Arch. exper. Path. u. Pharmakol., Bd. 225, S. 463--473 (1955).

Zur Frage des Mechanismus der Digitonin-H~imolyse. Von

W. W I L B R ~ ) T und S. FR~L

Mit 8 Textabbildungen.

(Eingegangen am 17. Januar 1955.)

Es wurde in frfiheren Arbeiten gezeigt, dal~ H~molyse auf verschie- dene Arten ausgelSst werden kann. Als kolloid-osmotisch 10,11, le wurde ein H~molysetyp bezeichnet, bei dem die ErythrocYtenmembran gesteigert fiir Kationen durchl~ssig wird, so dal~ Salz eintritt, osmotisch Wasser nachzieht, wodurch die Zellen osmotisch schwellen und bei Erreichung des kritischen H~molysevolumens h~molysieren. Diesem Typ, bei dem die inmittelbare Ursache der Lyse die gleiche ist wie bei osmotischen H~molysen in hypotonischen LSsungen oder LSsungen penetrierender Substanzen, wurde als nichtosmotisch ein anderer Typ gegeniibergestellt, bei dem der AuflSsung der Zellen eine osmotische Schwellung nicht vor- auszugehen scheint, jedenfalls am Verhalten der osmotischen Resistenz nicht erkennbar ist. Die Kurven der osmotischen Resistenz verschieben sich bei den osmotischen H~molysetypen seitlich, d .h . die osmotische Resistenz nlmmt ab. Beim nichtosmotischen veri~ndern sie sich bei un- ver~nderter osmotischer Resistenz nur in vertikaler Richtung durch Hebung des nichth~molytischen Kurventeils.

Es wurde welter gezeigt, dal~ die Abnahme der osmotischen Resistenz, die den osmotischen H~molysetypen eigen ist, auch bei einem drit ten H~molysetyp auftritt , bei dem sich nicht der osmotisch wirksame Inhalt der Zellen (durch Eindringen penetrierender Substanz), sondern das kritische H~molysevolumen ver~ndert. Dieser Typ wurde als Grenzvolum- h~molyse bezeichnet 14. Er ist vom kolloid-osmotischen Typ u. a. durch das Verhalten des H~matokritvolumens zu unterscheiden, das bei der kolloid- osmotischen ebenso wie bei anderen osmotischen It~molysen ansteigt, bei der Grenzvolumh~molyse dagegen nicht.

Es stellte sich die Frage, ob diese verschiedenea Typen als Ausdruck verschiedener Angriffspunkte der h~molytisch wirkenden Agentien zu betrachten sind und welche Angriffspunkte gegebenenfalls den einzelnen Typen zuzuschreiben seien.

Zahlreiche H~molysen, darunter auch solche, die durch einheitliche, chemisch wohl definiexte Substanzen ausgelSst werden, gehSren nach den genannten Kriterien nicht ausschlieBlich dem einen oder anderen Typ an, sondern zeigen Ziige verschiedener Typen: Je eingehender die Unter-

464 W. Wm~V~NDT und S. FREI:

suchung durchgeffihrt wird, d. h. je mannigfaltiger die Versuchsbedin- gungen abgewandelt werden, desto mehr erweisen sich solche Kombina- tionstypen als das h~ufigere und reine Typen als das seltenere Vorkommnis.

Damit erweitert sich die gestellte Frage dahin, ob solche H~molytika an mehreren Angriffspunkten ansetzen oder ob die verschiedenen Typen als Varianten eines gemeinsamen Grundvorganges betrachtet werden kSnnen, der in bezug auf Intensit~t und Geschwindigkeit durch ver- schiedene Parameter beeinfluBt wird und daher je nach quantitativem Verh~l~nis dieser Parameter verschiedene Erscheinungsformen annehmen kann. Insbesondere schien es denkbar, dab der kolloid-osmotische Vor- gang auch in anderen Typen enthalten oder durch sie ausgelSst wird. Fiir die Einzelheiten solcher Uberlegungen sei auf friihere VerSffentlichungen verwiesen 10,14 ~ 1 5 ~ 1 6

Fiir die Digitonin-H~molyse hat SCHMIDT-THOM]~ 6,7,s gezeigt, daB zwischen der Menge des einwirkenden Digitonins und derjenigen des in aufgelSsten Zellen enthaltenen Cholesterins eine stSchiometrische Bezie- hung 1 : 1 besteht, woraus geschlossen werden darf, dab als Angriffspunkt dieses H~molytikums das Cholesterin der Zellmembran zu betrachten ist. Durch den weiteren Nachweis, dab ~hnliche Affinit~ten zu anderen Be- standteflen der Zellmembran, insbesondere zu Lecithin im Gegensatz zu frfiheren Literaturangaben nicht bestehen, hat SCHMIDT-THoMk es auBer- dem recht wahrscheinlich gemacht, daB das Cholesterin nicht nur einer unter mehreren Angriffspunkten, sondern der einzige Angriffspunkt dieses Lytikums ist.

