TECHNISCHE UNIVERSITÄTDRESDEN
ILB
Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Lehrstuhl Lebensmitteltechnik
Verbundprojekt: Aktive Verpackung mit antimikrobiellen Eigenschaften - Teilprojekt 3:
Toxikologische Bewertung von aktiven Verpackungen mit antimikrobiellen
Eigenschaften
Abschlussbericht: Forschungsvorhaben: 0330313
Bearbeitungszeitraum: 01.01.2003 bis 30.04.2004
für: Forschungszentrum Jülich GmbH, Berlin bearbeitet von:
Autor: Dipl.-Lebensmittelchem. Tommy Opitz
Durchführende Institution: Technische Universität Dresden Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik
Projektleiter: Prof. Dr. rer. nat. habil. Th. Bley
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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt
Inhaltsverzeichnis
1. Aufgabenstellung und Zielsetzung ………………………………….………3
2. Methodische Umsetzung ...………………………………………….………6
3. Ergebnisse ………………………………………………………….……...20
4. Zusammenfassung und Ausblick …………………………………...……..30
5. Literaturverzeichnis .……………………………………………….……....32
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1. Einleitung, Aufgabenstellung und Zielsetzung
Einleitung
Die Verpackung eines Gutes hat neben dem Informations- und Werbeaspekt vor allem den
Schutz des Produktes bei Transport und Lagerung zur Aufgabe. Insbesondere im
Lebensmittelbereich werden zusätzlich noch hohe Ansprüche an die hygienische Qualität
gestellt. Eine mikrobiologische Schädigung von Lebensmitteln kann durch verschiedenste
Maßnahmen herabgesetzt oder verhindert werden:
• Reduzierung der Wasseraktivität (Trocknen, Pökeln, usw.)
• Absenken des pH-Wertes (Einlegen, Fermentieren)
• Hochtemperatur-Behandlung (Pasteurisieren, Sterilisieren)
• Absenkung der Lagertemperatur (Kühl- bzw. Tiefkühllagerung)
• Bestrahlung (Mikrowellen-, UV-Bestrahlung)
• Mechanische, elektrische und chemische Methoden (Konservierungsstoffe,
Elektroimpulse)
• Einsatz aktiver Verpackungen
Als aktive Verpackungen werden solche bezeichnet, die selbsttätig unerwünschten und
qualitätsmindernden Veränderungen des verpackten Gutes entgegenwirken (Bleisch, 2003).
Diese Art der Verpackung beeinflusst gezielt die stoffliche Zusammensetzung der
Atmosphäre im Kopfraum der Verpackung. Sie verhindert bzw. verzögert den
Qualitätsverlust des Packgutes während der Lagerung entweder durch selektives Binden von
unerwünschten, flüchtigen aus dem Gut austretenden Komponenten (z.B. Oxygen
scanvenger) oder durch die Abgabe konservierender Stoffe.
Im Rahmen des „Active Packaging“ werden unterschiedlichste Stoffgruppen zur Hemmung
des Wachstums von Mikroorganismen eingesetzt: 1. Wasserabsorber Verminderung von Kondensat-Tröpfchen an der Oberfläche von
Verpackungsfolien durch mehrlagige Kunststoffe in denen eine
saugfähige Schicht eingearbeitet ist
2. Sauerstoffabsorber Bindung von Sauerstoff aus dem Kopfraum der Verpackung und
Verminderung der Oxidation
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3. Ethanol-Emitter Kondensation von Ethanol an der Oberfläche des Gutes und
Verhinderung von Schimmelpilz-Wachstum
4. Silber-Ionen Silberzeolithe als Kontaktschicht auf Kunststofffolien (PE, PP
und PS)
5. Fruchtbehandlungsmittel Auftrag als Wachsemulsion auch direkt auf die Verpackung zur
Verhinderung von Schimmelpilzbefall
6. Pflanzliche Wirkstoffe Verwendung von natürlichen Bioziden bzw. Biostatica als
Zusatz auf und in Packstoffen
Erste Ansätze zur Herstellung antimikrobiell ausgerüsteter Verpackungen wurden schon in
den 60er Jahren beschrieben. Bereits damals wurden Papiere mit und ohne Wachskaschierung
Calciumsorbat dotiert und für den Einsatz im Bereich Molkereiprodukte erfolgreich getestet.
Feuchtigkeits- und Sauerstoffabsorber kommen in Japan und den USA bereits als kleine,
chemikaliengetränkte Kissen zur Einlage in Lebensmittelverpackungen zum Einsatz. Die
Akzeptanz der Verbraucher im europäischen Markt gegenüber solchen Produkten ist bislang
jedoch gering [HOLLEY, 2002].
Entscheidend für die Suche nach neuen antimikrobiellen Wirkstoffen zur Verwendung in
Verpackungen sind neben der verlängerten Haltbarkeit auch ökonomische und ökologische
Aspekte. Neben einem hohen Wirkniveau bei sehr geringen Aufwandmengen erwartet man
ein breites Wirkungsspektrum mit geringen bzw. keinen toxischen Nebenwirkungen auf das
Packgut. Weiterhin soll ein hoher Sicherheitsgrad für Umwelt, Anwender und
Endverbraucher gewährleistet sein
Zu neuen Wirkstoffen führen grundsätzlich zwei Wege: die chemische Synthese und die
Suche nach geeigneten Naturstoffen. Die chemische Synthese hat den Vorteil, dass sie
meistens kostengünstiger ist und gut reproduzierbare Ergebnisse liefert. Zusätzlich zeichnet
sich die chemische Synthese durch ihre gute Zugänglichkeit von Derivaten aus. Ihre Nachteile
liegen jedoch in der großen Anzahl von Syntheseprodukten, die geprüft werden müssen, um
zu einem brauchbaren antimikrobiell wirkenden Packstoff zu gelangen. Bei den Naturstoffen
ist die Auffindungsrate geeigneter Substanzen etwas höher und die Zahl der möglichen
Metabolite, wegen der Komplexizität der Strukturen, praktisch unbegrenzt. Nachteile liegen
in der oft schwierigen und teuren Herstellung, in der schlechten Zugänglichkeit von Derivaten
sowie in der meist erschwerten Standardisierung des Ausgangsmaterials [HAN, 2000;
PIRINGER, 1993].
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Weiterhin ist die Isolierung der aktiven Reinsubstanzen in der Regel beträchtlich teurer als die
Herstellung synthetischer Produkte. Darüber hinaus ist die biologische Aktivität und Stabilität
von Naturstoffen im Freiland oft geringer. Bei der Verwendung von Rohextrakten als
Wachstumshemmer von Mikroorganismen können Probleme hinsichtlich der
Standardisierung und der Toxizität auftreten, so dass die geforderten Voraussetzungen für
eine lebensmittelrechtliche Zulassung schwer zu erfüllen sind [BEELITZ, 2001]. Die häufig
sehr komplexe Struktur der Moleküle aus Naturstoffen sowie ihr komplexes
Wirkungsspektrum erschweren zudem eine chemische Synthese. Dennoch stellt die Isolierung
aktiver Substanzen aus Pflanzen eine vielversprechende Methode zur Auffindung von
Molekülen dar, welche in der Lage sind, aufgrund ihrer Eigenschaften einen Weg zu neuen
innovativer Verpackungen aufzuzeigen.
