Regel wird bei Quadrupol-Analysatoren die Wechselspannung mit einer

positiven Gleichspannung überlagert. Diese bewirkt, aufgrund der Abstoßung gleichnamiger

Ladungen, eine generelle Ablenkung zur Mittelachse hin. Bei Ionen mit hohem m/z überwiegt

der Einfluss der Gleichspannung: Sie werden zur Mittelachse hin abgelenkt, und können das

Stabsystem passieren. Ionen mit niedrigem m/z hingegen schwingen so stark aus, dass sie auf

die Stäbe treffen und entladen werden.

Grundlagen

31

Nun sollen auch die beiden verbleibenden Stäbe B und D betrachtet werden. Hier wird eine

um π verschobene Wechselspannung und eine negative Gleichspannung angelegt. Durch die

negative Gleichspannung werden die positiv geladenen Ionen generell zu den Stäben B und D

hin abgelenkt. Wieder überwiegt bei Ionen mit hohem m/z der Einfluss der Gleichspannung,

sodass diese zu den Stäben B und D abgelenkt und entladen werden. Bei Ionen mit niedrigen

m/z reicht das positive Feld der Wechselspannung aus, sie in die Mitte des Stabsystems zu

bringen. Somit selektieren die Stäbe A und C niedrige m/z heraus, während B und D hohe m/z

ausfiltern. Durch geeignete Abstimmung der Gleich- und Wechselspannungen erreicht man,

dass jeweils nur Ionen eines m/z das Stabsystem durchfliegen können (Budzikiewicz und

Schäfer, 2005).

Der Triple-Quadrupol-Analysator besteht aus vier in Reihe geschalteten Quadrupolen, Q0,

Q1, Q2 und Q3. Die Quadrupole Q1 und Q3 werden als Messquadrupole bezeichnet, und

wenden das eben beschriebene Prinzip der Kombination von Gleich- und Wechselspannung

zur Selektion von Ionen eines bestimmten m/z-Verhältnisses und zum Durchscannen eines

bestimmten Massenbereichs an, indem sukzessive durch wechselnde Kombinationen aus

unterschiedlichen Gleich- und Wechselspannungen die Stabilitätsbedingungen für die Ionen

des Messbereichs verändert werden. Quadrupole können aber auch im

Totaltransmissionsmodus eingesetzt werden, d.h. es liegt nur eine Wechselspannung an (RF

only) und alle Ionen gelangen durch den Quadrupol. Dieses Prinzip kommt bei Q0 immer, bei

Q1, Q2 und Q3 im Bedarfsfall zum Einsatz. Q2 wird auch als Kollisionszelle bezeichnet, und

neben der Transmission aller Ionen (RF only) ist in diesen Quadrupol auch die

Fragmentierung von Ionen möglich. Aus der Kombination verschiedener Modi der drei

Quadrupole Q1, Q2 und Q3 ergibt sich die experimentelle Bandbreite des Triple-Quadrupo-

Analysators: Beim Full Scan wird entweder im Q1 ein Massenbereich gescannt, während Q2

und Q3 auf den Totaltransmissionsmodus eingestellt sind (Q1 Scan), oder im Q3 ein

Massenbereich gescannt, während Q1 und Q2 im Totaltransmissionsmodus sind (Q3 Scan).

Beim Produktionenscan (Product Ion Scan) wird in Q1 das Mutterion selektiert, in Q2

fragmentiert und in Q3 die Fragmente ausgescannt. Beim Vorläuferionenscan (Precursor Ion

Scan) wird in Q1 ein Massenbereich gescannt, in Q2 fragmentiert, während in Q3 ein

spezifisches Ion selektiert wird, das ein charakteristisches geladenes Fragment des Mutterions

darstellt. Ähnlich ist der Neutralverlustscan (Neutral Loss Scan). Hier wird wieder in Q1 ein

Massenbereich gescannt und in Q2 fragmentiert, in Q3 jedoch wird nun jedoch gescannt, um

Fragmente zu finden, die um die Masse eines bestimmten Neutralteilchens leichter sind.

Wichtig für Quantifizierungsexperimente ist das Multiple Reaction Monitoring (MRM). Hier

Grundlagen

32

wird in Q1 auf ein spezifisches m/z selektiert, in Q2 erfolgt die Fragmentierung dieses Ions,

und in Q3 wird das m/z eines spezifisches Fragment gefiltert. Dadurch kombiniert dieses

Experiment hohe Selektivität mit hoher Empfindlichkeit.

2.1.3 Applied Biosystems/MDS Sciex QTrap 2000

Bei dem hauptsächlich für diese Arbeit verwendeten Massenspektrometer handelt es sich um

eine QTrap 2000 von Applied Biosystems/MDS Sciex. Die Ionisierung erfolgt bei diesem

Gerät über eine TurboIon-Quelle, die eine spezielle Form der Elektrospray-Ionisation darstellt

und in Abbildung 2-2 schematisch dargestellt ist.

Abbildung 2-2: Schematische Abbildung der TurboIon Quelle der QTrap 2000. Quelle: W.M.A. Niessen, 1999.

Von der Spraykapillare gelangen die Ionen durch Orifice und Skimmer in den Quadrupol Q0,

an dem eine Wechselspannung anliegt. Q0 dient dem Transport der Ionen in den

Vakuumbereich. Die QTrap 2000 besteht aus vier in Reihe geschalteten Quadrupolen (Q0,

Q1, Q2, Q3), von denen der letzte, Q3, auch als linear ion trap (LIT) verwendet werden kann.

In der LIT können die Ionen in einem Potentialtopf gefangen werden, indem eine

Wechselspannung am Quadrupol angelegt wird, und eine Gleichspannung an den beiden

Enden des Quadrupols.

Mit der QTrap 2000 sind neben allen typischen Triple-Quadrupol-Experimenten wie

Produktionen-(PI), Neutralverlust-(NL), Vorläuferionenscans(PC) sowie Multiple Reaction

Monitoring (MRM) möglich. Zusätzlich können noch Experimente im Trap Modus

durchgeführt werden, die dann den Zusatz enhanced im Namen tragen, und eine höhere

Grundlagen

33

Auflösung ermöglichen, beispielsweise der Enhanced Product Ion Scan (EPI) oder der

Enhanced MS Scan (EMS, entspricht einem Full Scan).

2.1.4 LC-ESI-MS-Kopplung

Bei der HPLC-MS-Kopplung wird der Ausgang der Chromatographiesäule mit der fused-

silica-Kapillare als Bestandteil der ES-Quelle verbunden. Bei atmosphärischem Druck (API =

Atmospheric Pressure Ionisation) gelangen die aufgetrennten Komponenten in die Quelle,

und werden dort ionisiert. Die m/z-Verhältnisse werden in Form eines rekonstruierten

Totalionenstroms (TIC) registriert. Während oder im Anschluss an die Messung kann die

Masseninformation aller zu einem bestimmten Zeitpunkt eluierten Verbindungen, die als

Peak im TIC erkennbar sind, erhalten werden.

2.1.5 MS/MS-Experimente

Da Fragmentierungsexperimente für diese Arbeit eine große Rolle spielten, soll hier nochmals

genauer darauf eingegangen werden. Die beiden Experimente, die angewendet wurden, sind

zum einen der EPI (Enhanced Product Ion Scan) und der MRM (Multiple Reaction

Monitoring). Beim Produktionenscan (Product Ion Scan) wird in Q1 das Vorläuferion

selektiert. In Q2, der bei der QTrap 2000 auch als LINAC (Linear Accelerator)

Kollisionszelle bezeichnet wird, wird das in Q1 ausgewählte Ion durch N2 als CAD

(Collisionally Activated Dissociation) Gas fragmentiert, und in Q3 die Fragmente

ausgescannt.

Die große Bedeutung des MS/MS-Experiments für diese Arbeit sowie in der Proteinchemie

allgemein liegt in der Möglichkeit zur Sequenzierung von Peptiden. Fragmentierung erfolgen

hauptsächlich an der Peptidbindung. Befindet sich die Ladung nach der Spaltung auf der

N-terminalen Seite, so spricht man von a-, b- und c-Serien, befindet sich die Ladung auf der

C-terminalen Seite, so handelt es sich um x-, y- und z-Serien (siehe Abbildung 2-3). Die

Anzahl der Aminosäuren wird über einen Index angegeben. In der Praxis erhält man nur

selten einen kompletten Satz von Fragmentionen der verschiedenen Serien. Durch

Kombination der Signale vorzugsweise mit Computerprogrammen ist jedoch eine

Interpretation möglich.

Grundlagen

34

Abbildung 2-3. Fragmentierung von Peptiden (Nomenklatur nach Roepstorff und Fohlmann, 1984). Die Fragmente, die durch Bindungsbruch entstehen können, sind unten angegeben. Quelle: Lottspeich, F. und Zorbas, H., 1998, leicht modifiziert.

Das zweite wichtige Fragmentierungsexperiment für diese Arbeit ist das Multiple Reaction

Monitoring (MRM). Hier wird Q1 auf ein spezifisches m/z gesetzt, in Q2 erfolgt die

Fragmentierung dieses Ions, und Q3 wird auf das m/z eines bestimmten Fragments gesetzt.

Der Begriff Multiple wird verwendet, da mehrere Pärchen von m/z in Q1 und Q2 in einem

Experiment betrachtet werden können. Im Allgemeinen wird auch von MRM gesprochen,

wenn nur der Übergang eines einzigen Ions betrachtet wird. Eine alternative, wenn auch

weniger gebräuchliche Bezeichnung in diesem Falle ist Single Reaction Monitoring (SRM).

Grundlagen

35

2.2 Kernresonanzspektroskopie

Die NMR Spektroskopie ist neben Massenspektrometrie und Röntgenbeugung die Methode

der Wahl bei der Strukturaufklärung sowohl von Makromolekülen wie Proteinen und

Nucleinsäure als auch von kleinen organisch-chemischen Substanzen wie

Sekundärmetaboliten. Nach der Entdeckung der NMR im Jahr 1945 waren vor allem die

Einführung der gepulsten Fourier-Transform-NMR und der mehrdimensionalen NMR

wichtige Meilensteine.

Während das eindimensionale NMR-Spektrum aus einer Frequenzachse besteht, an der die

chemischen Verschiebungen abgelesen werden können mit der Signalintensität auf der

Ordinate, besteht das zweidimensionale NMR-Spektrum aus zwei Frequenzachsen, auf denen

z.B. chemische Verschiebungen dargestellt werden. Das zweidimensionale NMR-Experiment

basiert auf einer Abfolge von drei Zeitintervallen: Präparation, Evolution und Detektion

(Abbildung 2-4 a). Bei einer Reihe von Experimenten kommt als weiteres Element vor der

Detektion die Mischzeit hinzu (Abbildung 2-4 b).

Die zweidimensionalen Verfahren setzen eine Kopplung von Kerndipolen voraus. Dabei muss

es sich nicht unbedingt um eine skalare Kopplung handeln. Die Wechselwirkung kann wie

beim Kern-Overhauser-Effekt auch dipolarer Natur sein, d.h. sie erfolgt durch den Raum.

Damit eröffnet sich die Möglichkeit, die räumliche Struktur von Molekülen aufzuklären. Ein

weiteres zweidimensionales Verfahren, mit dem man dynamische Prozesse untersuchen kann,

beruht auf dem Magnetisierungstransfer durch chemischen Austausch.

a)

b) Präparation

Präparation Evolution

Evolution

Detektion

DetektionMischzeit

t1 t2tM

t1 t2

FID

FID

a)

b) Präparation

Präparation Evolution

Evolution

Detektion

DetektionMischzeit

t1 t2tM

t1 t2

FID

FID

Abbildung 2-4. Zeitskalen von zweidimensionalen NMR-Experimenten.

In der Präparationszeit wird das interessierende Spinsystem für das Experiment vorbereitet,

z.B. durch Anwendung eines Entkopplungsexperiments oder durch die Erzeugung

Grundlagen

36

transversaler Magnetisierung mit Hilfe eines 90°-Impulses. In der Evolutionszeit t1 entwickelt

sich das Spinsystem sodann unter dem Einfluss verschiedener Faktoren, z.B. der

Larmorpräzession oder der skalaren Spin-Spin-Kopplung, bevor das NMR-Signal in der

Detektionszeit t2 registriert wird. Die in manchen Experimenten eingefügte Mischzeit

überführt die während der Evolution entwickelte Magnetisierung in eine detektierbare

Magnetisierung. Die Evolutioszeit t1 wird inkrementiert, so dass man eine Reihe von

1D-NMR-Spektren erhält, die in ihren Signalamplituden und Signalphasen moduliert

(periodisch variiert) sind, was eine zweite Fourier-Transformation bezüglich t1 ermöglicht.

Diese zusätzliche Frequenzachse F1 enthält die Frequenzen derjenigen Mechanismen, die

während der Evolutionszeit t1 wirksam waren. Resonanzfrequenzen und Spin-Spin-

Kopplungsfrequenzen, die im konventionellen eindimensionalen NMR-Spektrum a priori

nicht unterscheidbar sind, lassen sich damit auf zwei getrennten Frequenzachsen darstellen

und somit separieren.

Aus der Fülle der heute verfügbaren und routinemäßig eingesetzten 2D-NMR-Experimente

sollen hier nur diejenigen kurz beschrieben werden, die in dieser Arbeit verwendet wurden.

2.2.1 Das COSY-Experiment

Das COSY-Experiment (Correlated Spectroscopy) war das erste zweidimensionale NMR-

Experiment und besitzt auch heute noch große Bedeutung für die Strukturaufklärung (Braun,

Kalinowski und Berger, 2000; Kapitel 10.3). Aus dem COSY-Experiment lässt sich die

Kopplung benachbarter Protonen (2J und 3J) ermitteln. Auf den Frequenzachsen F1 und F2 ist

jeweils die chemische Verschiebung aufgetragen. Das 1D-NMR-Spektrum ergibt sich als

Projektion der Diagonalen, während die sog. Kreuzsignale zeigen, welche Kerne miteinander

koppeln. Die COSY-Pulssequenz besteht lediglich aus zwei durch die Evolutionszeit t1

getrennten 90°-Impulsen (Abbildung 2-5).

t1 t2

90°x 90°x

FID

t1 t2

90°x 90°x

FID

Abbildung 2-5. Pulssequenz für das H,H-COSY.

Grundlagen

37

Für ein AX-System erhält man im 2D-Spektrum auf der Diagonale die bei den Koordinaten

νA, νA bzw. νX, νX zentrierten sog. Diagonalsignale sowie als Nichtdiagonalelemente die

Kreuzsignale, zentriert bei νA, νX und νX, νA. Das Zustandekommen der Diagonalsignale

erklärt sich ausgehend vom Singulettsignal eines Kerns A, der keine skalare Spin-Spin-

Kopplung besitzt: Der erste 90°-Impuls der COSY-Sequenz erzeugt die transversale

A-Magnetisierung MA in der x,y-Ebene, die um die z-Achse rotiert. Der zweite 90°-Impuls

invertiert den y-Anteil von MA in die negative z-Richtung, während der x-Anteil in der x,y-

Ebene erhalten bleibt und detektiert wird. Die Intensität des detektierten Signals hängt dann

von der jeweiligen Stellung des Vektors MA am Ende der Evolutionszeit ab, die wiederum von

der Larmor-Frequenz des A-Kerns bestimmt wird. Die Signalamplitude ist daher in t1 mit

dieser Frequenz moduliert, und die Fourier-Transformation liefert in beiden Dimensionen die

Frequenz νA und somit ein Diagonalsignal.

Bei der Spin-Spin-Kopplung führt der zweite 90°-Puls nicht nur zu einer Änderung der

transversalen A-Magnetisierung MA, sondern auch zu Populationsänderungen für andere

Übergänge im betreffenden Spinsystem. Auf diese Weise wird die Magnetisierung zwischen

all jenen Kernen ausgetauscht, die miteinander koppeln; die Signale dieser Kerne werden in

einer Serie von t1-Experimenten mit den Frequenzen der Nachbarkerne moduliert. Dies führt

zu den Kreuzsignalen im 2D-Spektrum bei νA, νX und νX, νA.

2.2.2 Das TOCSY-Experiment

Während in einem COSY-Experiment meist Kopplungen von geminalen oder vicinalen

Protonen als Kreuzsignale detektiert werden, lassen sich durch ein TOCSY-Experiment

(Total Correlation Spectroscopy) ganze Teilspinsysteme betrachten. Das TOCSY-Experiment

ist auch unter dem Namen HOHAHA (Homonuclear Hartmann-Hahn) bekannt (Braun,

Kalinowski und Berger, 2000; Kapitel 10.18).

Das Experiment beginnt mit einem „Soft Pulse“ (Abbildung 2-6), d.h. mit einem Impuls

geringer Leistung (einem schwaches Hochfrequenzfeld B1) und einer Impulslänge τ, die so

eingestellt ist, dass der Impulswinkel genau 90° beträgt. Während der Dauer des

darauffolgenden Spin-Locks, der den Mischpuls des COSY ersetzt, befinden sich die Kerne

nur im schwachen Hochfrequenzfeld B1. Dadurch werden die chemischen

Verschiebungsdifferenzen der Protonen sehr klein, und die skalaren Kopplungen überwiegen.

Dies führt dazu, daß sich die Spinzustände mischen und Magnetisierung übertragen werden

kann. Der Magnetisierungstransfer kann durch die Länge der Mischzeit gesteuert werden.

Grundlagen

38

Kurze Zeiten von 20-50 ms liefern vorwiegend Kreuzsignale von stark koppelnden Protonen,

während längeres Mischen von 100-300 ms den Magnetisierungstransfer zwischen entfernten

Protonen des Spinsystems begünstigt.

Wie beim COSY-Experiment werden n Experimente mit inkrementierten t1-Zeiten

durchgeführt. Der Spin-Lock besteht in seiner Form der nach ihrem Erfinder Malcom Levitt

benannten MLEV-Sequenz, die den durch herkömmliche Modulationstechniken (Rausch-,

Rechteckmodulation) erreichbaren entkoppelten Bereich des angeregten Kernes im Spektrum

bei gleicher Senderleistung um das Dreifache übertrifft.

t1 t2

90°x

FID

MLEV-17t1 t2

90°x

FID

MLEV-17

Abbildung 2-6. Pulsprogramm für das TOCSY-Experiment. MLEV-17 ist die Form des Spin-

Locks im TOCSY-Experiment.

Wie im COSY-Spektrum entsprechen die Diagonalpeaks denjenigen des normalen

1D-Spektrums, während die Außerdiagonalpeaks Korrelationen zwischen Protonen

entsprechen, die zum jeweils gleichen Spinsystem gehören. Durch die Wahl der Mischzeit

(10 ms bis einige 100 ms) erhält man ein dem COSY entsprechendes Spektrum oder ein „total

korreliertes“ Spektrum unter Wechselwirkung aller benachbarter Protonen, die nicht durch

quartäre C-Atome isoliert sind. Bei der Wahl einer optimierten Mischzeit können

Schwierigkeiten auftreten, wenn Spinsysteme mit unterschiedlicher Anzahl von Atomen (z.B.

substituierte Aromaten und Saccharide) in der zu charakterisierenden Substanz vorhanden

sind. Dann besteht die Problematik darin, dass bei zu langer Mischzeit auch Korrelationen

eines Teilsystems über quartäre C-Atome hinweg zustande kommen und deren Kreuzsignale

im Spektrum sichtbar sind.

Eine breite Anwendung finden TOCSY-Experimente bei der Strukturaufklärung von

Oligosacchariden und vor allem bei Peptiden, da mit diesem Experiment Spinsysteme

einzelner Aminosäuren zugeordnet werden können.

Grundlagen

39

2.2.3 Das HMQC-Experiment

Mit dem HMQC-Experiment (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) lassen sich die

chemischen Verschiebungen von Kohlenstoffatomen mit daran gebundenen Protonen

korrelieren, es handelt sich also um ein inverses zweidimensionales heteronukleares

H,C-korreliertes NMR-Experiment (Braun, Kalinowski und Berger, 2000; Kapitel 10.13).

Charakteristisch für alle inversen Verfahren ist, dass Kohärenzen im Kanal der

unempfindlichen Kerne (13C, 15N) erzeugt und dann auf die empfindlichen Kerne (z.B. 1H)

übertragen werden, deren Resonanzen dann gemessen werden. Mit dem HMQC-Experiment

lassen sich die chemischen Verschiebungen von Protonen und deren direkt gebundenen

Kohlenstoffe (1J-Kopplungen) korrelieren.

2.2.4 Das HMBC-Experiment

In den C,H-korrelierten Spektren des HMQC-Experiments (Heteronuclear Multiple Bond

Correlation) werden keine Korrelationspeaks von Protonen mit quartären C-Atomen

gefunden, da diese Methoden auf große C,H-Kopplungskonstanten 1J(C,H) über eine Bindung

abgestimmt sind. Das HMBC-Experiment (Braun, Kalinowski und Berger, 2000; Kapitel

10.16) ist die empfindlichste Methode, um Konektivitäten zwischen 1H- und 13C-Kernen in

einem Kohlenstoffskelett zu bestimmen. Die Voraussetzung hierfür ist, dass das Molekül

genügend Protonen als Sonden für die inverse Detektion enthält. Die Bedeutung dieses

Experiments liegt außer in der Verknüpfungsbestimmung von CHn-Fragmenten auch noch in

der Möglichkeit, Heterokerne zuzuordnen. Bei Peptiden ist dieses Verfahren eine wichtige

Methode zur Zuordnung von Seitenkettenfunktionen von Aminosäuren zum Peptidrückgrat,

wenn diese durch quartäre C-Atome unterbrochen sind, sowie zur Bestimmung von

Peptidsequenzen

Grundlagen

40

2.3 Enzymkinetik

Die Enzyminhibition lässt sich in zwei Hemmtypen einteilen: reversible und irreversible

Inhibition. Charakteristisch ist für die reversible Hemmung, dass der Inhibitor I sich wieder

vom Enzym E lösen kann, beispielsweise durch das Substrat S des Enzyms verdrängt werden

kann, wodurch die Enzymaktivität wieder hergestellt wird. Bei der irreversiblen Inhibition

wird der Inhibitor so fest an das Enzym gebunden, dass er sich nicht mehr ablösen kann, d.h.

in der Regel kovalent. Zunächst soll die ungehemmte Enzymreaktion betrachtet und

anschließend mit verschiedenen Hemmtypen verglichen werden.

Die ungehemmte Enzymreaktion verläuft nach folgendem Schema:

E + S ES E + Pkcat

k1

k2

E + S ES E + Pkcat

k1

k2

Das Substrat reagiert mit der Geschwindigkeitskonstante k1 zum Enzym-Substrat-Komplex

ES, und dissoziiert mit der Geschwindigkeitskonstante k2 wieder vom Enzym ab. Der Umsatz

zum Produkt P erfolgt mit der Geschwindigkeitskonstante kcat. Die Michaelis-Menten-

Gleichung gibt dies wieder als

][

][max

SK

SVv

m += (Gleichung 1) mit

1

2

k

kkK cat

m

+= und ][max EkV cat=

Die beiden für ein Enzym charakteristischen Größen sind die Michaeliskonstante Km, die der

Substratkonzentration entspricht, bei der die Hälfte der Maximalgeschwindigkeit erreicht

wird, und der Geschwindigkeitskonstante kcat, die mit der Enzymkonzentration multipliziert

die Maximalgeschwindigkeit ergibt.

Die reversible Inhibition kann allgemein mit folgendem Schema beschrieben werden:

EI + P5

E + S ES E + Pkcat

k1

k2

E + S

+I

ES

+I

E + Pkcat

k1

k2

k3k4

EI + S ES9

k

kESI

kk

k6

k7k8

EI + P5

E + S ES E + Pkcat

k1

k2

E + S

+I

ES

+I

E + Pkcat

k1

k2

k3k4

EI + S ES9

k

kESI

kk

k6

k7k8

Grundlagen

41

Im Speziellen können folgende drei Typen der reversiblen Inhibition unterschieden werden,

die kompetitive, die nicht-kompetitive und die unkompetitive Inhibition. Alle drei Typen

sollen im Folgenden kurz beschrieben werden.

Bei der kompetitiven Inhibition konkurriert der Inhibitor – meist aufgrund einer hohen

Ähnlichkeit – mit dem Substrat um die Bindungsstelle am Enzym. Im Gegensatz zum

Substrat wird der Inhibitor jedoch nicht zum Produkt P umgesetzt. Die reversible Inhibition

folgt diesem Schema:

E + S ES E + Pkcat

k1

k2

E + S+I

ES E + Pkcat

k1

k2

k3k4

EI

E + S ES E + Pkcat

k1

k2

E + S+I

ES E + Pkcat

k1

k2

k3k4

EI

Das Enzym kann also Substrat und Inhibitor nicht gleichzeitig binden, EI und ES stehen in

einem Gleichgewicht. Wird das Substrat in genügend großem Überschuss zugegeben, so kann

der Inhibitor komplett verdrängt werden. Die Maximalgeschwindigkeit Vmax wird also von

einem kompetitiven Inhibitor nicht verändert, es ist jedoch eine höhere Substratkonzentration

erforderlich, um die halbmaximale Geschwindigkeit zu erreichen, Km erhöht sich also.

Der zweite wichtige Spezialfall der reversiblen Inhibition ist die nicht-kompetitive Inhibition.

Diese gehorcht folgendem Schema:

5

E + S ES E + Pkcat

k1

k2

E + S

+I

ES

+I

E + Pkcat

k1

k2

k3k4

EI + S ESk

kESI

k

k6

k7k8

5

E + S ES E + Pkcat

k1

k2

E + S

+I

ES

+I

E + Pkcat

k1

k2

k3k4

EI + S ESk

kESI

k

k6

k7k8

Im Gegensatz zum kompetitiven Inhibitor bindet der nicht-kompetitive Inhibitor unabhängig

vom Substrat an einer anderen Stelle des Enzyms. Deshalb bleibt Km auch unverändert, wenn

ein nicht-kompetitver Inhibitor anwesend ist. Vmax jedoch wird herabgesetzt, da aus dem

Enzym-Substrat-Inhibitor-Komplex kein Produkt freigesetzt werden kann, und somit der

Anteil Enzym, der als ESI-Komplex vorliegt, nicht an der Reaktion beteiligt ist.

Die unkompetitive Inhibition schließlich ist ein relativ seltener Hemmtyp, dem folgendes

Schema zugrunde liegt:

Grundlagen

42

E + S ES E + Pkcat

k1

k2

E + S ES+I

E + Pkcat

k1

k2

ESESI

k7k8

E + S ES E + Pkcat

k1

k2

E + S ES+I

E + Pkcat

k1

k2

ESESI

k7k8

In diesem Falle kann der Inhibitor nur an den Enzym-Substratkomplex binden. Sowohl Vmax

als auch Km werden durch Inhibitoren diesen Typs beeinflusst, das Verhältnis km/Vmax bleibt

jedoch gleich. Praktisch kommt die unkompetitve Inhibition beispielsweise bei Oxidasen vor,

wenn der Inhibitor nur mit dem Enzym reagieren kann, sofern sich dieses in einer bestimmten

Oxidationsstufe befindet.

Für diese Dissertationsschrift bedeutender ist jedoch die irreversible Hemmung. Im Gegensatz

zur reversiblen Inhibition ist bei der irreversiblen Inhibition die Inaktivierung des Enzyms

durch den Inhibitor von Dauer. Eine Dissoziation in freies Enzym und Inhibitor ist nicht

möglich, d. h. einmal inaktiviertes Enzym bleibt inaktiv. Die irreversible Inhibition verläuft

analog dazu nach folgendem Schema:

E + S ES E + Pkcat1

k2

E + S+

I

ES E + Pkcat1

k2

k3k4

EI

E-I

kinact

E + S ES E + Pkcat1

k2

E + S+

I

ES E + Pkcat1

k2

k3k4

EI

E-I

kinact

Die Bildung des irreversiblen E-I-Komplexes verläuft langsam verglichen zur Enzymreaktion

mit dem Substrat. Daher empfielt sich folgende experimentelle Strategie: Das Enzym wird für

verschiedene Zeitpunkte mit dem Inhibitor präinkubiert, bevor die Anfangsgeschwindigkeit

des Enzyms gemessen wird. Aus dem zeitabhängigen Verlust der Enzymaktivität lässt sich

die beobachtete Geschwindigkeitskonstante kobs bestimmen:

v/v0 = exp (-kobst) (Gleichung 2).

Aus obigem Reaktionsschema ergibt sich weiterhin folgende Gleichung für kobs:

][

][

IK

Ikk

appi

inactobs

+= (Gleichung 3)

Grundlagen

43

wobei appiK definiert ist als die scheinbare Konzentration des Inhibitors, bei der die

halbmaximale Rate der Inaktivierung erreicht wird. Wie das Reaktionsschema zeigt findet

zunächst eine reversible Bindung an das Enzym statt (durch appiK als Maß der Affinität des

Inhibitors zum Enzym wiedergegeben) bevor die irreversible Bindung erfolgt (durch kinact als

maximale Rate der Enzyminaktivierung wiedergegeben).

Zielsetzung

44

3 Zielsetzung Ziel der vorliegenden Arbeit war es, neue Erkenntnisse zum Wirkmechanismus und zur

Biosynthese der Abyssomicine zu gewinnen. Außerdem sollte versucht werden, neue

Abyssomicine zu identifizieren, zu isolieren und zu charakterisieren.

Die Abyssomicin-Biosynthese sollte im Rahmen dieser Arbeit mittels

Fütterungsexperimenten von 13C-markierten Vorläufern untersucht werden, um

herauszufinden, aus welcher Quelle die Kohlenstoffatome des Abyssomicins stammen. Die

Untersuchung des Wirkmechanismus von Abyssomicin wurde auf drei Säulen gestellt:

Zunächst wurde ein einfaches Modellsystem (Mercaptoethanol, N-Acetyl-Cystein) gewählt,

das mit atrop-Abyssomicin C umgesetzt werden sollte, um zu untersuchen, ob das

Michaelsystem des Abyssomicins von Thiolen nucleophil angegriffen wird. Zweitens sollte

eine Hemmkinetik von atrop-Abyssomicin C mit ADC-Synthase durchgeführt werden.

Hierfür mussten zunächst die an der Aminodesoxychorismatsynthese beteiligten Enzyme

PabA (Klonierung und Überexpression erfolgte bereits im Rahmen der Diplomarbeit) und

PabB aus aus dem Gesamtgenom von B. subtilis in E. coli kloniert, überexprimiert und eine

Reinigungsstrategie etabliert werden. Zur Verfolgung der Enzymreaktion musste zunächst ein

geeignetes Assay-System entwickelt werden, das eine direkte Beobachtung der ADC-

Synthase-Reaktion ermöglichte. Drittens sollte die kovalente Bindung von atrop-Abyssomicin

C an PabB untersucht werden, indem das mit Abyssomicin inkubierte Enzym sowie das

unbehandelte Enzym durch eine geeignete Protease verdaut, per LC-MS und LC-MS/MS

analysiert und verglichen werden.

Material und Methoden

45

4 Material und Methoden

4.1 Material

4.1.1 Geräte

Agarosegelkammern

BIO-RAD Mini-Sub Cell GT

Photometer

AMERSHAM BIOSCIENCES Ultrospec 2100 pro

PCR

PEQLAB Primus 96 advanced

Zentrifugen

HERMLE Z 383 K HERMLE Z 233 MK-2

Heizblock

EPPENDORF 1,5ml Thermomixer comfort

SDS-PAGE

BIO-RAD Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis

Western Blot

BIO-RAD Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell

Sterilbank

HOLTEN LaminaAr model 1,2

Brutschrank

BINDER

Schüttelinkubator

INFORS Multitron II

French Press

SIM-AMINCO, SLM Instruments, Inc. Rochester, NY, USA

HPLC und Massenspektrometer

HPLC: Agilent 1100 HPLC, Agilent Technologies, Waldbronn

Säulen: Phenomenex, Aschaffenburg

MS: Bruker Esquire3000+, Bruker Daltonics, Bremen

QTrap2000, Applied Biosystems / MDS Sciex, Darmstadt


46

4.1.2 Chemikalien

Agar Kobe I pulv., Roti®-Quant Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe

Ammoniumpersulfat (APS) Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg

Ampicillin Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg

BCA Protein Assay Kit PIERCE Biotechnology Inc., Rockford, IL, USA

Bromphenolblau Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg 13C-markierte Substanzen Eurisotop, Saint-Aubin Cedex, Frankreich

Dialysemembran Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg

Dithiothreitol (DTT) Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg

Ethidiumbromid Sigma Chemie, München

E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit I PEQLAB Biotechnology GmbH, Erlangen

GeneRuler 1kb DNA Ladder Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)

Diagnostic Chemicals Limited Charlottetown Bio-Tech Trade & Service GmbH

H2Odest. Interne Wasserentsalzungsanlage

H2Odd Millipore Corporation, Billerica, MA, USA

Ni-NTA Agarose Qiagen GmbH, Hilden

Ni-NTA Spin Kit Qiagen GmbH, Hilden

N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED)

Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg

NucleoSpin Extract Kit MACHEREY-NAGEL GmbH, Düren

Nutrient Broth BD Becton Dickinson GmbH, Sparks, MD, USA

Primer Biomers.net GmbH, Ulm

Prestained Proteinladder, 10-180 kDa Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

Proteinladder, 10-200 kDa Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

Rinderserumalbumin (BSA) Sigma Aldrich, Steinheim

Qiaex II Gel Extraction Kit Qiagen GmbH, Hilden

Roti®-Quant Reagenz Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe

Rotiphorese Gel A (30 %) Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe

Rotiphorese Gel B (2 %) Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe

Serva Blau 250 Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg

TriDye 100 bp DNA Ladder New England Biolabs, Schwalbach

TriDye 2-log DNA Ladder New England Biolabs, Schwalbach

Trizma® base (Tris) Sigma Chemie, München

Alle hier nicht aufgeführten Chemikalien waren analysenreine Reagenzien der Firma Carl

Roth GmbH & Co, Karlsruhe


47

4.1.3 Enzyme

Antarctic Phosphatase New England Biolabs, Schwalbach

DNA Polymerase I Klenow Fragment New England Biolabs, Schwalbach

Endoprotease GluC New England Biolabs, Schwalbach

Glutamat-Dehydrogenase Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg

Lysozym Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg

Proteinase K Roche, Basel

Pwo DNA-Polymerase und Puffer Roche, Basel

Quickligase New England Biolabs, Schwalbach

Restriktionsendonucleasen und –puffer Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

New England Biolabs, Schwalbach

T4-DNA-Ligase New England Biolabs, Schwalbach

T4-Polynucleotidkinase Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade Promega Corporation, Madison, WI, USA

4.1.4 Medien

DSMZ-Medium 1 Pepton 5 g

Malzextrakt 3 g

MnSO4 10 mg

H2O dest. ad 1 Liter

pH 7.0

KM 1-Medium Nutrient Broth 4 g

NaCl 2,5 g

H2O dest. ad 500 ml

MM 1-Medium Glucose* 5 g

tri-Na-Citrat x 2 H2O 0,5 g

KH2PO4 3 g

K2HPO4 7 g

MgSO4 x 7 H2O 0,1 g

(NH4)2SO4 1 g


48

H2O ad 1 Liter

SGG Stärke 10 g

Glucose* 10 g

Glycerin 10 g

Cornsteep Powder 2,5 g

Pepton 5 g

Hefeextrakt 2 g

NaCl 1 g

CaCO3 3 g

H2O ad 1 Liter

pH 7,2

TY-Medium Trypton 4 g

Yeast Extract 2,5 g

NaCl 2,5 g

H2O dest. ad 500 ml

* Glucose wird separat sterilisiert

4.1.5 Medienzusätze

Agar Agar Kobe I für Platten 7,5 g für 500 ml TY

Antibiotika Ampicillin (stock 25 mg/ml) in H2O 50 µg/ml

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalaktosid,

(stock 100 mM) in H2O

1 mM


49

4.1.6 Lösungen

4.1.6.1 Lösungen zur DNA-Isolierung

TE-Puffer 10 mM Tris/HCl 121,1 mg

1 mM EDTA 37 mg

H2O dest. ad 100 ml

pH 8,0

Lysozym-Lösung 100 mg/ml Lysozym in TE-Puffer

Proteinase K-Lösung 20 mg/ml Proteinase K in TE-Puffer

RNase A-Lösung 10 mg/ml RNase A in TE-Puffer

SB1-Puffer 50 mM EDTA 1,85 g

50 mM Tris/HCl 606 mg

0,5 % Tween-20 500 µl

0,5 % Triton X-100 500 µl

H2O dest. ad 100 ml

pH 8,0

SB1-Puffer 3 mM Guanidiniumhydrochlorid 29 mg

20 % Tween-20 20 ml

H2O dest. ad 100 ml

pH 5,5

Sämtliche weiteren benötigten Puffer stammten aus den entsprechenden Kits.