Die Digitonin-tI~molyse versprach unter diesen Umst~nden in bezug auf die diskutierten Fragen aufschluBreiche Ergebnisse. Sie wurde daher zum Gegenstand einer eingehenderen Studie gemacht, deren Ergebnisse in einer kurzen Mitteilung teflweise verSffentlicht worden sind 13 und nun ausffihrlicher dargestellt und diskutiert werden sollen.

Sie zeigen, dab die Digitonin-tt~molyse Komponenten aller drei ge- nannten Typen enth~lt, die je nach Versuchsbedingungen mehr oder weniger fiberwiegen kSnnen, teilweise derart, dab die H~molyse als reiner Vertreter des einen oder anderen Typs imponiert.

Methodik. Das Prinzip der verwendeten Methode, fiir deren Einzelheiten auf friihere Mit-

teflungen verwiesen werden muB 9,12, besteht darin, dab mit isotonischer Kochsalz- oder NatriumsulfatlSsung gewaschene Rindererythrocyten in isotonischer digi- toninhaltiger NatriumsulfatlSsung suspendiert und bei verschiedenen Temperu- turen inkubiert werden. Aus den Suspensionen (deren Volumverh~tnis Zellen : LS- sung zwisehen 1 : 1 und 1 : 50 variierte, in den meisten F~llen 1 : 10 betrug) wurden in regelm~Bigen Zeitintervallen Proben entnommen und auf das Verhalten der osmotischen Resistenz gepriift. Die Priifung erfolgte duvch photoelektrische Be- stimmung der Lichtstreuung mit Hilfe einer einfachen friiher dargestellten An- ordnung 9.

Zur Frage des Mechanismus der Digitonin-tt&molyse. 465

Die verwendeten Digitonin-Pr&parate waren Digitonin-Roche und Digitonin- Merck. Sie unterschieden sich in den wesentliehen Resultaten kaum. Die Hoffnung, in ihnen reine einheitliche Stoffe zu verwenden, erwies sich aUerdings als unbe- reehtigt, als es RUHENSTROTH und :BREITENFELD gelang, Digitonin-Merck in zwei Komponenten zu zerlegen. Eine der beiden, yon der die Autoren uns liebens- wiirdigerweise eine Versuehsmenge zur Verftigung stellten, wurde zur lhffifung des Hamolysetyps bei 2 ° C und 42 ° C verwendet. Der Typ war bei 42 ° C iiberwiegend nichtosmotisch, bei 2 ° C iiberwiegend derjenige einer Hamolyse mit Verschiebung der osmo~ischen Resistenz (Hamatokritversuche zttr Abgrenzung zwischen Grenz- volumhtLmolyse und kolloid-osmotiseher Hamolyse konnten nieht durehgefiihrt werden). Die Resultate zeigten keinen prinzipiellen Unterschied gegenfiber den mit Digitonin-Merck (oder Roche) erhaltenen.

Resultate. 1. Die beiden Haupt typen. a ) D e r E i n / l u f l der T e m p e r a t u r . Abb. 1

zeigt zwei Versuchsreihen, in denen die Wi rkung einer e b e n hamoly- sierenden K o n z e n t r a t i o n yon Digi tonin au f R indere ry th rocy ten durch

VYgg, 7m %, 2°C V 657p O,6rrl~°/o, g2°C

4o i 1 ", I

o sec [

~,~ o,¢ o,5 4e o,7 o,8 o,s ~o o~ ~3 o,¢ o5 ¢8 ~¢7 o,s 4g 7,~ isofon. NaCI, /solon. NaC'L

a b

Abb. 1. Osmotische Resistenz bei Digitoninh~molyse bei zwei versehiedenen Temperaturen. Rinder- erythroeyten. Abszisse: Konzentration der Kochsalzltisung, Ordinate: Photometrische Ablesung.

wiederholte Aufnahme osmotischer Res is tenzkurven vom Zusatz des I) igi tonins bis zur Htimolyse analysier t wurde. Der erste Versuch (Abb. 1 a) wurde bei 2 ° C durchgefiihrt , der zweite (Abb. l b ) bei 42 ° C.

I n dem Versuch bei 2 °C verschieben sich die Res is t~nzkurven zu- nt~chst ohne jede A n d e u t u n g einer H e b u n g im nichtht imolyt ischen Kur - ventei l rein seitlich bis zur E n t n a h m e nach 64 rain. Ers t bei den En t - n a h m e n nach 128 u n d 256 rain deute t sich aul]erdem eine leichte H e b u n g an. ])er Typ der Htimolyse ist danach in den ersten 64 mi n rein kolloid- osmotisch oder grenzvolumht~molytisch, nachher t r i t t eine nichtosmotische K o m p o n e n t e hinzu.