Die Naturstoffe können entweder direkt zur Bekämpfung / Hemmung von unerwünschten
Mikroorganismen verwendet werden oder als Ausgangsstoff bei der Synthese von
Wirkstoffen dienen.
In der Literatur ist ein breites Spektrum von ätherischen Ölen bekannt, welche bakterizid,
fungizid oder gar insektizid wirken können [PIZZALE, et al. 1998; SUHR, et al. 2003]
Aufgabenstellung
Toxikologische Bewertung von aktiven Verpackungen mit antimikrobiellen
Eigenschaften
Im Rahmen des Forschungsvorhabens am Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik
der TU Dresden sind Hemmstofftests an aktiven Verpackungen durchzuführen und die
Toxizität von antimikrobiell wirkenden Substanzen zu bewerten. Weiterhin soll eine Analyse
der Hauptinhaltsstoffe der antimikrobiell wirksamen Naturstoffe erfolgen, sowie der
Wirkstoffgehalt in Abhängigkeit der Anwenderkonzentration bestimmt werden.
Untersuchungen zu den verschiedenen technologischen Verfahrensvarianten zur Wirkstoff-
Applikation mit Hinblick auf die Verluste im Zuge der Lagerung sind durchzuführen.
Zielsetzung
In Abstimmung mit den Projektpartnern (IBN GmbH Dresden, Papierverarbeitung Görlitz
GmbH, ELBTAL Druckerei und Kartonagen Kahle GmbH, Heinrich Ludwig
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Verpackungsmittel GmbH) sollte im Laufe der Bearbeitungszeit eine strapazierfähige,
antimikrobiell wirksame Verpackung für Lebensmittel- und Technikanwendungen hergestellt
werden. Das Wachstum der Mikroorganismen sollte durch Auftrag von pflanzlichen
Wirkstoffen auf Papp- und Papierwerkstoffe verhindert bzw. eingeschränkt werden. Die
hergestellten Packstoffe mussten dabei eine ausreichende Wirkungszeit, besonders gegenüber
Schimmelpilzen, aufweisen sowie lebensmittelrechtlich unbedenklich sein.
2. Methodische Umsetzung
2.1. Materialauswahl
Beim Screening verschiedener antimikrobiell wirksamer Stoffklassen wurde das
Hauptaugenmerk auf pflanzliche Stoffe gelegt, speziell auf ätherische Öle und Extrakte von
Heil- und Gewürzpflanzen.
Als ätherische Öle werden im allgemeinen angenehm riechende ölige Produkte bezeichnet,
die durch Wasserdampfdestillation oder Extraktion von Pflanzen oder Pflanzenteilen bzw.
durch Abpressen der äußeren Fruchtschalen einiger Citrusarten gewonnen werden.
In Vorversuchen zeigte besonders Nelkenblätteröl und Nelkenextrakt eine antimikrobielle
Wirkung auch bei geringen Konzentrationen.
Der in Malaysia beheimatete, ca. 10 bis 12 m hohe, immergrüne Gewürznelkenbaum
(Syzygium aromaticum, Myrtaceae) liefert die getrockneten Blütenknospen (Nelken). Aus
den Nelken, deren Stielen sowie Blättern und Zweigen des Baumes werden verschiedene
Nelkenöle gewonnen, deren Inhaltsstoffe auch für die sensorischen Eigenschaften des
Nelkengewürzes verantwortlich sind.
Durch Wasserdampfdestillation aus Blättern und Zweigen wird das mengenmäßig wichtigste
Nelkenöl in 2 bis 3%iger Ausbeute gewonnen. Es wird in der Aromenindustrie, Parfümerie,
der Zahnmedizin und Mundpflege, als Insektenabwehrstoff in Sonnenschutzmitteln sowie zur
Herstellung von Eugenol, Isoeugenol und Vanillin verwendet.
Nelkenblätteröl enthält 82–88% Eugenol (Abb. 1) als Hauptkomponente.
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Abb. 1 Eugenol (4-Allyl-2-methoxyphenol)
Eugenol wirkt mäßig giftig bei oraler Aufnahme und kann bei direktem Kontakt
sensibilisierend sowie hautreizend wirken.
Weitere, in geringen Konzentrationen vorkommende, Inhaltsstoffe des Nelkenblätteröls sind
die Caryophyllene. Man unterscheidet diese Sesquiterpene in α-Caryophyllen /Humulen
(Abb. 2) und β-Caryophyllen (Abb. 3).
Abb. 2 Humulen (α-Humulen, α-Caryophyllen,
2,6,6,9-Tetramethyl-1,4,8-cycloundecatrien) in seinen 3 Isomeren.
Abb. 3 β-Caryophyllen,
In Abstimmung mit den Projektpartnern wurden möglichst geringe Konzentrationen an
Nelkenblätteröl / und Nelkenextrakt festgelegt, um einerseits kostensparend zu arbeiten und
andererseits die verwandte Matrix (Leime, Druckfarben etc.) der Anwender nicht zu
verändern. Die empfohlenen Wirkstoffkonzentrationen wurden bei 5 bis 10 % bei
Nelkenextrakt und 2,5 bis 5 % für Nelkenblätteröl festgelegt.
OH
CH2
OCH3
CH CH2
H3C
CH3
CH2
CH3
H2C
CH3
CH3
CH3
1
467
10 CH3H3C
H3C CH3
α β γ
H3C
H3C
H2CH
HCH3
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2.2. Analyse der ätherischen Öle / Extrakte
2.2.1. Chemisch-physikalische Analyse
Zur Charakterisierung des Nelkenblätteröls / -extrakts wurden sensorische Merkmale der
beiden Naturstoffe erfasst sowie die Dichte, pH-Wert und Brechungsindex gemessen.
Die in Tab. 1 und 2 dargestellten Ergebnisse resultieren jeweils aus Dreifachbestimmungen.
Tab. 1 Nelkenblätteröl (Herkunftsland Indonesien)
Kenngröße Messgerät Ergebnis
Dichte ( 20°C)
Pyknometer
1,041 g/cm³
pH-Wert ( 100 g/l H2O, 20°C) Messelektrode 6,2
Brechungsindex (20°C) Refraktometer 1,536
Aussehen flüssig
Farbe leicht gelblich
Sensorik
Geruch typisch, leicht scharf
Tab. 2 Nelkenblätterextrakt
Kenngröße Messgerät Ergebnis
Dichte ( 20°C)
Pyknometer
1,021 g/cm³
pH-Wert ( 100 g/l H2O, 20°C) Messelektrode 5,8
Brechungsindex (20°C) Refraktometer 1,407
Aussehen flüssig
Farbe braun
Sensorik
Geruch typisch nach Nelken
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2.2.2. Identifizierung und Quantifizierung der Hauptkomponenten
Dünnschichtchromatographische Kontrolle des Nelkenblätteröls
Die Dünnschichtchromatographie (DC) erlaubt im Gegensatz zur Gaschromatographie auch
die Untersuchung von nicht flüchtigen neben flüchtigen Inhaltsstoffen. Bei der Analyse
ätherischer Öle ist die DC als Screening-Methode bzw. zur Detektion von Hauptbestandteilen
geeignet und liefert gruppenspezifische Signale zur Identifizierung von Substanzen.