50

4.1.6.2 Puffer für Phosphorylierung und Ligation

10 x T4-DNA-Ligasepuffer 200 mM Tris/HCl 2,42 g

50 mM MgCl2 1,02 g

50 mM DTT 772 mg

500 µg/ml BSA 50 mg

ATP 1 mM

H2O dest. ad 100 ml

pH 7,6

4.1.6.3 Lösungen für Agarosegele

Auftragspuffer 5 x Saccharose 25 %

SDS 0,1 %

Bromphenolblau 0,05 %

Tris 50 mM

TAE-Puffer 10 x Tris 48, 4 g

Essigsäure (96 %) 11,4 g

EDTA 7,2 g

H2O dest. ad 1 l

pH 7,9

Ethidiumbromid-

Färbebad

5 µg/ml in 500 ml

H2Od


51

4.1.6.4 Lösungen für SDS-PAGE

Auftragspuffer 1 M Tris/HCl pH 6,8 3,75 ml

SDS 1,2 g

Glycerin 6 ml

Bromphenolblau 6 mg

H2O dest. ad 13,5 ml

Zugabe vor Verwendung: 1 M DTT 1,5 ml

Elektrophoresepuffer 10 x Tris 31 g

Glycin 144 g

SDS 10 g

H2O dest. ad 1 l

pH 8,3

Sammelgelpuffer Tris/HCl, pH 6,8 0,25 M

Trenngelpuffer Tris/HCl, pH 8,8 1,5 M

Sammelgel Rotiphorese Gel A (30 % Acrylamid) 1,25 ml

Rotiphorese Gel B (2 % Bisacrylamid) 0,5 ml

Sammelgelpuffer 6,3 ml

H2O dest. 4,0 ml

SDS (10 %) 120 µl

APS (100 mg/ml) 80 µl

TEMED 30 µl

Trenngel (12 %) Rotiphorese Gel A (30 % Acrylamid) 8 ml

Rotiphorese Gel B (2 % Bisacrylamid) 2,4 ml

Trenngelpuffer 5,0 ml

H2O dest. 7,5 ml

SDS (10 %) 400 µl

APS (100 mg/ml) 100 µl

TEMED 50 µl


52

Färbelösung Serva Blau R250 0,85 g

Ethanol 250 ml

Eisessig 50 ml

H2O dest. ad 500 ml

Entfärbelösung Ethanol 100 ml

Eisessig 100 ml

H2O dest. ad 1 l

4.1.6.5 Lösungen zur Proteinreinigung von PabA

Harnstoffpuffer 8 M Harnstoff 48,05 g

100 mM NaH2PO4 1,38 g

10 mM Tris/HCl 121 mg

H2O dest. ad 100 ml

pH 8,0

Zugabe vor Gebrauch: 1 M DTT (5 mM) 0,5 ml

Dialysepuffer 50 mM Tris/HCl 6,06 g

Glycerin 8 % 93 ml

H2O dest. ad 1 l

pH 8,0

Zugabe vor Gebrauch: 1 M DTT 1 ml

Puffer für Anionen-austauschchromatographie

Puffer A 50 mM Tris/HCl 6,06 g

Glycerin 8 % 93 ml

H2O dest. ad 1 l

pH 8,0

1 M DTT 1 ml


53

Puffer B 50 mM Tris/HCl 6,06 g

Glycerin 8 % 93 ml

1M NaCl 58 g

H2O dest. ad 1 l

pH 8,0

1 M DTT 1 ml

Gelfiltrationspuffer 50 mM Tris/HCl 6,06 g

Glycerin 8 % 93 ml

150 mM NaCl 8,7 g

H2O dest. ad 1 l

pH 8,0


4.1.6.6 Lösungen zur Proteinreinigung von PabB

Lysis-Puffer: 50 mM NaH2PO4 780 mg

300 mM NaCl 1,75 g

10 mM Imidazol 68 mg

ad 100 ml H2Odd

pH 8,0

Wasch-Puffer: 50 mM NaH2PO4 780 mg

300 mM NaCl 1,75 g

20 mM Imidazol 136 mg

ad 100 ml H2Odd

pH 8,0

Elutions-Puffer: 50 mM NaH2PO4 780 mg

300 mM NaCl 1,75 g

250 mM Imidazol 1,7 g

ad 100 ml H2Odd

pH 8,0


54

Dialysepuffer 50 mM Tris/HCl 6,06 g

Glycerol 50 %

H2Odd ad 1 l

pH 8,0


Gelfiltrationspuffer 50 mM Tris/HCl 6,06 g

Glycerin 8 % 93 ml

150 mM NaCl 8,7 g

H2Od ad 1 l

pH 8,0


4.1.6.7 Lösungen zur Proteinbestimmung

Reagenzlösung BCA BCA Protein Assay Reagent A 50 Teile (v/v)

BCA Protein Assay Reagent B 1 Teil (v/v)

Reagenzlösung Bradford Bradford Reagenz 2 Teile (v/v)

H2Odd 5,5 Teile (v/v)

4.1.6.8 Puffer für die Kinetik

Ammoniumsulfat-Puffer 2 x 100 mM Tris/HCl 1,21 g

200 mM (NH3)2SO4 2,64 g

10 mM MgCl2 203 mg

10 % Glycerol 10 ml

H2Odd ad 100 ml

pH 8,5


55

Assay-Puffer Ammoniumsulfatpuffer 50 µl

1 M DTT (1 mM f.c.) 0,2 µl

Chorismat 10 µl

H2Odd 39,8 µl

4.1.6.9 Puffer für den GluC Verdau

Verdau-Puffer GluC-Puffer (Fermentas)

Trypsinlösung Endoproteinase GluC

H2OLCMS 50 µl

4.1.6.10 Laufmittel für die LC-ESI-MS-Kopplung

Laufmittel für Proteinverdau

Laufmittel A H2OLCMS

0,1 % HCOOH

Laufmittel B AcetonitrilLCMS

0,1 % HCOOH

Laufmittel für Enzymkinetik

Laufmittel A H2OLCMS

5 mM Ammoniumformiat 313,15 mg/l

0,1 % HCOOH 1 ml

Laufmittel B AcetonitrilLCMS

5 mM Ammoniumformiat 313,15 mg/l

0,1 % HCOOH 1 ml

Alle Bestandteile der Laufmittel stammten von der Firma Carl Roth GmbH


56

4.1.7 Bakterienstämme

Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Bakterienstämme verwendet:

Spezies Bezeichnung Merkmale Referenz

Verrucosispora

AB-18-032

Abyssomicin-Produzent Riedlinger et al, 2004

Bacillus subtilis DSM 10 sensitiv auf Abyssomicin DSMZ, Braunschweig

Escherichia coli DH5α supE44 ∆lacU169

(Φ80 lacZ∆M15)

hsdR17 recA1 endA1 gyrA

thi-1 relA1

Hanahan, 1983

Escherichia coli BL21(DE3) hsdS (rB-mB

-) gal dcm

ompTλ(DE3), T7-RNA-Poly-

merasegen unter Kontrolle des

lacUV5-Promotors

Studier und Moffat, 1986


57

4.1.8 Plasmide

Für diese Arbeit wurde das in Abbildung 4-1 dargestellte Plasmid PrSet_6His_PP verwendet,

das freundlicherweise von Prof. Michael Groll (Charité, Berlin) zur Verfügung gestellt wurde.

PrSet_6His_PP

2803 bps

500

1000

1500

2000

2500

EcoO109IBamHI

BlpIEcoO109I

T7 Promotor

bla

Start BamHI

ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC CGT GAA GTT CTG TTC CAG GGG CCC GGA TCC M R G S H H H H H H L E V L F Q G P G S Hexa-His-Tag Erkennungssequenz für Prescission Protease

Abbildung 4-1. Schematische Darstellung des Plasmids PrSet_6His_PP. Eingezeichnet sind neben den Restriktionsschnittstellen der Hexa-His-Tag, die Erkennungssequenz der Prescission

Protease, die Promotorregion Φ10 und das für die Ampicillinresistenz verantwortliche β-Lactamasegen bla.

4.1.9 Primer

Oligo Name Sequenz PabB BamH1 forward tgtgttggatccgcacaacgcagacc PabB BlpI backward aggagtgctgagctcatctaatttttgtctcttcttcgc


58

4.2 Mikrobiologische Methoden

4.2.1 Lagerung und Anzucht von Verrucosispora AB-18-032

Zunächst wurden von dem Stamm Verrucosispora AB-18-032 Tiefkühlkulturen angelegt.

Hierzu wurde 1 ml einer Vorkultur in ein 2-ml-Kryoröhrchen vorgelegt, mit 1 ml steriler

Kryolösung (20% Glycerin, 10% Saccharose) versetzt und bei – 80 °C gelagert. Mit diesen

Kulturen wurde als Vorkultur ein 500 ml Schüttelkolben mit drei Schikanen, der 100 ml

SGG- Medium enthielt, beimpft. Die Inkubation erfolgte bei 27 °C auf einer Inforce-

Schüttelmaschine bei 120 Upm für 72 Stunden. Zur Herstellung von Hauptkulturen wurden

100 ml SGG-Medium in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 3 ml Vorkultur inokuliert. Die

Inkubation erfolgte bei 27 °C und 120 Upm auf einer Inforce-Schüttelmaschine für

72 Stunden.

4.2.2 Fütterungsexperimente mit 13C-isotopenmarkierten Verbindungen

Wie in 4.2.1 beschrieben wurde 1 l Hauptkultur verteilt auf 10 Erlenmeyerkolben angesetzt.

Pro 100 ml Kultur wurden 50 mg der jeweiligen 13C-isotopenmarkierten Substanzen gefüttert

(fünfmaliger Puls je 10 mg pro 100 ml) im Abstand von 3 h. Die Puls-Fütterung begann nach

48 h und wurde nach 60 h beendet. Anschließend wurde die Kultur für 12 h weiter wachsen

gelassen, und nach 72 h entsprechend 4.2.3 aufgearbeitet.

4.2.3 Isolierung der Abyssomicine aus Kulturen von Verrucosispora

Die Isolierung der Abyssomicine erfolgte in abgewandelter Version nach Riedlinger et al

(2004) durch eine Kombination aus Adsorptions-, Größenausschluss- und

RP-Chromatographie.

Zunächst wurde das Mycel durch Zentrifugation in einer Hermle Z383.K-Zentrifuge mit

Ausschwingrotor 221.08 V01 für 10 min bei 4500 rpm vom Kulturfiltrat abgetrennt. Das so

gewonnene Kulturfiltrat wurde zunächst an Polystyrolharz Amberlite XAD-16 gereinigt. Die

hierzu verwendete Menge des XAD-Harzes entsprach dem Volumen von 10 % des

Kulturfiltrates (meist 100 – 200 ml). Der Fluß wurde auf 5 Bettvolumen pro Stunde

eingestellt. Nach dem Beladen der Säule wurde mit 5 Bettvolumen deionisiertem Wasser und

mit 40 % Methanol gewaschen, und anschließend mit 100 % Methanol eluiert.

Das Eluat wurde am Rotationsverdampfer bis zum wässrigen Rückstand eingeengt. Der

wässrige Rückstand wurde auf pH 4,0 eingestellt und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Der


59

Extrakt wurde in einem Spitzkölbchen am Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingeengt.

Anschließend wurde der Extrakt in wenig Methanol aufgenommen und auf eine Sephadex

LH-20 Säule aufgetragen. Das Eluat wurde in Abständen von 20 min bei einem Fluss von

0,8 ml/min fraktioniert. Aufgrund von Analysen mittels HPLC-DAD wurden die

Abyssomicin-haltigen Fraktionen bestimmt, vereinigt und in einem Spitzkölbchen erneut bis

zur Trockene eingeengt. Der letzte Schritt war eine präparative RP-HPLC mit einem

Lösungsmittelsystem aus Wasser und Acetonitril, das unbedingt säurefrei sein muss. Die

Gradienten wurden jeweils an das Trennproblem angepasst und optimiert.

4.2.4 LC-ESI-MS und LC-DAD zur Untersuchung der Abyssomicine

Alle LC-ESI-MS-Experimente wurden mit einer Agilent 1100 HPLC-Anlage (Agilent

Technologies, Waldbronn) gekoppelt an eine QTRAP 2000 (MDS Sciex/Applied Biosystems,

Darmstadt) durchgeführt. Wurde die analytische HPLC verwendet, so lag die Flussrate bei

1,5 ml/min, wurde die Kapillar-HPLC verwendet, lag die Flussrate bei 60 µl/min. Das

Massenspektrometer wurde mit der Analyst-Software gesteuert und alle LC-ESI-MS-Daten

wurden mit dieser Software ausgewertet. Für LC-DAD-Experimente wurde die analytische

HPLC mit einer Flussrate von 1,5 ml/min verwendet.

Als mobile Phase diente H2O (LCMS grade) mit 0,1 % Ameisensäure (Laufmittel A) und

ACN (LCMS grade) mit 0,1 % Ameisensäure (Laufmittel B). Für LC-ESI-MS- und

LC-DAD-Untersuchungen wurden die in Tabelle 4-1 und Tabelle 4-2 angegebenen

Routinegradienten und die in Tabelle 4-3 angegebenen Säulen verwendet.

Tabelle 4-1. LC-MS Routinegradient.

Zeit [min] Solvent B [%] Flußrate analytische HPLC Flußrate Kapillar-HPLC

0,00 10 1,5 ml/min 60 µl/min

10,00 100 1,5 ml/min 60 µl/min

Tabelle 4-2. LC-DAD Routinegradient.

Zeit [min] Solvent B [%] Flussrate

0,00 5 1,5 ml/min

10,00 100 1,5 ml/min


60

Tabelle 4-3. HPLC-Säulen.

Dimension Säule Sorbent Partikelgröße

[µm]

Porengröße

[A] Länge

[mm]

ID

[mm]

Part. Nr. Hersteller

Luna RP-C18 3 90 50 1 00B-

4251-A0 Phenomenex

Luna RP-C18 5 100 100 4,6 00D-

4252-E0 Phenomenex

4.2.5 Präparative HPLC-MS

Präparative Trennungen wurden auf einer Agilent 1100 HPLC-Anlage (Agilent Technologies,

Waldbronn) durchgeführt. Die Flussrate lag bei 15 ml/min. Die HPLC wurde mit der

ChemStation-Software gesteuert. Als mobile Phase diente H2Odd (Laufmittel A) und

ACNgrad.grade (Laufmittel B). Die verwendete Säule ist in Tabelle 4-4 dargestellt. Die während

der Trennung aufgefangenen Fraktionen wurden per HPLC-DAD analysiert. Anschließend

wurden die Fraktionen vereinigt und gefriergetrocknet.

Tabelle 4-4. Präparative HPLC-Säule.

Dimension Säule Sorbent Partikelgröße

[µm] Länge

[mm]

ID

[mm]

Part. Nr. Serien Nr.

Hersteller

GROM-SIL

300 ODS-5 RP-C18 10 250 20

GSOD

51130R2520 25070091 Grom

In Tabelle 4-5 sind die verwendeten präparativen HPLC-Gradienten angegeben. Es wurden

Flußraten von jeweils 15 ml/min verwendet. Am Ende eines Chromatographie-Laufs wurde

mit 100 % ACN gespült. Die Trennungen wurden im analytischen Maßstab etabliert und auf

die präparative Trennung wie in Tabelle 4-5dargestellt übertragen.


61

Tabelle 4-5. Gradienten der präparativen HPLC-MS-Läufe.

Trennung Zeit

[min]

Solvent B

[%]

Flußrate

[ml/min]

Detektion,

Wellenlänge [nm]

0 20 15 230 a) Aufreinigung von atrop-

Abyssomicin C

35 100 15

0 40 15 260 b) Aufreinigung von Abyssomicin B,

G, H

20 100 15

0 20 15 260 c) Aufreinigung der Produkte der

Umsetzung mit Mercaptoethanol

und N-Acetylcystein

20 100 15

4.2.6 Umsetzungen von Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C mit Nucleophilen

Abyssomicin und atrop-Abyssomicin C wurden mit verschiedenen Nucleophilen (NaBH4,

Na(CN)BH3, NH2OH, NH3, Mercaptoethanol und N-Acetylcystein) umgesetzt. Folgende

Stammlösungen wurden verwendet, sofern nicht anders angegeben in Tetrahydrofuran, die

Reaktionen liefen jeweils 2 h bei Raumtemperatur:

Abyssomicin / Atrop-Abyssomicin 50 mM 17,35 mg/ml

Triethylamin 500 µg/ml

NaBH4 100 mM: 3,78 mg/ml

Na(CN)BH3 Lösung (100 mM)

NH2OH HCl 100 mM: 6,94 mg/ml

NH3 100 mM: 10 µl 25% Lsg + 1490 µl H2O

Mercaptoethanol 40 µg/ml in ACN

N-Acetylcystein 8,16 mg/ml


62

1. H-Nucleophile: NaBH4 Abyssomicin/ atrop-Abyssomicin

NaBH4 Triethylamin Tetrahydro-furan

1 eq (0,36 µmol) 1,5 eq (0,54 µmol) 1 eq 7,2 µl 5,4 µl 29,2 µl 430 µl 7,2 µl 5,4 µl 29,2 µl 430 µl

2. H-Nucleophile: Na(CN)BH3 Abyssomicin/ atrop-Abyssomicin

Na(CN)BH3 Triethylamin Tetrahydro-furan


3. N-Nucleophile: NH2OH HCl Abyssomicin/ atrop-Abyssomicin

NH2OH HCl Triethylamin Tetrahydro-furan


4. N-Nucleophile: NH3 Abyssomicin/ atrop-Abyssomicin

NH3 Tetrahydro-furan

1 eq (0,36 µmol) 1,5 eq (0,54 µmol) 7,2 µl 5,4 µl 430 µl 7,2 µl 5,4 µl 430 µl

5. S-Nucleophile: N-Acetylcystein präparativer Ansatz atrop-Abyssomicin

N-Acetylcystein Triethylamin Tetrahydro-furan

1 eq 1,5 eq 1 eq 200 µl 300 µl 811 µl 10 ml

6. S-Nucleophile: Mercaptoethanol präparativer Ansatz atrop-Abyssomicin

Mercaptoethanol Triethylamin Tetrahydro-furan

1 eq 1,5 eq 1 eq 200 µl 1070 µl 811 µl 10 ml


63

4.2.7 Testierung der Abyssomicine auf antibiotische Aktivität

Als Testorganismus wurde Bacillus subtilis verwendet, der in Agarplatten eingegossen wurde.

Hierzu wurden 200 ml Minimalmedium-Agar mit 2 ml Sporensuspension angeimpft und

anschließend Petrischalen mit 10 ml des beimpften Agar beschickt.

Die Herstellung der Sporensuspension erfolgte durch Kultivierung von B. subtilis DSM 10 in

DSM 1-Medium (500 ml Erlenmeyerkolben, 3 Schikanen, 100 ml Medium) für 10 d auf der

rotierenden Schüttelmaschine bei 37°C und 120 rpm. Die Kultur wurde abzentrifugiert und

zweimal mit Saline gewaschen, in Saline/Glyerin (1:1) resuspendiert und die OD587 nm auf 1,0

eingestellt.

Es wurden MM1-Testplatten mit und ohne Zusatz von jeweils 5 mM L-Tryptophan (Trp),

L-Phenylalanin (Phe), L-Tyrosin (Tyr) und para-Aminobenzoesäure (pABA) hergestellt. Je

zwei Filterrondelle wurden mit 10 µl des zu testenden Extrakts bzw. der zu testenden

Substanz (meist 1 mg/ml) beträufelt, ½ h getrocknet und auf eine Platte mit

Aminosäurenzusatz, sowie auf eine Platte ohne Aminosäurenzusatz gelegt. Die Platten

wurden anschließend bei 37 °C für 16 h inkubiert.

Als zweite Stufe der antibiotischen Testierung wurden Kreuztests durchgeführt. Auf

MM1-Testplatten wurde je ein Filterstreifen aufgelegt, der zuvor mit 100 µl der zu testenden

Substanz getränkt und danach getrocknet wurde. Von Trp, Phe und pABA wurde jeweils eine

Lösung in sterilem deionisiertem Wasser in einer Konzentration von 5 mg/ml hergestellt. Tyr

wurde in der gleichen Konzentration in 1 mM Ammoniak gelöst. Es wurden Filterstreifen

vorbereitet, die mit den verschiedenen Aminosäurelösungen beträufelt und getrocknet

wurden. Die Filterstreifen mit getränkten Aminosäuren wurden quer über die

substanzgetränkten Filterstreifen gelegt und anschließend bei 37 °C für 16 h inkubiert.

4.3 Molekularbiologische Methoden

4.3.1 Isolierung von chromosomaler DNA aus B. subtilis DSM 10

Die Isolierung der Gesamt-DNA aus B. subtilis erfolgte mit Hilfe von NucleoSpin-Säulchen

(Macherey-Nagel, Düren) nach einem Protokoll von Silke I. Patzer (persönl. Mitteilung). Das

der Isolierung und Reinigung zugrunde liegende Prinzip ist die Affinität der DNA zur

Silicamatrix der Säulchen.

5 ml einer Übernachtkultur in KM1-Medium wurde für 8 min bei 4000 rpm in einer Heraeus

Instruments Megafuge 1,0 R abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Die pelletierten


64

Bakterien wurden in 500 µl SB1-Puffer aufgenommen und 10 µl RNase, 11,5 µl Lysozym

und 14,5 µl Proteinase K zugegeben. Nach 30 min Inkubation bei 37 °C wurden 172 µl

SB2-Puffer zugegeben, gründlich gemischt und für 15 min bei 50 °C inkubiert. Der gesamte

Ansatz wurde auf ein NucleoSpin-Säulchen gegeben und 30 s bei 9000 rpm in der Eppendorf

Centrifuge 5415 C zentrifugiert. Anschließend wurde zuerst mit 500 µl PB-Puffer und dann

mit 750 µl PE-Puffer gewaschen, wobei jeweils 30 s bei 13000 rpm zentrifugiert wurde.

Getrocknet wurde die Säule durch 1 min Zentrifugieren im geleerten Sammelgefäß bei

13000 rpm. Zur Elution wurde 45 µl 40 °C warmer TE-Puffer direkt auf die Matrix pipettiert,

1 min inkubiert und anschließend 1 min bei 14000 rpm zentrifugiert. Die Lagerung der

Gesamt-DNA erfolgte bei 4 °C.

4.3.2 Agarose-Gelelektrophorese

Mit Agarose-Gelelektrophorese wurden die Ergebnisse von DNA-Isolierungen, Polymerase-

kettenreaktionen sowie Restriktionsspaltungen überprüft. Das Laufverhalten der DNA im

elektrischen Feld in der Agarosematrix beruht auf den negativen Ladungen der DNA, die von

der Anode angezogen werden. Die Wandergeschwindigkeit der DNA hängt ab von folgenden

Parametern: Von der Länge der DNA, der Konformation (einzelsträngig, doppelsträngig,

offen zirkulär, supercoiled, linear), der Maschenweite der Agarose sowie der angelegten

Feldstärke. Durch die Agarosekonzentration kann die Maschenweite, d. h. das Laufverhalten

eingestellt werden. Die Größe unbekannter DNA-Fragmente kann – sofern es sich um

linearisierte DNA handelt – durch Vergleich mit linearen Fragmenten definierter Länge,

einem sog. DNA-Längenstandard bestimmt werden. Als Längenmarker wurde hier die TriDye

2-log DNA Ladder (New England Biolabs, Schwalbach) verwendet.

Die elektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten im Agarosegel erfolgte in der

Flachbett-Elektrophoreseapparatur BIO-RAD Mini-Sub Cell GT (Bio-Rad, München) für

30 min bei einer Spannung von 80 V. Die hierzu verwendeten Gele enthielten 0,9 % Agarose

in TAE-Puffer. Durch Inkubation im Ethidiumbromid-Färbebad, wurden die DNA-Banden

nach der Elektrophorese durch langwelliges UV-Licht sichtbar gemacht.

4.3.3 Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die auf Saiki et al. (1988) zurückgehende Polymerasekettenreaktion dient der zyklischen

Amplifizierung von DNA-Abschnitten unter Verwendung einer thermostabilen Polymerase.

Hierzu sind zwei Oligonucleotid-Primer notwendig, die jeweils an einem Ende des zu ampli-


65

fizierenden DNA-Stückes hybridisieren können. Das in dieser Arbeit verwendete pabA-Gen

wurde durch PCR aus dem Gesamtgenom von B. subtilis DSM 10 amplifiziert.

Pro Ansatz wurde in ein PCR-Tube pipettiert:

5 µl 10 x Reaktionspuffer

0,3 µl Gesamt-DNA

1,6 µl dNTP (10 mM)

je 2,5 µl Primer (10 pmol/µl)

0,25 µl Pwo DNA-Polymerase (Roche)

H2Odd ad 50 µl

Für die PCR wurde folgendes Programm eingesetzt:

Reaktion Temperatur Zeit

1. Denaturierung 94 °C 3 min

30 Zyklen:

2. Denaturierung 94 °C 45 s

3. Annealing 54 °C 50 s

4. Polymerisation 72 °C 1 min 20 s

5. Polymerisation 72 °C 10 min

6. Ende 6 °C ∞

4.3.4 Restriktionsverdau, Phosphatase-Reaktionen und Ligationen

Restriktionsverdau, Dephosphorylierung und Ligation wurde bei der jeweils nach

Empfehlung des Herstellers im mitgelieferten Puffer durchgeführt. Bei Bedarf wurden die

Ansätze auf ein Agarosegel aufgetragen und mittels QIAEX II-DNA-Extraktionskit (Qiagen,

Hilden) aufgereinigt.

4.3.5 Reinigung von DNA-Fragmenten

PCR-Produkte, Restriktionsfragmente und Dephosphorylierungsprodukte wurden mit Hilfe

des QIAEX II-DNA-Extraktionskit (Qiagen, Hilden) aus dem Agarosegel entsprechend der


66

Anleitung aufgereinigt. Die Menge des PCR-Produkts wurde anhand von Agarosegelen

abgeschätzt.

4.3.6 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen

Die Herstellung kompetenter Zellen erfolgte nach der von Dagert und Ehrlich (1979)

beschriebenen CaCl2-Methode, die logarithmisch wachsenden E. coli-Zellen die Fähigkeit

verleiht, freie DNA aus dem umgebenden Medium aufzunehmen.

Hierzu wurden 40 ml TY-Medium mit 0,4 ml einer Übernachtkultur des entsprechenden E.

coli-Stammes angeimpft und bei 37 °C unter Schütteln etwa 2 h bis zu einer OD578 von 0,5

inkubiert. Die Bakterien wurden in einem sterilen 50 ml Falcon Tube 10 min auf Eis gestellt

und anschließend in einer auf 4 °C gekühlten Hermle Z383.K Zentrifuge mit Ausschwingrotor

221.08 V01 für 10 min bei 3500 rpm zentrifugiert. Die Bakterien wurden in 20 ml eiskaltem

0,1 M CaCl2 resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert und anschließend erneut bei 4 °C

10 min bei 4300 rpm abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 ml eiskalter CaCl2–Lösung

aufgenommen und weitere 30 min auf Eis gestellt, anschließend sofort zur Transformation

(siehe Absatz 4.3.7) verwendet.

4.3.7 Transformation von kompetenten E. coli-Zellen mit Plasmid-DNA

Die Transformation wurde nach Sambrook und Russel (2001) durchgeführt. Hierzu wurden

zwischen 100 und 250 µl kompetente Zellen mit 5 µl Ligationsansatz bzw. 1 µl Plasmid-

DNA-Lösung versetzt und zunächst 30 min auf Eis gestellt. Anschließend erfolgte der

Hitzeschock für 1,5 min bei 42 °C, dann wurden die Zellen erneut auf Eis gestellt. Der

gesamte Ansatz wurde auf ampicillinhaltigen TY-Platten ausplattiert und über Nacht bei

37 °C inkubiert.

4.3.8 Isolierung von Plasmid-DNA

Die Isolierung von Plasmid-DNA erfolgte unter Verwendung des E.Z.N.A. Plasmid Miniprep

Kit I (PEQLAB Biotechnology GmbH, Erlangen) entsprechend den Angaben des Herstellers.


67

4.4 Proteinchemische Methoden

4.4.1 Induktion und Überexpression

Zur heterologen Expression von Proteinen in E. coli eignen sich besonders solche Systeme,

die eine gezielte Induktion der Expression erlauben. Ein Beispiel ist der hier verwendete pT7-

7-Vektor, in den das zu exprimierende Gen unter der Kontrolle des T7-Promotors eingebracht

wird. Der Expressionswirt E. coli BL21 (DE3) besitzt eine chromosomale Kopie der T7-

RNA-Polymerase unter der Kontrolle des lac-Operators. Durch Zugabe von IPTG lässt sich

die Expression der T7-RNA-Polymerase und somit auch des gewünschten Gens induzieren.

Zunächst wurde die Expression im Testansatz durchgeführt. Hierzu wurden 20 ml ampicillin-

haltiges TY-Medium mit 400 µl einer Übernachtkultur von E. coli BL21(DE3) mit dem

jeweiligen Plasmid angeimpft und die Zellen unter Schütteln bei 37 °C zu einer OD578 von 0,5

wachsen gelassen. Davon wurde 1 ml als Negativkontrolle entnommen, abzentrifugiert und in

50 µl Probenpuffer aufgenommen. Der Rest wurde mit IPTG der Endkonzentration 1 mM

induziert und bei 37 °C weitergeschüttelt. Nach 1, 2, 3 und 4 h wurde jeweils die OD578

gemessen und 1 ml entnommen, abzentrifugiert und in Probenpuffer aufgenommen. Die

Proben wurden über SDS-PAGE analysiert.

Zur Expression des Proteins im größeren Maßstab wurden 250 ml ampicillinhaltiges TY-

Flüssigmedium mit 4 ml Übernachtkultur angeimpft, zu einer OD578 von 0,5 angezogen und

mit IPTG der Endkonzentration 1 mM induziert. Nach 4 h Schütteln bei 37 °C wurden die

Zellen in 50 ml Falcontubes durch Zentrifugieren für 10 min mit der Hermle Z383.K

Zentrifuge mit Ausschwingrotor 221.08 V01 bei 3500 rpm und 4 °C geerntet. Wurden die

Bakterien nicht sofort aufgearbeitet, so wurde das Pellet bei -80 °C aufbewahrt. Vor dem Auf-

schluss der Zellen wurden diese 15 min auf Eis aufgetaut, in 3 ml Lysepuffer aufgenommen

und mit der French Press aufgeschlossen.

4.4.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die Auftrennung der Proteine wurde nach der auf Lugtenberg et al. (1975) zurückgehenden

Methode in einer Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Gelelektrophoresekammer von BIO-

RAD im 12 %igen Trenngel für 30 min bei 15 mA/Gel und 45 min bei 20 mA/Gel

durchgeführt. Hierzu wurden jeweils 20 µl gelöstes Protein aufgetragen, das zuvor in


68

Auftragspuffer aufgenommen und für 3 min bei 95 °C erhitzt wurde. Zur Identifizierung

einzelner Proteinbanden wurden diverse Proteinmarker der Fermentas GmbH (St. Leon-Roth)

eingesetzt. Die Gele wurden mit Färbelösung gefärbt und mit Entfärbelösung entfärbt.

4.4.3 Reinigung von PabA

Zur Reinigung von PabA wurde die Tatsache ausgenutzt, dass sich bei der Überexpression

Proteinaggregate bilden. Die Reinigung erfolgte bei 4 °C im Kühlraum. Nach Aufschluss der

Bakterien in der French Press bei 11000 psi wurde zunächst 15 min bei 600 g und 4 °C

zentrifugiert, um Zelltrümmer abzutrennen. Die im Überstand enthaltenen „Inclusion bodies“

wurden durch 15 min Zentrifugieren bei 7000 g pelletiert und anschließend in Harnstoffpuffer

aufgenommen. Diese Lösung wurde für 10 min bei 4000 g zentrifugiert und der Überstand

zweimal gegen Dialysepuffer dialysiert. Anschließend wurde die bereits stark mit PabA-

angereicherte Probe mittels Anionenaustausch-Chromatographie und Gelfiltration

weitergereinigt.

4.4.4 Reinigung von PabB

Die Reinigung von PabB erfolgte bei 4 °C im Kühlraum. Nach Aufschluss der Bakterien in

der French Press bei 11000 psi wurde zunächst 20 min bei 10000 g und 4 °C zentrifugiert,

um Zelltrümmer abzutrennen. Der Überstand wurde auf eine Ni-NTA-Agarose-Säule

aufgetragen, mit Lysispuffer und Waschpuffer gewaschen und mit Elutionspuffer eluiert. Die

so erhaltenen Proben waren nahezu sauber und wurden nur im Bedarfsfall über Gelfiltration

weitergereinigt.

4.4.5 Proteinbestimmung

4.4.5.1 Proteinbestimmung nach Bradford

Die Proteinbestimmung nach Bradford (1976) beruht auf einer Farbänderung des Farbstoffs

Coomassie von braun nach blau nach Bindung in saurem Medium an Proteine. Die anionische

Form des Farbstoffs wird sowohl durch hydrophobe als auch durch ionische

Wechselwirkungen stabilisiert. Die Verschiebung des Absorptionsmaximums von λ = 465 nm

nach λ =595 nm lässt sich fotometrisch verfolgen.


69

Die Proteinbestimmung nach Bradford erfolgte unter Verwendung des Roti®-Quant Reagenz

(Carl Roth GmbH + Co., Karlsruhe). Die Standard-Verdünnungsreihe wurde entsprechend der

Vorschrift aus einer BSA-Stammlösung (400 µg/ml) hergestellt und umfasste einen

Konzentrationsbereich von 20 µg/ml bis 100 µg/ml. Von den zu bestimmenden

Proteinkonzentrationen wurden verschiedene Verdünnungen hergestellt, wobei meist eine

Verdünnung von 1:20 bis 1:40 ausreichend war. In Mikrotiterplatten wurden je 50 µl Standard

bzw. Probe vorgelegt und mit 200 µl Bradfordreagenz versetzt. Nach 5 min Inkubation wurde

die Absorption bei λ = 595 nm gemessen.

