(Aus der Chemischen Abteilung des Pathologischen Instituts der Universit~t Berlin. Leiter: Prof. Dr. Hinsberg.)

Versuche, das Wachstum des Ascitesearcinoms der Maus dutch Porphyrine zu beeinflussen.

Von Hans W. Sehmidt. MR 1 Textabbfldung.

(Eingegangen am 19. November 1942.)

Neuere Untersuchungen haben ergeben, dab den Porphyrinen eben- sowohl im intermedis Stoffwechsel (Hin,sberg und Merten 1) wie im h0rmonalen Geschehen eine wichtige Aufgabe zuzukommen seheint. Es sei hier - - wenn wir yon allen bei Porphyrinurien und Por- l~hyrien beobachteten Wirkungen absehen - - nur an die bemer- kenswerten Beobachtungen yon Hiihnerfdd ~ erinnert, wonaeh das I-I~matoporphyrin eine insulinsparende F~higkeit bes i t z t und den Blutzueker senkr Porphyrinhaltige KSrper sind auch die Cytochrome, fiber deren Bedeutung als sauerstoffiibertragende Fermente bei der ~eroben Zellatmung wit durch die Forschungen yon Keil in 3 unterrichtet sind. v. Euler und Mitarbeiter 4 verdanken wir die Entdeckung, dal~ beim Carcinom eine StSrung in der Ket te dieser Atmungskatalysatoren vor]iegt. Sie fanden im Jensen-Sarkom im Vergleieh zum Normal- gewebe u. ~. den Geha]t an Cytoehrom abgesunken. Dieser Befund ver- anlal~te sie, aueh im ttinblick auf den schon frfiher erhobenen Befund ver~nderter Atmungsvorgs im Krebsgewebe (Warburg 5) yon einem , ,Cytochromdefekt" der Krebszelle zu spreehen%

Auch der i~orphyringehalt in Tumoren ist vermindert 12. Anderer- seits gibt Hinsberg 7 an, dait h~ufig im Blur yon Krebskr~nken eine Vermehrung des Protoporphyrins gefunden wird. Es kSnnte somit so sein, dai] im Carcinomgewebe die Neubildung des Cytochroms gestSrt ist. In diesem Zusammenhang seien ~uch Beobaehtungen yon Hins- berg und Rodewald s erw~hnt, wonach H~matoporphyrin, einem tierisehen Org~nismus zugefiihrt, t tormonversehiebungen in der Hypophyse - - ~estgestellt ffir das Melanophorenhormon ~ hervorruft, die denen s neln, wie man sic bei krebskranken Menschen finder. - -P ro topo rphy r in hingegen vermag diese StSrungen wieder zu beseitigen.

Aus diesen Zusammenhi~ngen zwisehen Porphyrinen und Krebs heraus ~ul~erte Hinsberg v den Gedanken, d~s Porphyrin, speziell das Protoporphyrin, therapeutisch bei der Krebskrankheit zu versuehen. Aus einer Arbeit yon Klar 9 fiber die therapeutische Anwendung yon

Wachstum des Ascitescarcinoms der Maus. 313

(Jytochrom bei internen Erkrankungen entnehmen wir eine Angabe fiber nicht verSffentlichte Versuehe yon Mzdli und Guhr, wonach 1)orphyrin bei Krebskranken lediglich eine allgemein tonisierende Wirkung aus- ~ibt, jedoch das Gesehwulstwachstum unbeeinfluBt ]~Bt.