Die Dünnschichtchromatographie wurde zur Absicherung und Kontrolle von Extrakt und
ätherischem Öl auf 5×5-cm-Mini-DC-Platten durchgeführt. Die Trennung erfolgte auf einer
Kieselgel-60-F254-Platte (Fa. Merck, Darmstadt), als mobile Phase diente ein Gemisch aus
80 : 20 Hexan / Diethylether. Zur Entwicklung der DC-Platte wurde sie mit einer
Vanillin/Schwefelsäure-Reagenz besprüht.
Gaschromatographie
Zur Identifizierung der Hauptkomponenten des Nelkenblätteröls bzw. –extraktes mittels
Gaschromatographie (GC), kommt ein gemeinsam mit dem Institut für Lebensmittelchemie
an der TU Dresden entwickeltes Verfahren zur Anwendung.
Abb. 4 GC/MS-Gerät an der TU Dresden (Agilent / HP 6890 Series mit 5973 MSD)
Dabei wird nach der Isolierung der ätherischen Öle mittels simultaner Destillation/Extraktion
das erhaltene Duftstoffgemisch gaschromatographisch an einer partiell polaren Kapillarsäule
getrennt, die Inhaltsstoffe mittels Massenspektrometer identifiziert (Totalionenstrom) und
enthaltene kontaktallergene Duftstoffe quantifiziert (Select Ion Mode).
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Probenvorbereitung (Simultane Destillation-Extraktion SDE)
5 bis 10 g Probe werden in einen 500 ml Rundkolben eingewogen. Man fügt 5 g
Natriumchlorid, 3 Glasperlen, 150 ml destilliertes Wasser und eine Spatelspitze
Silikonentschäumer hinzu. Anschließend werden 5 ml einer Dicyclohexylmethanol-Lösung
(DHM; interner Standard; 460 g/ml in n-Pentan) dazu pipettiert und der Kolben zur besseren
Durchmischung leicht geschwenkt.
In einen 100 ml Rundkolben füllt man je 25 ml n-Pentan und Diethylether und fügt 2
Glasperlen hinzu. Beide Kolben werden an die SDE-Apparatur (vgl. Abb. 5) angeschlossen.
Jetzt wird das U-Rohr der Apparatur so mit Wasser und n-Pentan gefüllt, dass sich die
Phasengrenze direkt unter der Rücklaufverbindung des n-Pentans befindet.
Die wässrige Probelösung (Heizpilz) und das n-Pentan (mittels Wasserbad, ca. 70°C) werden
parallel langsam zum Sieden erhitzt. Es ist darauf zu achten, dass die Lösemitteldämpfe des n-
Pentans zuerst im Kopfraum der Apparatur
ankommen. Die Destillationsdauer beträgt 4
Stunden.
Nach beendeter Destillation wird das n-
Pentan aus dem U-Rohr durch Kippen der
Apparatur in den Lösemittelkolben
überführt. Das n-Pentan entfernt man am
Rotationsverdampfer bei 50°C und
Normaldruck. Anschließend wird der
Rückstand in wenig n-Pentan
aufgenommen, in einen 5 ml Maßkolben
überführt und zur Marke aufgefüllt.
Das so gewonnene Destillat wird in ein Vial
gefüllt und gaschromatographisch
untersucht.
Abb. 5 Apparatur zur simultanen Destillation/Extraktion nach LIKENS und NICKERSON
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GC-MS
Parameter: Trennsäule : Kapillarsäule ZB5 (30 m x 0,25 mm ID; 0,25 µm Film)
5 % Phenylmethylsiloxan
Injektor : 120°C, pulsed splitless 0,5 min 25 psi
Injektionsvolumen : 1,0 µl
Temperaturprogramm : 2 min 50°C 5°C/min bis 109°C
3,0 min 109°C 5°C/min auf 250°C
3 min 113°C 5°C/min auf 250°C
10 min 250°C
Trägergas : Helium 1,0 ml/min
Detektor : 280°C, Massenselektiverdetektor (MS)
Elektronenstoßionisation (positiv) Dwell time 80
Abb. 6 Massenspektrum der isolierten Eugenolkomponente (m/z = 164)
Eugenol ist erwartungsgemäß die Hauptkomponente des Nelkenblätteröls. Unter
Berücksichtigung der Verdünnungsschritte wurde aus einer Dreifachbestimmung folgende
Zusammensetzung ermittelt.
OH
CH2
OCH3
CH CH2
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Tab. 3 Zusammensetzung Nelkenblätteröl
2.3. Beurteilung der Lagerstabilität
Die Beurteilung der Lagerstabilität der mit Nelkenblätteröl / Nelkenblätterextrakt versetzten
Verpackungsmaterialien erfolgte anhand des Eugenolgehaltes - mit etwa 85% die
Hauptkomponente der ätherischen Öle - über einen Zeitraum bis 6 Monate nach der
Herstellung.
Dabei wurde analog zu den beschriebenen Methoden der Quantifizierung der
Hauptkomponenten mittels GC/MS vorgegangen. Eine Kalibrierung des Gerätes erfolgte
mittels einer Duftstoff-Stammlösung (Gemisch aus 22 Duftstoffen - u.a. Eugenol und β-
Caryophyllen) sowie dem inneren Standard Dicyclohydroxymethanol (DHM). Diese wurden
in Verdünnungsschritten von 1:1 bis 1:1000 injiziert und eine Kalibriergerade erstellt (y =
0,610 x - 0,0038 bei r2 = 0,998). Die Nachweisgrenze / Bestimmungsgrenze wurde für die
Eugenol - Standardsubstanz mit 6 µg/ml bzw. 18 µg/ml ermittelt.
Inhaltsstoffe Anteil in %
α-Pinen 0,02 Methyl-N-Aminoketon 0,04
2-Heptanol 0,02 Furfural 0,08
α-Cubeben 0,07 α-Copaenn 0,15
Linalol 0,01 β-Caryophyllen 10,57
Methylbezoat 0,03 Methylsalizylat 0,13 Terpinen-4-ol 0,02 α-Humulen 1,13
5-Methyl-Furfural 0,05 Benzaldehyd 0,02
Caryophyllenoxid 0,19 Methyleugenol 0,13
Chavicol 0,11 Farnesol 0,30 Eugenol 73,50
Aceteugenol 11,98 E-Isoeugenol 0,16 Z-Isoeugenol 0,02
Benzylbenzoat 0,05 Humuladion 0,01
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2.4. Migrationsexperimente
Um Aussagen zum Stoffübergang antimikrobieller Komponenten der Verpackung auf das
Packgut zu erhalten wurden Migrationsexperimente mit Mehl als Testlebensmittel
durchgeführt. Zum Einsatz kam ein handelsübliches Weizenmehl Type 505.
Die Migrationsversuche wurden an den Proben W 16, W 18, W19 und W 21 (Papiertüten der
Fa. H. Ludwig Verpackungsmittel GmbH, Siebenlehn) durchgeführt. Bei den zu
untersuchenden Proben handelte es sich um jeweils 500 g-Verpackungseinheiten für Mehl
und Graupen. Die antimikrobiell wirksame Beschichtung erfolgte durch Zugabe von 10 %
Nelkenblätteröl (W 16), 20 % Nelkenblätterextrakt (W19) und 20 % Nelkenblätteröl (W18
und W20) in der Druckfarbe.
