Hans-Martin JäckAbteilung für Molekulare Immunologie
Medizinische Klinik IIINikolaus-Fiebiger-Zentrum
Southern- und Northern-Blot-Analysen
Gk-MethodenseminarErlangen, März 2007
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 2
Modifiziert aus Elelectrophoresis in Practice by Westermeier, 2nd Edition
DNA
Migration
Elektrophorese
Transfer
Nachweis
BlockBlocksubstanz
Spezifische Sonde bzw. Antikörper
Southern
Übersicht: Blotting-Methoden
WesternProteinNorthern RNASouthwesternNorthwestern
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 3
Methode zum qualitativen (z.B. Größe) und quantitativen Nachweis spezifischer, immobilisierter DNA-Sequenzen
Isolierung der DNA bzw. PCR-Amplifikation
Restriktionsverdau isolierter DNA
Agarosegelelektrophorese
Transfer
Hybridisierung mit spezifischer DNA-Sonde
Signalentwicklung
Southern-Blot-Analyse
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 4
Größen-Standard
Modifiziert aus Recombinant DNA by Watson et al., 2nd Edition
Sonde hybridisiert mit komplementären Sequenzen
RNA or DNA
Gel Membran
Transferierte DNA/RNA
ElektrophoreseElektrophorese
Hybridisierung mit spezifischer Hybridisierung mit spezifischer radioaktiven Sonderadioaktiven Sonde
TransferTransfer
Exponieren mit Exponieren mit RöntgenfilmRöntgenfilm
Filter imGefrierbeutel
Gel
Puffer
Schwamm
Membran
Filterpapier
Autoradio-gramm
Migration
Markierung Markierung der Sondeder Sonde
Gewicht
Übersicht: Southern-Blot-Analysen
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 5
Proteinase K/Phenol-Methode
Zellen bzw. Gewebe in SDS-Puffer lysieren
Verdau der RNAmit RNAse A/T1
Extraktion des Lysats mit Phenol und
Phenol/Chloroform
Verdau der Proteine mit Proteinase K/SDS
Präzipitation der DNA mit Na-Acetat und EtOHauf Eis oder -200C/12 hrs
Lösen der DNA in TE(10mM Tris pH=8.0 /
1mM EDTA)
DNA
Phenol
DNA-Isolierung und -Quantifizierung
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 6
Ionenaustauschchromatographie nach Qiagen
St - HindIII Sau3A
Lyse cells in SDS buffer with
ProtK and RNAse
Apply to Resin
Elute
0
0
0
0
0
0
+
+
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 7
Quelle DNA (mg)
1 Säugetierzelle: 510-12 (= 5 pg)
106 kultivierte Zellen : 2.5-10
10 mg Maus-Leber: 10-15
300ml Blut: 1-10
Ausbeuten
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 8
µg/ml Nukleinsäure = OD260 x Umrechnungsfaktor
Umrechnungsfaktoren (für Küvette mit d = 1cm):ds-DNA: 1 OD260 Unit = 50µg/ml ssDNA: 1 OD260 Unit = 35µg/ml
ssRNA: 1 OD260 Unit = 40µg/ml
ss Oligonukleotide: 1 OD260 Unit = 20µg/ml
Quantifizierung und Reinheit isolierter Nukleinsäuren
Gute DNA: OD260 / OD280 = 1.7 - 1.9
Gute RNA: OD260 / OD280 = 2.0 - 2.2.