Bei 42 ° C dagegen ist in den ersten E n t n a h m e n nach 5 sec u n d nach 10 sec bereits eine ausgesprochene Hebung im n ich th~molyt i schen Teil zu erkennen, daneben eine seitliche Verschiebung, die sich jedoch bei den weiteren E n t n a h m e n nicht mehr verst~rkt . Von 10 sec an ist die Ver- ~nderung rein diejenige des nichtosmotischen tti~molysetyps.

466 W. ~VILBRANDT und S. F~EI:

l~eben der Form der Kurvenver/~nderung unterscheiden sich, wie zu erwarten, die beiden Temperaturen sehr ausgesprochen in der Geschwin- digkeit der Vergnderung. Wghrend bei 2 ° C die Wirkung einer eben voll- stgndig hgmolysierenden Digitoninkonzentration nach etwa 4 Std voll- stgndig wird, ist die entsprechende Zeit bei 42 ° etwa 3 min.

Niedrigere Digitoninkonzentrationen fiihren bei beiden Temperaturen qualitativ zu gleichartigen Xnderungen, die aber quanti tat iv geringeres AusmaB besitzen und nach einiger Zeit zum Stillstand kommen.

V u 3 g , 1~7mq%, 2°C, (Susp.5o°/ , ) io.0 ~ ~ i i I

Sfd i

2,5 ....... : - ~

t I I ' o, ~ o,s o,6 0,7 o,8 49 ~,o

/solon. Na.C1,

V a31, l, lem r%, uz°C,(Su , ~. 1o°/o) -

-t o

. i o

i i ' I o,s o, g o,5 o,e o,7 o,s o,9 1,o

/solon. N~CL b

v ~ 9 , o, errwj%, '~z°C, (,~u,, e. a%)

o,2 0,3 O,,g 0,5 O,e 0 7 0,8 0,9 lfl ~solon. NaC].

Abb. 2. Osmotische Resislenz be[ Digitoninhgmolyse in verschieden konzentrierten Zel]suspensionen. Rindererythrocyten. Abszisse:Konzentration der Kochsa]zl6sung,Ordinate :Photomef~rische Ablesung.

Bei 2 ° C kann dann die Hebungskomponente ganz fehlen, so dab aus- schlieBlich der Typ der seitlichen Verschiebung vorliegt (siehe Beispiel in Abb. 2a). Bei 42 ° C (Abb. 2b) beobachtet man unter solchen Bedin- gungen nicht selten, dab die initiale Rechtsverschiebung bei spgteren Entnahmen wieder zuriickgeht, so dab schlieBlich ein reiner Hebungstyp resultiert (Abb. 2c).

Die merkwiirdige Erscheinung des Riickgangs der osmotischen Resistenz t r a t nut bei hochverdiinnten Suspensionen (1 : 50) auf, nicht dagegen bei 10%igen Suspensionen. Sie war aul~erdem nur bei niedrigen Digitonin- konzentrationen zu beobachten und verschwand bei hSheren ganz (z. B. in einem Versuch : 0,6 rag% + + , 0,7 mg% ÷ , 0,8 mg% + , 0,9 mg% - - ) .

Zur Frage des Mechanismus der Digitonin-H~molyse. 467

Ff i r d ie m i t versch iedenen Dig i ton inkonzen t r a t i onen im Gleichge- wicht e rmi t t e l t en E n d k u r v e n der osmot i schen Resis tenz zeigt Abb . 3 Beispiele fiir 2 ° C und 42 ° C. Die K u r v e n s c h a r e n ~hne]n wei tgehend den- jenigen, die m i t einer u n d d e r s e l b e n K o n z e n t r a t i o n bei zei t l ich abges tu f ten B e s t i m m u n g e n gewoimen werden.

Sie zeigen einen wei teren Unte r sch ied der W i r k u n g bei den be iden Tempera tu r en , n~mlich die verschiedene Abh~ngigke i t de r W i r k u n g yon der K o n z e n t r a t i o n . W~hrend bei 42 ° die ers te bemerkba re und die

VCq-3 ; ,6Omin, 2°C V~53, 5rain. z/2°C

. ~ _ 0 ,65s f

0,3 o,,q 0,5 0,6 0,7 p,g 0,9 7,0 0,2 0,3 o,g g,5 o,s 0,7 0,8 0,9 7,0 /so/on. NaCL ~solon. NaCL

a b

Abb. 3. Osmotische Resistenz bei Digitoninh~molyse bei versehiedenen Temperaturen. Rinder- erythrocyten. Abszisse: Konzentration der KochsalzlSsung, Ordinate: Photometrische Ablesung.

m a x i m a l e W i r k u n g bei den K o n z e n t r a t i o n e n 0,61 und 0,8 m g - % Digi- t on in liegen, also einem Konzen t r a t ionsve rh~ l tn i s von e twa 3 : 4 ent- sprechen, s ind die en t sprechenden Zahlen be i 2 ° C 0,125 und 2,0 m g - % , was e inem Verh~l tnis yon 1 : 16 en tspr ich t .

b) Der Ein/lufl der Digitoninkonzentration. Das Auf t r e t en der be iden H ~ m o l y s e t y p e n h~ngt n ich t nur yon der T e m p e r a t u r ab, sondern auch v o n d e r K o n z e n t r a t i o n des Digi tonins und der Suspensionen.