Die beschichteten Papiertüten wurden mit jeweils 200 g des handelsüblichen Weizenmehls
befüllt und 3 unterschiedlichen Temperaturregimen ausgesetzt:
1) Stresslagerung (1 Woche bei 40 + 2 °C im Wärmeschrank)
2) Normallagerung (3 Wochen bei 23°C Raumtemperatur)
3) Kühllagerung (4 Wochen bei 8°C im Kühlschrank)
Nach Ende der Lagerversuche wurden etwa 10 g des Mehls entnommen (möglichst nah am
Rand der Verpackung) und zur Bestimmung des Eugenolgehaltes mittels GC-MS eingesetzt.
2.5. Toxikologische Untersuchungen
2.5.1. Hemmstofftests / Wachstumskurven
Hemmstofftests
Bereits zur Auswahl der am besten mikrobiell wirkenden ätherischen Öle und Extrakte
wurden in Zusammenarbeit mit der IBN GmbH Dresden Hemmstoftests mit Aspergillus niger
in Petrischalen durchgeführt. Weitere Untersuchungen zur Hemmung dieses Testkeims
wurden an den behandelten Verpackungen durchgeführt.
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Wachstumskurven
Mit den verwendeten AQUALYTIC ® - Digitalmanometer ist es durch selbsttätige Messung
und Aufzeichnung des Druckes in einem geschlossenen System möglich, den Stoffwechsel
einer Kultur zu überwachen. Beim aeroben Abbau von organischer Substanz durch
Mikroorganismen entsteht Kohlendioxid, das im System mit Kalilauge absorbiert wird. Der
zum Abbau benötigte Sauerstoff wird der Gasphase entnommen. Dadurch sinkt der Druck im
System, der Druckabfall ist somit ein Maß für den Sauerstoffverbrauch. Der Druckabfall im
Reaktionsgefäß, welcher dem Sauerstoffverbrauch entspricht, wird vom Drucksensor
periodisch erfasst und gespeichert. Der Drucksensor basiert auf dem Prinzip des
piezoelektrischen Effekts und bewirkt, dass sich bei Zug oder Druck auf Kristalle deren
Gitterbausteine verschieben. Durch das dabei entstehende Dipolmoment werden die Kristalle
positiv oder negativ aufgeladen. Die elektrische Polarität wird im Mess-Sensor über eine
Widerstandsbrücke gemessen und elektronisch aufgezeichnet, die Daten per Infrarotsensor
abgerufen
Die Wachstumshemmtests werden in dieser Form an Pseudomonas putida jeweils vor und
nach der Behandlung des Substrates (Packstoffe) mit mikrobiell wirksamen Komponenten
getestet.
2.5.2. Leuchtbakterientest
Heißwasserextrakt
Zur Vorbereitung des Leuchtbakterientests wurde ein Heißwasserextrakt der beschichteten
Proben gemäß DIN EN 647 hergestellt. Die Prüfnorm beschreibt ein Verfahren zur Extraktion
von Papier- und Papp-Werkstoffen, die für einen direkten Lebensmittelkontakt vorgesehen
sind. Zur Bereitung des Extraktes werden 10 g Probe in etwa 1 bis 2 cm² große Stücke
geschnitten und in einem Erlenmeyerkolben mit 200 ml kochendem Wasser übergossen.
Danach wird der Kolben verschlossen und für 2 h bei 80°C im Wasserbad unter
gelegentlichem Umschütteln stehen gelassen. Anschließend wird der Überstand dekantiert
und die Probenstücke mit 80°C heißem Wasser gewaschen. Der Extrakt und die Waschanteile
werden in einem Messkolben auf 23°C abgekühlt und der Kolben bis zur Marke aufgefüllt.
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Leuchtbakterientest
Die Bestimmung der Toxizität erfolgt nach EN ISO 11348-1. Dabei tritt eine Hemmung der
Lichtemission von Vibrio fischeri, einem
marinen Leuchtbakterium, bei Zugabe von
potentiell toxischer Substanz auf. Die
Durchführung erfolgt als Batch-Test. Dazu
werden definierte Volumina des Testgutes
mit einer Leuchtbakteriensuspension in
einer Küvette vereinigt und die Abnahme
der Lumineszenz über einen Zeitraum von
30 min gemessen. Die Hemmwirkung wird
anhand von Verdünnungsreihen bestimmt, bei der die Lichtemission erstmals kleiner als 20 %
des Ausgangswertes ist.
Geräte: Fluoreszens-Spectrometer F 4500 der Fa. HITACHI,
pH-Messgerät inkl. Glaselektrode der Fa. WTW,
Thermostat mit Thermoblock der Fa. EPPENDORF,
Autoklav, Kühlschrank, Kolbenhubpipetten, Kühlzentrifuge, Stoppuhr,
Magnetrührer, Inkubator
Materialien: Medium 1: für frisch gezüchtete Bakterien
- 8,0 g D(+)-Glucose-Monohydrat ( C6H12O6 · H2O )
- 20,0 g Natriumchlorid ( NaCl )
- 2,035 g Magnesiumchlorid-Hexahydrat ( MgCl2 · 6 H2O )
- 0,30 g Kalimchlorid ( KCl )
- 11,9 g N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N-(2-ethansulfonsäure) ( HEPES )
In Wasser lösen, 30 min rühren und den pH-Wert auf 7,0 + 0,2 einstellen.
Anschließend mit Wasser auf 1 l auffüllen.
Medium 2: Flüssigmedium für Vor- und Hauptkulturen
- 30,0 g Natriumchlorid ( NaCl )
- 6,10 g Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat ( NaH2PO4 · H2O )
- 2,75 g Di-Kaliumhydrogenphosphat-Trihydrat ( K2HPO4 · 6 H2O )
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- 0,204 g Magnesiumsulfat-Heptahydrat ( MgSO4 · 7 H2O )
- 0,500 g Di-Ammoniumhydrogenphospaht ( (NH4)2HPO4 )
- 3 ml Glycerin
- 5,00 g Pepton aus Casein
- 0,50 g Hefeextrakt
In Wasser lösen und den pH-Wert auf 7,0 + 0,2 einstellen. Mit Wasser auf 1 l
auffüllen. 50 ml in einen Erlenmeyerkolben überführen und bei 121°C im
Autoklav sterilisieren.
Medium 3: Schutzmedium
- 66,0 g D(+)-Glucose-Monohydrat ( C6H12O6 · H2O )
- 4,0 g Natriumchlorid ( NaCl )
- 2,0 g L-Histidin
- 0,5 g Rinderserumalbumin ( BSA )
Bei 37°C vollständig in Wasser lösen und falls erforderlich den pH-Wert auf
7,0 + 0,2 einstellen. Mit Wasser auf 100 ml auffüllen. Schutzmedium immer
frisch zubereiten.
Kultivierung:
Die Leuchtbakterien vom Stamm Vibrio fischeri NRRL B-1117 (DSM 7151) werden in
Petrischalen überimpft. Dabei werden dem Medium 2 12 g/l Agar zugesetzt und anschließend
bei 121°C autoklaviert. Unter sterilen Bedingungen werden die Leuchtbakterien mit einer
Impföse in die Petrischalen überführt und anschließen 2 bis 3 Tage bei 20°C im Dunkeln
inkubiert.