4.4.5.2 Proteinbestimmung durch UV-Absorption

Bei Kenntnis des Extinktionskoeffizienten lässt sich anhand des Lambert-Beerschen Gesetzes

die Konzentration eines Proteins aus seiner Absorption bei λ = 280 nm errechnen:

lcI

IE ⋅⋅=−= 280

0

280 log ε

mit I (Intensität des transmittierten Lichtes), I0 (Intensität des einfallenden Lichtes), c

(Konzentration der absorbierenden Substanz), ε280 (molarer Extinktionskoeffizient bei λ =

280 nm) und l (Weglänge des Lichtes in cm). Der Extinktionskoeffizient der Proteine wurde

auf der Webpage http://www.scripps.edu/~cdputnam/protcalc.html mit dem PROTEIN

CALCULATOR v3.3 berechnet.

4.4.6 GluC-Verdau

Endoproteinase GluC (Staphylococcus aureus Protease V8) ist eine Serinprotease, die

spezifisch C-terminal von Glutamat schneidet. Dadurch entstehen Peptidfragmente, die

massenspektrometrisch analysiert werden können und zur Identifizierung eines Proteins

herangezogen werden können.

Entsprechend dem von der Firma NEB (Schwalbach) empfohlenen Protokoll wurde

Endoproteinase GluC durch Zufügen von 50 µl sterilem LC-MS Wasser rekonstituiert. Da

Endoproteinase GluC in aufgelöstem Zustand auch tiefgefroren rasch autolysiert wird, kann

diese Lösung maximal zwei Wochen verwendet werden, sofern sie bei -80°C gelagert wurde.

Das zu verdauende Protein (in Dialysepuffer) wurde 1:1 mit GluC Reaction Buffer

(50 mM Tris-HCl; 0.5 mM Glu-Glu; pH 8,0) verdünnt. Als gut handhabbar erwies sich ein


70

Probenvolumen von insgesamt 40 µl. Hierzu wurden 2 µl GluC pipettiert, und 16 h bei 25°C

im Eppendorff-Heizblock inkubiert.

4.4.6.1 LC-ESI-MS und LC-ESI-MS/MS-Untersuchung des GluC-Verdaus

Die Detektion und Identifizierung der entstandenen Fragmente des tryptischen Verdaus er-

folgte mittels LC-ESI-MS an einer Agilent 1100 HPLC-Anlage, die mit einem QTRAP 2000 -

Massenspektrometer gekoppelt war. Auf der Chromatographieseite wurde eine Phenomenex

Jupiter-Säule (4u, 300 A, 150 x 1 mm) verwendet. Als mobile Phase dienten Wasser/0,1 %

HCOOH (Laufmittel A) und Acetonitril/0,1 % HCOOH (Laufmittel B). Das

Injektionsvolumen betrug 1 µl. Der verwendete Gradient ist in Tabelle 4-6 dargestellt.

Tabelle 4-6. Gradient zur Analyse des GluC-Verdaus

Zeit [min] Solvent B [%] Flussrate Kapillar-HPLC

0 5 50 µl/min

60 80 50 µl/min

65 100 50 µl/min

4.4.7 Kinetik der ADC-Synthase-Reaktion

Die Schwierigkeit bei der Quantifizierung der Enzymreaktion liegt im geringen strukturellen

Unterschied zwischen Substrat und Produkt. Wie in Abbildung 4-2 dargestellt ist, besteht der

Unterschied darin, dass Chorismat eine OH-Gruppe an C-4 trägt, während 4-Amino-4-

desoxychorismat statt dessen eine NH2-Gruppe an der 4-Position besitzt.

COOHO

COOH

OH

Chorismat

COOHO

COOH

NH2

ADC

NH3

NH3

H2O

H2O

ADC-Synthase

COOHO

COOH

OH

Chorismat

COOHO

COOH

NH2

ADC

NH3

NH3

H2O

H2O

ADC-Synthase

Abbildung 4-2. Biosynthese von 4-Amino-4-desoxychorismat (ADC) aus Chorismat durch das

Enzym ADC-Synthase.


71

Damit fallen einfache Möglichkeiten der Detektion für Enzymassays wie beispielsweise die

Absorptionsspektroskopie weg. Auch einfache gekoppelte Assays sind nicht möglich, da das

entstehende Nebenprodukt Wasser ist. Für das zweite Produkt 4-Amino-4-desoxychorismat

wäre lediglich ein gekoppelter Assay mit der ADC-Lyase möglich. Diese ist jedoch nicht

kommerziell erhältlich. Der Versuch, die ADC-Lyase selbst zu überexprimieren scheiterte

daran, dass das Enzym nicht aktiv war. Die Charakterisierung des Enzyms gestaltete sich

zudem schwierig, da das Substrat dieses Enzyms, ADC, nicht zugänglich ist. Grundlage für

die Kopplung an eine zweite Enzymreaktion ist aber, ein aktives und zudem charakterisiertes

Enzym zu haben. Aus diesem Grunde wurde eine massenspektrometrische MRM-Methode

etabliert, die den Molekülmassenunterschied von 1 Da zwischen Chorismat und ADC

ausnutzt.

4.4.7.1 MRM zur Quantifizierung der Enzymreaktion

Beobachtet wird der Übergang von m/z = 226 zu m/z = 191. Der verwendete Gradient

(Tabelle 4-7) ist ebenso wie die verwendete Säule (Tabelle 4-8) kurz gehalten, da sie lediglich

der Abtrennung von Pufferbestandteilen und Protein dienen. Wegen der Proteine ist es

wichtig, darauf zu achten, dass die Porengröße 300 A beträgt, da es sonst nach wenigen LC-

MS-Läufen zu Verstopfungen der Säule kommt.

Tabelle 4-7. LC-MS Gradient für MRM.

Zeit [min] Solvent B [%] Flussrate [µl/min]

0 5 60

3 50 60

4 5 60

7 5 60


72

Tabelle 4-8. verwendete HPLC-Säulen.

Dimension Säule Sorbent Partikel-

größe

[µm]

Porengröße

[A] Länge

[mm]

ID

[mm]

Part. Nr. Hersteller

Jupiter RP-C18 5 300 50 1 00B-

4053-A0 Phenomenex

Die Herausforderung dieser Experimente bestand ferner darin, die Methode so zu optimieren,

dass Peaks mit maximaler Ionenintensität erhalten wurden. Neben der Optimierung der

Laufmittel (Laufmittel A: Wasser mit 5 mM NH4Formiat und 0,1 % HCOOH; Laufmittel B:

Methanol mit 5 mM NH4Formiat und 0,1 % HCOOH) zur optimalen Unterstützung der

Ionisierung und des Gradienten spielte die Optimierung der massenspektrometrischen

Parameter eine wichtige Rolle. Die wichtigsten Parameter sind in Tabelle 4-9 dargestellt.

Tabelle 4-9. Parameter des Massenspektrometers zum MRM

Polarity: Positive Resolution Q1: Unit Resolution Q3: Unit Intensity Thres.: 0.00 cps Settling Time: 0.0000 msec MR Pause: 5.0070 msec MCA: No Step Size: 0.00 amu Dwell Time 400 msec CUR: 30 IS: 5000 TEM: 200 GS1: 30 GS2: 65 ihe: ON CAD: 5 DP 20 EP 10 CE 20 CXP 2


73

4.4.7.2 Enzymreaktion

Ziel der Kinetik war es, die Art der Interaktion von (atrop-)Abyssomicin C mit PabB zu

untersuchen. Da eine irreversible Hemmung vermutet wurde, basierte der Assay auf einer

Präinkubation des Enzyms mit dem Inhibitor für unterschiedlich lange Zeiten mit

unterschiedlichen Inhibitorkonzentrationen. Die Versuche wurden entsprechend Copeland

durchgeführt. Es zeigte sich, dass folgende Inhibitorkonzentrationen (2.5 mM, 2 mM,

1.5 mM, 1 mM, 0.75 mM, 0,5 mM, 0,25 mM) und folgende Präinkubationszeiten (0 min,

1 min, 2.5 min, 5 min, 10 min) ein geeignetes Zeit- und Konzentrationsfenster abdecken.

Wichtig war, dass (atrop-)Abyssomicin zunächst in DMSO gelöst und mit Wasser verdünnt

wurde (Endkonzentration DMSO 1%), da eine Inkubation des Enzyms mit DMSO alleine

schon zu einem schnellen Aktivitätsverlust führte. Zweiter wichtiger Punkt ist, dass PabB mit

PabA zusammen präinkubiert wurde, da PabB alleine instabil ist: Eine Inkubation von Pab B

mit der Kontrolle (2% DMSO in Wasser) führt zu einem raschen Aktivitätsverlust.

Der Reaktionspuffer setzte sich aus folgenden Reagenzien zusammen: 2 x

Ammoniumsulfatpuffer pH 8,5 (Endkonzentration NH4+ = 100 mM), Chorismat-

Stammlösung (Endkonzentration 1 mM), DTT (Endkonzentration 2 mM), ADC-Synthase

5 µM (Endkonzentration. 0,25 µM), H2OLCMS, atrop-Abyssomicin in 2 % DMSO in Wasser.

Unmittelbar vor Beginn des Versuchs wurden diese Reagenzien in folgender

Zusammensetzung pipettiert:

50 µl AS-Puffer 2x 29,8 µl H2O 0,2 µl DTT 10 µl Chorismat

Der Puffer wurde als Mastermix angesetzt für die geplante Anzahl von Ansätzen und auf Eis

aufbewahrt, da Chorismat nur unter diesen Bedingungen stabil ist. Jeweils exakt 5 min vor

Reaktionsstart wurde ein Aliquot von 90 µl bei 37°C im Thermoblock temperiert, bevor es

zum Präinkubationsmix bestehend aus 5 µl atrop-Abyssomicin und 5 µl ADC-Synthase

gegeben wurde. Da keine kontinuierliche Beobachtung der Reaktion möglich war, musste

sichergestellt werden, dass die Reaktion analysiert wurde, solange noch der lineare Bereich

der Anfangsgeschwindigkeit gewährleistet war. Die Analyse erfolgte über LC-MS, wobei

durch die Chromatographie zugleich auch die Enzymreaktion gestoppt wurde (siehe Abschnitt

4.4.7.1).

Durch den LC-MS-Lauf wurden Peaks in einer Breite von 0,3 min erhalten, die dem MRM

von 226 auf 191 entsprechen. Die Peaks wurden mit der Quantifizierungssoftware


74

Quantitation Wizard im Programm Analyst 1.4.1 anhand des Algorithmus Analyst Classic

integriert. Ein Beispiel für solch einen Peak ist in Abbildung 4-3 dargestellt.

Abbildung 4-3: Chromatogramm des MRM 226/191 mit integriertem ADC-Peak.

Ergebnisse

75

5 Ergebnisse

5.1 Strukturaufklärung neuer Abyssomicine

Die erneute Fermentation von Verrucosispora AB-18-032 und die nachfolgende

Aufreinigung von Abyssomicinen im Rahmen dieser Arbeit führten sowohl zu neuen

Erkenntnissen zu den bisher beschriebenen Abyssomicinen B, C und D als auch zur

Entdeckung weiterer neuer Metabolite.

5.1.1 Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C

Die wohl bedeutsamste Entwicklung auf dem Gebiet der Abyssomicine war die

Entdeckung des von K. C. Nicolaou erstmals beschriebenen atrop-Abyssomicins durch

Totalsynthese im Jahr 2006. Bei Abyssomicin und atrop-Abyssomicin handelt es sich um

Atropisomere, die chromatographisch voneinander getrennt werden können und bei

Raumtemperatur in verschiedenen inerten Lösungsmitteln stabil sind. Der Unterschied

besteht in der Stellung der Doppelbindung zur Ketogruppe, die im Falle des Abyssomicin

C transoid (145°), im Falle des atrop-Abyssomicin C cisoid (26°) ist.

O=C7-C8=C926 °

cisoid

O=C7-C8=C9145 °

transoid


O=C7-C8=C926 °

cisoid

O=C7-C8=C9145 °

transoid


Abbildung 5-1: Röntgenstrukturen von Abyssomicin C (Bister et al., 2004) und atrop-Abyssomicin C(Nicolaou und Harrison, 2006).

Ergebnisse

76

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

500

1000

1500

2000

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

500

1000

1500

2000

Abbildung 5-2: UV-Spektren von Abyssomicin C (links) und atrop-Abyssomicin C (rechts).

In Abbildung 5-2 dargestellt sind die UV-VIS-Spektren von Abyssomicin C und atrop-

Abyssomicin C. Da sich im unter 4.2.4 beschriebenen Standardgradienten die

Retentionszeiten nur um 0,02 min unterscheiden, kann es zu einer Überlagerung der

Spektren kommen, wobei die Summe der beiden Spektren fast genauso aussieht, wie das

Spektrum des atrop-Abyssomicins. Aus diesem Grunde wurde zunächst das Vorliegen

einer zweiten Substanz nicht bemerkt. Deutliche Unterschiede zwischen Abyssomicin C

und atrop-Abyssomicin C finden sich jedoch im NMR. Besonders die Unterschiede bei den 13C-Verschiebungen von C-8 und C-9 sowie der 1H-Verschiebung von CH-9 sind auffällig

(Abbildung 5-3 und Abbildung 5-4). Die Kopplungsmuster in den 2D-Experimenten

(COSY, TOCSY, HMBC) sind identisch. Aufgrund der hohen Ähnlichkeit zwischen

Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C gelang die Strukturaufklärung trotz

Identifizierung eines neuen, der Substanz C ähnlichen Abyssomicins nicht, bevor K.C.

Nicolaou Röntgenstruktur- und NMR-Daten veröffentlichte.

20406080100120140160180200 ppm

17.4

31

8.5

61

9.3

02

6.7

6

34.8

53

9.7

04

4.6

2

51.7

0

68.0

7

82.2

18

5.5

8

107

.31

130

.12

141

.35

171

.93

180

.54

201

.62

204

.66

Abbildung 5-3: 13C-Übersichtsspektrum von atrop-Abyssomicin C in MeOD.

C-7 C-1

C-9 C-11 C-4

C-3 C-16

C-8

C-2

C-12

C-15 C-10 C-14

C-5

C-17 C-19 C-18 C-13

C-6

Ergebnisse

77

MeOD

C7

C13

C19

C17

C18

C5

C11

C2

C10

C14C4

C6

C15

C12

C1

C8 , C 9

C3 C16

MeOD

C7

C13

C19

C17

C18

C5

C11

C2

C10

C14C4

C6

C15

C12

C1

C8 , C 9

C3 C16

Abbildung 5-4: 13C-Übersichtsspektrum von Abyssomicin C. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Bojan Bister aus „Abyssomicin C- ein neues Antibiotikum aus dem marinen Micromonospora-Stamm AB-18-032 als Inhibitor der p-Aminobenzoesäure/Tetrahydrofolat-Biosynthese – Isolierung und Strukturaufklärung“

Da sich atrop-Abyssomicin durch Inkubation mit Säure (z.B. durch präparative HPLC) in

Abyssomicin umwandelt, wurde zunächst nicht bemerkt, dass der Haupt-Metabolit atrop-

Abyssomicin C ist. In antibiotischen Testierungen ist dieses zudem wesentlich aktiver als

Abyssomicin C.

Ergebnisse

78

Tabelle 5-1: 1H und 13C-NMR-chemische Verschiebungen von atrop-Abyssomicin C und Abyssomicin C in MeOD.

atrop-Abyssomicin C Abyssomicin C Nr. 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm] 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm] 1 - 171,5 - 171,5 2 - 106,9 - 104,6 3 - 201,2 - 200,6 4 2,65 44,7 3,50 43,0 5 1,85

1,44 39,2 1,98

1,40 40,1

6 2,50 50,0 2,90 48,1 7 - 204,2 - 206,3 8 6,52 129,8 6,52 135,1 9 6,65 140,3 5,95 135,3 10 3,18 51,1 2,96 49,2 11 4,40 67,6 5,03 73,8 12 4,62 85,1 4,54 86,8 13 2,79 26,7 2,70 25,9 14 2,69

1,45 34,6 2,67

1,25 37,4

15 - 81,8 - 78,9 16 - 180,1 - 187,5 17 1,16 18,8 1,16 19,4 18 1,11 16,9 1,04 17,2 19 1,14 18,0 1,08 21,0

Ergebnisse

79

5.1.2 Abyssomicin B

Da im Rahmen der Dissertation von Herrn Dr. Bojan Bister die Isolierung von

Abyssomicin B nicht endgültig gelang, konnte eine eindeutige Zuordnung der NMR-

Signale damals nicht erfolgen. Da aber Einkristalle erhalten wurden, erfolgte die

Strukturaufklärung mittels Röntgenbeugung. Die Umstellung auf säurefreie Aufarbeitung

im Rahmen dieser Arbeit ermöglichte die problemlose Abtrennung der von Dr. Bojan

Bister als Abyssomicin B’ bezeichneten Komponente und somit eine eindeutige

Zuordnung der NMR-Signale zur von Bister et al. vorgeschlagenen Struktur.

H3C CH3

OO

OO

O

CH3

HO

N

HO

Abyssomicin B

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O

(atrop-)Abyssomicin C

1 2

3

45

6

7

8

9

10

11 12 13

17

16

15 14

1819

1 2

3

45

6

7

8

9

10

11 12 13

17

16

15 14

1819

Abbildung 5-5: Abyssomicin B (links) und C (rechts) im Vergleich.

Während Abyssomicin C als charakteristisches Strukturmerkmal eine Doppelbindung (C-8

und C-9) aufweist, die in Konjugation mit einer Ketogruppe (C-7) steht, enthält

Abyssomicin B an dieser Stelle einen ungewöhnlichen Heterocyclus (Abbildung 5-5). Die

Abwesenheit der Doppelbindung bei Abyssomicin B ist schon auf den ersten Blick im 1H-NMR-Spektrum zu sehen. Die beiden olefinischen Protonen zwischen 6 und 7 ppm des

Abyssomicin C bzw. atrop-Abyssomicin C sind hier nicht vorhanden (Abbildung 5-6).

Die wesentlichen Unterschiede zwischen (atrop-)Abyssomicin C und Abyssomicin B

liegen auch im 13C-NMR-Spektrum (Abbildung 5-7) zumeist im Bereich > 100 ppm: C-7,

das bei (atrop-)Abyssomicin C ein Carbonylkohlenstoff ist, besitzt eine chemische

Verschiebung von etwa 200 ppm, während C-7 im Abyssomicin B mit 116 ppm deutlich

hochfeldverschoben ist. C-8 ist bei (atrop-) Abyssomicin C Teil einer Doppelbindung mit

130 ppm bzw. 135 ppm, während die Verschiebung im Abyssomicin B lediglich 42 ppm

beträgt. C-9 hingegen ist bei Abyssomicin B mit fast 160 ppm tieffeldverschoben im

Vergleich zu 140 bzw. 135 ppm im (atrop-)Abyssomicin C.

Ergebnisse

80

12345 p p m5 4 3 2 1 ppm

H-12

H-11

H-4

H-10

H-8,H-13

H-14

H-17,H-19H-18

H-5

H-14H-6

H-8

12345 p p m5 4 3 2 1 ppm

H-12

H-11

H-4

H-10

H-8,H-13

H-14

H-17,H-19H-18

H-5

H-14H-6

H-8

Abbildung 5-6: 1H-NMR-Übersichtsspektrum von Abyssomicin B in MeOD.

20406080100120140160180 ppm

18

.56

26

.14

34

.55

37

.37

40

.61

42

.48

42

.82

48

.50

48

.67

48

.84

49

.01

49

.18

49

.29

49

.35

49

.52

50

.56

67

.76

78

.89

85

.47

10

4.4

5

11

6.2

9

15

9.2

4

17

1.8

1

18

5.3

5

19

9.8

6

Abbildung 5-7: 13C-NMR-Übersichtsspektrum von Abyssomicin B in MeOD

Die eindeutige Zuordnung der Signale erfolgte über 2D-NMR (Abbildung 5-9), die

entscheidende Information stammt aus dem HMBC-Experiment. Deutlich zu sehen sind in

Abbildung 5-8 die Kontakte von H-11, H-10 und H-8 zu C-9 sowie von H-6 und H-8 zu

C-7. Die anderen NMR-chemischen Verschiebungen von Abyssomicin B und C sind sich

sehr ähnlich, wie aus dem Vergleich von Tabelle 5-1 und Tabelle 5-2 hervorgeht.

C-3 C-16 C-9 C-1 C-2

C-12 C-11

C-15 C-10

C-4

C-5

C-13 C-17 C-18 C-19

C-6

C-7 C-8

Ergebnisse

81

ppm

2.02.22.42.62.83.03.23.43.63.84.04.2 ppm

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

Abbildung 5-8: Ausschnitt aus dem HMBC-Spektrum von Abyssomicin B in MeOD.

H3C CH3

OO

OO

O

CH3

HO

N

HO

1 2

3

4

9

1017

1819

H3C CH3

OO

OO

O

CH3

HO

N

HO

1 2

3

45

6

7

8

9

1017

16

15

1819

H3C CH3

OO

OO

O

CH3

HO

N

HO

1 2

3

4

9

1017

1819

H3C CH3

OO

OO

O

CH3

HO

N

HO

1 2

3

45

6

7

8

9

1017

16

15

1819

H3C CH3

OO

OO

O

CH3

HO

N

HO

1 2

3

45

6

7

8

9

1017

16

15

1819

Abbildung 5-9: H,H-COSY-Kontakte (links) und Korrelationen aus dem HMBC-Spektrum (rechts) des Abyssomicin B

H-8 /C-9 H-8 /C-9 H-10 /C-9 H-11 /C-9

H-6 /C-7

Ergebnisse

82

Tabelle 5-2: 1H und 13C-NMR-chemische Verschiebungen von Abyssomicin B in MeOD und DMSO-d6

Abyssomicin B (MeOD) Abyssomicin B (DMSO-d6) Nr. 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm] 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm] 1 - 172,0 - 169,7 2 - 104,5 - 102,5 3 - 200,2 - 197,1 4 3,36 43,0 3,22 40,9 5 1,32

1,18 40,6 1,19

1,05 39,0

6 1,91 37,4 1,74 35,5 7 - 116,1 7,01 (OH) 114,4 8 2,86

2,26 42,4 2,82

2,00 41,1

9 - 159,1 - 157,3 10 3,16 50,6 3,09 48,7 11 4,21 67,7 4,10

6,25 (OH) 65,9

12 4,81 85,6 4,85 85,5 13 2,83 26,2 2,67 24,1 14 2,67

1,41 34,4 2,64

1,34 32,7

15 - 79,1 - 77,3 16 - 185,3 - 183,7 17 1,14 18,6 1,02 17,8 18 1,05 17,0 0,95 16,7 19 1,08 14,4 0,96 14,2

Ergebnisse

83

5.1.3 Abyssomicin G

Im Rahmen der Aufreinigung von Abyssomicin B konnte auch die in der Dissertation von

Herrn Dr. Bojan Bister als Abyssomicin B’ bezeichnete zweite Komponente isoliert und

strukturaufgeklärt werden.

0%

25%

50%

75%

100%

rel. In

tensity

(%)

0%

25%

50%

75%

100%

rel. In

tensity

(%)

Time, min

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Zeit, min

10%

25%

50%

75%

100%

rel. In

tensity

(%)

0%

25%

50%

75%

100%

rel. In

tensity

(%)

0%

25%

50%

75%

100%

rel. In

tensity

(%)

0%

25%

50%

75%

100%

rel. In

tensity

(%)

Time, min

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Zeit, min

1

Time, min

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Zeit, min

1

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

Abyssomicin GAbyssomicin B

Abbildung 5-10: a) HPLC-DAD-Chromatogramm von Abyssomicin B (Rt = 5,13 min) und B’ (Rt = 5,32 min); b) UV-Spektren von Abyssomicin G (links) und B (rechts).

In Abbildung 5-10a dargestellt ist das HPLC-DAD-Chromatogramm der angereinigten

Abyssomicine B und B’ vor ihrer vollständigen Trennung voneinander. Abbildung 5-10 b

zeigt die UV-Spektren, die sich sehr ähnlich sind, und sich vor allem im Hinblick auf die

Extinktion bei λ = 230 nm unterscheiden. Die Aufreinigung war zunächst gescheitert, was

zu der Annahme geführt hatte, dass es sich bei diesen beiden Substanzen um

Gleichgewichtstautomere ((R)- und (S)-Stereoisomere des Isoxazolins) handeln würde

(Abbildung 5-11).

A

B mAU mAU

Ergebnisse

84

O

N

HO

NHO

NHO

OHO

NO

HO

NO

O O

N

HO(S) (R)

Abyssomicin B Abyssomicin B'

Abbildung 5-11. Ursprüngliche Hypothese zur Struktur von Abyssomicin B’. Die vermuteten Gleichgewichtstautomere des Isoxazolinrings sind in Klammern gefasst (Bojan Bister, 2004)

Diese Hypothese konnte jedoch nicht bestätigt werden, es handelt sich bei Abyssomicin B’

um eine eigenständige Verbindung, und so wurde Abyssomicin B’ in Abyssomicin G

umbenannt.

In Abbildung 5-12 dargestellt ist der extrahierte Ionenstrom von m/z = 378. Im

Massenspektrum beider Peaks deutlich zu erkennen ist das [M+H]+-Signal bei m/z = 378,3

und das um 22 Da zu höheren m/z verschobene [M+Na]+-Signal bei m/z = 400,3. Es

handelt sich also um isobare Verbindungen.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time, min

4,76

5,00

25%

75%

50%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

25%

50%

75%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

m/z

378,4

400,325%

50%

75%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

m/z

378,4

400,3

GB

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

4,76

5,00

25%

75%

50%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Zeit, min

4,76

5,00

25%

75%

50%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

rel. I

nte

nsity

(%)

m/z

378,4

400,325%

50%

75%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

m/z

378,4

400,3

G

[M+Na]+

[M+Na]+

[M+H]+ [M+H]+

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time, min

4,76

5,00

25%

75%

50%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time, min

4,76

5,00

25%

75%

50%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

25%

50%

75%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

m/z

378,4

400,325%

50%

75%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

m/z

378,4

400,325%

50%

75%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

m/z

378,4

400,3

GB

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

4,76

5,00

25%

50%

75%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

m/z

378,4

400,3

GB

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

4,76

5,00

25%

75%

50%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Zeit, min

4,76

5,00

25%25%

75%

50%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Zeit, min

4,76

5,00

25%

75%

50%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

rel. I

nte

nsity

(%)

m/z

378,4

400,325%

50%

75%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

m/z

378,4

400,325%

50%

75%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

m/z

378,4

400,3

G

[M+Na]+

[M+Na]+

[M+H]+ [M+H]+

Abbildung 5-12: LC-MS Chromatogramm / extrahierter Ionenstrom von m/z = 378 des Ethylacetatextrakts. Die Spektren zu den Retentionszeiten 4,76 min (Abyssomicin B) und 5,00 min (Abyssomicin G) sind ebenfalls abgebildet. Beide Substanzen zeigen ein [M+H]+ Signal bei m/z = 378,4 sowie ein [M+Na]+ Signal bei m/z = 400,3.

Ergebnisse

85

Nach erfolgreicher Aufreinigung des Abyssomicin G durch präparative HPLC wurden

hochauflösende Massenspektren mit hoher Messgenauigkeit aufgenommen. Aufgrund der

geringen relativen Messfehler und der exakten Nominalmassen der Metabolite wurden

Analysen zur Ermittlung der Summenformeln durchgeführt. Das Natriumaddukt von

Abyssomicin G zeigte die exakte Molekülmasse von 400.13646 Da. In Abbildung 5-13 ist

der Bereich des [M+Na]+–Signals vergrößert dargestellt.

Ergebnisse

86

397 399 401 403 405 m/z

400.13646

[M+Na]+

1 Da1 Da

397 399 401 403 405 m/z

[M+Na]+

1 Da1 Da

397 399 401 403 405 m/z

400.13646

[M+Na]+

1 Da1 Da

397 399 401 403 405 m/z

[M+Na]+

1 Da1 Da

m/z397 399 401 403 405 m/z

400.13646

[M+Na]+

1 Da1 Da

397 399 401 403 405 m/z

[M+Na]+

1 Da1 Da

397 399 401 403 405 m/z

400.13646

[M+Na]+

1 Da1 Da

397 399 401 403 405 m/z

[M+Na]+

1 Da1 Da

m/z

Abbildung 5-13: ESI-FT-ICR-Massenspektrum von Abyssomicin G.

Aus dieser Messung wurde für Abyssomicin G die Summenformel C19H23NO7

[(M+Na)+theor = 400.13667, ∆m = 0.5 ppm] ermittelt, es handelt sich also wie vermutet um

ein Isomeres von Abyssomicin B. Die weitere Strukturaufklärung basierte auf 2D-NMR-

Spektren. Die NMR-Spektren aus COSY-, TOCSY-, HMQC- und HMBC-Experimenten

weisen eine große Ähnlichkeit zu den Daten des Abyssomicin B auf (Abbildung 5-9,

Abbildung 5-17). Beispielhaft ist in Abbildung 5-14 das HMQC-Spektrum von

Abyssomicin G gezeigt. Die 1J-H-C-Kopplungen von Abyssomicin G sind zugeordnet und

eingezeichnet.. Abweichungen ergeben sich nur im Bereich von C-7 bis C-9. Wichtige

Kontakte aus dem HMQC-Spektrum für die Strukturermittlung sind die der beiden

Methylenprotonen H-8a (3,77 ppm) und H-8b (3,48 ppm) mit C-8 (46,8 ppm).

Ergebnisse

87

ppm

1.01.52.02.53.03.54.04.55.0 ppm

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Abbildung 5-14: HMQC-Spektrum von Abyssomicin G

Der auffälligste Unterschied liegt in der chemischen Verschiebung von C-7, die für

Abyssomicin B bei 116 ppm liegt, während sie im Abyssomicin G 211 ppm beträgt. In

Abbildung 5-15 dargestellt sind die Korrelationen der Protonen H-8a (3,77 ppm), H-8b

(3,48 ppm), H-6 (2,94 ppm) H-5a (1,95 ppm), H-5b (1,40 ppm) und H-19 (1,07 ppm) zu

C-7 (211,3 ppm). Damit liegt die Vermutung nahe, dass es sich bei C-7 des Abyssomicin G

wie auch in Abyssomicin C um den Carbonylkohlenstoff eines Ketons handelt.

Die 1H- und 13C-chemischen Verschiebungen von Abyssomicin G in MeOD sind in

Tabelle 5-3 zusammengefasst, die Struktur, die sich unter Berücksichtigung der FT-ICR-

Messungen und der NMR-Daten für Abyssomicin G ergibt, ist in Abbildung 5-16 im

Vergleich zu Abyssomicin B dargestellt. Es handelt sich bei Abyssomicin G um die

offenkettige Form von Abyssomicin B.

CH-12

CH-11

CH-10

CH-8a CH-4

CH-8b

CH-6

CH-13

CH-14a CH-14b

CH-5a CH-5b

CH-19 CH-17

CH-18

MeOH

tert. BuOH

Ergebnisse

88

ppm

1.01.21.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.8 ppm

210

215

Abbildung 5-15: Ausschnitt aus dem HMBC-Spektrum von Abyssomicin G in MeOD. Abgebildet ist der Bereich von 0,8 - 4 ppm im 1H-NMR-Spektrum und von 205 - 218 ppm des 13C-NMR-Spektrums (Bereich von C-7).

H3C CH3

HO

O

OO

O

CH3

HO

N

O

H3C CH3

OO

OO

O

CH3

HO

N

HO

1 2

3

45

6

7

8

9

10

11 12 13

17

16

15 14

1819

1 2

3

45

6

7

8

9

10

11 12 13

17

16

15 14

1819

Abyssomicin B Abyssomicin G

Abbildung 5-16: Abyssomicin B und G im Vergleich.

H-8a/ C-7 H-8b/ C-7 H-6/ C-7 H-5a/ C-7 H-5b/ C-7

H-19/ C-7

Ergebnisse

89

H3C CH3

HO

O

OO

O

CH3

HO

N

O 1 2

3

8

9

1017

16

15

1819

H3C CH3

HO

O

OO

O

CH3

HO

N

O 1 2

3

45

6

7

8

9

1017

16

15

1819

H3C CH3

HO

O

OO

O

CH3

HO

N

O 1 2

3

8

9

1017

16

15

1819

H3C CH3

HO

O

OO

O

CH3

HO

N

O 1 2

3

45

6

7

8

9

1017

16

15

1819

Abbildung 5-17: H,H-COSY-Kontakte (links) und Korrelationen aus dem HMBC-Spektrum (rechts) des Abyssomicin G.

Tabelle 5-3: 1H- und 13C-NMR-chemische Verschiebungen von Abyssomicin G in MeOD

Nr. 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm] 1 - 172,0 2 - 102,2 3 - 200,0 4 3,58 43,1 5 1,95

1,40 40,9

6 2,94 46,0 7 - 211,3 8 3,77

3,48 46,8

9 - 151,7 10 3,73 47,4 11 4,52 70,4 12 4,64 85,6 13 2,79 26,2 14 2,74

1,21 38,3

15 - 78,1 16 - 187,9 17 1,13 19,0 18 1,04 16,9 19 1,07 21,4

Ergebnisse

90

5.1.4 Abyssomicin H

Eine weitere Verbindung, die im Rahmen dieser Arbeit isoliert und analysiert wurde, ist

Abyssomicin H. In Abbildung 5-18 dargestellt ist das HPLC-DAD-Chromatogramm von

Abyssomicin H sowie sein UV-Spektrum. Auffällig ist die hohe Ähnlichkeit sowohl der

Retentionszeiten der Abyssomicine B, G und H (Abyssomicin B: 5,13 min; Abyssomicin

H: 5,24 min; Abyssomicin G: 5,32 min im Standardgradienten, der in 4.2.4 beschrieben

wurde) als auch der UV/VIS-Spektren. Alle drei Substanzen weisen ein Minimum bei

230 nm und Maxima bei 210 nm bzw. 254 nm auf.

Abbildung 5-18: HPLC-DAD Chromatogramm von Abyssomicin H (Rt = 5,24 min), Abyssomicin B, G und C sowie das UV-Spektrum von Abyssomicin H.

Mit Hilfe von LC-MS konnte die nominale Molekülmasse von Abyssomicin H bestimmt

werden ([M+H]+ m/z = 349). In Abbildung 5-19 dargestellt ist der extrahierte Ionenstrom

von m/z = 349 eines LC-MS-Laufs des Ethylacetatextrakts vom Kulturfiltrat. Es erscheinen

zwei Peaks zu den Retentionszeiten Rt = 5,66 min und 7,15 min. Im Massenspektrum

beider Peaks deutlich zu erkennen ist das [M+H]+-Signal bei m/z = 349, d.h. es handelt sich

also auch hier um zwei isobare Abyssomicine. Bei der mit Rt = 5,66 min eluierenden

Verbindung handelt es sich um das strukturell bisher unbekannte Abyssomicin H, bei der

mit Rt = 7,15 min eluierenden Verbindung um das bereits beschriebene Abyssomicin D.

