Rekombinante Allergene
Assoc.Prof.Dr. Birgit Linhart
Abteilung für Immunpathologie
Institut für Pathophysiologie
und Allergieforschung
Medizinische Universität Wien
8. WIENER KOMPONENTENSCHULE
2.-3. September 2016 in Wien
DEFINITIONEN:
Allergenquelle – Allergenextrakt - Allergen
Allergen
Mast-
zelle
Allergenquelle
Gemische aus allergenen
und nicht allergenen
Bestandteilen
Allergenextrakt
Molekül, das die
Krankheitssymptome
auslöst
Was sind standardisierte Allergenextrakte ?
Nachweis von IgE-bindenden Proteinen in Maisextrakten
Arbeiten aus dem Paul-Ehrlich Institut, 1996
‚Standardisierte‘ Allergenextrakte enthalten
unterschiedliche Konzentrationen von
Haupt- und Nebenallergenen
Arbeiten aus dem Paul-Ehrlich Institut, 2002
Analyse von 9 Haselnuß-Extrakten
‚Standardisierte‘ Allergenextrakte enthalten
unterschiedliche Konzentrationen von
Haupt- und Nebenallergenen
Nachweis des LTP-Gehalts in 9 Haselnuss - Hauttestlösungen
(A-I) mittels Immunoblot:
‚Standardisierte‘ Allergenextrakte enthalten
unterschiedliche Konzentrationen von
Haupt- und Nebenallergenen
Nachweis des LTP-Gehalts in 9 Haselnuss - Hauttestlösungen
(A-I) mittels Immunoblot:
14
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 IgE
Timothygrass
‚Standardisierte‘ Allergenextrakte enthalten
unterschiedliche Konzentrationen von
Haupt- und Nebenallergenen
Company 1
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14
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 IgE
Company 4
14
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14
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2 4 6 8 10 12 14 16 IgE
Company 5
14
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21
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46
68
21
30
46
2 4 6 8 10 12 14 16 IgE
1= preimmune Phl p 1
2= a-Phl p 1
3= preimmune-Phl p 2
4= a-Phl p 2
5= Preimmune Phl p 4
6= a-Phl p 4
7= preimmune Phl p 5
8= a-Phl p 5
9= preimmune-Phl p 6
10= a-Phl p 6
11= Preimmune Phl p 12
12= a-Phl p 12
13= preimmune Phl p 13
14= a-Phl p 13
15= preimmune-Phl p 7
16= a-Phl p 7
IgE= Graspollen-allergischer Patient
Lieschgras Extrakt
Focke M. et al,
Clin.Exp.Allergy 2008
14
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21
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14
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 IgE
Timothygrass
‚Standardisierte‘ Allergenextrakte enthalten
unterschiedliche Konzentrationen von
Haupt- und Nebenallergenen
Company 1
14
68
21
30
46
14
68
21
30
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 IgE
Company 4
14
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14
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21
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2 4 6 8 10 12 14 16 IgE
Company 5
14
68
21
30
46
68
21
30
46
2 4 6 8 10 12 14 16 IgE
1= preimmune Phl p 1
2= a-Phl p 1
3= preimmune-Phl p 2
4= a-Phl p 2
5= Preimmune Phl p 4
6= a-Phl p 4
7= preimmune Phl p 5
8= a-Phl p 5
9= preimmune-Phl p 6
10= a-Phl p 6
11= Preimmune Phl p 12
12= a-Phl p 12
13= preimmune Phl p 13
14= a-Phl p 13
15= preimmune-Phl p 7
16= a-Phl p 7
IgE= Graspollen-allergischer Patient
Lieschgras Extrakt
Focke M. et al,
Clin.Exp.Allergy 2008
Phl p 1
Wichtige Allergene sind oft nur in
geringen Mengen enthalten
Biological activity of recombinant Der p 2, Der p 5 and Der
p 7 allergens of the house-dust mite Dermatophagoides
pteronyssinus.
Lynch et al., Int-Arch-Allergy-Immunol. 1997
Recombinant spiked allergen extract
Lundberg et al., Allergy. 2001
‚Standardisierte‘ Allergenextrakte
enthalten beträchtliche Mengen
an Endotoxinen
Endotoxin content of standardized allergen
vaccines.
