Vorlesung zum Praktikum Vorlesung zum Praktikum Klinische ChemieKlinische Chemie(1. Kurstag; (1. Kurstag; AnalytikAnalytik//PostanalytikPostanalytik))

Quantitative Quantitative AnalysenAnalysen

AnalysentechnikenAnalysentechniken//--systemesysteme

StStöörfaktorenrfaktoren

PostanalytikPostanalytik

G. Schumann, Institut für Klinische Chemie, MHHwww.mh-hannover.de/schumann.html

LernzieleDefinition der labormedizinischen Messgröße (System – Analyt – Messgrößenart)

Beurteilung von Analysenergebnissen: longitudinal, transversal

Unterschiedliche Konzentrationen (Größenordnungen) von Blutbestandteilen

Störfaktoren

Sensitivität und Spezifität(Analytische Sensitivität, diagnostische Sensitivität)(Analytische Spezifität, diagnostische Spezifität)

Analysensysteme für Spektrofotometrie, Chromatografie, Immunotests

Postanalytik - Plausibilität (biologische und pathophysiologische Validierung)

Postanalytik - Befundbericht (wesentliche Bestandteile)

Postanalytik - Archivierung des Untersuchungsmaterials

Eppendorf-Fotometer (ca. 1980) ( im Notfall-Laboratorium der MHH)

• Messzeit ≤

10 min• Kleines Probenvolumen• Sehr gute Präzision• Sehr gute Wiederholbarkeit

Große Fortschritte bei derweltweiten Vergleichbarkeitder Messergebnisse.

1980

2008Autoanalyzer

Quantitative Analysen von Messgrößen[ System --- Analyt --- Messgrößenart ]

B - (Voll-) Blut oder Hämolysat ggf. arteriell (AB) oder venös (VB) deklarieren

C - KapillarblutS - Serum

Überstand aus geronnenem Blut; Zellen und Fibrin sind abgetrennt

P - Plasma gerinnungshemmender Zusatz bei Blutentnahme

EDTA-Plasma Citrat-PlasmaOxalat-PlasmaHeparinat-Plasma

ERC - Erythrozyten z.B. - Folsäure

- Zinkprotoporphyrin

SW - SerumwasserBW - Blutwasser

U - UrinL - LiquorF - Stuhl (z.B. F-Hb)SU - Schweiss (sudor)M - Mageninhalt

Y - Nicht spezifiziert Beschaffenheit des Untersu- chungsmaterials ist unklar spezi- fiziert (z.B. Punktatflüssigkeit)(Häufig keine Referenzintervalle)

Quantitative Analysen von Messgrößen[ System --- Analyt --- Messgrößenart ]

(Parameter, Eigenschaft)Exakte Bennung (ohne Abkürzung)wie z.B.:

Gesamteiweiß

Ionisiertes Calcium

Anorganisches Phosphat

Digoxin

DigitoxinProcalcitonin

(Parameter, Eigenschaft)„Akzeptierte” Abkürzungen:wie z.B.:

PSA Prostataspezifisches Antigen

Lp(a) Lipoprotein (a)

AST Aspartat Aminotransferase

TSH Thyeroidea Stimulierendes Hormon

hCG humanes Choriongonadotropin

Vorsicht bei der Verwendung von Abkürzungen (Akronymen) ! (http://de.wikipedia.org/wiki/PSA)

- Pacific Southwest Airlines, US-amerikanische Fluggesellschaft - Persistent Staging Area, ein Teil des Business Information Warehouse - Personal Sales Assistant - Personal-Service-Agentur - Personen-Such-Anlage Funkrufanlagen zum übermitteln von Textnachrichten - Persönliche SchutzAusrüstung - Persönlichkeits-Struktur-Analyse, ein Persönlichkeitsmodell aus der Arbeitspsychologie - PhthalSäureAnhydrid, chemische Verbindung - PostSparkassenAmt - Pressure Sensitive Adhesive (z. B. Beschichtung von Klebebändern) - Probabilistische SicherheitsAnalyse (engl. "probabilistic safety analysis", eine Methode zur