Mittels ESI-FT-ICR wurden hochauflösende Massenspektren mit hoher Messgenauigkeit

aufgenommen. Abyssomicin G zeigte die exakte Molekülionenmasse von 349.16389 Da,

daraus wurde die Summenformel C19H24O6 [(M+H)+theor = 349.16457, ∆m = 1.9 ppm]

ermittelt.

0%

25%

50%

75%

100%

rel. In

tensity

(%)

0%

25%

50%

75%

100%

rel. In

tensity

(%)

Time, min

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Zeit, min

10%

25%

50%

75%

100%

rel. In

tensity

(%)

0%

25%

50%

75%

100%

rel. In

tensity

(%)

0%

25%

50%

75%

100%

rel. In

tensity

(%)

0%

25%

50%

75%

100%

rel. In

tensity

(%)

Time, min

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Zeit, min

1

Time, min

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Zeit, min

1

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

Ergebnisse

91

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Zeit, min

7,15

5,66

25%

75%

50%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

7,15

5,66

25%

75%

50%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

25%

50%

75%

100%

349,3re

l. I

nte

nsity

(%)

m/z

25%

50%

75%

100%

349,3re

l. I

nte

nsity

(%)

m/z95%

100%

105%

110%

25%

50%

75%

100%349,4

rel. I

nte

nsity

(%)

m/z95%

100%

105%

110%

25%

50%

75%

100%349,4

rel. I

nte

nsity

(%)

m/z

DH[M+H]+ [M+H]+

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Zeit, min

7,15

5,66

25%

75%

50%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

7,15

5,66

25%

75%

50%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

25%

50%

75%

100%

349,3re

l. I

nte

nsity

(%)

m/z

25%

50%

75%

100%

349,3re

l. I

nte

nsity

(%)

m/z95%

100%

105%

110%

25%

50%

75%

100%349,4

rel. I

nte

nsity

(%)

m/z95%

100%

105%

110%

25%

50%

75%

100%349,4

rel. I

nte

nsity

(%)

m/z

DH

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Zeit, min

7,15

5,66

25%

75%

50%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

7,15

5,66

25%

75%

50%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

25%

50%

75%

100%

349,3re

l. I

nte

nsity

(%)

m/z

25%

50%

75%

100%

349,3re

l. I

nte

nsity

(%)

m/z95%

100%

105%

110%

25%

50%

75%

100%

349,3re

l. I

nte

nsity

(%)

m/z

25%

50%

75%

100%

349,3re

l. I

nte

nsity

(%)

m/z95%

100%

105%

110%

25%

50%

75%

100%349,4

rel. I

nte

nsity

(%)

m/z95%

100%

105%

110%

25%

50%

75%

100%349,4

rel. I

nte

nsity

(%)

m/z95%

100%

105%

110%

25%

50%

75%

100%349,4

rel. I

nte

nsity

(%)

m/z

DH[M+H]+ [M+H]+

Abbildung 5-19: LC-MS Chromatogramm (XIC 349) des Ethylacetatextrakts. Die Spektren zu den Retentionszeiten 5,66 min (Abyssomicin H) und 7,15 min (Abyssomicin D) sind ebenfalls abgebildet. Beide Substanzen zeigen ein [M+H]+-Signal bei m/z = 349,4 bzw. 349,3.

Abyssomicin H besitzt somit dieselbe Summenformel wie Abyssomicin D, was die

Vermutung nahe legt, dass es sich um ein Konstitutions- oder Konfigurationsisomeres

handelt. Neben einem deutlichen Unterschied in der Retentionszeit – Abyssomicin D

eluiert wesentlich später auf einer RP-C18 Säule – gleichen die 1D- und 2D-Spektren eher

den Abyssomicinen B, C, G und atrop-Abyssomicin C (Abbildung 5-22).

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ppm

16.57

18.22

18.49

19.35

19.99

24.07

25.98

26.75

32.17

33.15

34.64

34.99

37.03

38.07

38.53

38.96

39.10

39.24

39.38

39.51

39.65

39.79

41.82

43.59

44.36

45.63

45.97

47.88

51.67

65.94

68.80

72.44

75.99

77.87

84.35

99.66

169.37

184.46

197.02

211.54

Abbildung 5-20: 13C-NMR-Übersichtsspektrum von Abyssomicin H in DMSO-d6.

Ergebnisse

92

Der wesentliche Unterschied liegt im Bereich von C-8 und C-9. Während die 1H-chemische Verschiebung bei (atrop-)Abyssomicin C für H-8 6,52 ppm und für H-9 6,65

bzw. 5,95 ppm beträgt, liegt sie beim Abyssomicin H bei 2,60 ppm (H-8) bzw. 2,04 (H-9a)

und 1,80 (H-9b). Auch die Verschiebung im 13C-NMR unterscheidet sich deutlich,

129,8 ppm (C-8 atrop-Abyssomicin) bzw. 135,1 ppm (C-8 Abyssomicin) und 140,3 ppm

(C-9 atrop-Abyssomicin) bzw. 135,3 ppm (C-9 Abyssomicin) stehen 34,8 ppm (C-8) und

19,5 ppm (C-9) beim Abyssomicin H gegenüber (Abbildung 5-3, Abbildung 5-4,

Abbildung 5-20). Während C-8 und C-9 im (atrop-) Abyssomicin C eine Doppelbindung

bilden, sprechen die 13C-NMR-Verschiebungen des Abyssomicin H für Methylengruppen

(Abbildung 5-21).

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O

(atrop-)Abyssomicin C Abyssomicin H

9

8

9

8

Abbildung 5-21: (atrop-) Abyssomicin C und Abyssomicin H im Vergleich.

Ergebnisse

93

Tabelle 5-4: 1H- und 13C-NMR-chemische Verschiebungen von Abyssomicin H in MeOD-d4 und DMSO-d6

Abyssomicin H (MeOD-d4) Abyssomicin H (DMSO-d6) Nr. 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm] 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm] 1 - 172.1 - 169,6 2 - 101.7 - 99,9 3 - 200.2 - 197,3 4 3.33 44.1 3,21 42,0 5 1.99

1.43 40.6 1,80

1,34 38,7

6 2.73 47.6 2,61 745,8 7 - 214.4 - 211,7 8 2.65 36.5 2,60 34,8 9 2.17

1.91 21.0 2,04

1,80 19,5

10 2.24 45.6 2,19 43,8 11 4.44 71.0 4,27 69,0 12 4.55 86.7 4,58 84,5 13 2.67 26.0 2,54 24,2 14 2.60

1.13 39.0 2,57

1,01 37,2

15 - 79.9 - 78,0 16 - 187.0 - 187,7 17 1.11 19.1 1,00 18,6 18 1.08 17.0 1,04 16,3 19 1.04 21.2 0,97 20,1

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O 1 28

9

1017

16

15

1819

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O 1 2

3

45

6

7

8

9

1017

16

15

1819

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O 1 28

9

1017

16

15

1819

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O 1 2

3

45

6

7

8

9

1017

16

15

1819

Abbildung 5-22: H,H-COSY-Kontakte des Abyssomicin H.

Ergebnisse

94

5.1.5 Weitere Abyssomicine

Durch die HPLC-MS-Analyse von Ethylacetatextrakten des Kulturüberstandes konnten

noch weitere Abyssomicinderivate identifiziert werden, die allerdings in so geringen

Mengen vorkamen, dass eine Isolierung und Strukturaufklärung nicht möglich war. Von

einigen dieser Derivate gelang jedoch eine Zuordnung der Struktur auf der Basis von

LC-MS und exakter Massenbestimmung durch FT-ICR-MS sowie chemischen

Umsetzungen im Mikromaßstab. In LC-MS-Läufen des Ethylacetatextraktes fielen bei

genauerem Suchen zwei Molekülmassen auf, von denen vermutet wurde, dass es sich um

ein Aminoaddukt (m/z = 364) und um ein Hydroxyaminoaddukt (m/z = 380) von

Abyssomicin C handelte (Abbildung 5-23).

0%

25%

50%

75%

100%

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Time, min

0%

25%

50%

75%

100%

1

AminoabyssomicinRt= 4,1 min

HydroxylaminoabyssomicinRt= 5,4 min

Time, min

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Time, min

1

rel. I

nte

nsity

(%)

rel. I

nte

nsity

(%)

Time, min

0%

25%

50%

75%

100%

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Zeit, min

0%

25%

50%

75%

100%

1

AminoabyssomicinRt = 4,1 min

HydroxyaminoabyssomicinRt = 5,4 min

Time, min

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Zeit, min

1

rel. I

nte

nsity

(%)

rel. I

nte

nsity

(%)

0%

25%

50%

75%

100%

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Time, min

0%

25%

50%

75%

100%

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Time, min

0%

25%

50%

75%

100%

1

AminoabyssomicinRt= 4,1 min

HydroxylaminoabyssomicinRt= 5,4 min

Time, min

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Time, min

1

rel. I

nte

nsity

(%)

rel. I

nte

nsity

(%)

Time, min

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Time, min

1

rel. I

nte

nsity

(%)

rel. I

nte

nsity

(%)

Time, min

0%

25%

50%

75%

100%

0%

25%

50%

75%

100%

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Zeit, min

0%

25%

50%

75%

100%

1

AminoabyssomicinRt = 4,1 min

HydroxyaminoabyssomicinRt = 5,4 min

Time, min

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Zeit, min

1

rel. I

nte

nsity

(%)

rel. I

nte

nsity

(%)

Abbildung 5-23: HPLC-MS- (oben) und HPLC-DAD- (unten) Chromatogramm des Ethylacetatextrakts des Kulturfiltrats von Verrucosispora AB-18-032. Markiert sind Amino- und Hydroxyaminoabyssomicin mit den Retentionszeiten 4,1 bzw. 5,4 min.

Die beiden Substanzen wurden angereinigt und ihre Molekülmassen mittels ESI-FT-ICR-

MS bestimmt. Für Aminoabyssomicin ergab sich eine exakte Masse von 364.17564 amu,

was einer Summenformel von C19H26NO6 [(M+H)+theor = 364.17546 amu, ∆m = 0.5 ppm]

entspricht, und für Hydroxyaminoabyssomicin ergab sich eine Masse von 380.16994 Da,

was einer Summenformel von C19H26NO7 [(M+H)+theor = 380.17038 amu, ∆m = 1.2 ppm]

entspricht. Daraus ergeben sich vermutlich die in Abbildung 5-24 dargestellten

Strukturformeln für Amino- und Hydroxyaminoabyssomicin.

Ergebnisse

95

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O

H2NHOHN

Abbildung 5-24: Strukturformeln des Hydroxyamino- und des Aminoabyssomicins.

Die Biosynthese von Aminoabyssomicin und Hydroxyaminoabyssomicin wurde durch

Inkubation von atrop-Abyssomicin C mit NH3 und NH2OH in Tetrahydrofuran simuliert.

Hierzu wurde eine Lösung des Nucleophils in Tetrahydrofuran (5,4 µmol) zu einer Lösung

von atrop-Abyssomicin C (0,36 µmol) und Triethylamin (0,36 µmol) im Falle des

Hydroxyamins in 400 µl Tetrahydrofuran gegeben. Der Ansatz wurde 2 h bei 25 °C

geschüttelt und mittels LC-ESI-MS analysiert. Der extrahierte Ionenstrom von

Aminoabyssomicin (m/z = 364) ist in Abbildung 5-25 dargestellt, der von

Hydroxyaminoabyssomicin (m/z = 380) in Abbildung 5-26.

364,3

366,3362,2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Time, min

0%

25%

50%

75%

100%

4,79364,3

366,3362,2

m/z,

364,3

rel. I

nte

nsity

(%)

rel. I

nte

nsity

(%)

25%

50%

75%

100%

0%

364,3

366,3362,2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Time, min

364,3

366,3362,2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Zeit, min

0%

25%

50%

75%

100%

4,79364,3

366,3362,2

m/z

364,3

rel. I

nte

nsity

(%)

rel. I

nte

nsity

(%)

25%

50%

75%

100%

0%

[M+H]+

364,3

366,3362,2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Time, min

0%

25%

50%

75%

100%

4,79364,3

366,3362,2

m/z,

364,3

rel. I

nte

nsity

(%)

rel. I

nte

nsity

(%)

25%

50%

75%

100%

0%

364,3

366,3362,2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Time, min

364,3

366,3362,2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Zeit, min

0%

25%

50%

75%

100%

4,79364,3

366,3362,2

m/z

364,3

rel. I

nte

nsity

(%)

rel. I

nte

nsity

(%)

25%

50%

75%

100%

0%

364,3

366,3362,2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Time, min

364,3

366,3362,2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Time, min

0%

25%

50%

75%

100%

4,79364,3

366,3

0%

25%

50%

75%

100%

4,79364,3

366,3362,2

m/z,

364,3

rel. I

nte

nsity

(%)

rel.

362,2

m/z,

364,3

rel. I

nte

nsity

(%)

rel. I

nte

nsity

(%)

25%

50%

75%

100%

0%

364,3

366,3362,2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Time, min

Inte

nsity

(%)

25%

50%

75%

100%

0%

364,3

366,3362,2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Time, min

364,3

366,3362,2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Zeit, min

364,3

366,3362,2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Zeit, min

0%

25%

50%

75%

100%

4,79

0%

25%

50%

75%

100%

4,79364,3

366,3362,2

m/z

364,3

366,3362,2

m/z

364,3

rel. I

nte

nsity

(%)

rel. I

nte

nsity

(%)

25%

50%

75%

100%

0%

[M+H]+

Abbildung 5-25: Extrahierter Ionenstrom von m/z 364 des synthetisch erzeugten Aminoabyssomicin mit dazugehörigem Massenspektrum. Die Retentionszeit (Rt = 4,1 min) entspricht dem aus dem Kulturfiltrat detektierten Aminoabyssomicin.

Ergebnisse

96

364,3

366,3362,2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Zeit, min

0%

25%

50%

75%

100%

5,35364,3

366,3362,2m/z

380,3re

l. I

nte

nsity

(%)

rel. I

nte

nsity

(%)

25%

50%

75%

100%

0%

[M+H]+

364,3

366,3362,2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Zeit, min

364,3

366,3362,2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Zeit, min

0%

25%

50%

75%

100%

5,35364,3

366,3362,2m/z

380,3re

l. I

nte

nsity

(%)

rel. I

nte

nsity

(%)

25%

50%

75%

100%

0%

[M+H]+

Abbildung 5-26: Extrahierter Ionenstrom von m/z 380 des synthetisch erzeugten Hydroxyaminoabyssomicin mit dazugehörigem Massenspektrum. Die Retentionszeit (Rt = 5,4 min) entspricht dem aus dem Kulturfiltrat detektierten Hydroxyaminoabyssomicin.

Da beide Substanzen hervorragend ionisieren, war eine Detektion problemlos möglich, die

Aufreinigung der chemisch synthetisierten Substanzen, die NMR-Analyse sowie

biologische Testierung scheiterte jedoch an der geringen Ausbeute der Reaktion sowie an

der mangelnden Stabilität bei der präparativen Aufreinigung.

Ein weiteres Abyssomicin-Derivat, das in Kulturfiltraten identifiziert werden konnte, ist

ein Dimer, bestehend aus zwei Abyssomicinen, die über eine NH-O-Bindung miteinander

verbrückt sind (Abbildung 5-27). Die exakte Masse wurde mit 726.31138 amu bestimmt,

was einer Summenformel von C38H48NO13 ([M+H]+theor = 726.31202, ∆m = 0.88 ppm)

entspricht. Eine weitere Strukturaufklärung konnte wie im Fall des Aminoabyssomicin und

Hydroxyaminoabyssomicin in Ermangelung von Substanz nicht durchgeführt werden.

H3C CH3

O O

OO

O

CH3

HO

O

CH3H3C

OO

O O

O

H3C

OH

NH

Abbildung 5-27: Strukturformel des hypothetischen Abyssomicin-Dimers.

.

Ergebnisse

97

5.1.6 Abyssomicin A

In Zusammenarbeit mit Frau Dipl.-Chem. Kathrin Schneider gelang die Strukturaufklärung

von Abyssomicin A. Es zeigte sich, dass Abyssomicin A fälschlicherweise aufgrund seines

UV-Spektrums der Familie der Abyssomicine zugeordnet worden war, in Wirklichkeit

aber einer anderen Substanzklasse angehört. Daher wurde die Substanz umbenannt in

Proximicin C (Abbildung 5-28). Es handelt sich um ein Furan-Analogon von Netropsin

und Distamycin (Abbildung 5-28), Oligopeptid-Antibiotika, deren Wirkmechanismus auf

der Bindung and die kleine Furche der DNA beruht.

H2N NH

HN O

N CH3

HN

O

N CH3HN

O

HN

H2N

HN

H2N O

O

HN

O

OHN

OO

H3C

H2N NH

HN O

N CH3

HN

O

N CH3HN

ON

CH3

HNH

O

Abbildung 5-28: Strukturformel von Netropsin, Distamycin und Proximicin C, vormals Abyssomicin A.

Die Strukturaufklärung und Untersuchung des Wirkmechanismus der Proximicine wird in

Kürze veröffentlicht werden. Eine detaillierte Beschreibung wird in die Dissertation von

Frau Dipl.-Chem. Kathrin Schneider Eingang finden.

5.1.7 Zusammenfassung

Zusätzlich zu den bereits von Dr. Bojan Bister beschriebenen drei Abyssomicinen wurden

im Rahmen dieser Arbeit noch drei weitere Derivate gefunden, sodass derzeit sechs

Abyssomicine spektroskopisch umfassend charakterisiert sind: Abyssomicin B, C, D, G, H

und atrop-Abyssomicin C (Abbildung 5-29). Die charakteristischen analytischen Daten

sind in Tabelle 5-5 zusammengefasst. Eine antibiotische Wirkung weisen nur Abyssomicin

C und atrop-Abyssomicin C auf, letzteres ist stärker antibiotisch aktiv.

Ergebnisse

98

H3C CH3

HO

O

OO

O

CH3

HO

N

O

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O

G

H3CCH3

O

HO

OO

O

CH3

HO

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O

O

atrop-Abyssomicin C

H3C CH3

OO

OO

O

CH3

HO

N

HO

8

9 17

1819

1

16

13

15

C DB

H

Abbildung 5-29: Strukturformeln der bisher spektroskopisch umfassend charakterisierten Abyssomicine B, C, D, G, H und atrop-Abyssomicin C.

Tabelle 5-5: [M+H]+, Summenformel, Retentionszeit auf der Analytischen HPLC sowie die chemischen Verschiebungen von C-8 und C-9 als herausragende Unterscheidungsmerkmale der bisher charakterisierten Abyssomicine.

Substanz [M+H]+

[amu] Summen-formel

Retentionszeit [min]

13C-8, [ppm]

13C-9, [ppm]

Abyssomicin B : 378,2 C19H23NO7 5,13 42,4 159,1 Abyssomicin C : 347,2 C19H22O6 5,64 135,1 135,3 Atrop-Abyssomicin C : 347,2 C19H22O6 5,66 129,8 140,3 Abyssomicin D : 349,2 C19H24O6 6,89 60,2 28,2 Abyssomicin G : 378,2 C19H23NO7 5,32 46,8 151,7 Abyssomicin H : 349,2 C19H24O6 5,24 36,5 21,0 Eine schnelle Unterscheidung der Derivate ist durch HPLC-DAD über die Retentionszeit

in Verbindung mit dem UV/VIS-Spektrum möglich, daher sind in Abbildung 5-30 die

UV-Spektren der Abyssomicine nochmals abgebildet.

Ergebnisse

99

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

500

1000

1500

2000

Abyssomicin C

atrop-Abyssomicin C

450 500

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

nm2 50 300 350 4 00 450 500

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

Abyssomicin B

450 500

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

nm2 50 300 350 4 00 450 500

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

Abyssomicin B

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

Abyssomicin G

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

Abyssomicin G Abyssomicin H

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

Abyssomicin D

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

500

1000

1500

2000

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

500

1000

1500

2000

Abyssomicin C

atrop-Abyssomicin C

450 500

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

nm2 50 300 350 4 00 450 500

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

Abyssomicin B

450 500

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

nm2 50 300 350 4 00 450 500

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

Abyssomicin B

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

Abyssomicin G

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60


nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

Abyssomicin DAbyssomicin C Abyssomicin B Abyssomicin D

Abyssomicin HAbyssomicin GAtrop-Abyssomicin C

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

500

1000

1500

2000

Abyssomicin C

atrop-Abyssomicin C

450 500

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

nm2 50 300 350 4 00 450 500

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

Abyssomicin B

450 500

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

nm2 50 300 350 4 00 450 500

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

Abyssomicin B

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

Abyssomicin G

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60


nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

Abyssomicin D

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

500

1000

1500

2000

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

500

1000

1500

2000

Abyssomicin C

atrop-Abyssomicin C

450 500

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

nm2 50 300 350 4 00 450 500

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

Abyssomicin B

450 500

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

nm2 50 300 350 4 00 450 500

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

Abyssomicin B

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

Abyssomicin G

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60


nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

nm250 300 350 400 450 500

mAU

0

10

20

30

40

50

60

Abyssomicin DAbyssomicin C Abyssomicin B Abyssomicin D

Abyssomicin HAbyssomicin GAtrop-Abyssomicin C

Abbildung 5-30: UV/VIS-Spektren der bisher vollständig charakterisierten Abyssomicine im Vergleich.

Ergebnisse

100

5.2 Untersuchungen zur Biosynthese von atrop-Abyssomicin C

Die Biosynthese der Abyssomicine erfolgt gemäß unserer Hypothese auf dem Polyketid-

Synthase-Weg. Arbeiten zur Aufklärung des Genclusters erfolgen derzeit in der

Arbeitsgruppe durch Frau Mag. rer. nat. Elvira Gottardi und Frau Dipl. Biol. Hanna von

Suchodoletz. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der atrop-

Abyssomicin-Biosynthese durch Fütterung 13C-Isotopen-markierter Substanzen und

anschließender NMR-Analytik der angereicherten Kerne.

5.2.1 Fütterung von 1-13C markiertem Acetat

Naheliegend bei Polyketiden ist die Fütterung von 1-13C-markiertem Acetat. Dieses wurde

erfolgreich eingebaut. Eine deutliche Signalverstärkung wurde für die Kohlenstoffatome

C-1, C-7, C-8, C-11 und C-13 (Abbildung 5-31) beobachtet. Nicht zu sehen sind die

anderen C-Atome des Abyssomicin-Grundgerüsts, die nicht angereichert waren, aufgrund

der kurzen Messzeit.

20406080100120140160180200 ppm

26.2

6

48.3

74

8.5

84

8.7

94

9.0

14

9.2

24

9.4

34

9.6

46

7.5

5

140

.84

171

.44

204

.16

Abbildung 5-31: 13C-NMR-Spektrum von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1-13C-Acetat. Deutlich sichtbar ist die Anreicherung von 13C in C-1 (171,4 ppm), C-7 (204,2 ppm), C-9 (140,8 ppm), C-11 (67,6 ppm) und C-13 (26,3 ppm).

C-7

C-1

C-9 C-11

C-13

Ergebnisse

101

Eine Fütterung von 1-13C-Acetat gibt lediglich Auskunft über die Lage des C-1 des Acetats

(Abbildung 5-32), lässt aber keinerlei Rückschlüsse auf die Orientierung der Acetat-

Einheit im atrop-Abyssomicin zu. Es kann also keine Aussage getroffen werden, ob

beispielsweise C-13 aus derselben Acetateinheit stammt wie C-12, C-14 oder C-17.

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O 1 2

3

45

6

7

8

9

10

11 12 13

17

16

15 14

1819

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O 1 2

3

45

6

7

8

9

10

11 12 13

17

16

15 14

1819

Abbildung 5-32: Einbau von 1-13C-Acetat in atrop-Abyssomicin C

5.2.2 Fütterung von 1,2-13C-markiertem Acetat

Die Aufklärung der Orientierung des Einbaus der Acetateinheit gelang über die Fütterung

von 1,2-13C-markiertem Acetat (Abbildung 5-33). Zu sehen ist einerseits eine

Signalverstärkung von C-1 und C-2 sowie aller C-Atome von C-7 bis C-13. Ein weiteres

auffälliges Merkmal dieses Spektrums ist die Aufspaltung der Signale in Tripletts

(Abbildung 5-34).

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm

26.2

52

6.4

33

1.1

23

4.3

43

9.1

94

4.1

14

8.3

74

9.6

44

9.8

55

0.9

65

1.1

95

1.3

96

7.3

46

7.5

56

7.7

47

8.1

48

1.7

18

4.8

88

5.0

88

5.2

71

06

.44

107

.16

129

.33

129

.60

129

.84

140

.62

140

.84

141

.05

171

.08

171

.80

201

.13

203

.92

204

.17

204

.42

Abbildung 5-33: 13C-NMR-Übersichtsspektrum von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-13C-Acetat.

Ergebnisse

102

Die Ursache für diese Aufspaltung in Tripletts liegt in der Kopplung benachbarter 13C-

Kerne. Das Signal des von Natur aus vorhandenen 13C in den Substanzmolekülen, in die

aus statistischen Gründen kein markiertes Acetat eingebaut wurde, wird flankiert durch

zwei 13C-13C Kopplungssatelliten aus den Substanzmolekülen, in die 1,2-13C-Acetat

eingebaut wurde (Simpson, 1998). Je nach 13C-Anreicherungsgrad kann das Verhältnis der

beiden Satelliten zum natürlich vorhandenen Signal variieren. Die beiden 13C-Atome aus

1,2-13C-Acetat koppeln nur dann miteinander (Abbildung 5-34), sofern das Acetat als

intakte Einheit eingebaut wird. Die Wahrscheinlichkeit, dass zwei 13C-Atome, die nicht aus

der selben Acetateinheit stammen, nach der Biosynthese nebeneinander liegen und

miteinander koppeln, ist trotz der Anreicherung aufgrund der immer noch sehr großen

Isotopenverdünnung nahezu ausgeschlossen. Durch dieses Experiment lässt sich also auch

untersuchen, ob während der Biosynthese eine Acetat-Einheit gespalten wurde. In diesem

Falle würde man nur Signalverstärkung, aber keine Kopplung beobachten. Im Falle des

atrop-Abyssomicins wurden alle 1,2-13C markierten Acetate als vollständige Einheit

eingebaut, und zwar an folgenden Stellen: C-1 und C-2, C-7 und C-8, C-9 und C-10, C-11

und C-12 sowie C-13 und C-17 (Abbildung 5-32).

124126128130132134136138140142144146148 ppm

12

9.3

31

29.6

01

29.8

4

14

0.6

21

40.8

41

41.0

5

Abbildung 5-34: Ausschnitt aus dem 13C-NMR-Spektrum (120 ppm – 150 ppm, C-8 und C-9) von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-13C-Acetat. Gut zu sehen ist die Aufspaltung in Tripletts, bedingt durch die Kopplung der benachbarten 13C-Atome aus der Acetateinheit. Zu beachten ist hier, dass die Kopplung zwischen C-7 und C-8 sowie zwischen C-9 und C-10 erfolgt.

Ergebnisse

103

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O 1 2

3

45

6

7

8

9

10

11 12 13

17

16

15 14

1819

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O 1 2

3

45

6

7

8

9

10

11 12 13

17

16

15 14

1819

Abbildung 5-35: Einbau von 1,2-13C-Acetat in atrop-Abyssomicin C (grün).

5.2.3 Fütterung von 1-13C-markiertem Propionat

Die Vermutung, dass die über Acetatfütterung nicht abgedeckte Nordhälfte des atrop-

Abyssomicins (C-3 – C-6, C-18, C-19) aus Propionateinheiten stammt, wurde durch

Fütterung von 1-13C-Propionat überprüft. Tatsächlich führte dieses Experiment zu einer

Signalverstärkung von C-3 und C-5 (Abbildung 5-36).

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ppm

39.6

9

201

.65

Abbildung 5-36: 13C-NMR-Spektrum von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1-13C-Propionat. Deutlich sichtbar ist die Markierung von C-3 (201,7 ppm) und C-5 (39,7 ppm).

Deutlich erkennbar wird in Abbildung 5-37 damit eine zusammenhängende Kette von C-1

bis C-17, bestehend aus 5 Acetat- und 2 Propionateinheiten, deren Biosynthese auf dem

Polyketidbiosyntheseweg erfolgen muss.

C-3

C-5

Ergebnisse

104

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O 1 2

3

45

6

7

8

9

10

11 12 13

17

16

15 14

1819

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O 1 2

3

45

6

7

8

9

10

11 12 13

17

16

15 14

1819

Abbildung 5-37: Einbau von 1-13C-Propionat (rot, graue Kreise) und 1,2-13C-Acetat (grün, schwarze Quadrate) in atrop-Abyssomicin C

5.2.4 Die C3-Einheit der Tetronsäure

Damit bleiben lediglich drei Kohlenstoffe der Tetronsäureeinheit (C-14, C-15 und C-16)

übrig, die bisher nicht zugeordnet werden können. Ein in der Literatur häufig

beschriebener Vorläufer dieser C3-Einheit der Tetronsäure ist Glycerol. Auch im Falle des

Chlorothricins ist Glycerol der Vorläufer, im Falle des atrop-Abyssomicins wurde Glycerol

jedoch nicht eingebaut. Aufschlüsse über die Herkunft dieser drei Kohlenstoffe ergaben

sich aus der Fütterung von 1,2-13C-markierter Glucose (Abbildung 5-38). Sowohl C-15 als

auch C-14 sind markiert und weisen ein typisches Kopplungsmuster auf. Die Tatsache,

dass es sich um Tripletts handelt (Abbildung 5-39 und Abbildung 5-40), spricht dafür, dass

die Bindung der beiden Kohlenstoffe während der Biosynthese nicht getrennt wurde. Wie

aus Glucose der Vorläufer der C3-Einheit der Tetronsäure biosynthetisiert wird, ist in

Abbildung 5-41 dargestellt. Die Glucose wird auf dem Glycolyseweg abgebaut zu

Phosphoenolpyruvat, aus dem schließlich Enoylpyruvat-S-ACP gebildet wird.

Ergebnisse

105

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm

16

.94

18

.07

18

.61

18

.80

18

.97

26

.08

26

.26

26

.43

34

.15

34

.34

34

.51

39

.20

44

.12

48

.37

48

.58

48

.79

49

.01

49

.22

49

.29

49

.43

49

.65

49

.70

51

.19

51

.39

67

.56

67

.74

81

.72

81

.90

84

.88

85

.08

85

.28

10

6.8

21

29.3

41

29.6

01

29.8

41

40.8

51

71.4

51

80.0

52

01.1

52

04.2

0

Abbildung 5-38: 13C-Übersichtsspektrum von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-13C-Glucose.

7677787980818283 ppm

81.5

38

1.7

28

1.9

0

Abbildung 5-39: Ausschnitt aus dem 13C-NMR-Spektrum (C-15) von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-13C-Glucose. Die Aufspaltung in Tripletts, bedingt durch die Kopplung der benachbarten 13C-15 und 13C-14, beweist, dass hier C-1 und C-2 der Glucoseeinheit eingebaut wurden.

Ergebnisse

106

29303132333435363738 ppm

34.1

53

4.3

43

4.5

1

Abbildung 5-40: Ausschnitt aus dem 13C-NMR-Spektrum (C-14) von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-13C-Glucose. Die Aufspaltung in Tripletts, bedingt durch die Kopplung der benachbarten 13C-15 und 13C-14, beweist, dass hier C-1 und C-2 der Glucoseeinheit eingebaut wurden.

O

H

HO

H

HO

H

H

OHHOH

OH

OH

O

OP

O

OH

SACP

Abbildung 5-41: Biosynthese des Vorläufers der 3-Kohlenstoff-Einheit der Tetronsäure aus Glucose unter Berücksichtigung der 13C-Markierug und deren Verbleib im Vorläufer.

5.2.5 Zusammenfassung

Durch Fütterung von markiertem Acetat, Propionat und Glucose gelang es im Rahmen

dieser Arbeit, die Herkunft aller Kohlenstoffatome von atrop-Abyssomicin C aufzuklären.

C-1, C-2, C-7 bis C-13 sowie C-17 stammen aus Acetat, C-3 bis C-6 sowie C-18 und C-19

stammen aus Propionat und C-14 bis C-16 werden vermutlich über Enoylpyruvat-S-ACP

in atrop-Abyssomicin C eingebaut (Abbildung 5-42).

Ergebnisse

107

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O 1 2

3

45

6

7

8

9

10

11 12 13

17

16

1514

1819

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O 1 2

3

45

6

7

8

9

10

11 12 13

17

16

1514

1819

Abbildung 5-42: Einbau von 1-13C-Propionat (rot, graue Kreise), 1,2-13C-Acetat (grün, schwarze Quadrate) und 1,2-13C-Glucose (blau, gestreifte Fünfecke) in atrop-Abyssomicin C.

Ergebnisse

108

5.3 Überexpression und Aufreinigung der Proteine PabA und PabB

5.3.1 Konstruktion des Plasmids

Das Plasmid zur Überexpression von PabA war im Rahmen der Diplomarbeit des Autors

(Keller, 2003) hergestellt worden. Pab A wird ohne Tag im Plasmid pT7-7 vom

Wirtsstamm E. coli BL21 (DE3) über ein T7-Expressionssystem überexprimiert

(Abbildung 5-43).

B. subtilis

3065 bps

500

1000

1500

2000

2500

3000

pabA

bla

Nucleotidsequenz: ATGATTTTAA TGATTGATAA CTACGATTCA TTCACGTACA ACTTGGTACA GTATTTGGGC

GAGCTTGGGG AAGAGCTGGT TGTGAAACGC AATGACAGCA TCACAATCGA TGAAATTGAA

GAACTGTCTC CGGACTTTCT GATGATATCT CCCGGACCGT GCAGCCCTGA TGAGGCGGGA

ATCAGCCTCG AAGCAATTAA ACATTTCGCA GGGAAAATTC CTATTTTCGG TGTATGTCTC

GGACATCAGT CCATCGCACA AGTGTTCGGT GGTGATGTTG TTAGGGCAGA ACGGCTTATG

CACGGGAAAA CCTCGGATAT CGAGCATGAC GGCAAAACCA TTTTTGAAGG GTTGAAAAAT

CCCCTTGTTG CGACGCGATA CCACTCGCTG ATCGTAAAAC CTGAGACGCT GCCAAGCTGT

TTTACAGTAA CAGCACAAAC GAAAGAAGGA GAAATCATGG CTATTCGCCA CAATGACCTC

CCGATAGAGG GTGTGCAATT TCACCCAGAG TCTATTATGA CCTCCTTTGG GAAAGAAATG

CTCAGAAATT TTATTGAGAC ATATCGCAAG GAAGTTATTG CGTGA

Aminosäuresequenz: MILMIDNYDS FTYNLVQYLG ELGEELVVKR NDSITIDEIE ELSPDFLMIS PGPCSPDEAG

ISLEAIKHFA GKIPIFGVCL GHQSIAQVFG GDVVRAERLM HGKTSDIEHD GKTIFEGLKN

PLVATRYHSL IVKPETLPSC FTVTAQTKEG EIMAIRHNDL PIEGVQFHPE SIMTSFGKEM

LRNFIETYRK EVIA

Abbildung 5-43: Plasmid pT7-7 mit pabA aus B. subtilis. Darunter die Nucleotid- und die Proteinsequenzen.