Da es nach den bisher vorliegenden und bekannten Tatsachen im Bereich der MSglichkeit zu liegen scbien, das Carcinomwachstum dutch l~orphyrjnzufuhr entweder fiber das Hormonsystem oder dutch An- regung der Cytochrombildung zu beeinflussen, haben wir im Juli 1941 Versuche fiber die Wirkung dieser Pigmente auf das Aseitescarcinom tier Maus begonnen. Nachdem unsere Arbeit bereits fertiggestellt war, erschien in dieser Zeitschrift eine Mitteilung fiber Versuche yon Auler und Banzer 1~ die sich mit der gleichen Frage beschifftigt. Die Forscher prfiften die Wirkung yon I-I~mato-, Kopro- nnd Protoporphyrin auf das Waehstum des Flexner-Jobling-Careinoms und des Jensen-Sarkoms der Ratte. Sie ste]lten allgemein fest, dab Tumoren sowohl mit als ohne Porphyrinzufuhr besonders in den nekrotischen Teilen Porpbyrinfluores. cenz zeigen. Sie glauben, dab Applikation dieser Pigmente den nekroti. schen ZerfaH der Tumoren fSrdere. Aueh nach zus•tzlicher Bestrahlung mit einer Quarzlampe wiesen die Geschwiilste vermehrt Nekrosen auf. In unseren eigenen Versuchen benutzten wit zur 1)rfifung sowohl ein im tierischen Organismus natfi~'lich vorkommendes Porphyrin, das Proto- porphyrin, als aueh ein nieht normalerweise vorkommendes, das tt~ma- toporphyrin.

tterstellung der ProtoporphyrinlSsung: Aufl6sen der Pigment- krystalle in wenig 2 n HC1, neutralisieren mit gleichen Mengen 2 n NaOtI; ~ufffillen mit Ringerl6sung. Die Endkonzentration betrug 1 nag Proto- porph~in in 1 ccm.

Als tt~tmatoporphyrinl6sung benutzten wir das Photodyn der Firma Nordmark-Werke.

In orientierenden Vorversuehen an Mgusen wurde die Vertrs keit der verwendeten Porphyrine geprfift. Die 12--24 g schweren Tiere bekamen das Mittel in 2t~gigen Abstitnden. Sie erhielten im gan- zen 10 Injektionen. Die Dosierung betrug 0,25 mg oder 0,5 mg bei subcutaner bzw. 0,25 mg bei intraperitonealer Anwendung: Das Proto- porphyrin wurde gegenfiber dem Hi~matoporphyrin besser vertragen, bei letzterem die subcutane Applikation besser als die intraperitoneale. Von 9 mit Protoporphyrin behandelten Mgusen ]ebten nach 4 Wochen noch 8, yon 9 mit Hi~matoporphyrin behandelten noch 5. Ein Teil der Tiere nahm in dieser Zeit an Gewicht etwas ab, ein Teil etwas zu.

Als Transplantationstumor stand das bereits durch viele Passagen bei uns gehaltene Mi~useascitescareinom" yon Ehrlich zur Verffigung. Die Uberimpfung des Carcinoms gesehah folgendermaBen: 3 cam des jeweils friseh gewonnenen Ascites wurden mit 10 ccm steriler physio-

