Vortrag Klassische Serologie in der modernen Labordiagnostik 3 · Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt 1 Vortrag zur KBR, Fortbildungsveranstaltung der Länder Mai 2014

Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt 1

Vortrag zur KBR,

Fortbildungsveranstaltung der Länder Mai 2014

Joachim Borgwardt

Klassische Serologie in der modernen Labordiagnostik

Die Komplementbindungsreaktion (KBR) am Beispiel der serologischen

Diagnostik der Brucellose


● EG-Diagnose-Handbuch, Entscheidung der Komm. 2003/422/EG vom 26.05.2003

● Gesetz zur Vorbeugung vor und Bekämpfung von Tierseuchen (TierGesG) vom 22.05.2013 (BGBl. I S. 1324, 3942)

● Brucellose-VO in der Fassg. d. Bekanntm. Vom 23.12.2005 (BGBl. I S. 3602)

● Methodensammlung des Friedrich-Löffler-Institutes (FLI), auf der Grundlage von § 27 des TierGesG (ehem. § 4 TierSG), Stand Januar 2014

● Liste der zugelassenen Mittel nach § 11 TierGesG (ehem. § 17 c TierSG), Stand 14.03.2014

● Bundesmaßnahmekatalog-Tierseuchen und Diagnosehandbücher

● EG-Regelungen zum Brucellose-Status und zu Fragen zum innergemeinschaftl. Handel● RL/97/12/EG (in Änderg. RL/64/432/EWG) � Rinder und Schweine/Handel● RL/90/429/EWG � Schweinesamen/Handel● Entsch./2003/467/EG � Rinderbestände/Brucellose-Status● RL/91/68/EWG � Schafe und Ziegen/Handel

Rechtsgrundlagen zur Anwendung der KBR als serologische Testmethodeam Beispiel der Diagnostik der Brucellose


Brucellose-Spektrum und Antikörper-Diagnostik bei verschiedenen Tierarten

Brucella ssp. Hauptwirte Nebenwirte serologische

Nachweis-

Methoden

Infektions-

gefahr für

Menschen

Infektions-

quellen für

Menschen

melitensis(3 Biovare)

Ziege, Schaf Haus- und Wildrinder, Schwein, Carnivoren

RBT, KBR, (SLA)

hoch, bes. akute Verläufe

Blutkontakt, Geburtshilfe, Milch, Käse, Labor

abortus(7 Biovare)

Haus- und Wildrinder

Einhufer, alle WDK, Carnivoren, Nager

SLA, KBR, ELISA, RBT, (Milch = ELISA, ABR)

mittel bis hoch, bes. chronische Verläufe

Blutkontakt, Geburtshilfe, Milch, Käse, Labor

suis(5 Biovare)

Haus/Wild-Schwein, Hase, Nager Rentier

Carnivoren, Nager, WDK

RBT, SLA, KBR

gering bis hoch

Blutkontakt, Wildbret, Labor

ovis Schafe Ziege, Nager RBT, KBR keine

(unbeachtet bleiben weitere, noch nicht bei landwirtschaftlichen Nutztieren nachgewiesene Brucella ssp. -canis, -neotomae, -microti, -cetaceae, -pinnipedialis)


Nr.

AMS Name der Krankheit HAD IDT DIFT IIFT NT SNT KBRKBR IBlot IPox HA HAH SLA RBT

2 Afrik. Pferdepest x xx x

3 Afrik. Schweinepest x x x

5 Anst. Blutarmut d. Pferde x

6 Anst. Blutarmut d. Lachse x x

8 Aujeszky KH x x x

9 Aviäre Influenza x x

12 Beschälseuche d. Pferde x xx

14 BHV-1 x x

15 BSE x

16 BVD x x x

17 Brucellose xx x x

19 Chlamydiose x xx

21 Bovine Leukose x

23 Epiz. Hämorrh. D. Hirsche x

24 Equine Virus Arteritis x x

30 IHN, VHS x x x x x

31 Koi-Herpes-Infektion x

Auszug serologische Methoden aus: Amtliche Methodensammlung, FLI, Stand Januar 2014


Nr.

