Wirkung von Imidazolinen auf den „triggering pathway“ der ... fileWirkung von Imidazolinen auf den „triggering pathway“ der Insulinsekretion Von der Fakultät für Lebenswissenschaften

Wirkung von Imidazolinen auf den „triggering pathway“ der Insulinsekretion

Von der Fakultät für Lebenswissenschaften

der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina

zu Braunschweig

zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

genehmigte

D i s s e r t a t i o n

von Timm Große Lackmann aus Berlin-Schmargendorf

1. Referent: Prof. Dr. Ingo Rustenbeck 2. Referent: Prof. Dr. Uwe Panten eingereicht am: 11.07.2006 mündliche Prüfung (Disputation) am: 28.03.2007 Druckjahr 2007

Vorveröffentlichungen der Dissertation

Teilergebnisse aus dieser Arbeit wurden mit Genehmigung der Fakultät für Lebenswissen-schaften, vertreten durch den Mentor der Arbeit, in folgenden Beiträgen vorab veröffentlicht:

Publikation:

GROSSE LACKMANN T, ZÜNKLER BJ, RUSTENBECK I (2003): Specifity of non- adrenergic imidazoline binding sites in insulin-secreting cells and relation to the block of ATP-sensitive K+ channels. Ann NY Acad Sci 1009: 371-377

WIENBERGEN A, BLECK C, GROSSE LACKMANN T, RUSTENBECK I (2007):

Antagonism of the insulinotropic action of first generation imidazolines by openers of KATP channels. Biochem Pharmacol 73: 94-102

Tagungsbeiträge:

GROSSE LACKMANN T, RUSTENBECK I (2000): Quinine blocks ATP-dependent K+ channels by binding to the imidazoline site at the pore-forming subunit. Naunyn-

Schmiedeberg´s Arch Pharmacol 359: R78.

RUSTENBECK I, GROSSE LACKMANN T (2000): Molecular mechanism of quinine- induced insulin secretion. Exp Clin Endocrinol Diabetes 108 (Suppl. 1): S76.

RUSTENBECK I, FRICKE K, GROSSE LACKMANN T, DICKEL C (2001): Antagonism of the imidazoline block of ATP-sensitive K+ channels by nucleotides and diazoxide. Naunyn-Schmiedeberg´s Arch Pharmacol 360: R79

RUSTENBECK I, FRICKE K, GROSSE LACKMANN T, DICKEL C (2001): Antagonismus zwischen Imidazolinen und physiologischen und pharmakologischen Kaliumkanal-öffnern am KATP Kanal der B-Zelle. Diabetes und Stoffwechsel Band 10 (Suppl.1): 4-09

RUSTENBECK I, FRICKE K, DICKEL, C, GROSSE LACKMANN T (2002): Antagonis- mus of imidazoline induced KATP channel block by diazoxide. Diabetologia 45: A167

Meiner Familie

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Juli 1999 bis Dezember 2001 am Institut für

Klinische Biochemie der Medizinischen Hochschule Hannover und von Januar 2002 bis

Oktober 2002 am Insitut für Pharmakologie und Toxikologie der Technischen Universität

Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig angefertigt.

Mein großer Dank gilt Herrn Prof. Dr. I. Rustenbeck für die Bereitstellung und der intensiven

Betreuung dieser Arbeit. Mein besonderer Dank gilt Frau C. Dickel (Institut für

Pharmakologie; Göttingen) für die Einarbeitung in die Patch-Clamp-Technik und der Hilfe

bei den inside-out Versuchen, Frau K. Fricke (Institut für Pharmakologie; Göttingen) für die

Hilfe bei der Messung der cytosolischen Ca2+-Konzentrationen, Herrn Dr. M. Elsner, Herrn

Dr. S. Lortz und Frau A. Hager (Institut für Klinische Biochemie der MH Hannover) für die

Einführung in die molekularbiologischen Methoden sowie der bereitwilligen Antworten

meiner häufigen Fragen, Frau U. Sommerfeld (Institut für Klinische Biochemie der MH

Hannover) für die Hilfe der Messung der Membranpotentiale und der Einzelkanalkinetiken,

Prof. F. Ashcroft für die cDNA von Kir6.2∆C26 und Prof. J. Bryan (Baylor College of

Medicine, Houston, USA) für die cDNA vom SUR1 der Ratte. Außerdem danke ich den

Kolleginnen und Kollegen des Instituts für Klinische Biochemie der MH Hannover für ihre

helfenden Hände und offenen Ohren ganz herzlich.

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

Verzeichnis der Abkürzungen V

1 Einleitung 1

1.1 Die Bedeutung von oralen Antidiabetika in der Therapie des

Typ II Diabetes 1

1.2 Physiologische und pharmakologische Regulation der Insulinsekretion 2

1.3 Imidazoline als Stimulatoren der Insulinsekretion 4

2 Zielsetzung und Fragestellung der Arbeit 12

3 Material und Methoden 13

3.1 Materialien 13

3.2 Zellkultur und Gewebegewinnung 16

3.2.1 Zellkulturlinien 16

3.2.1.1 HEK293-Zellen 16

3.2.1.2 HIT-Zellen 16

3.2.2 Medien und Lösungen für die Zellkultur 16

3.2.2.1 Kulturmedium DMEM 16

3.2.2.2 Kulturmedium RPMI 1640 16

3.2.2.3 PBS 17

3.2.2.4 EDTA-Stammlösung 17

3.2.2.5 Trypsin-EDTA-Lösung 17

3.2.2.6 Krebs-Ringer-HEPES-Puffer 17

3.2.3 Zellpassagierung 17

3.2.4 Gewinnung von Pankreasinseln 18

3.3 Molekularbiologische Methoden 19

3.3.1 Geräteliste 19

Inhaltsverzeichnis

II

3.3.2 Ausgangs- und Expressionsplasmide 19

3.3.3 Manipulation der Plasmid-DNA 20

3.3.4 Herstellung elektrokompetenter E.coli-Bakterien 21

3.3.5 Transformation kompetenter E.coli-Bakterien durch Elektroporation 22

3.3.6 Isolierung und Aufreinigung von Plasmid-DNA aus Bakterien 23

3.3.7 Agarosegelelektrophorese 23

3.3.8 Technik der transienten Transfektion 24

3.3.9 Technik der stabilen Transfektion 25

3.4 Die Patch-Clamp-Technik 26

3.4.1 Aufbau des Messstands 26

3.4.2 Zellbad und Umströmungssystem 27

3.4.3 Herstellung der Patch-Pipetten 28

3.4.3.1 Stammlösungen der Testsubstanzen 30

3.4.4 Lösungen für Patch-Clamp-Versuche 30

3.4.4.1 Badlösungen 31

3.4.5 Allgemeine Versuchsdurchführung der Patch-Clamp-Technik 31

3.4.6 Cell-attached Konfiguration 32

3.4.7 Inside-out Konfiguration 32

3.4.8 Whole-cell Konfiguration 33

3.4.9 Auswertung und Statistik 33

3.4.9.1 Einzelkanalmessungen 33

3.4.9.2 Inside-out Messungen 34

3.4.9.3 Messungen des Membranpotentials 34

3.5 Mikrofluorimetrische Messung der cytosolischen Ca2+

-Konzentration 35

3.5.1 Eigenschaften und Anwendung von fluoreszierenden Ca2+-Indikatoren 35

3.5.2 Die Mikrofluorimetrie mit digitaler Bildverarbeitung 36

3.5.3 Versuchsdurchführung 37

4 Ergebnisse 39

4.1 Hemmung des nativen KATP -Kanals in HIT-Zellen durch

Clonidin und Chinin 39

Inhaltsverzeichnis

III

4.2 Wirkung von Clonidin und Chinin auf die porenbildende

Untereinheit des KATP-Kanals 40

4.2.1 Charakterisierung der Eigenschaften des heterolog exprimierten

Kir6.2∆C26-Kanals in HEK293-Zellen 40

4.2.2 Vergleich der Kinetik des nativen KATP-Kanals in HIT-Zellen mit

dem heterolog exprimierten Kir6.2∆C26-Kanal in HEK293-Zellen 41

4.2.3 Hemmung des heterolog exprimierten Kir6.2∆C26-Kanals in

HEK293-Zellen durch Clonidin und Chinin 42

4.2.4 Hemmung des heterolog exprimierten Kir6.2∆C26-Kanals in

HEK293-Zellen durch Alinidin 43

4.3 Heterologe Expression von Kir6.2∆C26/SUR1 in HEK293-Zellen

und Hemmung durch Chinin 44

4.4 Antagonismus von MgGDP und Diazoxid auf die durch

Phentolamin, Alinidin, Tolbutamid und Chinin gehemmten

KATP-Kanäle im inside-out Modus 46

4.5 Vergleich der repolarisierenden Wirkung von Diazoxid in Gegenwart

von den Imidazolinen Phentolamin, Alinidin und Idazoxan, sowie

Tolbutamid und Chinin 48

4.6 Antagonistische Wirkung von Diazoxid auf den Imidazolin-induzierten

Anstieg der cytosolischen Ca2+

-Konzentration 52

4.7 Wirkung des Stoffwechselinhibitors Natriumcyanid auf den

Alinidin-induzierten und den Tolbutamid-induzierten KATP-Kanalblock 57

5 Diskussion 60

5.1 Kir6.2 als gemeinsamer Wirkort von Imidazolinen und Chinin 60

5.2 Kir6.2 als Korrelat von nichtadrenergen Imidazolinbindungsstellen in

insulinsezernierenden Zellen 62

5.3 Wechselwirkung zwischen Imidazolinen und physiologischen und

pharmakologischen KATP-Kanalöffnern 65

5.4 Konsequenzen der Hemmung des Energiestoffwechsels der

B-Zellen für den Imidazolin-induzierten Schluß von KATP-Kanälen 68

Inhaltsverzeichnis

IV

6 Zusammenfassung 70

7 Literaturverzeichnis 74

Abkürzungsverzeichnis

V

Abkürzungsverzeichnis A Ampere

Abb. Abbildung

ADP Adenosin-5´-Diphosphat

ATP Adenosin-5´-Triphosphat

bp Basenpaare

cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

Ci Curie, veraltete Einheit der Aktivität

dd H2O doppelt destilliertes Wasser

et al. et alii (und andere)

g Erdbeschleunigung

GDP Guanosin-5´-Diphosphat

Hz Hertz

[3H] Titium (Isotop des Wasserstoffs)

h Stunde(n)

I1 Imidazolin-1-Rezeptor

I2 Imidazolin-2-Rezeptor

IC50 halbmaximal inhibitorisch wirksame Konzentration

KATP-Kanal ATP-sensitiver Kaliumkanal

kB Kilobasenpaare

KD Dissoziationskonstante

kV Kilovolt

l Liter

LB Luria-Bertani

M molar

mg Milligramm

MgGDP Magnesium2+-GDP-Komplex

min Minute(n)

ml Milliliter

mM millimolar

ms Millisekunden

N Normal

nM nanomolar

nm Nanometer

Abkürzungsverzeichnis

VI

ng Nanogramm

OD optische Dichte

Ω Ohm

pA Picoampere

pH negativer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration

rpm Umdrehungen pro Minute

RT Raumtemperatur

s Sekunde(n)

s. siehe

SEM Standardfehler der Mittelwerte (Standard Error of Means)

t-Test Student´s t-Test, zweiseitig

U Unit

UV ultraviolett

v/v Volumenanteile bezogen auf das Gesamtvolumen

V Volt

% Prozent

°C Grad Celsius

° Grad

µF Mikrofarad

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µM mikromolar

µm Mikrometer

Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Die Bedeutung von oralen Antidiabetika in der Therapie des Typ II Diabetes

Die Zunahme der Lebenserwartung geht in allen Ländern mit einer Zunahme der Prävalenz

des Altersdiabetes (Typ II Diabetes) einher. Durch die sog. „Spätschäden“, vor allem die

diabetische Makroangiopathie, ist der Typ II Diabetes eine der Hauptursachen für Morbidität

im höheren Lebensalter. Die Ergebnisse der Langzeitstudie der englischen

Diabetesgesellschaft (UK Prospective Diabetes Study = UKPDS) zeigen, dass eine

Behandlung mit oralen Antidiabetika oder Insulin die Blutzuckerkontrolle gegenüber

alleiniger Diätbehandlung signifikant verbessert, aber nicht normalisiert. Die verbesserte

Stoffwechselkontrolle, sei sie durch orale Antidiabetika oder Insulin bewirkt, konnte das

Auftreten von diabetischen Spätschäden verzögern aber nicht verhindern. Günstig beeinflusst

wurde das Auftreten der diabetischen Mikroangiopathie, die für Organschäden wie

Nephropathie, Retinopathie und Neuropathie verantwortlich ist, nicht aber die

Makroangiopathie (STRATTON et al., 2000). Das Ausmaß der diabetischen

Makroangiopathie wurde nur durch Metformin vermindert, ohne dass die BZ-Einstellung

besser war. Hier mag die Hyperlipidämie eine Rolle spielen (UKPDS GROUP 16, 1995;

UKPDS GROUP 34, 1998).

Allen Antidiabetika ist zu eigen, daß sie im Verlauf des Typ II Diabetes an

Wirksamkeit verlieren (KARAM et al., 1986; KAWAKI et al., 1999; TURNER et al., 1999).

Ursächlich ist hierfür wahrscheinlich ein Fortschreiten der dem Typ II Diabetes zugrunde

liegenden metabolischen Störung. Dieser Wirkungsverlust kann durch Kombination

verschieden wirkender oraler Antidiabetika zumindest zeitweilig kompensiert werden

(FONSECA et al., 2000; WOLFFENBUTTEL et al., 2000). Es werden daher sowohl

insulinsekretionssteigernde orale Antidiabetika als auch insulinwirkungssteigernde orale

Antidiabetika benötigt. Begrenzend für den Einsatz von insulinsekretionssteigernden oralen

Antidiabetika ist das Auftreten von Hypoglykämien (BERGER et al., 1986, CRYER, 2002).

Die Entwicklung von insulinsekretionsteigernden Antidiabetika, die keine Hypoglykämien

bewirken können, wäre ein Fortschritt in der Therapie des Typ II Diabetes.

Einleitung

2

1.2 Physiologische und pharmakologische Regulation der Insulinsekretion

Praktisch einziger physiologischer Auslöser der Insulinsekretion ist ein Anstieg der

Blutglucosekonzentration. Das Besondere der Stimulus-Sekretionskopplung der B-Zelle des

Pankreas besteht darin, dass das Signal für die Exozytose der insulinhaltigen Sekretgranula

aus dem Energiestoffwechsel der B-Zelle entsteht (MEGLASSON und MATSCHINSKI,

1986; PANTEN und LENZEN, 1988; LENZEN 1990). So führt eine Erhöhung des

Glucoseangebots an die B-Zelle zu einem vermehrten Durchsatz durch die Glykolyse und den

Citratzyklus und schlussendlich zu einer Steigerung der mitochondrialen ATP-Synthese. Die

Kopplung zwischen Metabolismus der Glucose und der Sekretionsauslösung wird v.a. durch

einen K+-Kanal in der Plasmamembran vermittelt, den ATP-sensitiven K+-Kanal

(ASHCROFT und RORSMAN, 1989 und 1990). Die Offenwahrscheinlichkeit dieses Kanals

bestimmt das Ruhemembranpotential der B-Zelle, das bei ca. -70 mV liegt. Steigt der

Quotient der cytosolischen Konzentrationen von ATP und ADP, so sinkt die

Offenwahrscheinlichkeit dieses Kanals. Durch einen bisher nicht identifizierten

Einwärtsstrom kommt es zur Depolarisation der Plasmamembran und dadurch zum Öffnen

von spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen (AGUILAR-BRYAN et al., 1998; PANTEN et al.,

1992; PANTEN et al., 1996). Ein Einstrom von Ca2+ aus dem Extrazellulärraum ist in den

meisten sekretorischen Zellen ebenso wie in synaptischen Endigungen von Neuronen ein

unmittelbares Signal zur Auslösung der Exozytose (GERBER und SÜDHOF, 2002). Dieser

Ablauf wird als der KATP-Kanal-abhängige Signalweg oder nach einem Vorschlag von

Henquin „triggering pathway“ genannt (Abb. 1 / HENQUIN, 2000). Außer Glucose gibt es

eine Reihe von physiologischen Stimuli der Insulinsekretion, wie z.B. das Glucagon-like

Peptide 1 (GLP-1), das Cholecystokinin (CCK-PZ) oder die Aktivierung der

parasympathischen Innervation der B-Zelle (MALAISSE et al., 1966). Es handelt sich hierbei

jedoch nicht um Auslöser, sondern um Verstärker der Sekretion, d.h. sie sind nicht wirksam in

Abwesenheit von Glucose.

Sulfonylharnstoffe, die derzeit am häufigsten verwendeten oralen Antidiabetika,

steigern die Insulinsekretion. Therapeutisch relevante extrapankreatische Wirkungen, die für

einige Sulfonylharnstoffe postuliert werden, konnten bisher nicht überzeugend belegt werden

(JOOST, 1985; MOORADIAN, 1987; PANTEN et al., 1996). Sulfonylharnstoffe können die

Insulinsekretion von isolierten Langerhansschen Inseln auch in Abwesenheit von Glucose

stimulieren, sie sind deshalb sekretionsauslösende Substanzen und nicht nur Modulatoren der

Insulinsekretion (MALAISSE et al., 1967; GORUS et al., 1988). Der molekulare

Einleitung

3

Mechanismus der insulinsekretionsauslösenden Wirkung der Sulfonylharnstoffe (Abb. 1)

wurde verständlich, als Mitte der achtziger Jahre mit Hilfe der damals neuen

elektrophysiologischen Patch-Clamp-Technik gezeigt wurde, dass Sulfonylharnstoffe den

ATP-sensitiven-K+-Kanal in den B-Zellen direkt schließen (NOMA, 1983; STURGESS et al.,

1985). Damit bewirken sie das, was der Glucosemetabolismus vermittels eines erhöhten

ATP/ADP-Verhältnisses bewirkt (ASHCROFT und RORSMAN, 1990; AGUILAR-BRYAN

et al., 1998): wiederum kommt es zur Depolarisation der Plasmamembran, Ca2+-Einstrom und

Exozytose (HENQUIN, 1987; ASHCROFT und RORSMAN, 1989)).

Abb. 1 Schema des „triggering pathways“ der Stimulus-Sekretionskopplung in der B-Zelle des Pankreas. Die Steigerung des Energiestoffwechsels durch die Aufnahme von Glucose führt zum Anstieg des ATP/ADP- Konzentrationserhältnisses im Cytosol. Dadurch kommt es zum Schließen der KATP-Kanäle und so zu einer Depolarisierung der Plasmazellmembran. Die Depolarisation führt zur Öffnung spannungsabhängiger Calciumkanäle (VDCC) und zum vermehrten Einstrom von Ca2+ in das Cytosol. Der Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration ([Ca2+]i) ist das unmittelbare Signal für die Freisetzung von Insulin.

Auf welche Weise schließen Sulfonylharnstoffe den KATP-Kanal? Mitte der neunziger Jahre

wurde gezeigt, dass der ATP-abhängige Kaliumkanal aus zwei Untereinheiten besteht: dem

eigentlichen porenbildenden Kanalprotein Kir6.2 und einem zusätzlichen regulatorischen

Protein, auf dem die Bindungsstelle für Sulfonylharnstoffe lokalisiert ist (AGUILAR-

BRYAN et al., 1995; INAGAKI et al., 1995). Da andere Funktionen und endogene Liganden

nicht bekannt waren, wurde das regulatorische Protein dementsprechend „sulfonylurea

receptor“ (SUR) genannt. Es sind bisher drei Isoformen beschrieben, SUR1, SUR2A und

Einleitung

4

SUR2B. Die B-Zelle des Pankreas hat, ebenso wie neuronale Zellen, den Isotyp SUR1

(INAGAKI et al., 1996; ISOMOTO et al., 1996). Es ist derzeit allgemein akzeptiert, dass die

öffnende Wirkung von ADP über eine Bindung von MgADP an den SUR vermittelt wird,

während die schließende Wirkung von ATP durch eine Bindung von ATP4- an Kir6.2

vermittelt wird (ASHCROFT und GRIBBLE, 1999).

Allerdings hat die B-Zelle durch diesen Wirkmechanismus der Sulfonylharnstoffe keinen

Energiegewinn, im Gegensatz zur glucoseinduzierten Insulinsekretion, so dass wegen der

ausgeprägten Energieabhängigkeit der Exozytose in der B-Zelle (DETIMARY et al., 1994;

RUSTENBECK et al., 1997b; TAKAHASHI et al., 1999) nur eine mäßige

Sekretionssteigerung zustande kommt. Die Tatsache, dass der gesteigerte Energiestoffwechsel

zusätzlich zum Schluss des KATP-Kanals und Anstiegs der cytosolischen Ca2+-Konzentration

Signale produziert, die die ausgelöste Sekretion verstärken, hat zur Hypothese eines

„amplifying pathways“ geführt (HENQUIN, 2000), dessen einzelne Elemente jedoch noch

nicht identifiziert sind. Für die therapeutische Anwendung ist diese geringe Wirkung der

Sulfonylharnstoffe in Abwesenheit von Glucose jedoch nur vorteilhaft, da sonst das Risiko

einer Hypoglykämie, die die wichtigste unerwünschte Wirkung von Sulfonylharnsstoffen

darstellt (BERGER et al., 1986; FERNER und CHAPLIN, 1987), noch größer wäre.

Tolbutamid (Abb. 2) ist die Leitsubstanz der Sulfonylharnstoffe der 1. Generation. Als

Sulfonylharnstoffe der 1. Generation werden solche Sulfonylharnstoffe definiert, die

Tagesdosen in Grammmengen haben, und von diesen ist nur noch Tolbutamid (Orabet®) auf

dem deutschen Markt erhältlich. Sulfonylharnstoffe der 2. Generation sind solche die in

Milligrammmengen dosiert werden. Die Leitsubstanz für die zweite Generation ist

Glibenclamid.

1.3 Imidazoline als Stimulatoren der Insulinsekretion

Die Verstärkung der glucoseinduzierten Insulinsekretion durch den α-

Adrenozeptorantagonisten Phentolamin (Abb. 2) ist ein seit langem bekanntes Phänomen und

galt ursprünglich als Hinweis auf eine tonische Hemmung der Insulinsekretion durch das

adrenerge Nervensystem (ROBERTSON und PORTE, 1973). Dieser tonischen Hemmung

sollte eine besondere Rolle im Typ II Diabetes zukommen (AHRÉN und LUNDQUIST,

1985). Aus dieser Vorstellung heraus wurden auch Therapieversuche begonnen, die zum Ziel

hatten, über eine Hemmung der α2–Adrenozeptoren auf den B-Zellen den Einfluss des

Einleitung

5

sympathischen Nervensystems zu vermindern und dadurch die Ansprechbarkeit der B-Zellen

auf einen Anstieg der Blutglucosekonzentration zu verbessern. Als spezifische α2-

Adrenozeptorantagonisten wie Idazoxan (Abb. 2) zur Verfügung standen, wurde jedoch

deutlich, dass die mit Phentolamin zu beobachtende Verbesserung der Glucosetoleranz

offenbar nicht auf einer Hemmung des sympathischen Nervensystems beruht (ÖSTENSON et

al., 1988).

Experimentell gelang der Nachweis, dass die Steigerung der Insulinsekretion nur von solchen

α-Adrenozeptorantagonisten bewirkt wurde, die eine Imidazolinstruktur aufwiesen (SCHULZ

und HASSELBLATT, 1988; 1989a). Auch Clonidin (Abb. 2), ein α2-Adrenozeptoragonist mit

Imidazolinstruktur, der ein typischer Hemmstoff der Insulinsekretion ist, konnte die

Insulinsekretion steigern, wenn die α2-Rezeptoren der B-Zellen irreversibel blockiert waren

(SCHULZ und HASSELBLATT, 1989b). Der Befund, dass Phentolamin, Clonidin und

andere Imidazoline den ATP-sensitiven K+-Kanal der B-Zelle schließen, bot eine logische

Erklärung für die sekretionssteigernde Wirkung der Imidazoline (PLANT und HENQUIN,

1990; DUNNE, 1991; CHAN und MORGAN, 1991). Andererseits war die ausgeprägte

Glucoseabhängigkeit des sekretionssteigernden Effekts des Imidazolins Efaroxan (CHAN und

MORGAN, 1990) Hinweis darauf, dass die Sekretionssteigerung durch Imidazoline nicht nur

auf denselben Mechanismen wie die Sulfonylharnstoff-induzierte Sekretion beruhen konnte.

Der Befund, dass Efaroxan bei niedrigen Glucosekonzentrationen nicht sekretionssteigernd

wirkt, ließ annehmen, dass es möglich sein sollte, aus dieser Substanzgruppe

sekretionssteigernde Antidiabetika zu entwickeln, die nicht das Risiko einer

Hypoglykämieauslösung mit sich tragen (MORGAN und CHAN, 2001). Um die

insulinotrope Wirkung der Imidazoline aufzuklären, wurden Anstrengungen unternommen,

die Bindungsstelle für diese Substanzen auf den B-Zellen zu identifizieren.

Verschiedene Untersuchungen zum Mechanismus zur antihypertensiven Wirkung von

Clonidin führten Mitte der achtziger Jahre zur Hypothese, dass nicht allein die agonistische

Wirkung an α-Adrenozeptoren die Ursache sein könnte, sondern dass es Rezeptoren geben

müsse, die spezifisch Imidazolingruppen erkennen (BOUSQUET et al., 1984). Im Laufe der

letzten Jahre hat die Ansicht, dass es spezifische Imidazolinbindungsstellen gibt, allgemeine

Anerkennung gefunden. Diejenigen Bindungsstellen, die von Clonidin und Clonidinanaloga

mit hoher Affinität erkannt werden, werden als I1-Rezeptoren bezeichnet (MICHEL und

ERNSBERGER, 1992). Diese Rezeptoren sollen wesentlichen Anteil an der Vermittlung des

hypotensiven Effekts von Clonidin haben (DE VOS et al., 1994). Davon sind diejenigen

Einleitung

6

Bindungsstellen abzugrenzen, die von Idazoxan und einigen Guanidinsubstanzen erkannt

Abb. 2 Strukturformeln der verwendeten Imidazoline, sowie des Sulfonylharnstoffs Tolbutamid und es

Chinabaumrindenalkaloids Chinin. Das gemeinsame Strukturmerkmal des Imidazolinrings bedingt eine hemmende Wirkung auf den KATP-Kanal, nicht aber einen Antagonismus an α2-Adrenozeptoren. Innerhalb der Imidazoline sind Idazoxan und Phentolamin α-Antagonisten, Clonidin ist ein α2-Agonist und Alinidin besitzt nur eine sehr geringe Affinität zu α-Rezeptoren.

Einleitung

7

werden; diese werden als I2-Rezeptoren klassifiziert. Ein Teil der als I2 klassifizierten

Bindungsstelle entspricht einer allosterischen Bindungsstelle auf der Monoaminoxidase,

einem Enzym auf der äußeren Mitochondrienmembran, andererseits werden mit I2-

Rezeptoren oder I2-ähnlichen Rezeptoren auch natriuretische Wirkungen an der Niere

assoziiert (REGUNATHAN und REIS, 1996), die nicht durch eine Änderung der

Monoaminoxidaseaktivität erklärt werden können.

