Aus der Klinik und Poliklinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin

(Direktor: Univ.- Prof. Dr. med. Michael Wendt)

der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

Vergleich des Einflusses verschiedener Hydroxyethylstärke-Lösungen auf

die intestinale Mikrozirkulation bei experimenteller Endotoxinämie

Inaugural - Dissertation

zur

Erlangung des akademischen

Grades

Doktor der Medizin

(Dr. med.)

der

Universitätsmedizin

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität

Greifswald

2012

vorgelegt von: Elsie Jordan Pfeifer

geb. am: 07.05.1983

in: Kota Kinabalu, Malaysia

vorgelegt von: Ulrike Stitz

geb. am: 05.12.1985

in: Stralsund

I

Dekan: Prof. Dr. med. dent. Reiner Biffar

1. Gutachter: Prof. Dr. med. Christian Lehmann

2. Gutachter: Prof. Dr. med. Michael Sander

Ort, Raum: Greifswald, Besprechungsraum Anästhesiologie und Intensivmedizin

Tag der Disputation: 19.11.2012

II

INHALTSVERZEICHNIS

1 Einleitung ........................................................................................................................... 1

2 Theoretische Grundlagen ................................................................................................. 2

2.1 Sepsis ........................................................................................................................... 2

2.1.1 Definition und Einteilung ..................................................................................... 2

2.1.2 Pathophysiologie der Sepsis ................................................................................. 4

2.1.2.1 Leukozyten-Endothel-Interaktion ................................................................... 10

2.1.2.2 Mikrozirkulatorische Dysfunktion ................................................................. 12

2.1.3 Bedeutung des Intestinums in der Sepsis ........................................................... 14

2.2 Therapie der Sepsis .................................................................................................... 15

2.2.1 Volumentherapie ................................................................................................ 17

2.2.1.1 Flüssigkeitshaushalt des Menschen ................................................................ 17

2.2.1.2 Kristalloide ..................................................................................................... 19

2.2.1.2.1 Ringer Laktat ............................................................................................ 19

2.2.1.2.2 Jonosteril® ................................................................................................. 19

2.2.1.3 Kolloide .......................................................................................................... 19

2.2.1.3.1 Hydroxyethylstärke ................................................................................... 20

2.2.1.3.2 Balancierte Lösungen ................................................................................ 22

2.2.1.4 HAES und Inflammation ................................................................................ 23

2.2.1.5 HAES und Gerinnung ..................................................................................... 23

2.2.1.6 HAES und Nierenfunktion ............................................................................. 23

2.2.1.7 HAES und Pruritus ......................................................................................... 24

2.2.1.8 Kontraindikationen für HAES ........................................................................ 24

3 Fragestellung ................................................................................................................... 25

4 Material und Methoden .................................................................................................. 26

4.1 Versuchstiere ............................................................................................................. 26

4.1.1 Gruppeneinteilung .............................................................................................. 26

4.2 Versuchsmodell ......................................................................................................... 27

4.2.1.1 Anästhesie ....................................................................................................... 27

4.2.1.2 Operativer Ablauf ........................................................................................... 28

4.2.1.3 Monitoring ...................................................................................................... 30

4.3 Intravitalmikroskopie ................................................................................................. 31

4.3.1 Technik ............................................................................................................... 31

4.4 Auswertung des Bildmaterials ................................................................................... 32

III

4.4.1 Leukozyten-Endothel-Interaktion ...................................................................... 32

4.4.1.1 Fest adhärente Leukozyten ............................................................................. 32

4.4.1.2 Temporär adhärente Leukozyten .................................................................... 33

4.4.2 Funktionelle Kapillardichte ................................................................................ 34

4.5 Blutgasanalyse ........................................................................................................... 35

4.6 Zytokine ..................................................................................................................... 36

4.7 Statistik ...................................................................................................................... 36

5 Ergebnisse ........................................................................................................................ 37

5.1 Hämodynamik ........................................................................................................... 37

5.1.1 Mittlerer arterieller Blutdruck ............................................................................ 37

5.1.2 Herzfrequenz ...................................................................................................... 37

5.2 Intravitalmikroskopie ................................................................................................. 39

5.2.1 Leukozyten-Endothel-Interaktion ...................................................................... 39

5.2.1.1 Fest adhärente Leukozyten ............................................................................. 39

5.2.1.2 Temporär adhärente Leukozyten .................................................................... 40

5.2.2 Kapillardichte ..................................................................................................... 41

5.2.2.1 Funktionelle Kapillardichte Lamina muscularis longitudinalis ...................... 41

5.2.2.2 Dysfunktionelle Kapillardichte Lamina muscularis longitudinalis ................ 42

5.2.2.3 Funktionelle Kapillardichte Lamina muscularis circularis ............................. 42

5.2.2.4 Dysfunktionelle Kapillardichte Lamina muscularis circularis ....................... 43

5.2.2.5 Funktionelle Kapillardichte Mukosa .............................................................. 44

5.3 Blutgasanalyse ........................................................................................................... 45

5.3.1 pH-Wert .............................................................................................................. 45

5.3.2 Sauerstoffpartialdruck ........................................................................................ 45

5.3.3 Kohlendioxidpartialdruck ................................................................................... 46

5.3.4 Bikarbonat .......................................................................................................... 47

5.3.5 Base Excess ........................................................................................................ 48

5.4 Zytokine ..................................................................................................................... 48

5.4.1 Tumornekrosefaktor-alpha ................................................................................. 48

5.4.2 Interleukin-1alpha .............................................................................................. 49

5.4.3 Macrophage Chemoattractant Protein-1 ............................................................. 50

5.4.4 Interferon-gamma ............................................................................................... 51

5.4.5 Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor ....................................... 52

6 Diskussion ........................................................................................................................ 54

6.1 Hämodynamik ........................................................................................................... 54

IV

6.2 Intravitalmikroskopie ................................................................................................. 55

6.2.1 Leukozyten-Endothel-Interaktion ...................................................................... 55

6.2.2 Kapillardichte ..................................................................................................... 59

6.3 Blutgasanalyse ........................................................................................................... 62

6.4 Zytokine ..................................................................................................................... 64

6.4.1 Tumornekrosefaktor-alpha ................................................................................. 65

6.4.2 Interleukin-1alpha .............................................................................................. 67

6.4.3 Monocyte Chemoattractant Protein-1 ................................................................ 68

6.4.4 Interferon-gamma ............................................................................................... 70

6.4.5 Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor ....................................... 71

6.5 Methodenkritik .......................................................................................................... 72

6.6 Klinischer Ausblick ................................................................................................... 74

7 Zusammenfassung ........................................................................................................... 76

8 Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................. 78

9 Literaturverzeichnis ....................................................................................................... 82

10 Erklärung über die Einzelanteile .................................................................................. 94

11 Danksagung ..................................................................................................................... 95

12 Eidesstattliche Erklärung ............................................................................................... 96

1

1 Einleitung

Die Sepsis ist eine systemische Entzündungsreaktion als Folge einer Infektion. In der Sepsis

kommt es zu Störungen der Mikrozirkulation verschiedener Organe und somit potentiell zum

Multiorganversagen [1].

Das Krankheitsbild der Sepsis hat im Hinblick auf die enormen Behandlungs- sowie

Personalkosten auf den intensivmedizinischen Stationen eine große ökonomische Bedeutung

[2].

Die Inzidenz der schweren Sepsis in den USA wird auf drei Fälle pro 1000 Einwohner pro

Jahr geschätzt, wobei die Mortalität mit 28,6% angegeben wird. Patienten über 85 Jahre

weisen eine Mortalität der schweren Sepsis von 38,4% auf [3].

In einer 2007 veröffentlichten Studie des vom Bundesministerium für Bildung und Forschung

geförderten Kompetenznetzwerkes Sepsis (SepNet) wurde über die Dauer eines Jahres (2003 -

2004) eine Querschnittstudie durchgeführt, in die 310 nationale Krankenhäuser

eingeschlossen waren. Dieser zufolge rangiert die Sepsis mit 57000 Todesfällen pro Jahr auf

Platz 3 der häufigsten Todesursachen in Deutschland hinter chronisch koronarer

Herzkrankheit und Myokardinfarkt. Nach Hochrechnungen des SepNet werden jährlich 79000

neue Fälle von Sepsis und 75000 neue Fälle von schwerer Sepsis diagnostiziert. Die

Auswertung der Daten ergab eine Prävalenz von 12,4% für Sepsis und 11,0% für schwere

Sepsis, einschließlich des septischen Schocks. Mehr als die Hälfte der Patienten verstirbt an

einer Sepsis und deren Folgen (Mortalität 55,2%). Damit sind die Zahlen noch um einiges

höher, als zuvor angenommen [4]. Die Kosten für das Gesundheitssystem sind ebenso

immens und beliefen sich 2006 bereits auf ca. 7,8 Milliarden Euro [2].

Die Gabe von Volumenersatzmitteln ist seit langem etabliert (z.B. mittels kolloidaler

Lösungen wie der Hydroxyethylstärke (HAES)), wobei mittelmolekulares HAES aufgrund

seines Nebenwirkungsspektrums in der schweren Sepsis und dem septischen Schock in den

aktuellen Leitlinien nicht empfohlen wird [5].

Wir untersuchten die Effekte verschiedener HAES-Lösungen auf die intestinale

Mikrozirkulation bei Sepsis im Endotoxinämie-Modell. Intravitalmikroskopisch wurde die

intestinale Leukozytenaktivierung und funktionelle Kapillardichte evaluiert sowie

durchflusszytometrisch sepsisrelevante Zytokine bestimmt.

2

2 Theoretische Grundlagen

2.1 Sepsis

2.1.1 Definition und Einteilung

Der Begriff Sepsis wurde bereits um 460 - 370 v. Chr. vom Arzt und Physiker Hippokrates

von Kos geprägt und leitet sich vom griechischen σηπω ("faul machen") ab. Hippokrates

erklärte es als ein Fieber, das durch eine „faulende Materie“ verursacht wird [6,7]. Der Glaube

an faulende Prozesse innerhalb des Körpers blieb noch bis ins 19. Jahrhundert hinein

bestehen. So ging auch der Gynäkologe Ignaz Semmelweis (1818 - 1865), der den Grundstein

für die Händedesinfektion legte, noch von übertragenen „Leichenteilchen“ seiner

Medizinstudenten auf die Wöchnerinnen aus [8].

Dank der Entdeckung von Bakterien durch den Chemiker Louis Pasteur (1822 - 1895) und

den Mediziner Robert Koch (1843 - 1910) wurde der Weg frei für eine neue Definition der

Sepsis [9].

Und so formulierte der Mediziner Hugo Schottmüller (1867 - 1936) die Sepsis im Jahre 1914

wie folgt:

„Eine Sepsis liegt dann vor, wenn sich innerhalb des Körpers ein Herd gebildet hat, von dem

konstant oder periodisch pathogene Bakterien in den Blutkreislauf gelangen, und zwar derart,

dass durch diese Invasion subjektive und objektive Krankheitserscheinungen ausgelöst

werden“ [10].

Ergänzt wurde diese Erklärung noch durch G. Schwarztman, der 1928 herausfand, dass eine

Sepsis nicht nur durch vitale Bakterien verursacht werden kann, sondern auch von deren

Oberflächenbestandteilen, den Endotoxinen [11].

Aber auch nicht bakterieninduzierte Erkrankungen wie die akute Pankreatitis,

Volumenmangelschock, Ischämie oder Verbrennungen können Symptome ähnlich der Sepsis

hervorrufen.