AMS Name der Krankheit HAD IDT DIFT IIFT NT SNT KBRKBR IBlot IPox HA HAH SLA RBT

33 Lungenseuche d. Rinder x xx

34 MKS x

36 Newcastle Krankheit x x

40 Pferdeencephalomyelitis x x x

41 Pockenseuche der Sf+Zg x

42 Q-Fieber xx

44 Rifttal-Fieber x x x x

45 Rotz xx x

46 Orthopox-Infektion x

48 Schweinepest (KSP) x x x x

49 Stomat. Vesicularis x

50 Taura-Syndrom x

51 Tollwut x x

52 Toxoplasmose x

56 Tularämie x

58 Vesicul. Schw.-KH (SVD) x

61 West-Nil-Virus x x

62 Yellowhead Disease x

63 Zecken-übertragbare KH x x

Auszug serologische Methoden aus: Amtliche Methodensammlung, FLI, Stand Januar 2014


1. Tag

2. Tag

3. Komplement

Indikatorsystem

Diagnosesystem

4. Schaf-Erythrozyten

5. Ambozeptor

1. Testserum

�1:5 verdünnt�hitzeinaktiviert

2. Antigen

�resuspendiert oder�gebrauchsfertig

HS

Prinzip und Komponenten der Komplementbindungsreaktion


Komplementbindungsreaktion: Testkomponenten

1. Testserum: Blutserum, mind. 1 Tag alt, gekühlt, nicht gefrostet, keine Hämolyse, keine Kontamination, keine Probenpools(Achtung: Heparin-, Citrat- oder EDTA-Blut ist für die KBR ungeeignet)

2. Spezifisches Antigen: Lyophilisat resuspendiert, FLI-zugel. TestchargeAliquote bei -20°C lagerfähig, �Sicherheitsstufe� beachten

3. Komplement: Gebrauchsverdünnung mit KBR-Puffer (aktuell 1:35) stets frisch herstellen, Zell-Lysis-Funktion bei Ca- und Mg-Ionen im System, Reaktionskaskade aus > 20 Serumproteinen (C1 � C9, Erkennungs-Aktivierungs- und Ausführungsfunktionen)

4. und 5. Hämolytisches System: Schaferythrozyten und Antikörper gegen Schaf-erythrozyten (Ambozeptor), kommerziell hergestellte HS-Einheit in Gebrauchsverdünnung (Haltbarkeit max. 4 Wochen), vorsichtiges Schütteln

KBR-Puffer (ehem. Veronalpuffer): Kommerzieller (Ionen)-Puffer auf Piperazin-Basis,rekonstituiert, im Kühlschrank bis 4 Wochen lagerfähig


Bildquelle: http://meduniwien.ac.at (2014)

Beispiele für die KBR

-Humanmedizin �

� Brucella-Ab

� Listeria-Ab

� Coxsackie-Virus

� Influenza-Virus-Ab

� Coxiella-Ab

� Treponema-Ab

� Mycoplasma-Ab

-Veterinärmedizin �

� Afrik. Pferdepest

� Brucella-Ab

� Burkholderia-Ab

� Mycoplasma-Ab

� Trypanosoma-Ab

� Leishmania-Ab

� Coxiella-Ab

http://meduniwien.ac.at(2014)


Komplementbindungsreaktion: Ansatzschema für Testserum (Hauptversuch)

Serumverdünnung (25 µl), 1:5 mit KBR-Puffer

Serum-Inaktivierung, 60 °C, 30 min. (WDK) und 50` (Schwein)

AG (25 µl), resuspendiert oder gebrauchsfertig

Komplement (25 µl), Verdünnung 1:35 mit Aqua bidest.