Auch die Überexpression von PabB wurde mit dem Wirtsstamm E. coli BL21 (DE3) über

ein T7-Expressionssystem durchgeführt. Als Expressionskonstrukt diente das Plasmid

PrSet_6His_PP bei dem das jeweils benötigte Gen unter der Kontrolle des T7-Promotors

steht. Dazu wurde das Plasmid PrSet_6His_PP in der Multiple Cloning Site (MCS) mit

Ergebnisse

109

geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten. PabB wurden über PCR aus der

chromosomalen DNA von B. subtilis DSM 10 amplifiziert.

B. subtilis

4219 bps

1000

2000

3000

4000

BamHI

BamHI

pabB

bla

Nucleotidsequenz: ATGAGAGGAT CGCATCACCA TCACCATCAC CTGGAAGTTC TGTTCCAGGG GCCCGGATCC

GCACAACGCA GACCGGCAGG CAAAAAAATA CCTTTTCAAA AAGACTCATT CTTACAACAA

TTTGAGAAAC TTGCGCAATC CCGGAAACAT CATGTACTTC TCGAAAGTGC AAGAGGCGGC

AGATATAGTA TAGCCGGTCT TGATCCAATT GCGACTGTGA AAGGAAAAGA CGGAATAACT

ACAATTAAGC ATGGTGATGA GATGCTGTTT AAAGAAGGTG ATCCATTACG GGCCTTCCAC

AGCTGGTTTA AAACACTGGA AACAGAAACG AATCATGAGT TCCCTGACTT TCAAGGCGGG

GCAATCGGGT TTCTCAGCTA TGATTACGCA CGGTACATTG AAAATTTTAA AATGCTCTCA

TTAGATGATT TAGAAACACC AGATATTTAT TTTCTTGTTT TTGATGATAT AGCAGTTTAT

GACCATCAAG AAGAGTCTCT ATGGCTGATT ACTCATGTTA ATGGTTCTGA TCAGGAAACA

GCGGATGTGA AGCTATCTGA GTTAGAGCAG ATGTGGTTGA CTGAGCTTCC CGCTGTCACT

TCGCGAGAGA TGAAGCCTGA AACAGCTGGT TCTTTCGCGG CGCCATTTAC CGAGGATGGG

TTCTCACAAG CTGTAGAGAA AATCAAACAA TACATTGCCA GCGGAGATGT GTTTCAAGTC

AATCTATCAA TAAGGCAGTC ACAGTCACTG TCTGTCCACC CATATCAAAT TTACAAAACC

TTGAGAGAAG TAAATCCTTC TCCTTATATG GCGTATTTAG AAACACCTGA TTTCCAAATC

ATTTGCGGAT CGCCTGAACT GCTTGTCAGC AAAAAGGGCA AGCTATTAGA GACGAGACCG

ATTGCGGGCA CCCGTTCCAG AGGGAAAACA AATGAAGAAG ACGAGGCGCT TGCAAACGAA

TTGATACACA ATGAAAAAGA ACGCGCGGAA CATGTCATGC TGGTTGATCT TGAGCGAAAT

GATCTGGGAA GAGTATCACG TTACGGGTCT GTGCGCGTAA ATGAATTCAT GGCAATTGAA

AAATACTCGC ATGTGATGCA CATTGTGTCT AATGTCCAAG GTGAACTGCA GGATGGGTAT

GATGCTGTAG ATATTATTCA TGCTGTGTTT CCCGGAGGAA CCATTACTGG TGCACCGAAA

GTAAGAACGA TGGAAATTAT AGAAGAACTT GAGCCGACAC GCCGAGGGCT TTATACTGGA

TCTATAGGAT GGTTTGGATA TAATCACGAT CTGCAGTTTA ATATCGTCAT TCGAACCATT

TATGCAACCG GAGGGCAGGC ATTTATGCAG TCCGGTGCAG GAGTTGTGAT TGATTCTGTT

CCGAAGCACG AATACAAGGA ATCATTCAAA AAAGCTTTTG CGATGCAAAG AGCATTAGAG

CTGAGCGAAG AAGAGACAAA AATTAGATGA

Aminosäuresequenz: MRGSHHHHHH LEVLFQGPGS MAQRRPAGKK IPFQKDSFLQ QFEKLAQSRK HHVLLESARG

GRYSIAGLDP IATVKGKDGI TTIKHGDEML FKEGDPLRAF HSWFKTLETE TNHEFPDFQG

GAIGFLSYDY ARYIENFKML SLDDLETPDI YFLVFDDIAV YDHQEESLWL ITHVNGSDQE

TADVKLSELE QMWLTELPAV TSREMKPETA GSFAAPFTED GFSQAVEKIK QYIASGDVFQ

VNLSIRQSQS LSVHPYQIYK TLREVNPSPY MAYLETPDFQ IICGSPELLV SKKGKLLETR

PIAGTRSRGK TNEEDEALAN ELIHNEKERA EHVMLVDLER NDLGRVSRYG SVRVNEFMAI

EKYSHVMHIV SNVQGELQDG YDAVDIIHAV FPGGTITGAP KVRTMEIIEE LEPTRRGLYT

GSIGWFGYNH DLQFNIVIRT IYATGGQAFM QSGAGVVIDS VPKHEYKESF KKAFAMQRAL

ELSEEETKIR

Abbildung 5-44: Plasmid PrSet_6His_PP mit pabB aus B. subtilis. Darunter die Nucleotid- und die Proteinsequenz.

Ergebnisse

110

Die Ligation wurde entsprechend dem Protokoll von Abschnitt 4.3.4 durchgeführt. Nach

der Ligation wurden nach dem in Abschnitt 4.3.7 beschriebenen Protokoll kompetente

Zellen des Stamms DH5α mit dem Plasmid transformiert und auf TY/Amp-Platten

ausplattiert. Am nächsten Tag wurden Kolonien gepickt und Übernachtkulturen angeimpft.

Das Plasmid wurde entsprechend der Vorschrift in Abschnitt 4.3.8 aus diesen Kulturen

isoliert. Die Ligation von Vektor und Insert in der gewünschten Orientierung wurde mittels

Restriktionsanalyse überprüft, und die Sequenz mittels Sequenzierung durch die Firma

GATC bestätigt.

5.3.1.1 Expression und Reinigung von PabA

PabA wurde überexprimiert und aufgereinigt wie zuvor in der Diplomarbeit des Autors

(Keller, 2003) beschrieben. Zusätzlich wurde noch Ionenaustauschchromatographie und

Gelfiltration durchgeführt. Das Enzym wurde aliquotiert und bei -80°C in Puffer (50 mM

Tris-HCl pH 8,0; 50 % Glycerin, 1 mM DTT) gelagert. Die Proteinbestimmung, die

sowohl nach Bradford als auch direkt über das Lambert-Beersche Gesetz durchgeführt

wurde, ergab Konzentrationen von etwa 150 µM.

50 kDa

40 kDa

30 kDa

25 kDa

20 kDa

60 kDa

M A

50 kDa

40 kDa

30 kDa

25 kDa

20 kDa

60 kDa

M A

Abbildung 5-45. PabA nach Reinigung. M: Protein Marker; A: gereinigtes PabA, 21,4 kDa.

5.3.1.2 Expression und Reinigung von PabB

Bei PabB erfolgte die Induktion der Hauptkultur bei einer OD578 von etwa 0,5 mittels

IPTG (1mM Endkonzentration) für 4 h bei 37 °C. Danach wurden die Bakterien geerntet

Ergebnisse

111

und bis zur weiteren Aufreinigung bei -80°C eingefroren. Die Bakterien wurden mittels

French-Press aufgeschlossen. Zelltrümmer wurden durch 20-minütige Zentrifugation bei

10.000 g und 4°C abgetrennt. Der Überstand wurde über Ni-NTA-Agarose gereinigt und in

50 mM Tris/HCl pH 8,0, 50 % Glycerin, 1 mM DTT dialysiert, um das im Elutionspuffer

enthaltene Imidazol abzutrennen und um das Protein aufzukonzentrieren. Versuche, den

Dialyseschritt durch eine Kombination aus PD-10-Sephadex Säulchen (zum Abtrennen des

Imidazols) und Vivaspin-Konzentratoren (zur Aufkonzentrierung des Proteins) zu ersetzen

scheiterten daran, dass die Aktivität des Enzyms durch diese Schritte drastisch abnahm. Da

zusätzliche Reinigungsschritte die Enzymaktivität stark verringerten, wurde darauf

verzichtet. Es wurde zudem beobachtet, dass Einfrieren und Auftauen rasch zu einem

Aktivitätsverlust führen, weshalb das Enzym aliquotiert wurde, auf Trockeneis

schockgefroren und bei -80°C in Puffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0; 50 % Glycerin, 1 mM

DTT) gelagert.

M PabB

50 kDa

40 kDa

30 kDa

25 kDa

60 kDa

20 kDa

70 kDa

85 kDa100 kDa

M PabB

50 kDa

40 kDa

30 kDa

25 kDa

60 kDa

20 kDa

70 kDa

85 kDa100 kDa

Abbildung 5-46: PabB nach Reinigung. M: Protein Marker; gereinigtes PabB, 55,5 kDa

5.4 Untersuchungen zum Wirkmechanismus von Abyssomicin

5.4.1 Umsetzung von atrop-Abyssomicin C mit Mercaptoethanol und N-

Acetylcystein

Die Untersuchung des Wirkmechanismus wurde basierend auf drei Säulen durchgeführt:

Zunächst wurde ein einfaches Modellsystem (Mercaptoethanol, N-Acetyl-Cystein)

gewählt, das mit atrop-Abyssomicin C umgesetzt werden sollte, um herauszufinden, ob das

Michaelsystem von Schwefel nucleophil angegriffen wird. Desweiteren sollte eine

Hemmkinetik von atrop-Abyssomicin C mit ADC-Synthase durchgeführt werden.

Schließlich wurde die kovalente Bindung von atrop-Abyssomicin C an PabB untersucht.

Ergebnisse

112

Für die Umsetzung mit den Modellverbindungen wurden je 10 µmol (3,46 mg) atrop-

Abyssomicin C umgesetzt und durch präparative HPLC aufgereinigt. Die so isolierten

Reinsubstanzen wurden über LC-MS und NMR charakterisiert. Zwei mögliche

Reaktionswege sind hier denkbar analog der Reaktion von atrop-Abyssomicin C mit

NaBH4 zu Abyssomicin D und Abyssomicin H (Abbildung 5-47).

H3CCH3

O

HO

OO

O

CH3

HO

H3C CH3

O O

OO

O

CH3

HO

H3C CH3

O O

OO

O

CH3

HO

H3CCH3

O

HO

OO

O

CH3

HO

CysS

H3C CH3

O O

OO

O

CH3

HO

CysS

H3C CH3

O O

OO

O

CH3

HO

a b

Abbildung 5-47: Bildung von Abyssomicin H und D durch Umsatz von atrop-Abyssomicin C mit NaBH4 (oben). Mögliche Bildung zweier N-Acetylcystein-Abyssomicin-Addukte durch a) einfache Michael-Addition oder b) zweifache Michaeladdition.

Es zeigte sich, dass sowohl bei der Reaktion mit Meraptoethanol als auch mit

N-Acetylcystein eine Umlagerung zu einer Abyssomicin D-artigen Struktur stattfand. In

den NMR-Spektren äußerte sich dies unter anderem in charakteristisch unterschiedlichen 13C-NMR-chemischen Verschiebungen von C-3, C-8 und insbesondere C-16. Während die

entsprechenden 13C-NMR-chemischen Verschiebungen bei Abyssomicin H bei 200 ppm

(C-3), 36,5 ppm (C-8) und 187 ppm (C-16) liegen, weist Abyssomicin D Verschiebungen

von 182 ppm (C-3), 60 ppm (C-8) und 86 ppm (C-16) auf. Sowohl das Mercaptoethanol-

Addukt (C-3: 182,1 ppm; C-8: 67,5 ppm; C-16: 86,6 ppm) als auch das N-Acetylcystein-

Addukt (C-3: 182,2 ppm; C-8: 66,8 ppm; C-16: 86,36 ppm) gleichen mehr dem

Abyssomicin D (Abbildung 5-48, Tabelle 5-6).

Ergebnisse

113

H3CCH3

O

HO

OO

O

CH3

HO

H3CCH3

O

HO

OO

O

CH3

HO

H3CCH3

O

HO

OO

O

CH3

HO

S

HO

S

HN

O

HO

O

Abbildung 5-48: Strukturformeln von Abyssomicin D sowie den Mercaptoethanol- und N-Acetylcystein-Addukten von atrop-Abyssomicin C.

ppm

1.01.52.02.53.03.54.04.5 ppm

80

90

Abbildung 5-49: Ausschnitt aus dem HMBC-Spektrum von N-Acetylcystein-Abyssomicin im 13C-Bereich von ca. 75 - 95 ppm mit C-15 (88,0 ppm) und C-16 (86,3 ppm).

Desweiteren wurden aus dem HMBC-Experiment wichtige Informationen gewonnen. In

Abbildung 5-50 dargestellt ist der diesbezüglich interessante Ausschnitt aus dem HMBC-

Spektrum mit C-15 bei 88,0 ppm und C-16 mit 86,3 ppm. Zu sehen sind die Kopplungen

von H-C-8, H-C-10, H-C-12 und H-C-14 zu C-16. Insbesondere die H-C Kopplung von

H-C-8 zu C-16 ist nur bei einer Abyssomicin D-artigen Struktur zu erwarten.

H3CCH3

O

HO

OO

O

CH3

HO

SCys

H3C CH3

HO O

OO

O

CH3

HO

CysS

H3C CH3

O O

OO

O

CH3

HO

CysSH

Abbildung 5-50: Mechanismus der Umsetzung von N-Acetylcystein mit atrop-Abyssomicin C.

Ergebnisse

114

Abbildung 5-50 zeigt den hypothetischen Mechanismus, nach dem die Reaktion von

N-Acetylcystein mit atrop-Abyssomicin C verläuft. An die Michaeladdition der

Thiolgruppe an C-9 von atrop-Abyssomicin C schließt sich eine intramolekulare zweite

Michaeladdition an C-16 als Teil des zweiten Michaelsystems an.

Tabelle 5-6: NMR Daten von Abyssomicin D, dem Abyssomicin-Mercaptoethanol-Addukt und dem Abyssomicin-N-acetylcystein-Addukt (in MeOD-d4, 298 K)

Abyssomicin D Abyssomicin -

Mercaptoethanol-Addukt Abyssomicin -

N-Acetylcystein-Addukt

Nr 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm] 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm] 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm]

1 - 176.0 - n.b. - n.b.

2 - 100.0 - 99.6 - 99.7

3 - 182.0 - 182.1 - 182.2

n.b. (OH) - n.b. (OH) - n.b. (OH) -

4 2.48 41.7 2.48 41.2 2.46 41.8

5 1.67 (a) 34.9 1.67 (a) 34.7 1.67 (a) 34.8

2.83 (b) 2.70 (b) 2.68 (b)

6 2.26 49.7 2.29 48.9 2.26 49.0

7 - 213.7 - 211.4 - 211.2

8 3.56 60.2 3.24 67.5 3.15 66.8

9 1.63 (a) 28.2 3.67 43.9 3.72 44.5

2.21 (b)

10 2.35 49.7 2.47 53.7 2.52 53.4

11 4.15 74.8 4.49 71.0 4.51 70.2

n.b. (OH) n.b. (OH) n.b. (OH)

12 3.63 78.3 3.67 78.4 3.66 77.9

13 2.49 26.0 2.59 26.0 2.53 26.0

14 1.06 (a) 33.6 1.09 (a) 33.6 1.03 (a) 33.6

2.36 (b) 2.35 (b) 2.32 (b)

15 - 89.1 - 88.4 - 88.0

16 - 86.1 - 86.6 - 86.3

17 1.02 19.2 1.02 18.8 1.00 19.2

18 1.36 20.1 1.34 19.8 1.33 20.2

19 1.09 19.6 1.08 18.7 1.05 19.1

20 - - 2.70 35.8 2.97 35.5

- - 3.09

21 - - 3.68 62.6 4.51 55.9

22 - - - - - 175.9

23 - - - - - 172.8

24 - - - - 2.00 22.6

n.b. = nicht bestimmt

Ergebnisse

115

5.4.2 Umsetzung von atrop-Abyssomicin C mit PabB

Die kovalente Bindung von atrop-Abyssomicin C an PabB wurde untersucht, indem atrop-

Abyssomicin C mit PabB inkubiert wurde, nicht gebundenes atrop-Abyssomicin C

sorgfältig abgetrennt und das Enzym mit Endoproteinase GluC verdaut wurde. Die aus

dem Verdau resultierenden Peptide wurden per LC-MS und LC-MSMS analysiert und mit

einer Probe von verdautem PabB (ohne atrop-Abyssomicin) verglichen. Bei der mit atrop-

Abyssomicin inkubierten Probe zeigte sich ein zusätzliches Peptid von m/z 827, das in der

unbehandelten Probe nicht detektiert wurde (Abbildung 5-51).

20,10

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Time, min

31,10

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Time, min

0%

25%

50%

75%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

0%

25%

50%

75%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

20,10

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Zeit, min

31,10

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Zeit, min

0%

25%

50%

75%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

0%

25%

50%

75%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

20,10

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Time, min

20,10

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Time, min

31,10

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Time, min

0%

25%

50%

75%

100%

31,10

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Time, min

0%

25%

50%

75%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

0%

25%

50%

75%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

20,10

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Zeit, min

rel. I

nte

nsity

(%)

0%

25%

50%

75%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

20,10

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Zeit, min

31,10

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Zeit, min

31,10

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Zeit, min

0%

25%

50%

75%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

0%

25%

50%

75%

100%

rel. I

nte

nsity

(%)

Abbildung 5-51: HPLC-MS-Chromatogramm der Peptide aus dem GluC-Verdau von PabB (oben) und PabB + atrop-Abyssomicin C (unten). Mit dem Pfeil markiert ist das zusätzlich auftretende Peptid von m/z 827 bei der Retentionszeit Rt = 31 min.

Dieses Peptid wurde anhand eines MS/MS-Experiments sequenziert, und das in Abbildung

5-52 dargestellte Fragmentionenspektrum erhalten. Anhand der b- und der y-Serie ließ sich

zeigen, dass es sich um das Peptid 256TPDFQIICGSPE handelt, das am Cystein atrop-

Abyssomicin gebunden hat. Dass atrop-Abyssomicin am 263Cys gebunden hat, beweisen

sowohl die beiden Fragmente b7 (m/z = 815,5) und b8 (1264,4) als auch die Fragmente y4

(m/z = 389,2) und y5 (m/z = 838,2) der y-Serie, deren Massendifferenz jeweils 449 berträgt,

was der Masse von Cystein und atrop-Abyssomicin entspricht. Unter geeigneten

Inkubationsbedingungen (5 min, 500 µM atrop-Abyssomicin) wurde keine Bindung an

Lysin, Serin oder Threoninreste beobachtet, wurde jedoch mehr atrop-Abyssomicin

Ergebnisse

116

(2 mM) eingesetzt und länger inkubiert (2 h), so konnte auch eine Bindung an Lysinreste

festgestellt werden.

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400

702,3

589,3 815,6

838,3

1408,6827,0 951,4

389,2

1264,51321,6

rel. In

tensity

(%)

100

50

0

m/z

[M+2H]2+ b10

b8

b6

b7

y5

y6

b9

y4

T P D F Q I I C G S P E

b10

y6

b9b8b7b6

y5

b5 b5

y4

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400

702,3

589,3 815,6

838,3

1408,6827,0 951,4

389,2

1264,51321,6

rel. In

tensity

(%)

100

50

0

m/z

[M+2H]2+ b10

b8

b6

b7

y5

y6

b9

y4


b10

y6

b9b8b7b6

y5

b5 b5

y4

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400

702,3

589,3 815,6

838,3

1408,6827,0 951,4

389,2

1264,51321,6

rel. In

tensity

(%)

100

50

0

m/z

[M+2H]2+ b10

b8

b6

b7

y5

y6

b9

y4


b10

y6

b9b8b7b6

y5

b5 b5

y4

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400

702,3

589,3 815,6

838,3

1408,6827,0 951,4

389,2

1264,51321,6

rel. In

tensity

(%)

100

50

0

m/z

[M+2H]2+ b10

b8

b6

b7

y5

y6

b9

y4


b10

y6

b9b8b7b6

y5

b5 b5

y4

Abbildung 5-52: MS/MS-Spektrum des atrop-AbyssomicinC-Adduktpeptids m/z 827.

5.4.3 Hemmkinetik von ADC-Synthase mit atrop-Abyssomicin C

5.4.3.1 Enzymkinetische Charakterisierung der ADC-Synthase

Bevor mit der Hemmkinetik begonnen werden konnte, musste der PabA-PabB-

Enzymkomplex zunächst enzymkinetisch charakterisiert werden. Literaturbekannt war bis

zu diesem Zeitpunkt nur das homologe E. coli-Enzym (Vishwanathan et al., 1995; Nichols

et al., 1989; Ye et al., 1990; Parsons et al., 2002), das Enzym aus B. subtilis wurde im

Rahmen dieser Arbeit erstmals kloniert, überexprimiert und enzymkinetisch untersucht.

Zunächst wurde die pH- und die Temperaturabhängigkeit von PabA-PabB charakterisiert.

Es ergab sich ein pH-Optimum von 8,5 und ein Temperaturoptimum um 40°C (Abbildung

5-53). Daher wurden alle folgenden Versuche bei pH 8,5 und der physiologisch relevanten

Temperatur 37°C, bei der auch die antibakteriellen Test mit B. subtilis stattgefunden

hatten, durchgeführt.

Ergebnisse

117

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40 50 60 70

Temperatur, °C

Akti

vit

ät,

%

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

5,0 7,0 9,0 11,0 13,0

pH-Wert

Akti

vit

ät,

%

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40 50 60 70

Temperatur, °C

Akti

vit

ät,

%

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

5,0 7,0 9,0 11,0 13,0

pH-Wert

Akti

vit

ät,

%

Abbildung 5-53: pH-Wert- und Temperaturabhängigkeit der ADC-Synthase.

Die Bestimmung der wichtigen Parameter KM und kcat erwies sich als schwierig, da es

nicht möglich war, Aminodesoxychorismat in ausreichender Menge als Reinsubstanz zu

erhalten, so dass keine Kalibriergerade erstellt werden konnte. Für die Bestimmung von

KM spielt dies keine Rolle, für die Bestimmung von kcat ist dies jedoch eine essenzielle

Voraussetzung.

0 2 4 6 8 10

0

2000

4000

6000

8000

10000

v,

AU

C/m

in

[Chorismat], mM

0 2 4 6 8 10

0

2000

4000

6000

8000

10000

v,

AU

C/m

in

[Chorismat], mM Abbildung 5-54: Bestimmung des KM-Wertes der ADC-Synthase.

Ergebnisse

118

0

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

0,007

0,008

0 2 4 6 8 10 12 14

1/[Chorismat], 1/mM

1/V

, m

in/A

UC

0

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

0,007

0,008

0 2 4 6 8 10 12 14

1/[Chorismat], 1/mM

1/V

, m

in/A

UC

Abbildung 5-55: Lineweaver-Burk Plot der Michaelis-Menten-Kinetik der ADC-Synthase.

Die Quantifizierung erfolgte also relativ in AUC/min, was der Zunahme der Fläche unter

der Kurve des MRM in Abhängigkeit von der Reaktionszeit entspricht (Tabelle 5-7). Die

so ermittelten Werte wurden gegen die Chorismatkonzentration (in mM) aufgetragen, und

die Werte entsprechend den gängigen Konventionen direkt an die Michaelis-Menten-

Kurve (least square) gefittet. Ein Lineweaver-Burk-Plot der Daten ist in Abbildung 5-55

dargestellt, auf eine Ermittlung der Konstanten aus dieser Darstellungsweise musste

verzichtet werden, da kein Programm zur Verfügung stand, mit dem eine korrekte

Gewichtung der Messpunkte unter Beachtung des Einflusses der zum Zwecke der

Linearisierung durchgeführten mathematischen Transformation möglich war. Ein sog.

einfacher Linear Fit ist bei reziproker Auftragsweise nicht zulässig (Copeland, 2000). Der

erhaltene KM-Wert der ADC-Synthase von B. subtilis für Chorismat bei der

ammoniumabhängigen Reaktion von etwa 6 mM scheint (Abbildung 5-54) unrealistisch

hoch zu sein.

Tabelle 5-7: Rohdaten der KM-Bestimmung als AUC (area under the curve) aus LC-MS Messungen.

AUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC

Zeit t, min

0,078 mM

0,156 mM

0,313 mM

0,625 mM

1,25 mM 2,5 mM 5 mM 10 mM

0,00 0 358 1050 1300 2420 3390 6820 7020

8,08 1120 3240 9320 13800 26900 43900 59800 96600

16,17 2430 5410 13000 23700 36300 71100 129000 160000

24,25 3510 7250 16700 32100 51000 115000 167000 227000

32,33 4200 8030 - 38600 72400 137000 181000 308000

40,42 4190 7920 20800 41600 74400 146000 199000 354000

48,50 4160 7780 19500 46600 81800 160000 247000 345000

Ergebnisse

119

5.4.3.2 Hemmkinetik

Die Hemmkinetik von atrop-Abyssomicin C und ADC-Synthase wurde bei pH 8,5 und

37°C mit einer konstanten Konzentration von Chorismat (1 mM) und Ammoniumsulfat

(200 mM) durchgeführt. Es wurde nur die PabB-Aktivität (Umsetzung von Chorismat und

NH4+ zu ADC) betrachtet. PabA musste jedoch auch zum Präinkubationsmix dazugegeben

werden, da eine Inkubation von PabB alleine mit der Kontrolle (1 % DMSO in Wasser) zu

einem raschen Aktivitätsverlust führte (ca. 20 % Aktivitätsverlust / min). PabA übt einen

stabilisierenden Effekt auf PabB aus, so dass eine Inkubation mit der Kontrolle (1 %

DMSO in Wasser) nicht mehr zu einem Aktivitätsverlust führte. Auch eine Inkubation von

PabA mit der Kontrolle (1 % DMSO in Wasser) resultierte nicht in einem

Aktivitätsverlust. Zunächst wurde überprüft, welchen Effekt die Inkubation von atrop-

Abyssomicin C mit PabA alleine auf die Aktivität von PabB zeigte (Kontrolle). Wie

erwartet führte eine Inkubation von PabA alleine mit atrop-Abyssomicin C nicht zu einem

Verlust der PabB-Aktivität. Die Inkubation des vorgebildeten ADC-Synthase-Komplexes

(PabA und PabB) mit atrop-Abyssomicin C führte hingegen zu einer zeitabhängigen

Abnahme der Enzymaktivität. Eine Serie von Experimenten bei variierender

Inhibitorkonzentration (50 bis 500 µM) und konstanter Enzymkonzentration (5 µM) wurde

mit verschiedenen Präinkubationszeiten (0 min - 10 min) gemessen. Die Restaktivität

wurde bestimmt durch Quantifizierung der ADC Bildung via MRM. In Abbildung 5-56

dargestellt ist der zeit- und konzentrationsabhängige Verlust der Enzymaktivität durch

Inkubation mit atrop-Abyssomicin C.

Ergebnisse

120

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

0 5 10 15

Zeit, min

Re

sta

kti

vit

ät

AD

C S

yn

tha

se

500 µM

400 µM

300 µM

200 µM

100 µM

50 µM

Abbildung 5-56: Enzyminaktivierung der ADC-Synthase durch atrop-Abyssomicin in Abhängigkeit von der Präinkubationszeit und der Inhibitorkonzentration.

Wird die Geschwindigkeitskonstante für die Enzyminaktivierung kobs gegen die

Inhibtitorkonzentration aufgetragen, so erhält man entsprechend Gleichung 2 die für

irreversible Inhibitoren typische hyperbole Kurve (Abbildung 5-57). Aus dieser Kurve

lassen sich die Inhibitionskonstanten grob abschätzen, appiK liegt bei etwa 390 µM und

kinact bei 0,8 min-1.

0 100 200 300 400 500

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

kob

s

[atrop-Abyssomicin C], µM

Ergebnisse

121

Abbildung 5-57: Plot der Geschwindigkeitskonstante kobs gegen die Inhibitorkonzentration.

Tabelle 5-8: Rohdaten der Inhibitionskinetik.

0,5 mM atrop-Abyssomicin C Zeit [min] Reaktionszeit

[min] AUC AUC/min %

0 4,78 1,98E+04 4139 100,0 1 4,77 1,14E+04 2392 57,8 2,5 4,75 7,34E+03 1545 37,3 5 4,98 5,37E+03 1078 26,0 10 4,70 3,18E+03 677 16,3 20 4,67 2,53E+03 542 13,1


[min] AUC AUC/min %

0 4,88 2,19E+04 4485 100,0 1 4,77 1,24E+04 2601 58,0 2,5 4,87 8,02E+03 1648 36,7 5 5,35 6,57E+03 1228 27,4 10 4,60 4,22E+03 917 20,5 20 4,60 3,48E+03 757 16,9

Ergebnisse

122


[min] AUC AUC/min %

0 4,78 2,21E+04 4620 100,0 1 4,93 1,45E+04 2939 63,6 2,5 4,73 8,69E+03 1836 39,7 5 4,77 6,08E+03 1276 27,6 10 4,83 4,88E+03 1010 21,9 20 4,80 3,55E+03 740 16,0


[min] AUC AUC/min %

0 4,85 2,44E+04 5031 100,0 1 4,82 1,59E+04 3301 65,6 2,5 4,97 1,27E+04 2557 50,8 5 4,80 9,57E+03 1994 39,6 10 4,85 7,24E+03 1493 29,7 20 4,88 6,50E+03 1331 26,5


[min] AUC AUC/min %

0 4,88 2,32E+04 4751 100,0 1 4,88 1,95E+04 3993 84,1 2,5 4,83 1,61E+04 3331 70,1 5 5,05 1,44E+04 2851 60,0 10 4,95 1,37E+04 2768 58,3 20 5,13 1,38E+04 2688 56,6


[min] AUC AUC/min %

0 4,00 1,55E+04 3875 100,0 1 4,58 1,67E+04 3644 94,0 2,5 4,37 1,52E+04 3481 89,8 5 7,20 2,43E+04 3375 87,1 10 3,87 1,28E+04 3310 85,4 20 4,58 1,47E+04 3207 82,8

Diskussion

123

6 Diskussion

6.1 neue Abyssomicine

6.1.1 Abyssomicin B und G

Abyssomicin G (Abbildung 5-16) ist ein Strukturanaloges des Abyssomicin B, das jedoch

keinen Isoxazolinring besitzt. Abyssomicin G ist stabil in DMSO und lagert sich entgegen der

Erwartung einer begünstigten Fünfringbildung nicht spontan in die korrespondierende

Halbacetalform von Abyssomicin B um. Die Biosynthese von Abyssomicin B und G verläuft

vermutlich über die Addition von Ammoniak an (atrop-)Abyssomicin C zu Amino-

Abyssomicin. Eine dem Amino-Abyssomicin C entsprechende Molekülmasse konnte mit

LC-MS und FT-ICR-MS im Kulturfiltrat (Ethylacetatextrakt) nachgewiesen werden.

Anschließend ist eine Oxidation des Amino-Abyssomicin durch eine Monooxygenase zu

Hydroxyamino-Abyssomicin, dessen Molekülmasse ebenfalls nachgewiesen werden konnte,

denkbar (Abbildung 6-1). Alternativ könnte auch direkt Hydroxylamin an (atrop-

)Abyssomicin C addiert werden, wenngleich diese Möglichkeit weniger wahrscheinlich

scheint, da in umfangreichen Literaturrecherchen keine Hinweise auf ein Vorkommen von

Hydroxylamin in Zellen gefunden werden konnten.

H3C CH3

HO

O

OO

O

CH3

HO

NH

O

H3C CH3

OO

OO

O

CH3

HO

N

HO

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O

NH2

OH

H3C CH3

HO

O

OO

O

CH3

HO

N

O

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O

NH3

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

H2N

O

B)

A)

Cyp

Cyp

Abssomicin C

Abssomicin G Abssomicin B

Abbildung 6-1. Hypothese zur Biosynthese von Abyssomicin G und B durch Michaeladdition von Ammoniak und anschließender Oxidation, vermutlich durch eine Monooxygenase (Weg A) oder alternativ durch Michaeladdition von Hydroxylamin (Weg B) an Abyssomicin C / atrop-Abyssomicin C.

N-oxidierte Naturstoffe werden häufig durch Flavinmonooxygenasen über ein

Hydroxylamino-Intermediat biosynthetisiert (Thariath et al., 1993; Parry et al., 1997).

Diskussion

124

Alternativ denkbar wäre auch eine N-Oxidation mit darauffolgender Oximbildung analog der

Biosynthese von Nocardicin A, die von Kelly und Townsend 2003 beschrieben wurde und

durch ein Cytochrom P450-Enzym vermittelt wird. Kelly und Townsend schlagen vor, dass

der Stickstoff sukzessive zweifach hydroxyliert wird, dann zu einer Nitrosoverbindung

dehydratisiert wird und schließlich zum Oxim tautomerisiert (Abbildung 6-2). Da

Stickstoffoxidationen durch Cytochrom P450-Enzyme ungewöhnlich sind, ist der detaillierte

Katalysemechanismus bisher noch nicht sehr gut verstanden.

R R'

NH2

R R'

HNOH

R R'

NOHHO

R R'

NO

R R'

NOH

Abbildung 6-2: Von Kelly und Townsend (2002) vorgeschlagener Biosyntheseweg für ein N-Oxim durch Oxidation mit Cytochrom P450-Enzymen.

6.1.2 Abyssomicin D und H

Abyssomicin D und H (Abbildung 6-3) sind Metabolite, die möglicherweise durch die

Addition eines Hydridionenäquivalents, beispielsweise aus NADPH, entstehen. Im Falle des

Abyssomicin H findet eine einfache Michaeladdition statt, während für Abyssomicin D eine

transannulare intramolekulare Michaeladdition (Bister et al., 2004) vorgeschlagen wurde

(Abbildung 6-3). Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden Abyssomicin C und atrop-

Abyssomicin C modellhaft mit NaBH4 in THF inkubiert und die Reaktion via LC-MS

analysiert. Es konnten sowohl Abyssomicin H als auch Abyssomicin D detektiert werden.

Interessanterweise ist Abyssomicin H, das bis auf die Abwesenheit des Michaelsystems

strukturell identisch mit (atrop-)Abyssomicin C ist, komplett inaktiv in antibakteriellen

Testierungen.

Diskussion

125

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O

H3CCH3

O

HO

OO

O

CH3

HO

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O

H

H

A)

B)

(atrop-)Abyssomicin C

Abyssomicin D

Abyssomicin H

Abbildung 6-3: Hypothese zur Biosynthese der Abyssomicine D und H. Durch einfache Michaeladdition eines Hydrogenäquivalents (vermutlich NADPH) an Abyssomicin C / atrop-Abyssomicin C entsteht Abyssomicin H (Weg B), im Falle von Abyssomicin D schließt sich eine Umlagerung an (Weg H).

