Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt 1

Vortrag zur Fortbildungsveranstaltung

der Länder 12. und 13. Mai 2014

Joachim Borgwardt

Klassische Serologie in der modernen Labordiagnostik

� Die Serumschnellagglutination (SSA) am Beispiel der serologischen Diagnostik der aviären Mykoplasmose

Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt 2

LAV, FB 4: Serologische Untersuchungen von Blutproben von Hühnern und Puten

mittels Serumschnellagglutination (SSA), Zeitraum Jan. � Dez. 2013

Untersuchungs-

auftrag

Standard-

Methode

Zul.-Nr.

(Standard-

Methode)

Alternativ-

Methode

Probenzahl

Mycoplasma

gallisepticum

SSA* FLI-B 512 Ab-ELISA 26.382

Mycoplasma

synoviae

SSA* FLI-B 513 Ab-ELISA 370

Mycoplasma

meleagridis

SSA* - Ab-ELISA

?

310

Salmonella

pullorum/gallinarum

SSA* - Ab-ELISA 1.560

SSA = Methode mit hoher Sensitivität aber geringer Spezifität

Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt 4

- Sensitivität und Spezifität- Objektivität und Robustheit- Validität und Reliabilität- Positive und negative Prädiktion- Prävalenz und Inzidens- Affinität und Avidität- Korrelationskoeffizient

Begriffe der klassischen mikrobiologischen Testheorie (KTT)als Grundlage von Testbewertungen

Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt 5

Krankheit /Goldstandard

ja nein

Test-ergebnis

positiv a b a+b

negativ c d c+d

a+c b+d

Sensitivität = a/(a+c) Spezifität = d/(d+b)

Möglichkeit vonTestvergleichen

Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt 6

Einsatzmöglichkeiten sensitiver und spezifischer Tests in der Serologie

Anwendung sensitiver Tests, falls

� kein spezifisch Antikörper-positiver Fall übersehen werden soll� spezifisch Antikörper-positive Fälle ausgeschlossen werden sollen

� Ausschluss-Tests �sicher negatives Ergebnis gesucht, Rule-Out�� Screening-Tests, Überwachungsuntersuchungen� Testsituation mit mehrheitlich geringer spezifischer Seroprävalenz

Anwendung spezifischer Tests, falls

� kein spezifisch Antikörper-negativer Fall übersehen werden soll� positive und verdächtige Fälle bestätigt / überprüft werden sollen

� Such-Tests �sicher positives Ergebnis gesucht, Rule-In�� Bestätigungs-Tests, Verlaufsuntersuchungen, Impfkontrollen� Testsituation mit mehrheitlich hoher spezifischer Seroprävalenz

Testprinzip:

� Korpuskuläre Antigene (komplette oder inkomplette Mycoplasmenzellen) werden durch die Bindung mit agglutinierenden O-Antikörpern vernetzt, es entstehen partikuläre, sichtbare, diagnostisch verwertbare Verklumpungen = Agglutinate.

� Dabei müssen Antigene und Antikörper sowie ihre Testvolumina in einem definierten Mengenverhältnis zueinander stehen.

� Die Agglutination kann wechselseitig als Antigennachweis und auch als Antikörpernachweis diagnostisch genutzt werden.

Quelle: www.biokurs.de/Skripten/12/bs12-53.htm (2014)

Methode: Serumschnellagglutination (SSA), Antikörper gegen aviäre Mycoplasma

Methode: Serumschnellagglutination (SSA), Antikörper gegen aviäre Mycoplasma

Probenqualität:

Die SSA zum Nachweis von Mycoplasma-Antikörper ist ein sensitiver Schnelltest, dies erfordert:

� Nichtstabilisiertes Einzelblut (Blutserum), mind. 24 h alt, gekühlt aber zu keinem Zeitpunkt gefrostet, Blutuntersuchungen immer bei Zimmertemperatur

� Keine deutliche Erythrolyse, gut erkennbare Serumphase, keine mikrobielleKontamination, keine sonstigen Verunreinigungen

so nicht ! so auch nicht !

Methode: Serumschnellagglutination (SSA), Antikörper gegen aviäre Mycoplasma

Testmaterialien:

� Zentrifuge, Schüttler, Kühlschrank, Glasplatte, Glasstäbe, Kolbenhubpipette und Spitzen, Lupe

Testreagentien:

� Untersuchungsmaterial (Blutserum)

� Antigen, gelöst, dichteeingestellt oder nach einem Standardserum geeicht, attenuiert(0,5% Phenol) und gefärbt (Kristallviolett, Bengalrot, Sudanschwarz)

� Kontrollsystem, resuspendierte, validierte und stabilisierte (0,01% Natriumazid) Positiv- und Negativkontrollen

Methode: Serumschnellagglutination (SSA), Antikörper gegen aviäre Mycoplasma

Testansatz:

� Alle Testreagentien auf Zimmertemperatur erwärmen !� 25 µl Blutserum-Tropfen auf einer Glasplatte vorlegen (Probenidentifikation !)� Kontrollsystem (PK und NK), gem. Prüfmethode ansetzen� jeweils 25 µl Antigen-Tropfen hinzufügen� Mischen von Blutserum und Antigen (Glasstab, Pipettenspitze)� Glasplatte mit Serum-Antigen-Gemisch 2 min. schwenken (Inkubationzeit !)

Visuelle Testauswertung:

� Positive Reaktion: Bildung von sichtbaren, einheitlichen Agglutinaten innerhalb der Inkubationszeit

� Negative Reaktion: Der Testansatz bleibt während der Inkubationszeit homogen (unverändert)

� Zweifelhafte Reaktion: Der Testansatz zeigt während der Inkubationszeit grobschollige, unterschiedlich große oder schlierige Verklumpungen

� Konsequenz = Testwiederholung und/oder andere Testmethode

Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt 11

Quelle: http://addl.purdue.edu,(Purdue University, IN, US, 2014)

- +++

Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt 12

http://seromed.net/seromed/id3.htm

Workshop: Rose-Bengal-Test (RBT)

Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt 13

Literaturhinweise zur Serumschnellagglutination

� Mayr, A. et al, Virologische Arbeitsmethoden, Band 2, Gustav Fischer Verlag,

Stuttgart, New York, 1977

� Jawetz E., Melnick J.L. & Adelberg E.A.. (1973). Medizinische Mikrobiologie.

Berlin: Springer Verlag.

� Thomas, L. (1992). Labor und Diagnose. Hamburg: Medizinische

Verlagsgesellschaft.

� Deutsche Norm: Serodiagnostik von Infektionskrankheiten. DIN 58 969, Teil 10,

Ausgabe Juli 1989; Beuth Verlag GmbH, Burggrafenstraße 6, Berlin

� Laborheft Serologie im Bayerischen Landesamt für Gesundheit und

Lebensmittelsicherheit

� www.infektionsnetz.at (2914)

� www.biokurs.de/Skripten/12/bs12-53.htm (2014)

� www.Laborwissen.de/wiki (2014)