Somit war die Vermutung naheliegend, dass auch die Wirkung der Imidazoline auf die

Insulinsekretion durch spezifische Imidazolinrezeptoren vermittelt wird. Die Gruppe um

Morgan veröffentlichte Befunde, die auf die Existenz eines Imidazolinrezeptors in den B-

Zellen schließen lassen: 1.) die Stereoisomere des insulinsekretionssteigernden Imidazolins

Efaroxan wiesen deutlich Unterschiede in ihrer Wirksamkeit auf (CHAN et al., 1993); 2.)

stimulatorisch wirksame Imidazoline wie Phentolamin und Efaroxan, nicht aber unwirksame

Imidazoline wie Idazoxan, bewirken eine homologe Desensitisierung (CHAN et al., 1994);

3.) der mögliche endogene Imidazolin-Agonist CDS (clonidine-displacing substance) steigert

die Insulinsekretion (CHAN et al., 1997a), was durch das Imidazolinderivat RX801080

antagonisiert werden konnte. Dieser Reihe von Befunden, die auf eine Existenz eines

Imidazoline erkennenden Rezeptors in den B-Zellen des Pankreas hinweisen, stehen Befunde

aus der Gruppe um Henquin entgegen. Diese belegen eine Stereoselektivität nur für die über

α-Rezeptoren vermittelten Wirkungen eines Imidazolins (SL84.0418) an der B-Zelle, nicht

aber für den Schluss des KATP-Kanals, und weisen damit auf eine weniger spezifische

Interaktion mit dem KATP-Kanalprotein hin (JONAS et al., 1994). Ein ähnlicher Mechanismus

wird auch für die insulinsekretionssteigernde Wirkung von Chinin (Abb. 2) und Klasse IA-

Antiarrhythmika vermutet (KAKEI et al., 1993). Diese Ansicht wird durch einen Befund aus

der Gruppe von F.Ashcroft unterstützt: eine C-terminal trunkierte Variante von Kir6.2, die im

Gegensatz zum Wildtyp auch ohne die gleichzeitige Expression von SUR1 an die

Plasmamembran gelangt und Kanalaktivität zeigt (TUCKER et al., 1997), war durch

Phentolamin in den Konzentrationen zu hemmen, in denen Phentolamin auch den

natürlichen, aus Kir6.2 und SUR1 bestehenden KATP-Kanal hemmt (PROKS und

ASHCROFT, 1997). Dieser Befund spricht dafür, dass zumindest Phentolamin den

Ionenkanal durch direkte Blockade der Ionenpore des KATP-Kanals hemmt. Darüber hinaus

besitzen Imidazoline aber noch zusätzliche Effekte, die sich als Sensitisierung der

Exozytosemaschinerie gegenüber der intrazellulären Ca2+-Konzentration beschreiben lassen

(ZAITSEV et al., 1996). Dieser Effekt der Imidazoline ähnelt der direkten Wirkung auf die

Exozytose, die von Sulfonylharnstoffen berichtet wurde (ELIASSON et al., 1996). Die

Einleitung

8

Relevanz dieser „distalen“ Effekte für die Insulinsekretionssteigerung ist jedoch bisher noch

unklar.

Mit Rezeptor-Bindungsstudien konnten nichtadrenerge Imidazolinbindungsstellen an

Membranen von insulinsezernierenden RINm5F-Zellen (CHAN et al., 1997b) und HIT-

Zellen nachgewiesen werden (RUSTENBECK et al., 1997a). In den letzteren Versuchen

wurde [3H]Clonidin als Radioligand verwendet, da Clonidin der etablierte Ligand für I1-

Bindungsstellen ist (REGUNATHAN und REIS, 1996) und Clonidin die Insulinsekretion

steigert, vorausgesetzt die α2-Adrenozeptoren der B-Zelle sind durch Antagonisten besetzt

(SCHULZ und HASSELBLATT, 1989b). Somit konnte angenommen werden, dass Clonidin

an die funktionell relevanten Stellen bindet und die Ergebnisse der Verdrängungsbindung

konnten direkt mit den an anderen Geweben erhaltenen Ergebnissen verglichen werden. Der

Nachweis, dass es an HIT-Zellmembranen nichtadrenerge Imidazolinbindungsstellen gibt

(RUSTENBECK et al., 1997a), ist durch den Befund gegeben, dass Noradrenalin markiertes

Clonidin nur unvollständig zu verdrängen vermochte (Abb. 3). Mit einem Überschuss an

Noradrenalin ließen sich nun die Adrenozeptoren maskieren und [3H]Clonidin konnte nur an

die nichtadrenergen Imidazolinbindungsstellen binden.

Abb. 3 Homologe Verdrängung von [

3H]Clonidin durch unmarkiertes Clonidin () verglichen mit der

Verdrängung von [3H] Clonidin durch Noradrenalin () von HIT-Zellmembranen. Die Verdrängung durch

Clonidin ist vollständig, die durch Noradrenalin unvollständig. Die durch Noradrenalin nicht verdrängbare Aktivität von [3H]Clonidin (ca. 30%) ist Ausdruck von nichtadrenergen Imidazolinbindungsstellen.

Einleitung

9

Die Verdrängungsbindungen, die in Gegenwart von Noradrenalin erhalten wurden, waren

biphasisch (Abb. 4). Die homologe Verdrängung von markiertem durch unmarkiertes

Clonidin ergab einen KD-Wert von 61 nM für die hochaffine Stelle und einen solchen von 4,5

µM für die niederaffine Stelle. Die Bindungskapazitäten (Bmax) betrugen 41 fmol/mg für die

hochaffine Stelle und 20,1 pmol/mg für die niederaffine Stelle. Da Tolbutamid [3H]Clonidin

nur in Konzentrationen von mehr als 1 mM verdrängte (RUSTENBECK et al., 1999b), war

SUR1 nicht als Korrelat dieser Bindungsstelle anzunehmen. Die Charakteristika der

hochaffinen Stelle unterschieden sich sowohl von denen von I1- als auch von denen von I2-

Rezeptoren. Die schließende Wirkung der Imidazoline auf den KATP-Kanal erforderte bei

einigen Substanzen solche Konzentrationen, bei denen sie nur an die hochaffine Stelle

banden, bei anderen Imidazolinen waren die notwendigen Konzentrationen so hoch, daß auch

eine Bindung an die niederaffine Stelle möglich war. Zudem ließ sich eine Korrelation

zwischen den Affinitäten für die hochaffine und für die niederaffine Stelle nachweisen, so daß

die Frage entstand, ob es sich hier überhaupt um zwei unabhängige Entitäten oder um zwei

verschiedene Formen der gleichen Bindungsstelle handelt (RUSTENBECK et al., 1997a).

Insofern blieb die Beziehung zwischen der Bindung der Imidazoline an diese Stellen und ihrer

hemmenden Wirkung auf den KATP-Kanal unklar.

Ein Hinweis darauf, dass die mit [3H]Clonidin nachgewiesenen

Imidazolinbindungsstellen möglicherweise doch in einem Zusammenhang mit dem KATP-

Kanal stehen, ergab sich durch den Befund, dass auch Chinin [3H]Clonidin von den

nichtadrenergen Bindungsstellen verdrängte (RUSTENBECK, unveröffentliche Beobachtung;

Abb. 4). Chinin steigert in mikromolaren Konzentrationen die Insulinsekretion durch

Hemmung des KATP-Kanals (HENQUIN et al., 1975; BOKVIST et al., 1990a). Auch hier war

die Verdrängung biphasisch mit einem Ki-Wert von 75 nM und einem weiteren von 133 µM.

Die Bindungskapazitäten dieser Stelle entsprachen 17 % und 83 % des verdrängten

Radioliganden. Im Unterschied zu der Verdrängung durch Imidazoline war die Verdrängung

durch Chinin inkomplett (Abb. 4). Es stellte sich also die Frage, ob Chinin den KATP-Kanal

durch Angriff an der porenbildenden Untereinheit (Kir6.2) blockiert, so wie es für das

Imidazolin Phentolamin beschrieben worden war. Dementsprechend könnte Kir6.2 also den

gemeinsamen Bindungsort oder genauer, einen gemeinsamen Bindungsort von Chinin und

Imidazolinen an der B-Zelle darstellen. Deshalb sollte geprüft werden, ob sowohl Clonidin als

auch Chinin in der Lage sind, die Kanalaktivität von Kir6.2 zu hemmen. Diese Wirkungen

sollten dann mit derjenigen auf native KATP-Kanäle und dem Bindungsverhalten verglichen

werden.

Einleitung

10

Abb. 4 Verdrängung von [

3H]Clonidin durch Clonidin und Chinin von HIT-Zellmembranen. Die Inkubationen

wurden in Gegenwart von 100 µM Noradrenalin durchgeführt, so dass α2-Adrenozeptoren maskiert waren, und nur nichtadrenerge Imidazolinbindungsstellen dargestellt sind. Die homologe Verdrängung durch nichtmarkiertes Clonidin () ergab eine biphasische Kurve mit einem Kd-Wert für die hochaffine Stelle von 61 nM, sowie für die niederaffine Stelle von 4,5 µM. Auch Chinin () verdrängte markiertes Clonidin von den nichtadrenergen Bindungsstellen. Die Verdrängung war biphasisch, jedoch nicht vollständing. Die Ki-Werte betrugen 75 nM und 133 µM. Für beide Substanzen ergab sich eine signifikant bessere Kurvenanpassung, wenn ein Modell mit zwei Bindungsstellen statt eines solchen mit einer Bindungsstelle gewählt wurde.

Mit dem Nachweis des KATP-Kanal-unabhängigen distalen Effekts (ZAITSEV et al., 1996)

stellte sich einerseits die Frage, ob die besondere Glucoseabhängigkeit einiger Imidazoline

auf diesem Effekt beruht, andererseits die Frage, ob es nicht überhaupt möglich sein sollte,

durch Strukturvariationen Substanzen zu erhalten, die zwar noch die Insulinsekretion steigern,

nicht mehr aber Hemmstoffe des KATP-Kanals sind. So wurde kürzlich über eine Substanz

(BL11282) mit Imidazolinstruktur berichtet, welche in Gegenwart einer stimulatorischen

Blutglukosekonzentration die Insulinsekretion zu steigern vermochte, ohne die KATP-

Kanalaktivität zu reduzieren (EFANOV et al., 2001).

Sicher ist bei den bisher verwendeten Imidazolinen die Blockade des KATP-Kanals

entscheidend für den insulinotropen Effekt. Diejenigen Imidazoline, die eine starke

stimulatorische Wirkung auf die Insulinsekretion haben, wie z.B. Phentolamin, haben auch

eine ausgeprägte hemmende Wirkung auf den KATP-Kanal (RUSTENBECK et al., 1997a).

Entsprechend diesem Effekt auf den KATP-Kanal zeigte die cytosolische Ca2+-Konzentration

in den B-Zellen bei Phentolamin einen deutlichen Anstieg, wobei die träge Kinetik des durch

Phentolamin induzierten Ca2+-Konzentrationsanstiegs gut mit der langsam einsetzenden

Einleitung

11

Hemmung des KATP-Kanals und dem langsamen Anstieg der Insulinsekretion korrelierte

(RUSTENBECK et al., 1995 und 1997a). Wahrscheinlich ist die Substanzgruppe der

Imidazoline bezüglich der Insulinsekretionssteigerung heterogen, d.h. es ist die Beeinflussung

mehrerer Mechanismen anzunehmen, die, je nach Substanz in unterschiedlichem Ausmaß die

Insulinsekretionsrate beeinflussen. So ist auch die Glucoseabhängigkeit des

sekretionssteigernden Effekts durchaus unterschiedlich. Phentolamin steigerte die

Insulinsekretion auch bei nichtstimulatorischen Glucosekonzentrationen, während Alinidin

und Idazoxan hier nahezu ineffektiv waren (RUSTENBECK et al., 1999a).

Ein Imidazolin, das die gewünschte Selektivität für stimulatorische

Glucosekonzentrationen mit einem starken sekretionssteigernen Effekt verbindet, ist Efaroxan

(MORGAN und CHAN, 2001). Nun hemmt auch Efaroxan den KATP-abhängigen K+-Kanal,

so dass sich durchaus die Perspektive ergibt, dass auch solche Imidazoline, die den KATP-

Kanal blockieren, klinisch verwendbare Substanzen ergeben können. In Hinsicht auf die

mögliche therapeutische Anwendung von Imidazolinen, die den KATP-Kanal schließen, stellte

sich jedoch die Frage, ob ein durch Imidazoline herbeigeführter Schluss des KATP-Kanals

durch physiologische und pharmakologische Kaliumkanalöffner antagonisiert werden kann.

Hierzu lagen nur wenige Daten vor, und sie wiesen darauf hin, dass nur eine minimale

Antagonisierbarkeit möglich ist (PLANT und HENQUIN, 1990).

Zielsetzung und Fragestellung

12

2 Zielsetzung und Fragestellung der Arbeit

Vertreter der Substanzgruppe der Imidazoline sind interessant als potentielle orale

Antidiabetika, da einige von ihnen die Insulinsekretion nur in Gegenwart einer

stimulatorischen Insulinsekretion steigern. Es gibt Hinweise darauf, dass neben dem Schluss

des ATP-abhängigen Kaliumkanals weitere Mechanismen an der Sekretionsauslösung

beteiligt sind. Umstritten ist, ob es einen spezifischen Imidazolinrezeptor (I3-Rezeptor) an der

B-Zelle des Pankreas gibt, und wie seine Beziehung zum KATP-Kanal und den zusätzlichen

insulinotropen Mechanismen ist. In der vorliegenden Arbeit soll die Wirkung der Imidazoline

auf Elemente des „triggering pathways“ der Insulinsekretion genauer charakterisiert werden.

Folgende Fragen sollen bearbeitet werden:

1. In welcher Beziehung steht der KATP-Kanal zu den nichtadrenergen

Imidazolinbindungsstellen, die in der Membran von insulinsezernierenden HIT-Zellen

beschrieben wurden?

1.1. Ist die Hemmung des KATP-Kanals durch Imidazoline ebenso wie diejenige durch

Chinin auf eine Interaktion mit der porenbildenden Untereinheit Kir6.2 des KATP-

Kanals zurückzuführen und kann dadurch die Bindung von Chinin an nichtadrenerge

Imidazolinbindungsstellen von HIT-Zellmembranen erklärt werden?

1.2. Die heterologe transiente Expression der trunkierten porenbildenden Untereinheit

Kir6.2∆C26 sollte etabliert werden und die Wirkung von Imidazolinen und Chinin

auf diesen Kanal mit derjenigen auf den nativen KATP-Kanal verglichen werden.

2. Lässt sich der insulinotrope Effekt, den Imidazoline durch Blockade von Kir6.2 bewirken,

durch physiologische und pharmakologische Kaliumkanalöffner antagonisieren?

2.1. Dazu sollte der Antagonismus der schließenden Wirkung von Imidazolinen auf den

nativen KATP-Kanal durch Diazoxid und GDP in der inside-out Konfiguration geprüft

werden.

2.2. Das Ausmaß der Diazoxid-induzierten Repolarisation sollte unter current-clamp

Bedingungen in der whole-cell Konfiguration geprüft werden.

2.3. Die Auswirkung der Repolarisation auf die cytosolische Ca2+-Konzentration sollte an

intakten perifundierten B-Zellen gemessen werden.

Material und Methoden

13

3 Material und Methoden 3.1 Materialien

[3

H] Clonidin (spez. Aktivität 63,5 Ci/mmol) NEN DuPont, Dreieich

Agar GibcoBrl, Karlsruhe

Agarose Amresco, Solon, Ohio, USA

Agarose (low-melting) FMC Bio Products, Rockland, Me, USA

Alinidin Boehringer, Ingelheim

ATP (Adenosintriphosphat) Boehringer, Mannheim

Ampicillin Boehringer, Mannheim

Bakto-Trypton GibcoBrl, Karlsruhe

Bakto-Yeast-Extrakt GibcoBrl, Karlsruhe

Borsäure Merck, Darmstadt

BSA (Rinderserumalbumin); Fraktion V Bayer Diagnostics GmbH, München

Calciumchlorid Merck, Darmstadt

Chinin Sigma, Taufkirchen

CIAP (calf intestinal alkaline phosphatse) GibcoBrl, Karlsruhe

Clonidin Boehringer, Ingelheim

Collagenase P Boehringer, Mannheim

Diazoxid Sigma, Taufkirchen

DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) GibcoBrl, Karlsruhe

DMSO (Dimethylsulfoxid) Sigma, Taufkirchen

E. coli (Escherichia coli) JM109 Stratagene, La Jolla, USA

E. coli (Escherichia coli) XL1Blue Stratagene, La Jolla, USA

EDTA (Ethylendiamin-N,N,N´,N´- Sigma, Taufkirchen

tetraessigsäure)

EGTA (Ethylenglykol-bis-(ß-aminoethylether)- Sigma, Taufkirchen

N,N,N´,N´-tetraessigsäure)

Elektroporationsküvetten, BioRad, München

2 mm Elektrodenabstand

Ethanol Baker, Deventer, Niederlande

Ethidiumbromid Merck, Darmstadt

Filterpapiere Schleicher & Schüll, Dassel

FCS (Fötales Kälberserum) GibcoBrl, Karlsruhe

Fura-2/AM Molecular Probes, Eugene, OR, USA


14

G418 (Geneticin) GibcoBrl, Karlsruhe

GFX PCR DNA Gel Band Purification Kit Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg

Glibenclamid Boehringer, Ingelheim

Glucose Merck, Darmstadt

Glycerol GibcoBrl, Karlsruhe

HEPES (4-(-Hydroxyethyl)-1- Sigma, Taufkirchen

piperazinethansulfonsäure

Idazoxan Research Biochemicals, Natick, MA,

USA

Isopropanol Baker, Deventer, Niederlande

Kaliumchlorid Merck, Darmstadt

Kanamycin Roche Molecular Biochemicals,

Mannheim

Lipofectamine TM GibcoBrl, Karlsruhe

Magnesiumchlorid Merck, Darmstadt

Magnesiumsulfat Merck, Darmstadt

Mineralöl Sigma, Taufkirchen

Natriumchlorid Merck, Darmstadt

Natriumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt

Natriumhydrogencarbonat Merck, Darmstadt

Natriumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt

Natriumhydroxid Merck, Darmstadt

Natrium-Laurylsarcosin Sigma, Taufkirchen

Noradrenalin Sigma, Taufkirchen

Orange G (8-(Benzolazol),7-hydroxyl, Sigma, Taufkirchen

1,3-naphthlindisulfonsäure)

Penicillin GibcoBrl, Karlsruhe

Phentolamin Ciba-Geigy, Lörrach

Puffer R+ Fermentas, St. Leo-Rot

Puffer Y+/TANGOTM Fermentas, St. Leo-Rot

QIAex II Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden

QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden

QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen, Hilden


15

Restriktionsenzyme Fermentas, St.Leo-Rot

EcoRV

SalI

XbaI

RPMI (Roswell Park Memorial Institute)- GibcoBrl, Karlsruhe

1640 Medium

Salzsäure (37%) Merck, Darmstadt

SDS (Natriumdodecylsulfat) Sigma, Taufkirchen

Spritzenvorfilter, steril, 0,2 µm Porengröße Schleicher & Schüll, Dassel

Streptomycin GibcoBrl, Karlsruhe

Sylgard 184 Silikon Gel Dow Corning Corp., Midland, MI, USA

Komponenten: Silicone Elastomer, Curning Agent

T4-DNA-Ligase GibcoBrl, Karlsruhe

Tolbutamid Serva, Heidelberg

Tris Merck, Darmstadt

Trypsin Biochrom, Berlin

Vektor pAdTrack CMV Qbiogene, Heidelberg

Vektor pcDNA 3 Invitrogen, Karlsruhe

Vektor pECE ratSUR1 Prof. J. Bryan, Baylor College of

Medicine, Houston, USA

Sterile Zellkulturgefäße und Plastiklaborartikel wurden von den Herstellern Biozym,

Eppendorf, Greiner, Nunc und Sarstedt bezogen.

Zur Datenverarbeitung wurde folgende Software verwendet: Microsoft Word 2000,

Microsoft Exel 2000, Adobe Photoshop 6.0, DNASIS 2.1, Graph Pad Prism 3.01, Heka Pulse

3.0, TAC V3.0, TAC Fit und EndNote 3.


16

3.2 Zellkultur und Gewebegewinnung

3.2.1 Zellkulturlinien

3.2.1.1 HEK 293-Zellen

Adenovirus5-transformierte HEK (human embryonic kidney) 293-Zellen (GRAHAM et al.,

1977) wurden in DMEM Medium bei 37°C, 5% CO2 (v/v) und wasserdampfgesättigter

Atmosphäre im Brutschrank kultiviert. Dem Medium wurde noch 10% FCS (v/v), sowie

Penicillin G und Streptomycin zugesetzt. Alle 3-4 Tage wurde das Zellkulturmedium

abgesaugt und durch neues ersetzt.

3.2.1.2 HIT-Zellen

Kultiviert wurde der Subklon T15 der SV40-transformierten, insulinsezernierenden Hamster-

B-Zelle (HIT-Zelle) (SANTERRE et al., 1981). Die Zellen wurden in RPMI 1640 Medium,

dem 10% FCS (v/v), Penicillin G und Streptomycin zugesetzt war, bei 37°C, 5% CO2 (v/v)

und wasserdampfgesättigter Atmosphäre im Brutschrank kultiviert. Alle 3-4 Tage wurde das

Zellkulturmedium abgesaugt und durch neues ersetzt.

3.2.2 Medien und Lösungen für die Zellkultur

3.2.2.1 Kulturmedium DMEM (DMEM Trockenmedium, NaHCO3 , FCS 10% (v/v), 100

µg/ml Streptomycin, 100 U/ml Penicillin)

50,75 g Trockenmedium und 18,5 g NaHCO3 wurden in 4 l autoklaviertem dd H2O unter

Rühren gelöst. Der pH-Wert wurde mit 37-prozentiger HCl auf 7,2 eingestellt. Nach Zugabe

von 500 ml hitzeinaktiviertem FCS und 50 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung wurde das

Volumen auf 5 l mit autoklaviertem dd H2O aufgefüllt und sofort sterilfiltriert.

3.2.2.2 Kulturmedium RPMI 1640 (RPMI 1640 Trockenmedium, NaHCO3 26 mmol/l, FCS

10% (v/v), 100 µg/ml Streptomycin, 100 U/ml Penicillin)

52 g Trockenmedium und 11 g NaHCO3 wurden in 4 l autoklaviertem dd H2O unter Rühren

gelöst. Der pH-Wert wurde mit 37-prozentiger HCl auf 7,15 eingestellt. Nach Zugabe von

500 ml hitzeinaktiviertem FCS und 50 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung wurde das

Volumen auf 5 l mit autoklaviertem dd H2O aufgefüllt und sofort sterilfiltriert.


17

3.2.2.3 PBS (Phosphate buffered saline):

137 mM NaCl 2,7 mM KCl 8,1 mM Na2HPO4 1,8 mM KH2PO4

Die Lösung wurde auf pH 7,4 eingestellt, autoklaviert und bei Raumtemperatur gelagert. 3.2.2.4 EDTA-Stammlösung:

2,0 % (w/v) EDTA

Das EDTA wurde in sterilem PBS gelöst. Die Lösung wurde auf pH 7,4 eingestellt und

autoklaviert. Die Lösung wurde in 5 ml Aliquoten bei –20 °C gelagert.

3.2.2.5 Trypsin-EDTA-Lösung:

10 ml 0,25 % (w/v) Trypsin-Stammlösung 5 ml 2,0 % (w/v) EDTA-Stammlösung 85 ml PBS

Die Lagerung der Lösung erfolgte bei –20 °C. 3.2.2.6 Krebs-Ringer-HEPES-Puffer (für Einzelzellen):

789 mg NaCl [135 mM] 36 mg KCl [4,8 mM] 16 mg KH2PO4 [1,2 mM]

30 mg MgSO4 •7H20 [1,2 mM] 596 mg HEPES [25 mM] 19 mg EGTA [500 µM] 54 mg Glucose [3,0 mM]

Die Elektrolyte, EGTA, Glucose und HEPES wurden in 100 ml dd H2O gelöst und mit 1N

NaOH auf pH 7,4 titriert. Nach Erreichen des gewünschten pH´s wurde 1% (v/v) BSA

hinzugefügt.

3.2.3 Zellpassagierung

Alle 6-8 Tage, bei den HEK293-Zellen eher noch in kürzeren Abständen, waren die 10 cm

Petrischalen dicht bewachsen, so dass die Zellen umgesetzt werden mussten. Das

Kulturmedium wurde abgesaugt, danach wurden die anhaftenden Zellen vorsichtig mit 4 ml

PBS gewaschen, da FCS die Trypsinaktivität hemmt. Zur Ablösung der Zellen von der

Petrischale wurden 2,5 ml Trypsin/EDTA-Lösung zugegeben und 3 min im Brutschrank

inkubiert. Durch Zugabe von 2 ml FCS-haltigem Zellkulturmedium wurde die

Trypsinwirkung gestoppt. Das Medium wurde mit einer Pipette aufgenommen und zum


18

Abspülen der Zellen verwendet. Etwa dreimal wurde die Petrischale abgespült und das

Medium mit den abgelösten Zellen in einem sterilen 15 ml Zentrifugenröhrchen

aufgenommen. Die Zellen wurden bei 300 g zentrifugiert (Biofuge primo, Heraeus) und der

Überstand verworfen. 1,3 µl (Erfahrungswert) des Zellpellets wurden abgenommen und in 10

ml Zellkulturmedium auf einer neuen 10 cm Petrischale gründlich resuspendiert.

Die Zellkonzentration in einer Suspension wurde mittels einer Neubauer-Zählkammer

bestimmt. In einem definierten Volumen wurde unter dem Lichtmikroskop die Zellzahl

ausgezählt. Die Neubauer-Zählkammer besteht aus 16 Quadraten, wobei jedes Quadrat eine

Fläche von 1 mm2 hat. Dies ergibt bei einer Tiefe von 0,1 mm ein Volumen von 0,1 µl. Die

Multiplikation des berechneten Mittelwerts mit 104 ergibt somit die Zellzahl pro ml. Der

Verdünnungsfaktor der Zellsuspension multipliziert mit der Zellzahl pro ml ergibt die

Gesamtzellzahl.

3.2.4 Gewinnung von Pankreasinseln

Eine NMRI Maus wurde mit Diethylether betäubt und durch Genickschnitt getötet. Das Fell

wurde mit Ethanol geglättet. Im unteren Bauchbereich wurde die Haut bis zum Brustbein

durchtrennt. Danach wurde das subkutane Fettgewebe von der Abdominalmuskulatur getrennt

und die Muskulatur aufgeschnitten. Das Pankreas wurde dargestellt und möglichst

fettgewebefrei herauspräpariert. Das Pankreas wurde in Krebs-Ringerlösung überführt und

von verbliebenem Fettgewebe getrennt. Nach Überführung in eine neue Petrischale mit 2 ml

Krebs-Ringer wurde das Pankreas sorgfältig mit einer Schere zerkleinert. Die

Gewebesuspension wurde mit einer Pipette aufgenommen und zu 1 mg Kollagenase in ein 5

ml Glasgefäß gegeben. Die Suspension wurde kräftig durchmischt, in einem auf 37 °C

temperiertem Schüttelwasserbad eingespannt und für 10 min unter Schütteln (5 Hz) inkubiert.