Zur Herstellung der Vor- und Hauptkulturen wird jeweils eine lichtemittierende Einzelkolonie
identifiziert und steril in einen Erlenmeyerkolben mit 50 ml Medium 2 überimpft.
Die Aufbewahrung der Leuchtbakterien erfolgt in einer Vorratssuspension. Hierbei wird die
Hauptkultur in einer Kühlzentrifuge bei 6000 g für 15 min zentrifugiert. Die sedimentierten
Partikel werden in einer eisgekühlten Natriumchlorid-Lösung (20 g/l) resuspendiert und in ein
vorgekühltes Becherglas gegeben. Nun fügt man unter ständigem Rühren etwa 4 ml Medium
3 je 50 ml Hauptkultur-Ansatz hinzu. Zum Einstellen der geforderten Trübung von etwa 2500
+ 500 FNU ist anschließend eine weitere Zugabe des Schutzmediums (Medium 3) nötig
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(mind. 10 ml Schutzmedium je ml resuspendierte Partikel. Die Vorratssuspension wird in
Teströhrchen gegeben und ist im Gefrierschrank bei -20°C etwa einen Monat haltbar.
Durchführung:
Die aus der Heißwasserextraktion gewonnenen Fraktionen werden einer pH-Messung
unterzogen (pHsoll = 6 - 8,5). Bei starken Abweichungen ist eine Korrektur des pH-Wertes in
Richtung 7,0 vorzunehmen.
Von jeder Probe werden Verdünnungsreihen (siehe Tab. 4) vorbereitet.
Tab. 4 Verdünnungsreihen Verdünnung Verdünnungsstufe
D
wässriges
Probenextrakt [µl]
Verdünnungs-
wasser
[µl]
Vorratssuspension
[µl]
1 in 1,25 1 800 200
1 in 2 2 500 500
1 in 3 3 333,3 166,7 500
1 in 4 4 250 250 500
1 in 6 6 166,7 333,3 500
1 in 8 8 125 375 500
1 in 12 12 83,3 416,7 500
1 in 16 16 62,5 437,5 500
1 in 24 24 41,7 458,3 500
1 in 32 32 31,3 468,7 500
1 in 40 40 25,0 475 500
1 in 50 50 20,0 480 500
Kontrolle für
D = 1 800 200
D ≥ 2 500 500
Im Thermostat werden die Kontrollansätze, die Verdünnungsstufen der Probe und die
Verdünnungslösung bei (15 + 1) °C temperiert.
Die Vorratssuspension der Leuchtbakterien wird aus dem Gefrierschrank entnommen und bei
20°C aufgetaut. Anschließend gibt man das Medium 1 im 5-fachen Überschuss zur Menge an
aufgetauter Vorratssuspension zu und homogenisiert das Gemisch mit einem Plümper.
Die folgenden Arbeitsschritte erfolgen je Probe nacheinander in 20 s Abständen:
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1. das vorbereitete Gemisch wird zu je 500 µl in die leeren im Thermoblock bei (15 + 1)
°C befindlichen Küvetten gegeben
15 min Inkubationszeit
2. die Leuchtintensität I0 der Testsuspension mittels Fluoreszens-Spectrometer bei 490
nm bestimmen
3. Zugabe von 500 µl der jeweiligen Probenverdünnung (bei Blindwert entsprechend mit
Wasser), kurz schütteln
15 min Inkubationszeit
4. die Leuchtintensität I15 aller Küvetten bestimmen
15 min Inkubationszeit
5. die Leuchtintensität I30 aller Küvetten bestimmen
Auswertung:
Aus den gemessenen Leuchtintensitäten wird ein Korrekturfaktor fkt berechnet (Gl. 1). Dabei
werden die Ausgangswerte I0 aller Testansätze korrigiert, bevor sie als Bezugswerte zur
Abnahme der Leuchtintensität verwendet werden können.
0I
If kt
kt = (t = 15 und 30 min) (1)
fkt Korrekturfaktor für die jeweilige Kontaktzeit
Ikt Lumineszenz nach Ablauf von 15 bzw. 30 min
I0 Lumineszenz der Kontrolltestsuspension vor Zugabe des
Verdünnungswassers
Der Mittelwert des Korrekturfaktors fkt dient zur Berechnung des korrigierten Wertes für I0
unmittelbar vor Zugabe der Probe (Gl. 2).
ktct fII ⋅= 0 (2)
Ict korrigierter Wert für I0
ktf Korrekturfaktor für die jeweilige Kontaktzeit
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Die Hemmwirkung des Testansatzes wird nach Gleichung (3) berechnet.
100⋅−
=ct
Ttctt I
IIH (3)
Ht Hemmwirkung nach 15 bzw. 30 min in %
ITt Lumineszenz des Testansatzes nach 15 bzw. 30 min
Zur Berechnung der Konzentrationseffekte wird der Gamma-Wert für jede Verdünnungsstufe
nach Gleichung (4) errechnet.
t
tt H
H−
=Γ100
(4)
Γt Gamma-Wert des Testansatzes nach Ablauf der
Kontaktzeit von 15 oder 30 min
tH Mittelwert von Ht aus (3)
Den Konzentrationseffekt EC für jede Inkubationszeit kann man mit Hilfe einer einfachen
linearen Regression berechnen. Der Konzentrationseffekt für eine gegebene Inkubationszeit
(z.B. 15 oder 30 min) kann durch die folgende lineare Gleichung (5) beschrieben werden.
abc tt lglglg +Γ= (5)
ct Anteil des wässrigen Extraktes im Testansatz in %
b Steigung der beschriebenen Geraden
lg a Wert des y-Achsenabschnittes der beschriebenen
Geraden
Mit der Methode der kleinsten Quadrate lassen die EC20 -und EC50 - Werte berechnen (ct =
EC20 bei Γ30 = 0,25 und ct = EC50 bei Γ30 = 1,00).
20
3. Ergebnisse
3.1. Materialauswahl
Im ersten Teil der Bearbeitungszeit wurde gemeinsam mit den Industriepartnern eine
Festlegung der antimikrobiell wirksamen Naturstoff-Klasse (ätherische Öle und deren
Extrakte) vorgenommen sowie ein Rahmen für die eingesetzten Konzentrationen beim
Anwender abgesteckt. Als besonders geeignet, das Wachstum von Testkeimen (z.B.
Aspergillus niger, Trichoderma viride, Aspergillus tereus) zu verlangsamen bzw. zu
verhindern, erwiesen sich kommerziell erhältliches Nelkenblätteröl und Nelkenextrakt. Sie
wurden als Bestandteile von Druckfarben und Leimen in Konzentrationen von 2,5 - 5 % beim
Nelkenblätteröl und 5 - 10 % beim Nelkenextrakt zum Einsatz kommen. Im Offset-
Druckverfahren führte eine Beimengung von Nelkenblätteröl / -extrakt zu Beeinträchtigungen
im Produktionsablauf sowie zu einer Farbverschiebung. Die bedruckten Proben wurden in
einem zweiten Arbeitsschritt mit einer Lackschicht versehen, die ebenfalls Nelkenblätteröl / -
extrakt in Konzentrationen von 5 - 10 % enthielt.