Zur F r a g e der K o n z e n t r a t i o n is t zun~chst folgende B e m e r k u n g zu machen . Wie SCHMIDT-THOM~ gezeigt h a t s und wie sich auch m i t den yon uns ve rwende ten K r i t e r i e n ergab, h~ngt die W i r k u n g quan¢ i t a t iv n i ch t v o n d e r mola ren K o n z e n t r a t i o n des Digi tonins ab, sondern yon ihrem Vorhgltnis zur Ze l lkonzent ra t ion , mi t anderen W o r t e n yon der Menge D ig i t on in pro Zelle*. Die gleiche h~moly t i sche W i r k u n g k a n n also in

* Nach JusG u. B6~M 1 ist die Menge Digitonin pro Zelle nicht konstant, d.h. Zeilzahl Z und lytische Digitoninkonzentration C nicht proportional (Z ~ K • C), sondern es gilt Z 2 ~ K . C. Wir konnten diese auch in der Arbeit Jv~G u. WIRT~ a belegte Beziehung bei Variation der Zellkonzentration 1:50 nicht best~tigen, sondern fanden nur eine geringfiigige Abweichung yon Z ~ K • C (in der gleichen Richtung wie Ju:sG). Die Frage wurde aber nicht eingehend untersucht, insbesondere wurde nicht geprfift, ob die yon Jv~G beschriebenen Zonenerscheinungen mit- spielen, die nach ihrer Richtung die Diskrepanz gegeniiber den Ju~Gschen Resul- taten mSglicherweise erkl~ren kSnnten.

468 W. WILBRANDT und S. FREI:

verdiinnten Suspensionen schon mit sehr niedrigen, bei hoher Zellkonzen- tr.ation erst bei entsprechend hSheren absoluten Digitoninkonzentrationen erzielt werden. Das macht eine Unterscheidung nStig zwischen der Digitoninmenge pro Zelle und der absoluten Konzentration.

ErhSht man die Digitoninmenge pro Zelle, so wird sowohl bei 2°C als bei 42°C das beobachtete Verhalten mehr dasjenige eiues Kombi- nationstyps. Zu der bei niedrigeren Digitoninmengen vorherrschenden Komponente t r i t t also in steigendem Ausmal~ jeweils die andere, d. h. bei 2 ° C der Hebungstyp, bei 42 ° C der seitliche Verschiebungstyp. Bei 42 ° ist dieses Verhalten nur bei den kiirzesten experimentell realisier- baren Zeiten zu erkennen (Abb. 4a). Fiir das entsprechende Verhalten bei 2 ° C gibt Abb. 4b ein Beispiel.

Neben der Menge pro Zelle beeinflul~t aber auch die absolute Kon, zen- tratiou des Digitonins den H~molysetyp, d .h . bei gleicher Digitonin-

V656, 5rain, 2°C V660 z 5sec, ~t2°C

p ~6

O0,t2 0,3 0,~ 0,5 0,6 g7 0,8 0,9 1,0 0+2 0,3 4V 0,5 g6 ~7 0,8 0.,9 [,0 /solon. NaCL /so/on. NaC'L a b

Abb. 4. Osmotische Resistenzkurven nach verschiedenen Zeiten in abgestuften Digitoninkonzen- trationen bei zwei verschiedenen Temperaturen.

menge pro Zelle kann der Typ verschieden sein, je nachdem ob eine hohe Zellkonzentration mit hoher absoluter Digitoninkonzentration oder nie- drige Konzentrationen verwendet werden. HShere absolute Konzentration begiinstigt den seitlichen Verschiebungstyp, niedrigere den Hebungstyp. Der Unterschied ist bei 42 ° C markanter als bei 2 °, jedoch bei der letz- teren Temperatur ebenfalls wahrnehmbar. Fiir das Verhalten bei 42 ° gibt Abb. 5 ein Beispiel. In diesem Versuch, in dem das AuBenvolumen nur das zweifache Zellvolumen ist und daher hohe absolute Digitonin- konzentrationen bis zu 50 rag-% zur Verwendung kommen, zeigen die Resistenzkurven naoh 120 sec (naoh dieser Zeit ist das Gleichgewicht praktisch erreicht) in sehr viel deutlicherem AusmaB eine Komponente dor seitlichen Verschiebung als etwa in den in Abb. 3 gezeigten Kurvon.