Photometrische Konzentrationsbestimmung
Reinheit
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 9
Entdeckung und Eigenschaften
Erkennen spezifische DNA-Sequenzen und schneiden entweder innerhalb (Typ II) oder außerhalb der Erkennungsstelle (Typ I)
Ca. 3,000 Restriktionsenzyme mit ca. 230 Sequenzspezifitäten
Hauptsächlich in Bakterien, aber auch in einigen Viren und Eukaryonten
Host-controlled restriction modification bei Bakteriophagen (Luria, 1950) ,
Erste Sequenz-spezifische Typ I Endonuklease (Arber and Linn sowie Meselson and Yuan, 1968)
Erstes Typ II-Restriktionsenzym Hind II (Smith und Kollegen, 1970)
Nobelpreis für Medzin an Werner Arber, Hamilton Smith und Daniel Nathans (1978)
Mit Entdeckung der RE begann der Start der Molekuarbiologie
Restriktionsenzyme
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 10
KpnI
5´-GGTNACC G GTNACC3´-CCANTGG CCANTC-5´ G
5´-GGTACC GGTAC-3´ C3´-CCATGG C CATGG
5´-CCCGGG CCC GGG3´-GGGCCC GGG CCC
XmaI
BstEII
Asp718I
SmaI
5´-CCCGGG C CCGGG3´-GGGCCC GGGCC-5´ C
5´-GGTACC G GTACC3´-CCATGG CCATG-5´ G
3´ Überhang3´ Überhang
BluntBlunt
5´ Überhang5´ Überhang
5´ Überhang5´ Überhang
5´ Überhang5´ Überhang
Isos
chiz
omer
eIs
osch
izom
ere
Einige Beispiele von Typ II-Restriktionsenzymen
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 12
Enzymatische Aktivität von Restriktionsenzymen
Die Aktivität von RE wird in Units [U] angegeben
1U entpricht der Menge an Enzym, das
1 ug Phagen-DNA (ca. 45kb) in 1 Stunde unter optimalen Temperatur- und Pufferbedingungen
verdaut
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 13
Ethidiumbromid (EtBr)-Färbung
Interkaliert zw. Basen Bindung ist proportional zur
Fragmentlänge EtBr löst Fluoreszenz-
löschung von eingestrahl-tem UV-Licht aus Fragmente orangerot
(Empfindlichkeit: 1-2ng DNA)
EtBr-Färbung elektrophorestisch aufgetrennter genomische DNA
Agarose-Gelelektrophorese
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 14
Glasplatte
Nylon Membran
PapiertücherWhatman Papier
Gewicht: ~250 g
Gel
10 x SSC
Whatman Papier-Brücke
Poröser Stein20xSSC
Wahl der Membran
Kapillar-Transfer
Aufbau
Nitro-zellulose
Nylon
Bindung hydrophob(backen)
Kovalent(UV)
Fragmente Denaturiert > 300bp
denaturiert > 50bp
Transfer Kapillar KapillarElektro
Sonden Alle v.a radioaktiv markierte Sonden
Bindungs-kapazität
Hoch gering
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 15
Fragmentierung durch Säure- und Alkalibehandlung
(modifiziert aus: Knippers, Molekulare Genetik)
Probleme Nur Einzelstrand-DNA bindet
an Membran Große DNA-Fragmente
(> 10kb) transferieren schlecht
1. Fragmentieren2. Denaturieren
OH
H+
AdeninDepurinierungdurch Säure
Spaltung der N-Glykosid-Bindung
-OHDenaturierung und Spaltung durch Lauge
Spaltung der Phospho-Diesterbindung)
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 16
Sonden
Doppelsträngige (ds) DNA
Einzelsträngige (ss) DNA
Einzelsträngige (ss) RNA
Oligonukleotide (20 - 50 Basen)
Verwendung markierter Desoxynukleotide während der Synthese bzw.
Markierung fertig synthetisierter DNA und RNA-Fragmente sowie Oligos
Prinzip
Markierung der Sonde
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 17
Markierte Desoxynukleotide
2
Digoxigenin-dUTP
Biotin-7-dATP
Biotin
[32P]-dATP
Digoxigenin
(adapted from http://www.boku.ac.at/zag/ubungen.htm)
α γ
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 18
* * * 5‘ 3‘
5‘ 3‘
‚Nick-Translation‘‚Random-Prime‘
Markierungsmethoden
3‘ 5‘dsDNA-Sonde
5‘ 3‘3‘ 5‘
dsDNA-Sonde
5‘ 3‘
5‘ 3‘
Klenow + P*dNTP
1. 950C2. Hexa-dNTP-Gemisch 5‘ 3‘
3‘ 5‘
Dnase I
Kornberg Pol (3‘-5‘ Exo)
* * *
3‘ 5‘
Markierung
5‘ 3‘3‘ 5‘
Kornberg Pol (Pol) + P*dNTP
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 19
***3‘ 5‘
5‘-EndmarkierungIn vitro Transkription 3‘ Tailing
Vektor mit Sondensequenz+ T7-Promoter
* * * *
* * * *
* * * ** * * *
T7RNA-Pol+ P*NTP
5‘ 3‘3‘ 5‘
dsDNA-Sonde
5‘ 3‘3‘ 5‘
* 5‘ 3‘3‘ 5‘*
5‘-Kinase+ P*dNTP
TdT+ P*dNTP
5‘ 3‘***
dsDNA-Sonde
* Markierung
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 20