314 I-I. W. Schmidt: Versuche, das Wachstum

]ogischer KochsalzlSsung versetzt und gut gemischt. 0,5 ccm hiervon ~urden pro Maus intraperitoneM injiziert. Die Versuche kamen jeweils mit Gruppen yon etwa 10 M~usen zur Durehffihru~g. Als Kontrollen dienten 115 Ascitesmi~use, die spontan an ihrem Carcinom gestorben waren. Die verwendeten Tiere hatten am Tage der Impfung (bezeichnet Ms 1. Tag !) in der Regel ein Gewicht um etwa 15 g. Leider stand uns genetisch einheitliches Tiermaterial nicht zur Verffigung, so dab wit mit M~usen verschiedener Zuchten vorliebnehmen muitten. Die Tier~ wurden bei K5rnermischfutter und Hundekuchen sowie Wasser geha]- ten. Mit dem Tage der Impfung beginnend, wurden sie jeden 2. Tag vor dem Ffittern gewogen. MiSuse, die bis zu 3 Tagen nach der Impfung starben, wurden nicht mitberficksichtigt. Aus den jeweils ermittelten KSrpergewichten wurde die durchschnittliche Gewichtszunahme i~ Prozenten des Ausg~ngswertes ermittelt und diese in Beziehung zum Impftag in ein Koordinatensystem eingetragen (,,Gewichtskurve"). In dem gleichen Koordinatensystem kam auch die dazugehSrige ,,Absterbe- kurve", dargestellt aus den an dem jeweiligen Tag noch lebenden Anteil an Versuchstieren, zur Aufnahme (s. Abb.). Wir sind uns im klaren, dab die Ermittlung der KSrpergewichtszun~hme nicht Ms Mleiniger und unbedingt zuverl~ssiger MaBstab ffir die Beurteilung des Ascites- tumorwuchstum gelten kann. Deren Fe'ststellung bietet nur einen einigermal3en brauchba.ren Anhalt, genfigt jedoch, besonders im Zu- sammenhang mit der Anlegung einer ,Absterbekurve", um mit einem Blick grSbere Abweichungen vom normalen Geschwulstwachstum zu erkennen. Die Gewichtskurven sind nur bis hSchstens zum 14. Tage nach der Impfung gezeichnet, da zu diesem Zeitpunkt gewShnlich bereits fiber 50 % der Versuchstiere an ihrem Tumor gestorben sind und die Erreeh- nung des Durchsehnittsgewichtes keine zum Vergleich brauchbare~ Werte mehr liefert.

Es wurden an fiber 100 Tieren folgende Versuchsreihen durchgeffihrt : A. Zufuhr yon Protoporphyrin in Einzeldosis yon 0,25 mg intra-

peritoneal. Die erste Injektion geschah mit der Impfung des Tumors. die weiteren jeden 2. Tag his zur Beendigung der Reihe durch Tod. Anzahl der Tiere: 19; Durchschnittsgewicht: 15,1 g. Bis auf 5 .Tiere, die am 12, 18., 27. bzw. 34. und 40. Tage starben, hatten Mle Ascites ; das am 34. Tage gestorbene Tier hatte einen soliden Tumor an der In]ektionsstelle in der Bauchwand. Die Gewichtskurve (s. Abb.} erscheint gegenfiber der Kontrollkurve etwas ~lacher. Eine prinzipielle Abweichung liegt ]edoch nicht vor.

B. In der zweiten Serie wurde ebenso vorgegangen wie vorher, nur bekamen die Tiere tti~matoporphyrin. In Versuch standen 19 Tiere mit. einem Durchschnittsgewicht yon '14,2 g, Ohne Ascites blieb nur eirL Tier, das am 15. Tage nach der Impfung starb. Die Gewichtskurve

des Ascitescarcinoms der Maus durch Porphyrine zu beeinflussen. 315

d e c k t sich fas t vSllig mi t der Kon t ro l lku rve , wenn wir yon einer in den ers ten Tagen bewi rk ten Senkung un te r das Ausgangsgewich t absehen. Auch die Abs t e rbeku rve weist nur geringf/ igige Abweichung insofern auf, als die Versuchsreihe bere i ts a m 19. Tage beende t ist.

C. E ine wei tere Tier re ihe (18 Mguse m i t 15,5 g mi t t l e r em Gewicht) wurde ebenfal ls mi t H g m a t o p o r p h y r i n , j edoch in Einze ldosen yon 0,5 mg bei subcu tane r Anwendung behande l t . Mit den I n j e k t i o n e n wurde berei ts ein Tag vor der I m p f u n g des Tumors begonneil . Die Hgl f te de r 18 Tiere b e k a m im ganzen 6, die andere 8 t n j ek t ionen . D a ein pr inzip ie l ler Er fo lgsunte rsch ied du tch ]e tz tere MaBnahme n ich t zu ver- %