Die bisher besprochenen Versuche zeigen, dab die beiden beobach- teten Typen der tIebung und der seitlichen Verschiebung in recht kom- plexer Weise yon verschiedenen Versuchsbedingungen abh~ngen. Der seitliche Verschiebungstyp wird begiinstigt durch niedrige Temperatur,

Zur Frage des Mechanismus der Digitonin-Hamolyse. 469

durch hohe absolute Digitoninkonzentration (in einem grol~en Konzen- trationsbereieh) ferner von der Digitoninmenge pro Zelle in der Weise, dab bei niedriger Temperatur eine niedrige, bei hoher Temperatur eine hohe Digit0ninmenge die Komponente der seitlichen Verschiebung fSrdert.

2. Die Natur der seitliehen Yersehiebung. In bezug auf die Frage, ob die seitliche Verschiebung der osmotisehen Resistenzkurven im Sinne einer kolloid-osmotischen H~molyse oder einer Grenzvolumh~molyse zu deuten ist, sind schon aus den bisher besprochenen Versuchen einige Hinweise zu entnehmen.

Zun~ehst f~llt die Tatsache auf, daB bei niedrigen Digitoninl~onzen- trationen die Verschiebung fast zum Stillstand kommt oder sich jeden- falls stark verlangsamt, bevor H~molyse eintritt. Diese schon oben erw~hnte Tatsache w~re mit einer kolloid-osmotischen Natur der H~mo- lyse nur dann vereinbar, wenn die dureh Digitonin gesetzte Steigerung der Kationenpermeabilit~t nach Er- reiehung eines bestimmten Schwel- lungsvolumens aus irgendeinem Grund wieder aufgehoben wiirde (da bei gegebenem Permeabilit~tsgrad ein Gleichgewieht fiir die osmotische Schwellung nicht besteht und sie bis zum h~molytischen Volumen fort- schreiten miil~te). Noeh gr6Bere Schwierigkeiten fiir die Deutung im Sinne einer kolloid-osmotischen ItS-

V#zlS, 2rain.. ~2°C

I 0_l I ~,3 0,~ 0,5 o,6 0,7 0,~ o,9 1,0

,'~oton. NaCT. Abb. 5. Osmoti~ehe Res[stenzkurven nacll

min Einw~kung yon DigitoninlSsungen abgestufter Konzentrationen bei 42 ° C. Rindererythroeyten. Abszisse: Konzen- tration der Kochsalzl(isung, Ordinate:

Photometrische Ablesung.

molyse bietet der Riickgang der seitlichen Verschiebung, der unter be- stimmten Versuchsbedingungen (siehe oben) beobachtet wird.

Die genauere quantitative Untersuchung der Seitenverschiebung zeigt allerdings, da~ der Stillstand ira allgemeinen kein vollkommener ist, sondern dab es vielmehr naeh kurzer Zeit zu einer hoehgradigen Verlang- samung der Verschiebung kommt. Berechnet man aus der seitliehen Verschiebung das seheinbare Schwellungsvolumen (das Volumen, das der gleichen seitliehen Versehiebung bei einer reinen kolloid-osmo- tisehen Schwellung entspreehen wiirde), so: erh~lt man Kurven, wie sie in Abb. 6 dargestellt sind. Ein vollst~ndig konstantes Niveau wird in diesen Kurven nieht oder erst nach recht langer Zeit erreieht. Offenbar enthalten die Kurven zwei Komponenten verschiedener Gesehwindigkeit.

Das erreiehte Niveau h~ngt auBerdem, wie Abb. 6 zeigt, nieht nur v o n d e r Digitoninkonzentration ab (Abb. 6a), sondern auBerdem bei gleicher Konzentration aueh yon der Temperatur (Abb. 6b). HShere Temperatur ffihrt zu hSherem scheinbarem Schwellungsvolumen. Die

A r c h . exper. Path. u. Pharmakol. , Bd. 225. 33

470 W . W I L B R A N D T und S. FREZ:

Temperatur beeinflul~t also hier nicht nur die Gesehwindigkeit, sondez~ aueh das Gleichgewieht der Veri~nderung.

Quantitative Tests zur Erkennung der kolloid-osmotisehen Hiimo- lyse, der Kompensations- sowie der Geschwindigkeitstest 15, basieren darauf, dab im allgemeinen bei mi~Sigen Graden von Kationenpermea- bilit/~tssteigerung eine Durchl~ssigkeit der Erythrocytenmembran ffir

~6

V' 7,2

Vq3~, z°C, (~usD. 5o%)

71} "~0 20 110 60 gO "/OOmin 120

Abb. 6a . Scheinbare V o l u m k u r v e n ~(berechnet aus der Versch tebung der osmot i schen l~esistenz) yon l~inder- blur bei E i n w i r k u n g abges tu f t e r Dig i ton inkonzen t ra t ion

bei 2 ° C.