3.2. Analyse der ätherischen Öle
Da die Zusammensetzung von Naturstoffen wie ätherischen Ölen immer gewissen
Schwankungen unterliegen, erfolgte eine exakte Quantifizierung der wirksamen
Komponenten (Eugenol-Gehalt) in den Ölen / Extrakten zeitnah zur Bestimmung des
Gehaltes dieser Stoffe in den antimikrobiell ausgerüsteten Verpackungsmaterialien.
Die zur Anwendung vorgesehenen Nelkenextrakte wurden zuerst durch sensorische und
chemisch-physikalische Analysen näher charakterisiert.
Im nächsten Schritt erfolgte eine Quantifizierung der Hauptinhaltsstoffe durch eine
Aufarbeitung / Aufreinigung der Proben mittels simultaner Destillation und Extraktion und
nachfolgender gaschromatographischer Analyse (GC-MS).
Eugenol konnte in einer Dreifachbestimmung durch Massenspektrometrie eindeutig als
Hauptkomponente des Nelkenblätteröls identifiziert und mit 73,5 + 3,2 % bestimmt werden
21
(siehe Tab. 3). Die beiden wichtigen Nebenbestandteile Aceteugenol und ß-Caryophyllen
wurden mit Gehalten von 12,0 + 1,9 % und 10,6 + 1,8 % gefunden.
Abb.7 GC-MS Chromatogramm der Probe W 19 (20 % Nelkenextrakt in Druckfarbe)
Reinheitsuntersuchungen des verwendeten Nelkenblätteröls ergaben einen Anteil von 85,43 +
1,77 % Eugenol beim Nelkenblätterextrakt betrug dieser Anteil 83,71 + 1,91 %. Über den
Anteil dieser Hauptkomponente ist die Rückrechnung auf die Gesamtmenge an ätherischem
Öl / Extrakt im Produkt möglich.
3.3. Beurteilung der Lagerstabilität
Die Beurteilung der Lagerstabilität der mit Nelkenblätteröl bzw. Nelkenblätterextrakt
versetzten Proben erfolgte anhand des Eugenolgehaltes. Der Eugenolgehalt wurde mittels
GC-MS Analytik mit vorangegangener SDE als Summenparameter aus Eugenol und
Aceteugenol bestimmt.
22
Tab. 5 Beurteilung der Lagerstabilität über die Abnahme des Eugenolgehaltes
Probe
Herstellung
/ Eingang
Anteil in %
an aufgetragenem Nelken-
Eugenolgehalt (mg/m²)
Wieder-findung
(%)
Eugenolgehalt (mg/m²)
Wieder-findung
(%)
-extrakt
-blätteröl
März / April 04
Juni / Juli 04
G 16 17.09.03 10 0,204 51,0 0,183 45,8
G 17 04.12.03 20 0,539 67,4 0,506 63,3
G 18 04.12.03 20 0,548 68,5 0,512 64,0
G 19 04.12.03 100 3,412 85,3 3,291 82,3
G 20 04.12.03 100 3,288 82,2 3,197 79,9
G 21 04.12.03 10 0,291 72,8 0,272 68,0
G 22 04.12.03 10 0,287 71,8 0,256 64,0
K 17 06.12.03 10 0,033 8,3 nicht
K 20 06.12.03 5 0,016 8,0 bestimmt
K 23 06.12.03 10 0,037 9,3 0,044 11,0
W 17 11.12.03 10 0,189 47,3 0,166 41,5
W 18 11.12.03 20 0,492 61,5 0,459 57,4
W 19 11.12.03 20 0,422 52,8 0,383 47,9
W 20 11.12.03 20 0,445 55,6 0,391 48,9
W 21 11.12.03 20 0,460 57,5 0,418 52,3
W 22 11.12.03 20 0,474 59,3 0,423 52,9
Die Berechnung der Wiederfindung erfolgt mit der Annahme einer gleichmäßigen Verteilung
auf der Oberfläche des Papiers bzw. im Leim des Bodens und der Seitennaht. Es wurde von
einer durchschnittlichen Auftragsmenge von 4 g/m² ausgegangen, da eine exakte Bestimmung
des Auftrages während der Herstellung der Proben bei den Industriepartnern nicht möglich
war. Diese Auftragsmenge entspricht in etwa dem Anteil an Druckfarbe für einen
vollflächigen Druck.
23
G 16G 17
G 18G 19
G 20G 21
G 22K 17
K 20K 23
W 17
W 18
W 19
W 20
W 21
W 22
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Euge
nolg
ehal
t [m
g/m
²]
Probe
Juni / Juli März / April
Abb. 8 Abnahme des Eugenolgehaltes während der Lagerung über 6 Monate
Die geringe Abnahme des Wirkstoffgehaltes (von 2,3 % bei Probe G 20 bis 7,8 % bei Probe
G 22) im Vergleich zu den im März gemessenen Werten lässt sich z.T. durch die idealen
Lagerbedingungen, im Kühlschrank bei 8°C in jeweils einzeln verschweißten
Umverpackungen, erklären. Weiterhin findet in der Zeit direkt nach der Herstellung der
größte Übergang von leicht flüchtigen Öl- und Extraktbestandteilen in die
Umgebungsatmosphäre statt und wurde hier nicht berücksichtigt.
Für die untersuchten Proben der Fa. Elbtal Druckerei Dresden (K 17, K 20 und K 23)sind mit
der verwendeten Methode zur Eugenolbestimmung keine verlässlichen Angaben zur
Wiederfindung möglich. Die Komponenten des ätherischen Öls lassen sich aufgrund des
Einbringens in eine Lackschicht nicht mittels SDE (Wasserdampfdestillation) in das
Lösungsmittel n-Pentan überführen. Eine direkte Extraktion mit n-Pentan führt jedoch durch
eine Reihe von aus dem Papier und Lack gelösten Stoffen (Weichmacher,
Konservierungsmittel, Füllstoffe usw.) zu zahlreichen Störpeaks und Überlagerungen im GC-
MS Spektrum.
24
3.4. Migrationsexperimente
In Auswertung der durchgeführten Lagerversuche mit dem trockenen Modell-Lebensmittel
Mehl konnten bei keinem Temperatur-Zeit-Regime Eugenolgehalte nachgewiesen werden.
Beispielhaft ist in Abbildung 9 das GC-MS-Chromatogramm einer bei 40°C gelagerten
Mehlprobe dargestellt (Stresslagerung: 200g Weizenmehl (Type 505) bei 40°C über einen
Zeitraum von 7 Tagen).
Abb. 9 Lagerversuch Weizenmehl (7 Tage bei 40°C)
Wie im Chromatogramm ersichtlich fehlt der typische Eugenol-Peak bei einer Retentionszeit
von 22.58 min. Die auftretenden Siloxan-Peaks bei 13,83 min; 21,22 min und 27,97 min
werden durch Auswaschungen des GC-Säulenmaterials (sog. Ausbluten der Säule)
verursacht. Die Siloxane sind sehr leicht durch ihre hohen Molmassen mz > 450 zu
identifizieren und sind nur in geringen Konzentrationen enthalten. Nach dem Austausch der
Chromatographie-Säule traten Siloxan-Peaks nur noch sehr vereinzelt auf (siehe auch Abb. 7)
Siloxane
25
Tab. 6 Auswertung der Stresslagerung von Weizenmehl bei 40°C
Bezeichnung Herstellung Nelken- Nelken- Anteil Ort Einwaage
Weizenmehl Eugenol-
gehalt extrakt blätteröl in % [ g ] [ µg/ml ]
Neg-Kontrolle 19.04.04 0 10,009 n.n
W 16 11.12.03 x 10 Druckfarbe 10,092 n.n W 18 11.12.03 x 20 Druckfarbe 10,032 n.n W 19 11.12.03 x 20 Druckfarbe 10,052 n.n W 21 11.12.03 x 20 Druckfarbe 10,044 n.n
Trotz des fehlenden quantitativen Nachweises der Nelkenkomponente entwickelten speziell
die im Wärmeschrank bei 40°C gelagerten Proben beim Öffnen einen sehr dominanten und
charakteristischen Nelkengeruch. Daraus lässt sich ein Vorhandensein von Eugenol im
Gasraum um die Verpackung sowie über dem Packgut ableiten.
