�Analytik�

Viren mit Leitfähigkeit detektieren

Bettina Rudolph, Anja Triebe, Toni Kaulfuß, Barbara Seise, Robert Kretschmer, Matthias Urban,

Karina Weber, Robert Möller

Die Jenaer Biochip-Initiative hat ein chipbasiertes Verfahren entwickelt, das anders als etablierte Bio-

chips den Gleichstromwiderstand als Messgröße nutzt. Damit lassen sich Krankheitserreger wie das

Maul-und-Klauenseuche-Virus schnell und spezifisch identifizieren.

� Das Maul-und-Klauenseuche-Vi-rus (MKSV) zählt aufgrund seiner ex-trem hohen Infektiosität zu den ge-fährlichsten Erregern von Tierseu-chen weltweit; seine ökonomischen Auswirkungen sind verheerend. Die Seuche befällt Paarhufer; neben Rin-dern, Schweinen, Schafen und Ziegen zählen wildlebende Spezies wie Rot-wild zu den Wirten des Virus. Bei er-wachsenen Tieren verursacht es Fie-ber, Lahmheit und Bläschen (Aph-ten) im Epithelgewebe des Mundes, der Klauen und der Euter;2) Jungtiere sterben oft am Herzinfarkt.1,2)

Die letzten Fälle der Maul- und Klauenseuche in Westeuropa waren die Epidemien in den Jahren 2001 und 2007 in Großbritannien sowie vereinzelte Fälle in den Niederlanden und Frankreich. Mittlerweile sind die westeuropäischen Länder offiziell MKS-frei. Weltweit gelten 60 bis 70

Länder als betroffen, vor allem in Afrika, Asien und Südamerika.3)

Eine MKS-Infektion können bisher nur speziell dafür vorgesehene Labore diagnostizieren. Der Nachweis erfolgt anhand einer Kultur auf Basis von Im-munreaktionen (Antigen-Elisa, Anti-körper-Elisa, Neutralisationstest) oder anhand von Teilen des MKSV-Genoms (real-time-PCR). Bisher sind der Transportweg ins Referenzlabor, die Aufarbeitung der Proben sowie die Di-agnose sehr arbeits- und zeitaufwen-dig. Ein Nachweis über Antikörper-Elisa dauert 24 bis 30 Stunden, ein kultureller Nachweis ein bis drei Ta-ge.4) Um Transportzeiten zu vermei-den, eine schnelle Diagnostik zu ge-währleisten und somit der Ausbrei-tung der Seuche entgegenzuwirken, sind mobile Nachweissysteme mit ei-ner schnellen und spezifischen Analy-tik erforderlich.

Die Universität Jena hat mit dem Institut für Photonische Technolo-gien (IPHT) innerhalb der Arbeits-gruppe Jenaer Biochip-Initiative (JBCI) ein chipbasiertes Verfahren entwickelt, das Krankheitserreger schnell und spezifisch identifiziert. Anders als bei etablierten Chipana-lysen erfolgt die Auswertung über eine Gleichstrom-Widerstandsmes-sung. Dieses Detektionsverfahren er-möglicht kleine, transportable und

kostengünstige Analysesysteme, die Proben direkt vor Ort untersuchen können. So ein System eignet sich auch für den Nachweis des MKSV.

Elektrisch auslesbare Biochips

� Der elektrisch auslesbare Biochip basiert auf einer planaren, mit Mi-kroelektroden strukturierten Ober-fläche. Als Messpunkte dienen Elek-trodenspalte, die durch die Anord-nung von Elektroden und Gegen-elektroden entstehen. In den Elek-trodenspalten sind Fängermoleküle immobilisiert, die mit Zielmolekü-len spezifisch wechselwirken. Durch die Interaktion zwischen den Bio-molekülen scheiden sich im Elektro-denspalt Silberpartikel ab, die den Spalt überbrücken und die Leitfähig-keit erhöhen. Über eine Gleich-strommessung werden dann die Wi-derstandswerte ausgelesen.5)

Neben standardphotolithographi-schen Methoden dient ein kosten-günstigeres Siebdruckverfahren dazu, Goldmikroelektroden auf die Glas-oberflächen aufzubringen (Kooperati-on mit Heraeus Sensor Technology).