Vq3s. 2,5mg%

~32°C

1,6

f 1'~0 2O qO 60

L !i

~-~°C ~°C

--i I i i

i _ _ Z o c

i I I ! L

gO 100 720 rain I~0

Abb. 6b. Scheinbaxe V o l u m k u r v e n (berechnet aus der Versch iebung der osmot i schen Res is tenz) yon Rinderb lu t in 2,5 r ag -% Dig i ton in bei verschiedenen T e m p e r a t u r e n

wiirden, zu keinerlei Verminderung der

Rohrzucker noch nicht ein- tritt , so dal~ der kolloid- osmitisehe Druek des H/~- moglobins innen durch eine entsprechende Saccharose- konzentratiou aul~en kom- pensiert werden kann. Die Sehwellung und die mit ihr verbundene seitliche Ver- sehiebung der Resistenz- kurven werden dann unter- driickt oder je nach Sac- eharosekonzentration in Richtung und Geschwindig- keit ver/~ndert. Entspre- chende Versuche bei der Digitoninh/~molyse haben regelm~$ig ergeben, dab selbst hohe Saecharose- konzentrationen, die bei kolloid-osmotischer H~mo- lyse nicht nur die Schwel- lung verhindern, sondern in Schrumpfung umkehren

seittichen Versehiebung der Resistenzkurven ffihren. In einer Anzahl von Versuchen wurde sogar eine Versti~rkung beobachtet (Abb. 7). Die dutch Digitonin gesetzte Xnderung mfiSte also, wenn es sich um eine kolloid-osmotische H/~molyse handeln wfirde, in sehr ungewShnlicher Weise mit hochgradiger Durch- l~ssigkeitssteigerung ftir das grol~e Rohrzuckermolekiil verbunden sein.

SchlieBtich wnrden H/~matokritvolumina bestimmt, die in Abb. 8 dar- gestellt sind. Sie wurden bei 2 ° C ausgefiihrt und die relativen Volumina (bezogen auf eine digitoninfreie S u s p e n s i o n - 1) wurden gegen das scheinbare Schwellungsvolumen, das aus der seitlichen Verschiebung der Resistenzkurven errechenbar ist, aufgetragen. Fiir osmotische und kolloid- osmotische Hamolysen ergibt eine solehe Auftragung eine Gerade mit einer Neigung von etwa 0,515. Fiir die Versuche mit Digitonin ist eine

Zur Frage des Mechanismus der Digitonin-Hi~molyse. 471

geringfiigige Steigerung des It~matokritvolumens bei seitlieher Verschie- bung der Resistenzkurven zwar nachweisbar, die Neigung der durch die Mel3punkte gelegten Regressionsgeraden ist aber ganz bedeutend ge- ringer als ffir echte osmotische H~molysen. Der Regressionskoeffizient betr~gt 0,08 also 1/e desjenigen osmotiseher Hiimolysen.

Diese Bestimmungen bflden eine Besti~tigung der aus anderen Be- obachtungen gezogenen SchluBfolgerung, dal~ eine ausschliel31iehe oder vorwiegende kolloid-osmotische Natur der H~molyse n~cht vorliegen kal~n. Dagegen zeigt sich eine geringe Sehwel- Vqsg, 2,sr~ r%, 2°C

~l Sl ~ gacih lungskomponente, aus l,a fl~V~Na-'sulf~ der gesch.loJ~sen werden l muB, dal~ aueh die V,1,2 \Sa-'sulfat Kaionenpermetabilit~t r der Membran etwas ~o~ 2o ~o so so too Izo m~n 7~o

gesteigert wire. M [ ) g - Abb. 7. Scheinbare Volumkurven (berechnet aus der Verschie- lieherweise ist die Tat- bung der osmotischen Resistenz) yon Rinderblut in 2,5 rag-%

Digitonin bei 2 ~ C in iaotonischen L6sungen yon Natr iumsulfat sache, dal~ die schein- und yon 3/, Saccharose und 1/4 Natriumsuffat N•heres im Text.

baren Schwellungs- Vq65+q66 kurven sich zwar n a c h , ~ , 2 , . , ~oY-~ ~i! - I " l×~ ~ " ~ einem rasehen i n i t i a - v ~ k 0 , ~ ~ . len Anstieg stark ab- '-z, ,2 ~ r,e ~,s z~o z2 2~ ~6

schw~ehen, aber doch VR noeh leieht ansteigen- Abb. 8. Hitmatokritsehwellungen der Erythroeyten in Digitonin- den Verlauf zeigen, 16sungen, vergliehen mit denVolum~inderungen, die sich aus der

Versehiebung der osmotisehen Resistenz bereehnen. VHkorr. darauf zurtickzufiih- tI i imatokritvolumen, korrigiert ffir den quantitat~v bes~immten ren, dal~ hier eine lung- tIitmolysegrad. VR: Volumen bereehnet aus der Versehiebung

der osmotisehen Resistenzkurven. same Kationenpene- tration erfolgt (die wie oben erw~hnt, nicht zu einem Gleichgewichts- volumen fiihren kann).