3.5. Toxikologische Untersuchungen
Wachstumskurven
Die Wachstumshemmtests mit den im Zwischenbericht 1 dargestellten AQUALYTIC ® -
Digitalmanometer verliefen unspezifisch. Das heißt, dass es bei Pseudomonas putida im
wässrigen Medium bei Zugabe von unbehandeltem Verpackungsmaterial einerseits zu
Wachstumshemmung kam, andererseits zu vermehrter Sauerstoffzehrung durch das einer
weiteren Kohlenstoffquelle in Form von Papier (Fremdbesiedelung). Eine verlässliche
Aussage über die Hemmwirkung der in verschiedenen Konzentrationen aufgetragenen
antimikrobiellen Agenzien ist daher nicht möglich.
Leuchtbakterientest
Die Bestimmung der Biotoxizität mittels Leuchtbakterientest (DIN EN ISO 11348) gehört
neben den ebenfalls normierten Fisch-, Daphnien- und Algentest zu den führenden Tests in
der Toxizitätsanalytik. Als Organismen werden marine Leuchtbakterien der Spezies Vibrio
fischeri NRRL B-11177 eingesetzt. Es handelt sich um ein halophiles, fakultativ anaerobes,
gramnegatives Stäbchen mit polarer Begeißelung, dessen Biolumineszenz Bestandteil des
26
Stoffwechsels ist. Jede Art von Toxizität beeinträchtigt diese Stoffwechselprozesse und kann
entsprechend erfasst werden.
Im durchgeführten Test wurde die Hemmung der Biolumineszenz ermittelt, indem definierte
Volumina des Heißwasserextraktes der Proben mit einer Leuchtbakteriensuspension in einer
Küvette vereinigt werden. Das eigentliche Testkriterium ist die nach einer Kontaktzeit von 30
min gemessene Abnahme gegenüber einem Kontrollansatz. Die Lumineszenzmessungen
wurden an einem Fluoreszens-Spectrometer F 4500 der Firma HITACHI durchgeführt.
Die Toxizität einer Substanz wird üblicherweise in Prozent der Leuchtkraft-Hemmung bei der
jeweiligen Verdünnungsstufe bzw. als EC50-Wert angegeben. Als Effektkonzentration EC
wird die Konzentration des Analyten bezeichnet, bei der ein bestimmter Prozentsatz
untersuchter Organismen betroffen ist (EC20 - 20%; EC50 - 50%).
Tab. 7 Auswertung Leuchtbakterientest
Probe
G 14 10%
Nelkenblätteröl im Bodenleim
G 17 20%
Nelkenblätter-extrakt in der Druckfarbe
W 18 20%
Nelkenblätteröl in der
Druckfarbe
W 20 20%
Nelkenblätter-extrakt im Bodenleim
K 35 10%
Nelkenblätteröl im Lack
Verdünnungs-
stufe D
Hemmung nach 30 min
30H [%]
2 69,78 79,07 84,77 77,68 54,97
3 54,19 63,87 75,85 58,08 21,08
4 20,28 32,34 43,70 41,61 5,49
6 7,37 10,93 13,65 14,73 1,67
8 1,34 3,60 9,06 7,66
12 3,20
EC20 - Wert [%]
24,7 20,9 17,0 18,4 33,3
EC50 - Wert [%]
35,5 31,2 26,6 30,3 46,6
27
In Tabelle 7 sind die ermittelten Werte für die Toxizitätsuntersuchungen mit dem
Leuchtbakterium Vibrio fischeri aufgeführt. Die kursiv dargestellten Werte der Verdünnung
(D) werden als niedrigste unwirksame Verdünnung (LID) bezeichnet sind solche, bei denen
H30 < 20 % ist. Die Daten für Hemmung 30H sind Mittelwerte aus jeweils 3 Messungen.
Die EC50 - Werte schwanken in einem Bereich von 26,6 (Probe W 18)bis 46,6 (Probe K 35)
wobei die Zahlenwerte als Reziproke ihrer Toxizität zu verstehen sind, d. h. EC50 > 100% -
nicht toxisch; EC50 < 1% - extrem toxisch.
Wie bereits bei der Aufarbeitung für die GC-MS Versuche ersichtlich, kommt es bei einer
Applikation des Nelkenblätteröles im Lack (Probe K 35) zu einer sehr starken / hydrophoben
Bindung und die Wirkstofffreisetzung erfolgt nur langsam.
Es lassen sich jedoch aufgrund der Aufarbeitung der Proben für den Leuchtbakterientest;
Überführen des Nelkenblätteröls bzw. -extraktes von den Trägermaterialien in den flüssigen
Aggregatzustand durch Heißwasser-Extraktion; keine detaillierten Aussagen über die
alleinige Hemmwirkung der aufgebrachten antimikrobiell wirksamen Komponenten treffen.
Eine Vergleichsprobe aus unbehandeltem Karton GC - 270 g/m² (Grundkörper der Probe W
35) zeigte durch herausgelösten Verbindungen die während der Extraktion eine Hemmung
von 37,2 % bei D = 2. Das, zum weiteren Vergleich eingesetzte, reine Eugenol (>99% der Fa.
Merck Darmstadt) ist mit einem ermittelten EC50-Wert von 1,6 % bereits als stark toxisch zu
bewerten.
Die Hersteller von Druckfarben und Leim geben in den entsprechenden
Sicherheitsdatenblättern lediglich eine verbale Beschreibung der humantoxischen Wirkung an
(GefahrstoffVO / EG-Richtlinie 88/379/EWG). Es kann aber davon ausgegangen werden,
dass diese Trägermaterialien der antimikrobiellen Komponenten an sich schon eine Hemmung
im Leuchtbakterientest bewirken.
Die in Tabelle 7 aufgeführten Werte verstehen sich demnach als eine Durchschnittsangabe der
Toxizität aller wasserlöslichen Verbindungen des Verpackungsmaterials zu beurteilen.
28
3.6. Lebensmittelrechtliche Beurteilung
Bedarfsgegenstände sind gemäß Definition in § 5 Abs. 1 Deutschem Lebensmittel- und
Bedarfsgegenständegesetz (LMBG):
(1) Gegenstände, die dazu bestimmt sind, bei dem Herstellen, Behandeln,
Inverkehrbringen oder dem Verzehr von Lebensmitteln verwendet werden und dabei
mit den Lebensmitteln in Berührung kommen oder auf diese einwirken;
(2) Packungen, Behältnisse oder sonstige Umhüllungen, die dazu bestimmt sind, mit
kosmetischen Mitteln oder Tabakerzeugnissen in Berührung zu kommen….