Vor allem durch die Bemühungen von R. Bone wurde 1991 die Konsensuskonferenz des

American Collage of Chest Physicians (ACCP) und der Society of Critial Care Medicine

(SCCM) einberufen [12].

Diese prägte den Begriff SIRS (Systemic Inflammatory Response Sydrome), der die klinischen

Symptome der Sepsis beschreibt und wie folgt definiert wird [13].

3

Für ein SIRS müssen mindestens 2 der folgenden Kriterien erfüllt sein:

Körpertemperatur ≥38°C (Fieber) oder ≤36°C (Hypothermie)

Herzfrequenz ≥90 Schläge/min (Tachykardie)

Atemfrequenz ≥20 Atemzüge/min (Tachypnoe) oder Hyperventilation mit pCO2

4

In Anlehnung an die 1946 von Pierre Denoix entwickelte TNM-Klassifikation von Tumoren

[15] entstand das PIRO-System.

Durch das PIRO-System sollten die Patienten nach ihren prädisponierenden Faktoren, nach

der Art und dem Ausmaß ihrer Infektion, ihrer Immunantwort (Response) und der jeweiligen

Organdysfunktion dem entsprechenden Sepsisstadium zugeteilt werden.

Tabelle 1: PIRO-System zum Staging der Sepsis (modifiziert nach [14])

gegenwärtige Faktoren

zukünftige Faktoren

Prädisposition

Vorerkrankungen, Alter,

Geschlecht, Kultur, Religion

genetische Polymorphismen der verschiedenen

Komponenten der Immunantwort (z.B. TLR,

TNF, IL-1, CD14)

Insult/Infektion

Keimnachweis und Resistenz-

Bestimmungen, Lokalisation, Art

und Ausmaß der Infektion

Assay spezifischer mikrobiologischer Produkte

(LPS, bakterielle DNA), spezifische Therapien

setzen Nachweis und Charakterisierung der

Infektion voraus

Response/Reaktion SIRS, andere Zeichen der Sepsis,

Schock, CRP

unspezifische Entzündungsmarker (z.B.

Prokalzitonin, IL-6) oder unzureichende

Immunantwort (z.B. HLA-DR-Expression),

spezifische Bestimmung der Zielparameter der

Therapie (z.B. Protein C, TNF)

Organdysfunktion

Ausfallende Organsysteme,

verschiedene Scores (MODS,

SOFA)

Messung der zellulären Antwort anhand

bestimmter Parameter: Apoptose, Zellhypoxie,

Zellstress

2.1.2 Pathophysiologie der Sepsis

Sepsis, schwere Sepsis und septischer Schock sind lebensbedrohliche Komplikationen einer

Infektion. Zu diesen kann es kommen, wenn mikrobielle Bestandteile in der Überzahl die

Schutzbarrieren des Körpers überwinden oder die angeborene Immunabwehr geschwächt ist

[16,17].

Die Zellen des Immunsystems besitzen zur Erkennung der fremden Organismen oder deren

Bestandteile Rezeptoren („Pattern Recognition Receptors“, PRRs), die die

unterschiedlichsten Strukturen wie Endotoxine, Peptidoglykane, Lipoteichonsäure,

Lipopeptide, Flaggelin, Mannan und virale RNA (alle zusammen auch als „Pathogen

Associated Molecular Patterns“, PAMPs bezeichnet) erkennen [18,19].

Lipopolysaccharid: Ein potenter Aktivator für die angeborene Immunabwehr ist das

Lipopolysaccharid (LPS) gram-negativer Bakterien, das Endotoxin [18]. Gram-negative

5

Infektionen treten in 40 - 50% aller Infektionen im Rahmen der Sepsis auf. Die restlichen 50 -

60% sind durch gram-positive Bakterien, Viren und Pilze bedingt [20,21]. Die häufigsten

Isolate im Falle einer Infektion mit gram-negativen Erregern sind dabei Escherichia coli,

Klebsiella pneumoniae und Pseudomonas aeruginosa [21].

Freigesetzt wird LPS durch das Wachstum oder den Zerfall der Bakterien im Rahmen einer

antimikrobiellen Therapie sowie durch Autolyse, externe Lyse durch Komplement oder

Phagozytose von Monozyten und neutrophilen Granulozyten [20].

Das Endotoxin ist Hauptbestandteil der äußeren Bakterienmembran und besteht aus 3

Komponenten: der Lipid-A-Komponente, dem Kernanteil („Core“) und dem O-

Polysaccharid, die zusammen ca. 10000 Dalton messen [20,22].

Das Lipid-A stellt dabei die Verankerung des LPS in der äußeren Membran der Bakterien dar

und besteht aus bisphosphoryliertem Hexosamin-Disaccharid, das über Ester- oder

Amidbindungen mit der Hydroxyfettsäure verbunden ist. Es ist bei allen gram-negativen

Bakterien hochkonserviert und Hauptfaktor für die immunologischen Effekte der Bakterien,

die ohne das Lipid-A apathogen sind.

So vermag Lipid-A allein bereits das Immunsystem zu aktivieren und die Zytokinproduktion

anzuregen [16,23].

Kovalent an das Lipid-A ist das „Core“-Oligosaccharid gebunden, ein aus mehreren 2-Keto-

3-desoxy-Octansäuren bestehendes Molekül, das Bedeutung für die korrekte Faltung und

damit Funktion der äußeren Membranproteine besitzt. Diese Region kann wiederum in einen

inneren und einen äußeren Teil unterschieden werden, wobei der innere Part in allen gram-

negativen Bakterien sehr ähnlich ist [16,20].

Nach außen schließt sich die O-Polysaccharidkette an, die sich aus vielen unterschiedlichen

Kohlenhydraten zusammensetzt. Diese Oberflächenantigene sind zwischen den

Bakterienarten sehr verschieden und ermöglichen bei Escherichia coli eine innerspezifische

Unterscheidung. Des Weiteren stellen diese Zuckerketten Angriffsstellen für Antikörper dar

und schützen die Bakterien vor Komplementfaktoren [16].

6

Abb. 1: Struktur des LPS [20]

LPS-Rezeptoren und folgende Signalkaskade: Im Plasma wird freigesetztes LPS durch

verschiedene Rezeptoren und Serumfaktoren gebunden. Zu diesen gehören Lipoproteine wie

z.B. HDL und LDL, Apolipoprotein A-1, Apolipoprotein B, Laktoferrin, Bactericidal

Permeability Increasing Protein (BPI), lösliches CD14 und Rezeptoren der Makrophagen wie

z.B. Scavenger-Rezeptoren und CD11/CD18 Rezeptoren [24].

Das Lipopolysaccharid-Bindungsprotein (LBP) verstärkt die Wirkung des LPS. Es ist ein

60kDa schweres Glykoprotein, das an das Lipid-A des LPS bindet und mit dem CD14-

Rezeptor auf Makrophagen, Monozyten und neutrophilen Granulozyten einen Komplex bildet

[24,25].

CD14 wiederum ist ein Glykosylphosphatidylinositol-verankertes Molekül [26], das keine

transmembranäre Domäne besitzt und ausschließlich mit Hilfe des Co-Rezeptors TLR-4

(Toll-Like-Receptor-4) Signale des LPS nach intrazellulär überträgt [18].

Die Familie der Toll-Rezeptoren, erstmals in der Embryogenese der Drosophila entdeckt und

erforscht, konnte in ähnlicher Form bei Säugetieren, dort als „Toll-Like-Receptors“

bezeichnet, gefunden werden.

Allen momentan bekannten 13 TLR gemein ist die extrazelluläre leucin-reiche Repeat-

Region, mit der sie die PAMPs erkennen können. Die Information wird dann über einen, mit

dem Interleukin-1-Rezeptor identischen Signaltransduktionsweg, nach intrazellulär

weitergeleitet, der auch als TIR (Toll/IL-1-Receptor)-Domäne bezeichnet wird [19,27].

Nachdem der für LPS spezifische TLR-4 mit Hilfe des Adapterproteins MD2 das Signal

transmembranär an das Protein TIRAP (Toll-Interleukin-1-Receptor-domain-containing-

Adaptor-Protein) weitergegeben hat, wird MyD88 (Myeloid-Differenzierungsprotein) an

7

TLR-4 gebunden. Dabei wird die IL-1-Rezeptor-assoziierte Kinase 4 (IRAK-4) aktiviert und

anschließend phosphoryliert.

Die IRAK-1 bindet an den Tumornekrosefaktor-assoziierten Faktor 6 (TRAF6) und bedingt

die Abspaltung von IRAK-1/TRAF6 vom Rezeptor, um einen Komplex mit der TAK1

(Transforming Growth Factor-β-aktivierte Kinase) und den TAK1-Bindungsproteinen zu

bilden [28–30].

IRAK-1 wird daraufhin aus dem Komplex abgespalten und verbleibt an der Membran,

während der Komplex aus TRAF6, TAK1 und den Bindungsproteinen ins Zytoplasma

wandert, wo er große Komplexe mit Proteinen wie den E2-Ligasen bildet [28].

Diese Komplexe aktivieren wiederum die TAK1 und phosphorylieren den IκB-Kinase-

Komplex (IKK) [28], der zur Phosphorylierung und Ubiquitinylierung des NF-κB-Inhibitors

(IκB) und damit zur Freisetzung des nukleären Faktors-κB (NF-κB) führt [29] .

NF-κB ist als Transkriptionsfaktor im Stande, durch Bindung an die Consensussequenz 5‘-

GGGACTTTCC-3‘ [31] die Expression einiger inflammatorischer Gene zu induzieren. Dazu

gehören Zytokine (TNF-α, TNF-β, Il-2, -3, -5, -12, -18), Chemokine (IL-8, MIP-1α, MIP-2,

MCP-1, Growth related Oncogenes), Adhäsionsmoleküle (ICAM-1, VCAM-1, E-Selektin, P-

Selektin), iNOS, COX-2, Phospholipase A2, Arachidonsäurederivate und Akute-Phase-

Proteine. Er spielt damit eine essentielle Rolle im Entzündungsmechanismus der Sepsis [32].

Abb. 2: Signalkaskade bei LPS-Aktivierung [20]

8

Daneben ist auch noch ein MyD88-unabhängiger Signaltransduktionsweg bekannt, bei dem

die LPS-Stimulierung des TLR-4 zu einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors IFR-3

(Interferon Regulatory Factor-3) führt und dabei IFN-β (Interferon-β) induziert. IFN-β

bedingt seinerseits die Aktivierung des Stat1 (Signal-transducer-and-activator-of-

transcription-1), das die Transkription einiger IFN-abhängiger Gene einleitet [28].

Die letztendliche Ausschüttung der Zytokine und anderer Mediatoren bedingt ein komplexes

Zusammenspiel aus Aktivierung des angeborenen und erworbenen Immunsystems mit

Interaktion des Gerinnungs-, Kallikrein-Kinin- und Komplement-Systems sowie den

reaktiven Sauerstoffspezies [33,34].

Gerinnung: Die plasmatische Gerinnung kann durch den extrinsischen und den intrinsischen

Weg initiiert werden. Zur Aktivierung des extrinsischen Weges wird Thromboplastin (Faktor

III oder Tissue Factor) benötigt, das bei Schädigung nichtvaskulärer Zellen ins Blut gelangt.

Thromboplastin und Faktor VII bilden zusammen mit Calcium und Phospholipiden einen

Komplex, der wiederum Faktor X aktiviert. Faktor X stellt den Punkt der gemeinsamen

Endstrecke von extrinsischem und intrinsischem System dar.