6.1.3 Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C

Die Entdeckung von atrop-Abyssomicin C in bakteriellen Kulturfiltraten von Verrucosispora

sowie unabhängig davon durch Totalsynthese (Nicolaou und Harrison, 2006) lieferte die

Grundlage für sämtliche im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Experimente. Der

Unterschied liegt zunächst in der stärkeren antibiotischen Aktivität des atrop-Abyssomicin C

im Vergleich zu Abyssomicin C (Nicolaou und Harrison, 2006). Strukturell unterscheiden

sich Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C in der Stellung der Doppelbindung zur

Ketogruppe, die im Falle des Abyssomicin C transoid (145°), im Falle des atrop-Abyssomicin

C cisoid (26°) ist (Nicolaou und Harrison, 2006). Eine Überlagerung der Röntgenstrukturen

von atrop-Abyssomicin C und Abyssomicin C ist in Abbildung 6-4 dargestellt (Nicolaou und

Harrison, 2006). Zu sehen ist, dass durch die veränderte Stellung der Doppelbindung zur

Ketogruppe auch die Methylgruppen C-18 und C-19 beeinflusst werden.

Diskussion

126

Abbildung 6-4: Überlagerung der Röntgenstrukturen von atrop-Abyssomicin C (gelb) und Abyssomicin C (blau). Quelle: Nicolaou und Harrison, 2007.

Hierin begründet liegt auch eine Erklärung für die stärkere antibiotische Aktivität von atrop-

Abyssomicin C: Durch die Konjugation der Doppelbindung und der Carbonylgruppe beim

atrop-Abyssomicin C erhöht ist, handelt es sich bei atrop-Abyssomicin C um einen stärkeren

Michael-Akzeptor (Nicolaou und Harrison, 2006). Aus diesem Grunde wurde das

antibakteriell aktivere atrop-Abyssomicin C zur Untersuchung des Wirkmechanismus

ausgewählt. Zudem wurde die Aufklärung der Biosynthese durch Fütterungsexperimente erst

möglich durch die Zuordnung der NMR-Signale, da es sich bei atrop-Abyssomicin C um den

Hauptmetaboliten handelt. Bei allen im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Kultivierungen

von Verrucosispora AB-18-032 konnte kein Abyssomicin C isoliert werden, sondern

ausschließlich atrop-Abyssomicin C. Da im Laufe der Arbeit festgestellt wurde, dass sich

atrop-Abyssomicin C durch Kontakt mit Säure in Abyssomicin C umwandelt, darf vermutet

werden, dass in den Arbeiten von Bister et al. (2004) durch präparative Aufreinigung mit

säurehaltigen Lösungsmitteln Abyssomicin C aus dem ursprünglich gebildeten atrop-

Abyssomicin C entstand. Die säurekatalysierte Umwandlung von Abyssomicin C in atrop-

Abyssomicin C wurde 2007 von Nicolaou und Harrison systematisch untersucht (Tabelle

6-1).

Diskussion

127

Tabelle 6-1: Säurekatalysierte Isomerisierung von atrop-Abyssomicin C und Abyssomicin C nach Nicolaou und Harrison (2007).

Nr. Bedindungen Zeit [h] Verhältnis atrop-Abyssomicin C / Abyssomicin C

1 unstabilisiertes CDCl3 24 1:2

2 d4-1,2-dichlorobenzol, 180 °C 12 1:1

3 TFA/CH2Cl2 (1:1) 24 n.r.

4 BF3 OEt2 (1 eq)/CH2Cl2 24 n.r.

5 CSA (1 eq)/CH2Cl2 24 n.r.

6 1M aq HCl/Tetrahydrofuran (1:3) 24 n.r.

7 1M HCl in Et2O (0,2 eq)/d6-Tetrahydrofuran 1 1,6:1

8 1M HCl in Et2O (0,2 eq)/CD3CN 1 1,4:1

9 1M HCl in Et2O (0,2 eq)/ CD2Cl2 1 1:2,2

10 1M HCl in Et2O (0,2 eq)/ CDCl3 1 1:2,5

11 p-TsOH (1eq), LiCl (5eq)/ CD3CN, 50 °C 2 2:1

Sofern nicht anders angegeben, wurden die Reaktionen bei 25°C durchgeführt. n.r. = no reaction

Nicolaou und Harrison (2007) stellen die Hypothese auf, dass die Stabilität von atrop-

Abyssomicin C und Abyssomicin C bei Raumtemperatur auf eine hohe thermische Barriere

der Umwandlung zurückzuführen ist, die durch einen ungünstigen Übergangszustand

verursacht wird. Durch Säurezugabe wird der Übergangszustand günstiger. Drei mögliche

Mechanismen zur Umwandlung wurden von Nicolaou und Harrison (2007) vorgeschlagen

(Abbildung 6-5). Die erste Möglichkeit (Weg a) geschieht durch Protonierung am Tetronat

durch HCl. Dadurch wird das Tetronat zu einer ausreichend guten Abgangsgruppe, so dass

die Hydroxygruppe an C-11 ein Epoxid mit C-12 bilden kann. Das so gebildete Epoxid ist so

flexibel, dass eine Rotation von C-6–C-7 und C-7–C-8 möglich ist. Gegen diese erste

Hypothese spricht, dass Nicolaou und Harrison kein Epoxid nachweisen konnten. Die zweite

Möglichkeit (Weg b) sieht eine Protonierung eines Sauerstoffatoms des Tetronats vor, durch

die C-16 ein Elektronendefizit erhält. Dadurch zieht C-16 Elektronendichte durch den Raum

von dem Olefin C-8–C-9 ab. Hierdurch würde C-8 näher an das Tetronat kommen und den

Übergangszustand stabilisieren. Die dritte, von Nicolaou und Harrison (2007) favorisierte

Hypothese (Weg c) sieht vor, dass die Protonierung an C-2 geschieht, was zu einem

Oxocarbenium-Ion führt. Dieses würde das bereits deformierte sp2-Zentrum in ein komplett

Diskussion

128

pyramidales Zentrum konvertieren, wodurch die Spannung in dem makrozyklischen System

aufgehoben, und die Rotation möglich wird.

atrop-Abyssomicin C Abyssomicin C

Weg aWeg a

Weg bWeg b

Weg cWeg c

27

1013

27

1012

28

1012

16

16

168

8atrop-Abyssomicin C Abyssomicin C

Weg aWeg a

Weg bWeg b

Weg cWeg c

27

1013

27

1012

28

1012

16

16

168

8

Abbildung 6-5: Hypothese zur Umwandlung von atrop-Abyssomicin C in Abyssomicin C (Quelle: Nicolaou und Harrison (2007), leicht modifiziert.

Diskussion

129

6.2 Biosynthese der Abyssomicine

Durch Fütterung von markiertem Acetat, Propionat und Glucose gelang es im Rahmen dieser

Arbeit, die Zuordnung aller Kohlenstoffatome aus den Biosynthesevorläufern für atrop-

Abyssomicin C aufzuklären. C-1, C-2, C-7 bis C-13 sowie C-17 stammen aus Acetat, C-3 bis

C-6 sowie C-18 und C-19 stammen aus Propionat und C-14 bis C-16 werden vermutlich über

Enoylpyruvat-S-ACP in atrop-Abyssomicin C eingebaut (Abbildung 6-6). Auf der Basis

dieser Ergebnisse und durch Analogieschluss aus der Chlorothricin-Biosynthese (Abbildung

1-25) erscheint die in Abbildung 6-7 und Abbildung 6-8 dargestellte Hypothese zur

Biosynthese des linearen Vorläufers wahrscheinlich.

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O 1 2

3

45

6

7

8

9

10

11 12 13

17

16

1514

1819

H3C CH3

O

OO

O

CH3

HO

O 1 2

3

45

6

7

8

9

10

11 12 13

17

16

1514

1819

Abbildung 6-6: Einbau von 1-13C-Propionat (rot, graue Kreise), 1,2-13C-Acetat (grün, schwarze Quadrate) und 1,2-13C-Glucose (blau, gestreifte Fünfecke) in atrop-Abyssomicin C.

loadModul 1

Modul 2Modul 3

Modul 4Modul 5

Modul 6

ATACP KS AT ACP KS ATACPKS AT

DH

ACP

KR

KS AT

DH

ACP

KR

KS AT ACPKS

DH KR

AT

DH

ACP

ERKR

KS

S

O

O

O

S

O

O

S

O

O

S

OS

O

S

O

S

O

loadModul 1

Modul 2Modul 3

Modul 4Modul 5

Modul 6

ATACP KS AT ACP KS ATACPKS AT

DH

ACP

KR

KS AT

DH

ACP

KR

KS AT ACPKS

DH KR

AT

DH

ACP

ERKR

KS

S

O

O

O

S

O

O

S

O

O

S

OS

O

S

O

S

O

Abbildung 6-7: Hypothese zum Aufbau der Abyssomicin-Polyketidsynthase auf der Basis der Fütterungsversuche und des Chlorothricinbiosyntheseclusters.

Das Kohlenstoffgerüst des Abyssomicins, bestehend aus aus Acetat- und Propionateinheiten

wird vermutlich von PKS I-Modulen aufgebaut, wobei auf vier Acetateinheiten zwei

Diskussion

130

Propionateinheiten und eine weitere Acetateinheit folgen. Die ersten drei Acetateinheiten

werden zum Alken reduziert, bei der vierten bleibt das Keton erhalten. Eine der

Propionateinheiten wird zum Alkan reduziert, während bei der anderen Propionateinheit und

der letzten Acetateinheit das Keton erhalten bleibt (Abbildung 6-7). Zuletzt wird die

Enoylpyruvateinheit angehängt (Abbildung 6-8). Für Chlorothricin (Jia et al, 2006) wurde

vorgeschlagen, dass die Freisetzung der linearen Polyketidkette durch den nucleophilen

Angriff der Hydroxygruppe des Enoylpyruvats stattfindet, bei der ein Ester gebildet wird.

Anschließend findet die Cyclisierung zur Tetronsäureeinheit statt. Ein analoger Mechanismus

scheint auch für Abyssomicin möglich. Ein alternativer Biosyntheseweg ist in Abbildung 6-8

dargestellt. Hier erfolgt ein nucleophiler Angriff der Polyketidkette auf die

Enoylpyruvateinheit unter Ausbildung einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung. Daran

anschließend könnte die Bildung des Lactons stattfinden. Die Zyklisierung des linearen

Vorläufers durch eine [4+2] Diels-Alder Reaktion analog dem von Jia et al.vorgeschlagenen

Mechanismus für Chlorothricin ist in Abbildung 6-9 dargestellt.

H3C

O

CH3 CH3

O

O

O

OH

H3C

O

CH3 CH3

O

O S

H3C

O

CH3 CH3

O

O S

ACP

Glycolyse

HO

SOACP

OH

OH

H3C

O

CH3 CH3

O

O

O

OH

H3C

O

CH3 CH3

O

O O

SOACP

H3C

O

CH3 CH3

O

O S

ACP

Glycolyse

HO

SOACP

1

23

45

67

8

9

10

11

12

13

1716 15

14

1819

1

23

45

67

8

9

10

11

12

13

1716 15

14

1819

1

234

56

78

9

10

11

12

13

17

16

15

14

1819

1

23

45

67

8

9

10

11

12

13

17

16

15

14

1819

1

234

56

78

9

10

11

12

13

17

16

15

141819

1

23

45

67

8

9

10

11

12

13

17

1615

14

1819

ACP

Abbildung 6-8: Hypothese zur Biosynthese des linearen Vorläufers von atrop-Abyssomicin C auf der Basis der Fütterungsversuche (grün: Acetat, rot: Propionat, blau: Enoylpyruvat aus Glucose). Das Flussschema links entspricht dem von Jia et al. (2006) vorgeschlagenen Mechanismus, das Schema rechts entspricht einer von unserer Arbeitsgruppe aufgestellten Alternativroute.

Diskussion

131

O

O

O

H3C

H3C O

CH3O

O

O

HOH3C

H3C O

CH3

O

CH2

OO

O

OH

H3C

H3C

O

CH3

[4+2]Diels-Alder Reaktion Epoxidierung, Ringöffnung

OH

Abbildung 6-9: Hypothese zur Zyklisierung des linearen Vorläufers analog zur Chlorothricin-Biosynthese (Jia et al., 2006).

Beteiligt wären in diesem Falle das En gebildet von C-15 und C-16 und das Dien gebildet von

C-10 bis C-13. Dadurch wird ein Grundkörper erhalten, der dem Chlorothricin ähnlich ist

insofern dass ein Spirotetronat mit Cyclohexenring vorhanden ist. Dieses bleibt beim

Chlorothricin erhalten, während bei Abyssomicin zunächst noch zwei Hydroxygruppen

eingeführt werden müssen, möglicherweise über Epoxidierung (Abbildung 6-9), die von einer

Monooxygenase katalysiert werden könnten. Anschließend findet ein Ringschluss statt durch

Veretherung der Hydroxygruppe von C-16 der Tetronsäureeinheit mit der Hydroxygruppe an

C-12.

COOH

OR

O

HOO

O

OO

O

O

O

HO

1

2

11

18

8

25

26

23

1

3

7

19

18

10

12

16

14

Abbildung 6-10: Strukturformeln von Chlorothricin (R entspricht zwei mal D-Olivose und einer modifizierten Methylsalicylsäure, siehe Einleitung) und atrop-Abyssomicin C in einer Darstellungsweise, die die strukturelle Verwandtschaft der beiden Substanzen aufzeigt.

Diskussion

132

Chlorothricolid Abysomicin CChlorothricolid Abyssomicin CChlorothricolid Abysomicin CChlorothricolid Abyssomicin C

Abbildung 6-11: Röntgenstrukturen des Chlorothricin-Aglycons und von Abyssomicin C. (abgewandelt nach Bister, 2004). Der Pfeil zeigt auf den Ring der Tetronsäure.

In Abbildung 6-10 und Abbildung 6-11 sind eine Darstellungsweisen gewählt, bei denen die

Ähnlichkeit und die Unterschiede von Chlorothricin und Abyssomicin deutlich zu sehen sind.

Ähnlich sind die Spirotetronsäure mit dem Cyclohexan- bzw. Cyclohexenring, wobei neben

der zusätzlichen Etherbrücke zwischen C-12 und C-16 bei Abyssomicin auch die OH-Gruppe

(C-11 Abyssomicin) bzw. die Carboxygruppe (Chlorothricin) sofort ins Auge fällt. Die

Carboxygruppe des Chlorothricin stammt aus Propionat, das im späteren Verlauf der

Biosynthese oxidiert wird. Bei Abyssomicin wird hier stattdessen eine Acetat-Einheit

eingebaut. Gleich ist weiterhin die rechts unten angrenzende Propionateinheit (C-3, C-4 und

C-18 bei Abyssomicin), die in beiden Fällen als Keton erhalten bleibt. Links an den

Cyclohexan- bzw. –hexenring angrenzend folgen zwei weitere Acetateinheiten, die in beiden

Fällen zunächst eine Doppelbindung (C-8 und C-9 bei Abyssomicin) bilden, wobei beim

atrop-Abyssomicin C in Konjugation hierzu ein Keton steht (C-7), während der entsprechende

Kohlenstoff beim Chlorothricin gesättigt ist. Während beim Chlorothricin dann eine weitere

Acetateinheit folgt, wird beim atrop-Abyssomicin C eine Propionateinheit (C-5, C-6 und C-

19) eingebaut. Weiterhin fehlt dem atrop-Abyssomicin C der gesamte bizyklische Südteil des

Chlorothricins samt Glycosylierung. Bemerkenswert ist auch, dass die Konfiguration an der

Spirotetronsäure und am Cyclohexan- bzw. Cyclohexenring unterschiedlich sind.

In Abbildung 6-12 ist die Biosyntheseabfolge des Einbaus der Monomereinheiten graphisch

nochmals verdeutlicht. Beim Chlorothricin wird der lineare Vorläufer gebildet, indem

zunächst ein Acetat, dann ein Propionat, dann acht Acetate, ein Propionat, ein Acetat und am

Diskussion

133

Ende Enoylpyruvat aneinanderkondensiert werden, während atrop-Abyssomicin C aus vier

Acetaten, zwei Propionaten, einem Acetat und Enoylpyruvat synthetisiert wird. Der

Unterschied liegt also darin, dass der zweite Baustein im Falle des Chlorothricins ein

Propionat, im Falle des Abyssomicins ein Acetat ist, und dass sechs Acetateinheiten des

Chlorothricins durch eine Propionateinheit beim atrop-Abyssomicin C ersetzt sind. Genauere

Einblicke in die Biosynthese, vor allem auch bezüglich der Zyklisierung des linearen

Vorläufers und der Herkunft der Sauerstoffatome an C-11 und C-12 werden in Kürze durch

die Aufklärung des Biosynthesegenclusters und die Erzeugung entsprechender Mutanten

erwartet.

Acetat PropionatEnoyl-

pyruvatPropionat AcetatAcetat Acetat Acetat AcetatAcetatAcetatAcetat Acetat

Enoyl-

pyruvatPropionat AcetatAcetatAcetatAcetat Acetat Propionat

A)

B)

Acetat PropionatEnoyl-

pyruvatPropionat AcetatAcetat Acetat Acetat AcetatAcetatAcetatAcetat Acetat

Enoyl-

pyruvatPropionat AcetatAcetatAcetatAcetat Acetat Propionat

A)

B)

Abbildung 6-12: Schematische Darstellung des Einbaus von Acetat- und Propionateinheiten sowie von Enoylpyruvat bei A) Chlorothricin und B) atrop-Abyssomicin C.

Diskussion

134

6.3 Wirkung von atrop-Abyssomicin C als irreversibler Inhibitor von PabB

Die Untersuchung des Wirkmechanismus wurde auf drei Säulen aufgebaut: Zunächst wurde

ein einfaches Modellsystem (Mercaptoethanol, N-Acetyl-Cystein) gewählt, das mit atrop-

Abyssomicin C umgesetzt wurde, um herauszufinden, ob das Michaelsystem von Schwefel

nucleophil angegriffen wird. Desweiteren sollte eine Hemmkinetik von atrop-Abyssomicin C

mit ADC-Synthase durchgeführt werden. Schließlich wurde die kovalente Bindung von atrop-

Abyssomicin C an PabB untersucht.

Alle drei Versuchsreihen deuten darauf hin, dass 263Cys der Aminodesoxychorismat-Synthase

PabB kovalent von atrop-Abyssomicin C modifiziert wird. Bei der der Umsetzung von

N-Acetyl-Cystein mit atrop-Abyssomicin konnte mit NMR-Experimenten gezeigt werden,

dass eine Umlagerung zu einer Abyssomicin D-artigen Struktur stattfindet. Durch Inkubation

von atrop-Abyssomicin C mit PabB und anschließendem Verdau mit der Endoproteinase

GluC ließ sich der Ort der Modifikation auf 263Cys einschränken. Dies wurde durch MS/MS-

Experimente bestätigt. Die Kinetik der ADC-Synthase mit atrop-Abyssomicin C bestätigte

schließlich, dass es sich um irreversible Inhibition handelt. Die Hemmkonstanten konnten

bestimmt werden zu appiK = 390 µM und kinact = 0,8 min-1. Auf den ersten Blick mag app

iK

hoch erscheinen, versucht man doch im Bereich reversibler Inhibitoren Verbindungen mit

einem KI im niedrigen nanomolaren Bereich zu finden. Bei irreversiblen Inhibitoren jedoch

müssen Inhibitionskonstanten ganz anders bewertet werden. Bindet ein Molekül des

Inhibitors an das Enzym, wird es sich nicht wieder lösen. So kann auch bei hohen appiK -

Werten eine komplette Inaktivierung erreicht werden, wenn das Enzym dem Inhibitor lange

genug ausgesetzt ist.

Diskussion

135

6.3.1 Vergleich von atrop-Abyssomicin C mit literaturbekannten irreversiblen Inhibitoren

Vergleicht man die Werte appiK = 390 µM und kinact = 0,8 min-1 mit denen des bisher

potentesten beschriebenen irreversiblen Inhibitor der (E. coli) ADC-Synthase,

Fluorochorismat (Bulloch et al., 2004), die bei appiK = 130 µM und kinact = 1 min-1 liegen, so

sieht man, dass appiK etwa um einen Faktor drei höher ist, und kinact um 20 % niedriger ist. Mit

einem Verhältnis kinact/appiK = 0,0077 min-1µM-1 ist Fluorochorismat etwa drei bis vier mal

potenter als atrop-Abyssomicin C mit einem kinact/appiK = 0,0021 min-1µM-1. Angesichts der

Tatsache, dass Fluorchorismat strukturell dem Chorismat sehr ähnlich ist, ist es nicht

verwunderlich, dass Fluorchorismat insgesamt ein etwas besserer Inhibitor ist als atrop-

Abyssomicin C (Abbildung 6-13). Man kann sich leicht vorstellen, dass Fluorchorismat -

ähnlich dem Chorismat - besser in die Bindungstasche des Enzyms passt als atrop-

Abyssomicin C mit dem relativ großen Rest auf der Nord-Seite des Moleküls.

COOHO

COOH

OH

H

COOHO

COOH

OH

F

H3C CH3

O O

OO

O

CH3

OH

Abbildung 6-13: Strukturen von Chorismat, Fluorchorismat und (atrop-)Abyssomicin C.

Interessant ist weiterhin ein Vergleich des Wirkmechanismus von Fluorchorismat und atrop-

Abyssomicin C, der komplett unterschiedlich ist (Abbildung 6-14). Während beim atrop-

Abyssomicin eine Cysteinseitenkette (von PabB aus B. subtilis) nucleophil an der

Doppelbindung des Michaelsystems angreift, findet beim Fluorchorismat ein nucleophiler

Angriff einer Lysinseitenkette (von PabB aus E. coli) statt, und zwar an derselben Stelle, an

der normalerweise auch Chorismat von eben dieser Lysinseitenkette angegriffen wird. Im

Gegensatz zur Reaktion von Chorismat zu Aminodesoxychorismat folgt jedoch auf die

Elimination der OH-Gruppe nicht der nucleophile Angriff von NH3, der zur Abspaltung des

Enzyms führt, sondern das Fluor wird – vermutlich als HF – eliminiert, wobei das Enzym

kovalent gebunden bleibt und nicht mehr abgespalten werden kann. Somit handelt es sich bei

Fluorchorismat um einen Suicidinhibitor.

Diskussion

136

H3C CH3

O

HO

OO

O

CH3

HO

SCys

H3C CH3

HO O

OO

O

CH3

HO

CysS

H3C CH3

O O

OO

O

CH3

HO

CysSH

COO-

OH

O COO-

F

Lys-274

H2N COO-

O COO-

NH

Lys-274

F

COO-

O COO-

NH

Lys-274

Abbildung 6-14: Wirkmechanismus von atrop-Abyssomicin und Fluorchorismat im Vergleich.

Weitere Inhibitoren der ADC-Synthase von E. coli wurden 2006 von Dixon et al. im Rahmen

einer kombinatorischen Bibliothek synthetisiert und untersucht. Die Bibliothek war

folgendermaßen konzipiert: ein einfaches Chorismat-Analogon (Payload) wurde über Lysin

(Spacer) an einen variablen Rest (Combi) geknüpft. Die so erhaltenen Inhibitoren waren

allesamt reversible, kompetitive Inhibitoren der ADC-Synthase. Der stärkste Inhibitor, der

gefunden wurde (Abbildung 6-15), zeigte einen KI von 360 µM. Ein Vergleich dieses

reversiblen Inhibitors, dessen KI eine Dissoziationskonstante darstellt, mit dem irreversiblen

Inhibitor atrop-Abyssomicin C mit appiK =390 µM ist nur insofern zulässig, dass beide

Inhibitionskonstanten ein Maß für die Affinität des Inhibitors zum Enzym darstellen. Der

Hemmtyp unterscheidet sich, die Affinität der beiden Inhibitoren zur ADC-Synthase (für den

synthetischen Inhibitor L5 von E. coli, für atrop-Abyssomicin C von B. subtilis) liegt in der

gleichen Größenordnung.

Diskussion

137

OHN

O

COOH

HN

O

NH

O

NH2

CN

O

HO

NO2

Abbildung 6-15: Der kompetitive Inhibitor L5 der E. coli ADC-Synthase aus dem Screening

Programm von Dixon et al. (2006) mit einem KI von 360 µM.

Atrop-Abyssomicin C stellt also einen irreversiblen Inhibitor der ADC-Synthase von

B. subtilis dar, der in einer Größenordnung hemmt, die vergleichbar ist mit bekannten

Inhibitoren der ADC-Synthase von E. coli. Der potenteste bislang beschriebene Inhibitor ist

etwa um einen Faktor drei bis vier besser als atrop-Abyssomicin C. Da die ADC-Synthase

von B. subtilis im Rahmen dieser Arbeit erstmalig überexprimiert wurde, existieren keine

Literaturwerte zur Hemmung ADC-Synthase von B. subtilis.

Zur Einordnung der Hemmkonstanten in einen Gesamtzusammenhang scheint es dem Autor

sinnvoll, einen Vergleich zu bekannten irreversiblen Inhibitoren zu ziehen. Mit Sicherheit

einer der bedeutendsten irreversiblen Inhibitoren ist Acetylsalicylsäure (Handelsname

Aspririn). Aspirin hemmt die Prostaglandinsynthase durch Acetylierung eines bestimmten

Serinrests, 530Ser für Cycloogygenase-1 (COX-1) und 516Ser für Cyclooxygenase-2 (COX-2).

Rome und Lands ermittelten 1975 für die Fatty Acid Oxygenase (vermutlich handelt es sich

dabei um COX-1) die Inhibitionskonstanten KI = 14000 µM und kinact/KI = 0,0003 min-1µM-1.

Die Affinität zur Bindungsstelle ist also etwa 36 mal niedriger und insgesamt sind die

Inhibitionskonstanten etwa um einen Faktor 10 schlechter als die des atrop-Abyssomicin C.

Trotz dieser scheinbar schlechten Inhibitionskonstanten – wer will bestreiten, dass es sich bei

Aspirin um ein sehr gutes Medikament handelt? Neuere Inhibitionswerte zu Aspirin liegen

von Kalgutkar et al. (1998) für COX-2 vor, sie bestimmten das Verhältnis kinact/KI =

0,003 min-1µM-1. Von dieser Grundlage aus betrachtet ist atrop-Abyssomicin C immerhin

noch um 50 % potenter als Aspirin. Als zweites bekanntes Literaturbeispiel soll Penicillin

angeführt werden. Penicillin acyliert ein Serin im aktiven Zentrum von Penicillin-binding

proteins (PBPs). Lu et al. (2001) untersuchten die Wirkung von Penicillin G auf PBP2x aus

dem humanpathogenen Stamm Streptococcus pneumoniae, der Lungenentzündungen

Diskussion

138

verursacht. Da in diesem Fall keine Enzymreaktion stattfindet, wurde die Bindung von

Penicillin an PBP2x beobachtet. Daher wurden statt KI Kd und statt kinact k2 ermittelt: Kd =

0,9 mM, k2 = 180 s-1 und k2/Kd = 12 min-1µM-1 (Lu et al. 2001). Die Bindungsgeschwindigkeit

ist in diesem Falle mit k2 = 180 s-1 = 10800 min-1 extrem hoch, die Bindungsaffinität Kd =

900 µM ist jedoch verglichen mit atrop-Abyssomicin C etwa um einen Faktor zwei bis drei

niedriger.

Die für atrop-Abyssomicin C erhaltenen Inhibitionskonstanten sind also im Vergleich zu

irreversiblen Inhibitoren im Allgemeinen sowie zu Inhibitoren von PabB im Speziellen

durchaus konkurrenzfähig.

Diskussion

139

6.3.2 Vergleich von B. subtilis PabB mit PabB anderer Organismen und mit der Anthranilatsynthase

Vergleicht man die Proteinsequenz von PabB aus B. subtilis mit PabB aus anderen

Organismen (Abbildung 6-16), so fallen zwei Dinge auf: Die active site ist bei allen

betrachteten Organismen sehr ähnlich, und die wichtigste Aminosäure des aktiven Zentrums, 274Lys bei E. coli (He et al., 2004; He und Toney, 2006; Bulloch und Abell, 2006), die den

nucleophilen Angriff am Chorismat ausführt, ist konserviert. Einzig bei B. subtilis steht

anstelle eines Lysins ein Alanin. Dies ist sehr ungewöhnlich, da das aktive Zentrum der ADC-

Synthase streng konserviert ist.

E.coli ------------------------------------------------------------ S.venezuelae MRTLLIDNYDSFTHNLFQYIGEATGQPPVVVPNDADWSRLPVE-DFDAIVVSPGPGSPDR C.glutamicum1 MRVLIIDNYDSFTFNLATYVEEVTGQAPVVVPNDQEIDEM----LFDAVILSPGPGHAGV S.avermitilis MKTLLIDNYDSYTYNLFQLIAEVNGEEPVVVLNDAPPDDIPDLRDFANVVVSPGPGHPAK B.subtilis ------------------------------------------------------------ M.tuberculosis ----------------MGISCAVDGMAGLPIAFSGP--------RWLALLLQPLSGPPST E.coli ------------------------------------------------------------ S.venezuelae ERDFGISRRAITDSGLPVLGVCLGHQGIAQLFGGTVGLAPEPMHGRVSEVRHTGEDVFRG C.glutamicum1 AADFGICAGVIERARVPILGVCLGHQGIALAYGGDVDLAPRPVHGEVSQITHDGSGLFAG S.avermitilis RRDFGIVGELLAAAPVPVLGVCLGHQGIAAGERAWVTPAPEPRHGHLSTVRHNGQDLFEG B.subtilis ------------------------------------------------------------ M.tuberculosis SAKHTTTPSVLFLLLKTIATSRSHRASTSRGQRETALALAARTATPPGTETGAGHGLN-- E.coli ---------------MKTLSPAVITLLWRQDAAEFYFSRLSHLPWAMLLHSGYADHPY-- S.venezuelae LPSPFTAVRYHSLAATD-LPDELEPLAWSDDGVVMGLRHREKPLWGVQFHPESIGSDFGR C.glutamicum1 IPETFEAVRYHSMVATR-LPESLKATATSDDGLIMALAHEVLPQWGVQFHPESIGGQFGH S.avermitilis LPQQFTAVRYHSLSVREPLPLSLEPTAWAEDGVLMGLRHRSRPLWGVQFHPESVLTEFGH B.subtilis ---------------MAQRRPAGKKIPFQKDSFLQQFEKLAQSRKHHVLLESARGGRYS- M.tuberculosis -----------LAWELSTRTKSPRSHLRCENPQFCQARTVRIDRLGDLGGAPAVLRAVG- .: E.coli ------------------------------------------------------------ S.venezuelae EIMANFRDLALAHHRARRHGAD-------------------------------------S C.glutamicum1 QIIKNFLNLARTYR---------------------------------------------- S.avermitilis RMFVNFRELTASRARETRTAKARTSGTRTTEPPVRPPSPSAEGAGAAPAVLVPRPRRVAP B.subtilis ------------------------------------------------------------ M.tuberculosis ------------------------------------------------------------ E.coli ------SRFDIVVAEPICTLTTFG-----------------------KETVVSESEKRTT S.venezuelae PYELHVRRVDVLPDAEEVRRGCLPGEGTTFWLDSSSVLEGASRFSFLGDDRGPLAEYLTY C.glutamicum1 -WQLTEKTIPLSVDSAAVFETFFAHSSHAFWLDD------AQGTSYLGDASGPLARTKTH S.avermitilis SHRLHTRRIDVAVDAEAAFTRMYTDAPRAFWLDSSRVEEGQSRFSFFGDGTGPLAEFVRY B.subtilis ----------IAGLDPIATVKGKD-----------------------GITTIKHGDEMLF M.tuberculosis -----RATSRLDLPPPAALTGEWFG------------------------ALAVIAPSVSI : . E.coli TTDDP------------------LQVLQQVLDRADIRPTHNEDLPFQGGALGLFGYDLGR S.venezuelae RVADGVVSVRGSDGTTTRTRRPFFNYLEEQLERRRVPVAPELPFEFNLGYVGYLGYELKA C.glutamicum1 NVGEG----------------DFFTWLKEDLAAN--SVAPGQ--GFRLGWVGYVGYELKA S.avermitilis DVESGLCEIERPGRPVRKVRASVFDYLKRQLVTR-QVDATGLPFDFTGGYVGYFGYEVKA B.subtilis KEGDP------------------LRAFHSWFKTLETETNHEFP-DFQGGAIGFLSYDYAR M.tuberculosis QPVSG----------------------DDVFSGPPGTGGPDATGAVGGGWVGYLSYPDAG . . : . * :* ..* E.coli RFESLPEIAEQDIVLPDMAVGIYDWALIVDHQRHTVSLLSHNDVN-----ARRAWLESQQ S.venezuelae ETT---GDPAHRSPHPDAAFLFADRAIALDHQEGCCYLLALDRRG--HDDGARAWLRETA C.glutamicum1 EAG---ARAAHTSSLPDAHLIFADRAIAVESDQ--VRLLALGE----QDE----WFEETI S.avermitilis DCG---SVNRHRARTPDACWLFADRLIAVDHQDGATYAVCLAENTRQGAQQAADWLDAAM B.subtilis YIENFKMLSLDDLETPDIYFLVFDDIAVYDHQEESLWLITHVNGS-DQETADVKLSELEQ M.tuberculosis ADG-------RPHRIPEAAGGWTDCVLRR-DRDGQWWYESLSGAP------IADWLASAL *: *

Diskussion

140

E.coli FS--------------------PQEDFTLTSDWQSNMTREQYGEKFRQVQEYLHSGDCYQ S.venezuelae ETLTGLAVRAPAEPTPAMVFGIPEAAAGFGPLARARHDKDAYLKRIDECLKEIRNGESYE C.glutamicum1 KKLHNLVA--------------PRIPASGHLALQVRDSKDEYLDKIRRAQELITRGESYE S.avermitilis AQLSFVSSAKPTAPPR------PTAPRLDAVEPWLVRDRTTYLADIGTCKRELKDGTSYE B.subtilis MWLTELPAVTS-----------REMKPETAGSFAAPFTEDGFSQAVEKIKQYIASGDVFQ M.tuberculosis ATTRASVAR----------------PAPACRIDWEPADRAAHRDGVLACLEAIGAGEVYQ . . . . : * :: E.coli VNLAQRFHATYSGDEWQAFLQLNQANRAPFSAFLRLEQGAILSLSPERFILCDNS-EIQT S.venezuelae ICLTNMVTAPTEATALPLYSALRAISPVPYGALLEFPELSVLSASPERFLTIGADGGVES C.glutamicum1 ICLTTKLQGTTDVAPLAAYLALRGANPTAYGAYLQLGDTSILSSSPERFITIDSAGYVES S.avermitilis ICLTNAARLPAPYDPYDFYRVLRRLDPAPYAAYLRFGDLDVAGSSPERFLRITRDGVAEA B.subtilis VNLSIRQSQSLSVHPYQIYKTLREVNPSPYMAYLETPDFQIICGSPE-LLVSKKGKLLET M.tuberculosis ACVCTQFAGTVTGSPLDFFIDGFGRTAPSRSAFVAGPWGAVASLSPELFLRRRGS-VVTS : . : . * : : *** :: : E.coli RPIKGTLPRLPDPQEDSKQAVKLANSAKDRAENLMIVDLMRNDIGRVAVAGSVKVPELFV S.venezuelae KPIKGTRPRGGTAEEDERLRADLAGREKDRAENLMIVDLVRNDLNSVCAIGSVHVPRLFE C.glutamicum1 KPIKGTRPRGRTAQEDQEIIAELRSNPKDRAENLMIVDLVRNDLARGALPTTVKTSKLFD S.avermitilis RPVKGTAPRGERPEEDARLRDALTTDDKTRAENLVIVDLLRNDLGRVCRTGTVKVTRLMA B.subtilis RPIAGTRSRGKTNEEDEALANELIHNEKERAEHVMLVDLERNDLGRVSRYGSVRVNEFMA M.tuberculosis SPIKGTLPLDAPP-------SALRASAKEVAENIMIVDLVRNDLGRVAVTGTVTVPELLV *: ** . * * **::::*** ***: . :* . .:: E.coli VEPFPAVHHLVSTITAQLPEQLHASDLLRAAFPGGSITGAPKVRAMEIIDELEPQRRNAW S.venezuelae VETYAPVHQLVSTIRGRLRPGTSTAACVRAAFPGGSMTGAPKKRTMEIIDRLEEGPRGVY C.glutamicum1 VETYATVHQLVSTVSAELGP-RSPIECVRAAFPGGSMTGAPKLRTMEIIDELEAAPRGIY S.avermitilis TETCATVHQLVSTVEGRLREGIGAVDCVRVCFPGGSVTGAPKLRTMEIIDSLETEARGVY B.subtilis IEKYSHVMHIVSNVQGELQDGYDAVDIIHAVFPGGTITGAPKVRTMEIIEELEPTRRGLY M.tuberculosis VRPAPGVWHLVSTVSARVPLEEPMSALLDAAFPPASVTGTPKLRARQLISQWERYRRGIY . . * ::**.: ..: : . ** .::**:** *: ::*. * *. : E.coli CGSIGYLSFCGNMDTSITIRTLTAING-QIFCSAGGGIVADSQEEAEYQETFDKVNRILK S.venezuelae SGALGWFALSGAADLSIVIRTIVLADG-QAEFGVGGAIVSLSDQEEEFTETVVKARAMVT C.glutamicum1 SGGLGYFSLDGAVDLSMVIRTLVIQNN-HVEYGVGGALLALSDPEAEWEEIRVKSRPLLN S.avermitilis SGAIGYFGCSGGADLAIASRTAVFTDG-EMHLGAGGAIVLGSDPVGEYDEMLLKTAAPMR B.subtilis TGSIGWFGYNHDLQFNIVIRTIYATGG-QAFMQSGAGVVIDSVPKHEYKESFKKAFAMQR M.tuberculosis CGTVGLASPVAGCELNVAIRTVEFDTAGNAVLGVGGGITADSDPDAEWAECLHKAAPIVG * :* . : :. ** . *..: * *: * * E.coli QLEK------------------- S.venezuelae ALDGSAVAGAR------------ C.glutamicum1 LFG---VEFP------------- S.avermitilis AHRDRIAGLRPAARTLPLKEAVR B.subtilis ALELSEEETKIR----------- M.tuberculosis LPAATRTTPARLASKVR------

Abbildung 6-16: Sequenzvergleich von PabB aus E. coli, S. venezuelae, C. glutamicum, S.

avermitilis, B. subtilis und M. tuberculosis. Farblich markiert sind Cystein (gelb), die konservierten Aminosäuren der active site auf der Basis des E. coli-Enzyms (grün) und die Aminosäuren, die sich von der active site des E. coli-Enzyms unterscheiden (rosa).