Trivedi et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 2003
Allergenextrakte können mit Allergenen aus
anderen Allergenquellen kontaminiert sein
Beispiel:
False-positive skin prick test responses to commercially
available dog dander extracts caused by contamination
with house dust mite (Dermatophagoides
pteronyssinus) allergens.
van der Veen MJ, Mulder M, Wittemann AM, van Ree R, Aalberse
R, Jansen HM, van der Zee JS. J. Allergy Clin Immunol. 98, 1028-
1034, 1996.
cDNA Bank
Bakteriophage
ausplatieren
jeder Plaque steht
für 1 Protein
die Proteine werden auf
Nitrozellulose übertragen
Serum IgE von
allergischen Patienten
Detektion von
gebundenem IgE
Bakterienrasen
IgE IMMUNOSCREENING
cDNA Bank
Bakteriophage
ausplatieren
jeder Plaque steht
für 1 Protein
die Proteine werden auf
Nitrozellulose übertragen
Serum IgE von
allergischen Patienten
Detektion von
gebundenem IgE
Bakterienrasen
IgE IMMUNOSCREENING
Isolation der
DNA, die für das
Allergen kodiert
DNA Sequenz-
analyse
Expression des
rekombinanten
Allergens
Produktion von rekombinanten Allergenen:
Prokaryontische und eukaryontische Expressionssysteme
1. Bakterien: Escherichia coli
2. Hefe: Pichia pastoris
3. Pflanzen: Tabak
4. Insektenzellen
Produktion von rekombinanten Allergenen:
Prokaryontische und eukaryontische Expressionssysteme
1. Bakterien: Escherichia coli
2. Hefe: Pichia pastoris
3. Pflanzen: Tabak
4. Insektenzellen
Proteine werden
nicht glykosyliert!
Proteine werden
glykosyliert!
MUXF3 CCD (Bromelain),
eine prototypische N-Glykan Struktur
Cross-reactive Carbohydrate Determinants
(CCDs)
Karbohydrate sind IgE-bindende Strukturen
Studies of the carbohydrate moieties of the timothy grass
pollen allergen Phl p 1
Petersen et al., Electrophoresis 1995
Post-translational modifications influence IgE reactivity to
the major allergen Phl p 1 of timothy grass pollen
Petersen et al., Clin Exp Allergy 1998
Hapten
Cross-reactive Carbohydrate Determinants
(CCDs)
Phl p 1 Lieschgraspollen
Phl p 4 Lieschgraspollen
Phl p 13 Lieschgraspollen
Lyc e 2 Tomate
Hev b 4 Latex
Lol p 11 Weidelgraspollen
Api g 5 Sellerie
Ole e 1 Olivenpollen
Cor a 11 Haselnuss
Ara h 1 Erdnuss
Cyn d 1 Bermudagraspollen
Art v 1 Beifußpollen
Api m 1 Bienengift
Api m 2 Bienengift
Ves v 2 Wespengift
Karbohydrate sind IgE-bindende Strukturen,
jedoch mit geringer biologischer Relevanz
Poor biologic activity of cross-reactive IgE directed to carbohydrate
determinants of glycoproteins.
van-der-Veen et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 1997
Carbohydrate epitopes and their relevance for the diagnosis and treatment
of allergic diseases.
van-Ree et al., Int-Arch-Allergy-Immunol. 2002
Specific IgE to cross-reactive carbohydrate determinants strongly affect
the in vitro diagnosis of allergic diseases.
Mari et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 1999
IgE to cross-reactive carbohydrate determinants: analysis of the
distribution and appraisal of the in vivo and in vitro diagnosis.
Mari et al., Int-Arch-Allergy-Immunol. 2002
?