Der Reaktionsstop erfolgte durch das Auffüllen der Flasche mit kaltem Krebs-Ringer-

Medium. Anschließend sedimentierten die Inseln für 5 min bei RT. Der Überstand wurde

verworfen und das Glasgefäß mit neuem Krebs-Ringer-Medium aufgefüllt. Der Inhalt wurde

in eine 10 cm Petrischale gegeben. Das Glasgefäß wurde mit 5 ml Krebs-Ringer nachgespült,

und der Inhalt wiederum in die Petrischale gegeben.


19

3.3 Molekularbiologische Methoden

3.3.1 Geräteliste

AvantiTM J-25 Zentrifuge Beckmann, München

BIORAD Gene Pulser BioRad, München

Kodak Digitalkamera Kodak, Rochester, USA

(Kodak Digital ScienceDC40)

Electrophoresis Power Supply EPS 200 Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg

Elektrophoresekammer Horizon 58 GibcoBrl, Karlsruhe

(+ Gelträger, Kämme und Keile)

Eppendorf Jürgens Zentrifuge 5417C Eppendorf, Hamburg

Gelgußdeck GibcoBrl, Karlsruhe

GFL 3032 Schüttler GFL, Gesellschaft f. Labortechnik, Burgwedel

Lambda Bio UV/VIS Spektrometer Perkin Elmer, Überlingen

Quarzküvette Hellma, Mühlheim/Baden

UV Transilluminator (254/366 nm) Vetter GmbH, Wiesloch

3.3.2 Ausgangs- und Expressionsplasmide

Die cDNA der trunkierten porenbildenden Untereinheit des KATP-Kanals (Kir6.2∆C26)

wurde freundlicherweise von F. Ashcroft im Expressionsvektor pcDNA3 (Abb. 5B) zur

Verfügung gestellt. Dieser Vektor enthielt Resistenzmarker für Ampicillin und Neomycin und

konnte direkt für stabile Transfektionen verwendet werden. Ferner konnte die cDNA von

Kir6.2∆C26 mit den geeigneten Restriktionsendonukleasen EcoRV und XbaI aus dem

pcDNA3 Vektor geschnitten werden, um sie in das pAdTrackCMV Plasmid (HE et al., 1998)

zu subklonieren. Dieses cDNA-Fragment war ca. 1,4 kB groß. pAdTrackCMV Kir6.2∆C26

(Abb. 5A) enthielt außerdem die codierende Sequenz für das grünfluoreszierende Protein

(GFP). GFP ermöglichte die Detektion erfolgreich transient transfizierter Zellen, mit denen

Patch-Clamp Experimente durchgeführt wurden (CHALFIE et al., 1994). Die cDNA von

SUR1, der regulativen Untereinheit des KATP-Kanals der Ratte, lag im pECEratSUR1 Vektor

(Abb. 5C) vor. Die cDNA der ratSUR1 konnte mit den Restriktionsendonukleasen SalI und

XbaI herausgetrennt werden und ebenfalls in den pAdTrackCMV subkloniert werden. Das

cDNA-Fragment war ca. 5 kB groß. Mit pAdTrackCMV ratSUR1 wurde wiederum die

Grünfluoreszenz zur Detektion der erfolgreichen Koexpression von SUR1 in HEK293

Kir6.2∆C26 Zellen genutzt.


20

Abb. 5 Strukturen des klonierten Expressionsvektors pAdTrackCMV Kir6.2∆C26 (A) und der Ausgangs- und

Expressionsvektoren pcDNA3 mit den relevanten Schnittstellen EcoRV und XbaI (B) und pECE ratSUR1 mit den relevanten Schnittstellen SalI und XbaI (C).

3.3.3 Manipulation der Plasmid-DNA

Die Plasmid-DNA wurde mit Restriktionsendonukleasen in dem vom Hersteller

mitgelieferten Puffersystem bei empfohlener Temperatur- (Trio-Thermoblock, Biometra),

Mengen- und Zeitkonstante hydrolysiert. Neben dem präparativen Zweck der Restriktion

wurden zur Überprüfung einer erfolgreichen Subklonierung Restriktionsanalysen

durchgeführt. Nach dem Restriktionsverdau schloss sich ein Aufreinigungsschritt an.


21

Durch die Inkubation mit alkalischer Phosphatase (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase

CIAP) wurden die Phosphatreste an den 5´- und 3´-Enden der Plasmid-DNA abgespalten.

Dadurch wurde eine Religation des Vektors vermieden und die Effizienz der Subklonierung

erhöht. Die Dephosphorylierung wurde mit 1 U CIAP in dem vom Hersteller gelieferten

Reaktionspuffer (50 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,5) bei 37°C für 30 min durchgeführt. Das

Reaktionsvolumen betrug 50 µl. Das nachfolgende Erhitzen auf 72°C für 10 min führte zur

Inaktivierung des Enzyms.

Die Aufreinigung der beim Restriktionsverdau entstandenen DNA-Fragmente erfolgte mit

dem GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit von Amersham Pharmacia Biotech oder

dem QIAex II Gel Extraction Kit von Qiagen nach Herstellerangaben.

Die komplementären kohäsiven Enden der jeweiligen cDNA und des Plasmids, die nach dem

Restriktionsverdau entstanden sind, wurden im molaren Verhältnis von 3:1 für 16 h bei 16°C

ligiert. Die Inkubation von insgesamt 300 ng DNA erfolgte mit 0,1 U T4-DNA-Ligase in

Ligasepuffer (66 mM Tris, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1mM ATP, pH 7,5). Das

Reaktionsvolumen betrug 20 µl.

3.3.4 Herstellung elektrokompetenter E.coli-Bakterien

Um eine Bakterienmembran für Plasmide permeabel zu machen, kann neben chemischen

Verfahren mit divalenten Kationen (Ca-Phosphat) ein starkes elektrisches Feld verwendet

werden (Elektroporation). Um E.coli-Bakterien durch Elektroporation mit Plasmid-DNA

transformieren zu können, ist es erforderlich, die Bakterien mit sequenziellen Waschschritten

in ein salzarmes Medium zu überführen. Wenn ein starkes elektrisches Feld (5 kV/cm)

angelegt wird, kann die Membran für 4 ms desintegriert werden, ohne dass die Bakterien

sterben. Die Aufnahme der Plasmid-DNA wird damit möglich.

Folgende E.coli-Stämme wurden verwendet: E.coli JM109 mit dem Genotyp: EndA, recA1,

gyrA96, thi, hsdR17 (rk-, mk

+), relA1, supE44, λ-, ∆(lac-proAB), [F´,traD36, proA+B+,

laclqZ∆m15] und E.coli XL1 Blue mit dem Genotyp: RecA1, endA, gyrA96, thi-1, hsdR17,

supE44, relA1, lac, [F´, proA+B+, laclqZ∆m15, Tn10 (Tetr)].


22

400 ml LB-Medium (1% (w/v) Bakto-Trypton, 0,5% (w/v) Bakto-Yeast-Extrakt, 1% (w/v)

NaCl, pH 7,0) wurden mit 4 ml einer E.coli-Vorkultur angeimpft und in einem Rundschüttler

(GFL 3032) bei 37°C und 220 rpm inkubiert, bis eine OD660 nm von 0,7 erreicht wurde.

Anschließend wurde die Bakteriensuspension für 30 min auf Eis gekühlt, bevor die Bakterien

15 min bei 4°C und 4000 g pelletiert (AvantiTM J-25 Zentrifuge, Beckman) wurden. Der

Überstand wurde dekantiert und das Pellet vorsichtig in 400 ml 10%igem (v/v) Glycerol

resuspendiert. Es folgten weitere Zentrifugations- und Waschschritte, in denen das Volumen

der 10%igen (v/v) Glycerollösung schrittweise verringert wurde. Am Ende waren die

Bakterien in 1 ml 10%igem (v/v) Glycerol konzentriert. Sie wurden in 60 µl Aliquoten bei

–70°C gelagert.

3.3.5 Transformation kompetenter E.coli-Bakerien durch Elektroporation

Zunächst kühlte man die Elektroporationsküvette (BioRad, 2 mm Elektrodenabstand) auf Eis

vor. In der Zwischenzeit wurden 40 µl einer Suspension elektrokompetenter E.coli-Bakterien

aus den gelagerten Aliquoten schonend auf Eis aufgetaut und in die Küvette überführt. 1 µl

des Ligationsansatzes (entsprechend ca. 50 ng Plasmid-DNA) wurde auf die

Bakteriensuspension pipettiert und gut durchmischt. Die Kontakte an der Küvette wurden

getrocknet und in die Elektroporationskammer (BioRad Gene-Pulser) eingesetzt. Die

Bakterien wurden für 4-5 ms einer elektrischen Spannung von 2,5 kV bei einer Kapazität von

25 µF und einem Widerstand von 200 Ω ausgesetzt. Im Anschluss wurden die gepulsten

Bakterien in 0,5 ml SOC-Medium aufgenommen. Das SOC-Medium wurde aus dem LB-

Medium entwickelt und bestand aus: 2% (w/v) Bakto-Trypton, 0,5% (w/v) Bakto-Yeast-

Extrakt und sowie 0,5% (w/v) NaCl; vor dem Gebrauch wurde das Medium mit 5 mM MgCl2

und 20 mM Glucose komplettiert. Um die Expression der Resistenzgene zu gewährleisten,

wurde der Ansatz für 1 h bei 37°C und 220 rpm im Rundschüttler inkubiert.

Danach wurden 100-250 µl der Kultur mit einem sterilen Glasspatel auf eine LB-

Agarplatte mit Selektionsmedium ausplattiert, und die Platte über Nacht bei 37°C inkubiert.

Die gewachsenen Klone waren antibiotikaresistent und konnten auf das rekombinante

Plasmid untersucht werden. Der LB-Agar wurde folgendermaßen hergestellt: 1% (w/v)

Bakto-Trypton, 0,5% (w/v) Bakto-Yeast-Extrakt, 1,2% (w/v) Agar und 1% (w/v) NaCl

wurden in 1000 ml dd H2O suspendiert und autoklaviert. Die Agarlösung wurde auf 50°C

abgekühlt, und dann Kanamycin (Endkonzentration 25 µg/ml) als Antibiotikum

hinzupipettiert. Je 20 ml Agarlösung wurden in eine 9 cm Petrischale gegossen und nach dem

Aushärten bis zu einem Monat bei 4°C gelagert.


23

3.3.6 Isolierung und Aufreinigung von Plasmid-DNA aus Bakterien (Mini-, Maxiprep)

Die auf den Agarplatten gewachsenen Klone wurden mit einer ausgeglühten Öse in 2 ml

kanamycinhaltiges (25 µg Kanamycin/ml) LB-Medium überführt und im Rundschüttler bei

37°C und 220 rpm über Nacht (ca. 16 h) inkubiert. 1 ml der Bakterienkulturen wurde zur

Isolation der Plasmid-DNA von der bakteriellen DNA mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit

(Qiagen) nach Herstellerangaben einer alkalischen SDS-Lyse unterzogen. Das erhaltene, reine

Plasmid der positiven Klone wurde in 75 µl dd H2O aufgenommen und für Transfektions-

oder Transformationszwecke bei –20°C gelagert. Die positiven Klone selbst wurden mit

Glycerol stabilisiert und bei –70°C gelagert. Es wurden dafür 150 µl Glycerol in einem

Eppendorfgefäß vorgelegt und 850 µl der Übernachtkultur hinzupipettiert und gut gevortext.

Maxipreps wurden zur Isolation größerer Mengen hochreinen Plasmids benötigt. Dazu

wurden 15 µl des bei RT aufgetauten stabilisierten Bakterienstocks in 250 ml LB-Medium mit

Kanamycin (25 µg/ml) im Rundschüttler bei 37°C und 220 rpm über Nacht vermehrt. Die

Isolation erfolgte nach dem gleichen Prinzip wie bei der Miniprep nur in anderem Maßstab

mit dem QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben.

3.3.7 Agarosegelelektrophorese

Zu analytischen und präparativen Zwecken wurden die DNA-Fragmente mittels horizontaler

Agarosegelelektrophorese aufgetrennt (Abb. 6A u. 6B). Die Konzentration des Agarosegels

ist dabei abhängig vom Molekulargewicht der aufzutrennenden DNA. Für DNA >1000 bp

wird in der Regel ein 1%iges Agarosegel verwendet, bei DNA < 1000 bp ein 3%iges

Agarosegel.

Abb. 6A Auftrennung der Plasmid-DNA isolierter Bakterienklone durch Gelelektrophorese. 10 Klone (Bahnen 3 – 12) aus der Transformation von E.coli JM109 mit dem ligierten pAdTrackCMVKir6.2 ∆C26 liefen gegen einen Längenstandard (kB-Leiter; Bahn 1) und den ursprünglichen Vektor pAdTrackCMV (Bahn 2) in einem 0,8 %-igen Agarosegel. Die aus den Klonen 1-9 isolierten Plasmide hatten eine geringere Wanderungs-geschwindigkeit als der ursprüngliche Vektor, was auf ein höheres Molekulargewicht schließen ließ und darauf, dass das Insert erfolgreich aufgenommen wurde. Klon 10 hatte eine höhere Wanderungsgeschwindigkeit, war daher negativ und wurde verworfen.


24

Die hier verwendete Agarosekonzentration betrug 0,8 %. Dazu wurde die Agarose unter

Aufkochen in der Mikrowelle in TBE-Puffer gelöst und mit 1 µl Ethidiumbromid zur

Fluoreszenzmarkierung der DNA-Banden versetzt. Anschließend wurde die Lösung auf den

im Gelgußdeck (Gibco Brl) fixierten Gelträger + Kamm (Gibco Brl) luftblasenfrei gegossen.

Nach dem Aushärten des Gels wurde der Gelträger in die Elektrophoresekammer (Horizon 58

Elektrophoresekammer, Gibco Brl) überführt und der Kamm entfernt. Die aufzutrennenden

DNA-Fragmente wurden mit 0,1 Vol. Orange G-Puffer gemischt und in die Geltaschen

gefüllt. In eine Geltasche wurde ein DNA-Längenstandard (kB-Leiter) zur Orientierung

pipettiert. Die Elektrophorese vollzog sich bei einer Spannung von 60-120 V. Die

Spannungsdifferenz ergab sich aus der verwendeten Agarose. Musste eine In-Gel-Ligation

durchgeführt werden, um z.B. einen Aufreinigungsschritt zu sparen, wurde eine low-melting-

Agarose verwendet, die sich bei Spannungen oberhalb von 60 V zersetzen würde. Mit einem

UV-Transilluminator (Vetter) wurden die DNA-Fragmente bei einer Wellenlänge von 254 nm

sichtbar gemacht und mit einer Digitalkamera (Kodak) dokumentiert. Für präparative Zwecke

wurden die Banden aus dem Gel geschnitten und aufgereinigt.

Abb. 6B Restriktionsschnittanalyse der Plasmid-DNA

isolierter Bakterienklone aus der Transformation von

E.coli JM109 mit dem ligierten pAdTrackCMVKir6.2

∆C26. Dafür wurde die Plasmid-DNA von den

Restriktionsenzymen EcoRV und XbaI geschnitten und in

einem Agarosegel gegen einen Längenstandard (kB-

Leiter; Bahn 1) laufen gelassen. Die Fragmente

entsprachen den Größen des Inserts (~ 1,4 kB) und des

linearisierten Plasmids (~ 9,2 kB). Abgebildet ist ein

Ausschnitt des Gels mit der kB-Leiter des

Längenstandards und 3 positiven Klonen.

3.3.8 Technik der transienten Transfektion

Neben den Möglichkeiten mittels divalenter Kationen oder Dextranen Zellen zu transfizieren,

gelingt dies auch mit Lipofectamine™, einem kationischen Liposomkomplex. Dazu wurden

am Vortag der Transfektion die zu transfizierenden HEK293-Zellen abtrypsiniert, ausgezählt

und in einer Zahl von 3x105 Zellen auf 35 mm Petrischälchen ausgesät. Die Schälchen

wurden im Brutschrank über Nacht kultiviert. Die transiente Transfektion wurde

folgendermaßen durchgeführt: 1 µg Plasmid (pAdTrack CMV Kir6.2∆C26) und 5 µl

Lipofectamine™ wurden in je 100 µl serumfreies DMEM pipettiert. Es musste serumfrei


25

gearbeitet werden, weil FCS die Transfektion behindern würde. Beide Ansätze wurden

vereint und 45 min bei Raumtemperatur stehengelassen. In diesem Zeitraum konnte sich der

DNA-Liposom-Komplex ausbilden. In der Zwischenzeit wurden die ausgesäten HEK293-

Zellen aus dem Brutschrank genommen und das Nährmedium abgesaugt. Anschließend

wurde der Zellrasen mit serumfreien DMEM gespült und 800 µl serumfreies DMEM

vorgelegt. Der Liposom-Plasmid-Ansatz wurde dazugegeben. Die Zellen wurden dann im

Brutschrank inkubiert. Nach 6 h wurde das Transfektionsmedium abgenommen, und die

Transfektion durch Zugabe von 2 ml FCS-haltigem DMEM abgestoppt. Die Zellen wurden

im Brutschrank weiter kultiviert. 18 bis 36 h später war eine Erfolgskontrolle unter

Fluoreszenzanregung (470 nm) möglich. Etwa 5-10 % der Zellen waren transfiziert (Abb. 7).

Die transfizierten Zellen konnten in den folgenden 48 h für Patch-Clamp Experimente genutzt

werden.

Abb. 7 Nachweis von erfolgreich transfizierten HEK293-Zellen durch GFP-Fluoreszenz. HEK293-Zellen wurden transient mit der cDNA der trunkierten porenbildenden Untereinheit des KATP-Kanals (Kir6.2∆C26) transfiziert (A). Die Zellen, die den Kanal exprimieren, sind nach Fluoreszenzanregung (470 nm) an der GFP-Fluoreszenz erkennbar (B).

3.3.9 Technik der stabilen Transfektion

Im Gegensatz zu der transienten Transfektion wird mit der stabilen Transfektion Fremd-DNA

dauerhaft in eine Zelle eingebracht. Nachteil des Verfahrens gegenüber der transienten

Transfektion ist allein der Zeitfaktor, da sich eine stabile Transfektion über Monate hinziehen

kann. Der Vorteil ist, dass alle Zellen die erwünschte genetische Information beinhalten. Als

Expressionsvektor diente das pcDNA3 Kir6.2∆C26 Plasmid, welches ein Resistenzgen für

das Aminoglykosid Geneticin (G418; Stammlösung: 500 mg/20 ml PBS) enthielt. 24 h vor


26

der Transfektion wurden 5x105 HEK293-Zellen pro 6 cm Petrischale abtrypsiniert, ausgezählt

und ausgesät. Die Zellen wurden über Nacht im Brutschrank kultiviert. Am folgenden Tag

wurden in zwei Ansätzen 7 µg pcDNA3 Kir6.2∆C26 und 15 µl Lipofectamine™ in

serumfreies DMEM-Medium pipettiert (Endvolumen: 600 µl). Beide Ansätze wurden vereint

und 45 min bei Raumtemperatur stehengelassen. In der Zwischenzeit wurden die vortags

ausgesäten HEK293-Zellen FCS-frei gewaschen und 2,4 ml serumfreies DMEM vorgelegt.

Das DNA-Lipofectamine-Gemisch wurde dazugegeben und durch vorsichtiges Schwenken

auf den Zellen gleichmäßig verteilt. Die Petrischalen wurden dann im Brutschrank inkubiert.

Nach 6 h Inkubation wurde das Tranfektionsmedium durch komplettes DMEM-Medium

ersetzt und so die Transfektion abgestoppt. Nach 48 h wurde bei jedem Mediumwechsel G418

(150 µl/5 ml Medium) hinzugefügt, so dass die Zellen unter Selektionsdruck weiterwuchsen.

Die resistenten Zellen wurden weiterkultiviert bzw. für eine spätere Verwendung eingefroren,

nicht-resistente Zellen starben ab.

3.4 Die Patch-Clamp Technik

3.4.1 Aufbau des Messstands

Zum Messstand gehörten:

1) EPC 9 Patch-Clamp-Verstärker (HEKA)

2) EPC 9 Vorverstärker mit Pipettenhalter

3) Patch-Clamp-Software (Pulse + Pulse Fit/ HEKA)

4) Hydraulischer Narishige-Mikromanipulator (XYZ-Kombination)

5) Axiovert 135 TV Mikroskop (hier: invers) mit 3 Objektiven und Objekttisch

6) Schwingungsgedämpfter Messtisch (Nanofilm Technologie GmbH)

7) Farrand Spektralfluorometer Mark 1 (Kontron Technik)

8) Pentium II Rechner

Mit der Patch-Clamp-Technik lassen sich sehr kleine elektrische Ströme (pA-Bereich)

messen. Diese Signale wurden häufig von elektrischem Hintergrundrauschen überlagert. Mit

Hilfe eines Faraday-Käfigs ließ sich das Rauschen im niederfrequenten Bereich (50

Hz/Netzbrummen) reduzieren. Ursache der elektromagnetischen Störfelder ist meist das

öffentliche Stromnetz, welches das Rauschen durch die metallischen Komponenten und

stromführenden Kabel in den Messaufbau überträgt. Der Faraday-Käfig umhüllte die


27

Messanlage, und alle Teile des Käfigs waren elektrisch leitend miteinander verbunden. Die

Komponenten der Anlage wurden sternförmig geerdet.

Patch-Clamp-Messungen werden durch geringste Bewegungen zwischen Präparat und

Pipette gestört. Deswegen war es erforderlich, den Messplatz vor mechanischen

Schwingungen und Erschütterungen abzuschirmen. Hierzu wurde ein schwingungsgedämpfter

Tisch (Nanofilm Technologie GmbH) verwendet. Auf diesem Tisch befanden sich

Mikroskop, Zellbad und Mikromanipulator mit Pipettenhalter. Der schwingungsgedämpfte

Tisch wurde von einem weiteren Tisch mit einer entsprechenden Aussparung eingerahmt, so

dass sich eine kleine Arbeitsfläche ergab, die Erschütterungen (z.B. durch Abstützen des

Bedieners) nicht auf das Messsystem übertrug.

Das inverses Mikroskop (Zeiss-Axiovert 135TV) wurde benötigt, um die Patch-Pipette an die

zu messende Zelle heranzuführen. Bei dem inversen Mikroskop ist das Objektiv unterhalb des

Tischs angeordnet. Vorteilhaft war, dass somit oberhalb des Mikroskoptischs viel Platz für die

restlichen Komponenten (Messpipette, Badperfusion etc.) verblieb. Zum Fokussieren wurde

nicht der Mikroskoptisch bewegt, sondern das Objektiv.

3.4.2 Zellbad und Umströmungssystem

In diesem Messstand wurden die Testsubstanzen mit der Badlösung an die Zellen gebracht.

Die Konzentration der Testsubstanzen am Wirkort änderte sich also nur mit der

Geschwindigkeit, mit der sich die Lösung im ganzen Zellbad austauschte. Es handelte sich

somit um ein langsames Umströmungssystem. Mittels eines Pumpsystems (Rollenpumpe/

Desaga) und zweier 25 ml Spritzen, die sich am Messtisch fixieren ließen, wurden die

entsprechenden Badlösungen gleichmäßig dem Zellbad zugeführt. Die Badlösung wurde

gefiltert in Kunststoffschläuche gedrückt, die an einem Vierwegehahn (Stämpfli-Hahn)

zusammenliefen. Der Stämpfli-Hahn war der Glastropfkammer, welche am Mikroskoptisch

fixiert wurde, vorgeschaltet. Neben den zwei zuführenden Schläuchen und dem zum Zellbad

führenden Schlauch war ein weiterer, abführender Schlauch am Stämpfli-Hahn

angeschlossen, der es ermöglichte, vor der eigentlichen Messung die Schläuche luftblasenfrei

zu füllen, um einen schnellen Lösungswechsel zu garantieren.

Das Zellbad bestand aus einem 35 mm Petrischälchen, in dessen Mitte die zu

messenden Zellen angewachsen waren. In dieses Schälchen wurde ein runder Plexiglasblock

gesetzt, der konisch ausgebohrt war, daß sich eine zentrale Öffnung ergab. In dieser Öffnung

befanden sich die angewachsenen Zellen. Weiterhin waren in den Flanken des

Plexiglasblocks drei Aussparungen für den Badzulauf, die Referenzelektrode und für die


28

Absaugung gefräst. Da die Aussparung für die Absaugung weniger tief als der Zulauf

eingefräst war, ergab sich dadurch die Pegelhöhe der Badflüssigkeit.

3.4.3 Herstellung der Patch-Pipetten

Die Pipetten wurden aus mittelhartem Borosilikatglas hergestellt. Borosilikatglas wird wegen

seiner vorteilhaften elektrischen Eigenschaften benutzt. So ist das Rauschen geringer als bei

weichen Glastypen. Die Kapillaren wurden aus Glasmeterware auf eine Länge von 7,5 cm

zugeschnitten. Die scharfkantigen Enden der Glaskapillaren wurden dann mit Hilfe eines

Bunsenbrenners abgerundet, um später beim Einspannen der Pipette in den Pipettenhalter die

Silberchloridschicht der Elektrodendrähte so wenig wie möglich anzukratzen. Die

Glasrohlinge sollten staub- und fettfrei sein. Aus den so vorbereiteten Glaskapillaren wurden

dann mit Hilfe des vertikalen Pipettenziehgerätes (L/M-3P-A; List Electronics) in einem

zweiphasigen Ziehvorgang die Patch-Pipetten hergestellt. Die 7,5 cm lange Glaskapillare

wurde so eingespannt, dass ihre Mitte von einem zirkulären, aus Nickel-Chrom-Draht

bestehenden Heizfilament umgeben war. Dann wurde durch eine Unterlegscheibe die Länge

des ersten Zuges auf 9 cm eingestellt. Die Heizstromintensität für den ersten Ziehvorgang

wurde mit dem Potentiometer A eingestellt. Das Heizfilament erwärmte sich und konnte

somit die Glaskapillare in der Mitte erweichen. Die Glaskapillare wurde durch die

Schwerkraft nach unten gezogen, bis sie durch die Unterlegscheibe gestoppt wurde. Nach

diesem Vorgang, bei dem sich die Mitte der Glaskapillare verjüngt hatte, musste die Kapillare

nach Abkühlen erneut so zentriert werden, dass ihre verengte Mitte von dem Heizfilament

umgeben war. Bei dem nun folgenden zweiten Ziehvorgang wurde durch die Unterlegscheibe

eine Ziehlänge von 12,8 cm bestimmt und die Glaskapillare in dieser Position an der oberen

Halterung fixiert. Die Unterlegscheibe wurde anschließend von der Kapillare entfernt. Nun

wurde der zweite Ziehvorgang wie oben beschrieben über das Potentiometer B mit

niedrigerem Heizstrom durchgeführt bis es zum Abreißen an der kapillär verengten Stelle

kam. Das Ergebnis waren zwei einzelne Pipetten identischen Typs. Der Strom betrug im

ersten Ziehvorgang 22 A und beim zweiten Ziehvorgang 14-15 A. Der zweite Ziehvorgang

war für den Durchmesser der Pipettenspitze ausschlaggebend. Der Strom des zweiten

Ziehvorgangs musste so eingestellt werden, dass die Pipettenspitzen einen Durchmesser von

1-2 µm hatten. Der Widerstand, der mit der Pipettenlösung gefüllten Pipetten, lag dann

zwischen 3 und 8 Megaohm.