Bei der Anthranilatsynthase der meisten Organismen ist 274Lys durch ein Alanin ersetzt (He et

al., 2004). Nach einer von He et al. (2004) aufgestellten Hypothese verlaufen die Reaktionen

der ADC-Synthase und der Anthranilatsynthase sehr ähnlich, wobei einer der entscheidenden

Unterschiede dadurch zustande kommt, dass die ADC-Synthase an Position 274 ein Lysin

trägt, während an der entsprechenden Stelle der Anthranilatsynthase ein Alanin steht. Bei der

ADC-Synthase greift zunächst 274Lys nucleophil an C-2 an. Hingegen findet der nucleophile

Angriff an C-2 bei der Anthranilatsynthase durch Ammoniak statt (Abbildung 6-17).

2-Amino-2-desoxychorismat reagiert bei der von der Anthranilatsynthase katalysierten

Reaktion sofort zu Anthranilat weiter. Die beiden Reaktionen, die bei der pABA-Synthese

von zwei Enzymen (ADC-Synthase und ADC-Lyase) katalysiert werden, werden im analogen

Diskussion

141

Fall der Anthranilatsynthese von der Anthranilatsynthase allein katalysiert. Das

Zwischenprodukt 2-Amino-2-desoxychorismat kann im Normalfall nicht isoliert werden

(Morollo und Bauerle, 1993). Vergleicht man die ADC-Synthase von B. subtilis mit der

Anthranilatsynthase, so fällt auf, dass das aktive Zentrum komplett identisch ist (Abbildung

6-18). Dies steht scheinbar in Widerspruch zu der von He et al. (2004) aufgestellten

Hypothese. Es darf jedoch vermutet werden, dass der Katalysemechanismus der ADC-

Synthase bei B. subtilis grundsätzlich nach demselben Mechanismus verläuft, und

möglicherweise eine andere Lysinseitenkette den nucleophilen Angriff auf C-2 des

Chorismats übernimmt. Dieser signifikante Unterschied des B. subtilis Enzyms zum E. coli

Enzym könnte auch die Ursache dafür sein, dass der Km für Chorismat bei der

ammoniumabhängigen Reaktion des B. subtilis Enzyms mit Km = 5 mM höher ist als der des

E. coli Enzyms, der in verschiedenen Publikationen von Km = 20 µM bis Km = 0,5 mM

variiert (Viswanathan et al., 1995, He et al., 2003, Dixon et al., 2006). Eine weitere denkbare

Ursache für den ungewöhnlich hohen Km-Wert ist, dass sich das artifizielle System, in dem

als Co-Substrat zu Chorismat Ammoniumsulfat verwendet wird anstelle von Glutamin, auf

die B. subtilis ADC-Synthase stärker auswirkt als auf die E. coli ADC-Synthase, deren Km-

Wert für Chorismat ebenfalls um einen Faktor fünf niedriger wird, wenn Glutamin statt

Ammoniumsulfat als Cosubstrat verwendet wird (Vishwanathan et al., 1995).

COO-

OH

O COO-

Lys

H2N COO-

O COO-

NH

LysCOO- H2N

Lys-274

NH3NH2

COO-

OH

O COO-

NH3 COO-

O COO-

NH2

COO-

NH2

a)

b)

Abbildung 6-17: Katalysemechanismus von ADC-Synthase (a) und Anthranilatsynthase (b).

TrpE 33 IQMIEKL--DREITYLLESKDDTSTWSRYSFIGLNPFLTIKEEQGRFSAADQDSKSLYTG 90

+Q EKL R+ LLES + RYS GL+P T+K + G + D G

PabB 19 LQQFEKLAQSRKHHVLLES----ARGGRYSIAGLDPIATVKGKDGITTIKHGDEMLFKEG 74

TrpE 91 NELKEVLNWMNTTYKIKTPELGIPFVGGAVGYLSYDMIPLIEPSVPSHTKETDMEKCMLF 150

+ L+ +W T + +T F GGA+G+LSYD IE + +

PabB 75 DPLRAFHSWFKTL-ETETNHEFPDFQGGAIGFLSYDYARYIENFKMLSLDDLETPDIYFL 133

Diskussion

142

TrpE 151 VCRTLIAYDHETKNVHFIQYARLTGEETKNEKMDVFHQNHL-ELQNLIEKMMDQKNIKEL 209

V + YDH+ +++ I + + +ET + K+ Q L EL + + M +

PabB 134 VFDDIAVYDHQEESLWLITHVNGSDQETADVKLSELEQMWLTELPAVTSREMKPE----- 188

TrpE 210 FLSADSYKTPSFETVSSNYEKSAFMADVEKIKSYIKAGDIFQGVLSQKFEVPIKADAFEL 269

+A S+ P + + F VEKIK YI +GD+FQ LS + + +++

PabB 189 --TAGSFAAP--------FTEDGFSQAVEKIKQYIASGDVFQVNLSIRQSQSLSVHPYQI 238

TrpE 270 YRVLRIVNPSPYMYYMKLLDREIVGSSPERLIHVQDGHLEIHPIAGTRKRGADKAEDERL 329

Y+ LR VNPSPYM Y++ D +I+ SPE L+ + LE PIAGTR RG EDE L

PabB 239 YKTLREVNPSPYMAYLETPDFQIICGSPELLVSKKGKLLETRPIAGTRSRGKTNEEDEAL 298

TrpE 330 KVELMKDEKEKAEHYMLVDLARNDIGRVAEYGSVSVPEFTKIVSFSHVMHIISVVTGRLK 389

EL+ +EKE+AEH MLVDL RND+GRV+ YGSV V EF I +SHVMHI+S V G L+

PabB 299 ANELIHNEKERAEHVMLVDLERNDLGRVSRYGSVRVNEFMAIEKYSHVMHIVSNVQGELQ 358

TrpE 390 KGVHPVDALMSAFPAGTLTGAPKIRAMQLLQELEPTPRETYGGCIAYIGFDGNIDSCITI 449

G VD + + FP GT+TGAPK+R M++++ELEPT R Y G I + G++ ++ I I

PabB 359 DGYDAVDIIHAVFPGGTITGAPKVRTMEIIEELEPTRRGLYTGSIGWFGYNHDLQFNIVI 418

TrpE 450 RTMSVKNGVASIQAGAGIVADSVPEAEYEESCNKAGALLKTIHIAED 496

RT+ G A +Q+GAG+V DSVP+ EY+ES KA A+ + + ++E+

PabB 419 RTIYATGGQAFMQSGAGVVIDSVPKHEYKESFKKAFAMQRALELSEE 465

Abbildung 6-18: Sequenzvergleich der Anthranilatsynthase TrpE und der ADC-Synthase PabB von B. subtilis. Farblich markiert sind: das Cystein aus PabB, an dessen Stelle bei TrpE Glycin steht (gelb), die konservierten Aminosäuren der active site auf der Basis des E. coli-Enzyms, die komplett identisch sind zwischen TrpE und PabB (grün) und der wichtigste Rest der active site des E. coli-Enzyms, das sowohl bei TrpE als auch bei PabB ein Alanin anstelle eines Lysins ist (rosa).

Die zweite Auffälligkeit beim Sequenzvergleich von PabB verschiedener Bakterienstämme

(Abbildung 6-16) betrifft 263Cys von B. subtilis, an dem die Bindung von atrop-Abyssomicin

C stattfindet. An dieser Stelle steht bei den meisten anderen Organismen ein Serin, dessen

Reaktion mit atrop-Abyssomicin C aufgrund der weitaus geringeren Nucleophilie eher

unwahrscheinlich ist. Denkbar ist, dass andere in der Nähe befindliche Cysteinseitenketten

von atrop-Abyssomicin C angegriffen werden könnten - die hier dargestellten Sequenzen

anderer Mikroorganismen verfügen jeweils über drei bis zwölf Cysteinseitenketten. Der

einzige Stamm, bei dem erwiesen ist, dass eine Wachstumshemmung durch atrop-

Abyssomicin eintritt, ist C. glutamicum. Bei E. coli konnte keine antibiotische Wirkung

festgestellt werden (Riedlinger et al., 2004). Dies mag darauf zurückzuführen sein, dass es

sich bei E. coli um einen Gram-negativen Organismus handelt, allerdings wurde auch bei E.

coli, dessen Zellwand durch Perforierung durchgängig gemacht wurde, keine antibiotische

Wirkung erzielt.

Abgesehen von der Inhibition der ADC-Synthase besteht auch die Wahrscheinlichkeit, dass

die antibiotische Wirkung des atrop-Abyssomicin C noch auf weiteren Mechanismen beruht.

Geplant ist in der Arbeitsgruppe derzeit eine Untersuchung der Wirkung von atrop-

Abyssomicin C auf das dritte Enzym der pABA-Biosynthese, PabC. Desweiteren besteht

Diskussion

143

Grund zur Annahme, dass neben der pABA-Biosynthese noch weitere Targets für atrop-

Abyssomicin C existieren. So beginnen beispielsweise Caco-2-Zellen, die bekanntermaßen

nicht über die Enzyme der pABA-Biosynthese verfügen, bereits bei einer Konzentration von

100 µM atrop-Abyssomicin C abzusterben (Dipl.-Biochem. Heiko Schadt, persönliche

Mitteilung). Angesichts der hohen Reaktivität von atrop-Abyssomicin C gegenüber

Nucleophilen ist anzunehmen, dass neben PabB eine Reihe von cysteinhaltigen Proteinen

kovalente Bindungen eingehen.

Diskussion

144

6.3.3 Überlegungen zum Resistenzmechanismus von Verrucosispora AB-18-032

Eine wichtige Rolle bei der Erforschung des Wirkmechanismus von atrop-Abyssomicin C

spielt die Frage nach der Selbstresistenz von Verrucosispora AB-18-032 gegen atrop-

Abyssomicin C. Es gibt drei Hauptwege, durch die sich Bakterien vor von ihnen produzierten

Antibiotika schützen (Hopwood, 2007): Die chemische Modifizierung des Antibiotikums

(Cundliffe, 1989), die Änderung der Zielstruktur sowie die Ausschleusung des Antibiotikums

aus dem Organismus. So verfügen Actinomyceten über einen ganzen Satz an Antibiotika-

modifizierenden Enzymen, durch die z.B. Aminoglycoside phosphoryliert, acetyliert oder

adenyliert werden können (Benveniste und Davies, 1973). Ein Beispiel für die Änderung der

Zielstruktur ist am Beispiel des Erythromycin-Produzenten verwirklicht. Dieser produziert ein

Enzym, das eine Methylgruppe an eine bestimmte Stelle der ribosomalen RNA hängt, so dass

das Ribosom unempfindlich gegenüber dem Inhibitor wird (Hopwood, 2007). Ein Beispiel für

den dritten Selbstschutzmechanismus liefern die Produzenten von Tetracyclinen. Diese

koppeln den Export des Antibiotikums mit einem Protonenimport (Hopwood, 2007). Egal,

mit welchem Selbstschutzmechanismus sich ein Antibiotika-Produzent schützt, allen gemein

ist, dass die Produktion des Antibiotikums erst erfolgt, wenn das Wachstum des Bakteriums

nachlässt und eine stationäre Phase erreicht. Die Steuerung der Aktivierung des

Selbsschutzmechanismus in Abhängigkeit von der Produktion des Antibiotikums ist komplex

(Bibb, 2005). Wichtig ist, dass die für die Resistenz erforderlichen Proteine in ausreichend

hoher Konzentration vorhanden sind, wenn die Biosynthese des Antibiotikums beginnt.

Für den Selbstschutz von Verrucosispora AB-18-032 gegen atrop-Abyssomicin C sind

mehrere Möglichkeiten denkbar. Neben der Ausschleusung von atrop-Abyssomicin C durch

spezifische Transporter aus dem Organismus ist auch die Selbstresistenz durch chemische

Modifizierung denkbar. Sowohl die Bildung von Abyssomicin H und D, die vermutlich durch

enzymatische Hydrierung entstehen, als auch die Bildung von Abyssomicin B und G durch

Aminierung und anschließende N-Oxidation könnten dem Zwecke des Selbstschutzes dienen,

da alle vier Abyssomicin-Derivate antibiotisch inaktiv sind, und bislang noch keine andere

biologische Funktion zugeordnet werden konnte. Weiterhin denkbar ist die reversible

Bindung an ein Protein. Auffällig bei Kultivierungen und Aufreinigungen von atrop-

Abyssomicin C ist, dass aus dem Kulturfiltrat direkt kein atrop-Abyssomicin C nachgewiesen

werden kann. Erst nach Ansäuern auf pH 4,0 und Extraktion mit Ethylacetat lässt sich atrop-

Abyssomicin C detektieren. Wird bereits isoliertes atrop-Abyssomicin C mit Kulturfiltrat

verdünnt, so ist es ebenfalls nicht nachweisbar. Bei gleicher Konzentration durch Verdünnung

mit Wasser oder Medium bleibt atrop-Abyssomicin C detektierbar. Als weitere Möglichkeit

Diskussion

145

schließlich bleibt die Modifizierung der Zielstruktur, der ADC-Synthase. So ist es einerseits

denkbar, dass PabB keine Cysteinseitenkette enthält, und somit keine Bindung von atrop-

Abyssomicin C möglich ist. Versuche, PabB aus Verrucosispora AB-18-032 zu klonieren

waren bislang noch nicht erfolgreich. Eine Schwierigkeit besteht in der großen Ähnlichkeit

von PabB zur Anthranilatsynthase TrpE. Aus dieser Schwierigkeit, PabB in Verrucosispora

AB-18-032 zu finden, ergibt sich eine weitere denkbare Möglichkeit. Porat et al. (2006)

beschrieben einen alternativen Weg für die pABA-Biosynthese, die nicht von Chorismat

ausgeht (siehe auch: Xie et al., 2003 und Gosset et al., 2001). Im Genom des Stammes

Methanococcus maripaludis kommen die Gene pabA, pabB und pabC nicht vor

(Hendrickson, 2004). Statt dessen erfolgt die Biosynthese von pABA auf einem alternativen

Weg ausgehend von 6-Desoxy-5-ketofruktose-1-phosphat (DKFP) und L-Aspartat-

semialdehyd. Das Genprodukt von aroA katalysiert die Reaktion von DKFP und L-Aspartat-

semialdehyd zu 2-Amino-3,7-didesoxy-D-threohept-6-ulosonat (ADTH), das in einer vom

Genprodukt von aroB katalysierten Reaktion zu 3-Dehydrochinonsäure (DHQ) wird. Daran

schließen sich 5 Reaktionen an, die schließlich zur pABA führen. Porat et al. (2006) schlagen

vor, dass diese Reaktionen von der 3-Dehydrochinat-Aminotransferase (1), der

4-Aminodehydroshikimat-Synthase (2), der 4-Aminoshikimat-Dehydrogenase (3), der

4-Aminoshikimat-Dehydratase (4) und der 4-Aminobenzoesäure-Synthase (5) katalysiert

werden (Abbildung 6-19).

OH

COO

NH3

O OH

HO COO

NH3

O OH

HO COO

NH3

O OH

COO

NH3

HO OH

COO

NH3

OH

COO

1 2 3

COO

O

H3N

CH2OP

HO

O

OH

O

DKFP L-Aspartat-semialdehyd

COO

HO

H3N

O

OHPyruvat

4 5

ADTH

DHQ

Abbildung 6-19: Von Porat et al. (2006) vorgeschlagener Biosyntheseweg von pABA, ausgehend von 6-Desoxy-5-ketofruktose-1-phosphat (DKFP) und L-Aspartat-semialdehyd, als Alternative zur von Chorismat ausgehenden pABA-Synthese.

Diskussion

146

6.4 Zusammenfassung und Ausblick

Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, neben der Entdeckung neuer Mitglieder der

Abyssomicinfamilie wichtige Erkenntnisse zur Biosynthese und zum Wirkmechanismus zu

gewinnen. Durch Fütterung von markiertem Acetat, Propionat und Glucose gelang die

Zuordnung aller Kohlenstoffatome für atrop-Abyssomicin C. Auf der Basis dieser Ergebnisse

und durch Analogieschluss aus der Chlorothricin-Biosynthese konnte eine Hypothese zur

Abyssomicin-Biosynthese aufgestellt werden. Diese Hypothese wird derzeit durch die

Sequenzierung sowie durch die Generierung und Analytik von Knock-Out-Mutanten durch

Frau Mag. rer. nat. Elvira Gottardi und Frau Dipl.-Biol. Hanna von Suchodoletz überprüft. Im

Bereich des Wirkmechanismus konnte eine Zielstruktur von atrop-Abyssomicin C

identifiziert werden, die ADC-Synthase von B. subtilis, die von atrop-Abyssomicin C

irreversibel gehemmt wird. Ziel weiterer Arbeiten durch Herrn Dipl.-Biochem. Heiko Schadt

wird eine Co-Kristallisation von atrop-Abyssomicin C mit ADC-Synthase sein. Desweiteren

sollen Untersuchungen zum Resistenzmechanismus durchgeführt werden, zum einen durch

die Generierung und Evaluierung einer 263Cys->Ala-Mutante von PabB, zum anderen durch

die Analyse der an der pABA-Biosynthese beteiligten Enzyme des Abyssomicin-Produzenten

Verrucosispora AB-18-032. Da die Vermutung nahe liegt, dass die ADC-Synthase nicht das

einzige Target von atrop-Abyssomicin C ist, wird der Fokus weiterer Arbeiten darauf liegen,

zusätzliche Angriffsorte von atrop-Abyssomicin C zu identifizieren.

Literatur

147

7 Literatur Abraham, E.P. (1983)

History of β-lactam antibiotics. In: Antibiotics containing β-lactam structure. (Demain, A.L.: Solomon, N.A. (Hrsg.)) New York/Heidelberg/Berlin/Tokyo (Springer) 1983. Bd. 1, S. 1-14.

Benkovic, S.J. (1984)

The transformylase enzymes in de novo purine biosynthesis, Trends Biochem. Sci. 9: 320-322.

Benveniste, R.; Davies, J. (1973)

Aminoglycosideantibiotic-inactivating enzymes in actinomycetes similar to those present in clinical isolates of antibioticresistant bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 2276–2280.

Benveniste, R.; Davies, J. (1973)

Aminoglycosideantibiotic-inactivating enzymes in actinomycetes similar to those present in clinical isolates of antibioticresistant bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 2276–2280.

Bibb, M.J. (2005)

Regulation of secondary metabolism in streptomycetes. Curr. Opin. Microbiol. 8: 208–215.

Blattner, F.R.; Plunkett, G., III; Bloch, C.A.; Perna, N.T.; Burland, V.; Riley, M.; Col-lado-Vides, J.; Glasner, J.D.; Rode, C.K.; Mayhew, G.F.; Gregor, J.; Davis, N. W.; Kirkpatrick, H.A.; Goeden, M.A.; Rose, D.J.; Mau, B.; Shao, Y. (1997)

Complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science, 277: 1453-1462.

Boccaccio, Giovanni (1350)

Il Decamerone. Aus: Die Pest in Italien. Fünfzig zeitgenössische Quellen. Hrsg. Klaus Bergdolt, 1989, S. 38-51.

Bracher, A.; Schramek, N.; Bacher, A. (2001)

Biosynthesis of pteridines. Stopped-flow kinetic analysis of GTP cyclohydrolase I. Biochemistry, 40: 7896-7902.

Bradford, M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding" Anal. Biochem. 72: 248-254.

Braun, S.; Kalinowski, H.-O.; Berger, S. (2000)

Hundredfifty (150) and More Basic NMR Experiments. A Practical Course. (Braun, S.; Kalinowski, H.-O.; Berger, S., Hrsg.) Wiley-VCH; Weinheim.

Literatur

148

Brown, G.M. and Williamson, J.M. (1987)

Biosynthesis of folic acid, riboflavin, thiamine, and pantothenic acid. In Escherichia coli and Salmonella typhimurium (Neidhardt, F.C., Ingraham, J.L., Low, K.B., Magasanik, B., Schaechter, M. & Umbarger, H.E., Hrsg.), American Society for Microbiology, Washington, DC.; S. 521-538. Bruins, A.P.; Covey, T.R.; Henion, J.D. (1987)

Ion spray interface for combined liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 59: 2642-2646.

Budzikiewicz, H., Schäfer, M. (2005)

Massenspektrometrie. Eine Einführung. Wiley-VCH; Weinheim.

Bulloch, E.M.M.; Jones, M.A.; Parker, E.J.; Osborne, A.P.; Stephens, E., Davies, G.M.; Coggins, J.R.; Abell, C. (2004)

Identification of 4-amino-4-deoxychorismate synthase as the molecular target for the antimicrobial action of (6S)-6-fluoroshikimate. J. Am. Chem. Soc., 126: 9912-9913.

Burchall, J. and Hitchings, G.H. (1965)

Inhibitor binding analysis of dihydrofolate reductases from various species. Mol. Pharmacol., I: 126-136.

Burg, A.W. and Brown, G. M. (1986)

The biosynthesis of folic acid. VIII. Purification and properties of the enzyme that catalyzes the production of formate from carbon atom 8 of guanosine triphosphate. J. Biol. Chem., 243: 2349-2358.

Buvinger, W.E.; Stone, L.C.; Heath, H.E. (1981)

Biochemical genetics of tryptophan synthesis in Pseudomonas acidovorans. J. Bacteriol., 147: 62-68.

Cane, D.E. ; Walsh, C.T. (1999)

The parallel and convergent universes of polyketide synthases and nonribosomal peptide synthetases. Chem. Biol., 6: 319-325.

Carreras, C.W. and Santi, D.V. (1995)

The catalytic mechanism and structure of thymidylate synthase. Annu. Rev. Biochem.; 64: 721-762.

Charlton, Peter A.; Young, Douglas W.; Birdsall, Berry; Feeney, James; Roberts, Gordon C. K. (1979)

Stereochemistry of reduction of folic acid using dihydrofolate reductase. J. Chem. Soc. Chem. Commun., 20: 922-924.

Literatur

149

Copeland, R.A. (2000)

Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism and Data Analysis. (Copeland, R.A., Hrsg.) Wiley-VCH; New York.

Copley, D. and Knowles, J.R. (1985)

The uncatalyzed claisen rearrangement of chorismate to prephenate prefers a transition state of chairlike geometry. J. Am. Chem. Soc., 107: 5306-5308.

Copley, D. and Knowles, J.R. (1987)

The conformational equilibrium of chorismate in solution: implications for the mechanism of the non-enzymatic and the enzyme-catalyzed rearrangement of chorismate to prephenate. J. Am. Chem. Soc., 109: 5008-5013.

Cundliffe, E. (1989)

How antibiotic-producing organisms avoid suicide. Annu. Rev. Microbiol. 43: 207–233. Dagert, M. and Ehrlich, S.D. (1979)

Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells. Gene, 1: 23-28.

Dixon, S.; Ziebart, K.T.; He, Z.; Jeddeloh, M.; Yoo, C.L.; Wang, X.; Lehman, A.; Lam, K.S.; Toney, M.D.; Kurth, M.J. (2006)

Aminodeoxychorismate Synthase Inhibitors from One-Bead One-Compound Combinatorial Libraries: “Staged” Inhibitor Design. J. Med. Chem., 49: 7413-7426.

Domagk, G. (1935)

Chemotherapy of bacterial infections. Dtsch. Med. Wochenschr., 61: 250-253.

Dongré, A.R.; Jones, J.L.; Somogyi, A.; Wysocki, V.H. (1996)

Influence of peptide composition, gas-phase basicity, and chemical modification on fragmentation efficiency: evidence for the mobile proton model. J. Am. Chem. Soc., 118: 8365-8374.

Dosselaere, F. and Vanderleyden, J. (2001)

A metabolic node in action: Chorismate-utilizing enzymes in microorganisms. Crit. Rev. Microbiol., 27: 75-131.

Eckerskorn, C. (1998)

Bioanalytik. (Lottspeich, F. und Zorbas, H.(Hrsg.)) Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlin 1989. S. 344.

Literatur

150

Flannery, A.V.; Beynon, R.J.; Bond, J.S. (1989)

Proteolysis of proteins for sequencing analysis and peptide mapping. In Proteolytic Enzymes: A Practical Approach, (R.J. Beynon and J.S. Bond , Hrsg.), IRL Press, Oxford.

Fleming, A. (1929)

On the antibacterial action of cultures of a Penicillium, with special reference to their use in the isolation of B. influenzae. Br. J. Exp. Pathol., 10: 226-236.

Fuller, A.T. (1937)

Is p-aminobenzenesulfonamide the active agent in prontosil therapy? Lancet, I: 194-198.

Gosset, G.; Bonner, C.A.; Jensen, R.A. (20012)

Microbial origin of plant-type 2-keto-3-deoxy-D-arabinoheptulosonate 7-phosphate synthases, exemplified by the chorismate- and tryptophan-regulated enzyme from Xanthomonas campestris. J. Bacteriol., 183: 4061-4070.

Grant, S.G.; Jessee, J.; Bloom, F.R.; Hanahan, D. (1990)

Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87: 4645-4649.

Green, J.M. and Nichols, B.P. (1991)

p-aminobenzoate biosynthesis in Escherichia coli. purification of aminodeoxychorismate lyase and cloning of pabC. J. Biol. Chem., 226: 12971-12975.

Green, J.M.; Merkel, W. K.; Nichols, B.P. (1992)

Characterization and sequence of Escherichia coli pabC, the gene encoding aminodeoxy-chorismate lyase, a pyridoxal phosphate-containing enzyme. J. Bacteriol., 174: 5317-5323.

Green, J.M.; Nichols, B.P.; Matthews, R.G. (1996)

Folate biosynthesis, reduction and polyglutamylation. In Escherichia coli and Salmonella typhimurium (Neidhardt, F., Hrsg.) 2nd Ed., Vol. 1, S. 665-673.

Hanahan, D. (1983)

Studies on transformation of E. coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166: 557-580.

Hendrickson, E.L.; Kaul, R.; Zhou, Y.; Bovee, D.; Chapman, P.; Chung, J., et al. (2004)

Complete genome sequence of the genetically tractable hydrogenotrophic methanogen Methanococcus maripaludis. J. Bacteriol. 186: 6956-6969.

Hopfgartner, G.; Bean, K.; Henion, J.; Henry, R. (1993)

Ion spray mass spectrometric detection for liquid chromatography: a concentration- or a mass-flow-sensitive device? J. Chromatogr., 647: 51-61.

Literatur

151

Hopwood, D.A. (2007)

How do antibiotic-producing bacteria ensure their self-resistance before antibiotic biosynthesis incapacitates them? Mol. Microbiol. 63: 937-940.

Huang, M. and Gibson, F. (1970)

Biosynthesis of 4-aminobenzoate in Escherichia coli. J. Bacteriol.,102: 767-773.

Hur, S. and Bruice, T.C. (2003)

Comparison of formation of reactive conformers (NACs) for the claisen rearrangement of chorismate to prephenate in water and in the E. coli mutase: the efficiency of the enzyme catalysis. J. Am. Chem. Soc.,125: 5964-5972.

Hur, S. and Bruice, T.C. (2003)

The near attack conformation approach to the study of the chorismate to prephenate reaction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100: 12015-12020.

IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) (1983)

Nomenclature and symbolism for amino acids and peptides. Recommendations [published erratum appears in Eur J Biochem 1993 Apr 1;213(1):2]. Eur. J. Biochem., 138: 9-37.

Jia, X.Y.; Tian, Z.H.; Shao, L.; Qu, X.D.; Zhao, Q.F.; Tang, J.; Tang, G.L.; Liu, W. (2006)

Genetic characterization of the chlorothricin gene cluster as a model for spirotetronate antibiotic biosynthesis. Chem. Biol., 13:575-585.

Kalgutkar, A.S.; Crews, B.C.; Rowlinson, S.W.; Garner, C.; Seibert, K.; Marnett, L.J. (1998)

Aspirin-like molecules that covalently inactivate cyclooxygenase-2. Science., 280: 1268-1270.

Kane, J.F.; Holmes, W.M.; Jensen, R.A. (1972)

Metabolic interlock. The dual function of a folate pathway gene as an extra-operonic gene of tryptophan biosynthesis. J. Biol. Chem., 247:1587-1596.

Kane, J.F. (1977)

Regulation of a common amidotransferase subunit. J. Bacteriol., 132: 419-425

Keating, T.A.; Walsh, C.T. (1999)

Initiation, elongation, and termination strategies in polyketide and polypeptide antibiotic biosynthesis. Curr. Op. Chem. Biol., 3:598-606.

Literatur

152

Kelly, W.L., Townsend, C.A. (2003)

Role of the cytochrome P450 NocL in nocardicin A biosynthesis. J. Am. Chem. Soc., 124: 8186-8187.

Kozlowski, Marisa C.; Tom, Norma J.; Seto, Christopher T.; Sefler, Andrea M.; Bart-lett, Paul A. (1995)

Chorismate-utilizing enzymes isochorismate synthase, anthranilate synthase, and p-amino-benzoate synthase: mechanistic insight through inhibitor design. J. Am. Chem. Soc., 117: 2128-2140.

Lu, W.-P.;Kincaid, E.; Sun, Y.; Bauer, M.D. (2001)

Kinetics of β-lactam interactions with penicillin-susceptible and -resistant penicillin-binding protein 2x proteins from Streptococcus pneumoniae. Involvement of acylation and deacylation in β-lactams. J. Biol. Chem., 276: 31494–31501.

Lugtenberg, B.; Meijers, J.; Peters, R.; van der Hoek, P.; van Alphen, L. (1975)

Electrophoretic resolution of the "major outer membrane protein" of Escherichia coli K12 into four bands. FEBS Lett., 58: 254-258.

Mann, M.; Hendrickson, R.C.; Pandey, A. (2001)

Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry. Ann. Rev. Biochem. 70: 437-473.

Mathis J.B. and Brown, G.M. (1980)

Dihydroneopterin aldolase from Escherichia coli. Methods Enzymol., 66: 556-560.

Martí, S., Roca, M., Andrés, J., Moliner, V., Silla, E., Inaki J.B. Bertrán, J. (2003)

Theoretical insights in enzyme catalysis. Chem. Soc. Rev., 33: 89-107.

McLuckey, S.A. and Wells, J.M. (2001)

Mass analysis at the advent of the 21st century. Chem. Rev., 101: 571-606.

Morollo, A.A.; Bauerle, R. (1993)

Characerization of composite aminodeoxyisochorismate synthase and aminodeoxy-isochorismate lyase acticities of anthranilate synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 9983-9987.

Mueller, D.R.; Eckersley, M.; Richter, W.J. (1988)

Hydrogen transfer reactions in the formation of "Y + 2" sequence ions from protonated peptides. Org. Mass Spectrom., 23: 217-222.

Literatur

153

Mueller, W.T. and Benkovic, S.J. (1981)

On the purification and mechanism of 5-aminoimidazole-4-carboxyamide-ribonucleotide transformylase from chicken liver. Biochemistry, 20: 337-334.

Nakai, T.; Mizutani, H.; Miyahara, I.; Hirotsu, K.; Takeda, S.; Jhee, K.H.; Yoshimura, T.; Esaki, N. (2000)

Three-dimensional structure of 4-amino-4-deoxychorismate lyase from Escherichia coli. J. Biochem., 128: 29-38

Northey, E.H. (1940)

Structure and chemotherapeutic activities of sulfanilamide derivatives. Chem. Rev., 27: 85-197.

Nichol, C.A. and Welch, A.D. (1950)

Mechanism of action of aminopterin. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 74: 403-411.

Nichols, B.P.; Seibold, A.M.; Doktor, S.Z. (1989)

para-Aminobenzoate synthesis from chorismate occurs in two steps. J. Biol. Chem., 25: 8597-8601.

Nicolaou, K.C.; Harrison, S.T. (2006)

Total Synthesis of Abyssomicin C and atrop-Abyssomicin C. Angew. Chem. Int. Ed., 45, 3265-3260

Parry, R.J.; Li, W.; Cooper, H.N. (1997)

Cloning, analysis, and overexpression of the gene encoding isobutylamine N-hydroxylase from the valanimycin producer, Streptomyces viridifaciens. J Bacteriol., 179: 409-416.

