Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei

Prostatakarzinomzelllinien

Doreen Kunze

20.05.05

Institut für Biochemie

Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften

Technische Universität Dresden

Klinik und Poliklinik für Urologie

Universitätsklinikum Carl Gustav Carus

Technische Universität Dresden

Ziele

1. Auswirkungen der P38IP-mRNA-Inhibition auf molekularer und zellulärer Ebene

2. Zusammenhang zwischen P38IP und p38MAPK

3. Hormonabhängigkeit der P38IP-mRNA-Expression

1. P38IP-mRNA-Inhibition (Einleitung)

Prostatakarzinom (PCa)

• häufigste Krebserkrankung bei Männern

• zweithäufigste Krebs-Todesursache

• Lebenszeitrisiko:– Zu erkranken: 9,6 %– Zu sterben: 3,2 %

• Häufigkeitsgipfel zw. 70 – 75 Lebensjahr

• genetisch sehr heterogen

1. P38IP-mRNA-Inhibition (Einleitung)

P38IP• C13ORF19, Fam48A

• lokalisiert auf 13q13 zwischen zwei Tumorsuppressorgenen

• mRNA-Expression im PCa reduziert

• Hypothese: Tumorsuppressorfunktion in Prostatagewebe: verbesserte Proliferation der PCa-Zellen nach Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression

Chromosom 13

13RB1

C 13BRCA2

In situ Hybridisierung von Prostatagewebe mit P38IP

Schematische Darstellung des längsten offenen Leserahmens im P38IP-Gen und das abgeleitete Proteinmuster.

PEST-RegionKernlokalisierungssignal

Glutamin-Cluster-Helix-Region

733 AA

CN

1.1 P38IP-mRNA-Inhibition (M & M, Ergebnisse)

• M & M:

• Ergebnisse:

h nach TF-Start

siRNA-D1

siRNA-D2

siRNA-D3

siRNA-D4

siRNA-D5

12 42 % 49 % 22 % 55 % 12 %

24 50 % 58 % 40 % 56 % 16 %

48 45 % 45 % 32 % 67 % 23 %

72 56 % 50 % 36 % 93 % 31 %

020406080

100

0 100 200 300 400 500 600

Konzentration der siRNA in nM

P38I

P-m

RNA

-Ex

pres

sion

/PBG

D no

rmie

rt

auf n

s-si

RNA

siRNA-D3 siRNA-D5

Aussaat(PC-3, BPH-1)

Transfektion(4 h)

24 – 72 h WST-1-Test 

ZellzählungRNA-Isolierung + qPCR

ApoptosemessungZellzyklustest

ZellkoloniebildungstestWestern Blot

20 – 68 h

Tf mit 250 nM siRNA:

24 h nach Tf:

1.1 P38IP-mRNA-Inhibition (Ergebnisse)

unbehandelt 48 h

siRNA-D5 48 h

5,5 %

ns-siRNA 48 h

4,9 % 4,3 %

Apoptosemessung (FACS) - Tf mit 125 nM siRNA

ZellkoloniebildungstestWST-Test 48 h nach Tf

0

40

80

120

160

200

ns-s

iRNA

siRN

A-D

5

unbe

hand

elt

Kolo

niez

ahl

100 Zellen/w ell 125 nM

150 Zellen/w ell 125 nM

300 Zellen/w ell 250 nM

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

ns-s

iRN

A

siR

NA-

D3

siR

NA-

D5

ns-s

iRN

A

siR

NA-

D3

siR

NA-

D5

unbe

hand

elt

OD

450

125 nM 250 nM

1.1 P38IP-mRNA-Inhibition (Ergebnisse)

0%

20%

40%

60%

80%

100%ns

-siR

NA

siR

NA

-D5

unbe

hand

elt

ns-s

iRN

A

siR

NA

-D5

unbe

hand

elt

ns-s

iRN

A

siR

NA

-D5

unbe

hand

elt

G0-G1 S-Phase G2-M

24 h 48 h 72 h

langanhaltende Inhibition der P38IP-mRNA-Expression

keine Kurz- und Langzeit- Proliferationseffekte

1.2 Chemoprotektion (M & M, Ergebnisse)

• M & M:

• Ergebnisse:

CT (Etoposid, Docetaxel; 24 h)

Aussaat(PC-3)

Transfektion(4 h)

24 – 72 h 20 h WST-1-Test 

ZellzählungApoptosemessung

Zellzyklustest

24 – 72 h

WST-1-Test: 96 h nach Tf

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

ns-s

iRN

A

siR

NA

-D5

Eto

posi

d

ns-s

iRN

A +

Eto

posi

d

siR

NA

-D5

+E

topo

sid

Eto

posi

d

ns-s

iRN

A +

Eto

posi

d

siR

NA

-D5

+E

topo

sid

unbe

hand

elt

OD

450

5 µM 20 µM

1.2 Chemoprotektion (Ergebnisse)

0

4

8

12

16

20

ns-siRNA siRNA-D5 Etoposid ns-siRNA +Etoposid

siRNA-D5 +Etoposid

unbehandelt

Apo

ptos

erat

e in

%

0

0,5

1

1,5

2

2,5

ns-siRNA siRNA-D5 Etoposid ns-siRNA +Etoposid

siRNA-D5 +Etoposid

unbehandelt

Zellz

ahl (

x 10

6 )

0%

20%

40%

60%

80%

100%

ns-s

iRN

A

siR

NA

-D5

Eto

posi

d

ns-s

iRN

A +

Eto

posi

d

siR

NA

-D5

+E

topo

sid

unbe

hand

elt

G0-G1 S-Phase G2-M

A

B125fache VergrößerungA: PC-3 siRNA-D5B: PC-3 siRNA-D5 + Etoposid

Zellzyklusarrest, keine Apoptoseinduktion

2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (Einleitung)

• P38IP = p38MAPK interacting protein

• MAPK = mitogen-aktivierte Proteinkinase• intrazelluläre Signalübertragung

(Proteinkinasen-Kaskaden)• streßaktiviert• 4 Isoformen (α, β, γ, δ)

• SB203580 inhibiert p38α und p38β durch Bindung an ATP-Bindestelle

2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (M & M, Ergebnisse)

• M & M:

• Ergebnisse:

Aussaat (PC-3, BPH-1)

DMEM ohne FKS

24 – 72 h 24 – 72 h ZellzählungRNA-Isolierung + qPCRWestern Blot (HSP27)

10 – 60 minSB203580(0,5 – 8 µM)

020406080

100120140160

DM

SO

0,5

µM

2 µM

8 µM

unbe

hand

elt

DM

SO

0,5

µM

2 µM

8 µM

unbe

hand

elt

P38I

P-m

RNA-

Expr

essi

on re

lativ

zu

TBP

norm

iert

auf D

MSO

BPH-1 PC-3

kein Zusammenhang zw. P38IP und p38MAPK erkennbar

2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (Ergebnisse, Ausblick)

• Ergebnisse:

HSP 27ß-Actin

HSP27 ist kein geeigneter Nachweis für p38MAPK-Inhibition

• Ausblick:Einfluss von siRNA-D5-Behandlung auf p38MAPK ?

(Western Blot mit AK gegen p38MAPK)

3. Hormonabhängigkeit (M & M, Ergebnisse)

• M & M:

• Ergebnisse:

P38IP-mRNA-Expression ist nicht hormonabhängig

Aussaat Hormonfreies Medium

24 h 3 – 48 hAndrogen R1881(+ Casodex)

24 h RNA-Isolierung + qPRC

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

0 10 20 30 40 50

Zeit (in h)

P38I

P-m

RNA

-Ex

pres

sion

/TBP

1 nM R1881 1 nM R1881 + Casodex10 nM R1881 10 nM R1881 + Casodex

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40 50

Zeit (in h)

PSA

-mRN

A-Ex

pres

sion

/TBP

Zusammenfassung

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit !

langanhaltende Inhibition der P38IP-mRNA-Expression

keine Kurz- und Langzeit- Proliferationseffekte

kein Zusammenhang zw. P38IP und p38MAPK

P38IP-mRNA-Expression ist nicht hormonabhängig