Um die Pipetten-Bad-Kapazität und damit störendes Rauschen bei

Einzelkanalmessungen zu reduzieren, wurden die Pipetten mit einem Silikongel ummantelt.


29

Das Silikongel setze sich aus zwei Komponenten zusammen: Sylgard 184 Silicone Elastomer

und Sylgard 184 Curning Agent. Nach Vermischen dieser beiden Komponenten im Verhältnis

10:1 wurde das Silikongel auf kleine Plastikgefäße verteilt und mit entsprechenden Deckeln

verschlossen. In einer Kühltruhe konnte das Silikongel bei -40°C über mehrere Monate

gelagert werden. Durch das Ummanteln mit dem Silikongel wurde die Wandstärke der

Pipettenspitze vergrößert und somit die Kapazität gesenkt. Außerdem wurde durch die

hydrophobe Beschichtung verhindert, dass sich ein langer Wasserfilm am Schaft der Pipette

hochzog, welcher ebenso das kapazitive Rauschen erhöhen würde. Dazu wurde jede einzelne

Pipette an ihrem Schaft in der Haltevorrichtung des Pipetten-Coating/Polishing-Gerätes auf

dem inversen Labormikroskop (10-fache Vergrößerung, Fa. Nikon) gespannt. Nun wurde mit

einem dünnen Metallhäkchen die Pipettenspitze mit dem Silikongel ummantelt. Die ersten

200 µm der Spitze sollten frei bleiben, weil einige niedermolekulare Komponenten im

Silikongel mit dem Füllen der Pipette und auch mit der Herstellung des Gigaohmseals

interferieren könnten (AUERBACH und SACHS, 1985). Nach dem Umhüllen wurde das

Silikongel getrocknet, indem über die Spitze der Glaskapillare das Heizfilament des Gerätes

aus Platin-Iridium-Draht geschoben wurde. Das Heizfilament war über einen Schlauch mit

einem Druckluftanschluss verbunden, so dass bei Betätigung des Fußpedals und der zuvor

gewählten Funktion „Coating“ heiße Luft auf die Pipette gelenkt wurde. Die Stromstärke

betrug etwa 1 A.

Um eine Verletzung der Zellmembran durch eine scharfe Abrisskante an der

Pipettenspitze zu verhindern, wurden die Pipettenspitzen hitzepoliert. Zudem wurden nach

Polieren höhere Abdichtwiderstände erreicht. Nach dem Beschichten der Pipette mit

Silikongel ist das Polieren unumgänglich. Dazu verblieb die Pipette in der Haltevorrichtung

des oben beschriebenen Gerätes. Durch Umschalten der Hebel auf „Polishing“ erwärmte sich

der Draht, in dessen unmittelbare Nähe die Pipettenspitze zuvor gebracht wurde und dort für

10-20 Sekunden belassen wurde. Der Draht wurde mit etwa 2 A gespeist. Die Pipetten sollten

innerhalb von 2-3 Stunden nach Herstellung benutzt werden.

Die Pipetten wurden je nach Messkonfiguration mit der erforderlichen Lösung (EZ

bzw. IZ) gefüllt. Um das Füllen möglichst luftblasenfrei zu gewährleisten, wurde die

Pipettenspitze in einen mit Pipettenlösung gefüllten Behälter gehalten, so dass sich die ersten

1-2 mm der vorderen Spitzenverengung über Kapillarkräfte füllten. Danach wurde die

restliche Lösung mittels einer 1 ml Spritze, plus Sterilfilter und eines schmalen

Kunststoffschlauchs in die Pipette gespritzt, bis diese etwa zu einem Drittel gefüllt war.

Etwaige Luftblasen konnten durch vorsichtiges Beklopfen der Pipette gelöst werden.


30

3.4.3.1 Stammlösungen der Testsubstanzen

-Alinidin (1 mM)

2,92 mg Alinidin wurden in 10 ml dd H2O gelöst und waren bei 4°C in einem

lichtgeschützten Gefäß über mehrere Tage haltbar.

-Chininstammlösung (10 mM)

5,33 mg Chinin wurden in 2 ml dd H2O gelöst und waren bei 4°C lichtgeschützt über

mehrere Tage haltbar.

-Clonidinstammlösung (1 mM)

2,66 mg Clonidin wurden in 10 ml dd H2O gelöst und waren bei 4°C in einem

lichtgeschützten Gefäß über mehrere Tage haltbar.

-Glibenclamidstammlösung (1 mM)

4,92 mg Glibenclamid wurden in 1ml 0,05 N NaOH gelöst, mit 9 ml dd H2O auf 10 ml

aufgefüllt und waren bei 4°C über mehrere Tage haltbar.

-Phentolaminstammlösung (10 mM)

18,9 mg Phentolamin wurden in 5 ml dd H2O gelöst. Die Lösung war bei -20°C über

mehrere Wochen haltbar.

-Tolbutamid (1 mM)

2,7 mg Tolbutamid wurden in 1 ml 0,05 N NaOH gelöst und mit 9 ml dd H2O aufgefüllt.

Die Lösung war bei -20°C über mehrere Wochen haltbar.

3.4.4 Lösungen für die Patch-Clamp-Versuche

Die Pipettenlösung enthielt: 140,0 mM KCl 1,0 mM MgCl2

2,0 mM CaCl2

10,0 mM EGTA 5,0 mM HEPES Die Lösung wurde mit 1 N KOH auf einen pH-Wert von 7,15 eingestellt.


31

3.4.4.1 Badlösungen:

Die Extrazellulärlösung (EZ) für den cell-attached Modus enthielt: 140,0 mM NaCl 5,6 mM KCl 2,6 mM CaCl2

1,2 mM MgCl2 10,0 mM HEPES

Die Lösung wurde mit 1 N NaOH auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt. Die Intrazellulärlösung (IZ) für den inside-out Modus enthielt: 140,0 mM KCl 1,0 mM MgCl2 2,0 mM CaCl2 10,0 mM EGTA 5,0 mM HEPES Die Lösung wurde mit 2 N KOH auf einen pH-Wert von 7,15 eingestellt.

3.4.5 Allgemeine Versuchsdurchführung in der Patch-Clamp-Technik

Aus dem Brutschrank wurden die 35 mm Kulturschälchen mit dem zu untersuchenden

Zellmaterial entnommen. Der Großteil des Zellkulturmediums wurde mit einer

Eppendorfpipette abpipettiert. Daran wurde der Plexiglasblock mit Aussparungen für Ab- und

Zulauf sowie die Agarbrücke (s. 3.4.2) in das Schälchen eingesetzt. Das Petrischälchen wurde

in die Einfassung auf dem Objekttisch gesetzt. Zulauf, Absaugung und Agarbrücke wurden in

ihre jeweiligen Aussparungen auf dem Mikroskoptisch positioniert und über Magnete fixiert.

Über den Zulauf wurde Extrazellulärlösung zugeführt und mit dem Anstellen der

Absaugvorrichtung ein gleichmäßiger Fluss der Badperfusion sichergestellt. Dann wurden die

Zellen mit dem 10-fach Objektiv scharf gestellt. Nun wurde die gefüllte Glaspipette über den

chlorierten Silberdraht des Pipettenhalters gezogen. Der Pipettenhalter musste immer trocken

sein. An die Pipette wurde ein Überdruck von 2-3 cm H2O an dem seitlichen Eingang des

Pipettenhalters angelegt, um mit dem gleichmäßigen Austritt von Pipettenlösung ein

Verstopfen der Spitze durch Schmutzpartikel aus der Badlösung zu verhindern. Der

Vorverstärker samt Pipette wurde um etwa 45° abgesenkt und mit dem Grobmanipulator

soweit herabgelassen, dass die Pipettenspitze in die Badlösung eintauchte. Am Monitor ließ

sich im Oszilloskopmodus des Pulseprogramms das Eintauchen an einem rechteckigen

Strompuls als Antwort auf den Testpuls (eine rechteckförmige Änderung des

Pipettenpotentials) erkennen.


32

Unter starker Vergrößerung (40-fach) wurde die Pipette an die zu messende Zelle mit dem

Mikromanipulator herangefahren.

Sollte eine GFP-markierte Zelle identifiziert werden, wurde über einen

Auflichtkondensor monochromatisches Licht (470 nm) vom Farrand Spektralfluorometer zum

Objektiv geleitet. Nach Identifikation einer fluoreszierenden Zelle (s. Abb. 7) konnte der

Strahlengang wieder geschlossen werden und in normaler Durchlichtbeleuchtung gearbeitet

werden.

Befand sich die Pipettenspitze in unmittelbarer Nähe der Zelle wurde der Überdruck

abgelassen. Nach Berühren der Zellmembran, erkennbar an der Abnahme der Stromantwort

auf den Testpuls, wurde ein Sog an der Pipettenspitze angelegt. Nun sollte der Widerstand,

ablesbar vom Monitorfenster des Pulse Programms, rasch vom Megaohmbereich in den

Gigaohmbereich ansteigen. Dann wurde der Sog wieder weggenommen. Die nachfolgenden

Schritte wurden je nach gewünschter Messkonfiguration über die HEKA-Software am

Computer gesteuert. Sämtliche Messungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.

3.4.6 Cell-attached Konfiguration

Sollten Einzelkanalmessungen durchgeführt werden oder war die Intaktheit der Zellen von

Bedeutung, so wurde die cell-attached Konfiguration der Patch-Clamp-Technik verwendet

(HAMILL et al., 1981). Alle cell-attached Versuche wurden bei einem Pipettenpotential von

0 mV durchgeführt.

3.4.7 Inside-out Konfiguration

Für die Herstellung der inside-out Konfiguration wurde nach der Erlangung der cell-attached

Konfiguration die Pipette langsam von der Zelle zurückgezogen. Dadurch wurde ein

Membranstück aus der Zelle gelöst, so dass die cytosolische Seite der Plasmamembran direkt

der Badlösung zugewandt war. Wenn sich der Seal nicht deutlich veränderte, erhielt man so

die inside-out Konfiguration. Kam es beim Abziehen des Membranstücks an der

Pipettenspitze zu einer Vesikelbildung, musste die Pipette kurz aus dem Bad herausgezogen

werden. Durch den Luftkontakt entstand dann häufig die gewünschte inside-out

Konfiguration. Alle inside-out Versuche wurden bei einem Pipettenpotential von +50 mV

durchgeführt.


33

3.4.8 Whole-Cell Konfiguration

Nach Erstellung der cell-attached Konfiguration ließ sich durch Sog an der Pipette das

Membranstück unter der Pipettenmündung perforieren, so dass ein offener Zugang zum

Cytoplasma resultierte. Diese Konfiguration wurde verwendet, um unter Current-Clamp-

Bedingungen (hier wurde nicht die Spannung, sondern der Strom konstant gehalten) das

Membranpotential der Zelle zu messen.

3.4.9 Auswertung und Statistik

3.4.9.1 Einzelkanalmessungen

Die KATP-Kanalaktivität wurde mit der Halbamplituden-Schwellenwerttechnik

(COLQUHOUN und SIGWORTH, 1983) unter Verwendung des Analysenprogramms TAC

V3.0 + TAC Fit (Bruxton Corporation, Seattle, WA, USA) ausgewertet. Die Kanalaktivität I

wurde als das Produkt aus der Zahl der im Beobachtungszeitraum aktiven Kanäle (N) und der

Offenwahrscheinlichkeit (I) definiert und errechnet, indem die Gesamtoffenzeit aller Kanäle

durch die Beobachtungszeit dividiert wurden. Die Kanalaktivität wurde jeweils vor, während

und nach der Gegenwart jeder Testsubstanz bestimmt. Die Einzelkanalaktivitäten konnten in

Amplituden- und Dauer-Histogrammen dargestellt werden. Eine Kurvenanpassung an die

Dauer-Histogramme ergab die Werte für die mittlere Kanaloffenzeit.

Die konzentrationsabhängige Hemmung der Kanalaktivität jeder Testsubstanz wurde an

folgende Gleichung angepasst:

I/IC = 1 – [A] nH

/ ([A]nH

+ IC50nH

)

I ist der Strom entsprechend der Kanalaktivität bei der gegebenen Testsubstanzkonzentration,

IC die Offenwahrscheinlichkeit der Kontrolle, A die Konzentration der Testsubstanz, IC50 die

halbmaximal inhibitorisch wirksame Konzentration der Testsubstanz und nH der pseudo-

Hillkoeffizient.

Die Ergebnisse wurden angegeben als arithmetische Mittelwerte ± SEM für N unabhängige

Experimente. Zur Signifikanzberechnung wurden Vergleiche mit Hilfe des t-Tests und des

zweiseitigen U-Tests von Mann-Whitney und von Wilcoxon vorgenommen. Eine

Irrtumswahrscheinlichkeit von weniger als 5 % bei zweiseitiger Hypothese wurde als

signifikant gewertet.


34

3.4.9.2 Inside-out Messungen

Durch ATP-Applikation wurde die Grundlinie für den geschlossenen Zustand festgelegt.

Diese diente als Referenz für den Versuch. Gemessen wurde im Anschluss die in einer

definierten Zeitspanne aufgetretene durchschnittliche Stromstärke, provoziert durch die

„intrazelluläre Lösung“ bzw. der jeweiligen Testsubstanz, und diese auf die zuvor durch ATP

festgelegte Grundlinie bezogen. Die Kanalaktivität wurde in Gegenwart von ATP auf 0 % und

in Gegenwart von „intrazellulärer Lösung“ auf 100 % normalisiert.

100%(ATP) I-)(Kontrolle I

(ATP) Ianz)(Testsubst IitätKanalaktiv Relative ⋅

−=

3.4.9.3 Messung des Membranpotentials

Um das Membranpotential der Zellen zu messen wurde der Modusschalter des EPC-7 auf

Current-Clamp-(CC)-Bedingungen umgestellt. Hierbei wurde der Strom konstant gehalten.

Durch Umschaltung auf CC-Bedingungen werden im EPC-7 die RS-Kompensation und die

Abgleichungen durch Cfast und Cslow außer Kraft gesetzt (SIGWORTH in EPC-7 USER`S

MANUAL, S.49).

Zur Auswertung der Gesamtströme und des Membranpotentials wurde das Programm

Clampfit verwendet.

Zur Auswertung der Gesamtströme wurden Versuchsabschnitte von 12,8 Sekunden auf der

Festplatte gespeichert. Diese Versuchsabschnitte umfassen 5 runs von jeweils 2,56 Sekunden

Länge. Bei einem Haltepotential von -70 mV, welches nahe dem Ruhemembranpotential

liegt, sollte der Stromfluss nahe Null sein. Die Haltepotentiale betrugen entsprechend dem

oben dargestellten Stimulationsprotokoll abwechselnd -60 mV und -80 mV. Zur Auswertung

wurde die Differenz des Stromflusses bei -60 mV und -80 mV herangezogen. Nachdem alle 5

runs durch das Programm Clampfit eingelesen wurden, wurde die Trace-Average gebildet und

die Strommaxima bei -60 mV und die Stromminima bei -80 mV bestimmt. Als

Gesamtstromfluss wurde die Differenz (IDiff) zwischen den Werten festgelegt.

Um die unterschiedlichen elektrischen Aktivitäten der Zellen auszugleichen wurden die

Differenzen der Ströme in extrazellulärer Lösung gleich 100 % gesetzt. Die Werte in

Gegenwart der Testsubstanzen wurden auf diesen Wert nach folgender Formel normalisiert:

IDiff% = IDiffSubst / IDiffEZ * 100


35

3.5 Mikrofluorimetrische Messung der cytosolischen Ca2+

-Konzentration

3.5.1 Eigenschaften und Anwendung von fluoreszierenden Ca2+

-Indikatoren

Die intrazelluläre Ca2+-Ionenkonzentration wird gegenwärtig zumeist mit dem

Fluoreszenzindikator Fura-2 gemessen, der, wie eine Reihe anderer ionensensitiver

Fluoreszenzfarbstoffe auch, von der Gruppe um Roger Tsien synthetisiert wurde (SIMPSON,

1999). Fura-2 bindet mit einer funktionellen Gruppe, die dem Ca2+-Chelator BAPTA

entspricht, freies Ca2+, wodurch sich die Fluoreszenzeigenschaften des Moleküls ändern.

Hierbei ist die Eigenschaft, die den Gebrauch von Fura-2 populär gemacht hat, dass die

Fluoreszenzintensität bei einer bestimmten Anregungswellenlänge mit dem Ausmaß der Ca2+-

Bindung zunimmt, bei einer längerwelligen Fluoreszenzanregung jedoch mit dem Ausmaß

der Ca2+-Bindung abnimmt. Das Anregungsspektrum von Fura-2 bei verschiedenen Ca2+-

Konzentrationen ergibt auf diese Weise eine Kurvenschar, die bei ca. 340 nm den größten

Abstand zwischen hohen und niedrigen Ca2+-Konzentrationen aufweist, bei ca. 360 nm sich in

einem Punkt trifft und bei ca. 380 nm ein weiteres Maximum des Abstands zwischen hoher

und niedriger Ca2+-Konzentration aufweist, wobei hier jedoch die höhere

Fluoreszenzintensität in Gegenwart niedriger Ca2+-Konzentration vorliegt (GRYNKIEWICZ

et al., 1985).

Wird nun die Fura-2 Fluoreszenz abwechselnd bei 340 und bei 380 nm angeregt, so ergeben

sich zwei gegenläufige Fluoreszenzsignale, deren Intensität neben der Ca2+-Konzentration

auch Ausdruck der Indikatorkonzentration ist. Wird die bei 340 nm erzeugte Fluoreszenz

durch die bei 380 nm erzeugte geteilt, so ist die nun erhaltene Größe, die Fluoreszenzratio,

von der Indikatorkonzentration unabhängig (zur genauen Herleitung s. GRYNKIEWICZ et

al., 1985). Dies ist der wesentliche Vorteil der Messung mit Indikatoren mit zweifacher

Fluoreszenzanregung verglichen mit solchen mit einfacher Fluoreszenzanregung. Weiterhin

muss für eine Kalibrierung von Indikatoren mit einfacher Anregung die Zelle lysiert werden,

während mit Indikatoren mit zweifacher Anregung eine in-situ Kalibrierung möglich ist

(MORGAN und THOMAS, 1999). Nachdem sich jedoch herausgestellt hat, dass die mit

Fura-2 gemessene intrazelluläre Ca2+-Konzentration keine einheitliche Größe ist, sondern

dass Mikrokompartimente exstieren, in denen unter Stimulationsbedingungen andere Ca2+-

Konzentrationen vorliegen als in dem allgemeinen Cytosol (SIMPSON, 1999), wird auf eine

in-situ Kalibrierung zumeist verzichtet und nur die Fura-2 Fluoreszenzratio angegeben. Auch

in der vorliegenden Arbeit wurde die Änderung der intrazellulären Ca2+-Konzentration nur als

Änderung der Fura-2 Fluoreszenzratio beschrieben.


36

Voraussetzung für die breite Anwendung von fluoreszierenden Ionenindikatoren war die

leichte Einbringung in die Zelle. Die das Ca2+-Ion komplexierenden Carboxylgruppen

verhindern eine wesentliche Membranpassage der Ca2+-Indikatoren. Werden die

Carboxylgruppen jedoch mit Acetoxymethylgruppen verestert (sog. AM-Ester), so ist der

Indikator lipophil genug, um die Zellmembran passieren zu können. Im Cytosol werden die

Esterbindungen durch unspezifische Esterasen gespalten und der nunmehr wieder polare

Farbstoff kann nicht mehr aus der Zelle heraus diffundieren. Dieser „dye-trapping“ genannte

Mechanismus hat die Messung von intrazellulären Ionenkonzentrationen verglichen mit der

Technik der Mikroinjektion fast trivial einfach gemacht (COBBOLD und RINK, 1987). Es

sind jedoch auch so noch eine Reihe von Problemen mit der Beladung möglich. Ist die Zeit

für die Farbstoffbeladung zu kurz, so ist die esteratische Spaltung unvollständig, und ein Teil

des Fluoreszenzsignals ist nicht Ca2+-sensitiv (SIMPSON, 1999). Ist die Beladungsdauer zu

lang oder werden im Bemühen um höhere Signalintensitäten hohe Konzentration des

Indikators zur Beladung verwendet, kann es vermehrt zur intrazellulären Sequestrierung

kommen, d.h. der Indikator wird in Organellen akkumuliert, deren Ca2+-Konzentrationen sich

nicht oder nur zeitversetzt mit der cytosolischen Ca2+-Konzentration ändert. Auch aus diesem

Mechanismus folgt eine Verminderung der dynamischen Breite des Indikatorsignals.

Aufgrund der bereits in vorangegangenen Versuchen gemachten Erfahrungen hatte sich für

die Beladung von isolierten Pankreasinselzellen eine Konzentration von Fura-2/AM von 2

µM, eine Dauer von 45 min und eine Beladungstemperatur von 37 °C als geeignet erwiesen.

3.5.2 Die Mikroskopfluorimetrie mit digitaler Bildverarbeitung

Obwohl die fluoreszierenden Ionenindikatoren auch verwendet werden können, um die

entsprechenden Konzentrationen in Zellsuspensionen zu messen, so ist doch die weite

Verbreitung dadurch begründet, dass es mit Hilfe der Mikrofluorimetrie möglich ist, an

Einzelzellen Messungen durchzuführen, die einen höheren Informationsgehalt haben, als

Messungen an Zellsuspensionen (COBBOLD und RINK, 1987). Für eine

mikrofluorimetrische Messung der Fura Fluoreszenz ist eine Lichtquelle erforderlich, die die

Anregungswellenlängen von 340 und 380 nm in annähernd gleicher Intensität liefert. Hierfür

eignet sich eine Xenon-Lichtbogenlampe. Die abwechselnde Exzitation der Fluoreszenz

wurde im für diese Versuche verwendeten Messstand dadurch erreicht, dass das Licht des

Xenonlichtbogens auf zwei Quarzlichtleiter projiziert wurde, deren Eingang durch

programmierbare Schnellverschlüsse (Uniblitz-Shutter) gesperrt war. Wurde einer der


37

Verschlüsse geöffnet, so fiel das Licht auf ein Beugungsgitter, das ein Spektrum auf den

Eingang eines weiteren Lichtleiters projizierte, dessen distales Ende in dem Lampenhaus des

Epifluoreszenzmikrokops (Leitz-Orthoplan) fixiert war. Durch unterschiedliche

Winkelstellung von Quarzlichtleitern und Beugungsgitter wurden die Ausschnitte aus den

Spektren verschoben, die sich auf den zum Mikroskop führenden Lichtleiter projizierten.

Somit konnten mit dieser Lichtquelle abwechselnd Licht aus zwei beliebigen, annähernd

monochromatischen Wellenlängen an das Mikroskop abgegeben werden.

Das von J. Ploem eingeführte Prinzip der Epifluoreszenz besagt, dass für die

Anregung der Fluoreszenz und die Sammlung des Fluoreszenzlichts ein und dasselbe optische

Element verwendet wird, nämlich das Mikroskopobjektiv (PLOEM, 1989). Im

Anregungsstrahlengang dient es als Kondensor, im Emissionsstrahlengang als Objektiv.

Ermöglicht wird dieser Strahlengang durch den dichromatischen oder auch Teilerspiegel. Ein

solcher Spiegel reflektiert Licht, das kurzwelliger ist als seine Teilerkante, und lässt das

längerwellige Licht passieren. In einem Winkel von 45° zum einfallenden Licht angebracht,

reflektiert ein solcher Teilerspiegel das Anregunglicht zum Objekt (=Kondensor) und lässt

das vom Objekt wieder gesammelte, längerwellige Fluoreszenzlicht zum Detektor (Multipler

oder CCD Kamera) passieren.

3.5.3 Versuchsdurchführung

Da es sich bei dem verwendeten Orthoplan Mikroskop um ein aufrechtes Mikroskop handelte,

so mussten die Umströmungskammer und die Zuleitungen ein geschlossenes System bilden.

Das Deckgläschen wurde auf die mit Medium gefüllte Umströmungskammer gelegt, so dass

die Seite mit den angewachsenen, Fura-beladenen Zellen nach unten zeigte. Durch das

Auflegen des Deckgläschens wurde die Umströmungskammer geschlossen. Mittels einer auf

der abfließenden Seite der Kammer befindlichen peristaltischen Pumpe wurde vorgewärmtes

Medium aus einen Vorratsgefäß in die Kammer gesogen. Der Wechsel des

Perifusionmediums geschah, indem die Pumpe angehalten und der zuführende Schlauch in

das nächste Vorratsgefäß eingehängt wurde. Da die 340/380 nm Bildpaare im Abstand von 1

Minute aufgenommen wurden, war diese Art des Mediumwechsels hinreichend schnell. Als

Objektiv wurde ein Zeiss Fluar mit 40-facher Vergrößerung benutzt, das auch bei 340 nm

noch eine relativ hohe Transmission aufweist. Üblicherweise waren pro Gesichtsfeld 5 bis 8

Einzelzellen oder kleinere Zellcluster zu erkennen. Mittels einer slow-scan CCD Kamera


38

wurden die Fluoreszenzbilder bei 340 und 380 nm Anregung aufgenommen und nach

Beendigung des Versuchs die Fluoreszenzratio des Bildes durch Pixel pro Pixel Division

berechnet. Die Zellen wurden im Ratiobild markiert und die Kinetik durch Auswertung aller

Ratiobilder eines Versuchs erstellt. Für den Mittelwert wurden alle auswertbaren Zellen aus

mindestens drei Versuchen verwendet.

Resultate

39

4 Resultate

4.1 Hemmung des nativen KATP -Kanals in insulinsezernierenden HIT-Zellen durch

Clonidin und Chinin

Mit der cell-attached Konfiguration der Patch-Clamp-Technik wurde der Einfluss von

Clonidin und Chinin auf die Kanalaktivität nativer KATP-Kanäle in intakten HIT-Zellen

bestimmt. Weil die Effekte Chinins vor allem bei höheren Konzentrationen nur schwer

reversibel waren, wurde die cell-attached Konfiguration gewählt, um den Einfluss eines

Kanal-„Run-Downs“ zu minimieren. Nach jedem Experiment wurden frische HIT-Zellen

verwendet.

Beide Substanzen hemmten konzentrationsabhängig die Kanalaktivität der nativen KATP-

Kanäle (Abb. 8). Beide Substanzen schlossen die Kanäle vollständig, Chinin hemmte die

Kanalaktivität potenter als Clonidin. Es ergaben sich IC50-Werte von 44,2 ± 14,6 µM für

Clonidin und 5,3 ± 1,2 µM für Chinin. Die korrespondierenden Hill-Koeffizienten waren 1,0

für Clonidin und 1,7 für Chinin. Die Werte wurden aus 5 bis 8 unabhängigen

Einzelexperimenten pro getesteter Konzentration bestimmt. Die Einzelkanalamplitude war in

allen Experimenten im getesteten Konzentrationsbereich nicht verändert.