Sicherheitsanalyse komplexer technischer Systeme, z. B. von Kernkraftwerken - Problem Statement Analyzer, klassischer Ansatz des Requirements Engineering - Production Sharing Agreements - Profil-Simulations-Analyse - Prostataspezifisches Antigen, ein Glykoprotein, das v.a. von der Prostata sezerniert wird - PSA International, eine Management-Trainingsagentur - PSA Peugeot Citroën, Société Anonyme des Automobiles Peugeot (kurz Peugeot S.A.), ein

französischer Automobilkonzern - PSychoAnalytische Spezialabteilung in Larry Brent Romanen

Quantitative Analysen von Messgrößen[ System --- Analyt --- Messgrößenart ]

Stoffmengenkonzentration mol/l (mmol/l, µmol/l, nmol/l)Massenkonzentration g/l oder g/dl (g/100 ml)

(mg/l, µg/l, ng/l)

Internationale Einheiten Uarbiträre Einheiten (Units) bei Makromolekülen (Proteinen)Katalytische Enzymkonzentration - Substratumsatz pro Minute U/l : 60 =- Substratumsatz pro Sekunde kat/l (µkat/l)

nicht mg% !!!

„Die Glucose ist 25“??

Quantitative Analysen[ System --- Analyt --- Meßgrößenart ]

„Die Glucose ist 25“

Die Glucosekonzentration im Kapillarblut ist25 mmol/l

(Referenzintervall: 3,9 - 5,5 mmol/l)

Hyperglykämie!

Die Glucosekonzentration im Kapillarblut ist25 mg/100 ml

(Referenzintervall: 70 - 99 mg/100 ml)

Hypoglykämie!

Komponenten und ihre Konzentrationen im menschlichen BlutAus Klinische Chemie und Labordiagnostik für die PraxisHerbert Keller, Georg Thieme Verlag

100 mmol

0,00 000 001 mmol= 10 picomol

Komponenten und ihre Konzentrationen im menschlichen Blut (I)

Stoffmenge (mol/l) Ionen, Metabolite Therap. Pharm.-Konz.

10-1 100 mmol/l Natrium, Chlorid

10-2 10 mmol/l Gesamt-CO2, Harnstoff

10-3 1 mmol/l Glucose, Cholesterin, Triglyceride, Ca2+, Mg2+, anorg. Phosphat

Salicylat,Lithium

10-4 100 µmol/l Harnsäure, Kreatinin, Pyruvat, Phenylalanin

Valproat, Phenobarbital,Theophyllin

10-5 10 µmol/l Fe, Cu, NH3/NH4+, Zn, Bilirubin, Creatin

Phenytoin, Primidon, Aminoglykosidantibiotika

10-8 10 nmol/l H+ (pH) Methotrexat

10-9 1 nmol/l Digoxin

Komponenten und ihre Konzentrationen im menschlichen Blut (II)

Stoffmenge mol/l Proteine Vitamine Hormone, Peptide 10-5 10 µmol/l Transferrin, Met-Hb,

IgG Ascorbat

10-6 1 µmol/l Caeruloplasmin, IgA Vit. A, Carotinoide

Dehydroepiandro-steron (DHEAS)

10-7 100 nmol/l IgM Gesamt-T4, Cortisol

10-8 10 nmol/l Folat Tyrosin-bindendes Globulin (TBG)

10-9 1 nmol/l IgE

Noradrenalin, HCG, Prolactin

10-10 100 pmol/l Vit. B12 Insulin, Parathormon

10-11 10 pmol/l CEA, AFP Freies T3 u. T4 TSH, Angiotensin

10-23 1 Molekül/l DNA, RNA

Geräte und Verfahren für klinische chemische Analysen

Spektrofotometrie (Endpunkt oder kinetisch)

Immunchemische Verfahren

Chromatografische Verfahren

Modulares Analysensystem

Schematischer Aufbau von Spektrophotometern Polychromator (Diodenarray-System)

Schematischer Aufbau von Spektrophotometern Monochromator (konventionelles System)

Spektrofotometrische Verfahren an vollmechanisierten

Analysengeräten sind so konfiguriert, dass ein

Trennschritt nicht erforderlich ist.