Parsons, J.F.; Jensen, P.Y.; Pachikara, A.S.; Howard, A.J.; Eisenstein, E.; Ladner, J.E. (2002)

Structure of Escherichia coli aminodeoxychorismate synthase: architectural conservation and diversity in chorismate-utilizing enzymes. Biochemistry, 19: 2198-2208.

Paul, W. and Steinwedel, Z. (1953)

A new mass spectrometer without magnetic field. Z. Naturforsch., 8a: 448-450.

Paul, W. (1990)

Electromagnetic traps for charged and neutral particles. Rev. Mod. Phys., 62: 531-540.

Literatur

154

Porat, I.; Sieprawska-Lupa, M.; Teng, Q.; Bohanon, F.J.; White, R.H.; Whitman, W.B. (2006)

Biochemical and genetic characterization of an early step in a novel pathway for the biosynthesis of aromatic amino acids and p-aminobenzoic acid in the archaeon Methanococcus maripaludis. Mol. Microbiol., 62: 1117-1131.

Qiagen (1997)

Plasmid purification handbook. Qiagen GmbH, Hilden.

Ranaghan, K.E., Ridder, L., Szefczyk, B., Sokalski, W.A., Hermann, J.C., Mulholland, A.J. (2004)

Transition state stabilization and substrate strain in enzyme catalysis: ab initio QM/MM modelling of the chorismate mutase reaction. Org. Biomol. Chem., 2: 968-980.

Riedlinger, J.; Reicke, A.; Zähner, H.; Krismer, B.; Bull, A.T.; Maldonado, L.A.; Ward, A.C.; Goodfellow, M.; Bister, B.; Bischoff, D.; Süssmuth, R.D.; Fiedler, H.-P. (2004)

Biosynthetic capacities of Actinomycetes: abyssomicins, inhibitors of the para-aminobenzoic acid pathway produced by the marine Verrucosispora strain AB-18-032. J. Antibiot., 57: 271-279.

Roepstorff, P. and Fohlman, J. (1984)

Proposal for a common nomenclature for sequence ions in mass spectra of peptides. Biom. Mass Spectrom., 11: 601.

Rome, L.H. and Lands, W.E.M. (1975)

Structural requirements for time-dependent inhibition of prostaglandin biosynthesis by anti-inflammatory drugs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 4863-4865.

Roux, B. and Walsh, C.T. (1992)

p-Aminobenzoate synthesis in Escherichia coli: kinetic and mechanistic characterization of the amidotransferase PabA. Biochemistry, 31: 6904-6910.

Saiki, R.K.; Gelfand, D.H.; Stoffel, S.; Scharf, S.J.; Higuchi, R.; Horn, G.T.; Mullis, K.B.; Erlich, H.A. (1988)

Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 239: 487-491.

de Saizieu, A.; Vankan, P.; Vockler, C.; van Loon, A.P. (1997)

The trp RNA-binding attenuation protein (TRAP) regulates the steady-state levels of transcripts of the Bacillus subtilis folate operon. Microbiology, 143: 979-989.

Literatur

155

Sambrook, J. and Russel, D.W. (2001)

Molecular cloning: a laboratory manual. (Sambrook, J. and Russel, D.W., Hrsg.) Cold Spring Habour Laboratory Press, Cold Spring Harbour. S. 1.110.

Sawula, R.V. and Crawford, I.P. (1972)

Mapping of the tryptophan genes of Acinetobacter calcoaceticus by transformation. J. Bacteriol., 112:797-805.

Sawula, R.V. and Crawford, I.P. (1973)

Anthranilate synthetase of Acinetobacter calcoaceticus. Separation and partial characterization of subunits. J Biol Chem., 248: 3573-3581.

Shen, B. (2003)

Polyketide biosynthesis beyond the type I, II and III polyketide synthase. Curr. Op. Chem. Biol., 7:285–295.

Simpson, T.J. (1998)

Application of isotopic methods to secondary metabolic pathways. Top. Curr. Chem., 195:1–48.

Sköld, O. (2001)

Resistance to trimethoprim and sulfonamids. Vet. Res. 32: 261-273.

Slock, J.; Stahly, D.P.; Han, C.Y.; Six, E.W.; Crawford; I.P. (1990)

An apparent Bacillus subtilis folic acid biosynthetic operon containing pab, an amphibolic trpG gene, a third gene required for synthesis of para-aminobenzoic acid, and the dihydrop-teroate synthase gene. J. Bacteriol. 172: 7211-7226.

Staunton, J und Weissman, K.J. (2001)

Polyketide biosynthesis: a millennium review. Nat. Prod. Rep., 18, 380–416.

Studier, F.W. and Moffatt, B.A. (1986)

Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol., 189: 113-130.

Tabor, S.; Richardson, C.C. (1985)

A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 1074-1078.

Literatur

156

Tabor, S. (1996)

Expression using the T7 RNA polymerase/promoter system. In: Current protocols in mo-lecular biology. (Ausubel, F.M.; Brent, R.; Kingston, R.E.; Moore, D.D.; Seidman, J.G.; Smith, J.A.; Struhl, K. (Hrsg.)) John Wiley & Sons, Inc. New York. Kap. 16.2.

Thariath A., Socha D., Valvano M.A., Viswanatha T. (1993)

Construction and biochemical characterization of recombinant cytoplasmic forms of the IucD protein (lysine:N6-hydroxylase) encoded by the pColV-K30 aerobactin gene cluster. J Bacteriol.,175: 589-596.

Then, R.L. (1982)

Mechanisms of resistance to trimethoprim, the sulfonamides, and trimethoprim-sulfameth-oxazole. Rev Infect Dis. 4: 261-269.

http://www.expasy.org/tools/peptidecutter/ Viswanathan, V.K.; Green, J.M.; Nichols, B.P. (1995)

Kinetic characterization of 4-amino-4-deoxychorismate synthase from Escherichia coli. J. Bacteriol., 177: 5918-23.

Wysocki, V.H.; Tsaprailis, G.; Smith, L.L.; Breci, L.A. (2000)

Mobile and localized protons: a framework for understanding peptide dissociation. J. Mass Spectrom., 35: 1399-1406.

Xie, G.; Keyhani, N.O.; Bonner, C.A.; Jensen, R.A. (2003)

Ancient origin of the tryptophan operon and the dynamics of evolutionary change. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 67: 303-342.

Ye, Q.Z.; Liu, J.; Walsh, C.T. (1990)

p-Aminobenzoate synthesis in Escherichia coli: purification and characterization of PabB as aminodeoxychorismate synthase and enzyme X as aminodeoxychorismate lyase. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.;87: 9391-9395.

Zalkin, H. and Smith, J.L. (1998)

Enzymes utilizing glutamine as an amide donor. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 72: 87-144.

Zapf, C.W.; Harrison, B.A.; Drahl, C. Sorensen, E.J (2005)

A Diels–Alder Macrocyclization Enables an Efficient Asymmetric Synthesis of the Antibacterial Natural Product Abyssomicin C. Angew. Chem. Int. Ed, 44, 6533-6537.

Abbildungsverzeichnis

157

8 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1-1. Struktur der Tetrahydrofolsäure........................................................................ 2 Abbildung 1-2. Schritte der Purinbiosynthese, an denen THF beteiligt ist. GAR =

Glycinamid-β-D-ribofuranosyl-5’-monophosphat; FGAR = Formylglycinamid-β-D-ribofuranosyl-5’-mono-phosphat; GAR TFase = Glycinamidribonucleotid Transformylase; AICAR = 5-Amino-4-imidazolcarboxamid-β-1-D-ribofuranosyl-5’-monophosphat; FAICAR = 1’-[(5-Formylamino)-4-(aminocarbonyl)-1-imidazolyl]-β-D-ribofuranosyl-5’-monophosphat; AICAR TFase = 5-Amino-4-imidazolcarboxamid-ribonucleotid Transformylase ............................................................................................ 3

Abbildung 1-3. Die Biosynthese von dTMP aus dUMP durch Thymidylat-Synthase. Alle drei Wasserstoffatome der Methylgruppe stammen von N5,N10-Methylentetrahydrofolat (grau hinterlegt). Deshalb muss das bei der dTMP-Biosynthese entstehende 7,8-Dihydrofolat durch Dihydrofolat-Reduktase wieder zu Tetrahydrofolat reduziert werden. Der mit Glutamat verknüpfte para-Benzoylrest des Tetrahydrofolats ist in der Abbildung mit R bezeichnet........................................................................................................................... 4

Abbildung 1-4. Struktur von Sulfanilamid, dem antibiotisch wirksamen Metaboliten des Prontosils............................................................................................................................ 5

Abbildung 1-5. Die Tetrahydrofolatbiosynthese und bekannte Inhibitoren. ............................ 6 Abbildung 1-6. Struktur des Folsäureantagonisten Methotrexat. .............................................. 7 Abbildung 1-7. Strukturformeln der Abyssomicine B, C und D. .............................................. 7 Abbildung 1-8: Röntgenstrukturen von Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C. ................ 9 Abbildung 1-9: UV-Spektren von Abyssomicin C (links) und atrop-Abyssomicin C (rechts). 9 Abbildung 1-10. Biosynthesewege wichtiger Stoffwechselprodukte, die von Chorismat

ausgehen. .......................................................................................................................... 12 Abbildung 1-11. Genorganisation des Folat-Operons. Die Richtung der Transkription ist von

links nach rechts. Die kodierenden Sequenzen sind durch Pfeile gezeigt, die Zahlen bezeichnen die Position der ersten Base des Startcodons ATG und der letzten Base des Stoppcodons. Oberhalb des Folat-Operons sind die vier möglichen Transkripte eingezeichnet. ................................................................................................................... 13

Abbildung 1-12. Ausschnitt aus der Folsäurebiosynthese. Unter den Enzymen sind jeweils die codierenden Gene aufgeführt, dabei sind die Gene aus dem Folat-Operon grau hinterlegt........................................................................................................................................... 14

Abbildung 1-13. Die katalytische Triade von Glutamin-Amidotransferasen. Der Cysteinrest greift nucleophil am Glutamin an, der Histidinrest wirkt als Protonendonor bei der Hydrolysereaktion, und der Glutamatrest stabilisiert das protonierte Histidin. ............... 15

Abbildung 1-14. Möglicher Mechanismus von PabB nach Kozlowski et al. Die Reaktion verläuft über eine sequenzielle 1,3-Substitution unter Retention der Position und der Stereochemie. In Version A erfolgt der nucleophile Angriff durch eine Aminosäure des Enzyms, in Version B durch die Enolpyruvyl-Seitenkette. Weiterhin könnte auch Wasser als Nucleophil dienen (nicht dargestellt).......................................................................... 16

Abbildung 1-15. Bändermodell von PabB aus E. coli. Die Kristalle wurden in Ameisensäure gezüchtet. Im Kalottenmodell dargestellt sind ein Molekül Ameisensäure und ein Molekül Tryptophan, das möglicherweise stabilisierende Funktion besitzt (Parsons et al., 2002)................................................................................................................................. 17

Abbildung 1-16: Überlagerung der Kristallstrukturen der ADC-Synthase (grau) und der Anthranilatsynthase (rosa) von E. coli. Das grüne Atom ist Magnesium, die Zahlen beziehen sich auf die ADC-Synthase. (Quelle: He et al, 2004)....................................... 18

Abbildung 1-17: Ausschnitt aus dem Alignment der PabB Sequenz von B. subtilis und E. coli........................................................................................................................................... 18


158

Abbildung 1-18. Bändermodell des PabC-Homodimers mit dem Cofaktor PLP. Eine der Untereinheiten ist in grau dargestellt, die große und kleine Domäne der anderen Untereinheit sind in weiß bzw. schwarz abgebildet (Nakai et al., 2000)......................... 19

Abbildung 1-19. Mechanismus von PabC nach Nakai et al.. Aminodesoxychorismat bildet eine Schiff-Base mit PLP, wodurch ein katalytisch aktives Lysin frei wird, das eine Wasserstoffbrücke mit einem Threoninrest ausbildet. Die neutrale Aminogruppe des Lysins eliminiert ein Proton des ADC, wodurch ein chinoides PLP-Zwischenprodukt entsteht. Nun kann nach Rearomatisierung des Cofaktors Pyruvat abgespalten werden, wobei ein Proton von Threonin auf den olefinischen Teil des ADC übertragen wird.. 21

Abbildung 1-20. Pseudo-diäquatoriale und pseudo-diaxiale Konformation von Chorismat in wässriger Lösung im Vergleich zur Struktur von Abyssomicin C................................... 22

Abbildung 1-21. Michael-Addition eines Nucleophils an Abyssomicin C.............................. 22 Abbildung 1-22: Schematische Darstellung der Erythromycin Polyketidsynthase. ................ 25 Abbildung 1-23: Synthese des C-3 Bausteins der Tetronsäureeinheit aus einem

Glykolyseintermediat durch die Proteine ChlD1, ChlD2, ChlD3 und ChlD4. ................ 27 Abbildung 1-24: Biosyntheseweg des Chlorothricins nach Jia et al. ....................................... 28 Abbildung 2-1: Schematische Darstellung des ESI-Prozesses. Quelle: Bioanalytik.

(Lottspeich, F. und Zorbas, H.(Hrsg.)) Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlin 1989. S. 349........................................................................................ 29

Abbildung 2-2: Schematische Abbildung der TurboIon Quelle der QTrap 2000. Quelle: W.M.A. Niessen, J. Chromatogr. A 856 (1999) 179 –197............................................... 32

Abbildung 2-3. Fragmentierung von Peptiden (Nomenklatur nach Roepstorff und Fohlmann, 1984). Die Fragmente, die durch Bindungsbruch entstehen können, sind unten angegeben. Modifiziert nach Eckerskorn (1998). ............................................................ 34

Abbildung 2-4. Zeitskalen von zweidimensionalen NMR-Experimenten. .............................. 35 Abbildung 2-5. Pulssequenz für das H,H-COSY..................................................................... 36 Abbildung 2-6. Pulsprogramm für das TOCSY-Experiment. MLEV-17 ist die Form des Spin-

Locks im TOCSY-Experiment. ........................................................................................ 38 Abbildung 4-1. Schematische Darstellung des Plasmids PrSet_6His_PP. Eingezeichnet sind

neben den Restriktionsschnittstellen der Hexa-His-Tag, die Erkennungssequenz der Prescission Protease, die Promotorregion Φ10 und das für die Ampicillinresistenz verantwortliche β-Lactamasegen bla. .............................................................................. 57

Abbildung 4-2. Biosynthese von Aminodesoxychorismat (ADC) aus Chorismat durch das Enzym ADC-Synthase ..................................................................................................... 70

Abbildung 4-3: Chromatogramm des MRM 226/191 mit integriertem ADC-Peak. ............... 74 Abbildung 5-1: Röntgenstrukturen von Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C. .............. 75 Abbildung 5-2: UV-Spektren von Abyssomicin C (links) und atrop-Abyssomicin C (rechts).

.......................................................................................................................................... 76 Abbildung 5-3: 13C-Übersichtsspektrum von atrop-Abyssomicin C in MeOD. ...................... 76 Abbildung 5-4: 13C-Übersichtsspektrum von Abyssomicin C. Mit freundlicher Genehmigung

von Dr. Bojan Bister aus „Abyssomicin C- ein neues Antibiotikum aus dem marinen Micromonospora-Stamm AB-18-032 als Inhibitor der p-Aminobenzoesäure/Tetrahydrofolat-Biosynthese – Isolierung und Strukturaufklärung“ 77

Abbildung 5-5: Abyssomicin B und C im Vergleich. .............................................................. 79 Abbildung 5-6: 1H-Übersichtsspektrum von Abyssomicin B in MeOD.................................. 80 Abbildung 5-7: 13C-Übersichtsspektrum von Abyssomicin B in MeOD................................. 80 Abbildung 5-8: Ausschnitt aus dem HMBC-Spektrum von Abyssomicin B in MeOD .......... 81 Abbildung 5-9: a) HPLC-DAD Chromatogramm von Abyssomicin B (RT = 5,13 min) und B’

(RT = 5,32 min); b) UV-Spektren von Abyssomicin G (links) und B (rechts)............... 83 Abbildung 5-10. Hypothese zur Struktur von Abyssomicin B’. Die vermuteten

Gleichgewichtstautomere des Isoxazolinrings sind in Klammern gefaßt. (Mit


159

freundlicher Genehmigung von Dr. Bojan Bister aus „Abyssomicin C- ein neues Antibiotikum aus dem marinen Micromonospora-Stamm AB-18-032 als Inhibitor der p-Aminobenzoesäure/Tetrahydrofolat-Biosynthese – Isolierung und Strukturaufklärung“).......................................................................................................................................... 84

Abbildung 5-11: LC-MS Chromatogramm (XIC 378) des Ethylacetatextrakts. Die Spektren zu den Retentionszeiten 4,76 min (Abyssomicin B) und 5,00 min (Abyssomicin G) sind ebenfalls abgebildet. Beide Substanzen zeigen ein [M+H]+ Signal bei m/z = 378,4 sowie ein [M+Na]+ Signal bei m/z = 400,3. ............................................................................... 84

Abbildung 5-12: ESI-FT-ICR-Massenspektrum von Abyssomicin G. .................................... 86 Abbildung 5-13: HMQC-Spektrum von Abyssomicin G ........................................................ 87 Abbildung 5-14: Ausschnitt aus dem HMBC-Spektrum von Abyssomicin G in MeOD.

Abgebildet ist der Bereich von 0,8 bis 4 ppm im 1H und von 205 bis 218 ppm im 13C (Bereich des C-7). ............................................................................................................ 88

Abbildung 5-15: Abyssomicin B und G im Vergleich............................................................. 88 Abbildung 5-16: HPLC-DAD Chromatogramm von Abyssomicin H (RT = 5,24 min),

Abyssomicin B, G und C sowie das UV-Spektrum von Abyssomicin H. ....................... 90 Abbildung 5-17: LC-MS Chromatogramm (XIC 349) des Ethylacetatextrakts. Die Spektren

zu den Retentionszeiten 5,66 min (Abyssomicin H) und 7,15 min (Abyssomicin D) sind ebenfalls abgebildet. Beide Substanzen zeigen ein [M+H]+ Signal bei m/z = 349,4 bzw. 349,3. ................................................................................................................................ 91

Abbildung 5-18: : 13C-Übersichtsspektrum von Abyssomicin H in DMSO............................ 91 Abbildung 5-19: (atrop-) Abyssomicin C und Abyssomicin H im Vergleich. ........................ 92 Abbildung 5-20: HPLC-MS (oben) und HPLC-DAD (unten) Chromatogramm des

Ethylacetatextrakts des Kulturfiltrats von Verrucosispora AB-18-032. Markiert sind Amino- und Hydroxylaminoabyssomicin mit den Retentionszeiten 4,1 bzw. 5,4 min. .. 94

Abbildung 5-21: Strukturformeln des Hydroxylamino- und des Aminoabyssomicins............ 95 Abbildung 5-22: Extrahierter Ionenstrom von m/z = 364 des synthetisch erzeugten

Aminoabyssomicin mit dazugehörigem Massenspektrum. Die Retentionszeit (4,1 min) entspricht dem natürlichen Aminoabyssomicin. .............................................................. 95

Abbildung 5-23: Extrahierter Ionenstrom von m/z = 380 des synthetisch erzeugten Hydroxylaminoabyssomicin mit dazugehörigem Massenspektrum. Die Retentionszeit (5,4 min) entspricht dem natürlich vorkommenden Hydroxylaminoabyssomicin........... 96

Abbildung 5-24: Strukturformel eines Abyssomicindimers. ................................................... 96 Abbildung 5-25: Strukturformel von Netropsin, Distamycin und Proximicin C, vormals

Abyssomicin A. ................................................................................................................ 97 Abbildung 5-26: Strukturformeln der bisher charakterisierten Abyssomicine B, C, D, G, H

und atrop-Abyssomicin C................................................................................................. 98 Abbildung 5-27: UV-Spektren der bisher vollständig charakterisierten Abyssomicine im

Vergleich. ......................................................................................................................... 99 Abbildung 5-28: 13C Spektrum von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1-13C-Acetat.

Deutlich sichtbar ist die Markierung von C-1 (171,4 ppm), C-7 (204,2 ppm), C-9 (140,8 ppm), C-11 (67,6 ppm) und C-13 (26,3 ppm)................................................................ 100

Abbildung 5-29: Einbau von 1-13C-Acetat in atrop-Abyssomicin C ..................................... 101 Abbildung 5-30: 13C-Übersichtsspektrum von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-

13C-Acetat....................................................................................................................... 101 Abbildung 5-31: Ausschnitt aus dem 13C-Spektrum (120 ppm – 150 ppm, C-8 und C-9) von

atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-13C-Acetat. Gut zu sehen ist die Aufspaltung in Tripletts, bedingt durch die Kopplung der benachbarten 13C aus der Acetateinheit. Zu beachten ist hier jedoch, dass die Kopplung zwischen C-7 und C-8 sowie zwischen C-9 und C-10 erfolgt. ........................................................................... 102

Abbildung 5-32: Einbau von 1,2-13C-Acetat in atrop-Abyssomicin C .................................. 103


160

Abbildung 5-33: 13C Spektrum von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1-13C-Propionat. Deutlich sichtbar ist die Markierung von C-3 (201,7 ppm) und C-5 (39,7 ppm). .............................................................................................................................. 103

Abbildung 5-34: Einbau von 1-13C-Propionat (rot, graue Kreise) und 1,2-13C-Acetat (grün, schwarze Quadrate) in atrop-Abyssomicin C................................................................. 104

Abbildung 5-35: 13C-Übersichtsspektrum von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-13C-Glucose. ................................................................................................................... 105

Abbildung 5-36: Ausschnitt aus dem 13C-Spektrum (C-15) von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-13C-Glucose. Die Aufspaltung in Tripletts, bedingt durch die Kopplung der benachbarten 13C-15 und 13C-14, beweist, dass hier C-1 und C-2 der Glucoseeinheit eingebaut wurden. ................................................................................. 105

Abbildung 5-37: Ausschnitt aus dem 13C-Spektrum (C-14) von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-13C-Glucose. Die Aufspaltung in Tripletts, bedingt durch die Kopplung der benachbarten 13C-15 und 13C-14, beweist, dass hier C-1 und C-2 der Glucoseeinheit eingebaut wurden. ................................................................................. 106

Abbildung 5-38: Biosynthese des Vorläufers der 3-Kohlenstoff-Einheit der Tetronsäure aus Glucose unter Berücksichtigung der 13C-Markierug und deren Verbleib im Vorläufer.106

Abbildung 5-39: Einbau von 1-13C-Propionat (rot, graue Kreise), 1,2-13C-Acetat (grün, schwarze Quadrate) und 1,2-13C-Glucose (blau, gestreifte Fünfecke) in atrop-Abyssomicin C. .............................................................................................................. 107

Abbildung 5-40: Plasmid pT7-7 mit pabA aus B.subtilis. Darunter die Nucleotid- und die Aminosäuresequenzen.................................................................................................... 108

Abbildung 5-41: Plasmid PrSet_6His_PP mit pabB aus B. subtilis. Darunter die Nucleotid- und die Aminosäuresequenz........................................................................................... 109

Abbildung 5-42. PabA nach Reinigung. M: Protein Marker; A: gereinigtes PabA, 21,4 kDa......................................................................................................................................... 110

Abbildung 5-43: PabB nach Reinigung. ................................................................................ 111 Abbildung 5-44: Bildung von Abyssomicin H und D durch Umsatz von atrop-Abyssomicin C

mit NaBH4 (oben) sowie die mögliche Bildung zweier N-Acetylcystein-Abyssomicin-Addukte. ......................................................................................................................... 112

Abbildung 5-45: Strukturformeln von Abyssomicin D sowie den Mercaptoethanol- und N-Acetylcysteinaddukten von atrop-Abyssomicin C. ........................................................ 113

Abbildung 5-46: Ausschnitt aus dem HMBC-Spektrum des N-Acetylcystein-Abyssomicin im 13C-Bereich von ca. 75 bis 95 ppm mit C-15 (88,0 ppm) und C-16 (86,3 ppm)............ 113

Abbildung 5-47: Mechanismus der Umsetzung von N-Acetylcystein mit atrop-Abyssomicin C. .................................................................................................................................... 113

Abbildung 5-48: HPLC-MS Chromatogramm der Peptide aus dem GluC-Verdau von PabB (oben) und PabB + atrop-Abyssomicin C (unten). Mit dem Pfeil markiert ist das zusätzlich auftretende Peptid von m/z = 827 bei der Retentionszeit 31 min.................. 115

Abbildung 5-49: MS/MS Spektrum des Peptids m/z = 827. .................................................. 116 Abbildung 5-50: pH-Wert- und Temperaturabhängigkeit der ADC-Synthase ...................... 117 Abbildung 5-51: Bestimmung des KM-Wertes der ADC-Synthase ....................................... 117 Abbildung 5-52: Enzyminaktivierung der ADC-Synthase durch atrop-Abyssomicin in

Abhängigkeit von der Präinkubationszeit und der Inhibitorkonzentration. ................... 120 Abbildung 5-53: Plot der Geschwindigkeitskonstante kobs gegen die Inhibitorkonzentration.

........................................................................................................................................ 121 Abbildung 6-1. Hypothese zur Biosynthese von Abyssomicin G und B via Michaeladdition

von Ammoniak und anschließender Oxidation, vermutlich durch eine Monooxygenase (Weg A) oder alternative via Michaeladdition von Hydroxylamin (Weg B) an abyssomicin C / atrop-abyssomicin C............................................................................ 123


161

Abbildung 6-2: Von Townsend vorgeschlagener Mechanismus zur Biosynthese eines N-Oxims. ............................................................................................................................ 124

Abbildung 6-3: Hypothese zur Biosynthese der Abyssomicine D und H. Die erste Möglichkeit ist die Michaeladdition eines Hydrogenäquivalents (vermutlich NADPH) an Abyssomicin C / atrop-Abyssomicin C, im Falle von Abyssomicin D gefolgt von einer Umlagerung (Weg A). Denkbar, wenn auch weniger wahrscheinlich wäre die Synthese von Abyssomicin H durch eine fehlfunktionierende Enoylreduktase eines PKS-Moduls der Abyssomicinbiosynthese.......................................................................................... 125

Abbildung 6-4: Einbau von 1-13C-Propionat (rot, graue Kreise), 1,2-13C-Acetat (grün, schwarze Quadrate) und 1,2-13C-Glucose (blau, gestreifte Fünfecke) in atrop-Abyssomicin C. .............................................................................................................. 129

Abbildung 6-5: Hypothese zum Aufbau der Abyssomicin-Polyketidsynthase auf der Basis der Fütterungsversuche und des Chlorothricinbiosyntheseclusters...................................... 129

Abbildung 6-6: Hypothese zur Biosynthese des linearen Vorläufers von atrop-Abyssomicin C auf der Basis der Fütterungsversuche (schwarze Quadrate: Acetat, graue Kreise: Propionat, gestreifte Fünfecke: Enoylpyruvat aus Glucose). ......................................... 130

Abbildung 6-7: Hypothese zur Zyklisierung des linearen Vorläufers analog zur Chlorothricin-Biosynthese. ................................................................................................................... 131

Abbildung 6-8: Strukturformeln von Chlorothricin und Abyssomicin in einer Darstellungsweise, die die Analogie der beiden Substanzen aufzeigt. .......................... 131

Abbildung 6-9: Schematische Darstellung des Einbaus von Acetat- und Propionateineheiten sowie von Enoylpyruvat bei A) Chlorothricin und B) Abyssomicin. ............................ 133

Abbildung 6-10: Strukturen von Chorismat, Fluorchorismat und (atrop-) Abyssomicin C. . 135 Abbildung 6-11: Wirkmechanismus von atrop-Abyssomicin und Fluorchorismat im

Vergleich. ....................................................................................................................... 136

Tabellenverzeichnis

162

9 Tabellenverzeichnis Tabelle 1-1. Antibakterielles Spektrum von Abyssomicin C. Angegeben sind die Hemmhöfe

des Plattendiffusionstests in mm bei Verwendung von Komplexmedium (Riedlinger et al., 2004). ........................................................................................................................... 8

Tabelle 4-1. LC-MS Routinegradient....................................................................................... 59 Tabelle 4-2. LC-DAD Routinegradient.................................................................................... 59 Tabelle 4-3. HPLC-Säulen. ...................................................................................................... 60 Tabelle 4-4. Präparative HPLC-Säule. ..................................................................................... 60 Tabelle 4-5. Gradienten der präparativen HPLC-MS-Läufe.................................................... 61 Tabelle 4-6. Gradient zur Analyse des GluC-Verdaus............................................................. 70 Tabelle 4-7. LC-MS Gradient für MRM.................................................................................. 71 Tabelle 4-8. HPLC-Säulen. ...................................................................................................... 71 Tabelle 4-9. Parameter des Massenspektrometers zum MRM................................................. 72 Tabelle 5-1: 1H und 13C-NMR-chemische Verschiebungen von atrop-Abyssomicin C und

Abyssomicin C in MeOD................................................................................................. 78 Tabelle 5-2: 1H und 13C-NMR-chemische Verschiebungen von Abyssomicin B in MeOD und

DMSO .............................................................................................................................. 82 Tabelle 5-3: 1H und 13C-NMR-chemische Verschiebungen von Abyssomicin G in MeOD ... 89 Tabelle 5-4: 1H und 13C-NMR-chemische Verschiebungen von Abyssomicin H in MeOD und

DMSO .............................................................................................................................. 93 Tabelle 5-5: [M+H]+, Summenformel, Retentionszeit auf der Analytischen HPLC sowie die

chemischen Verschiebungen von C-8 und C-9 als herausragende Unterscheidungsmerkmale der bisher charakterisierten Abyssomicine........................... 98

Tabelle 5-6: NMR Daten von Abyssomicin D, dem Abyssomicin-Mercaptoethanol Addukt und dem Abyssomicin-N-acetylcysteine Addukt (in MeOD[D4], 298 K) .................... 114

163

Danksagung

Bei Prof. Dr. Roderich Süßmuth möchte ich mich herzlich bedanken für die Überlassung des

interessanten Themas, für die Möglichkeit, selbstständig zu arbeiten und für sein

unerschöpfliches Vertrauen in mich.

PD Dr. Ullrich Keller danke ich für interessante und anrengende Diskussionen.

Prof. Dr. Volkmar Braun und Frau Dr. Silke Patzer danke ich für das Bereitstellen eines

Arbeitsplatzes zu Tübingener Zeiten und für die Möglichkeit, dort molekularbiologische

Arbeiten durchzuführen.

Prof. Dr. Hans-Peter Fiedler und seiner Arbeitsgruppe danke ich für die hervorragende

Kooperation.

Herrn Ingo Ortel danke ich für die Hilfe und Unterstützung bei der Aufreinigung der Proteine.

Herrn Dr. Reinhard Zeisberg, Herrn Paul Schuler und Dr. Peter Schmieder danke ich für viele

gute Tipps bei den NMR-Messungen.

Frau Kathrin Schneider danke ich für die gute und erfolgreiche Zusammenarbeit bei mehreren

Projekten und für viele hilfreiche Diskussionen rund um die Strukturaufklärung.

Bei Falko Wolter bedanke ich mich für die Synthese von Naturstoffen für einige Projekte und

für unzählige Tipps und Informationen zum Thema Organische Chemie

Elvira Gottardi und Hanna von Suchodoletz danke ich für die gute und sehr produktive

Zusammenarbeit bei den Arbeiten zur Aufklärung der Abyssomicin-Biosynthese.

Allen Praktikanten, die an dem Projekt mitgewirkt haben, danke ich für ihre Hilfe, besonders

hervorheben möchte ich Louise Aigran, die drei Monate lang sehr gute Arbeit geleistet hat.

Den „Massenspektrometrikern“ der Gruppe, Diane Butz, Timo Schmiederer und Kathrin

Schneider danke ich für die gute Zusammenarbeit an der QTrap, für ihr Verständnis und ihre

164

Kooperationsbereitschaft, insbesondere für die Möglichkeit, in den letzten Monaten dieser

Arbeit quasi ständig das MS blockieren zu dürfen.

Allen Kollegen aus dem Süßmuth-Labor möchte ich danken: Dr. Stefan Weist, Dr. Bojan

Bister, Dr. Marcelo Bertasso, Dr. Andreas Reicke, Suada Turkanovic, Heiko Schadt, Kathrin

Schneider, Falko Wolter, Diane Butz, Timo Schmiederer, Elvira Gottardi, Stefan Pohle,

Hanna von Suchodoletz, Dr. Christian Appelt, Frank Dettner, Dr. Sven Feifel, Carolin

Schlosser, Maik Henkel, Georg Sambeth, Anne Hänchen, Dr. Walter Affo, Pierre-Henri

Berriere.

Meinen Kommilitonen danke ich für schöne gemeinsame Studienzeit, insbesondere für die

großartigen Tage im Winter auf der Hütte im Schwarzwald, für’s sommerliche Zelten am

Bodensee und die Wandertouren in den Dolomiten.

Bei meiner Freundin Leah Herrgen bedanke ich mich für die ihre Freundschaft über die

gemeinsame Studienzeit und über die Distanz Berlin-Köln hinaus.

Meinem Freund Heiko Schadt danke ich für seine Unterstützung und Hilfe, für viele gute

Ideen, und für unsere wunderschöne gemeinsame Zeit in Tübingen und Berlin!

Meiner lieben Großmutter danke ich für ihre Unterstützung.

Meinem Bruder Michael danke ich für seelisch-moralische Unterstützung (und dafür, dass er

mir als permanent bis in die frühen Morgenstunden lernender Pharmaziestudent immer wieder

vor Augen geführt hat, dass ich es trotz Promotionsstress und viel Arbeit eigentlich doch ganz

gut habe…).

Nicht zuletzt möchte ich meinen lieben Eltern danken für ihr Vertrauen und für die

bedingungslose Unterstützung zu jeder Zeit meines Lebens, insbesondere während meines

Studiums und meiner Promotion!

165

Lebenslauf

Schulbildung

Grundschule Ochsenhausen 09/1986 – 07/1990 Gymnasium Ochsenhausen 09/1990 – 06/1999 Abitur Studium

Universität Tübingen 10/1999 – 07/2004 Studium der Biochemie Diplomprüfung 03/2003 ● Organische Chemie (2. Hauptfach) 09/2003 ● Immunologie (Wahlfach) 11/2003 ● Biochemie (1. Hauptfach) 11/2003 – 07/2004 Diplomarbeit Arbeitsgruppe PD Dr. Roderich Süßmuth Überexpression der β-Untereinheit der Aminodesoxychorismatsynthase PabA aus Bacillus subtilis Universität Tübingen Dissertation seit 07/2004 Arbeitsgruppe Prof. Dr. Roderich Süßmuth Technische Universität Berlin seit 07/2005

Boehringer Ingelheim Post-Doc Pharma GmbH und Co. KG seit 02/2007

Documents

Untersuchungen zur Biosynthese und zum Wirkmechanismus der ...€¦ · 4.2.4 LC-ESI-MS und LC-DAD zur Untersuchung der Abyssomicine 59 4.2.5 Präparative HPLC-MS 60 4.2.6 Umsetzungen