Im intrinsischen System wird zuvor die Aktivierung des Gerinnungsfaktors XII benötigt, der

durch Kontakt mit negativ geladenen Oberflächen von Kollagen und Thrombozyten entsteht.

Daraufhin werden Faktor XI und IX aktiviert. Faktor IX bildet mit Faktor VIII ebenfalls einen

Komplex aus Calcium und Phospholipiden, der wiederum die Aktivierung des Faktor X

vermag. Faktor X bedingt zusammen mit Faktor V die Spaltung von Prothrombin (Faktor II)

zu Thrombin, das seinerseits Fibrinogen (Faktor I) in Fibrin umwandelt. So entstehen über

nichtkovalente Bindungen große Polymere aus Fibrin, die mit Hilfe des Faktor XIII stabile

Thromben bilden [31,35].

Im Rahmen der Sepsis läuft die Gerinnung durch LPS-bedingte Aktivierung der

Thrombozyten, der Leukozyten, des Endothels und des Faktor XII ubiquitär ab [26,36]. Dies

kann zur Ausbildung einer disseminierten intravasalen Gerinnung (DIG) führen, die unter

anderem daraus resultiert, dass die Fibrinolyse gehemmt wird. Die Fibrinolyse wird im

Körper über Plasmin vermittelt, das aus der Vorstufe Plasminogen freigesetzt wird.

In der Sepsis entsteht jedoch vermehrt Plasminogenaktivator-Inhibitor-1 (PAI-1), der die

Auflösung von Thrombin verhindert [37]. Der zusätzliche Verbrauch von Antithrombin

(hemmt Faktoren IX, X, XI und XII) und Protein C (hemmt Faktoren V und VIII) [35] trägt

sein Übriges zur Entstehung der DIG bei [37]. Die dadurch entstehenden Mikrothromben

behindern die Perfusion und können somit zum MODS und Tod führen [26].

9

Kallikrein-Kinin-System: Über den Faktor XII ist die Gerinnung auch mit dem Kallikrein-

Kinin-System verbunden. Faktor XII wird benötigt um Präkallikrein zu Kallikrein zu

aktivieren [32,36], das wiederum Kininogen zu Bradykinin oder Kallidin (zusammen als

Kinine bezeichnet) spaltet. Die Kinine besitzen eine kurze Halbwertzeit von wenigen

Sekunden und bewirken Vasodilatation sowie Gefäßpermeabilitätssteigerung und fördern die

Leukozytenmigration [31], was zum „Capillary-Leak-Syndrome“ führen kann [36].

Komplement: Es gibt insgesamt neun Komplementfaktoren (C1 - 9), die über drei

unterschiedliche Wege aktiviert werden können. Den klassischen (Antigen-Antikörper), den

alternativen (Antigen z.B. LPS) und den Lektin-Weg. Durch die Fähigkeiten zur

Opsonierung, Chemotaxis und Lyse (mit Hilfe des MAC-C5b-C9-Komplexes) spielen

Komplementfaktoren eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Sepsis [32,38]. C3a, C4a

und C5a gelten dabei als Anaphylatoxine, die die Permeabilität der Gefäße verändern, indem

sie zu Kontraktionen der glatten Muskelzellen sowie zur Thrombozytenaggregation führen

[31].

Über den C1-Inhibitor ist das Komplementsystem mit dem Gerinnungssystem verbunden. Der

C1-Inhibitor gehört zu den Serin-Protease-Inhibitoren und inaktiviert neben C1 [39] die

Gerinnungsfaktoren XI und XII [32,36].

Komplementkaskade und Gerinnung induzieren sich gegenseitig. Durch Bildung von

Thromben im Gerinnungsprozess wird das Komplement stimuliert, das wiederum durch

Veränderung der Phospholipidmembran, die Aktivierung von Thrombozyten und über die

Expression des Tissue Factors und PAI-1 auf Leukozyten die Gerinnung aktiviert [37].

Reaktive Sauerstoffspezies: Die neutrophilen Leukozyten sind die Hauptproduzenten von

reaktiven Sauerstoffspezies (ROS= Reactive Oxygen Species). Sie werden vermehrt bei

oxidativem Stress in der Sepsis gebildet [32,40]. ROS wie das Superoxid werden zur

Bekämpfung von Pathogenen im „Oxydative Burst“ gebildet. Mit Hilfe der

manganabhängigen Superoxiddismutase wird Superoxid in Sauerstoff und

Wasserstoffperoxid umgewandelt. Wasserstoffperoxid kann im Beisein von Eisen in das

hochreaktive Hydroxylradikal übergehen [31,35].

Superoxid ist außerdem in der Lage mit NO das ebenfalls sehr reaktive Peroxynitrit (RNS=

Reactive Nitrogen Species) zu bilden. RNS und ROS können DNA-Strukturen, Lipide und

Kohlenhydrate irreversibel schädigen. Dies betrifft besonders die Atmungskette der

Mitochondrien, die durch Inhibierung der Cytochrom-c-Oxidase [41] funktionell gestört wird

und vermindert ATP produziert. Im weiteren Verlauf kann es durch RNS- und ROS-bedingte

10

Schäden an Membranen und DNA sowie der ATP-Verminderung zur Caspasen-Aktivierung

kommen, die in der Apoptose der Zelle endet [32,40,42,43].

An Endothelzellen resultiert daraus eine Schädigung der Endothelbarriere [36,44].

NO wird in der Sepsis vermehrt von der induzierbaren NO-Synthetase aus L-Arginin

produziert [41,45] und ist ein hochpotenter Vasodilatator. Es wird unter anderem für den

klinisch auftretenden Abfall des peripheren Gefäßwiderstandes und des mittleren arteriellen

Druckes sowie die Kardiodepression verantwortlich gemacht [46]. NO-Donatoren sind

außerdem in der Lage die Leukozyten-Endothel-Interaktion durch Herunterregulierung von

Zell-Adhäsionsmolekülen zu modulieren [47].

2.1.2.1 Leukozyten-Endothel-Interaktion

Die Leukozyten-Endothel-Interaktion findet vor allem in den postkapillären Venolen statt

[31,48] und beinhaltet die sequentielle Migration der Leukozyten aus der Gefäßmitte, das

temporäre und permanente Adhärieren an der Endothelwand und die Transmigration in das

Gewebe [48].

Durch die LPS-induzierte Signalkaskade kommt es zur Expression von Adhäsionsmolekülen

auf der Zelloberfläche der Leukozyten. Zu diesen zählen Selektine, Integrine und Mitglieder

der Immunglobulin-Superfamilie [22].

Selektine sind Glykoproteine und bestehen aus einer NH2-terminalen C-Typ-Lektin-Domäne,

einer „Epidermal-Growth-Factor-like“-Domäne, einer „Short-Consensus-Repeat“ (SCR)-

Domäne, einer transmembran-Domäne und einer zytoplasmatischen Domäne [49,50,50]. Sie

unterteilen sich in L-Selektin (auf Leukozyten), P-Selektin (auf Endothelzellen in Weibel-

Pallade-Körperchen und Thrombozyten) und E-Selektin (auf Endothelzellen) [47], wobei L-

Selektin als Einziges konstitutiv exprimiert wird. E- und P-Selektin werden durch

inflammatorische Mediatoren wie TNF-α und/oder IL-1 induziert [51,52]. P-Selektin

erscheint bereits wenige Minuten nach Stimulation auf der Zelloberfläche, während E-

Selektin einige Stunden benötigt [38].

Selektine erkennen unterschiedliche Glykoproteine bzw. Glykolipidstrukturen [31] an deren

terminalen Enden sich das Tetrasaccharid Sialyl-Lewis X befindet [52].

Selektine ermöglichen somit den ersten Kontakt der Leukozyten mit dem Endothel, wobei die

reversible Adhärenz das Rollen an der Gefäßwand bedingt und für die Aktivierung durch

Chemokine essentiell ist [31,53].

Die nächste Phase der Rekrutierung beinhaltet die Aktivierung verschiedener Integrine.

Integrine sind Transmembranproteine, die aus einer nichtkovalenten Zusammenlagerung einer

11

großen α-Kette und einer kleineren β-Kette bestehen [22,54]. Die Untereinheit β ist dabei mit

dem Zytoskelett verbunden und bewirkt unter Stimulation durch z.B. Zytokine eine

Konformationsänderung des Leukozyten [50].

Liganden für die Integrine sind Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie ICAM

(Intercellular Adhesion Molecules), VCAM (Vascular Cell Adhesion Molecules) und PECAM

(Plateleted-endothelial Cell Adhesion Molecule) [55]. Diese Zelladhäsionsmoleküle bestehen

aus Polypeptidketten, mit einer Transmembrandomäne und einem teilweise immunglobulin-

ähnlichen extrazellulären Teil [31]. ICAM-1 und VCAM-1 (beide exprimiert durch

Endothelzellen) sind an der festen Bindung der Leukozyten an das Endothel beteiligt und

werden ebenso wie die Integrine durch proinflammatorische Stimuli vermehrt exprimiert

[46,48].

Nachdem die feste Adhäsion erreicht ist, erfolgt die Transmigration der Leukozyten durch die

Endothelbarriere mit Hilfe eines Chemokin-Gradienten. Zu den wichtigsten Chemokinen

gehören MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1), Leukotrien B4, C5a, PAF (Platelet

Activating Factor) und IL-8 [46,51].

IL-8 ist außerdem in der Lage eine feste Bindung an das Endothel durch

Konformationsänderung der Integrine zu bewirken [38] und in Granulozyten die

Degranulation zu aktivieren [46].

Der eigentliche Prozess der Transmigration, die Diapedese, geschieht mit Hilfe des PECAM

und kann entweder transzellulär oder parazellulär erfolgen [56].

Im Zuge der physiologischen Abwehr ist die Leukozytenmigration unerlässlich um z.B.

pathogene Erreger zu eliminieren. Im septischen Geschehen, wo sich dieser Vorgang im

gesamten Körper abspielt, ist es ein entscheidender Faktor zur Schädigung von Geweben und

trägt somit maßgeblich zum Auftreten des MODS bei [57,58]. Abbildung 3 zeigt die

chronologischen Abläufe der Leukozytenmigration im Gefäß.

12

2.1.2.2 Mikrozirkulatorische Dysfunktion

Als Ursache für das Multiorganversagen während der Sepsis wird die mikrozirkulatorische

Dysfunktion angesehen [40,41,45,60,61].

Das Strombett der Mikrozirkulation setzt sich zusammen aus Arteriolen, Kapillaren und

Venolen. Die Gefäße bestehen aus Endothelzellen, die von glatten Muskelzellen umgeben

sind. Über „Gap Junctions“ verbunden, regelt die glatte Muskulatur den Gefäßdurchmesser.

Kapillaren werden anhand ihrer histologischen Struktur unterschieden in kontinuierlich,

fenestriert und diskontinuierlich. Der kontinuierliche Endotheltyp findet sich in Muskulatur-,

Nerven- und Fettgewebe sowie in der Lunge und zeichnet sich dadurch aus, dass der

Stofftransport hauptsächlich über den Interzellularspalt erfolgt. Den fenestrierten Typ findet

man in der Darmmukosa, den Nierenglomeruli und den endokrinen Drüsen. Diese Kapillaren

weisen intrazelluläre Poren von 50 - 60nm Größe auf, die teilweise von einer perforierten

Abb. 3: Leukozytenmigration und –diapedese [59]

(sLeA = Sialyl-Lewis-A, sLeX = Sialyl-Lewis-X, MAC-1 = Macrophage Antigen alpha Polypeptide)

13

Membran bedeckt sind. Die diskontinuierlichen Kapillaren sind im Knochenmark, der Leber

und der Milz vorhanden und besitzen inter- und intrazelluläre Poren von 0,1 - 1μm Breite, die

den Durchtritt von Proteinen und korpuskulären Bestandteilen ermöglichen [62].