Aus 0,2 - 0,3 ml Serum können bis zu 40 Messgrößen bestimmt werden.

Pro Messgröße wird eine Küvettenposition beansprucht.

10 Minuten nach der ersten Pipettierung ist die erste Messung beendet.

(Die nächsten Ergebnisse folgen im 8-Sekunden-Takt)

Indikatorreaktion in diesem Zusammenhang häufig Bildung bzw. Verbrauch von NAD(P)H.Im Gegensatz zu NAD(P)+ hat NADH ein Absorptionsmaximum bei 340 nm

Photometrie: Prinzipien

Beispiel: Bestimmung von Glucose mittels Hexokinase-Reaktion:

Glucose + ATP Glucose-6-Phosphat + ADP

Indikatorreaktion:

Glucose-6-Phosphat + NADP+ 6-Phosphogluconat + NADPH + H+

Hexokinase

Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase

Absorption bei 340 nm proportional zu gebildetem NADPH und zur Glucosekonzentration

Beispiel: Bestimmung der Aktivität der Lactatdehydrogenase (LDH)

Lactat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+

Messung der Absorptionszunahme (ΔA) pro Zeiteinheit bei 340 nm (Zunahme der NADH-Konzentration)

Aufnahme einer Absorptions-Zeit-Kurve in einem vorgegebenen Messintervall zur Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit

Messung der Enzymaktivität

LDH

Bedingungen für enzymatische Tests

Optimale SubstratkonzentrationOptimaler pHOptimale CoenzymkonzentrationOptimale Konzentration von Aktivatoren

Definierte Temperatur (37°C)

Damit enzymatische Bestimmungen auch von Labor zu Labor verglichen werden können (Standardisierung), sind u.a. die Einhaltung folgender Rahmenbedingungen unbedingt erforderlich

Veränderung der Temperatur um 1° C verändert das Ergebnis eines enzymatischen Tests um ca. 10 %

Trennmethoden in der Klinischen ChemieBeispiel Prinzip

Ausfällung Ausfällen von Proteinen Erzeugung von unlöslichen durch Trichloressigsäure Niederschlägen

Sedimentation Abtrennung der Blutkörperchen Höhere rel. Dichte der suspendiertenvom Plasma Teilchen

Zentrifugation Abtrennung der Blutkörperchen Beschleunigung dervom Plasma Sedimentationsgeschwindigkeit (2000g)

UltrazentrifugationTrennung von Zellkomponenten hohe Beschleunigung der Sed.geschw.(z.B. 100.000-500.000 g)

Filtration Klären von trübem Urin Abtrennung von festen Partikelndurch Filter

Ultrafiltration Proteinanreicherung im Urin, Liquor Abtrennung gelöster makromolekul.Stoffe von niedermolekularen

Elektrophorese (Gruppen-)Trennung von Proteinen Unterschiedliche Wanderungs-geschwindigkeit im elektr. Feld

Chromatographie Auftrennung von Proteinen, Auftrennung von Stoffgemischen durch Pharmaka, Drogen.... unterschiedliche Verteilung in mobiler

und stationärer Phase

Extraktion Abtrennung hydrophober von Löslichkeit in organ. Lösungsmittelnhydrophilen Substanzen

Chromatographie

Man unterscheidet zwischen:Dünnschichtchromatographie, PapierchromatographieSäulenchromatographie

Trennprinzipien:• Adsorptionschromatographie• Ionenaustauschchromatographie• Gelchromatographie• Affinitätschromatographie

Unterschiedliche Verteilung von Stoffen in zwei verschiedenen Phasen, genauer gesagt an den Phasengrenzflächen der

a) stationären (unbeweglichen) Phase, b) mobilen (beweglichen) Phase

(Voraussetzung: Beide Phasen sind nicht mischbar)

ChromatographieEine Automatisierung chromatographischer Methoden führt generellauch zu einer Ankopplung an ein analytisches Nachweisverfahren hierbei in Form eines entsprechenden Detektorssolche chromatographischen Systeme können folgendermaßen benannt sein:HPLC High Performance Liquid ChromatographyLC Liquid ChromatographyGC Gas ChromatographyBei der Vielzahl möglicher Detektionstechniken spielt vor allem die Massenspektroskopie (MS) ein besondere Rolle.