Das Ergebnis der Priifung ist also auch in bezug auf die Diferenzierung zwischen kolloid-osmotischer H~molyse und GrenzvolumhiCmolyse der SchluB, dal3 ein kombinierter Typ vorliegt, alterdings quantita~iv durch- aus vorwiegend der Typ der Grenzvolumh~molyse, Die Digitoninh~mo- lyse erweist sich somit bei genauerer Analyse als Kombination aller drei Typen.

Diskussion. Die Versuche haben erstens gezeigt, dal~ die Digitoninh~molyse in den

beiden Formen einer nichtosmotischen ]-I~molyse und in Form einer Grenzvolumh/~molyse (_~nderung des kritisehen H/~molysevotumens) auf- treten kann, ferner dab das Auftreten der einen oder der anderen Form yon verschiedenen Versuchsbedingungen abh~ngig ist und dab im all- gemeinen Kombinationstypen beobaehtet werden, bei denen allerdings

33*

472 W. WILBRANDT und S. FREI:

d e r e ine ode r de r a n d e r e T y p sehr w e i t g e h e n d i ibe rwiegen kann . S c h l i e ~ -

l ich h a t s ieh e rgeben , dab n e b e n d e r t imde rung des H g m o l y s e v o l u m e n s a u c h e ine gewisse S c h w e l l u n g be t e i l i g t ist , die im S inne e iner ko l lo id - o s m o t i s c h e n H ~ m o l y s e zu d e u t e n ist .

DaB die Digitoninh~molyse am Cholesterin der Zellmembran angreift, kann nach den Ergebnissen yon ScnMIDT-THoM]~ 8,1s gesichert betrachtet werden ~. DaB sie noeh weitere Angriffspunkte im Sinne yon Receptoren fiir die Bildung eines Komplexes mit Digitonin besitzt, [st durch SCttMIDT-THoM]~S Untersuchungen un- wahrseheinlich geworden. Die Frage, ob diesem H~molysemeehanismus mit nur einem Angriffspunkt ein reiner unvermischter und yon den Versuehsbedingungen unab- h~ngiger H~molysetyp entsprieht, ist in negativem Sinn beantwortet worden. Es fragt sich daher weiter, ob trotz der recht iiberzeugenden Ergebnisse und SchluBfolge~ungen SCH~IDT-THo~I~S ein (oder mehr als ein~ weiterer Angriffspunkt des Digitonins an- gen0mmen werden soll oder ob das Auftre~en der verschiedenen Typen sich mit der Wirkung yon nur einem Receptor, n~mlich dem Cholesterin, in Einklang bringen l~Bt.

Eine definitive Antwort auf diese Frage l~tBt sieh aus den bisher vorliegenden Resultaten nicht geben. Immerhin scheint es angezeigt, die MSglichkeiten zu er- 5rtern, die fiir die letztere Interpretation zur Verfiigung stehen wiirden.

Es wurde schon friiher darauf hingewiesen, dab die nicht-osmotische Hi~molyse in ihrem Mechanismus durchaus identiseh mit der kolloid-osmotisehen H~molyse sein kann, sofern ni~mlich bestimmte kinetische Voraussetzungen fiir die kolloid- osmotische Schwellung erfiillt sind. Erfolgt die Schwellung nach betr~chtlicher und yon Zelle zu Zelle stark streuender Latenz mit relativ groBer Geschwindigkeit, so mug die H~molyse, wie an anderer Stelle ausfiihrlicher erSrtert und graphiseh fllustriert worden ist, den Typ der nieht-osmotischen H~molyse annehmen. Das gleiche gilt mutatis mutandis fiir die Grenzvolumh~molyse.

Trotz dieser MSglichkeit bereitet es nicht unerhebliche Schwierigkeiten, sich den Ubergang yore einen zum anderen Typ bei Wechsel der Versuchsbedingungen vor- zusteUen, insbesondere weil die beiden Formen meist ohne ~berg~nge (die sich u.a. in Absehr~gung der Resistenzkurve ~uBern wiirden) nebeneinander zu bestehen scheinen.

Leichter li~Bt sich eine Kombination yon Grenzvolumhi~molyse und kolloid- osmotischer Schweltung vorstellen. DaB eine ~_nderung, die zum Eintr i t t der Schwelhmgsh~molyse sehon bei kleinerem Volumen fiihrt, gleichzeitig gesteigerte Kationenpermeabilit~t auslSst, l~Bt sich auf Grund des gemeinsamenZuges der Locke- rung der Membranstruktur, der in beiden Wirkungen erblickt werden kann, vorstellen.