Durch unterschiedliche Rezeptorausstattung und –dichte reagieren die Endothelzellen von

Organ zu Organ unterschiedlich auf Mediatoren. So kann das primär vasokonstriktorische

Endothelin beispielsweise je nach Blutgefäßtyp und Lokalisation ebenfalls vasodilatatorisch

wirken. Im septischen Schock kommt es in Organen mit hoher α-adrenerger und Arginin-

Vasopressor-1A-Rezeptor-Dichte zur inadäquaten Vasokonstriktion [45]. Die in der Sepsis

vermehrt induzierte NO-Synthetase bewirkt wiederum Vasodilatationen durch NO. Im

Gefolge entsteht eine funktionelle Dysregulation der Mikrozirkulation [45,63].

Zusätzlich kommt es durch die Ausschüttung von Komplementfaktoren, Serotonin, Histamin

und Bradykinin zu einer erhöhten interzellulären Durchlässigkeit, was zu einem vermehrten

Flüssigkeitseinstrom in das Interstitium führt. Das so entstandene Ödem kann die Gefäße

komprimieren und zu einer verminderten Gewebsperfusion führen [59]. Erschwerend kommt

hinzu, dass die Gefäße nicht mehr adäquat auf Katecholamine reagieren [64]. Begründet wird

dies durch eine gestörte Kopplung des Katecholamin-Rezeptors und seines Second-

Messenger-Systems. Diese wiederum ist bedingt durch eine verminderte Kortisolausschüttung

bei relativer Nebenniereninsuffizienz, die vor allem in der schweren Sepsis gehäuft auftritt

[45,65].

Diese Veränderungen haben einen Einfluss auf die Leitfähigkeit (L), die angibt wie viel Liter

Blut pro mmHg durch die Gefäße fließt. L wird reguliert durch das humorale und nervale

System und ist in den unterschiedlichen Organen extrem variabel.

Bei stetiger Zunahme der Leitfähigkeit sowie des Herzminutenvolumens entsteht eine

Dysbalance zwischen L und dem systemischen Blutdruck, die zur Hypotension führt.

Vasokonstriktion, Hypotension und konsekutiver Kapillarkollaps führen zum O2-Defizit und

vermindern das Membranpotential der Endothelzellen, was zum Einstrom von Natrium und

Wasser und damit zum Zellödem führt. Die Hypoxie kann durch Shunt-Bildungen zwischen

Arteriolen und Venolen noch wesentlich verstärkt werden [45].

Sauerstoffradikale, Komplementfaktoren und Azidose triggern eine reduzierte

Erythrozytenverformbarkeit und die vermehrte Adhärenz und Migration der Leukozyten

[41,45,60].

Die Deformierbarkeit der Erythrozyten ist für den O2-Transport in den Kapillaren besonders

wichtig, da die Kapillaren teilweise schmaler sind als der Durchmesser der Erythrozyten.

Durch die verringerte Verformbarkeit der Erythrozyten, eine veränderte Temperatur, einen

14

anderen pH-Wert oder durch NO wird die Abgabe des Sauerstoffs behindert. Darüber hinaus

wird die Sekretion von antikoagulatorisch wirkenden Substanzen z.B. Prostazyklin,

Antithrombin und Plasminogenaktivatoren gestört, die unter normalen Bedingungen

kontinuierlich von Endothelzellen abgegeben werden [59].

Die Rezeptordysregulierung mit etwaiger Vasodilatation oder -konstriktion, das interstitielle

sowie intrazelluläre Ödem, die verringerte Erythrozytenverformbarkeit, die Aktivierung von

Gerinnungssystem und Leukozyten führt zu einem geminderten oder gestoppten Fluss und

Mikrothrombenbildung in den Kapillaren und damit zur Reduktion der funktionellen

Kapillardichte [41]. Die funktionelle Kapillardichte macht demzufolge Aussagen über die

Integrität der Kapillarperfusion [207].

Die aufgrund der geringeren O2-Abgabe hypoxischen Zellen steigen auf den anaeroben

Stoffwechselweg zur Energiegewinnung um und produzieren Laktat [66]. Erhöhte

Laktatwerte und die Laktat-Clearance korrelieren dabei klinisch mit einer gesteigerten

Mortalität in der Sepsis [67].

2.1.3 Bedeutung des Intestinums in der Sepsis

In fast 90% aller Fälle liegt die Ursache einer Sepsis in einer Infektion der Lunge (62,9%)

oder des Darmes (25,3%) [4].

Der menschliche Dünndarm ist 3 - 4m lang und besteht aus Duodenum, Jejunum und Ileum.

Dickdarm und Mastdarm tragen nochmals 1,5m zur Gesamtlänge des Darmes bei. Die

Schleimhaut des Dünndarms setzt sich zusammen aus Plicae circularis, Villi intestinalis und

Microvilli, die seine Oberfläche auf 100 - 200m2 vergrößern. Der Wandaufbau gliedert sich in

die oberste Tunica mucosa (die Schleimhaut), die Tela submucosa, Tunica muscularis, die

sich in Stratum longitudinale und circulare unterteilt, und die Tela subserosa mit

angrenzender Serosa [68,69].

Der Darm ist mit einem Anteil am Herzzeitvolumen von 20 - 35% besonders anfällig für

Hypoperfusion und Ischämie, wie sie in der Sepsis gehäuft vorkommen. Wenn es zu einer

Minderperfusion des Darmes kommt, zeigt sich mikroskopisch ein verlangsamter, pendelnder,

intermittierend stillstehender Blutfluss der kleinen Gefäße. Bei zunehmender Ischämie oder

Reperfusionsschäden kann es besonders an der Zottenspitze zu Nekrosen kommen [36,70].

Im Darm befindet sich das größte Reservoir für Bakterien im menschlichen Körper und mit

103

- 106 Bakterien/ml Darminhalt allein im Ileum, bietet der Darm Grundlage für die

Translokationstheorie. Diese besagt, dass es im Rahmen von Epithelschäden zu

15

Barrierestörungen kommt, die den Weg für Bakterien und deren Bestandteile in Blut- und

Lymphgefäße freigeben [23,71–73].

Das Übersiedeln von Bakterien passiert auch unter physiologischen Bedingungen und ist

wichtig, um das Immunsystem mit pathogenen Erregern zu konfrontieren und entsprechende

spezifische Abwehrmechanismen zu entwickeln. Allerdings kann das Immunsystem im

Rahmen der systemischen Inflammation nicht mehr adäquat darauf reagieren [74].

Normalerweise schützt der Darm den Organismus mit Hilfe einer Schicht Mucus (die

reichlich IgA enthält), diverser Enzyme, dem GALT (Gut-Associated Lymphoid Tissue),

seiner eigenen transienten Flora und seiner Motilität vor dem Eindringen pathogener Erreger.

In diesem Zusammenhang wird angenommen, dass es besonders bei Patienten auf

Intensivstationen zu Störungen dieser Mechanismen als „second hit“ zu einer Sepsis oder

Komplikationen einer Sepsis führen kann [16,75].

Beeinflusst wird die Darmfunktion von Individualparametern wie Alter, Geschlecht,

Vorerkrankungen und Immunstatus [76,77]. Obwohl der Pathomechanismus der bakteriellen

Translokation bisher nur im Tierexperiment eindeutig belegt werden konnte, spricht doch

einiges für die Translokationstheorie im Menschen, entweder als Ursache für postoperative

septische Komplikationen oder sogar als alleinige Ursache eines ursprünglich nicht-

infektiösen Multiorganversagens [75,76,78].

2.2 Therapie der Sepsis

Die Therapie der Sepsis besteht aus vier Säulen. Diese sind die kausalen Therapiemethoden

der Herdsanierung und antimikrobielle Therapie sowie supportive Maßnahmen und die

spezielle Sepsistherapie [79,80].

Im März 2010 wurden die S2k-Leitlinien zur Prävention, Diagnostik, Behandlung, und

Nachsorge der Sepsis im Hinblick auf die „Evidence Based Medicine“ überarbeitet und

aktualisiert.

Die Herdsanierung steht nach wie vor an erster Stelle für eine erfolgreiche Therapie. Sie

beinhaltet unter anderem das Entfernen von infizierten Implantaten, die Inzision bzw. die CT-

gestützte Drainage von Abszessen, Wunderöffnung und Nekrektomie, Amputation und

Fasziotomie, Peritoneallavage, Drainage oder Enterostomie zur Behandlung einer Peritonitis,

einer Anastomoseninsuffizienz und eines Ileus [5,79].

Nach vorheriger Abnahme von Blutkulturen erfolgt die Antibiotikatherapie hochdosiert,

intravenös und kalkuliert mit einem Breitspektrumantibiotikum.

16

Frühestmöglich eingeleitet sollte sich die Therapie nach dem individuellen Risikoprofil des

Patienten und dem klinikinternen mikrobiologischen Resistenzmuster richten [5].

Zu den supportiven Maßnahmen gehört in erster Linie das hämodynamische Management der

Patienten mittels Volumensubstitution und Katecholamingabe. Es wird empfohlen, bei

Hypovolämie initial 500 - 1000ml Kristalloide oder 300 - 500ml Kolloide über den Zeitraum

einer halben Stunde zu verabreichen [5].

In diesem Zusammenhang ist die „Early Goal Directed Therapy“ (EGDT) zu erwähnen. Nach

dieser sind folgende Zielparameter innerhalb der ersten 6 Stunden zu erreichen [5,81,82]:

- Erreichen einer zentralvenösen Sättigung (ScvO2) von >70% (um dieses Ziel zu

erreichen, wird die Gabe von Volumen, Dobutamin und Erythrozytenkonzentraten bei

einem Hkt 35/min), muskulärer Erschöpfung (Einsatz der Atemhilfsmuskulatur),

eingeschränkter Vigilanz und Sättigungsabfall unter 90% trotz Sauerstoffinsufflation wird

eine frühzeitige Beatmung empfohlen [5].

Unter spezieller Therapie werden Behandlungen verstanden, die zusätzlich und gemeinsam

mit den kausalen und supportiven Therapien die Sepsis eindämmen sollen.

17

Es werden die Stressulkusprophylaxe mit Histamin-2-Rezeptorblockern oder

Protonenpumpenhemmern und die Thromboseprophylaxe mit unfraktionierten oder

niedermolekularen Heparinen angeraten [5].

2.2.1 Volumentherapie

Die 2008 von Brunkhorst et al. publizierte, multizentrische, randomisierte VISEP-Studie

untersuchte neben der intensivierten Insulintherapie in der schweren Sepsis und dem

septischen Schock den Einsatz von 10%-igem HAES 200/0.5.

Es wurde bei der Verwendung von HAES eine 12%-ig erhöhte Inzidenz für Nierenversagen

und ein doppelt so häufiger Einsatz von Nierenersatzverfahren festgestellt [84].

In der SAFE-Studie konnte gezeigt werden, dass bei Patienten mit Hypovolämie die Gabe von

30 - 40% mehr Volumen isotonischer Kochsalzlösung im Vergleich zu 4%-iger

Humanalbuminlösung, gleiche hämodynamische Ergebnisse erzielte.