1. Inkubation, 37°C, 30 min. / oder bei 3-8°C, übernacht

Hämolytische System (50 µl), gebrauchsfertig(Erythozyten- und Ambozeptorsuspension)

2. Inkubation, 37°C, 30 min.

Auswertung


Ansatz: Komplementbindungsreaktion (Testkomponenten und Kontrollsysteme)

Kontroll-

system

Serum

(1:5)

KBR-

Puffer

Antigen Komple-

ment

HS Kontroll-

ergebnis

Serum-K 25 µl 25 µl --- 25 µl 50 µl neg.

AG-K --- 25 µl 25 µl 25 µl 50 µl neg.

Komple-ment-K

--- 50 µl --- 25 µl 50 µl 2 x neg. *2 x pos. *

HS-K --- 75 µl --- --- 50 µl keine Erythrolyse

Pos.-K ** 25 µl --- 25 µl 25 µl 50 µl pos.Titer !

Neg.-K 25 µl --- 25 µl 25 µl 50 µl neg.

*) = nach Titration, Startverdünnung 1:35**) = Standardserum +/- 1 Titerstufe, Berechnungsgrundlage für sens.E/ml


Übersichtskarten zum Testablauf der KBR als Anlagen zur Prüfmethode

Serologische Diagnostik der Brucellose(PM 61-0001-03)


KBR-Ansatzschema MTP 96, Halbrundboden, 300 µl/Kav.

PK

KK

NK

Proben

QMK

AG

KBR-Beschriftung


KBR-Ansatzschema MTP 96, Halbrundboden, 300 µl/Kav.

PK

KK

NK

Proben

QMK

AG

KBR-Auswertung

KBR-Brucellose-Auswertung am Abbildungs-Beispiel�PK 1:320, NK neg, AG neg, KK 2 x neg, 2 x pos�QMK 1:20 (pos), Proben 1 x pos/1 x n.a./10 x neg(Eine Probe gilt als positiv ab 1:5 bzw. 20 IE/ml, gem. FLI-Methoden-Sammlung)

pos. Testreaktionneg. Testreaktion


1. Serum-Inaktivierung

1. Testkomponenten, Probensystem

1. MTP-Plattenansatz


4. Inkubation (37°C, 30 min.)


5. Hämolytisches System

6. Inkubation (37°C, 30 min.)


7. Auswertung, gem. Vierkreuzschema

100%ige Hämolyshemmung (++++) = pos.75%ige Hämolysehemmung (+++) = pos.50%ige Hämolysehemmung (++) = neg.25%ige Hämolysehemmung (+) = neg.< 25%ige Hämolysehemmung (-) = neg.

Ablese-Kriterien (Routineansatz)

�PK - HV-Titer, SK�NK - HV, SK�AG - HV�QMK - HV-Titer, SK�Komplement - Auswertung !�Testseren - HV, SK


Literaturhinweise zur KBR-Methode

� Eichel, K., Heinz, St., Mönch, J.: Bedeutung und Durchführung der KBR. Projektarbeit der SBFS für VMTA am Bayr. LA für Ges.- und LM-Sicherh.

� Laborheft Serologie im Bayerischen Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit

� Jawetz E., Melnick J.L. & Adelberg E.A. (1973). Medizinische Mikrobiologie. Berlin: Springer Verlag.

� Thomas, L. (1992). Labor und Diagnose. Hamburg: Medizinische Verlagsgesellschaft.

� Deutsche Norm: Serodiagnostik von Infektionskrankheiten Komplementbindungsreaktion (KBR), DIN 58 969, Teil 10, Ausgabe Juli 1989; Beuth Verlag GmbH, Burggrafenstraße 6, Berlin

� Mayr, A. et al, Virologische Arbeitsmethoden, Band 2, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, New York, 1977

� http://www.infektionsnetz.at/KBR.phtml

� http://de.wikipedia.org/wiki/Komplementbindungsreaktion

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