Abb. 8 Konzentrationsabhängige Hemmung der KATP-Kanalaktivität in HIT-Zellen durch Clonidin und Chinin,

gemessen in der cell-attached Konfiguration der Patch-Clamp-Technik. Die Kanalaktivitäten in Gegenwart der Testsubstanz sind dargestellt in Prozent bezogen auf die durchschnittlichen Kanalaktivitäten der Kontrolle vor und nach der Zugabe der Testsubstanzen. Die IC50-Werte waren 44,2 ± 14,6 µM für Clonidin und 5,3 ± 1,2 µM für Chinin (n = 5-8 für jede Konzentration).

Resultate

40

4.2 Wirkung von Clonidin und Chinin auf die porenbildende Untereinheit des KATP-

Kanals

4.2.1 Charakterisierung der Eigenschaften des heterolog exprimierten Kir6.2∆C26-

Kanals in HEK293-Zellen

Für die weitere Charakterisierung der nichtadrenergen Bindungsstellen bzw. des möglichen

Angriffspunkt der Imidazoline sowie Chinin wurde die trunkierte porenbildende Untereinheit

des KATP-Kanals (Kir6.2∆C26) in HEK293-Zellen, die keine eigenen KATP-Kanäle aufweisen,

transient exprimiert (s. 3.3.8). Die typischen Eigenschaften der exprimierten Kir6.2∆C26-

Kanäle wurden mit der Patch-Clamp-Technik in der cell-attched Konfiguration geprüft.

Phentolamin und Clonidin hemmten in der eingesetzten Konzentration von 100 µM die

Kanalaktivität (Abb. 9). Zum Vergleich wurde der Sulfonylharnstoff Glibenclamid eingesetzt.

Glibenclamid wurde in einer Konzentration von 1 µM getestet, welches die maximal effektiv

blockierende Konzentration für native KATP-Kanäle darstellt (GRIBBLE et al., 1998). Hier

jedoch war Glibenclamid nicht in der Lage die Kir6.2∆C26-Kanalaktivität zu hemmen

(Abb.9). Es konnte also angenommen werden, daß die Kanalaktivität tatsächlich allein auf

Kir6.2∆C26 zurückzuführen war und nicht mit einer SUR-Untereinheit verbunden war.

Abb. 9 Originalregistrierungen der Hemmung von Kir6.2∆C26-Kanälen exprimiert in HEK293-Zellen. 100 µM Phentolamin (obere Bahn) und 100 µM Clonidin (mittlere Bahn), nicht jedoch 1 µM Glibenclamid (untere Bahn) hemmten die Kanalaktivität im cell-attached Modus der Patch-Clamp-Technik. Die Pfeile markieren Anfang und Ende der Testsubstanzzugabe. In dieser Registrierung sind die Einwärtsströme nach oben ausschlagend dargestellt.

100 µM Phentolamin

100 µM Clonidin

1 µM Glibenclamid

1 min 5 pA

Resultate

41

4.2.2 Vergleich der Kinetik des nativen KATP-Kanals in HIT-Zellen mit dem heterolog

exprimierten Kir6.2∆C26-Kanal in HEK293-Zellen

Der exprimierte Kanal wurde weiter charakterisiert durch die Messung der

Einzelkanalamplitude und der Kinetik des Kanalöffnens und –schließens. Mit durchschnittlich

5 pA war die Einzelkanalamplitude vom nativen KATP-Kanal und vom Kir6.2∆C26-Kanal

nicht unterschiedlich, jedoch war die durchschnittliche Offenzeit (mean open time) des

Kir6.2∆C26-Kanals deutlich kürzer (Abb. 10). Während die mittlere Kanaloffenzeit vom

nativen Kanal 1,54 ± 0,2 ms betrug, betrug die mittlere Kanaloffenzeit des Kir6.2∆C26

Kanals 0,81 ± 0,1 ms (p = 0,023; t-Test). Die mittlere Kanaloffenzeit des Kir6.2∆C26-Kanals

wurde durch die Gegenwart von Imidazolinen nicht beeinflusst, in Gegenwart von 100 µM

Alinidin betrug sie 0,75 ± 0,06 ms, nach Auswaschen von Alinidin 0,86 ± 0,06 ms.

Abb. 10 Vergleich der Orginalregistrierungen von Aktivitäten von nativen KATP-Kanälen und Kir6.2∆C26-

Kanälen im cell-attached Modus. Native KATP-Kanäle von HIT-Zellen sind in den Registrierungen a + b dargestellt, die in HEK293-Zellen heterolog exprimierten Kir6.2∆C26-Kanäle in den Registrierungen c + d. Die Badlösung enthielt Chinin während der Registrierungen b (3 µM) und d (10 µM), während die Registrierungen a und c einen repräsentativen Ausschnitt aus der Kontrolle zeigen.

Resultate

42

4.2.3 Hemmung des heterolog exprimierten Kir6.2∆C26-Kanals in HEK293-Zellen

durch Clonidin und Chinin

Die Effektivität beider Substanzen, native KATP-Kanäle zu hemmen, konnte in den

vorangegangenen Experimenten gezeigt werden. Auch die Aktivität der transient exprimierten

Kir6.2∆C26-Kanäle in HEK293-Zellen wurde durch Clonidin und Chinin signifikant

gehemmt. Analog der cell-attached Experimente an nativen KATP-Kanälen wurde an

transfizierten HEK293-Zellen (s. 3.3.8) eine Konzentrationsreihe vermessen. Pro

Konzentration wurden 4 bis 6 unabhängige Einzelexperimente durchgeführt. Beide

Substanzen zeigten eine konzentrationsabhängige Hemmung der Kir6.2∆C26-Kanalaktivität

bis hin zu einem kompletten Block des Kanals bei 1 mM für Clonidin bzw. 300 µM für

Chinin (Abb. 11). Für Clonidin ergab sich ein IC50-Wert von 40,1 ± 13,7 µM mit einem Hill-

Koeffizienten von 0,7 und für die Chinin-induzierte Hemmung ein IC50-Wert von 14,6 ± 2,1

µM mit einem Hill-Koeffizienten von 1,4.

Der IC50-Wert für die Chinin-induzierte Hemmung des Kir6.2∆C26-Kanals war hier

signifikant (P = 0,0006, t-Test) größer als der IC50-Wert für die Hemmung von nativen

Kanälen durch Chinin.

Abb. 11 Konzentrationsabhängige Hemmung des Kir6.2∆C26 in intakten HEK293-Zellen durch Clonidin und

Chinin gemessen in der cell-attached Konfiguration der Patch-Clamp-Technik. Dargestellt sind die Kanalaktivitäten in Gegenwart der Testsubstanz in Prozent bezogen auf die durchschnittlichen Kanalaktivitäten in der Kontrolle vor und nach Zugabe der Testsubstanzen. Die IC50-Werte waren 40,1 ± 13,7 µM für Clonidin und 14,6 ± 2,1 µM für Chinin. (n = 4-6 für jede Konzentration).

Resultate

43

4.2.4 Hemmung des heterolog exprimierten Kir6.2∆C26-Kanals in HEK293-Zellen

durch Alinidin

Als ein nahes strukturelles Derivat des Clonidins wurde Alinidin (Abb. 2) eingesetzt. Alinidin

hat im Vergleich mit Clonidin eine wesentlich geringere Affinität zu α2-Adrenozeptoren, ist

aber mindestens ebenso effektiv wie Clonidin, den KATP-Kanal zu schließen.

Mittels Patch-Clamp-Technik in der cell-attached Konfiguration wurde eine

Konzentrationsabhängigkeit auf die Kanalaktivität der trunkierten porenbildenen Untereinheit

untersucht. Es zeigte sich, dass Alinidin wesentlich potenter als Clonidin Kir6.2∆C26-Kanäle

hemmen konnte (Abb. 12). Der IC50-Wert für Alinidin betrug 0,38 ± 0,05 µM (Hill-

Koeffizient 0,9).

Abb. 12 Konzentrationsabhängige Hemmung des Kir6.2∆C26 in HEK293-Zellen durch Alinidin, gemessen in der cell-attached Konfiguration der Patch-Clamp-Technik. Dargestellt sind die Kanalaktivitäten in Gegenwart der Testsubstanz in Prozent bezogen auf die durchschnittlichen Kanalaktivitäten in der Kontrolle vor und nach Zugabe der Testsubstanzen. Der IC50-Wert betrug 0,38 ± 0,05 µM (n = 4-5 für jede Konzentration).

Resultate

44

4.3 Heterologe Expression von Kir6.2∆C26/SUR1 in HEK293-Zellen und Hemmung

durch Chinin

Um zu prüfen, ob die signifikant unterschiedlich erhaltenen IC50-Werte der Chinin-

induzierten Hemmung von nativen KATP-Kanälen und Kir6.2∆C26-Kanälen durch die

Anwesenheit des Sulfonylharnstoffrezeptors bedingt ist, wurden Kir6.2∆C26 und SUR1

zusammen in HEK293-Zellen exprimiert. Wie in 3.3.9 beschrieben wurde hier eine den

Kir6.2∆C26 stabil exprimierende Zelllinie mit SUR1 transient transfiziert. Die Expression

von SUR1 wurde durch eine GFP-Fluoreszenz nachgewiesen. Dieser Kanal hatte eine ähnlich

schnelle Kinetik von Öffnen und Schließen wie der allein exprimierte Kir6.2∆C26-Kanal: die

mittlere Kanaloffenzeit betrug 0,69 ± 0,06 ms. In Gegenwart von 30 µM Chinin betrug die

mittlere Kanaloffenzeit 0,66 ± 0,07 ms, nach Auswaschen betrug die mittlere Kanaloffenzeit

0,68 ± 0,06 ms (Abb. 13).

Abb. 13 Vergleich der Originalregistrierungen von heterolog exprimierten Kir6.2∆C26-Kanälen und von

koexprimierten Kir6.2∆C26/SUR1-Kanälen. Beide Kanäle wurden in HEK293-Zellen exprimiert Dargestellt sind repräsentative Ausschnitte aus cell-attached Registrierungen. Die Bahnen a + c sind jeweils die Kontrollbedingungen, während in den Registrierungen b + d jeweils das Ausmaß der Hemmung der Kanalaktivität durch die Anwesenheit von 10 µM Chinin gezeigt wird. Gegenüber Kir6.2∆C26 allein zeigte sich durch die Koexpression von Kir6.2∆C26 und SUR1 keine Veränderung der Kanaloffenzeit (s.a. Abb. 10).

a

b

c

d

200 ms

5 pA

Resultate

45

Die Wirkung von Chinin auf die Kanalaktivität wurde im Konzentrationsbereich von 0,1 bis

300 µM mit der cell-attached Konfiguration gemessen. Wie in den vorherigen Versuchen

wurde pro Versuch nur eine Konzentration getestet, anschließend wurden neue transfizierte

Zellen verwendet. Bei 300 µM hemmte Chinin die Kanalaktivität vollständig (Abb. 14). Es

ergab sich ein IC50-Wert von 29,6 ± 5,7 µM mit einem Hill-Koeffizienten von 1,45.

Abb. 14 Konzentrationsabhängige Hemmung des heterolog exprimierten Kir6.2∆C26/SUR1-Kanals in HEK293- Zellen durch Chinin, gemessen in der cell-attached Konfiguration der Patch-Clamp-Technik. Dargestellt sind die Kanalaktivitäten in Gegenwart der Testsubstanz in Prozent bezogen auf die durchschnittlichen Kanalaktivitäten in der Kontrolle vor und nach Zugabe der Testsubstanz. Der IC50-Wert betrug 29,9 µM.

Resultate

46

4.4 Antagonismus von MgGDP und Diazoxid auf die durch Phentolamin, Alinidin,

Tolbutamid und Chinin gehemmten KATP-Kanäle im inside-out Modus

Der Frage, wieweit eine durch Imidazoline bedingte Hemmung der Aktivität von KATP-

Kanälen durch Kanalöffner antagonisiert werden kann, wurde zunächst durch Messung der

Kanalaktivität in inside-out Patches aus normalen B-Zellen des Mauspankreas nachgegangen.

Da es zunächst um den prinzipiellen Nachweis einer Antagonisierbarkeit ging, wurde die

inside-out Konfiguration gewählt, um den Testsubstanzen einen möglichst direkten Zugang

zum Wirkort zu verschaffen. Die Konzentration der Testsubstanzen sollte hoch genug sein,

eine eindeutige Hemmung der Kanalaktivität zu bewirken, nicht aber eine komplette

Hemmung hervorzurufen. Angesichts des auch in dieser relativ niedrigen Konzentration

langsam einsetzenden Effekts von Chinin war eine Beeinflussung des Ergebnisses durch

einen „Run-down“ des Kanals nicht auszuschließen. Deshalb wurde zu Beginn und zum

Schluss des Versuchs die Kanalaktivität in Gegenwart von intrazellulärer Lösung gemessen

und die Werte gemittelt, ebenso wurde die Wirkung von MgGDP vor und nach der Wirkung

von MgGDP plus Diazoxid gemessen und die Werte gemittelt.

Abb.15 Antagonismus zwischen dem Imidazolin Alinidin und Kaliumkanalöffnern an nativen KATP-Kanälen von

normalen B-Zellen der Maus gemessen in der inside-out Konfiguration der Patch-Clamp-Technik. Die obere Registrierung zeigt die Wirkung von Diazoxid (300 µM) in Gegenwart von Alinidin (10 µM). Die untere Registrierung zeigt die öffnende Wirkung von MgGDP (500 µM) in Gegenwart von Alinidin (10 µM) sowie einen zusätzlichen öffnenden Effekt von Diazoxid (300 µM).

300 µM Diazoxid

10 µM Alinidin

300 µM Diazoxid

500 µM MgGDP

10 µM Alinidin

1 min

10 pA

Resultate

47

Die Effekte von Alinidin und von Chinin in der gewählten Konzentration von 10 µM waren

mit 48 bzw. 63 % Restaktivität etwas geringer als erwartet (Tab. 1), jedoch war für jede der

eingesetzten Testsubstanzen eine signifikant hemmende Wirkung festzustellen. Unerwartet

eindeutig war die öffnende Wirkung von 500 µM MgGDP bei allen Testsubstanzen. Die

durch die Imidazoline bzw. Tolbutamid oder Chinin verminderte Kanalaktivität wurde durch

MgGDP signifikant auf das drei- bis fünffache gesteigert (Tab. 1). Die zusätzliche

Anwesenheit von 300 µM Diazoxid hingegen führte nur in Gegenwart von Tolbutamid und

Alinidin zu einer signifikanten weiteren Steigerung der Kanalaktivität um ca. 40 bis 50 %

(Tab. 1).

Testsubstanz Testsubstanz

+ 500 µµµµM Mg GDP

Testsubstanz

+ 500 µµµµM Mg GDP

+ 300 µµµµM Diazoxid

Phentolamin 25.8 ± 3.8 628.3 ± 265.2 95.3 ± 16.1

Alinidin 47.8 ± 8.5 519.2 ± 161.7 141.3 ± 15.1

Tolbutamid 17.8 ± 2.6 548.9 ± 204.6 151.2 ± 28.4

Chinin 63.2 ± 13.8 302.8 ± 47.0 122.4 ± 18.0

Tab.1 Effekt von MgGDP und Diazoxid auf den Block von KATP-Kanälen durch Imidazoline, Tolbutamid und

Chinin in inside-out Patches von B-Zellen des Pankreas. Die Testsubstanzen wurden in einer Konzentration von 10 µM eingesetzt (Tolbutamid 50 µM). Die Effekte sind angegeben in Prozent der Kanaktivität unter der vorangegangenen Versuchsbedingung, d.h. die Wirkungen der Testsubstanzen sind bezogen auf die Kanalaktivität in Gegenwart von intrazellulärer Lösung und die Wirkung von 500 µM MgGDP ist bezogen auf die Kanalaktivität in Gegenwart der jeweiligen Testsubstanz (s. Originalregistrierungen Abb.15). Es handelt sich um Mittelwerte ± SEM von 6 unabhängigen Versuchen. Der schließende Effekt war für jede Testsubstanz signifikant, ebenso war die öffnende Wirkung von MgGDP bei jeder der Testsubstanzen signifikant (P < 0.05, Wilcoxon Test). Der Effekt der zusätzlichen Anwesenheit von 300 µM Diazoxid war nur bei Alinidin und Tolbutamid signifikant. (P < 0.05, Wilcoxon Test).

Resultate

48

4.5 Vergleich der repolarisierenden Wirkung von Diazoxid in Gegenwart von den

Imidazolinen Phentolamin, Alinidin und Idazoxan, sowie Tolbutamid und Chinin

Das Membranpotential wurde an Einzelzellen aus NMRI Mausinseln mit der konventionellen

whole-cell Konfiguration der Patch-Clamp-Technik unter current-clamp Bedingungen

gemessen. Das Ruhemembranpotential der Einzelzellen lag im Mittel bei –73,6 mV. Die

Imidazoline Alinidin, Idazoxan und Phentolamin, sowie der Sulfonyharnstoff Tolbutamid und

das Alkaloid Chinin führten alle zu einer starken Depolarisation der B-Zell Plasmamembran

(Abb. 16 A-E; Mittelwerte s. Abb. 17). Die Konzentration der Imidazoline und von Chinin im

Bad betrug 100 µM, die von Tolbutamid 500 µM.

Abb. 16A Repolarisierende Wirkung von Diazoxid (300 µM) in Gegenwart von Phentolamin (100 µM). An Einzelzellen aus NMRI Mausinseln wurde mit der konventionellen whole-cell Technik das Membranpotential unter current-clamp Bedingungen gemessen. Das repolarisierte Membranpotential betrug in dieser Registrierung nur –64,4 mV, war aber nicht signifikant verschieden vom Ruhemembranpotential. Bemerkenswert ist das plötzliche Aufhören der „spike“-artigen Depolarisationen, die wahrscheinlich durch die Aktivität von Ca2+-Kanälen bedingt ist.

Phentolamin führte zu einer trägen Depolarisation (Abb. 16A). Erst fünf Minuten nach der

Zugabe war das Maximum der Depolarisation der Zellmembran (-43,8 mV) erreicht. Der

Diazoxid-Antagonismus stellte sich zwei Minuten nach Einstrom von Diazoxid (300 µM) in

das Zellbad ein. Das repolarisierte Membranpotential betrug nur –64,4 mV, war aber nicht

signifikant verschieden vom Ruhemembranpotential. Auffallend war an der Diazoxid-

induzierten Repolarisierung das vollkommene Sistieren der Potentialspikes bereits bei noch

ausgeprägter Depolarisation.

Resultate

49

Abb. 16B Repolarisierende Wirkung von Diazoxid (300 µM) in Gegenwart von Alinidin (100 µM). An Einzelzellen aus NMRI Mausinseln wurde mit der konventionellen whole-cell Technik das Membranpotential unter current-clamp Bedingungen gemessen. Die Depolarisation nach Zugabe von Alinidin sowie die Repolarisation nach Zugabe von Diazoxid erfolgte mit einer raschen Kinetik.

Alinidin führte bereits eine Minute nach Zugabe zu einer Depolarisation auf -41,5 mV mit

ausgeprägten, „spike“-artigen Änderungen des Membranpotentials (Abb. 16B). Durch

Diazoxid (300 µM) erfolgte eine Repolarisation auf das Ruhemembranpotentialniveau (-75,1

mV), die eine Minute nach der Diazoxidzugabe einsetzte.

Idazoxan wies eine ähnlich schnelle Kinetik auf. Eine Minute nach der Zugabe von

Idazoxan wurde das Schwellenpotential überschritten und die Zellmembran depolarisierte

(Abb. 16C) genauso stark wie nach Phentolamin- oder Alinidin-Exposition (Abb. 17). Die

Anwesenheit von Diazoxid (300 µM) führte wiederum eine Minute nach Zugabe zu einer

plötzlichen, deutlichen Repolarisation, jedoch wurde im weiteren Verlauf dieses Versuchs die

Zellmembran nicht stärker als bis ca. -55 mV repolarisiert (Abb. 16C). Der Mittelwert des

repolarisierten Membranpotentials (-66,4 ± 7,8 mV) war jedoch nicht signifikant verschieden

vom Ruhemembranpotential (s. Abb. 17).

Tolbutamid führte prompt zu einer Depolarisation (Abb. 16D). Das Ausmaß der

Depolarisation entsprach den mit den Imidazolinen enthaltenen Werten (Abb. 17). Die

antagonistische Wirkung von Diazoxid setzte eine Minute nach dem Einstrom von Diazoxid

(300 µM) in das Bad ein. Obwohl die Wirkung von Diazoxid ebenso schnell einsetzte wie in

Gegenwart von Alinidin und Idazoxan, so verlief doch die Repolarisation zögerlicher. Die

Geschwindigkeit der Repolarisierung entsprach ungefähr derjenigen in Gegenwart von

Phentolamin. So betrug das Membranpotential nur –61,2 mV 180 s nach Zugabe von

Diazoxid, verstärkte sich jedoch noch auf –65,2 mV nach 360 s.

Resultate

50

Abb. 16C Repolarisierende Wirkung von Diazoxid (300 µM) in Gegenwart von Idazoxan (100 µM). An Einzelzellen aus NMRI Mausinseln wurde mit der konventionellen whole-cell Technik das Membranpotential unter current-clamp Bedingungen gemessen. Die De- und Repolarisation in Anwesenheit der Testsubstanzen erfolgte ebenso prompt wie bei der Gegenwart von Alinidin. In diesem Versuch wurde die Zellmembran nur bis ca. -55 mV repolarisiert. Im Mittel der Versuche war das durch Diazoxid repolarisierte Membranpotential (-66,4 ± 7,8 mV) jedoch nicht signifikant verschieden vom Ruhemembranpotential.

Abb. 16D Repolarisierende Wirkung von Diazoxid (300 µM) in Gegenwart von Tolbutamid (500 µM). An Einzelzellen aus NMRI Mausinseln wurde mit der konventionellen whole-cell Technik das Membranpotential unter current-clamp Bedingungen gemessen. Die Repolarisation in Gegenwart von Diazoxid setzte prompt ein, verlief jedoch zögerlicher als bei den Imidazolinen Alinidin und Idazoxan.

Resultate

51

Die Wirkung des Alkaloids Chinin setzte ähnlich träge ein wie die von Phentolamin. Zwei

Minuten nach der Chininzugabe wurde das Schwellenpotential erreicht, und „spike“-artige

Depolarisationen der Zellmembran wurde sichtbar (Abb. 16E). Die Gegenwart von Diazoxid

(300 µM) führte nach einer Minute zu einer Repolarisation. Das dauerhaft erreichte Potential

lag jedoch etwas oberhalb des Ruhemembranpotentials. Zum Zeitpunkt 180 s nach Zugabe

von Diazoxid war das Membranpotential (-61,9 mV) nicht signifikant verschieden vom

Ruhemembranpotential, jedoch zum Zeitpunkt 360 s (-57,5 mV). Auch das Auswaschen mit

extrazellulärer Lösung führte nicht zu einer vollständigen Repolarisation.

Abb. 16E Repolarisierende Wirkung von Diazoxid (300 µM) in Gegenwart von Chinin (100 µM). An Einzelzellen aus NMRI Mausinseln wurde mit der konventionellen whole-cell Technik das Membranpotential unter current-clamp Bedingungen gemessen. Die Gegenwart von Chinin führte zu einer trägen Depolarisation der Zellmembran. Die Repolarisation durch die Anwesenheit von Diazoxid setzte relativ schnell ein, es wurde jedoch nicht eine dauerhaft vollständige Repolarisation erreicht.

Zusammenfassend kam es durch alle Testsubstanzen zu einer praktisch gleich starken

Depolarisation der Zellmembran. Die zusätzliche Gegenwart von Diazoxid führte nicht nur

bei Tolbutamid, sondern auch bei den Imidazolinen Alinidin, Idazoxan und Phentolamin

sowie bei dem Alkaloid Chinin zu einer Repolarisation, die zumindest bei Chinin nicht

vollständig war.

Resultate

52

Abb. 17 Vergleich der repolarisierenden Wirkung von Diazoxid in Gegenwart von den Imidazolinen Alinidin, Idazoxan und Phentolamin, sowie Tolbutamid und Chinin. An Einzelzellen aus NMRI Mausinseln wurde mit der konventionellen whole-cell Technik das Membranpotential unter current-clamp Bedingungen gemessen, wie in Abb.16A-E dargestellt. Das Ruhemembranpotential lag im Mittel bei –73,6 mV (offene Säule). Die jeweils mittlere Säule zeigt den maximalen depolarisierenden Effekt der Testsubstanzen (Imidazoline, Chinin (100 µM); Tolbutamid (500 µM)). Die jeweils dritte Säule zeigt das Ausmaß der Repolarisierung 3 min nach Zugabe von Diazoxid (300 µM).

4.6 Antagonistische Wirkung von Diazoxid auf den Imidazolin-induzierten Anstieg

der cytosolischen Ca2+

-Konzentration

Der Antagonismus zwischen Diazoxid und den Imidazolinen sollte auch an intakten B-Zellen

(aus NMRI Mausinseln) nachgewiesen werden. Dieses erfolgte indirekt vermittels der

mikrofluorimetrischen Messung der intrazellulären Ca2+-Konzentration von Einzelzellen, die

mit dem Indikator Fura-2 beladen waren. Nach der Beladung wurden die an ein Deckgläschen

festgewachsenen Zellen mit Krebs-Ringer Medium (5 mM Glucose) umströmt. Nach 10 min

wurden jeweils die Imidazoline Phentolamin, Alinidin und Idazoxan sowie das Alkaloid

Chinin in einer Konzentration (100 µM) zugegeben, die als maximal wirksam für die

Insulinsekretion angesehen werden. Tolbutamid (500 µM) wurde, wie in den vorherigen

Versuchen, als Positivkontrolle eingesetzt, da hier ein Diazoxid-induzierter Abfall des durch

Tolbutamid erhöhten [Ca2+]i bekannt war. Sämtliche Imidazoline wie auch Tolbutamid und

Chinin führten zu einem deutlichen Anstieg der [Ca2+]i. Nach 20 min alleiniger Anwesenheit

der verschiedenen KATP-Kanal Blocker wurde Diazoxid (300 µM) hinzugegeben, um die

Reaktion der [Ca2+]i zu beobachten.

Resultate

53

Abb. 19A+B Antagonistische Wirkung von Diazoxid auf den Anstieg der cytosolischen Ca

2+-Konzentration von

B-Zellen des Pankreas durch die Imidazoline Phentolamin (A) und Alinidin (B). Einzelzellen aus NMRI Mausinseln wurden mit Fura 2/AM beladen und mit Krebs-Ringer Medium (5 mM Glucose) bei 37 °C umströmt. Nach 10 min wurde die Testsubstanz (jeweils 100 µM) zugegeben, nach weiteren 20 min zusätzlich Diazoxid (300 µM). Ein Abfall der cytosolischen Ca2+-Konzentration durch Diazoxid war bei Alinidin (B) festzustellen.