Für eine stabile Anbindung der Fänger-Biomoleküle müssen die Oberflächen der elektrisch ausles-baren Chips mit reaktiven Gruppen funktionalisiert werden. Um Epoxy-

� QUERGELESEN

�� Ein elektrisch auslesbarer Biochip kombiniert die

enzyminduzierte Abscheidung von Silberpartikeln

mit DNA-chipbasierter Detektion.

�� Der Biochip und die Arbeitsschritte zum Nachweis

lassen sich in eine Durchflusszelle integrieren, so

dass ein teilautomatisiertes Analysensystem ent-

steht, das Krankheitserreger, beispielsweise von

Tierseuchen, vor Ort nachweist.

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Nachrichten aus der Chemie | 59 | Juli I August 2011 | www.gdch.de/nachrichten

oberflächen herzustellen, hat sich 3-Glycidyloxypropyltrimethoxysi-lan etabliert. An diese Epoxyoberflä-chen binden aminomodifizierte Bio-moleküle über eine Amidbindung kovalent auf der Chipoberfläche.

Für den DNA-Nachweis werden endständig aminomodifizierte einzel-strängige Oligonukleotide in den Elektrodenspalten immobilisiert (Abbildung 1a). Die zur Fängerse-quenz komplementäre Ziel-DNA bin-det nun über DNA-DNA-Wechsel-wirkungen (Hybridisierung) an die Chipoberfläche (Abbildung 1b). Für die Detektion ist eine Markierung der Ziel-DNA mit Biotin notwendig. Die nachzuweisende DNA-Sequenz eines Erregers kann mit PCR angereichert und währenddessen durch den Ein-bau biotinylierter Primer oder Nu-kleotide markiert werden. Über die Biotinmarkierung bindet im nächs-ten Schritt ein Streptavidin-Peroxida-se-Konjugat an die hybridisierten DNA-Stränge (Abbildung 1c) und in-duziert am DNA-DNA-Komplex die Silberabscheidung (Abbildung 1d).

Teilautomatisiertes System

� Die enzyminduzierte Abschei-dung von Silberpartikeln ist eine schnelle und spezifische Reaktion, die Biomoleküle hochsensitiv nach-weist. Zudem detektieren DNA-Chips schnell und kostengünstig Krankheitserreger. In diagnosti-schen Systemen zum laborunabhän-gigen Vor-Ort-Nachweis kombiniert die JBCI beide Verfahren.

Das Verfahren ist miniaturisiert und teilweise automatisiert, indem der elektrisch auslesbare Biochip und alle Arbeitsschritte für den Nachweis in eine dafür entwickelte Durchfluss-zelle mit thermischem und mikroflui-

dischem Management sowie elektro-nischer Ausleseeinheit integriert wer-den (Abbildung 2). Reagenzien und Waschlösungen werden aus Vorrats-behältern zur Durchflusskammer transportiert, wo ein mäanderförmi-ger Kanal sie über die Messpunkte auf der Chipoberfläche leitet. Eine Schlauchpumpe, deren Förderrate und -richtung steuerbar sind, regelt den Flüssigkeitsstrom. Durch die Be-wegung erhöht sich die Bindungseffi-zienz zwischen nachzuweisender und immobilisierter DNA. Die Tem-perierung des Chips in der Kammer während der Bindungsschritte opti-miert die Wechselwirkungseffizienz zusätzlich. Der Gleichstromwider-stand wird direkt in der Durchfluss-kammer gemessen.6,7)