IgE-Reaktivität gegen Karbohydrat-Epitope
kann zu falsch positiven Testresultaten führen
Recombinant allergen-based IgE testing to distinguish
bee and wasp allergy
Mittermann I., et.al. J Allergy Clin Immunol 2010
Zirkulardichroismus (CD): eine einfache Technik,
um die strukturelle Integrität von Proteinen festzustellen
Temperature scan
-40000
-20000
0
20000
40000
60000
80000
185 195 205 215 225 235 245 255
Wavelength (nm)
Mo
lecu
lar
Ellip
ticit
y
25°C
35°C
45°C
55°C
65°C
75°C
85°C
95°C
Tropomyosin
Die dreidimensionale Struktur der rekombinanten
Allergene ist für ihre allergene Wirkung von Bedeutung
Die dreidimensionale Struktur der rekombinanten
Allergene ist für ihre allergene Wirkung von Bedeutung
Die dreidimensionale Struktur der rekombinanten
Allergene ist für ihre allergene Wirkung von Bedeutung
Die Strukturaufklärung von Allergenen erfolgt mittels
NMR-Spektroskopie und Röntgenstrukturanalyse
Birchpollen-Profilin Acanthamoeba-Profilin
Vergleich der IgE-Reaktivität von
natürlichen und rekombinanten Allergenen
Recombinant allergens for immunoblot diagnosis of tree-pollen
allergy
Valenta et al., J Allergy Clin Immunol 1991
Gereinigte natürliche Allergene sind
oft Gemische aus mehreren Isoformen
Humane IgE- und T-Zell-Reaktivität der Bet v 1
Isoformen a, e, b, d und l
T cell
reactivity
(rel. %)
IgE binding
(rel. %)
Skin prick test
wheal areas
(mm2)
nBet v 1 100 100 ND
rBet v 1a 41 100 70
rBet v 1e 67 83 50
rBet v 1l 87 3 10
rBet v 1d 100 5 7
rBet v 1b 92 60 19
IgE antibodies to recombinant pollen allergens
(Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, and Bet v 2) account for a
high percentage of grass pollen-specific IgE
Niederberger et al., J Allergy Clin Immunol 1998
Recombinant birch pollen allergens (rBet v 1 and
rBet v 2) contain mostof the IgE epitopes present in
birch, alder, hornbeam, hazel, and oak pollen: A
quantitative IgE inhibition study with sera from
different populations
Niederberger et al., J Allergy Clin Immunol 1998
Vergleich der IgE-Reaktivität von
natürlichen und rekombinanten Allergenen
Eine in vitro - Methode zur Messung der
biologischen Aktivität von rekombinanten Allergenen
Induction of specific histamine release from basophils with purified natural and
recombinant birch pollen allergens. Valenta et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 1993
Die Stimulierung von spezifischen T-Zellen
ist kein charakteristisches Merkmal für Typ I Allergien !
Peptide specificity and HLA restriction do not dictate lymphokine
production by allergen-specific T-lymphocyte clones.
van-Neerven et al., Immunology. 1994
Nonallergic individuals recognize the same T cell epitopes of Bet
v 1, the major birch pollen allergen, as atopic patients.
Ebner et al., J-Immunol. 1995
Zelluläre Allergen-Stimulationstests:
Der Lymphozyten-Transformationstest
Zelluläre Allergen-Stimulationstests:
Der Basophilen-Aktivierungstest
misst die CD63 und CD203c Expression auf
basophilen Granulozyten
Messung der CD203c Expression
auf basophilen Granulozyten
Recombinant allergens promote expression of CD203c
on basophils in sensitized individuals.
Hauswirth et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 2002
Pricktest und intradermaler Hauttest
mit rekombinanten Allergenen
In vivo allergenic activity of a hypoallergenic mutant of the major
fish allergen Cyp c 1 evaluated by means of skin testing.
Douladiris et al., J Allergy Clin Immunol. 2015
Diagnostic value of recombinant Aspergillus fumigatus allergen
I/a for skin testing and serology.
Moser et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 1994
Type I skin reactivity to native and recombinant phospholipase A2
from honeybee venom is similar.
Muller et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 1995
Serological and skin-test diagnosis of birch pollen allergy with
recombinant Bet v I, the major birch pollen allergen.
Menz et al., Clin-Exp-Allergy. 1996
Skin testing with recombinant allergens rBet v 1 and birch
profilin, rBet v 2: diagnostic value for birch pollen and associated
allergies.
Pauli et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 1996
Nasale Provokation mit rekombinanten Allergenen
Skin test results but not serology reflect
immediate type respiratory sensitivity: a study
performed with recombinant allergen
molecules.
Niederberger et al., J-Invest-Dermatol. 2001
1988-89 First cloning of allergen-encoding cDNAs
1991-92 IgE-based diagnosis with recombinant allergens
1992-96 Development of animal models based on recombinant allergens
1989-92 DNA and amino acid sequence similarities – the basis for the
‘one for all’ concept
1993-97 Construction and characterization of recombinant hypoallergens
for allergy vaccination
1994-96 First studies using recombinant allergens for provocation testing
in allergic patients
1996 First population studies using recombinant allergens
1999 Monitoring the course of SIT using recombinant allergens
1999-2000 Evaluation of recombinant hypoallergens in patients by
provocation testing
2002 The concept of marker allergens for the identification of
cross-sensitizations and for selection of patients for SIT
2002 Microarrayed recombinant allergens for diagnosis
2001-05 First immunotherapy trial with recombinant hypoallergens
2005 First immunotherapy trial with recombinant allergens
2008 Comparison of extract-, purified allergen-, and recombinant
allergen-based SIT
2009 Phase III studies with recombinant hypoallergens completed
2010 First SLIT studies with recombinant allergens
REKOMBINANTE ALLERGENE IN DER ALLERGIEDIAGNOSTIK UND -BEHANDLUNG
2008 Recombinant allergens as reference materials for allergenic
products