Nach Zugabe von Phentolamin (Abb. 19A) kam es zu einem trägen Anstieg der [Ca2+]i, der ab

Minute 13 einsetzte und sein Maximum bei Minute 23 erreichte. Anschließend kam es zu

einem leichten Abfall der [Ca2+]i. In Gegenwart von Diazoxid setzte sich der Rückgang träge

fort. Prästimulatorische Werte wurden jedoch auch bei Minute 50, d.h. nach 20 min

Anwesenheit von Diazoxid, nicht erreicht. Bei Betrachtung der Kontrolle (Krebs-Ringer mit

der jeweiligen Testsubstanz, jedoch ohne Diazoxid) zeigte sich kein signifikanter Unterschied

zwischen dem Ausmaß des Rückgangs der [Ca2+]i, so dass ein Antagonismus zwischen

Phentolamin und Diazoxid nicht nachweisbar war.

Resultate

54

Alinidin (Abb. 19B) führte zu einem raschen Anstieg der [Ca2+]i. Schon bei Minute 12 stiegen

die Werte stark an und erreichten um die Minute 16 ihr Maximum. Dann fielen die Werte

leicht ab und erreichten eine Plateauphase. Nach Zugabe von Diazoxid sank die [Ca2+]i

abrupt. Der Abfall bis auf die prästimulatorischen Werte erfolgte ab Minute 31, jedoch kam es

ab Minute 41 zu einem erneuten, leichten Anstieg der [Ca2+]i, der in ein Plateau überging,

dessen Werte etwas oberhalb der prästimulatorischen lagen.

Mit Idazoxan wurde ein weiteres schnell wirksames Imidazolin getestet. Die

Anwesenheit von Idazoxan (Abb. 19C) führte zu einem raschen, wenn auch nur mäßig stark

ausgeprägten Anstieg der [Ca2+]i. Ab Minute 12 stiegen die Werte und erreichten ab Minute

14 eine Plateauphase. Die zusätzliche Gegenwart von Diazoxid bewirkte eine schnelle

Umkehr des Anstiegs. Die [Ca2+]i fiel zwischen Minute 31 bis 32 deutlich und ab Minute 32

schwächer bis auf die prästimulatorischen Werte ab, welche ab Minute 40 erreicht wurden.

Die Kurve der Kontrolle verlief unterhalb der Testkurve, was darauf zurückzuführen war,

dass mit Idazoxan nur eine geringe Anzahl von Versuchen gemacht werden konnte, da die

Substanz knapp war, und sie zum Zeitpunkt der Versuchsdurchführung nicht zu beschaffen

war. Dennoch kann von einem effektiven Diazoxid-Antagonismus ausgegangen werden.

Der Effekt von Tolbutamid auf die [Ca2+]i war wie erwartet durch Diazoxid zu

antagonisieren. Der Anstieg der [Ca2+]i erfolgte prompt nach Zugabe von Tolbutamid ab

Minute 12. Das Maximum wurde bei Minute 13 erreicht und war die stärkste Erhöhung der

[Ca2+]i, die durch eine der Testsubstanzen bewirkt wurde. Die Werte gingen dann etwas

zurück und verliefen auf einem Plateau. Die Gegenwart von Diazoxid bewirkte einen starken

Abfall der [Ca2+]i, der bei Minute 31 einsetzte. Bei Minute 33 wurden die prästimulatorischen

Werte erreicht, jedoch setzte sich der Abfall weiter fort. Ab Minute 39 wurde wieder eine

Plateauphase erreicht, die leicht unterhalb der prästimulatorischen Werte verlief.

.

Resultate

55

Abb. 19C+D Antagonistische Wirkung von Diazoxid auf den Anstieg der cytosolischen Ca

2+-Konzentration von

B-Zellen des Pankreas durch das Imidazolin Idazoxan (C), sowie durch Tolbutamid (D). Einzelzellen aus NMRI Mausinseln wurden mit Fura 2/AM beladen und mit Krebs-Ringer Medium (5 mM Glucose) bei 37 °C umströmt. Nach 10 min wurde die Testsubstanz (100 µM) bzw. Tolbutamid (500 µM) zugegeben, nach weiteren 20 min zusätzlich Diazoxid (300 µM). Ein Abfall der cytosolischen Ca2+-Konzentration durch Diazoxid war bei Idazoxan (C) und Tolbutamid (D) festzustellen.

Die Zugabe von Chinin (Abb. 19E) führte ebenfalls zu einem Anstieg der [Ca2+]i. Der Anstieg

erfolgte später als bei den vorherigen Versuchen mit Alinidin und Idazoxan. Ab Minute 14

stiegen die Werte deutlich. Um die Minute 17 war der Anstieg maximal. Ab Minute 20 ging

der Anstieg etwas zurück und verharrte auf einer Plateauphase. Auch die Anwesenheit von

Resultate

56

Diazoxid erbrachte keine Reversibilität des Anstiegs. Die Werte verblieben auf einem Plateau,

welches merklich oberhalb der prästimulatorischen Werte verlief. Die Testkurve war so

aussagekräftig, dass hier auf eine Kontrolle verzichtet wurde.

Abb. 19E Antagonistische Wirkung von Diazoxid auf den Anstieg der cytosolischen Ca2+

-Konzentration von B-

Zellen des Pankreas durch Chinin (E). Einzelzellen aus NMRI Mausinseln wurden mit Fura 2/AM beladen und mit Krebs-Ringer Medium (5 mM Glucose) bei 37 °C umströmt. Nach 10 min wurde die Testsubstanz (100 µM) zugegeben, nach weiteren 20 min zusätzlich Diazoxid (300 µM).

Zusammenfassend ließ sich feststellen, dass durch zusätzliche Anwesenheit von 300 µM

Diazoxid nicht nur der Tolbutamid-induzierte Anstieg der [Ca2+]i wieder rückgängig gemacht

wurde, sondern auch der durch die Imidazoline Alinidin und Idazoxan induzierte Anstieg

wurde vollständig antagonisiert. Dagegen wurde der durch Phentolamin und Chinin bewirkte

Anstieg der [Ca2+]i nicht durch Diazoxid beeinflusst.

Resultate

57

4.7 Wirkung des Stoffwechselinhibitors Natriumcyanid auf den Alinidin-induzierten

und den Tolbutamid-induzierten KATP-Kanalblock

Um den Einfluss des Energiestoffwechsels der B-Zelle auf die Effektivität der KATP-

Kanalblockade durch Alinidin und Tolbutamid zu prüfen wurde die Kanalaktivität an intakten

B-Zellen in der cell-attached Konfiguration der Patch-Clamp-Technik gemessen.

100 µM Alinidin führten zu einer praktisch vollständigen Hemmung (Abb. 18; Abb. 18B).

Die Kanalaktivität war auf 2,0 ± 0,7 % gehemmt. 500 µM Tolbutamid bewirkten ebenfalls

eine komplette Hemmung. Die zusätzliche Gegenwart von 200 µM des Stoffwechselinhibitors

Natriumcyanid bewirkte beim Alinidin-induzierten Block eine nicht sigifikante Steigerung

der KATP-Kanalaktivität (Abb. 18; Abb. 18C) auf 5,4 ± 2,3 % des Kontrollwerts (p = 0,255; t-

Test; n = 5); beim Tolbutamid-induzierten Kanalblock jedoch eine Steigerung auf 51,4 ± 27,3

%, die signifikant war (p = 0,03; Mann-Whitney U-test; n = 5).

Abb.18 Wirkung des Stoffwechselinhibitors Natriumcyanid auf den Block von KATP-Kanälen durch das

Imidazolin Alinidin in intakten B-Zellen der Maus. Der Überblick gibt das Versuchsprotokoll anhand von repräsentativen Ausschnitten der Registrierung wieder. Die Pfeile signalisieren Start- bzw. Endpunkte der Zugabe der Testsubstanzen. Für die Zeiträume A-E wird in den Abb. 18A-E entsprechend je ein Ausschnitt mit expandierter und stark expandierter Zeitskala dargestellt.

Resultate

58

Abb. 18 (Fortsetzung 1) Wirkung des Stoffwechselinhibitors Natriumcyanid auf den Block von KATP-Kanälen

durch das Imidazolin Alinidin in intakten B-Zellen der Maus. Nach Zugabe von 100 µM Alinidin kam es zu einer hochgradigen Hemmung der Kanalaktivität (B) verglichen mit der Kontrolle, d.h. Extrazellulärlösung ohne Glucose (A). Wurden zusätzlich 200 µM NaCN gegeben, führte das zu einer geringfügigen Steigerung der Kanalaktivität, insgesamt blieb die Kanalaktivität weiter stark vermindert (C).

Resultate

59

Abb. 18 (Fortsetzung 2) Wirkung des Stoffwechselinhibitors Natriumcyanid auf den Block von KATP-Kanälen

durch das Imidazolin Alinidin in intakten B-Zellen der Maus. Enthielt das Badmedium nur noch NaCN (D), so entsprach die Kanalaktivität im Mittel wieder den Kontrollwerten (A u. E).

Nach Auswaschen von Alinidin führte die alleinige Anwesenheit von 200 µM Natriumcyanid

im Badmedium zu einem deutlichen Anstieg der Kanalaktivität (Abb. 18; Abb. 18D). Die

Kanalaktivität stieg bei der Alinidin-induzierten Hemmung von 5,4 ± 2,3 % auf 107,6 ± 35,5

% bezogen auf den Kontrollwert (EZ ohne Glucose; Abb.18, Abb. 18A. Diese Erhöhung der

Kanalaktivität war signifikant (p = 0,032, t-Test). Beim Tolbutamid-induzierten Block führte

die alleinige Anwesenheit von Natriumcyanid zu einer Steigerung der Kanalaktivität von 51,0

± 37,3 % auf 538,3 ± 139,0 %. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte ± SEM von jeweils n

= 6 (Alinidin) bzw. n = 4 (Tolbutamid) Experimenten.

Diskussion

60

5 Diskussion

Die Fähigkeit von Imidazolingruppen-haltigen Pharmaka, die Insulinsekretion zu steigern, ist

deshalb interessant, weil sie sich von der Wirkung der Sulfonylharnstoffe durch eine stärkere

Glucoseabhängigkeit unterscheidet. Wieweit dieses Charakteristikum durch eine

Beeinflussung des „triggering pathways“ oder des „amplifying pathways“ (nach der

Definition von Henquin, 2000) bedingt ist, ist unklar. Es ist jedoch so, dass auch Imidazoline,

die den KATP-Kanal blockieren und somit den „triggering pathway“ aktivieren, diese

Eigenschaften aufweisen. Es ist daher das Anliegen der vorliegenden Arbeit die Wirkung von

Imidazolinen auf den „triggering pathway“ und hier insbesondere auf den KATP-Kanal

genauer zu charakterisieren.

5.1 Kir6.2 als gemeinsamer Wirkort von Imidazolinen und Chinin

Wie in der Einleitung beschrieben war zu Beginn dieser Arbeit bekannt, dass das

Chinabaumrindenalkaloid Chinin [3H]Clonidin von nichtadrenergen Imidazolin-

bindungsstellen an HIT-Zellen verdrängt. Außerdem war bekannt, dass Chinin in

mikromolaren Konzentrationen die Insulinsekretion durch Hemmung des KATP-Kanals

(HENQUIN et al., 1975; BOKVIST et al., 1990a) steigert. Obwohl Chinin auch andere K+-

Kanäle hemmt (FATHERAZI und COOK, 1991), wird der Block von den KATP-Kanälen in

der B-Zelle als Hauptursache für das Auftreten von Hypoglykämien als unerwünschte

Nebenwirkung von Chinin im therapeutischen Einsatz gegen Malaria angesehen (DAVIS et

al., 1990; GRIBBLE et al., 2000). Der Block ist ausreichend, um die B-Zell Plasmamembran

zu depolarisieren und die Insulinsekretion zu stimulieren, sogar in Abwesenheit von Glucose

(HENQUIN, 1982). Messungen an outside-out Patches von insulinsezernierenden Zellen

zeigten den hemmenden Effekt von 100 µM Chinin auf KATP-Kanäle in RINm5F-Zellen

(FINDLAY et al., 1985) und konzentrationsabhängig (0,01 – 1mM) an HIT-Zellen

(FATHERAZI und COOK, 1991). 100 µM blockierten komplett die KATP-Kanäle in

RINm5F-Zellen, während die KATP-Kanäle der HIT-Zellen bei dieser Konzentration zu 70%

geschlossen waren. Unsere Befunde an intakten HIT-Zellen ergaben eine ähnliche Potenz der

Wirkung von Chinin auf die KATP-Kanäle. Deren Aktivität war um 97 % vermindert.

Wesentlich geringere Konzentrationen an Chinin (10 und 20 µM) benötigten Bokvist et al.,

um an B-Zellen der Maus einen Block der KATP-Kanäle zu erzeugen (BOKVIST et al.,

1990b). Dabei war das Ausmaß der Hemmung von 10 µM Chinin ähnlich ausgeprägt wie bei

dem Block durch 20 µM Chinin, so dass die Autoren in dem Konzentrationsbereich 10-20 µM

Diskussion

61

auch den Bereich sahen, in dem die maximal inhibitorische Wirkkonzentration von Chinin

liegen sollte. Dementsprechend wäre ein IC50-Wert von 1 bis 2 µM anzunehmen. Fatherazi

und Cook bestimmten einen IC50-Wert von 25 µM, wobei diesem Wert allerdings nur drei

Konzentrationen zugrunde lagen. Unsere Messungen führten zu einem geringeren IC50-Wert

von 5,3 µM. Hierbei ist zu berücksichtigen, dass unsere Messungen an intakten Zellen

durchgeführt wurden, wohingegen die Messungen von Findlay et al. und Fatherazi und Cook

an outside-out Membranen durchgeführt wurden. Es kann also eine intrazelluläre

Akkumulation von Chinin in unseren Versuchen möglich gewesen sein und zu dem

niedrigeren IC50-Wert beigetragen haben.

Die in der Einleitung dargestellten Bindungsdaten (Kap. 1.3) und der Befund, dass Chinin den

KATP-Kanal hemmt, führten zu der Hypothese, dass Chinin zumindest eine der spezifischen

nichtadrenergen Imidazolinbindungsstellen an insulinsezernierenden HIT-Zellen erkennt

(RUSTENBECK et al., 1997a), und dass die porenbildende Untereinheit Kir6.2 des KATP-

Kanals diese Stelle sein könnte. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten unterstützen diese

Hypothese insofern, als Chinin ebenso wie Clonidin die Kanalaktivität von Kir6.2∆C26

hemmte. Der IC50-Wert lag bei 14,6 µM. Ein solcher Effekt von Chinin wurde auch von

Gribble und Kollegen bestätigt, die diese Versuche an einer anderen trunkierten Variante,

Kir6.2∆C36, durchgeführt hatten. Mit 10 µM Chinin wurde in diesen Versuchen eine ca.

90%-ige Hemmung erzielt, eine Konzentrationsabhängigkeit wurde jedoch nicht erstellt

(GRIBBLE et al., 2000). Die sich in diesen Versuchen andeutende höhere Potenz der

Wirkung von Chinin kann allerdings nicht direkt mit der in unseren Versuchen erzielten

Wirkung verglichen werden, da ein unterschiedliches Versuchsmodell vorlag (transfizierte

Xenopus Oocyten, giant-inside-out Patch).

In unseren Versuchen war die schließende Wirkung von Chinin auf Kir6.2∆C26

signifikant weniger potent als diejenige auf den nativen KATP-Kanal in HIT-Zellen (IC50: 14,6

µM vs. IC50: 5,3 µM), im Gegensatz zur Wirkung von Clonidin, das an beiden Kanälen

gleiche IC50-Werte aufwies. Daher wurde die Wirkung von Chinin auf einen heterolog

exprimierten Kanal aus Kir6.2∆C26 und SUR1 getestet. Ziel dieser Versuche war es zu

klären, ob die unterschiedliche Potenz der Wirkung von Chinin auf Kir6.2∆C26 und den

nativen KATP-Kanal auf die Anwesenheit von SUR1 im nativen Kanal zurückzuführen war,

SUR1 also als Affinitätsfaktor wirkt oder auf einer unspezifischen Ursache wie z.B. einer

unterschiedlichen zellulären Akkumulation in HEK- und HIT-Zellen beruht.

Der IC50-Wert für die Hemmung der koexprimierten Kir6.2∆C26/SUR1-Kanäle durch

Chinin betrug 29,6 µM und war damit sogar noch höher als der IC50-Wert für die Hemmung

Diskussion

62

von Kir6.2∆C26-Kanälen. Somit ist der Unterschied zwischen den IC50-Werten nicht der

Gegenwart von SUR1 zuzurechnen. Es ergibt sich für Clonidin und Chinin gleichermaßen,

dass SUR1 nicht als Affinitätsfaktor für die Hemmung von Kir6.2 wirkt, im Gegensatz zur

hemmenden Wirkung von ATP4- auf Kir6.2, wo die Anwesenheit von SUR1 zu einer ca.

siebenfachen Steigerung der kanalschließenden Potenz von ATP4- führt (PROKS und

ASCROFT, 1997). Ein fehlender Effekt von SUR1 auf den Chinin-induzierten Schluss

entspricht auch den Befunden von Gribble und Kollegen (2000): an rekonstituierten

Kir6.2/SUR1 Kanälen in Xenopus Oocyten war die Hemmung durch 10 µM Chinin praktisch

ebenso stark wie an Kir6.2∆C36 Kanälen.

Um sicher zu stellen, dass der exprimierte Ionenkanal tatsächlich Kir6.2∆C26 war,

wurde die durchschnittliche Kanaloffenzeit in Einzelkanalmessungen bestimmt. Dadurch ließ

sich ein Unterschied zum nativen KATP-Kanal belegen aber auch Aussagen zum Mechanismus

machen. Die mittlere Kanaloffenzeit wurde durch die Gegenwart der Imidazoline nicht

beeinflusst. Die Hemmung des Kanals kann also nicht auf einen sogenannten „open-channel-

block“ zurückgeführt werden, sondern ist wahrscheinlich durch ein verändertes Gating

bedingt. Ein Kanalblock durch verändertes Gating kann auch durch unspezifische Substanzen,

z.B. Detergentien, hervorgerufen werden und ist daher noch nicht hinweisend auf eine

spezifische Bindungsstelle (SMITH und PROKS, 1998).

5.2 Kir6.2 als Korrelat von nichtadrenergen Imidazolinbindungsstellen in

insulinsezernierenden Zellen.

Clonidin wurde auf seine schließende Wirkung auf native KATP-Kanäle und Kir6.2-Kanäle

getestet, weil Clonidin der prototypische Ligand für I1-Rezeptoren (KD: 1-5 nM) ist

(REGUNATHAN und REIS, 1996) und in früheren Untersuchungen als Radioligand zur

Charakterisierung von Imidazolinrezeptoren an insulinsezernierenden Zellen verwendet

wurde (RUSTENBECK et al. 1997a). Auch Phentolamin und Idazoxan binden an diese Stelle

mit hoher Affinität (Ki: 1-100 nM mit [3H]Clonidin als Radioliganden). Idazoxan ist

außerdem der typische I2-Ligand (Ki Werte von 1-100 nM). Eine Reihe anderer Imidazoline,

die hochaffin an I1-Rezeptoren binden, haben jedoch eine wesentlich geringere Affinität (Ki

Werte von 1–100 µM mit [3H]Idazoxan als Radioliganden), so z.B. Phentolamin und

Rilmenidin. Während I1-Rezeptoren wahrscheinlich auf der Plasmamembran lokalisiert sind,

sind I2-Rezeptoren auf der äußeren Mitochondrienmembran und wahrscheinlich in der

Plasmamembran lokalisiert (REGUNATHAN und REIS, 1996).

Diskussion

63

I1-Rezeptoren wurden in der ventrolateralen Medulla im Hirnstamm des Rinds beschrieben

und sind dort an der Regulation des Blutdrucks mit beteiligt (BOUSQUET et al., 1984;

BOUSQUET et al., 2000). Neben der zentralen Regulation des Blutdrucks über I1-Rezeptoren

scheint zusätzlich ein Einfluss auf den Blutdruck über periphere Imidazolinrezeptoren

möglich zu sein. Die Stimulierung präsynaptischer Imidazolinrezeptoren an sympathischen

Nerven, die die glatten Muskelzellen der Blutgefäße innervieren, führte zu einer Hemmung

der Noradrenalinfreisetzung und damit zu einem Abfall des peripheren Blutdrucks

(GÖTHERT und MOLDERINGS, 1991; LIKUNGU et al., 1996). I2-Rezeptoren wurden u.a.

im Gehirn, in Astrozyten, in der Niere und in Adipozyten nachgewiesen. Substrat zumindest

eines Teils der I2-Rezeptoren scheint das Enzym Monoaminooxidase (MAO) der äußeren

Mitochondrienmembran zu sein. Auch an insulinsezernierenden Zelllinien des Pankreas

wurden I2-Bindungsstellen beschrieben, ohne dass jedoch eine Beziehung zur Insulinsekretion

hergestellt werden konnte (LACOMBE et al., 1993).

Bindungsstudien mit radioaktiv markierten Imidazolinen sprechen dafür, dass weitere

Bindungsstellen existieren, die nicht den Charakteristika der I1- und I2-Bindungsstellen

entsprechen. Diese Versuche wurden an insulinsekretorischen Zelllinien durchgeführt. So

wurde eine Bindungsstelle (KD: 145 nM) an RINm5F Zellen für das tritiierte Imidazolin

[3H]RX821002 nachgewiesen (CHAN et al., 1994). Mit [3H]Clonidin wurde an

insulinsezernierenden HIT-T15-Zellen sowohl eine hochaffine Bindungsstelle (KD: 0,4 nM)

als auch eine niederaffine Bindungsstelle (KD: 241 nM) nachgewiesen (RUSTENBECK et al,

1997a). Die Bindung an die hochaffine Stelle entsprach in der Affinität der Bindung von

Clonidin an α2-Adrenozeptoren (VAN ZWIETEN, 1988). Die niederaffine Stelle war als

nichtadrenerge Imidazolinbindungsstelle zu definieren. Wurden die Adrenozeptoren durch

Noradrenalin maskiert (Abb. 4), ließen sich nicht nur eine, sondern mindestens zwei

nichtadrenerge Bindungsstellen nachweisen (KD: 61 nM für die hochaffine Stelle; KD: 4,5 µM

für die niederaffine Stelle). Im Gegensatz dazu stehen die Daten von Olmos und Kollegen, die

in RIN-5AH Zellen eine Bindung von [125I]-para-Iodoclonidin nur an α2-Adrenozeptoren

nicht aber an Imidazolinbindungsstellen nachweisen konnten (OLMOS et al., 1994).

Bei Betrachtung der ermittelten IC50-Werte der Hemmung des nativen KATP-Kanals

(IC50: 44,2 µM) und des trunkierten Kanals Kir6.2∆C26 (IC50: 40,1 µM) durch den I1-

Rezeptorligand Clonidin, konnte keine Korrelation mit den KD-Werten ermittelt werden.

Zwischen der Potenz der Hemmung des KATP-Kanals bzw. des Kir6.2∆C26-Kanals

einerseits und der Affinität der Bindung von Clonidin und Chinin an HIT-Zellmembranen

andererseits war keine Korrelation festzustellen. Clonidin hatte sowohl zur hoch- als auch zur

Diskussion

64

niederaffinen nichtadrenergen Imidazolinbindungsstelle eine höhere Affinität als Chinin,

während Chinin eine höhere oder zumindest ebenso große Potenz wie Clonidin aufwies, die

genannten Kanalaktivitäten zu hemmen.

Im Vergleich mit Clonidin war das Clonidin-Derivat Alinidin (N-allyl-Clonidin),

welches keine α-agonistischen Eigenschaften mehr besitzt (KOBINGER et al., 1979),

wesentlich potenter in der Hemmung von Kir6.2∆C26. Hier wurde für Alinidin ein IC50-Wert

von 0,38 µM ermittelt. Dem entspricht, dass auch in Versuchen an inside-out Membranen von

normalen B-Zellen Alinidin potenter wirksam war als Clonidin (RUSTENBECK et al.,

1997a). Die höhere Potenz von Alinidin verglichen mit Clonidin spiegelt sich jedoch nicht in

den bisher vorliegenden Bindungsdaten wieder: die Bindungsstudien an HIT-Zellmembranen

ergaben für Clonidin Ki Werte von 38 nM für die hochaffine und von 4,9 µM für die

niederaffine Imidazolinbindungsstelle. Für Alinidin betrugen die entsprechenden Werte 36

nM und 84,9 µM (RUSTENBECK et al., 1997a).

Folgende Gründe können dafür verantwortlich sein, dass sich keine Entsprechung

zwischen den Bindungsaffinitäten und der Hemmung des KATP-Kanals bzw. Kir6.2∆C26-

Kanals nachweisen ließ: 1) die experimentellen Modelle waren unterschiedlich, insofern das

für die Bindungen Membranfraktionen und für die funktionellen Messungen intakte Zellen

verwendet wurden. Dadurch kann es in intakten Zellen zu unterschiedlich ausgeprägten

Akkumulationen der Testsubstanzen kommen, das die Potenz scheinbar erhöht. 2) es liegt

nicht nur eine, sondern mehrere niederaffine Bindungsstellen vor, die in den

Bindungsversuchen nicht aufgelöst werden konnten. Ein Hinweis darauf ist, dass im

Gegensatz zu den Imidazolinen Chinin den Radioliganden nur unvollständig verdrängen

konnte. 3) obgleich Chinin und Clonidin an das gleiche Protein (Kir6.2) binden, müssen die

Bindungsstellen nicht identisch sein. Hier müssten Sättigungsbindungen mit markiertem

Chinin und Clonidin Aufschluss geben.

Um die bisher charakterisierten Imidazolinbindungsstellen an B-Zellen für eine

Klärung der Funktion der Imidazoline nutzbar zu machen, bedarf es höheraffiner Liganden,

die keine Affinität zu α-Adrenozeptoren haben. Davon ausgehend könnte getestet werden, ob

sich die Verdrängung durch klassische Imidazoline wie Phentolamin oder Alinidin von der

Verdrängung durch neue, nicht KATP-kanalwirksame Imidazoline (EFENDIC et al., 2002)

unterscheidet.

Diskussion

65

5.3 Wechselwirkung zwischen Imidazolinen und physiologischen und

pharmakologischen KATP-Kanalöffnern

Die Frage, ob die Imidazolin-induzierte Hemmung des KATP-Kanals der B-Zelle durch

physiologische und pharmakologische Kanalöffner antagonisiert werden kann, wurde in der

vorliegenden Arbeit deshalb untersucht, weil die Öffnung des KATP-Kanals möglicherweise

einen wichtigen Schutzmechanismus von „gestressten“ Zellen (z.B. bei Hypoxie oder

neuronaler Überstimulation) darstellt (BALLANYI, 2004). Es wäre also potentiell gefährlich,

wenn ein solcher Schutzmechanismus durch permanente Blockade des KATP-Kanals

ausgeschaltet werden würde.