Auf einen anderen Punkt hat J~NG ~ hingewiesen, dab n~mlich tier Assoziations- grad des Digitonins wechselnde Werte annehmen kann. Seine Annahme steht jedoch nieht in ~bereinstimmung mit den Resultatcn yon RUrSSEN u. Loos 5, die nur monodisperse LSsungen finden.

Vielleicht ist an die MSglichkeit zu denken, dab zwar der Angriffspunkt des Digitonins bei allen Hi~molyseformcn das Cholesterin ist, dab aber Cholesterin in

1 Es ist aller4ings darauf hinzuweisen, dab die stSchiometrische 1 : 1 Beziehung zwischen Digitonin- und Zellcholesterinmenge aus den SCm~DT-THoM~.sehen Ver- suchen zun~ehst nur fiir lytische Digitoninkonzentrationen hervorgeht, bzw. sogar nur fiir Konzentrationen, die relativ raseh h~molysieren. DaB auch bei niedrigeren Konzentrationen, wie sie in den vorliegenden Versuchen verwendet wurden, Chole- sterin der einzige Rezeptor ist, ist damit viclleicht nicht strikt erwiesen, aber doeh eher wahrscheinlich. Herr Professor LENDLE war so freundlich, mich auf einc Unter- suchung aufmerksam zu machen, die in seinem Insti tut yon G. GESS~ER ausgeftihrt worden ist und in der eine Bindung von Digitonin an EiweiB nicht gefunden wurde. (Dissertation Miinster 1943, nicht gcdruckt.)

Zur Fr~ge des Mechanismus der Digitonin-H~molyse. 473

verschiedenen Bindungsformen in die Membran eingebaut ist, und dab sich die Kom- plexbindung des Digitonins an Cholesterin je nach Bindungsform verschiedcn ~uBert.

Ffir die Theorie dcr H~nolyse ist aus den Resultaten wohl zu schlieBen, dal~ ihre experimentelle Basis sich nicht auf die Beziehung zwischen prozentualer H~molyse und Digitoninkonzentration beschr~nken sollte, da der gleiche H~molyse- grad bei verschiedenen Typen offenbar nicht das gleiche bedeuten diirfte. Der an- sprechende Versuch yon RvHE~S~O~ 4, die kritische GrSl~e in der Belegung der Zelloberfl~che mit Digitoninmolekfilen zu sehen, der yon Ju~G kritisiert wurde, kSnnte auf entsprechend ver~nderter Basis interessante Aussichten bitten.

Z u s a m m e n f a s s u n g .

Die Dig i ton inh~molyse wurde m i t Hilfe de r Kr i t e r i en , die aus dem Verha l t en der osmot ischen Resis tenz und des t t ~ m a t o k r i t v o l u m e n s in frf iheren Arbe i t en abge le i te t worden waren, ana lys ie r t .

Obwohl nach den Arbe i t en yon Sem~DT-THO~t~ fiir die Dig i ton in- h~molyse ein (und wahrscheinl ich nur ein) b e s t i m m t e r Angr i f f spunk t (Membran-Choles ter in) anzunehmen ist, e rgab sich ke in e inhei t l icher H ~ m o l y s e t y p . Die H~molyse bes i tz t K o m p o n e n t e n im Sinne einer n icht - osmot i schen H~molyse u n d einer Grenzvolumh~molyse , auBerdem eine q u a n t i t a t i v ger ingere K o m p o n e n t e ehler kol lo id-osmot ischen Schwellung. Der q u a n t i t a t i v e Antef l dieser K o m p o n e n t e n wechsel t s t a r k je nach den Versuchsbedingungen, u n t e r denen den s t~rks ten EinfluB die T e m p e r a t u r zeigt. Bei n iedr igen T e m p e r a t u r e n k a n n die H~molyse fas t oder ganz re in den T y p der Grenzvolumh~m01yse zeigen, bei hohen T e m p e r a t u r e n fas t oder ganz re in den T y p der n ich tosmot i schen H~molyse . N e b e n der T e m p e r a t u r erwiesen sich die abso lu te D i g i t o n i n k o n z e n t r a t i e n und d ie Dig i ton inmenge p ro Zelle als modif iz ierende Fak to ren .

Es wi rd die Anschauung ve r t r e t en , d a b ein wei te re r Angr i f f spunk t des Digi tonins zwar n ich t m i t S icherhei t ausgeschlossen werden kann , dal~ abe r eher Que rve rb indungen zwischen den drei Typen , z . B . in F o r m gemeinsamer E lemente , oder kausa l e r Verknf ipfung, anzunehmen seien.

L i t e r a t u r . 1 JV~.G, F., u. K. B S ~ : Arch. exper. Path. u. Phaxmakol. 207, 144--158 (1949).

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Prof. Dr. W. W/LBRANDT, Bern/Schweiz, Pharmakol. Institut.