Das MKS-Virus im Biochip

� Das Maul-und-Klauenseuche-Vi-rus ist ein Einzelstrang-RNA-Virus und gehört zum Genus der Aphtovi-ren der Virenfamilie Picornaviridae. Innerhalb der MKS-Erreger unter-scheidet man sieben Serotypen. Da-

neben existieren zahlreiche Sub-typen und Varianten. Untereinander weisen die Serotypen keine Kreuz-immunität auf. Eine hohe Mutati-onsrate der Virus-RNA während der Replikation führt dazu, dass ständig neue Subspezies des MKSV entste-hen. Es ist zudem nicht möglich, MKS von anderen Erkrankungen mit Bläschenbildung, z. B. der vesi-kulären Schweinekrankheit, kli-nisch zu unterscheiden.8)

Als Zielsequenzen für den chipba-sierten Nachweis von MKSV dienen ein 128 Basenpaare (bp) langes Frag-ment aus der hochkonservierten Re-gion der internen ribosomalen Ein-trittsstelle (IRES) und ein 88 bp lan-ges Fragment aus der konservierten Region der RNA-Polymerase (3D).1,9) So lässt sich eine Probe zeitgleich auf alle sieben Serotypen untersuchen. Nach Extraktion der Gesamt-RNA werden die Zielsequenzen in einer Reversen-Transkriptase-PCR amplifi-ziert und biotinyliert. Die Hybridisie-rung der MKS-3D- und MKS-IRES-Fänger- und -Ziel-DNA sowie die en-zyminduzierte Silberabscheidung

Abb. 2. Technischer Aufbau des Chip-Systems mit integriertem thermischen, mikroflui-

dischen und elektrischen Modul.

Abb. 1. Elektrischer DNA-Nachweis: a) zwischen den Elektroden immobilisierte Oligonucleotide, b) biotinmarkierte Ziel-DNA bindet an die

Oligonucleotide an der Chipoberfläche, c) Bildung des Streptavidin-Peroxidase-Konjugats, d) Silberabscheidung.

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Analytik �Blickpunkt� 749

und elektrische Auslese erfolgen dann auf dem elektrischen Biochip direkt in der Durchflusskammer.

Abbildung 3 zeigt einen positiven MKSV-Nachweis. Die Signale im blau und grün markierten Bereich zeigen, dass das Virus vorhanden ist.

Analysenzeiten verkürzen

� Durch die Integration der Nukle-insäuredetektion in ein chipbasiertes miniaturisiertes und teilautomatisier-tes System dauert es nur wenige Mi-

nuten, in denen DNA hybridisiert wird, sich enzyminduziert Silber ab-scheidet und der elektrische Wider-stand ausgelesen wird.7) Für eine schnelle und spezifische Analytik ist es auch erforderlich, die Prozess-schritte Probenaufarbeitung und Am-plifikation von Nukleinsäuren (Pro-benvorbereitung) zu automatisieren. Derzeit entwickelt die JBCI dazu so-wie zur elektrischen Detektion von Nukleinsäuren ein modulares Sys-tem. Dies soll vor Ort schnelle Diag-nosen z. B. im Fall einer Tierseuche liefern, ohne dass Transport und Ana-lyse in hochspezialisierten Laboren erforderlich sind.