Kombination: GC-MS, LC-MS, LC-MS/MS Durch Elektronenstoß entstehen bei der MS positiv geladene Fragmente einer Substanz, die in charakteristische Größe und Anzahl auftreten (molekularer Fingerabdruck)

Kombination: Gaschromatograf / Massenspektrometer

Glaskapillarsäule (25 m)

Wanderung in Lösung befindlicher Teilchen beim Anlegen einer Gleichspannung

Geschwindigkeit der Moleküle ist proportional der Feldstärke und der Molekülladung und umgekehrt proportional der Molekülgröße

Serumelektrophoreseauf Celluloseacetatfolie als Trägermaterial

Elektrophorese: Serumelektrophorese

Elektrophoresetechniken = Trennung von Stoffgruppen

Immunchemische Verfahren Nephelometrie/ Turbidimetrie

Bei diesen immunchemischen Verfahren wird durch Antikörper-Antigen-Aggregate das Licht gestreut. Anwendung beim Nachweis vieler Serumproteine (Albumin, Immunglobuline, Akute-Phase-Proteine, Speicher- und Transportproteine) und Urinproteine (Albumin, α1 -Mikroglobulin).

Immuno-Nephelometrie: Messung eines Anteils des gestreuten Lichtes (A)

Immuno-Turbidimetrie: Messung der Abschwächung der Lichtintensität (B)

(A) (B)

Immunchemische Verfahren Heidelberger-Kurve als Grundlage bei Trübungs- und Streulichtmessungen

Antigen(AG-)überschuss:Aggregate werden wieder kleiner und somit besser löslich. Zahl der AK reicht nicht aus, alle AG zu verküpfen.

Antikörper(AK-)überschuss:Jede Steigerung der AG-Menge führt zu weiter Vernetzung, die im Äquivalenzbereich am stärksten ist.

Immunchemische Verfahren Sandwich-Assay (2 Antikörper)

Einsatz eines „Capture“-Antikörpers und eines markierten ZweitantikörpersArt der Markierung legt Detektionsprinzip fest (ELISA, RIA, LIA, ECLIA...)

Ein Indikator (Tracer, Label, Konjugat) konkurriert mit der Probe um BindungsstellenArt der Markierung gibt Detektionsprinzip vor

Immunchemische Verfahren kompetitiver ELISA

Analytische Verfahren in der Klinischen Chemie

Beispiel Prinzip

Potentiometrie pH-Messung Potentialmessung

Coulometrie Coulometrische Chlorid-Bestimmung Messung der Strommenge

Kryoskopie Osmolalität von Serum/Urin Gefrierpunktserniedrigung

Optische Messmethoden

Photometrie Protein-Bestimmung mit Messung der Absorbance(Spektrometrie) Biuretreagenz

Flammenphotom. Natrium im Serum/Urin Messung der Lichtemission

Atomabsorptions- Kupfer im Urin Messung der atomarenspektrometrie Absorption

Densitometrie Elektrophoreseauswertung Messung der Lichtdurchlässigkeit

Turbidimetrie Immunglobulin-Bestimmung Trübungsmessung

Nephelometrie Streulichtmessung

Fluorimetrie DNA/RNA-Bestimmung Fluoreszenzmessung

Proteinbindung Tumormarker-Bestimmung Enzymimmunoassay

Ziele:Kontrolle der zufälligen Messabweichung (FehlerFehler).Kontrolle der systematischen Messabweichung über den gesamten klinisch-relevanten Messbereich.Kontrolle jeder Analysenserie (umfasst längstens acht Stunden).Anwendbarkeit in allen Laboratorien.