Diese und andere Studien hielten Einzug in die aktuellen S2k-Leitlinien und führten zu der

Einschätzung, dass der Einsatz von HAES-Lösungen und anderer künstlicher kolloidaler

Lösungen bei schwerer Sepsis und septischem Schock nicht empfohlen werden kann

(Expertenmeinung, Evidenzgrad V). Geraten wird hingegen zu kristalloiden Lösungen, wobei

der Gebrauch von Humanalbumin erwogen werden kann [5].

2.2.1.1 Flüssigkeitshaushalt des Menschen

Der Mensch besteht zu mehr als der Hälfte seines Körpergewichtes aus Wasser. Der

Wassergehalt ist vom Geschlecht, dem Alter und der individuellen Konstitution abhängig.

Zudem ist es im Körper in drei Kompartimente verteilt: in den intravasalen, interstitiellen und

intrazellulären Raum (IZR). Die beiden Ersten fasst man mit dem Oberbegriff extrazellulärer

Raum (EZR) zusammen.

Das größte Volumen befindet sich im IZR, das restliche im EZR, von dem 1/3 intravasal zu

finden ist und sich der Rest im interstitiellen Raum verteilt. Die Flüssigkeitsbewegung

zwischen den Räumen hängt zum einen von der Permeabilität der jeweiligen Trennwand zum

anderen vom hydrostatischen und kolloidosmotischen Druck ab.

Die Durchlässigkeit des Endothels variiert je nach Lokalisation. Aus Gründen der

Übersichtlichkeit sollen jedoch die folgenden Erläuterungen anhand des Endothels vom

geschlossenen Typ dargestellt werden. Mögliche Durchtrittswege für Wasser und

Plasmabestandteile sind sowohl zwischen den Zellen, also parazellulär, als auch durch die

18

Zellen, also transzellulär. Parazellulär regulieren Proteine wie „Tight Junctions“ und

Adhäsionskontakte den Stoff- und Wasserübertritt. Transzellulär können kleinere Ionen wie

Na+, K

+, Cl

- u.a. durch ihre jeweiligen Kanäle und Wasser durch die sog. Aquaporine

passieren. Dennoch findet sich eine unterschiedliche Verteilung der jeweiligen Ionen

zwischen dem intra- und extrazellulären Raum. Der unterschiedliche Ionengradient wird

durch zahlreiche Ionenpumpen aufrechterhalten, von denen die ATP-abhängige NA+/K

+-

Pumpe die wichtigste ist [62]. Größere Moleküle wie Albumin können bei intaktem Endothel

den intravasalen Raum nicht verlassen.

Der hydrostatische Druck wird als, in alle Richtungen gleich wirkender Druck einer ruhenden

Flüssigkeit definiert [85]. Dies ist der Druck, den das Wasser intravasal auf die Gefäßwand

ausübt. Da der hydrostatische Druck hier größer ist als im Interstitium, wird eine

Flüssigkeitsbewegung gen Interstitium gefördert.

Kolloidosmotischer Druck entsteht, wenn kolloidale Teilchen eines Lösungsmittels einen

Dichtegradienten über eine semipermeable Membran erzeugen. Dieser Druck bewirkt eine

Flüssigkeitsbewegung aus dem Interstitium in das Gefäß hinein, da hier im Vergleich zu dem

des Interstitiums der kolloidosmotische Druck höher ist [86].

Die Osmolarität (osmol/l) wird definiert als die molare Konzentration aller osmotisch

wirksamen Moleküle pro Liter, während die Osmolalität (osmol/kg) gleiches pro Kilogramm

angibt. Das Blutplasma besitzt eine Osmolarität von etwa 290 - 300mosmol/l. Lösungen mit

Abb. 4: Das Zusammenspiel zwischen dem kolloidosmotischen Druck (COP) und dem hydrostatischen Druck (P)

zwischen Kapillare (cap) und Interstitium (int) beeinflusst die Flüssigkeitsbewegung zwischen intra- und

extravasalem Raum [87]

19

annähernd gleicher Osmolarität wie das Blutplasma bezeichnet man als isoton, mit weniger

Osmolarität als hypoton und mit höherer Osmolarität als hyperton [62].

2.2.1.2 Kristalloide

Als Kristalloide („Kristall“ und griechisch eides „ähnlich“) bezeichnet man Lösungen die

kristallisierbare Elektrolyte enthalten [88]. Diese Elektrolytlösungen können sowohl hypoton,

isoton (z.B. 0,9% NaCl) oder hyperton (z.B. 10% NaCl) sein.

Der Natriumgehalt der kristalloiden Lösungen beträgt mehr als 120mmol/l. Damit wird der

physiologische Ionengradient an der Zellmembran aufrechterhalten und die Wasserverteilung

zwischen dem Intrazellularraum und dem Intravasalraum reguliert [89].

Nachfolgend werden die Zusammensetzungen der kristalloiden Lösungen dargestellt, die wir

für unsere Untersuchung verwendet haben.

2.2.1.2.1 Ringer Laktat Tabelle 2:

Osmolarität

mosmol/l

Na⁺

mmol/l

K⁺

mmol/l

Ca²⁺

mmol/l

Cl¯

mmol/l

Laktat¯

mmol/l

278 130,9 5,4 1,84 111,7 28,3

[90]

2.2.1.2.2 Jonosteril® Tabelle 3:

Osmolarität

mosmol/l

Na⁺

mmol/l

K⁺

mmol/l

Ca²⁺

mmol/l

Mg²⁺

mmol/l

Cl¯

mmol/l

Acetat¯

mmol/l

291 137 4 1,65 1,25 110 36,8

[90]

2.2.1.3 Kolloide

Als Kolloide (vom griechischen kolla „Leim“ und eides „ähnlich“) werden Teilchen oder

Tröpfchen bezeichnet, die in einem anderen Medium (Feststoff, Gas oder Flüssigkeit) fein

verteilt und lediglich ultramikroskopisch erkennbar sind. Das einzelne Kolloid ist zwischen

1nm und 10μm groß und fungiert als Plasmaersatzstoff [88].

Bei einer Hypovolämie z.B. durch Blutverluste ist es wichtig den Füllungsdruck in dem

Gefäßsystem aufrechtzuerhalten, um den venösen Rückstrom zum Herzen zu gewährleisten.

20

Bei Blutverlusten von weniger als einem Drittel des Gesamtvolumens kommt die Gabe von

Plasmaersatzstoffen in Frage [91].

Das durchschnittliche Blutvolumen von 5 - 6l besteht zu ca. 3l aus Wasser, das sich intravasal

befindet und damit das kleinste Flüssigkeitsreservoir im Menschen darstellt.

Bei der Volumensubstitution ist zu beachten, dass die Lösung ausreichend Na+-Ionen

(≥120mmol/l) enthält, da ein zu geringer Natriumanteil gemäß dem Ionengradienten Wasser

nach intrazellulär zieht und somit zum Zellödem führt [89,92]. Ebenfalls besteht die

Möglichkeit, dass Kolloide beim „Capillary-Leak-Syndrome“ in den interstitiellen Raum

gelangen und Volumen extravasal binden [91,93].

Physiologisch findet sich Albumin als Kolloid im menschlichen Körper, dessen wichtigste

Aufgabe es ist, den kolloidosmotischen Druck von 26 - 28mmHg aufrechtzuerhalten.

Albumin, ein 66kDa Molekül, das in der Leber synthetisiert wird und Wasser mit hoher

Kapazität bindet, erfüllt außerdem entscheidende Funktionen beim Transport von Hormonen

und Enzymen. Aufgrund seiner Größe kann es den Intravasalraum nicht verlassen und

verhindert somit den Übertritt von Wasser in das Interstitium.

Grundsätzlich gibt es vier Kolloide, die in der medizinischen Therapie zur

Volumensubstitution Anwendung finden. Das körpereigene Humanalbumin und die künstlich

erzeugten Kolloide Dextran, Gelatine und Hydroxyethylstärke [89,92].

Dextran und Gelatine sind aufgrund häufiger allergischer Reaktionen auf dem deutschen

Markt kaum vertreten [92].

Bei Plasmaersatzmitteln ist die Volumenexpansion, die von der Wasserbindungskapazität

abhängt, von besonderer Bedeutung. Ist der erzielte Volumeneffekt größer als die infundierte

Volumenmenge, werden die Lösungen als Plasmaexpander bezeichnet [91,94].

2.2.1.3.1 Hydroxyethylstärke

Hydroxyethylstärke fand zum ersten Mal größere Anwendung im 2. Weltkrieg. Man benötigt

weniger Flüssigkeit, um den gleichen hämodynamischen Effekt zu erzielen als bei dem

Gebrauch von Kristalloiden, was zu Kriegszeiten sehr erwünscht war [89,95,96]. Die ersten

Lösungen hatten allerdings noch HAES-Moleküle mit einer großen Molekülmasse und waren

mit einer erhöhten Inzidenz von Blutungen und Nierenschäden assoziiert [96].

HAES wird aus Mais- oder Kartoffelstärke (Amylopektin) gewonnen und ist eine

polydisperse Makromoleküllösung. In seiner Struktur ähnelt es dem ubiquitär im

menschlichen Organismus vorkommenden Glykogen und ist dem Immunsystem daher

bekannt. Es besteht aus α-1-4-verknüpften Glukoseeinheiten, die über α-1-6-glykosidische

21

Bindungen verzweigt sind [89,92,97,98]. Gespalten wird die α-1-4-Verbindung durch die α-

Amylase. Der Abbau wird durch das Einfügen von Hydroxyethylgruppen an den

Kohlenstoffatomen C2 oder C6 am Glukosering gestört und verzögert [89].

HAES-Lösungen werden in ihrem Molekukargewicht, der molaren Substitution (MS), dem

C2/C6-Verhältnis und der Konzentration unterschieden. Es stehen HAES-Präparate mit einem

Molekulargewicht von 70, 130 (niedermolekulares HAES z.B. Voluven®, Volulyte®), 200

(mittelmolekulares HAES, z.B. HemoHAES® und Pentaspan®) und 450kDa (hochmolekulares

HAES, z.B. Hespan®) zur Verfügung [97,98].

Die molekulare Substitution bezeichnet das Verhältnis aus Hydroxyethylgruppen an der

Gesamtzahl der Glukosemoleküle. Dabei entspricht eine MS von 0,4 als niedrig-, 0,5 als

mittel- und 0,65 bzw. 0,7 als hochsubstituiert [97].

Je größer die MS ist, desto schwerer kann HAES über die α-Amylase abgebaut werden, was

die Eliminationshalbswertzeit und den Volumeneffekt verlängert.

Ebenfalls beeinflusst das C2:C6-Verhältnis die Metabolisierungsrate. Der Abbau erfolgt umso

langsamer, je mehr Hydroxyethylgruppen am C2-Atom im Verhältnis zum C6-Atom

substituiert sind. Dieser Quotient wird allerdings nicht auf den Verpackungen angegeben.

HAES ist in den Konzentrationen 3% (hypoonkotisch), 6% (isoonkotisch) und 10%

(hyperonkotisch) erhältlich [92,98]. Die Konzentrationen haben Einfluss auf die

Volumenexpansion. So haben 6%-ige Präparate bereits die Fähigkeit 100% des eigenen

Volumens intravasal zu binden und 10%-ige Lösungen sogar 130% [99].