In dieser Erweiterung müssen sich die hergestellten antimikrobiellen Verpackungsmaterialien
dem LMBG unterwerfen.
Der Fünfte Abschnitt: Verkehr mit sonstigen Bedarfsgegenständen des LMBG regelt in § 30
Verbote zum Schutz der Gesundheit:
Es ist verboten,
(1) Bedarfsgegenstände derart herzustellen oder zu behandeln, dass sie bei bestimmungs-
gemäßem oder vorauszusehenden Gebrauch geeignet sind, die Gesundheit durch ihre
stoffliche Zusammensetzung, insbesondere durch toxikologisch wirksame Stoffe oder
durch Verunreinigungen, zu schädigen;
(2) Gegenstände oder Mittel, die bei bestimmungsgemäßem oder vorauszusehenden
Gebrauch geeignet sind, die Gesundheit durch ihre stoffliche Zusammensetzung,
insbesondere durch toxikologisch wirksame Stoffe oder durch Verunreinigungen, zu
schädigen, als Bedarfsgegenstände in den Verkehr zu bringen; …..
Speziell die Wirkstoffe des Nelkenblätteröls / -extrakts besitzen ein allergenes Potential
[SCHUMANN, 2001] und sind somit auch geeignet den Gesundheitszustand der Verbraucher
negativ zu beeinflussen.
Der § 31 LMBG regelt den Übergang von Stoffen auf Lebensmittel:
Es ist verboten,
(1) Gegenstände als Bedarfsgegenstände im Sinne des § 5 Abs. 1 Nr. 1 gewerbsmäßig so
zu verwenden oder für solche Verwendungszwecke in den Verkehr zu bringen, dass
29
von ihnen Stoffe auf Lebensmittel oder deren Oberfläche übergehen, ausgenommen
gesundheitlich, geruchlich und geschmacklich unbedenkliche Anteile, die technisch
unvermeidbar sind……
Dieser Paragraph lässt wenig Spielraum hinsichtlich einer Beeinflussung von Lebensmitteln
durch Nelkenwirkstoffe, allein schon durch ihren geringen Geruchsschwellenwert. Den
Übergang von Stoffen auf das Lebensmittel die „technisch unvermeidbar“ sind regeln u.a.
auch die EU- Verordnungen RL 76/893/EWG Art. 2 und RL 89/109/EWG Art 2.
In der Bedarfsgegenstände-Verordnung findet man in den Anlagen zu § 8 Übergang von
Stoffen auf Lebensmittel:
Anlage 3 Abschnitt 3 Zugelassene Stoffe, für die besondere
Verwendungsbeschränkungen gelten
Eugenol EWG-Verpackungsmaterial-Referenznummer: 17160
SML (spez. Migrationswert) = n.n. (nicht nachweisbar)
NG (Nachweisgrenze der Methode) = 0,02 mg / kg
Anlage 6 …gilt der Anteil der Stoffe die vom Bedarfsgegenstand auf das
Lebensmittel übergeht als geruchlich und geschmacklich unbedenklich,
wenn der für das Lebensmittel typische Geruch nicht nachteilig
beeinflusst wird….(es wird ein Verfahren mit Blind- und
Vergleichsproben vorgeschlagen)
Auch wenn nach 14-tätiger Stresslagerung kein Eugenol mittels GC-MS nachweisbar war
(Anforderung gem. § 8 BedarfsgegenständeV Anlage 3) würde eine Gegenüberstellung von
Blind- und Vergleichsprobe das mit Nelkenwirkstoff versetzte Verpackungsmaterial
geruchlich leicht erkennbar machen.
30
4. Zusammenfassung und Ausblick
Ätherische Öle sind prinzipiell dazu geeignet, das Wachstum von Mikroorganismen zu
hemmen. Im Rahmen des Forschungsvorhabens wurden erste Anwendungen im
Verpackungsbereich für Papier-Packstoffe getestet.
Nelkenblätteröl und Nelkenblätterextrakt, als antimikrobielle Komponenten, wurden in
Konzentrationen von 5 bis 20 Vol.-% dem Klebstoff, der Druckfarbe oder dem Lack
zugesetzt und auf verschiedene Papier- und Pappwerkstoffe appliziert.
Die Analytik der Nelkenbestandteile erfolgte über GC-MS Untersuchungen mir
entsprechender Vorbehandlung. Über die quantitative Erfassung der Hauptkomponente dieser
Verbindungen, das Eugenol, war es möglich einen Wirkstoffverlust während der Lagerung
bzw, einen Übergang auf ein Testlebensmittel nachzuweisen. In der Regel sind Verpackungen
nach einem Zeitraum von 3 bis 6 Monaten beim Verbraucher angekommen. In
Lagerversuchen unter geschlossenen Bedingungen konnte der Wirkstoffverlust während
dieses Zeitraumes maximal 8 % betragen. Für den Anwendungsfall wird eine ähnliche
Aufbewahrung der Packmittel (kühl, lichtgeschützt, Luftabschluss) empfohlen.
In Migrationsexperimenten mit einem trockenen Testlebensmittel konnte kein Eugenol
nachgewiesen werden. Bei höheren Temperaturen kam es jedoch zu einer deutlichen
Geruchsentwicklung durch flüchtige Komponenten des ätherischen Öls / Extraktes.
Die sensorische Wahrnehmungsschwelle (Geruch) liegt bei einer Vielzahl von ätherischen
Ölen deutlich über der Wirkschwelle dieser Stoffe, somit ist eine Geruchsneutralisierung der
behandelten Verpackung nur durch Überlagern des Eigenaromas mit anderen Duftstoffen
möglich. Die Applikation in einer Lackschicht bietet eine Chance den typischen Geruch der
Nelkenkomponenten zu binden - bei leichter Abschwächung der antimikrobiellen
Wirksamkeit.
Im Leuchtbakterientest mit Vibrio fischeri zeigten die funktionalisierten Packstoffe eine
mittlere bis mäßige toxikologische Wirkung. Reines Eugenol in hohen Konzentrationen ist
stark toxisch und besitzt kontaktallergenes Potential.
Für einen weiteren Anwendungsverlauf sollte eine weitere Minimierung der Auftragsmengen
an Nelkenblätteröl und -extrakt bei Einhaltung der erwünschten fungiziden und bakteriziden
Wirkung erfolgen. Es wäre anstrebenswert, den auftretenden Eigengeruch der
funktionalisierten Verpackungsmaterialien beispielsweise durch eine bindende Lackschicht zu
31
minimieren. Dies könnte ebenfalls zu einem geringeren kontaktallergenen Potential der
Verpackung führen.
Nach derzeitiger Rechtslage dürfte eine Verpackung, bei der Nelkenblätteröl oder -extrakt
direkt mit der Druckfarbe oder dem Leim aufgetragen wurde, keine Zulassung nach LMBG
erhalten - dafür ist die Beeinflussung des Eigengeruchs der zu verpackenden Lebensmittel zu
groß. Weiterhin sollten Lagerversuche mit wasser- bzw. ölhaltigen Modelllebensmitteln die
Migration auf das Packgut (Lebensmittel) untersuchen.
Für eine technische Anwendung sind die im Bearbeitungszeitraum untersuchten Materialien
sehr gut geeignet.
32
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