Als physiologische Kalium-Kanal-Öffner fungieren Nukleosiddiphosphate, wenn

intrazellulär Mg2+ zur Verfügung steht (ZÜNKLER et al., 1988). Der öffnende Effekt auf den

KATP-Kanal ist abhängig von der Interaktion mit den Walker A und Walker B Motiven in den

Nukleosid-Bindungs-Domänen auf der regulativen Untereinheit SUR (SHYNG et al., 1997;

GRIBBLE et al., 1997). In Abwesenheit von intrazellulärem Mg2+ haben

Nukleosiddiphosphate einen hemmenden Einfluss auf die KATP-Kanalaktivität, diese

Hemmung ist jedoch weniger effektiv als diejenige der Nukleosidtriphosphate. Verwendet

wurde in den Versuchen dieser Arbeit MgGDP, weil GDP die schwächste inhibitorische

Wirkung der Nukleosiddiphosphate auf den KATP -Kanal aufweist (SCHWANSTECHER et

al., 1994), MgGDP deshalb der reinste KATP-Kanalöffner unter den Nukleosiddiphosphaten

ist.

Als pharmakologischer Kalium-Kanal-Öffner (KCO) wurde das den Thiaziddiuretika

verwandte Diazoxid eingesetzt, das die Glucose- und Sulfonylharnstoff-induzierte

Insulinsekretion in den B-Zellen des Pankreas hemmt (SELZER und ALLEN, 1965; PORTE,

1968). Die Wirkung auf die B-Zelle wird über den gleichen KATP-Kanal vermittelt, der von

Sulfonylharnstoffen spezifisch geschlossen wird (HENQUIN und MEISSNER, 1982; TRUBE

et al., 1986). Ferner wurde auch eine öffnende Wirkung von Diazoxid an cardialen und

glattmuskulären KATP-Kanälen nachgewiesen (BABENKO et al., 1998). Während

Imidazoline einen Teil ihrer Wirkung durch einen Angriff an Kir6.2 vermitteln, liegt die

Bindungsstelle für Diazoxid wie die für die Sulfonylharnstoffe auf der regulativen

Untereinheit (ÄMMÄLÄ et al., 1996). Dabei scheint der C-Terminus der SUR-Untereinheit

eine wichtige Rolle zu spielen (BABENKO et al., 1998). Diazoxid öffnet die

Sulfonylharnstoff-geblockten KATP-Kanäle der B-Zelle und repolarisiert deren

Plasmamembran, so dass sich die spannungsabhängigen Ca2+-Kanäle schließen, und es zu

einem Abfall der intrazellulären Ca2+-Konzentration kommt (PANTEN et al., 1996).

Diskussion

66

Die bisher veröffentlichen Untersuchungen ergaben ein widersprüchliches Bild hinsichtlich

der Frage, ob KATP-Kanalblocker, die direkt auf Kir6.2 wirken (wie Imidazoline und Chinin),

durch Diazoxid antagonisiert werden können.

Henquin und Kollegen untersuchten in Umströmungsversuchen an B-Zellen der Maus

anhand des 86Rb-Effluxes den Einfluss von Diazoxid (100 µM) auf die schließende Wirkung

von 20 µM Phentolamin. Das Badmedium enthielt zusätzlich 6 mM Glucose, bei dieser

Konzentration sind unter physiologischen Bedingungen die meisten KATP-Kanäle geschlossen.

Diazoxid war nicht in der Lage, den 86Rb-Ausstrom zu verstärken (PLANT und HENQUIN,

1990). Auch in der whole-cell Konfiguration der Patch-Clamp-Technik wurde die

Kanalaktivität in Gegenwart von 20 µM Phentolamin durch 100 µM Diazoxid nur mäßig von

5,7 % auf 9,1 % vom Kontrollwert gesteigert (PLANT und HENQUIN, 1990). In die gleiche

Richtung wiesen Befunde von Bokvist et al. (1990), die fanden, dass der Chinin-induzierte

Block des KATP-Kanals in outside-out Membranen durch Diazoxid (200 µM) nicht zu

antagonisieren war. Andererseits zeigte sich jedoch bei Messungen des Membranpotentials

von B-Zellen, dass die persistierende, komplette Depolarisation, die durch 30 µM

Phentolamin hervorgerufen war, durch Diazoxid aufgehoben werden konnte. Allerdings war

bei diesen Versuchen Phentolamin vor Zugabe von Diazoxid aus dem Badmedium entfernt

(RUSTENBECK et al., 1999a). Weiterhin wurde gezeigt, dass der Phentolamin-induzierte

Ca2+-Anstieg in B-Zellen in Gegenwart von Diazoxid deutlich geringer ausfiel

(RUSTENBECK et al., 1999a). Somit waren Hinweise gegeben, dass Diazoxid einen für die

Insulinsekretion relevanten Antagonismus des Imidazolineffektes an KATP-Kanälen ausübt.

In der vorliegenden Untersuchung wurde die Hemmung von nativen KATP-Kanälen in

der inside-out Konfiguration durch die Imidazoline Alinidin und Phentolamin durch die

Gegenwart des öffnenden Nukleotids MgGDP ebenso antagonisiert wie die Hemmung durch

Tolbutamid oder Chinin. Die zusätzliche Gegenwart von Diazoxid erbrachte nur bei der

Alinidin-induzierten Hemmung eine weitere signifikante Steigerung der Kanalaktivität. Für

Phentolamin und Chinin ergab sich keine signifikante Veränderung der Kanalaktivität durch

die Anwesenheit von Diazoxid. Eine mögliche Erklärung für die unterschiedliche Effektivität

von Diazoxid ist, dass durch die Gegenwart von MgGDP in letzteren Fällen bereits eine

maximale Öffnung der KATP-Kanäle erzielt wurde. Andererseits kamen Unterschiede

zwischen den schließenden Substanzen hinsichtlich ihres Wirkungsmechanismus in Betracht.

Durch den Nachweis jedoch, dass die von allen Testsubstanzen (Imidazoline ebenso wie

Tolbutamid und Chinin) induzierte Depolarisation der Plasmamembran von B-Zellen durch

Diazoxid zu antagonisieren waren, war die Interpretation wahrscheinlich, dass Diazoxid

Diskussion

67

grundsätzlich den über Kir6.2 vermittelten Schluss des KATP-Kanals ebenso zu antagonisieren

vermag wie den über SUR1 (z.B. durch Sulfonylharnstoffe) vermittelten Kanalschluss.

Um zu klären, ob dieser Befund auch für die intakte B-Zelle Gültigkeit hat, wurde die

Messung der cytosolischen Calciumkonzentration ([Ca2+]i) durchgeführt. Die [Ca2+]i spiegelt

die Aktivität von spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen wieder und diese sind wiederum von

der De- und Repolarisation der Plasmamembran abhängig. Hier konnte der von Phentolamin

und Chinin hervorgerufene Anstieg der [Ca2+]i nicht durch die Gegenwart von Diazoxid

rückgängig gemacht werden, während sich der Alinidin- und Idazoxan-induzierte Anstieg

durch Diazoxid antagonisieren ließ, ebenso wie der Tolbutamid-induzierte Ca2+-Anstieg.

Insofern war der Befund bestätigt, dass der KATP-Kanalschluss durch Alinidin im inside-out

Patch durch Diazoxid antagonisierbar war. Warum waren aber die Wirkungen von

Phentolamin und Chinin auf die [Ca2+]i nicht durch Diazoxid antagonisierbar, obwohl die

Ergebnisse der Membranpotentialmessungen ein solches Ergebnis erwarten ließen? Die

wahrscheinliche Erklärung ist, dass die unterschiedlichen Ergebnisse durch die

verschiedenartigen Zellkonfigurationen bedingt sein können. Durch die Herstellung der

whole-cell Konfiguration zur Messung des Membranpotentials steht das Cytosol in

Verbindung mit der Pipettenlösung und wird gewissermaßen dialysiert (NUMBERGER und

DRAGUHN, 1996). Durch diesen Vorgang können entweder mögliche Mediatorsubstanzen

der Imidazolinwirkung oder die Imidazoline (bzw. Chinin) selbst in ihrer cytosolischen

Konzentration soweit vermindert werden, dass ein Antagonismus durch Diazoxid möglich ist.

Die Relevanz der Messungen der [Ca2+]i konnte jetzt durch Messungen der Insulinsekretion an

perifundierten Inseln der Maus bestätigt werden. Die insulinsekretionssteigernde Wirkung

von Phentolamin konnte von Diazoxid nicht antagonisiert werden, wohl aber diejenige von

Alinidin (RUSTENBECK et al., 2002).

Ein Antagonismus zwischen Imidazolinen und Diazoxid wurde auch von der Gruppe

um Dunne an intakten B-Zellen beschrieben. Erstaunlicherweise war in diesen Versuchen

Diazoxid (250 µM) in der Lage, die [Ca2+]i-steigernde Wirkung einer supramaximalen

Konzentration (500 µM) von Phentolamin stark zu vermindern (SHEPHERD et al., 1996). In

weiteren Versuchen dieser Gruppe wurde jedoch gefunden, dass Phentolamin in der Lage

war, auch in der Gegenwart von Diazoxid einen deutlichen [Ca2+]i -Anstieg zu bewirken,

hingegen konnte das Imidazolin Efaroxan nur in 5 von 11 Versuchen eine solche Wirkung

aufweisen (SHEPHERD et al., 1996). Auch in diesen Versuchen deutet sich also ein

Unterschied zwischen den Wirkungen der Imidazoline an intakten Zellen an, wenngleich er in

dieser Arbeit nicht diskutiert wird.

Diskussion

68

Die Frage, ob Diazoxid den KATP-Kanal öffnet, obwohl ein Imidazolin gebunden ist, oder ob

es die Bindung des Imidazolins vermindert, kann anhand der bisherigen Daten nicht

entschieden werden. In die letztere Richtung deutet der Befund, dass Diazoxid [3H] Clonidin

mäßiggradig aber signifikant von der Bindung an HIT-Zellmembranen verdrängt

(RUSTENBECK et al., 1997a)

5.4 Konsequenzen der Hemmung des Energiestoffwechsels der B-Zellen für den

Imidazolin-induzierten Schluss von KATP-Kanälen

Der Befund, dass MgGDP die Alinidin-induzierte Hemmung der KATP-Kanäle in den inside-

out Membranen von normalen Maus B-Zellen antagonisieren konnte, führte zu der Erwartung,

dass die Imidazolin-geblockten KATP-Kanäle durch die Hemmung des Energiestoffwechsels

der B-Zelle (metabolischer Stress) zu öffnen wären. Bei länger dauernder metabolischer

Hemmung kommt es zu einem Abfall der ATP- und einem Anstieg der ADP-Konzentration

im Cytosol. An der intakten Zelle zeigte sich jedoch keine signifikante Öffnung des durch 100

µM Alinidin induzierten Blocks des KATP-Kanals durch 7,5 minütige Umströmung mit NaCN,

gemessen in der cell-attached Konfiguration der Patch-Clamp-Technik. Hingegen kann der

von Tolbutamid oder anderen Sulfonylharnstoffen induzierte Block der KATP-Kanäle durch

metabolische Blockade (d.h. wahrscheinlich durch Anstieg von MgADP) aufgehoben werden,

wie auch in dieser Arbeit bestätigt werden konnte. NaCN wirkt als Hemmstoff der

Cytochrom-Oxidase, welches in der inneren Mitochondrienmembran den Komplex IV der

Atmungskette bildet (TYLER, 1992). Als Folge unterbleibt die Phosphorylierung von ADP

zu ATP am Atmungskettenkomplex V, so dass die ATP/ADP Ratio im Cytosol sinkt. Als

mögliche Erklärung für die Diskrepanz zwischen der öffnenden Wirkung von MgGDP an

inside-out Membranen und der fehlenden Öffnung bei metabolischer Hemmung von intakten

B-Zellen kann angenommen werden, dass der ADP-Anstieg (oder ATP-Abfall) nicht stark

genug war, um die durch Alinidin gehemmten Kanäle zu öffnen.

Der Befund, dass der Alinidin-Block bei metabolischer Hemmung persistiert, steht in

Übereinstimmung mit dem Befund, dass der Cibenzolin-Block an KATP-Kanälen von B-Zellen

der Ratte durch 2,4-Dinitrophenol (DNP) nicht aufgehoben werden konnte (MUKAI et al.,

1998). Cibenzolin ist ein IA-Antiarrhythmikum und zählt aufgrund seiner Struktur zu den

Imidazolinen. Mukei et al. zeigten, dass Cibenzolin seinen hemmenden Effekt über eine

Bindungsstelle auf Kir6.2 vermittelt, so dass eine gleichartige Wirkung wie bei den hier

getesteten Imidazolinen anzunehmen ist. DNP ist ein Entkoppler der Atmungskette, es macht

die innere Mitochondrienmembran durchlässig für Protonen, wodurch das Membranpotential

Diskussion

69

der inneren Mitochondrienmembran kollabiert und die oxidative Phosphorylierung von ADP

zu ATP, ähnlich wie in Gegenwart von Cyanid, zum Erliegen kommt (TYLER, 1992). Im

Unterschied zur Wirkung von Cyanid läuft die Sauerstoffreduktion weiter, sie ist sogar

maximal erhöht (TYLER, 1992).

Im Gegensatz zum Alinidin-induzierten Block war der Tolbutamid-induzierte Block

der KATP-Kanäle in intakten B-Zellen durch NaCN abzuschwächen. Dieser Befund stimmt mit

den Beobachtungen von Findlay (FINDLAY, 1993) überein, der an ventrikulären Myocyten

der Ratte die durch die Entkoppler DNP und FCCP (Carbonylcyanid-trifluormethoxy-

phenylhydrazon) aktivierten ATP-sensitiven K+-Kanäle durch Glibenclamid und Tolbutamid

nur vorübergehend hemmen konnte. Die Abhängigkeit des durch Sulfonylharnstoffe

induzierten Blocks vom Energiestoffwechsel konnte auch an KATP-Kanälen von B-Zellen

gefunden werden (MUKAI et al., 1998). Somit bietet sich eine Erklärung an, dass die

unterschiedliche Reaktion auf eine metabolische Hemmung dadurch bedingt ist, dass

Imidazoline an Kir6.2 und Sulfonylharnstoffe an SUR1 bzw. SUR2 binden. Diese Erklärung

ist aber insofern nicht hinreichend, als auch der Block des KATP-Kanals durch Phenylalanin-

Derivate und Benzoesäure-Derivate nicht oder nur gering durch eine metabolische Hemmung

zu beinflussen ist. Beide Substanzgruppen binden an SUR1 (HU et al., 2000; HANSEN et al.,

2002). So wurde gezeigt, dass die Wirkung des Phenylalanin-Derivats Nateglinid (A-4166)

sehr viel weniger durch eine metabolische Hemmung zu beeinflussen war als die von

Sulfonylharnstoffen (FUJITANI et al., 1997). Auch das Benzoesäure-Derivat Repaglinid war

nicht durch metabolischen Stress in seiner hemmenden Wirkung auf den KATP-Kanal

vermindert (KOFOD und FUHLENDORFF, 1995). Zwar ist Repaglinid als Benzoesäure-

Derivat nicht selektiv für den B-Zell-Typ des Sulfonylharnstoffrezeptors, SUR1,

möglicherweise wird aber die Bindungsstelle von Repaglinid von SUR und Kir6.x zusammen

gebildet, wodurch sich eine Erhöhung und Differenzierung der Bindungsaffinitäten ergibt

(HANSEN et al., 2005).

In Versuchen, die gegenwärtig in der Arbeitsgruppe durchgeführt werden, hat sich

gezeigt, dass die Wirkung von Alinidin in einer geringeren, halbmaximal wirksamen

Konzentration durch metabolische Hemmung aufzuheben war. Dadurch ist der ursprüngliche

Befund, dass MgGDP Alinidin-geschlossene KATP-Kanäle öffnen kann, bestätigt worden. Es

kann angenommen werden, dass die Hemmung von KATP-Kanälen durch Imidazoline nicht

notwendigerweise zu einem Verlust der Schutzfunktion dieses Kanals bei zellulärem Stress

führt.

Zusammenfassung

70

6 Zusammenfassung

Imidazoline sind als potentielle orale Antidiabetika interessant, da einige Vertreter dieser

Substanzgruppe die Insulinsekretion nur in Gegenwart von erhöhten Glucosekonzentrationen

steigern. Hierdurch unterscheiden sie sich vorteilhaft von den bisher am meisten verwendeten

insulinsekretionssteigernden Pharmaka, den Sulfonylharnstoffen, die die Insulinsekretion

auch bei sehr niedrigen Glucosekonzentrationen steigern können. Als Wirkmechanismus ist

die Hemmung des KATP-Kanals der insulinsezernierenden B-Zellen bekannt; im Gegensatz zu

den Sulfonylharnstoffen, die an die regulative Untereinheit (SUR1) dieses Kanals binden,

binden die Imidazoline an die porenbildende Untereinheit (Kir6.2). Da die Konsequenzen der

Hemmung gleich sind, kann dieser Mechanismus jedoch nicht die unterschiedliche

Wirkcharakteristika von Imidazolinen und Sulfonylharnstoffen erklären und es sind in der Tat

zusätzliche Effekte in späteren Abschnitten der Stimulus-Sekretions-Kopplung der B-Zelle

beschrieben worden.

Seit mehreren Jahre wird die Existenz von nichtadrenergen Imidazolinrezeptoren

postuliert und von einigen Autoren wird die Auffassung vertreten, dass auch die B-Zellen des

Pankreas über einen Subtyp solcher Imidazolinrezeptoren („I3“-Rezeptoren) verfügen. In

vorangegangenen Untersuchungen waren eine hoch- und eine niederaffine nichtadrenerge

Imidazolinbindungsstelle an insulinsezernierenden HIT-Zellen charakterisiert worden. In der

vorliegenden Arbeit sollte einerseits das Verhältnis von Imidazolinbindungsstellen und KATP-

Kanal als Wirkort von Imidazolinen weiter geklärt werden und andererseits die funktionellen

Konsequenzen der Hemmung dieses Kanals (insgesamt der „triggering pathway“ nach

Henquin) weiter untersucht werden. Insbesondere interessierte in diesem Zusammenhang die

Frage, ob die über den Schluss von Kir6.2 vermittelten Wirkungen antagonisierbar sind, d.h.

einer physiologischen oder pharmakologischen Modulation zugänglich sind.

Für die erste Fragestellung wurden die Wirkungen von Clonidin und Chinin auf den nativen

KATP-Kanal von insulinsezernierenden HIT-Zellen mit ihren Wirkungen auf die heterolog

exprimierte porenbildende Untereinheit Kir6.2 verglichen. Da die Expression von Kir6.2

allein keinen funktionsfähigen Kanal ergibt, wurde stattdessen eine C-terminal deletierte

Variante, Kir6.2∆C26, eingesetzt, die auch ohne die Gegenwart der regulativen Untereinheit

(SUR1) Ionenkanalaktivität in der Plasmamembran hat.

Clonidin wurde als Testsubstanz ausgewählt weil es 1) der prototypische Radioligand

für die relativ gut charakterisierten I1-Rezeptoren ist und als solcher bereits für die

Charakterisierung von Imidazolinbindungsstellen an insulinsezernierenden Zellen eingesetzt

Zusammenfassung

71

worden ist, 2) den KATP-Kanal blockiert und 3) die Insulinsekretion steigert, wenn die α2-

Adrenozeptoren der B-Zelle blockiert sind. Chinin wurde als Testsubstanz ausgewählt, weil

es 1) den KATP-Kanal blockiert, 2) die Insulinsekretion steigert und 3) Clonidin als

Radioliganden von Imidazolinbindungsstellen von HIT-Zellmembranen verdrängt. Es stellte

sich konkret die Frage, ob Clonidin und Chinin direkt an der porenbildenden Untereinheit

wirksam sind und somit Kir6.2 einen gemeinsamen Bindungsort für diese Substanzen

darstellt. Der Vergleich mit der Wirkung auf den nativen KATP-Kanal der HIT-Zellen sollte

einerseits den Bezug zu den Bindungsstudien herstellen, andererseits die Frage beantworten,

ob die zusätzliche Gegenwart der regulativen Untereinheit SUR1 die Wirkung der beiden

Substanzen beeinflusst.

Die Expression von Kir6.2∆C26 in HEK293-Zellen wurde durch Koexpression des

grünfluoreszierenden Proteins (GFP) identifiziert. Die Identität dieses Kanals wurde durch

Bestimmung elektrophysiologischer Merkmale (mittlere Kanaloffenzeit von Kir6.2∆C26 0,81

± 0,1 ms vs. 1.54 ± 0.2 ms beim nativen KATP-Kanal) und pharmakologischer Merkmale

(Hemmung durch ATP und Imidazoline, nicht aber durch Sulfonylharnstoffe) belegt. Die

Einzelkanalamplitude und die mittlere Einzelkanalöffnungszeit wurden durch die Hemmung

mit Imidazolinen nicht beeinflusst, hierdurch kann ein unspezifischer „open channel block“

wie er typischerweise von Lokalanästhetika bewirkt wird, als ausgeschlossen gelten.

Es ließ sich nachweisen, dass sowohl Chinin als auch Clonidin in mikromolaren

Konzentrationen die Kanalaktivität von Kir6.2 ∆C26 hemmten (IC50 14,6 ± 2,1 bzw. 40,1 ±

13,7 µM) damit könnte dieser Kanal also das Korrelat der niederaffinen Imidazolin-

bindungsstelle darstellen, die auch Chinin bindet. Auch das Clonidin-Derivat Alinidin, das

keine a2-agonistische Wirkung hat, hemmte die Kanalaktivität von Kir6.2 ∆C26. Die

hemmende Wirkung dieser Substanzen wurde durch die zusätzliche Anwesenheit der

regulativen Untereinheit SUR im nativen Kanal nicht verstärkt, dieser Befund ließ sich auch

durch heterologe Koexpression von Kir6.2∆C26 mit SUR1 bestätigen. Damit unterscheidet

sich der Schluss des KATP-Kanals durch Imidazoline und Chinin von dem ebenfalls an Kir6.2

bewirkten Kanalschluss durch ATP, der durch die Anwesenheit von SUR deutlich potenter

wird.

Eine eindeutige Parallelität zwischen der hemmenden Wirkung von Clonidin und

Chinin auf den KATP-Kanal und ihrer Bindungaffinität für nichtadrenerge

Imidazolinbindungsstellen von insulinsezernierenden HIT-Zellen ließ sich jedoch nicht

belegen. Ursächlich könnten hierfür die unterschiedlichen experimentellen Systeme von

Verdrängungsbindung einerseits und Funktionsmessung andererseits sein, aber auch die

Zusammenfassung

72

Möglichkeit, dass es mehrere niederaffine Imidazolinbindungsstellen gibt, die in den

Bindungsversuchen nicht aufgelöst wurden.

Die durch Imidazoline und Chinin ausgelöste Hemmung des KATP-Kanals in inside

out-Membranen von B-Zellen ließ sich durch ein öffnendes Nukleotid, MgGDP, ebenso

antagonisieren wie der durch das Sulfonylharnstoff Tolbutamid ausgelöste Block. Eine

zusätzlich öffnende Wirkung des pharmakologischen Kaliumkanalöffners Diazoxid ließ sich

jedoch nur für Alinidin, nicht jedoch für Phentolamin belegen. Wurde jedoch als indirekter

Parameter der Hemmung des KATP-Kanals das Membranpotential in der whole cell-

Konfiguration gemessen, so war die depolarisierende Wirkung aller in maximal effektiver

Konzentration getesteten Imidazoline und auch von Chinin durch Diazoxid zu antagonisieren.

Die Ergebnisse belegen, dass nicht nur die Wirkung von solchen KATP-Kanal-Blockern, die

wie Sulfonylharnstoffe an SUR binden, sondern von solchen, die an Kir6.2 binden, durch

Diazoxid antagonisiert werden kann.

An metabolisch intakten B-Zellen, hier wurde als indirekter Parameter die

cytosolische Ca2+-Konzentration gemessen, konnte jedoch bei gleichen Konzentrationen ein

Diazoxid-Antagonismus nur mit den Imidazolinen Alinidin und Idazoxan (und

erwartungsgemäß auch mit Tolbutamid) gesehen werden, nicht aber mit dem Imidazolin

Phentolamin und mit Chinin. Als Erklärung für diese Diskrepanz bietet sich an, dass letztere

Substanzen in intakten Zellen akkumulieren oder dort zusätzliche Mechanismen auslösen, die

eine Antagonisierung durch Diazoxid behindern.

Eine weitere Eigenschaft, die nur in intakten Zellen geprüft werden kann, ist die

Aufhebung der KATP-Kanal-blockierenden Wirkung durch metabolische Hemmung,

wahrscheinlich vermittelt durch einen Anstieg der MgADP-Konzentration. Nur die

kanalschließende Wirkung von Tolbutamid, nicht aber von Alinidin war durch metabolische

Hemmung zu vermindern. Angesichts des Antagonismus zwischen MgGDP und Alinidin am

inside-out Patch war diese Beobachtung unerwartet und bedarf einer sorgfältigen Klärung.

Insgesamt weisen die Ergebnisse in dieser Arbeit darauf hin, dass die Hemmung des

KATP-Kanals durch Imidazoline ein spezifischer und durch endogene oder pharmakologische

Regulatoren der Kanalaktivität modulierbarer Effekt ist. Die o.g. vorteilhaften Charakteristika

bezüglich der Insulinsekretionssteigerung lassen sich durch die Wirkung auf den KATP-Kanal

und den dadurch aktivierten „triggering pathway“ allein nicht erklären, sie können aber als

eine Summation von Wirkungen auf den KATP-Kanal und auf spätere Ereignisse in der

Stimulus-Sekretions-Kopplung aufgefasst werden. Insofern kann es für die

Weiterentwicklung dieser Substanzklasse essentiell sein, welche Bedeutung die Hemmung

Zusammenfassung

73

des KATP-Kanals besitzt. Der Einwand, eine Hemmung des KATP-Kanals über Kir6.2 sei ein

unspezifischer und nicht regulierbarer Porenblock und würde mit einem möglichen

therapeutischen Einsatz solcher Substanzen nicht vereinbar sein, ist nach den vorliegenden

Daten nicht zutreffend.