Vorschriften zur Durchführung der Qualitätskontrolle in med. Laboratorien und Anforderungen bzgl. Güte der Messungen für 87 Messgrößen festgelegt in Richtlinien der Bundesärztekammer (RILIBÄK): Maximal zulässige Unpräzision (Anlage 1, Spalte 5), Maximal zulässige Unrichtigkeit (Anlage 1, Spalte 6), Maximal zulässige Abweichung des Einzelwertes (Anlage 1, Spalte 7)

Qualitätskontrolle im Überblick

285 300 [mg/100 ml]Cholesterin

Bei der Folgeuntersuchung 4 Wochen später wird eine Cholesterinkonzentration von 285 mg/100 ml befundet

Die Frage an den Arzt für Laboratoriumsmedizin:

Ist die Abnahme der Cholesterinkonzentration um 5 % (mit großer Wahrscheinlichkeit) als therapeutischer Effekt zu betrachten?

5 %

• Patient bekommt Cholesterin-reduzierte Diät und Statine.• Die initiale Cholesterinkonzentration ist 300 mg/100 ml

285 300 [mg/100 ml]Cholesterin

2σ2σ

Zwei Messergebnisse sind hier signifikant (95 %) unterschiedlich, wenn die

5 % = 4 σ

Relative Unpräzision (Tag / Tag): CV = 1,25 %

Beurteilung klinisch-chemischer Analysenergebnisse

Longitudinalbeurteilung (Kumulativer Laborbericht/-Befund)

Betrachtung einer zeitlichen Folge (Zeitreihe) von Ergebnissen desselben Individuums.

(Stabiles analytisches System)

Transversalbeurteilung (an Hand eines Referenzintervalls o. ä.)

Vergleich eines Analysenergebnisses mit Beurteilungskriterien, die durch die Untersuchung einer geeigneten Referenz- Stichprobe gewonnen wurden.

(Messung in der Patientenprobe muss rückführbar sein)

Hämolyse: Einflussgröße und Störfaktor ?

Einflussgröße in vivo Veränderung (Beeinflussung) des zu bestimmenden Analyten

Störfaktor in vitro Veränderung (Beeinflussung) des zubestimmenden Analyten bzw. der Analytik

Veränderliche (z.B. P-Glucosekonzentration postprandial)

Unveränderliche (z.B. Geschlecht)

Einflussgrößen

Veränderliche:

• Ernährung• Fasten• Körpergewicht, Muskelmasse• Körperliche Aktivität• Körperlage• Venenstauung• Schwangerschaft• Tagesrhythmus• Klima• Höhenlage• Pharmaka• Alkohol

Unveränderliche:

• Geschlecht• Rasse• Erbfaktoren• Alter

Alle Makromoleküle:↑

(Gesamtprotein, Enzyme)

Elektrolyte, Chol., TG: ↑

(Flüssigkeitsverschiebung)

Laktat: ↑

(Anaerobe Glykolyse unter Belastung)

Freies Hämoglobin im Plasma

Das medizinische Laboratorium erhDas medizinische Laboratorium erhäält eine Blutprobe und lt eine Blutprobe und

den Untersuchungsauftrag zur Bestimmung verschiedener den Untersuchungsauftrag zur Bestimmung verschiedener

Serumbestandteilen (z.B. SSerumbestandteilen (z.B. S--Kalium, SKalium, S--LDH, SLDH, S--CK).CK).

•• Die Blutprobe wird Die Blutprobe wird zentrifugiertzentrifugiert..

•• Das Serum ist durch freies HbDas Serum ist durch freies Hb sichtbar rotsichtbar rot gefgefäärbt.rbt. ((deutlich mehr als 200 mg/l freies Hbdeutlich mehr als 200 mg/l freies Hb!)!)

Handelt es sich hier um einen Handelt es sich hier um einen Störfaktor oder umoder um

eineeine Einflussgröße??

Freies Hämoglobin im Plasma im Plasma (3)(3)

Von sichtbar hämolytischen Proben, die im Labor bear- beitet werden, ist in weniger als 5% der Fälle die Ursache eine in vivo-Hämolyse.

95% Fehler: Falsche Blutentnahme, langer Transport, Erschütterungen beim Transport, Fehler bei der Gewinnung des Serums bzw. Plasmas im Labor ( Blut gefroren, etc.)