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Taye ~ach dep #m#tu,~ Abb. 1. Absterbe- und Gewichtskurven yon unbehandelten und rait Porphyrinen behandelten Ascitescarcinomm/~usen. ~ ~ 115 Eontrolltiere; . . . . . A. Protoporphyrin jeden 2. Tag 0,25 mg i.p. (19 Tiere); - - = B. ]tgmatoporphyrin jeden 2. Tag 0,25 mg i.p. (19 Tiere); ................ C. ]ff/~matoporphyrin jeden 2. Tag 0,50 mg s.c. (18 Tiere); . . . . . . D. Protoporphyrin jeden 2. Tag 0,25 mg i.p. -b UV./ganze M~use (30 Tiere); . . . . . . . . . . E. Ascites + Proto-

porphyrin. UV.-Bestrahhng in vitro (10 Tiere).

z e i c h n e n war, wurden die Gruppen als E inhe i t be t r ach te t . W i r ver- me rken auch b ier eine gcr inggradige Senkung der Gewich tskurve u n t e r d ie der unbehande l t en Tumor t i e re . A m 20. Tage leb te keine Maus mehr . Alle bis auf 4 Tiere b a t t e n s t a rke Asci tesbi ldung. Gerade diese 4 M~use, die bis auf eine, die a m 6. Tage s ta rb , sei t der ] m p f l m g s tgndig an Gewicht a b n a h m e n und ke inen Asci tes auiwiesen, s ind ffir die De- press ion der Gewich tskurve ve ran twor t l i ch zu machen.

D. Des wei teren wurde versucht , die photosens ib i l i s ie rende Eigen- schaf t der P o r p h y r i n e fiir unsere Versuche n u t z b a r zu machen . Zu d iesem Zweck wurden Mguse m i t P r o t o p o r p h y r i n in Einze ldosen yon 0,25 mg subcu tan jeden 2. Tag behande l t und tggl ich m i t aufs te igenden Dosen U]traviole~t l ieht bes t rah l t . Die Po rp hy r inz u fuh r begann einen Tag vor der Tumor impfung . U n m i t t e l b a r nach der I m p f u n g wurde die e r s te Bes t r ah lung durchgef i ihr t . Die U l t r av io l e t t l i ch t e inwi rkung ge- schah ungef i l t e r t m i t e iner Quecks i lberbogenlampe im A b s t a n d yon

316 H. W. Schraidt: Versuche, das Wachstum

einem halben Meter yon oben in den Kgfig. Es wurde mit einer Minute Bestrahlungsdauer begonnen und die Zeit tgglich um eine Minute ver- lgngert, lqaeh der 10. Sitzung wurde abgebrochen. Ira ganzen standen 30 Tiere (mittleres Gewicht 15,4 g) im Versuch. In der ersten Serie yon 10 Mgusen wurde ein auffglliger Befund erhoben. Bei 5 yon d{esen Tieren kam es nieht zur Ausbildung yon Ascites, sondern in der Bauch- h6hle zur Bildung so]ider Tumoren mit zentralem Zerfall. Die Tiere starben erst am 32., 35.,46., 49. und 74. Tage. Es schien somit die UV.- Liehteinwirkung bei-Protoporphyringaben die Bildung des Ascites zu hemmen und hierdurch die Lebensdauer der Mguse zu v e r l g n g e r n . - Weitere Versuche unter v611ig gleiehen Bedingungen bestgtigten jedoch diese Beobachtung keineswegs. Im ganzen bekamen yon 30 Mgusen 23 Aseites. Nur 2 Tiere starben ohne makroskopiseh erkennbaren Tumor am 21. bzw. 26. Tage.