Literaturstellen

74

7 Literaturstellen

AGUILAR-BRYAN L, NICHOLS CG, WECHSLER SW, CLEMENT JP IV, BOYD AE III,

GONZALES G, HERRERA-SOSA H, NGUY K, BRYAN J, NELSON DA (1995): Cloning of the beta cell high-affinity sulfonylurea receptor: a regulator of insulin-secretion. Science 268: 423-426

AGUILAR-BRYAN L, CLEMENT JP IV, NELSON DA (1998): Sulfonylurea receptors and

ATP-sensitive potassium ion channels. Methods Enymol 292: 732-744 AHRÉN B, LUNDQUIST I (1985): Effects of α-adrenoceptor blockade by phentolamine on

basal and stimulated insulin secretion in the mouse. Acta Physiol Scand 125: 211-217 ÄMMÄLÄ C, MOORHOUSE A, ASHCROFT FM (1996): The sulfonylurea receptor confers

diazoxide sensitvity on the inwardly rectifying K+ channel Kir6.1 expressed in human embryonic kidney cells. J Physiol 494: 709-714

ASHCROFT FM, RORSMAN P (1989): Electrophysiology of the pancreatic ß-cell. Prog

Biophys Mol Biol 54: 87-143 ASHCROFT FM, RORSMAN P (1990): ATP-sensitive K+ channels: a link between ß-cell

metabolism and insulin secretion. Biochem Soc Trans 18: 109-111 ASHCROFT FM, GRIBBLE FM (1999): ATP-sensitive K+ channels and insulin secretion:

their role in health and disease. Diabetologia 8: 903-919 AUERBACH A, SACHS F (1985): High resolution patch-clamp techniques. In: Voltage and

patch clamping with microelectrodes; hrsg. v. Smith TG, Jr., Lecar H, Redman SJ, Gage PW; Waverly Press Inc., Baltimore/Maryland Kap.6: 121-149

BABENKO AP, AGUILAR-BRYAN L, BRYAN J (1998): A view of SUR/KIR6.X, KATP

channels. Annu Rev Physiol 60: 667-687 BALLANYI K (2004): Protective role of neuronal KATP channels in brain hypoxia. J Exp

Biol 207 (Pt 18): 3201-3212 BERGER W, CARDUFF F, PASQUEL M, PUMP A (1986): Die relative Häufigkeit der

schweren Hypoglykämien unter Sulfonylharnstofftherapie in den letzten 25 Jahren in der Schweiz. Schweiz Med Wschr 116: 145-151

BOKVIST K, RORSMAN P, SMITH PA (1990a): Effects of external tetraethylammonium

ions and quinine on delayed rectifying K+ channels in mouse pancreatic ß-cells. J

Pysiol 423: 311-325 BOKVIST K, RORSMAN P, SMITH PA (1990b): Block of ATP-regulated and Ca2+-

activated K+ channels in mouse pancreatic ß-cells by external tetraethylammonium and quinine. J Physiol 423: 327-342

BOUSQUET P, FELDMAN J, SCHWARTZ J (1984): Central cardiovascular effects of alpha

adrenergic drugs: differences between catecholamines and imidazolines. J Pharmacol

Exp Ther 230: 232-236

Literaturstellen

75

BOUSQUET P, DONTENWILL M, GRENEY H, FELDMAN J (2000): Imidazoline

receptors in cardiovascular and metabolic diseases. J Cardiovasc Pharmacol 35

(Suppl 4): S21-25 CHALFIE M, TU Y, EUSKIRCHEN G, WARD WW, PRASHER DC (1994): Green

fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263: 802-805 CHAN SLF, MORGAN NG (1990): Stimulation of insulin secretion by efaroxan may involve

interaction with potassium channels. Eur J Pharmacol 176: 97-101 CHAN SLF, DUNNE MJ, STILLINGS M, MORGAN NG (1991): The α2-adrenoceptor

antagonist efaroxan modulates KATP channels in insulin-secreting cells. Eur J

Pharmacol 204: 41-48 CHAN SLF, MORGAN NG (1993): Stimulation of insulin secretion by the imidazoline α2-

adrenoceptor antagonist efaroxan is mediated by a novel, stereoselective, binding site. Eur J Pharmacol 230: 375-378

CHAN SLF, BROWN CA, SCARPELLO K, MORGAN NG (1994): The imidazoline site

involved in insulin secretion: characteristics that distinguish it from I1 and I2 sites. Br J

Pharmacol 112: 1065-1070 CHAN SLF, ATLAS D, JAMES RFL, MORGAN NG (1997a): The effect of the putative

endogenous imidazoline receptor ligand clonidine-displacing substance, on insulin secretion from rat and human islets. Br J Pharmacol 112: 1065-1070

CHAN SLF, SCARPELLO KE, MORGAN NG (1997b): Identification and characterization

of non-adrenergic binding sites in insulin-secreting cells with the imidazoline RX821002. Adv Exp Med Biol 426: 159-163

COBBOLD PH, RINK TJ (1987): Fluorescence and bioluminescence measurement of

cytoplasmic free calcium. Biochem J 248: 313-328 COLQUHOUN D, SIGWORTH FJ (1983): Fitting and statistical analysis of single-channel

records; in: Single-Channel Recording; hrsg. v. Sakmann B, Neher E; Plenum Press, New York, London, 191-193

CRYER PE (2002): Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of

Type I and Type II diabetes. Diabetologia 45: 937-948 DAVIS TME, KARBWANG S, LOOAREESUWAN, R, TURNER RC, WHITE NJ (1990):

Comparative effects of quinine and quinidine on glucose metabolism in healthy volunteers. Br J Clin Pharmacol 30: 397-403

DETIMARY P, GILON P, NENQUIN M, HENQUIN JC (1994): Two sites of glucose

control of insulin release with distinct dependence of the energy state in pancreatic B-cells. Biochem J 297: 455-461

Literaturstellen

76

DE VOS H, BRICCA G, DE KEYSER J, DE BACKER JP, BOUSQUET P, VAUQUELIN G (1994): Imidazoline receptors, nonadrenergic idazoxan binding sites and α2-adrenoceptors in the human central nervous system. Neuroscience 59: 589-598

DUNNE MJ (1991): Block of ATP-regulated potassium channels by phentolamine and other

α-adrenoceptor antagonists. Br J Pharmacol 103: 1847-1850 EFANOV AM, ZAITSEV SV, MEST HJ, RAAP A, APPELSKOG IE, LARSSON O,

BERGGREN PO, EFENDIC S (2001): The novel imidazoline compound BL11282 potentiates glucose-induced insulin secretion in pancreatic ß-cells in the absence of modulation of KATP channel activity. Diabetes 50: 797-802

EFENDIC S, EFANOV AM, BERGGREN PO, ZAITSEV SV(2002): Two generations of

insulinotropic imidazoline compounds. Diabetes 51 (Suppl 3): S448-454 ELIASSON L, RENSTRÖM E, ÄMMÄLÄ C, BERGGREN PO, BERTORELLO AM,

BOKVIST K, CHIBALIN A, DEENEY JT, FLATT PR, GÄBEL J, GROMADA J, LARSSON O, LINDSTRÖM P, RHODES CJ, RORSMAN P (1996): PKC-dependent stimulation of the exocytosis by sulfonylureas in pancreatic ß-cells. Science 271: 813-815

FATHERAZI S, COOK DL (1991): Specifity of tetraethylammonium and quinine for three K

channels in insulin-secreting cells. J Membrane Biol 120: 105-114 FERNER RE, CHAPLIN S (1987): The relationship between the pharmacokinetics and

pharmacodynamic effects of oral hypoglycaemic drugs. Clin Pharmacokinet

12: 379-401 FINDLAY I, DUNNE MJ, ULLRICH S, WOLLHEIM CB, PETERSEN OH (1985): Quinine

inhibits Ca2+-independent K+ channels whereas tetraethylammonium inhibits Ca2+-activated K+ channels in insulin-secreting cells. FEBS Lett 185: 4-8

FINDLAY I (1993): Sulfonylurea drugs no longer inhibit ATP-sensitive K+ channels during

metabolic stress in cardiac muscle. J Pharmacol Exp Ther 266: 456-467 FONSECA V, ROSENSTOCK J, PATWARDHAN R, SALZMANN A (2000): Effect of

metformin and rosiglitazone combination therapy in patients with type 2 diabetes mellitus: a randomized controlled trial. JAMA 283: 1695-1702

FUJITANI S, OKAZAKI K, YADA T (1997): The ability of a new hypoglycaemic agent, A-

4166, compared to sulphonylureas, to increase cytosolic Ca2+ in pancreatic ß-cells under metabolic inhibition. Br J Pharmacol 120: 1191-1198

GERBER SH, SÜDHOF TC (2002): Molecular determinants of regulated exocytosis.

Diabetes 51 (Suppl 1): S3-S11 GÖTHERT M, MOLDERINGS GJ (1991): Involvement of presynaptic imidazoline receptors

in the α2-adrenoceptor-independent inhibition of noradrenaline release by imidazoline derivatives. Naunyn-Schmiedeberg´s Arch Pharmacol 343: 271-282

Literaturstellen

77

GORUS FK, SCHUIT FC, IN´T VELD PA, GEPTS W, PIPELEERS DG (1988): Interaction of sulfonylureas with pancreatic ß-cells. Diabetes 37: 1090-1095

GRAHAM FL, SMILEY J, RUSELL WC, NAIRN R (1977): Characteristics of a human cell

line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J Gen Virol 36: 59-74 GRIBBLE FM, TUCKER SJ, ASHCROFT FM (1997): The essential role of the Walker A

motifs of SUR1 in KATP channel activation by MgADP and diazoxide. EMBO J 16: 114-1152

GRIBBLE FM, TUCKER SJ, SEINO S, ASHCROFT FM (1998): Tissue specificity of

sulfonylureas: studies on cloned cardiac and beta-cell KATP channels. Diabetes 47: 1412-1418

GRIBBLE FM, DAVIS TM, HIGHAM CE, CLARK A, ASHCROFT FM (2000): The

antimalarial agent mefloquine inhibits ATP-sensitive K+-channels. Br J Pharmacol

131: 756-760 GRYNKIEWICZ G, POENIE M, TSIEN RY (1985): A new generation of Ca2+ indicators

with greatly improved properties. J Biol Chem 260: 3440-3450 HAMILL OP, MARTY A, NEHER E, SAKMANN B, SIGWORTH FJ (1981): Improved

patch-clamp techniques for high-resolution current recordings from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch 391: 85-100

HANSEN AMK, CHRISTENSEN IT, HANSEN JB, CARR RD, ASHCROFT FM, WAHL P

(2002): Differential interactions of nateglinide and repaglinide on the human ß-cell sulphonylurea receptor 1. Diabetes 51: 2789-2795

HANSEN AMK, HANSEN JB, CARR RD, ASHCROFT FM, WAHL P (2005): Kir6.2-

dependent high-affinity repaglinide binding to ß-cell KATP channels. Br J Pharmacol

144: 551-557 HE TC, ZHOU S, DA COSTA LT, YU J, KINZLER KW, VOGELSTEIN B (1998): A

simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci USA

95: 2509-2514 HENQUIN JC, HOREMANS B, NENQUIN M, VERNIERS J, LAMBERT AE (1975):

Quinine-induced modifications of insulin release and glucose metabolism by isolated pancreatic islets. FEBS Lett 57: 280-284

HENQUIN JC (1982): Quinine and the stimulus-secretion coupling in pancreatic ß-cells:

glucose-like effects on potassium permeability and insulin release. Endocrinology 110: 1325-1333

HENQUIN JC, MEISSNER HP (1982): Opposite effects of tolbutamide and diazoxide on

86Rb+-fluxes and membrane potential in pancreatic B cells. Biochem Pharmacol 31: 1407-1415

HENQUIN JC (1987): Regulation of insulin release by ionic and electrical events in ß-cells.

Hormone Res 27: 168-178

Literaturstellen

78

HENQUIN JC (2000): Perspectives in diabetes: triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes 49: 1751-1760

HU S, WANG S, FANELLI B, BELL PA, DUNNING BE, GEISSE S, SCHMITZ R,

BOETTCHER BR (2000): Pancreatic ß-cell KATP channel activity and membrane-binding studies with nateglinide: a comparison with sulfonylureas and repaglinide. J

Pharmacol Exp Ther 293: 444-452 INAGAKI N, GONOI T, CLEMENT JP IV, NAMBA N, INAZAWA J, GONZALEZ G,

AGUILAR-BRYAN L, SEINO S, BRYAN J (1995): Reconstitution of IKATP: an inward rectifier subunit plus the sulfonylurea receptor. Science 270: 1166-1170

INAGAKI N, GONOI T, CLEMENT JP IV, WANG CZ, AGUILAR-BRYAN L, BRYAN J,

SEINO S (1996): A family of sulfonylurea receptors determines the pharmacological properties of ATP-sensitive K+-channels. Neuron 16: 1011-1017

ISOMOTO S, KONDO C, YAMADA M, MATSUMOTO S, HIGASHIGUCHI O, HORIO

Y, MATZUZAWA Y, KURACHI Y (1996): A novel sulfonylurea receptor forms with BIR (Kir6.2) a smooth muscle type ATP-sensitive K+-channel. J Biol Chem 271: 24321-24324

JONAS JC, GARCIA-BARRADO MJ, ANGEL I, HENQUIN JC (1994): The imidazoline SL

84.0418 shows stereoselectivity in blocking alpha 2-adrenoceptors but not ATP-sensitive K+ channels in pancreatic B-cells. Eur J Pharmacol 264: 81-84

JOOST HG (1985): Extrapancreatic effects of hypoglycemic sulfonylureas: still a

controversial issue. Trends Pharmacol Sci 6: 239-241 KAKEI M, NAKAZAKI M, KAMISAKI T, NAGAYAMA I, FUKAMACHI Y, TANAKA H

(1993): Inhibition of the ATP-sensitive potassium channel by class I antiarrhythmic agent, cibenzoline, in rat pancreatic islets. Br J Pharmacol 109: 1226-1232

KARAM JH, SANZ E, SALOMON E, NOLTE MS (1986): Selective unresponsiveness of

pancreas ß-cells to acute sulfonylurea stimulation during sulfonylurea therapy in NIDDM. Diabetes 35: 1314-1320

KAWAKI J, NAGASHIMA K, TANAKA J, TAKASHI M, MIYAZAKI M, GONOI T,

MITSUHASHI N, NAKAJIAMA N, IWANAGA T, YANO H, SEINO S (1999): Unresponsiveness to glibenclamide during chronic treatment induced by reduction of ATP-sensitive K+ channel activity. Diabetes 48: 2001-2006

KOBINGER W, LILLIE C, PICHLER L (1979): N-allyl-derivative of clonidine, a substance

with a specific bradycardic action at a cardiac site. Naunyn-Schmiedeberg´s Arch

Pharmacol 306: 255-262 KOFOD H, FUHLENDORFF J (1995): Effect of repaglinide on insulin release in isolated

islets of Langerhans is unaffected by metabolic stress induced by dinitrophenol. Eur J

Endocrinol 132 (Suppl 1): 14

Literaturstellen

79

LACOMBE C, VIALLARD V, PARIS H (1993): Identification of alpha 2-adrenoceptors and of non-adrenergic idazoxan binding sites in pancreatic islets from young and adult hamsters. Int J Biochem 25: 1077-1083

LENZEN S (1990): Hexose recognition mechanisms in pancreatic B-cells. Biochem Soc

Trans 18: 105-107 LIKUNGU J, MOLDERINGS GJ, GÖTHERT M (1996): Presynaptic imidazoline receptors

and α2-adrenoceptors in human heart: Discriminaton by clonidine and moxonidine. Naunyn- Schmiedeberg´s Arch Pharmacol 354: 689-692

MALAISSE WJ, MALAISSE-LAGAE F, WRIGHT PH, ASHMORE J (1966): Effects of

adrenergic and cholinergic agents upon insulin secretion in vitro. Endocrinology 80: 975-978

MALAISSE WJ, MALAISSE-LAGAE F, MAYHEW DA, WRIGHT PH (1967): Effects of

sulfonylureas upon insulin secretion by the rat´s pancreas. In: Tolbutamide after ten

years, hrsg. v. Butterfield WJH, von Westering W; Excerpta Medica, Amsterdam: 49-60

MEGLASSON MD, MATSCHINSKJ FM (1986): Pancreatic islet glucose metabolism and

regulation of insulin secretion. Diabetes Metab Rev 2: 163-214 MICHEL MC, ERNSBERGER P (1992): Keeping an eye on the I site: imidazoline

preferring-receptors. Trends Pharmacol Sci 13: 369-370 MORGAN NG, CHAN SLF (2001): Imidazoline binding sites in the endocrine pancreas: can

they fulfil their potential as targets for the development of new insulin secretagogues? Curr Pharmaceut Design 7: 1413-1431

MORGAN AJ, THOMAS AP (1999): Single cell and subcellular measurement of

intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i). In: Calcium Signaling Protocols, hrsg. v. Lambert DG; Humana Press, Totowa, New Jersey: Kap 6: 93-123

MOORADIAN AD (1987): The effect of sulfonylurea on the in vivo tissue uptake of glucose

in normal rats. Diabetologia 30: 120-121 MUKAI E, ISHIDA H, HORIE M, NOMA A, SEINO Y, TAKANO M (1998): The

antiarrhythmic agent cibenzoline inhibits KATP channels by binding to Kir6.2. Biochem

Biophys Res Commun 251: 477-481 NOMA A (1983): ATP-regulated K+

channels in cardiac muscle. Nature 305: 147-148 NUMBERGER M, DRAGUHN A (1996): Patch-Clamp-Technik. Spektrum, Akad Verl,

Heidelberg, Berlin, Oxford OLMOS G, KULKARNI RN, HAQUE M, MACDERMOT J (1994): Imidazolines stimulate

release of insulin from RIN-5AH cells independently from imidazoline I1 and I2 receptors. EUR J Pharmacol 262: 41-48

Literaturstellen

80

ÖSTENSON CG, PIGON J, DOXEY JC, EFENDIC S (1988): α2-adrenoceptor blockade does not enhance glucose-induced insulin release in normal subjects or patients with non insulin-dependent diabetes. J Clin Endocrinal Metab 67: 1054-1059

PANTEN U, SCHWANSTECHER M, SCHWANSTECHER C (1992): Pancreatic and

extrapancreatic sulfonylurea receptors. Horm Metab Res 24: 549-554 PANTEN U, SCHWANSTECHER M, SCHWANSTECHER C (1996): Sulfonylurea

receptors and mechanism of sulfonylurea action. Exp Clin Endocrinol Diabetes 104: 1-9

PLANT TD, HENQUIN JC (1990): Phentolamine and yohimbine inhibit ATP-sensitive K+-

channels in mouse pancreatic ß-cells. Br J Pharmacol 101: 115-120 PLOEM JS (1989): Fluorescence microscopy. In: Light Microscopy in Biology, hrsg. v. Lacey

AJ; IRL Press at Oxford University Press, Oxford, New York, Tokio: 163-185 PORTE D (1968): Inhibition of insulin release by diazoxide and its relation to catecholamine

effect in man. Ann NY Acad Sci 150: 11716-11720 PROKS P, ASHCROFT F (1997) Phentolamine block of KATP channels is mediated by

Kir6.2. Proc Natl Acad Sci USA 94: 11716-11720 REGUNATHAN S, REIS DJ (1996): Imidazoline receptors and their endogenous ligands.

Ann Rev Pharmacol Toxicol 36: 511-544 ROBERTSON RP, PORTE D (1973): Adrenergic modulation of basal insulin secretion in

man. Diabetes 22: 1-8 RUSTENBECK I, KOWALEWSKI R, HERRMANN C, DICKEL C, RATZKA P,

HASSELBLATT A (1995): Effects of imidazoline compounds on cytoplasmic Ca2+ concentration and ATP-sensitive K+ channels in pancreatic B-cells. Exp Clin

Endocrinol Diabetes 103 (Suppl 2): 42-45 RUSTENBECK I, HERRMANN C, RATZKA P, HASSELBLATT A (1997a):

Imidazoline/guanidinium binding sites and their relation to inhibition of KATP channels in pancreatic islets. Naunyn-Schmiedeberg´s Arch Pharmacol 356: 410-417

RUSTENBECK I, HERMANN C, GRIMMSMANN T (1997b): Energetic requirement of

insulin secretion distal to calcium influx. Diabetes 46: 1305-1311 RUSTENBECK I, LEUPOLT L, KOWALEWSKI R, HASSELBLATT A (1999a):

Heterogeneous characteristics of imidazoline-induced insulin secretion. Naunyn-

Schmiedeberg´s Arch Pharmacol 359: 235-242 RUSTENBECK I, KÖPP M, RATZKA P, LEUPOLT L, HASSELBLATT A (1999b):

Imidazolines and the pancreatic B-cell: actions and binding sites. Ann N Y Acad Sci 881: 229-240

RUSTENBECK I, FRICKE K, DICKEL C, GROSSE LACKMANN T (2002): Antagonism

of imidazoline-induced KATP channel block by diazoxide. Diabetologia 45: A167

Literaturstellen

81

SANTERRE RF, COOK RA, CRISEL RM, SHARP JD, SCHMIDT RJ, WILLIAMS DC,

WILSON CP (1981): Insulin synthesis in a clonal cell line of simian virus 40-transformed hamster pancreatic islets. Proc Natl Acad Sci USA 78: 4339-4343

SCHULZ A, HASSELBLATT A (1988): Phentolamine, a deceptive tool to investigate

sympathetic nervous control of insulin release. Naunyn-Schmiedeberg´s Arch

Pharmacol 337: 637-643 SCHULZ A, HASSELBLATT A (1989a): An insulin-releasing property of imidazoline

derivatives is not limited to compounds that block α-receptors. Naunyn-

Schmiedeberg´s Arch Pharmacol 340: 321-327 SCHULZ A, HASSELBLATT A (1989b): Dual action of clonidine on insulin release:

Suppression, but stimulation when α-receptors are blocked. Naunyn-Schmiedeberg´s

Arch Pharmacol 340: 712-714 SCHWANSTECHER C, DICKEL C, PANTEN U (1994): Interaction of tolbutamide and

cytosolic nucleotides in controlling the ATP-sensitive K+ channel in mouse ß-cells. Br

J Pharmacol 111: 302-310 SELZER HS, ALLEN EW (1965): Inhibition of insulin secretion in `Diazoxide Diabetes´.

Diabetes 14: 439 SHEPARD RM, HASHMI MN, KANE C, SQUIRES PE, DUNNE MJ (1996): Elevation of

cytosolic calcium by imidazolines in mouse islets of Langerhans: implications for stimulus-response coupling of insulin release. Br J Pharmacol 119: 911-916

SHYNG S, FERRIGNI T, NICHOLS CG (1997): Regulation of KATP channel activity by

diazoxide and MgADP: distinct functions of the two nucleotide binding folds of the sulfonylurea receptor. J Gen Physiol 110: 643-654

SIMPSON AW (1999): Fluorescent measurement of [Ca2+]c: Basic practical considerations.

In: Calcium Signaling Protocols, hrsg. v. Lambert DG; Humana Press, Totowa, New Jersey: Kap 1: 3-30

SMITH PA, PROKS P (1998): Inhibition of the ATP-sensitive potassium channel from

mouse pancreatic beta-cells by surfactants. Br J Pharmacol 124: 529-539 STRATTON IM, ADLER AI, NEIL HAW, MATTHEWS R, MANLEY SE, CULL CA,

HADDEN D, TURNER RC, HOLMAN RR (2000): Association of glycaemia with macrovascular and microvascular complications of type 2 diabetes (UKPDS 35): prospective observational study. BMJ 321: 405-412

STURGESS NC, ASHFORD MLJ, COOK DL, HALES CN (1985): The sulfonylurea

receptor may be an ATP-sensitive potassium channel. Lancet 31: 474-475 TAKAHASHI N, KADOWAKI T, YAZAKI Y, ELLIS-DAVIES GCR, MIYASHITA Y,

KASEI H (1999): Post-priming actions of ATP on Ca2+-dependent exocytosis in pancreatic beta cells. Proc Natl Acad Sci 96: 760-765

Literaturstellen

82

TUCKER SJ, GRIBBLE FM, ZHAO C, TRAPP S, ASHCROFT F (1997): Truncation of Kir6.2 produces ATP-sensitive K+-channels in the absence of the sulfonylurea receptor. Nature 387: 179-183

TRUBE G, RORSMAN P, OHNO-SHOSAKU T (1986): Opposite effects of tolbutamide and

diazoxide on the ATP-dependent K+-channel in mouse pancreatic B-cell. Pflügers

Arch 407: 493-499 TYLER DD (1992): The Mitochondrion in Health and Disease. VCH Weinheim/ New York TURNER RC, CULL CA, FRIGHI V, HOLMAN RR (1999): Glycemic control with diet,

sulfonylurea, metformin, or insulin in patients with type 2 diabetes mellitus: progressive requirement for multiple therapies (UKPDS 49). JAMA 281: 2005-2012

UK PROSPECTIVE DIABETES STUDY (UKPDS) GROUP (1995): Overview of 6

years´therapy of type II diabetes: a progressive disease (UKPDS 16). Diabetes 44: 1249-1258

UK PROSPECTIVE DIABETES STUDY (UKPDS) GROUP (1998): Effect of intensive

blood-glucose control with metformin on complications in overweight patients with type 2 diabetes (UKPDS 34). Lancet 352: 854-865

VAN ZWIETEN PA (1988): The role of adrenoceptors in circulatory and metabolic

regulation. Am Heart J 116: 1384-1392 WOLFFENBUTTEL BH, GOMIS R, SQUATRITO S, JONES NP, PATWARDHAN RN

(2000): Addition of low-dose rosiglitazone to sulfonylurea therapy improves glycaemic control in type 2 diabetic patients. Diabet Med 17: 40-47

ZAITSEV SV, EFANOV AM, EFANOVA IB, LARSSON O, ÖSTENSON CG, GOLD G,

BERGGREN PO, EFENDIC S (1996): Imidazoline compounds stimulate insulin release by inhibition of KATP channels and interaction with the exocytotic machinery. Diabetes 45: 1610-1618

ZÜNKLER BJ, LINS S, OHNO-SHOSAKU T, TRUBE G, PANTEN U (1988): Cytosolic

ADP enhances the sensitivity to tolbutamide of ATP-dependent K+ channels from pancreatic islets. FEBS Lett 239: 241-244

Lebenslauf Persönliche Daten:

Name: Timm Große Lackmann

Geburtsdatum: 20.01.1972

Geburtsort: Berlin

Eltern: Michael Große Lackmann, Apotheker

Hannelore Große Lackmann geb. Totz,

Apothekerin

Nationalität: deutsch

Familienstand: verheiratet Schulbildung: 1978 - 1982 Grundschule Elze

1982 - 1991 Jugenddorf Christophorus Schule Elze

1991 Allgemeine Hochschulreife Studium: SS 1992 - WS 1997/98 Pharmazie an der Technischen Universität Carolo

Wilhelmina zu Braunschweig

SS 1995 1. Staatsexamen

WS 1997/98 2.Staatsexamen

Januar 1998 - Juli 1998 Pharmaziepraktikant in der Löwenapotheke Hannover

Juli 1998 - Februar 1999 Diplomarbeit – Martin-Luther-Universität Halle/Saale; die Diplomarbeit wurde am Institut für Pharmazeutische Technologie der TU Braunschweig erstellt. Titel:

„Erarbeitung einer Meßroutine mit dem SPF-290 Analyzer und Überprüfung der Anwendbarkeit des In Vitro SPF-Bestimmungsverfahrens anhand ausgewählter Sonnenschutzprodukte und vier mikropigmenthaltiger Rezepturen“

März 1999 3. Staatsexamen und Approbation als Apotheker

September 1999 Erlangung des akademischen Grads eines Diplompharmazeuten

Berufstätigkeit:

März 1999 - Juni 1999 Apotheker in der Mühlenapotheke, Elze

Juli 1999 - Dezember 2001 Wissenschaftlicher Mitarbeiter am Institut für Klinische Biochemie an der Medizinischen Hochschule Hannover.

Januar 2002 - Oktober 2002 Weiterführung der Promotion am Institut für Pharmazeutische Pharmakologie und Toxikologie der TU Braunschweig

November 2002 - März 2003 Apotheker in der Mühlenapotheke, Elze

April 2003 - Mai 2004 Apotheker in der Limmer Apotheke, Hannover

Seit Juni 2004 Apotheker in der Friedenstal Apotheke, Hannover

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Wirkung von Imidazolinen auf den „triggering pathway“ der ... fileWirkung von Imidazolinen auf den „triggering pathway“ der Insulinsekretion Von der Fakultät für Lebenswissenschaften