Abb. 5: Generationen HAES [97]

450/0,7

70/0,5

200/0,5

200/0,62

130/0,4

1. Generation 2. Generation 3. Generation

22

Abb. 6: Verpackungsbeschriftung HAES 6%

Die Elimination des HAES erfolgt größtenteils renal, da Moleküle mit einer Größe von 40 -

60kDa direkt glomerulär filtriert werden. Größere Moleküle, die die Nierenschwelle

überschreiten, müssen zuvor durch die α-Amylase gespalten werden, um dann ebenfalls über

die Niere ausgeschieden zu werden. Ein Teil des HAES wird im mononukleär

phagozytierenden System (MPS) in Vakuolen gespeichert und dort langsam abgebaut. Ob

dieser Mechanismus Auswirkungen auf Organe wie z.B. die Milz hat, konnte bisher noch

nicht eindeutig geklärt werden. Die Halbwertszeiten sind bei den jeweiligen HAES-

Präparaten unterschiedlich [97]. Die Tageshöchstdosis von HAES (200/0.5) wird mit 33ml/kg

KG angegeben [208].

2.2.1.3.2 Balancierte Lösungen

Balancierte Lösungen wurden entwickelt, um dem physiologischen Milieu des Plasmas

näherzukommen. Sie enthalten aus diesem Grund ähnliche Elektrolytkonzentrationen (vor

allem von Na+, K

+ und Cl

-) wie das Blutplasma. Sie sollen Isotonie erzielen, d.h. eine

Osmolarität von 280 - 300mosmol/kg erreichen.

Herkömmliche HAES-Präparate sind in 0,9%-iger NaCl-Lösung gelöst und können durch das

Überangebot an Chlorid (154mmol/l im Gegensatz zu 103mmol/l im Plasma) und negativer

Ladungen eine hyperchlorämische Azidose (auch Dilutionsazidose genannt) auslösen [100].

Diese metabolische Azidose kann bei Patienten das Outcome durch Reduktion der

Splanchnikusperfusion und Urinausscheidung sowie durch vermehrte Emesis verschlechtern.

Im Fall von Volulyte® wurde als Anion Acetat verwendet, das schnell und weitgehend

leberunabhängig zu Bikarbonat umgesetzt wird [101].

Bisher konnte festgestellt werden, dass balancierte Kolloide den Säure-Basen-Haushalt

weniger stören als unbalancierte Lösungen [98].

6% HAES

200/0.5

Konzentration

Molarekulargewicht Molare Substitution

23

2.2.1.4 HAES und Inflammation

Vorwegzunehmen ist, dass vorliegende Studien aufgrund der Vielzahl an HAES-Präparaten

teilweise schwer zu vergleichen sind. Es ist zu beachten, dass viele Studien aus den USA

stammen, wo lediglich die hochmolekularen, hochsubstituierten HAES-Präparate zugelassen

sind [89,97].

In mehreren Versuchen konnte gezeigt werden, dass HAES-Präparate die Mikrozirkulation

verbessern und die Leukozytenadhärenz reduzieren können [93,95,97,102,103]. Verschiedene

Mechanismen kommen dafür in Betracht wie z.B. die reduzierte Expression von

Adhäsionsmolekülen [99,102,104,105] sowie die Beeinflussungen der Sekretion

inflammatorischer Zytokine [93] oder von verschiedenen intrazellulären Signalkaskaden

[106].

2.2.1.5 HAES und Gerinnung

Vor allem die älteren, hochmolekularen HAES-Präparate führen häufiger zu Blutungen. Diese

sind bedingt durch reduzierte Faktor-VIII-Gerinnungsaktivität, verminderten Faktor-VIII-

Ristocitin-Kofaktor und vermindertes Von-Willebrand-Faktor-Antigen. Die dadurch

ausgelösten Symptome ähneln dem Von-Willebrand-Syndrom Typ I und werden ebenso

behandelt.

Des Weiteren wurden Thrombozytenveränderungen und Störungen der Fibrinpolymerisation

beschrieben. Unter höheren Dosen wurden Schwellungen der Thrombozyten mit konsekutiver

Adhäsionsschwäche beobachtet. Präparate der neuesten Generation (130/0.4) wiesen in

Untersuchungen eine schwache bis keine Beeinträchtigung der Gerinnung auf [92,97,107].

2.2.1.6 HAES und Nierenfunktion

Schon länger ist bekannt, dass HAES Einfluss auf die Nierenfunktion hat und zu

Kreatininerhöhung sowie Störungen der tubulären Integrität führen kann [92].

In der bereits erwähnten VISEP-Studie lag die 90-Tages-Letalität der 10% HAES 200/0.5-

Patienten signifikant über der der Ringer Laktat-Patienten und führte zu mehr Nierenversagen

und nachfolgender Nierenersatztherapie. Dies begründete die Einschätzung der Autoren, dass

Kolloide in der schweren Sepsis und dem septischen Schock nicht mehr verwendet werden

sollten [84]. Bezüglich dieser Aussagen und des Studiendesigns gab es allerdings Kritiken. So

kritisiert Engelmann, dass die empfohlene Tagesdosis des 10%-igen HAES 200/0.5 von

20ml/kg/d überschritten und es bereits bei einem ZVD von 12mmHg verabreicht worden sei.

Ebenso habe man sich nicht an den Serumkreatinin-Grenzwert 177μmol/l gehalten, sondern

24

Patienten mit einem Wert von bis zu 320μmol/l in die Studie eingeschlossen [108], was die

Resultate nachhaltig beeinflusse.

Im Hinblick auf die Anwendung modernerer HAES-Präparate wie HAES 130/0.4 fanden

Jungheinrich et al. bei der Gabe von 500ml bei Patienten mit mittlerer bis schwerer

Einschränkung der Nierenfunktion keine weitere Verschlechterung der Nierenfunktion [97].

2.2.1.7 HAES und Pruritus

Es ist vor allem aus dem HNO-Bereich bei der Therapie von Hörstürzen bekannt, dass

langfristig hohe Gaben von HAES zu Tage bis Wochen anhaltendem Pruritus führen können.

Die kumulative Gesamtdosis spielt dabei die entscheidende Rolle. Metze und Kollegen

konnten in diesem Zusammenhang die Aufnahme von HAES in die Lysosomen von

Schwannzellen des peripheren Nervensystems nachweisen, was den Pruritus erklären könnte

[97].

2.2.1.8 Kontraindikationen für HAES

„Bekannte Überempfindlichkeit gegenüber Hydroxyethylstärke, Hypervolämie,

Hyperhydratationszustände, schwere stauungsbedingte Herzinsuffizienz oder

Herzdekompensation, Lungenödem, Niereninsuffizienz mit Oligurie, Anurie oder

Serumkreatininwerten über 2 mg/dl, Thrombozytopenie oder andere schwere Blutgerinnungs-

störungen (z.B. Afibrinogenämie, schwere hämorrhagische Diathese), intrakranielle

Blutungen und Dialysepatienten, da HAES nur durch glomeruläre Filtration ausgeschieden

wird“ [208].

25

3 Fragestellung

Eine Grundlage der Sepsistherapie ist die Volumensubstitution, um das intravasale Volumen

und damit den Blutdruck aufrechtzuerhalten.

Die Anwendung von Kolloiden, im Speziellen der Hydroxyethylstärke, ist jedoch aufgrund

der Interaktionen mit dem renalen und dem inflammatorischen System umstritten und bedarf

weiterer Untersuchungen. Zu diesem Zweck wurden in der vorliegenden Arbeit die

Auswirkungen verschiedener HAES-Präparate auf die intestinale Mikrozirkulation bei

experimenteller Sepsis (Endotoxinämie) an der Ratte untersucht. Es wurden HAES-Präparate

mit unterschiedlichem Molekulargewicht und Substitution sowie HAES in 0,9%-iger NaCl-

und balancierter Lösung gegenübergestellt und mit der Wirkung kristalloider Lösungen

verglichen.

Das Intestinum wurde ausgewählt, da es im Rahmen der Sepsis und des Multiorganversagens

eine zentrale Rolle einnimmt und die mikrozirkulatorischen Verhältnisse

fluoreszenzmikroskopisch optimal beurteilbar sind.

Es sollten folgende Fragen beantwortet werden:

1. Haben die HAES-Lösungen Auswirkungen auf die feste und temporäre

Leukozytenadhärenz am Endothel submuköser Venolen?

2. Welchen Einfluss haben die HAES-Lösungen auf die funktionelle Kapillardichte?

3. Gibt es Unterschiede zwischen den HAES-Lösungen bezüglich der Effekte auf den

mittleren arteriellen Blutdruck und die Herzfrequenz sowie pH, Sauerstoffpartialdruck

(pO2), Kohlendioxidpartialdruck (pCO2), Bikarbonat und dem Base Excess?

4. Zeigen die HAES-Präparate Auswirkungen auf die Freisetzung von TNF-α, IL-1α,

MCP-1, IFN-γ und GM-CSF?

26

4 Material und Methoden

4.1 Versuchstiere

Von Mai bis September 2008 wurden 70 männliche Lewis-Ratten (Charles River, Kißlegg,

Dt.) mit einem Gewicht von 280g ± 80g für die Tierexperimente eingesetzt.

Gemäß den Richtlinien des Tierschutzgesetzes §7 und §8 Abs.1 wurden die Experimente dem

Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei (LALLF) Mecklenburg-

Vorpommern zur Genehmigung vorgelegt und bewilligt.

Nach Übernahme der Ratten erfolgte eine mindestens einwöchige Akklimatisierungsphase, in

der die Tiere bei einem zwölf-stündigen Tag-Nacht-Rhythmus zu zweit in Boxen ständigen

Zugang zu Futter (ssniff RIM-H, sniff Spezialdiät GmbH, Soest, Dt.) und Wasser hatten. Zum

Zeitpunkt des Versuches waren die Tiere zehn bis zwölf Wochen alt.

4.1.1 Gruppeneinteilung

Die Einteilung erfolgte in sieben Gruppen zu jeweils zehn Tieren. Alle Tiere durchliefen die

gleiche operative Präparation.

Als Kontrollgruppe diente Gruppe 1, in der die Ratten ohne Zugabe von Endotoxin mit

16ml/kg KG Ringer Laktat Basisvolumensubstitution (Fresenius Kabi, Bad Homburg, Dt.)

infundiert wurden.

Die restlichen 6 Gruppen wurden mit 5mg/kg KG Endotoxin (LPS von Escherichia coli

Serotyp O26:B6, Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Dt.; in 1ml NaCl 0,9% gelöst) und mit

den jeweiligen Lösungen behandelt.

Gruppe 2 wurde mit 16ml/kg KG Ringer Laktat (=RL 16ml) infundiert, während die

Volumensubstitution der Gruppe 3 mit 64ml/kg KG Ringer Laktat (=RL 64ml) und der

Gruppe 4 mit 64ml/kg KG Jonosteril® (Fresenius Kabi, Bad Homburg, Dt.) erfolgte. In

Gruppe 5 erhielten die Tiere 16ml/kg KG HAES 6% (200/0,5 in 0,9% NaCl-Lösung,

Fresenius Kabi, Bad Homburg, Dt.), in der 6. Gruppe 16ml/kg KG Voluven® (HAES 6%

130/0,4 in 0,9% NaCl-Lösung, Fresenius Kabi, Bad Homburg, Dt.) und in der 7. Gruppe

16ml/kg KG Volulyte®

(Voluven®

-Stärke, HAES 6% 130/0.4, in balancierter

Elektrolytlösung, Fresenius Kabi, Bad Homburg, Dt.).