E. In einer weiteren Versuchsreihe bestrahlten wir den Tumor vor der Impfung in vitro. Zu diesem Zweck wurde frisch entnommener und mit phys. Koehsalzl6sung sowie Protoporphyrin vermisehter Ascites sofort 3 Minuten bei 30 em Abstand dem Ultraviolettlieht aus- gesetzt. Je 0,5 ccm dieser Misehung, die die gleiche Aseitesmenge wie

s o n s t und 0,25 rag des Pigmentes enthielt, wurde sodann 10 Mgusen mit einem Durchschnittsgewicht yon 14,5 g eingeimpft. Eine weitere Behandlung erfo]gte nicht. Zur Kontrolle dienten 10 Mguse, denen gleicher Aseites, in gleicher Weise behandelt, jedoeh ohne Porphyrin- zusatz injiziert wurde. Ein Blick auf die Abbildung lehrt, dab die Ge~vichtskurve keine wesentliche Abweiehung yon der Kontrollkurve aufweist und aueh die Absterhekurve keine merkliehe Versehiebung erfahren hut. Alle Tiere bis auf eines starben an ihrem Ascites. Die mit bestrahltem Aseites ohne Porphyrinzusatz behandelten KontroUtiere begannen erst am 16. Tage abzusterben. I~ur 2 yon diesen M~usen blieben ohne Ascites. Es geht somit auch aus dieser wenn auch kleinen Versuchsreihe hervor, dab eine wesentliche Schs der Krebszellen durch kurzfristige Einwirkung yon Ultraviolettlicht bei Anwesenheit yon Porphyrin nicht hervorgerufen wird. Es wurde davon Abstand genommen, in dem in Frage stehenden Zusammenhang weitere Ver- suehe in dieser Riehtung zu unternehmen, da insbesondere bei 1/~nger dauernder Bestrahlung der Zeitfaktor als neues, die Krebszellen wesent- lieh seh~digendes Moment hinzugekommen w~re.

tP. Nur kurz erwghnt seien VersuehsergebrSsse einer weiteren Serie yon 9 Mgusen, denen 10 Tage lang v e t der Tumorimpfung jeden 2. Tag 0,25 mg Protoporphyrin subcutan gegeben worden war. Auch bier lief das Tumorgeschehen in iib]ieher Weise ab.

Betraehtet man die Versuchsergebnisse kritisch, so muB man zu- geben, dab eine irgendwie in die Augen springende Beeinflussung des

des Ascitescarcinoms der Maus durch Porphyrine zu beeinflussen. 317

Tumorwachstums, wenigstens in bezug auf das hier verwendete Ascites- .carcinom der Maus durch Porphyrine, nicht zu verzeichnen ist. Die in den Diagrammen hervortretenden Abweichungen yon der Kontroll- kurve sind derart geringfiigig, dab man sie keineswegs im Sinne einer hemmenden Wirkung der Pigmentstoffe auf das Krebswachstum aus- deuten kann. Auch der Tatsache, dab fast in jeder Versuchsserie einige l-VI/iuse" ohne Tumor blieben, wird kein Gewicht beigelegt, da unter unseren 115 Kontrolltieren in 8 F/~llen ebenfails der Ascites nicht an- gegangen war. - - Weiterhin ist zu berficksichtigen, dab jeweils im Ver- gleich zu der Kontrollserie weniger Tiere im Yersuch standen und somit Abweichungen auch der kleineren Zahl zur Last zu legen sind. Die vor- zeitige Beendigung der beiden unter Hamatoporphyrin stehenden Ver- suchsserien finder ihre Erkli~rung in der anscheinend etwas grSBeren Toxiziti~t des tt/~matoporphyrins gegenfiber dem Protoporphyrin.