Einflussgröße für die Hb-Konz. bei in vivo-(intravasaler)-Hämolyse Beispiel (Sport): Ein Marathon (Marsch-Hämoglobinurie)

Hämolyse als Einflussgröße:S-Creatinkinase (CK), S-Eisen, S-Gesamtprotein, S-Kalium, S-LDHS-Eiweiß-Elektrophorese,

Hämolyse in der präanalytischen Phase = Störfaktor

Hämolyse als Störfaktor:Bei diversen fotometrischen Verfahren

Andere Störfaktoren als Hämoglobin

Lipide (Trübung bei fotometrischen Analysen)Bilirubin (Störung von Indikatorreaktionen)Paraproteine (Trübung bei fotometrischen Analysen)(monoclonale Komponenten, M-Gradient)Kreuzreagierende Komponenten bei immun-chemischen Verfahren (z.B. Arzneimittel-Metabolite)Humane anti-Maus-Antikörper (Störung von IA)Antikoagulanzien (Serum-Elektrophorese, S-K, S-Fe)Infusionslösungen (Verdünntes Serum)Bakterien, HefenPharmaka (z.B. Benzoylpenicilline bei Proteinbestimmung)

Analytische Spezifität

Die Eigenschaft eines analytischen Verfahrens, nur die Messgröße (die Komponente, den Analyten) zu messen, der zu erfassen beabsichtigt ist (aber nichts anderes!).

Analytische Sensitivität (Empfindlichkeit)

(a) Die Eigenschaft eines analytischen Verfahrens, die kleinste Konzentrationsdifferenz innerhalb des Messbereiches sicher unterscheiden zu können.

(b) Bei Vorhandensein der Messgröße ein Messsignal zu erhalten, dass sicher von Null unterschieden werden kann.

Postanalytik:Gründe für eine Wiederholungsanalysen

Bei unplausibler Konstellation der Transversalbeurteilung(z.B. S-Harnsäure und S-Harnstoff ⇑, aber S-Kreatinin ⇒)

Bei unplausibler Konstellation der Longitudinalbeurteilung(z.B. Abnahme der Enzymaktivität schneller als mit Halbwertszeit erklärbar)

Wenn der Einsender eine Bestätigungsanalyse verlangt.

Bei Verdacht, dass technische Probleme nicht vor Freigabe der Ergebnisse erkannt worden sind.

Datum 02.01.2008 03.01.2008 05.01.2008 06.01.2008 07.01.2008

S-CK U/l 141 155 145 174 191S-CK MB U/l 9 11 10 13 25

Quotient % 6 7 7 7 13

Serum Hämolytisch

Beurteilung von CK und Isoenzym CK-MB bei Verdacht auf einen Myokardinfarkt

Postanalytik: Prüfung der Plausibilität

Die Hämolyse stört das Verfahren zur Bestimmung der CK-MB doppelt so intensiv wie das Verfahren zur Bestimmung der (Gesamt)-CK.

Befundbericht für laboratoriumsmedizinische Untersuchungen

Wesentliche Bestandteile des Berichts:

Zuständiges Laboratorium

Befundempfänger

Datum/Uhrzeit des Befunddruckes

Befundblatt (z.B. Blut)

Entnahmedatum/-uhrzeit

Eindeutige Bezeichn. d. Messgrößen

Referenzintervall, Entscheidungsgrenze

Abgeleitete Messgrößen (z.B. GFR)

Warnhinweise

Kommentare

Befundbericht für laboratoriumsmedizinische Untersuchungen

Referenzintervall oderEntscheidungsgrenze ?

Asservierung von Untersuchungsmaterial

Aufbewahrung von Serum, Urin Liquor im Kühlschrank, 5-7 Tage (für Wiederholungsanalysen, Nachforderungen)

Aufbewahrung von Serum, Urin, Liquor, tiefgefroren über lange Zeiträume (für Vergleichsanalysen bei Methodenwechsel, bei toxikologischen Untersuchungen)

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit

G. Schumann