27

Um eine suffiziente Volumensubstitution zu erzielen verwendeten wir viermal so viel

Volumen kristalloider Lösungen wie Volumen HAES-Lösungen. Wir richteten uns nach

Studien, die ebenfalls HAES mit kristalloiden Lösungen verglichen [95,109–112]. Die

Gruppe 2 mit einer viermal geringeren Substitution von Ringer Laktat (16ml) fungierte daher

als unbehandelte Kontrollgruppe, bei der wir eine nicht-adäquate Volumensubstitution

während Endotoxinämie annahmen.

Gruppe 1: 16ml/kg KG Ringer Laktat

Gruppe 2: 5mg/kg KG LPS + 16ml/kg KG Ringer Laktat (RL 16ml)

Gruppe 3: 5mg/kg KG LPS + 64ml/kg KG Ringer Laktat (RL 64ml)

Gruppe 4: 5mg/kg KG LPS + 64ml/kg KG Jonosteril®

Gruppe 5: 5mg/kg KG LPS + 16ml/kg KG HAES 6%

Gruppe 6: 5mg/kg KG LPS + 16ml/kg KG Voluven®

Gruppe 7: 5mg/kg KG LPS + 16ml/kg KG Volulyte®

4.2 Versuchsmodell

Abb. 7: Schematische Darstellung des experimentellen Ablaufes

(BE= Blutentnahme, IVM= Intravitalmikroskopie)

4.2.1.1 Anästhesie

Die intraperitoneale Narkoseeinleitung erfolgte mittels 60mg/kg KG Pentobarbital

(Pentobartital-Natrium, FAGRON GmbH & Co KG, Barsbüttel, Dt.). Nach ca. 15 bis 20

Minuten wurde die Narkosetiefe durch Schmerzreize an Ohren und Pfoten überprüft. Diese

Tests wurden über den gesamten Zeitraum des Versuchs intermittierend durchgeführt und bei

Bedarf konnte Pentobarbital (5mg/kg KG) über den venösen Zugang nachgegeben werden.

28

4.2.1.2 Operativer Ablauf

Nach Narkoseeinleitung wurde die Ratte, auf dem Rücken liegend, auf einem Heizkissen

(Beurer HK 20, Beurer GmbH & Co KG, Ulm, Dt.) mittels Heftpflaster (Leukoplast Hospital,

BSN Medical, Hamburg, Dt.) fixiert und ein Rektalthermometer (rektale Thermistorsonde, W

233, RFT, Stassfurt, Dt.) zur Temperaturkontrolle eingeführt. Während des Experimentes

wurde eine Temperatur von 37 ± 0,5°C aufrechterhalten.

Anschließend wurden die OP-Felder rasiert (Carrera®, Lutter & Partner GmbH, München,

Dt.), die das Halsdreieck und den Bauch vom Processus Xyphoideus bis zur Symphyse

beinhalteten.

Der Hals wurde daraufhin von kranial nach kaudal mit einem Skalpell (Präzisa Plus Skalpelle,

Dahlhausen, Köln, Dt.) entlang der Mittellinie inzidiert.

Der Präparation der Trachea folgte eine Querinzision unterhalb des Larynx zwischen zwei

Knorpelspangen, sodass ein präparierter Flexülenschlauch 16G (Introcan, B. Braun,

Melsungen, Dt.) mit handelsüblichen Fäden (Coats Duett, Ungarn) fixiert werden konnte. Das

Tier konnte so spontan Raumluft atmen und bei Bedarf abgesaugt (18G Flexülenschlauch auf

einer 5ml Spritze) oder mittels Beatmungsgerät (CWE SAR-830/P Ventilator, FMI GmbH,

Seeheim-Ober Beerbach, Dt.) mit 100%-igem Sauerstoff beatmet werden.

Es folgten die Freilegung und Ligatur der Vena jugularis interna sinistra sowie deren

Eröffnung mit einer Arterienschere (Spring Scissors, World Precision Instruments, Florida,

USA) und das Einführen eines 0,28mm durchmessenden Polyethylenkatheters (SIMS Portex,

Kent, United Kingdom). Dieser wurde mit Fäden gesichert und unter Integrierung eines

Dreiwegehahnes (Discofix, Braun Melsungen AG, Melsungen, Dt.) an ein Perfusorsystem

(Perfusor® Secura FT, Braun Melsungen AG, Melsungen, Dt.) angeschlossen.

Um vegetative Reize zu verhindern, wurde die Arteria carotis communis sinistra unter

vorsichtiger Abpräparation des Nervus vagus dargestellt, kranial ligiert und kaudal mit einem

Gefäßclip (World Precision Instruments, Florida, USA) abgeklemmt. Wie zuvor die Vene

wurde das Gefäß eröffnet und ein Polyethylenkatheter mit 0,58mm Innendurchmesser

eingeführt. Der Gefäßclip verblieb über die Zeit des Experimentes an der Arterie zur

Fixierung des Katheters.

29

Abb. 8: Intubation und Einlage des venösen Katheters (links) in die Vena jugularis sinistra sowie des arteriellen Katheters (rechts) in die Arteria carotis communis sinistra

Das System wurde mit einem Druckwandler verbunden (1DT-XX-1 Safedraw, Becton

Dickinson, Singapur) und ebenfalls unter Zwischenschalten eines Dreiwegehahnes mit einem

Perfusor konnektiert. Die Perfusoren des venösen und arteriellen Systems ermöglichten im

Folgenden die Basisvolumensubstitution mit 16ml/kg KG Ringer Laktat (Fresenius Kabi, Bad

Homburg, Dt.).

Nach Abschluss der Präparation erfolgte die erste Blutentnahme von 1,5ml aus dem

arteriellen Katheter, was im Protokoll dem Zeitpunkt t-15 entspricht.

Der LPS-Gabe (Zeitpunkt t0) folgte in der 60. Minute die Therapie mit den verschiedenen

Lösungen. Dazu wurden das venöse sowie das arterielle System kurzzeitig über die

Dreiwegehähne geschlossen, mit den therapeutischen Flüssigkeiten durchspült und erneut an

die Perfusoren angeschlossen. Nach Wiederöffnen der Wege betrug die Infusionsdauer eine

Stunde.

In der 90. Minute wurde das Abdomen medial vom Xyphoid bis zur Symphyse eröffnet und

der ileocoecale Übergang des Darmes mit Hilfe von feuchten Wattestäbchen (Paul Hartmann

AG, Heidenheim, Dt.) aufgesucht und vorsichtig ausgelagert. Die entstandenen

Operationswunden an Hals und Abdomen wurden mit feucht-warmen Mullbinden (Gazin®

Mullkompresse 10x20cm, Lohmann und Rauscher, NL) bedeckt, um sie vor Austrocknung zu

schützen.

Es schloss sich die Umlagerung des Tieres auf den Mikroskopiertisch an, wobei die

Körpertemperatur weiterhin durch das darunterliegende Heizkissen reguliert werden konnte.

Daraufhin wurde der zu untersuchende Darmabschnitt auf eine Spezialvorrichtung in ein

30

37°C warmes Wasserbad platziert und mittels des „Hanging Drops“ [113] ständig feucht

gehalten, durch den ebenfalls die Adhäsion zum darüber liegenden Objektträger (Thermo

Scientific Menzel-Gläser, Menzel GmbH & Co KG, Braunschweig, Dt.) gewährleistet wurde.

In der 105. Minute erfolgte die Applikation von 1,5ml/kg KG 0,05% Rhodamin (Rhodamine

6G C.L. 45160, Basic Red 1, Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Dt.) zur

Leukozytenmarkierung. Für eine bessere optische Auflösung wurde zwischen Objektträger

und Objektiv Aqua dest. (Universitäts-Apotheke, Greifswald, Dt.) gegeben. Zum Zeitpunkt

t120 wurde mit der Intravitalmikroskopie begonnen.

Nach dem Aufnehmen der Lamina muscularis (siehe Intravitalmikroskopie) mittels

Videorekorder folgte die i.v.-Injektion von 1ml/kg KG 5% FITC-Albumin (Fluorescein

Isothiocyanate conjugate bovine, Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Dt.).

Für die anschließende Mukosapräparation wurde ein Darmsegment antimesenterial unter

Zuhilfenahme eines Elektrokauters (Geiger coutery unit, Modell 100, Geiger Instrument Co.

Inc., Californien, USA) über die Länge von 1,5 bis 2cm eröffnet. Um eine thermische

Beeinträchtigung der kontralateralen Darmwand zu vermeiden, wurde ein faecesreicher

Darmabschnitt ausgewählt.

Der Kot wurde anschließend mit erwärmter NaCl-Lösung (0,9 % Isotonische Natriumchlorid-

Lösung, Delta Select GmbH, Dreieich, Dt.) ausgespült.

Nach Beendigung der Mukosaaufnahmen zum Zeitpunkt t180 wurden der Ratte erneut 1,5ml

Blut entnommen. Das Tier wurde daraufhin mit einer intravenösen Überdosis Pentobarbital

getötet.

4.2.1.3 Monitoring

Während des gesamten Experimentes wurden Körperkerntemperatur, mittlerer arterieller

Blutdruck und Herzfrequenz über einen Monitor (Hewlett-Packard, Modell 66S, Saronno,

Italien) erfasst und alle 15 Minuten protokolliert.

31

4.3 Intravitalmikroskopie

4.3.1 Technik

Bei der intravitalmikroskopischen Untersuchung der jeweiligen Darmschichten kam folgende

Technik zum Einsatz:

Epifluoreszenzmikroskop Axiotech Vario, Carl Zeiss, Jena, Dt.

- Lichtquelle HBO 50, Carl Zeiss, Jena, Dt.

- Objektiv - 20x/0,5; Achroplan, Carl Zeiss, Jena, Dt.

- Filtersatz Nr. 20, Carl Zeiss, Jena, Dt. (Anregung: BP 546/12; Frequenzteiler: 560;

Emission: BP 575 - 640) für Beobachtungen mit Rhodamin 6G

- Filtersatz Nr. 10, Carl Zeiss, Jena, Dt. (Anregung: BP 450 - 490; Frequenzteiler: 510;

Emission: BP 515 - 565) für Beobachtungen mit FITC-Albumin

- Videokamera: AVT-BC 12, AVT-Horn, Aalen, Dt.

- Videorekorder: NV-HS8830, Panasonic, United Kingdom

- Monitor: PM9-5B, Ikegami Elektronics GmbH, Dt.

Nach der in situ Markierung der Leukozyten mittels Rhodamin 6G wurden jeweils sechs

Gesichtsfelder mit mindestens 300μm langen, unverzweigten Gefäßabschnitten (V1 und V3)

der Submukosa aufgesucht.

Die Unterscheidung der Gefäße in V1 und V3 erfolgte anhand ihres Durchmessers. Dabei

wurden V1-Gefäße als Venolen 1. Grades definiert, die einen Durchmesser zwischen 50 -

80μm aufwiesen (Sammel-Venolen). V3-Gefäße hingegen als Venolen 3. Grades, deren

Durchmesser zwischen 30 - 50μm lag (postkapilläre Venolen). Jedes Gesichtsfeld wurde

daraufhin 30 Sekunden mit Hilfe des Videorekorders aufgenommen.

Dem schloss sich die Plasmakontrastierung durch FITC-Albumin an, woraufhin sich die

Kapillaren der Muscularis longitudinalis et circularis darstellen ließen. Auch hier erfolgten

sechs Aufnahmen à 30 Sekunden.