Die zu Beginn gestellte ~u ob Porphyrine in der Lage sind, das Wachstum des Ascitescarcinoms der Maus zu beeinflussen, mfissen wir ~uf Grund dieser experimentellen Ergebnisse verneinen. Die Versuche lassen daher auch yon vornherein die therapeutische Anwendung yon Porlohyrinen beim menschlichen-Krebs als sehr wenig aussichtsreich erscheinen. Es ist zun~chst festzustellen, dab das Porphyrin als solches keine ffir die Krebszelle giftige Eigenschaften aufweist; denn es zeigte sich in unseren Versuchen, dab die Carcinomzellen, die ja in unmittel- bare Berfihrung mit Porphyrin in sehr hohen Konzentrationen gebracht werden, weiterleben und sich hemmungslos vermehren. Auch mikrosko- pische Kontrolle ergab keine auffallende Veri~nderung der Asciteszellen. - - Zu den Versuchen wurde das Protoporphyrin sowie das H/~matopor- phyrin verwendet. Die Ergebnisse Sind daher, strenggenommen, nut ffir diese beiden Stoffe giiltig. Es ist mSglich, dab die physiologisch .ebenfalls vorkommenden Derivate, wie Koproporphyrin und Uropor- phyrin, infolge ihrer noch sti~i-keren phot.osensibilisierendenEigenschaften einen Effekt erwarten lassen und das Wachstum der Krebszellen beein- ~lussen.

Im iibrigen sei noch fo]gendes bemerkt: Nach v. Eulers Anschauung liegt der Cy~ochromdefekt ja in der fertigen Krebszelle vor, ist somit eine besondere Eigenschaft einer Zel!e, die ganz anders geartet ist als eine gew6hnliche KSrperzelle. Dieser Defekt beruht (nach v. E~tler)

~z16glicherweise auf Ver~nderungen yon Erbanlagen (also auf Muta- tionen) in der Krebszelle, die fiir die Ausbildung des Cytochromsystems verantwortlich seien. Es ist nun nicht zu erwarten, da$ eine solche Zelle allein durch reichliche Zufuhr eines in ihr mangelhaft vorhandenen Stoffes ihren Grundcharakter i~ndert und ihre malignen Eigenschaften aufgibt oder gar zum Absterben gezwungen wird. Davon abgesehen, stellt der Defekt im Atmungsk~talysatorensystem wahrscheinlich nur

318 H.W. Schmidt: Wachstum des Ascitesearcinoms der Maus.

ein Teflsymptom einer m~lignen Zelle und nieht ihr obligates Charakteri- s t ikum dar. Die primare StSrung, hier das mangelhafte Cytrochrom- bfldungsverm6gen, kann jedoch auch sehon im , , k r e b s b e l " e i t e n " Organis- mus - - darunter verstehe ieh einen KSrp~r, bei dem der Ausbruch einer Krebskrankheit unmittelbar bevorsteht - - vorliegen. Wenn wir daher mit Porphyrinen eingreifen wollen, so mtiBte, vorausgesetzt, dal~ der Organlsmus fiberhaupt ohne weiteres die F~higkeit besa]~e, aus Por- phyrinen als Bausteine das Cytochrom aufzubauen, die Zufuhr yon Porphyrin vor Ausbrueh des Geschwuls~wachstums einsetzen. Diese Magnahme ist beim Menschen, solange wir keine MSglichkeit haben, drohendes Krebswachstum zu erkennen, schlechterdings u n m 6 g l i c h . Auf den Tierversuch iibertragen, kSnnte man jedoch vorschlagen, zu priifen, ob nicht das Ents tehen von Reizgeschwfilsten, wie z. B. Benz- pyrentumoren oder aueh yon Spontantumoren bei belasteten Stammen, durch Porphyrine gehemmt oder verhindert wird.

Z u s a m m e n ] a s s u n g .

Es wird gepriift, ob Porphyrine einen therapeutischen Effekt auf das Wachstum des Ms austiben. Weder Pro toporphy- rin noch Hgmatoporphyr in lassen bei verschiedener Anwendungsart und weehselnder Dosierung einen solchen erkennen. Auch die zus~tz- liche, kurzfristige Bestrahlung mit Ultraviolettlicht stSrt das Tumor- gesehehen nieht. Es wird zu der M6glichkeit der PorphyrinanwendunK in der Krebstherapie iiberhaupt Stellung genommen.

Ffir die Unterstii tzung der Arbeit dutch die Deutsche Forschungs- gemeinschaft spreehe ich meinen besten Dank aus.

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