Bettina Rudolph und Barbara Seise sind wis-

senschaftliche Mitarbeiterinnen und Matthias

Urban ist Ingenieur am Institut für Photonische

Technologien IPHT in Jena. Robert Möller war

ebenfalls am IPHT und leitete bis zu seinem

Wechsel in die Industrie die Jenaer Biochip-Ini-

tiative. Seine Nachfolgerin, Karina Weber, hat

Biotechnologie und Chemieingenieurwesen

studiert und in analytischer Chemie pro-

moviert. Wie Robert Kretschmer, Ingenieur, ist

sie wissenschaftliche Mitarbeiterin am Institut

für Physikalische Chemie und Abbe-Center of

Photonics der Universität Jena. Anja Triebe und

Toni Kaulfuß waren ebenfalls dort wissen-

schaftlich tätig. karina.weber@ipht-jena.de

� Synchrotronstrahlung für die Chemie

Melissa A. Denecke: Die Vortrags-

reihe bietet eine Plattform, um ak-

tuelle Forschungsergebnisse vor-

zustellen und wichtige Entwick-

lungen bei der Anwendung von

Synchrotronstrahlung in der Che-

mie zu identifizieren und zu dis-

kutieren. Sie zielt auf die Zusam-

menführung erfahrener Wissen-

schaftler und Newcomer, die ihre

anspruchsvollen Aufgaben in der

chemischen Forschung und Indus-

trie mit Synchrotronstrahlungs-

methoden lösen können. Die Be-

sucher erleben Vorträge und Pos-

ter, die jüngste Ergebnisse in der

Chemie mit synchrotronbasierten

Methoden zeigen – wie verschie-

dene Beugungs- und Streuungs-

methoden sowie spektroskopi-

sche, tomographische und abbil-

dende Verfahren.

Melissa A.

Denecke orga -

nisiert auf dem

GDCh-Wissen-

schaftsforum in

Bremen die Vor-

tragsreihe „Che-

mistry and Synchrotron Radiation:

Recent Re search Highlights, Future

Perspectives and New Opportuni-

ties“. Die Session findet im Rahmen

der Jahrestagung der Fachgruppe

Nuklearchemie statt, wird vom Ar-

beitskreis Analytik mit Radionukli-

den und Hochleistungsstrahlen-

quellen (ARH) organisiert und vom

deutschen Komitee Forschung mit

Synchrotronstrahlung unterstützt.

Nachrichten aus der Chemie: Frau

Denecke, was erwartet den Besu-

cher in der Session?

Abb. 3. Elektrisch auslesbarer MKS-Chip

(rot: Positivkontrolle; blau und grün:(3D)-

und (IRES)-Sequenzen des MKS-Virus,

schwarz: Negativkontrolle).

Nachrichten: „Chemie schafft Zu-

kunft“, so das Motto der Tagung.

Welchen Beitrag leistet Ihr Fach-

gebiet dazu“?

Denecke: Moderne synchrotron -

basierte Techniken werden zuneh-

mend erfolgreich eingesetzt, um

anspruchsvolle Fragen in der che-

mischen Forschung und in der an-

gewandten Chemie zu beantwor-

ten. Diese Methoden erstrecken

sich auf eine breite Palette von

chemischen Disziplinen, ein-

schließlich der analytischen Che-

mie, Nuklearchemie, Biochemie,

Geochemie, Katalyse, Polymerche-

mie, Festkörperchemie, Chemie in

energierelevanten Themen und

Koordinationschemie.

Literatur

1) M. J. Grubman, B. Baxt, Clinical Microbio-

logy Reviews 2004, 17, 465–493.

2) M. Moniwa et al., Journal of Veterinary

Diagnostic Investigation 2007, 19, 9–20.

3) Bundesamt fur Veterinarwesen, 2009

http://www.bvet.admin.ch/gesund

heit_tiere/01065/01066/01068/

index.html?lang=de.

4) FLI, 2010, Amtliche Methodensammlung,

Friedrich-Löffler-Institut, Bundesfor-

schungsinstitut für Tiergesundheit.

5) T. Schüler et al., Biosensors and Bioelect-

ronics 2009, 25, 15–21.

6) T. Schüler et al., Biosensors and Bioelect-

ronics 2009, 24, 2077–2084.

7) B. Seise et al., Engineering in Life Sci-

ences 2011, 11, 148–156.

8) Deutsche Veterinarmedizinische Gesell-

schaft e.V., 2010, http://www.dvg.net/in

dex.php?id=324.

9) J. K. Oem et al., Clin. Vaccine Immunol.

2009, 16, 1660–1664.

Wir danken dem Friedrich-Löffler-Institut,

Riems, für die gute Zusammenarbeit und

die Bereitstellung von Proben und Pro-

tokollen.

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