Anschließend begann das bereits beschriebene Verfahren der elektrothermischen Eröffnung

des Darmes zur Darstellung der Mukosa. Es wurden vornehmlich Abschnitte aufgesucht, die

sich in möglichst großer Entfernung zu den koagulierten Rändern befanden, um

unbeeinflusste Kapillaren zu dokumentieren. Wie zuvor wurden 6 Sequenzen 30 Sekunden

lang gefilmt.

32

Abb. 9: a) Vorrichtung zur Auflage des Darmes während der Intravitalmikroskopie und „Hanging Drop“-Anlage b) Ratte während der Intravitalmikroskopie mit fluoreszierendem Licht

4.4 Auswertung des Bildmaterials

Die Auswertung des Bildmaterials erfolgte nach erfolgreicher Aufnahme der Videosequenzen

(Videoplayer JVC SR-S388E CTL Time Code) manuell am Bildschirm (Monitor, Ikegami

Elektronics GmbH, Dt.).

Mit Hilfe eines Objektmikrometers wurden maßstabgerechte Schablonen angefertigt, mit

denen die jeweiligen Längen und Gefäßdurchmesser bestimmt wurden.

4.4.1 Leukozyten-Endothel-Interaktion

Zur Auswertung kamen jeweils sechs Gefäße von Venolen 1. und 3. Grades. Es wurde die

Anzahl fest adhärenter und temporär adhärenter Leukozyten am Endothel bestimmt. Auf einer

Schablone wurde der Abstand markiert, der im Maßstab 300μm entsprach und die Anzahl fest

und temporär haftender Leukozyten gezählt. So wurde für die Venolen 1. und 3. Grades

verfahren.

4.4.1.1 Fest adhärente Leukozyten

Fest adhärente Leukozyten sind Zellen, die mindestens 30 Sekunden an der

Endotheloberfläche haften (Zellen/mm2). Zur mathematischen Berechnung der

Endotheloberfläche wird ein Zylinder angenommen (Zylinderoberfläche (F) = Länge des

Gefäßes (l) x Zylinderumfang (U)).

b a

33

Abb. 10: a) Intravitalmikroskopie der Darmwand (LPS-Gruppe, Submukosa, V1-Venolen mit adhärenten Leukozyten)

b) Intravitalmikroskopie der Darmwand (LPS-Gruppe, Submukosa, V3-Venolen mit adhärenten

Leukozyten)

4.4.1.2 Temporär adhärente Leukozyten

Temporär adhärente Leukozyten sind Zellen, die in einem Beobachtungszeitraum von 30

Sekunden mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von ca. 50μm/s an der Endothelwand

entlang rollen.

Der Rollerflow ist dabei die Anzahl der temporär adhärenten Leukozyten pro Zeit

(Zellen/min).

a b

34

4.4.2 Funktionelle Kapillardichte

Die funktionelle Kapillardichte (FCD) errechnet sich aus der Länge der Kapillaren mit

sichtbarer Erythrozytenperfusion (erkennbar als Hell- [FITC-markiertes Plasma]/Dunkel-

[Erythrozyten] Kontrast) im Verhältnis zu einer umschriebenen Fläche (cm/cm2).

Abb. 11: a) Intravitalmikroskopie der Darmwand (Kontrollgruppe, Muscularis circularis, Kontrastierung der

Kapillaren mit FITC-Albumin)

b) Intravitalmikroskopie der Darmwand (Kontrollgruppe, Muscularis longitudinalis, Kontrastierung der

Kapillaren mit FITC-Albumin)

Abb. 12: Intravitalmikroskopie der Darmwand (Kontrollgruppe, Mukosa, Kontrastierung der Kapillaren mit FITC-Albumin)

b a

35

Einteilung der Kapillaren in:

1. funktionelle Kapillardichte [FCD]: die FCD errechnet sich aus der Länge der Kapillaren

mit permanenter Erythrozytenperfusion über einen Zeitraum von 30 Sekunden im

Verhältnis zu einer bestimmten Fläche

2. dysfunktionelle Kapillardichte [DCD]: die DCD errechnet sich aus der Länge der

Kapillaren mit pendelnder Erythrozytenperfusion über einen Zeitraum von 30 Sekunden im

Verhältnis zu einer bestimmten Fläche

Über ein Gitter, dessen Kästchen-Kantenlänge im Maßstab den Ausmaßen von 400 x 500μm

entsprach, wurden die Kapillaren der Lamina muscularis longitudinalis bzw. circularis

nachgezeichnet. Anschließend wurden die Schnittpunkte zwischen den Kapillaren und der

Gitterstruktur der Schablone ausgezählt und ergaben mit der Formel nach Schmid-Schoenbein

die FCD [114]:

FCD = k x N/L

L = 2 PMd = Länge des Gittersystems

d = Kantenlänge der Kästchen (in μm = Originallänge)

PM = Anzahl der Kästchen

N = Anzahl der Kreuzungen der Kapillaren mit den Gitterlinien

k = Konstante entspricht π/2

Durch das gleiche Prozedere wurde die DCD ermittelt.

Für das Stratum mucosae wurde hingegen ein Gitter angefertigt, dessen Kästchen-

Kantenlänge im Maßstab den Ausmaßen von 100 x 150µm entsprach. Das zuvor erklärte

Verfahren wiederholte sich erneut.

4.5 Blutgasanalyse

Zu den Zeitpunkten t-15 und t180 wurden jeweils 1,5ml Blut aus dem arteriellen System mit

Hilfe einer Monovette (2ml LH, Ca 2+

-balanciertes Heparin, 50ml Heparin/1ml Blut, Sarstedt

AG & Co, Nümbrecht, Dt.) entnommen. Davon wurden 125µl in ein Kapillarröhrchen

(Clinitubes 125µl, Radiometer Medical ApS, Dänemark) abgefüllt, um über ein automatisches

Blutgasanalysegerät (ABL 700 Series, Radiometer Kopenhagen, Dänemark) die Werte pH,

36

Sauerstoffpartialdruck (pO2), Kohlendioxidpartialdruck (pCO2), Bikarbonat, (cHCO3) und

Base Excess zu bestimmen.

4.6 Zytokine

0,7ml Blut wurden zur Plasmagewinnung in ein EDTA-Röhrchen (Microvette 500 K3E, Tri-

Kalium-EDTA, Sarstedt Ag & Co, Nümbrecht, Dt.) gefüllt und anschließend 15 Minuten

zentrifugiert (Zentrifuge Desaspeed LC-1, Desaga Sarstedt Gruppe, Dt.).

Der gewonnene Plasmaüberstand wurde in 4 Eppendorfgefäße (0,5ml, Sarstedt Ag & Co,

Nümbrecht, Dt.) à 60µl abpipettiert (Pipette Research Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Dt.)

und bei -80°C (Colora UF 80-450 S, Colora Meßtechnik GmbH, Lorch, Dt.) aufbewahrt.

Im Anschluss wurden die Zytokine TNF-α, IL-1α, MCP-1, IFN-γ und GM-CSF über ein Kit-

System (FlowCytomix, Rat Cytokin 6-plex, BMS825FF, Bender MedSystems GmbH, Wien,

Österreich) am Durchflusszytometer (BD FACSCaliburTM system, Becton Dickinson & Co,

USA) bestimmt.

4.7 Statistik

Die Daten wurden anfangs in einer Exel-Datei gespeichert und später in das

Statistikprogramm Prism5.01 (GraphPad Prism, San Diego, USA) übertragen.

Es folgte zuerst eine deskriptive Untersuchung auf Mittelwert, Standardfehler,

Standardabweichung und Varianz.

Nach bestätigter Normalverteilung durch den Kolmogorov-Smirnov-Test konnte die One-

Way-Anova (einfaktorielle Mittelwertvergleich unabhängiger Stichproben) erfolgen. Wenn

sich signifikante Unterschiede darstellen ließen, wurde die post hoc–Testung mit dem

Newman-Keuls Multiple Comparison Test durchgeführt.

Im Falle eines multifaktoriellen Designs (wiederholte Messungen, mehrere Gruppen) wurde

eine Two-Way-Anova mit Messwertwiederholung und anschließendem Post-Test nach

Bonferroni durchlaufen.

Das Signifikanzniveau wurde bei p

37

5 Ergebnisse

5.1 Hämodynamik

5.1.1 Mittlerer arterieller Blutdruck

Initial lag der mittlere arterielle Blutdruck bei allen Tieren zwischen 110 - 145mmHg. In den

Gruppen mit LPS-Applikation zeigte sich ein temporärer Blutdruckabfall.

Im Zeitraum der Volumentherapie (von der 60. bis 120. Minute) stieg der MAP in allen LPS-

Gruppen wieder langsam auf durchschnittlich 100 - 120mmHg an. Zum Experimentende (t180)

wurde in der Kontroll-, Ringer Laktat 16ml-, Jonosteril®- und HAES 6%-Gruppe das

Ausgangsniveau des Blutdruckes wieder erreicht. Lediglich der MAP der Volulyte®-Gruppe

lag im Vergleich zum Ausgangswert zum Zeitpunkt t180 signifikant niedriger.

Mittlerer arterieller Blutdruck

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

Kontrolle

RL 64mlRL 16ml

JonosterilHAES 6%VoluvenVolulyte

-15

1***

3*** 4*** 5*** 6*** 7***

1***2**3***4***5***6***7***

1***2**3***4***5**6***7***

1***2**3***4***5***6***7***

1***3***4**5***6**7***

5**6**7***

5*6*

7***

5**7** 7**

3*6*7*

7* 7*

min

mm

Hg

Abb. 13: Mittlerer arterieller Blutdruck (MAP in mmHg); Mittelwert ± SD; p-Wert:

* p

38

Minute. Die Herzfrequenz aller LPS-Gruppen zeigte sich im Zeitraum der Volumentherapie

(t60 bis t120) stabil und unterschied sich nicht signifikanten zu den jeweiligen Ausgangswerten.

Signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe fanden sich im Zeitraum der Volumentherapie

in der HAES 6%-, der Volulyte®-, der Jonosteril®- und der Ringer Laktat 64ml-Gruppe. Zum

Ende des Experimentes stieg die Herzfrequenz bei allen Tieren auf Werte um 500 Schläge pro

Minute, was noch über dem Niveau der Ausgangsfrequenz lag. Die Voluven- und Volulyte-

Gruppen zeigten zum Zeitpunkt t180 dabei eine signifikant höhere Frequenz im Vergleich zu

deren Ausgangswerten.

Herzfrequenz

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180

400

425

450

475

500

525

550

575

600

Kontrolle

RL 64mlRL 16ml

JonosterilHAES 6%VoluvenVolulyte

-15

7*

7**3*

7**

2*5**6*7*

1*

1*1*

2*5***

2*5***6*

5***6**

°

^""

° ^""

"--^̂ ^

"

""

min

min

-1

Abb. 14: Herzfrequenz (Hf in Schläge/min); Mittelwert ± SD; p-Wert:

* p

39

5.2 Intravitalmikroskopie

5.2.1 Leukozyten-Endothel-Interaktion

5.2.1.1 Fest adhärente Leukozyten

Die Anzahl der fest adhärenten Leukozyten am Endothel der Venolen 1. und 3. Grades im

Ileum der Ratten erhöhte sich bei Endotoxinämie signifikant in allen Gruppen. In den

postkapillären Venolen (V3) ließen sich insgesamt ca. doppelt so viele adhärente Leukozyten

nachweisen wie in den Sammel-Venolen (V1).

In der Behandlungsgruppe mit HAES 6% stieg der Wert am geringsten an.

In den Sammel-Venolen wurde der höchste Anstieg in der Gruppe mit Ringer Laktat 16ml

(209,5 ± 13,5/mm2, p