Spezifische Aktivität und chemische Konzentration
Spezifische Aktivität
z.B. 3000 mCi pro mMol
Chemische Konzentration
mMol pro liter
Konsequenz:
Setzt man 100 mCi eines 32P-markierten Fragments mit 3000mCi/mmol bzw. 300 mCi/mmol ein, so ist die chemische Konzentration des Fragments mit der höheren spezifischen Aktivität um das 10-fache geringer
(Beispiel: Über Random-prime bzw. Nick-translation markierte Sonden)
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 21
Fixieren der transferierten
Nukleinsäure (UV oder 800C)
Gel Membran
Transferierte DNA/RNA
1. Prähybdridisierung2. Hybridisierung3. Waschen
HybridisierofenEinfrierbeutel
Markierte Sonde
Hybridisierung
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 22
Nachweis radioaktiv-markierter Sonden
Belichten eines Röntgenfilms mit Verstärkerfolie Bei –700C
VerstärkerfolieMembran
Röntgenfilm
Autoradiogramm
23
9.4
6.6
4.4
kb
Nachweis der Hybridisierung
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 23
Photon
Ag+ Ag* Ag *•Ag*
t½=1sec
Zur Entwicklung von aktivierten Silber-atomen (Ag * ) während der Filment-wicklung benötigt man mindestens zwei aktivierte Silberatome. Bei niedrigen Temperaturen ist die Halbwertszeit des ersten aktivierten Silveratoms größer. Dadurch erhöht sich die Wahr-scheinlichkeit, dass ein zweites aktivier-tes Ag-Atom entsteht, bevor das erste Silberatom wieder reduziert wird
Einfluß der Temperatur Einfluß der Verstärkerfolie
Membran
Röntgenfilm
Verstärkerfolie
-Strahlung
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 24
Markierte Sonde
Nachweis nicht-radioaktiv markierter Sonden
Kolorimetrisch
Immobilisiertes Fragment
AP
Avidin
AP
Ak
BiotinDigoxigeninRedoxreaktion mit reduziertem farblosen P-Substrat(z.B. NTB/BCIP-Reaktion)
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 25
Schematic of the NBT/BCIP reaction: when alkaline phosphatase (AP) removes the phosphate group of BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate) the resulting molecules dimerizes under oxidating conditions to give the blue precipitate (5, 5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo). During the reaction with BCIP, NBT (nitroblue tetrazolium) is reduced to its colored form to give an enhanced color reaction
(adapted from http://www.boku.ac.at/zag/ubungen.htm: Kolloquiumsunterlagen, Molekularbiologische Übungen,
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 26
Chemilumineszenz
Schematic of the CSPD reaction: Enzymatic dephosphorylation of the dioxetane CSPD by alkaline phosphatase leads to the metastable phenolate anion, which decomposes and emits light at 477 nm.
(adapted from http://www.boku.ac.at/zag/ubungen.htm: Kolloquiumsunterlagen, Molekularbiologische Übungen, Gößl et al., Zentrum für Angewandte Genetik)
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 27
Verfizierung der Identität eines PCR Produktes bzw. DNA-Fragmentes
Kartierung isolierter DNA-Fragmente
Analyse von Intronsequenzen
Nachweis von Genmutationen
Nachweis von Genumlagerungen
Nachweis der homologer Rekombinationen (gezielte Mutationen z.B. bei Mäusen)
Anwendungen
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 28
Immunglobulin- bzw. T-Zellrezeptorgen-Umlagerungen
Immunglobulin- bzw. T-Zellrezeptorgene werden durch Umlagerung von Gen-segmenten während der Reifung von B- und T-Zellen aus Blutstammzellen ge-bildet
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 29
Beispiel: Genumlagerung am Schwerkettengen-Lokus
Kb
6 -
5-
4 -
3 -
2 -
1 -
S B+/- B+/+
Sonde
Eco-Verdau + SondeSonde
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 30
J C
5’ J
Pst I Pst I
7-kb wildtype fragment
(JkW)
Pst I Pst I
5.7-kb targeted fragment
(JkT)
neo
Pst I digest5’ J probe
JW (7.0)
JT (5.7)
5 6 7 8
+/-
+/- +/+
Wild
type
Beispiel: Nachweis gezielter Mutationen in transgenen Mäusen
Wildtypelocus
Targetedlocus
Aus: Kline et al, JI 1998
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 32
Gendiagnostik
Dia entnommen aus www.????
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 33
Methode zum qualitativen (z.B. Größe !!!!) und quantitativen Nachweis spezifischer, immobilisierter RNA-Sequenzen
RNA-Isolierung
Denaturierung
Agarosegelelektrophorese
Transfer
Hybridisierung
Signalentwicklung
Northern-Blot-Analyse
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 34
Eine eukaryontische Zelle enthält etwa 10 pg Gesamt-RNA
ca 80 - 85% ribosomale RNA
ca. 15 - 20% tRNA and snRNA ca. 1-5% mRNA
Typische Ausbeuten (g)
106 Hela : 15
106 COS-7 35
106 NIH/3T3 10
10 mg Milz 35
10 mg Hirn 8
RNA-Isolierung
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 35
Vorsichtsmaßnahmen
Handschuhe tragen (Haut ist kontaminiert mir RNAsen)
RNAse-freie Reagentien separat im Labor lagern
Verwendung steriler Einwegmaterialien (Zellkultur)
Glasswaren sollten bei 2000C gebacken werden
Behandlung von deionisiertem Wasser mit 0.1% Diethylpyrocarbonat (DEPC, von Sigma)
Gelkammern und andere Materielen für RNA-Arbeit reservieren
Verwendung von RNase-Inhibitoren (Rnasin von Promega)
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 36
Erfolgreiche RNA-Isolierung (4-Punkte-Regel)
1. Inaktivierung der RNAse-Aktivität
2. Effektiver Zellaufschluß
3. Denaturierung der Nukleoproteinkomplexe
4. Entfernung von Protein und DNA
OH + CHCl3 S-C N2HN C NH2
NH2+-
Guanidinium-Isothiocyanat (GIT)
Phenol / Chloroform
o Inaktiviert RNAsen
o Guter Zellaufschluß
o Zerstört Nukleoprotein-komplexe
o Zerstört Nukleoprotein-komplexes
o Extrahiert DNA und denaturierte Proteine
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 37
Isolierung von Gesamt-RNA
Lyse der Zellen bzw. Gewebe
mit GIT/-ME lysieren
Extraktion des Lysats mit Phenol und
Phenol/Chloroform
Präzipitation der RNA mit Na-Acetat und EtOHauf Eis oder -200C/12 hrs
Lösen der RNA in TE(10mM Tris pH=8.0 /
1mM EDTA)
DNA
RNA
CsCl-Dichte-zentrifugation
Lösen der RNA in TE(10mM Tris pH=8.0 /
1mM EDTA)
Reinigen der RNA über Ionenaustauscher-Matrix
(Qiagen, Promega)
1
3
2
Reinheit:OD260/280 = 2.0 - 2.2
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 38
Isolierung zytosolischer RNA
Zellen bzw. Gewebe werden in nicht-ionischem Detergenz
(NP-40, Triton X-100) lysiert
RNA wird mit Na-Acetat und EtOH auf Eis oder bei -200C/12 hrs präzipitiert
RNA wird in TE gelöst(10mM Tris pH=8.0 /
1mM EDTA)
Reinheit:OD260/280 = 1.8 - 2.0
Kerne werden abzentrifugiert(Eppendorf, 13000g)
Postnukleärer Überstand wird mit Phenol/Chloroform extrahiert
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 39
Isolierung von Kern-RNA mRNA-Isolierung
-TTTTTT
AAAAAA cap
mRNA
Oligo-dT
Zellen mit nicht-ionischen Detergenz aufschließen
Kerne über Sucrose-gradienten aufreinigen
RNA über GIT-Methode und CsCl-Gradienten aufreinigen
Zellen mit GIT aufschließen
Affinitätschromatographie an oligo(dT)-Matrix
Sepharose, Cellulose oder Magnet. Partikel
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 40
Einzelsträngige, isolierte RNA-Transkripte besitzen viele, thermodynamisch-stabile
Sekundärstruktur
Analog Southern-Methode, RNA muss aber denaturiert werden
Schmier im Agarosegel
Elektophorese und Transfer
Formaldehyd
Verhindert Wasserstoffbrücken-bindungen zwischen Basen und somit die
Ausbildung einer Sekundärstruktur
Denaturierte RNA-Fragmente haben keine Sekundärstruktur
Scharfe Bande im Agarosegel
Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 41
Beispiel: Formaldehyd-Agarose-Elektrophorese verschiedener RNA-Fraktionen aus Hybridomzellen
HC+/-
Hybridom
HC-Sonde
Aktin-SondeEtBr
Gesamt-RNA = G
Kern-RNA = K
Zytoplasma-RNA = Z